본 발명은 건조인삼박 20g에 증류수 500mL를 넣고 30분간 교반한 후 필트라제 BR을 2g 가하여 50℃에서 2시간 교반한 다음 100℃에서 20분간 가열하여 효소를 불활성화 하고 원심분리하여 상등액을 획득한 후 한외여과막에 통과시킨 분획을 건조하여 인삼올리고당을 제조하는 단계; 겔침투 크로마토그래피를 이용하여 상기 인삼 올리고당의 분자량을 측정하는 단계; 상기 본 발명 인삼 올리고당을 첨가한 MRS broth에서 비피도박테리움 롱검의 증식효과를 측정하는 단계; 상기 인삼 올리고당 제조시 가수분해효소의 종류에 따른 생산수율과 분자량를 측정하는 단계; 상기 인삼 올리고당 제조시 가수분해효소를 혼합하여 첨가했을때의 생산수율과 분자량을 측정하는 단계; 분자량이 각기 다른 한외여과막에 인삼 올리고당액을 통과시켜 분자량이 다양한 인삼 올리고당을 제조하는 단계로 구성된다.
본 발명 건조 인삼분말이나 인삼박에 물을 가하여 교반시킨 다음 다당류 가수분해효소인 셀룰라제(cellulase), 헤미셀룰라제(hemicellulases), 펙티나제(pec- tinases)를 단독 또는 혼합하여 첨가하였다. 이 때 다당류 가수분해 효소의 첨가방법으로는 상업용으로 판매되고 있는 효소를 사용하였다.
본 발명에서는 사용한 상업용는 셀룰라제로서 셀루클라스트(Celluclast, Novo Nordisk, Denmark)을, 헤미셀룰라제로서 세레믹스 L(Ceremix L Novo Nordisk, Denmark), 필트라제 BR(Filtrase BR Gist-Brocades, Netherlands), 울트라플로 L(Ultraflo L, Novo Nordisk, Denmark)을, 펙티나제로서 펙틴넥스(Pectinex, Novo Nordisk, Denmark)를 사용하였다.
효소반응 후에는 원심분리하여 상등액으로부터 인삼 올리고당 분획을 얻은 후 이를 한외여과기를 이용하여 분자량별로 분획한 후 이를 동결건조 하거나 열풍건조 하였다.
상기 다당류 가수분해 효소를 이용한 효소적 방법에 의한 인삼 올리고당의 제조방법을 제조공정별로 상세히 설명한다.
본 발명 인삼올리고당의 바람직한 제조방법은 도 1에 공정별로 도시하였다.
제 1공정: 인삼박의 제조
홍삼, 백삼 및 태극삼 등의 인삼제품에 열수나 에탄올 또는 메탄올 등의 용매를 가하여 인삼 내부의 엑기스(extract)를 추출한 후 가공부산물로 생산된 인삼박을 수거한다. 상기 인삼박에 잔류하는 수분이나 용매를 가열증발기나 동결건조기를 이용하여 건조한 후 분쇄하여 인삼박을 제조한다. 본 발명에서 사용한 인삼박의 당성분을 페놀-황산법(pheonol-sulfuric method)에 의해 분석한 결과 총 인삼박의 98% 이상이 당성분의 다당류로 구성되어 있는 것으로 나타났다.
제 2공정: 다당류 가수분해 효소 처리공정
상기 제 1공정에서 제조한 인삼박을 증류수에 1∼10%(w/v) 첨가한 후 인삼박에 대해 중량비로 상업용 다당류 가수분해 효소인 셀룰라제, 헤미셀룰라제, 펙티나제 단독 또는 2종이상의 혼합 효소액을 1:1∼1:0.001을 가한 후 효소의 반응조건에 따라 온도 30∼60℃에서 30분∼480분간 교반한다. 상기 시료를 100℃에서 15분간 가열하여 효소를 불활성화 한 다음 5,000∼10,000 x g에서 10∼30분간 원심분리하여 상등액으로부터 수용성 인삼 올리고당 용액을 획득한다. 이 때 침전물은 건조하여 식이섬유로 활용할 수 있다.
제 3공정: 한외여과막을 이용한 분자량별 인삼 올리고당 제조공정
상기 제 2공정에서 제조한 인삼 올리고당 액을 한외여과기(ultrafiltrator)를 이용하여 분자량 500∼5,000의 한외여과막에 순차적으로 통과시킨 후 건조함으로써 분자량별 인삼 올리고당을 제조한다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 본 발명 인삼 올리고당의 제조
건조 인삼박 20g에 증류수 500mL을 넣고 30분간 교반한 후 필트라제BR (Gist-Brocades, Netherlands)을 2.0g 가하고 나서 50℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이를 100℃에서 20분간 가열하여 효소를 불활성화 한 다음 6,000 x g에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 여과하였다. 상등액의 고형분 함량에 의해 인삼 올리고당의 수율을 측정한 결과 56.7%로 나타났다. 이러한 결과는 다당류 가수분해 효소의 처리에 의해 인삼박으로부터 인삼 올리고당 성분이 성공적으로 분리될 수 있음을 의미한다. 또한, 상기 실시예에서 제조한 올리고당은 알콜 첨가에 의해 침전물이 생성되지 않아 저분자량의 올리고당으로 구성되어 있음을 나타내었다.
본 발명 인삼 올리고당은 음료, 제과, 제빵류 및 건강식품 등에 사용할 수 있다.
실험예 1: 본 발명 인삼 올리고당의 분자량 측정
인삼 올리고당의 분자량 측정은 겔침투 크로마토그래피(gel permeationchromatography)를 이용하여 측정하였다. 분자량의 측정을 위해 사용한 겔침투 크로마토그래피는 미국 워터스사(Waters LC Module I)의 제품을 사용하였으며, 검출기는 히팅 챔버(heating chamber)가 부착된 M410-RI와 M2010 밀레니엄 소프트웨어(Millennium software)를 사용하였다. 컬럼은 울트라하이드로겔 (ultrahydrogel) 120 & 250 컬럼을 사용하였으며 이동상으로는 0.1M NaNO3을 사용하였다. 분석시 이동상의 속도는 0.8mL/min이였고, 표준물질로는 풀루란(pullulan)과 유당(lactose)을 사용하였다.
실험 결과, 도 2a와 도 2b에 나타낸 바와 상기 실시예 1에서 제조한 인삼 올리고당의 무게평균분자량(weight molecular weight)은 1,050이였다.
실험예 2: 본 발명 인삼 올리고당의 장내미생물 증식효과
본 실험에서는 한국식품개발연구원에서 한국인의 분변에서 분리한 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)을 장내미생물로서 사용하였다(Korean J. Dairy Sci., 11(1), 16-25, 1989). 비피도박테리움 롱검은 하기 표 1 나타낸 바와 같은 조성을 가진 20㎖ MRS broth에서 혐기적 조건으로 3차 계대배양하여 활성을 증가시킨 후 실험에 사용하였다. 이때, 올리고당을 포함하지 않은 배지를 대조구로 하였다. 상기 인삼 올리고당을 첨가한 배지와 첨가하지 않은 배지에 비피도박테리움 롱검을 접종하고 37℃ 인큐베이터(incubator)에서 배양하면서 2시간간격으로 배양액을 샘플링하여 660nm에서 흡광도(absorbance)를 측정하고 생육곡선을 작성하였다.
실험 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 상기 실시예 1에서 제조한 인삼 올리고당을 배지 중에 첨가한 경우 배양 20시간이 경과된 후의 흡광도가 2.95였으며 첨가하지 않은 대조구의 경우에는 흡광도가 0.22였다. 즉, 본 발명 인삼 올리고당을 첨가한 경우 첨가하지 않은 대조구에 비해 비피도박테리움 롱검의 생육이 월등히 우수하였다.
비피도박테리움 롱검의 배양을 위한 MRS broth 배지조성
조 성 |
함 량 |
펩톤 (peptone) |
20 g |
육수(Meat extract) |
10 g |
효모 추출물(Yeast extract) |
1 mL |
트윈 80(Tween 80) |
2 g |
구연산 암모늄(Ammonium citrate) |
5 g |
아세트산 나트륨(Sodium acetate) |
0.1 g |
황산 마그네슘(MgSO4·7H2O) |
0.05 g |
황산 망간(MnSO4·5H2O) |
2 g |
한천(Agar) |
15 g |
인삼 올리고당 |
20 g |
〔주〕배지의 총부피 1L, pH 6.0 |
실시예 2∼6: 인삼 올리고당의 제조시 가수분해효소의 종류에 따른 영향
가수분해 효소의 종류가 인삼 올리고당의 제조에 미치는 영향을 조사하였다. 건조 인삼박 10g에 증류수 500mL을 넣고 30분간 교반한 후 다당류 가수분해 효소로서 Celluclast(Novo Nordisk, Denmark), Ultraflo L(Novo Nordisk, Denmark), Ceremix(Novo Nordisk, Denmark), Pectinex(Novo Nordisk, Denmark), FiltraseBR(Gist-Brocades, Netherlands)을 각각 0.1g씩 가한 후 하기 표 2에 나타낸 바와 같은 조건에 따라 인삼 올리고당을 제조하였다. 상기 제조한 수용성 인삼 올리고당의 생산수율과 분자량은 각각 실시예 1과 실험예 1에서 사용한 동일한 방법으로 확인하였다.
실험 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이 가수분해 효소의 종류에 따라 생산수율은 19.6∼43.1%, 분자량은 1,180∼1,820의 분포를 보였으며 헤미셀루라제인 필트라제BR(Filtrase BR)를 사용한 경우 올리고당 수율이 43.1%로 가장 우수하였으며 펙티나제인 펙틴넥스를 사용한 경우에도 올리고당 수율이 40.7%로 우수하였다. 이는 가수분해 효소의 종류에 따라 다양한 수율과 분자량을 갖는 인삼 올리고당의 생산이 가능하다는 것을 의미한다.
가수분해 효소의 종류에 따른 인삼올리고당의 생산
실시예 |
효 소(상품명) |
반응온도 |
반응시간 |
반응 pH |
올리고당수율(%) |
분자량 |
실시예 2 |
Celluclast |
60℃ |
1시간 |
5.0 |
20.5 |
1,820 |
실시예 3 |
Ceremix |
30℃ |
1시간 |
6.5 |
38.9 |
1,530 |
실시예 4 |
Filtrase |
50℃ |
1시간 |
6.0 |
43.1 |
1,250 |
실시예 5 |
Pectinex |
50℃ |
1시간 |
5.0 |
40.7 |
1,180 |
실시예 6 |
Ultraflo |
50℃ |
1시간 |
6.0 |
20.3 |
1,470 |
실시예 7∼10: 인삼올리고당 제조시 가수분해 효소의 혼합효과
상기 실시예 2∼6에서 사용한 효소를 중량비로 동량씩 두가지 또는 세가지를 혼합하여 실시예 2∼6과 동일한 조건에 의해 처리하였을 때 인삼 올리고당의 수율및 분자량의 변화를 조사하였다.
실험 결과, 표 3에 나타난 바와 같이 상기 실시예 2에서 셀루클라스트 (Celluclast)를 단독으로 사용하였을 경우에는 인삼 올리고당의 생산수율이 20.5%로 낮았으나, 다른 효소를 혼합한 경우에는 생산 수율이 크게 증가하여 셀루클라스트(Celluclast), 필트라제(Filtrase) 및 펙티넥스(Pectinex)를 함께 첨가하여 반응하였을 경우에 올리고당의 생산수율이 50.4%였다..
가수분해 효소의 혼합에 따른 인삼 올리고당의 제조
실시예 |
효 소(상품명) |
반응온도 |
반응시간 |
반응 pH |
올리고당수율(%) |
분자량 |
실시예 7 |
Celluclast +Ceremix |
40℃ |
1시간 |
6.0 |
38.5 |
1,670 |
실시예 8 |
Celluclast +Filtrase |
50℃ |
1시간 |
6.0 |
48.6 |
1,320 |
실시예 9 |
Celluclast + Pectinex |
50℃ |
1시간 |
6.0 |
47.2 |
1,120 |
실시예 10 |
Celluclast + Ultraflo |
50℃ |
1시간 |
6.0 |
33.6 |
1,420 |
실시예 11 |
Celluclast + Filtrase +Pectinex |
50℃ |
1시간 |
6.0 |
50.4 |
980 |
실시예 12∼16: 한외여과기를 이용한 인삼올리고당의 분자량 분획
상기 실시예 2∼6에서 제조한 인삼 올리고당액을 한외여과기(ultrafiltrator : Amicon, USA)를 이용하여 분자량 3000, 1000, 500의 한외여과막에 순차적으로 통과시킨 후 동결건조하였다. 인삼 올리고당의 분자량별 분획의 수율을 표 3에 나타낸 바와 같이 분자량이 3,000이상인 경우에 올리고당 생산 수율은 10%이하였으며분자량이 1,000∼3,000인 경우에는 올리고당 생산 수율이 15∼30%였고, 분자량 500∼1,000인 경우에는 올리고당 생산 수율이 40∼50%였으며 분자량 500이하는 생산 수율이 18∼20% 였다. 따라서 적용하는 효소의 종류에 따라 한외여과를 이용하면 분자량 분포가 다양한 인삼 올리고당의 조제가 가능함을 알 수 있었다.
한외여과를 이용한 분자량 분포가 다양한 인삼올리고당의 생산
분자량 분획 |
수 율(%) |
실시예 12 |
실시예 13 |
실시예 14 |
실시예 15 |
실시예 16 |
>3,000 |
9.4 |
10.6 |
8.9 |
8.1 |
7.4 |
1,000∼3,000 |
30.9 |
28.5 |
15.6 |
20.7 |
25.3 |
500∼1,000 |
39.1 |
40.7 |
52.1 |
53.4 |
47.6 |
<500 |
20.6 |
20.2 |
23.4 |
17.8 |
19.7 |