KR20020021784A - 미세담체의 코딩 - Google Patents

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Abstract

코드화된 미세담체, 및 보다 특히 그들위에 쓰여진 코드를 갖는 미세담체. 미세담체상에 코드를 쓰는 방법, 코드를 판독하는 방법, 및 코드화된 미세담체를 사용하는 방법. 미세담체를 코드화하는 바람직한 방법은 표백될 수 있는 물질을 함유하는 미세담체를 고 공간 해상력 광원에 노출시켜 미세담체상의 코드를 표백하는 것을 포함한다. 코드화된 미세담체는 화학적 및 생물학적 분석 및 합성에서 예를들어 지지체 물질로서 사용될 수 있다.

Description

미세담체의 코딩{Encoding of microcarriers}
화학적 및 생물학적 분야에서 약물 발견 및 약물 스크리닝은 흔히 매우 많은 수의 화합물 또는 분자에 분석을 수행하는 것을 포함한다. 이들 분석은 전형적으로 관심의 대상이 되는 화합물에 대한 화학적 라이브러리를 스크리닝하는 것, 시험 샘플에서 특별한 표적 분자를 스크리닝하는 것, 및 분자사이의 관심의 대상이 되는화학적 및 생물학적 상호작용에 대한 일반적인 시험을 포함한다. 상기 기술된 분석은 종종 수천개의 개개 화학적 또는 생물학적 반응을 수행하는 것을 요구한다. 예를들어 약물 발견 분석은 특정 표적 분석물(analyte)에 대해 수천개의 화합물을 시험하는 것을 포함할 수 있다. 표적 분석물과 반응하거나, 결합하거나, 다르게 상호작용하는 것으로 관찰되는 화합물은 관찰된 상호작용이 유의적인 것으로 믿어지는 어떤수의 이용성에 대해 약속을 보장 할 수 있다.
다수의 실제적인 문제점이 상기된 분석에서 요구되는 다수의 개개 반응을 다루는데 존재한다. 아마도, 가장 중요한 문제는 각 반응을 표지화하고 추적화할 필요성이다. 예를들어, 관심의 대상이 되는 반응이 수천개 반응 그룹중 오직 하나에서 관찰된다면, 연구자는 수천개의 초기 화합물 또는 분자중의 하나가 그 반응을 생성하는지를 결정할 수 있어야 한다.
반응의 동일성을 추적하는 통상적인 한 방법은 고밀도 배열내의 개개 반응 용기에로 각 반응을 물리적으로 분리시키고, 어떤 개개 반응물이 각 용기에서 사용되는지를 기록하는 것이다. 따라서, 예를들어, 관심의 대상이 되는 반응이 1000개중 5의 수로 표지화된 용기에서 관찰될 때, 연구자는 그 용기에서 사용된 반응물을 참조할 수 있고, 용기 5의 기록으로부터 어떤 특정한 반응물이 존재하여 관심의 대상이 되는 반응에 이르게 되었는 지를 알 것이다. 상기 참조된 고밀도 배열의 예는 384-, 864-, 1,536-, 3,456- 및 9,600-웰 마이크로티터 플레이트 용기이고, 마이크로티터 플레이트의 각 웰은 소형 반응 용기를 구성한다. 소형화된 반응 웰은 그들이 공간을 보존하고, 분석에서 사용된 시약의 비용을 감소시키기 때문에 사용한다.
그러나, 화학적 및 생물학적 분석에서 마이크로티터 플레이트 용기의 사용은 다수의 불리한 점을 수반한다. 예를들어, 플레이트의 사용은 모든 반응이 자유롭게 일어나게하고, 종종 보다 편리하게는 한 개의 반응 용기에서 일어나게 허용하는 것 보다는 매우 많은 수의 별개의 반응 용기를 주의깊게 분리하는 것을 요구한다. 또한, 반응 부피가 공간적으로 분리되어야 하는 요구사항은 그와 함께 사용된 마이크로티터 플레이트의 크기에 대한 물리적인 제한, 및 따라서 플레이트상에서 수행될 수 있는 상이한 반응의 수에 물리적인 제한을 수반한다.
마이크로티터 플레이트의 사용에서 상기된 제한의 견지에서, 고-처리량 분석에서 개개 반응을 추적하는 다른 수단을 개발하려는 시도가 있어왔다. 이들 방법은 반응을 공간적으로 분리하는 개념을 포기하고, 대신에 다른 수단에 의해 개개 반응을 추적한다. 예를들어, 지지체로서 미세담체상에서 고-처리량 분석 및 반응을 수행하는 방법이 개발되었다. 각 미세담체는 반응물로서 작용하는 그의 표면에 결합된 하나의 특별한 리간드를 함유할 수 있고, 미세담체는 또한 미세담체를 확인하는 "코드"를 함유할 수 있으며, 그러므로, 표면에 결합된 특별한 리간드를 확인한다. 상기된 이들 방법은 "랜덤 처리(random processing)"를 가능하게 하고, 이는 각각 표면에 결합된 리간드를 갖는 수천개의 독특하게 코드화된 미세담체가 혼합되어 동시에 분석될 수 있다는 것을 의미한다. 부착된 리간드와 표적 분석물사이에 관심의 대상이 되는 유리한 반응을 나타내는 미세 담체는 이어서 그들의 코드가 판독되어져 유리한 반응을 생성하는 리간드의 정체를 확인하게 한다.
상기된 랜덤 처리의 실시는 미세담체 각각을 별개로 정확히 코딩하는 것을 요구하고, 코드의 정확하고, 지속적인 확인을 요구한다. 랜덤 처리를 사용한 분석은 결과에 대해 미세담체를 코딩하는 것에 중대하게 의존하기 때문에, 분석의 질은 미세담체상의 코드의 질 및 판독가능성(readability)에 크게 의존한다. 미세담체를 코드화하는 시도가 여전히 시차 착색화(differential coloring)(Dye-Trak microspheres), 형광 표지(Fluorospheres; Nu-flow), 소위 메모리를 갖는 원격 프로그램가능한 매트리스(IRORI; 미국 특허 제 5,751,629), 탈착할 수 있는 태그, 예를들어 올리고뉴클레오타이드 및 소형 펩타이드(미국 특허 제 5,565,324 호; 미국 특허 제 5,721,099 호; 미국 특허 제 5,789,172 호), 및 트랜스폰더를 수반하는 고체상 입자(미국 특허 제 5,736,332 호)로 제한된다. 상기 인용된 특허들의 개시는 본 명세서에 참고로 인용된다.
미세담체를 코딩하기 위하여 상기 확인된 공지된 방법들은 각각 불리한 점을 수반한다. 예를들어, 크기, 모양, 칼러, 형광 강도, 또는 이들의 조합을 기초로만 해서 구별되는 미세담체는 종종 상응하게 많은 수의 상이한 분자의 시험을 수반하는데 필요한 대량 갯수의 독특한 코드를 만들기에 이들 변수의 충분하고, 독특하며 판독하는 것이 가능한 조합을 제공할 수 없다. 또한, 탈착할 수 있는 태그 또는 형광 마커와 같은 코드로서 작용하는 표면상의 외부 물체(body)를 수반하는 미세담체는 부착된 부위가 분석에서 분석물을 표적화하는 미세담체상의 리간드-결합된 분자의 결합이나 반응을 방해할 위험성이 있다. 유리한 반응을 나타내는 관심의 대상이 되는 미세담체를 분리한 후, 탈착할 수 있는 태그를 갖는 미세담체를 코딩하는 방법은 유리한 반응을 생성하는 미세담체상의 리간드의 정체를 최종적으로 알기위하여 태그를 절단 및 분석하는 추가의 단계를 종종 포함한다. 이 절단 단계는 자연적으로 시험의 결과를 결정하는데에 필요한 시간과 노력을 연장시킨다.
상기의 견지에서, 다르게 동일한 미세담체상의 대량 군에서 단일 미세담체를 확인하는 간단한 방법, 특히 미세담체의 표면에 외부 물체로서 부착될 필요가 없는 다수의 독특한 코드를 코딩하는 방법이 본 분야에서 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 코드로서 작용하는 미세담체의 표면에 외부 물체를 부착시킬 필요가 없이 코딩되는 미세담체를 제공하는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 미세담체상에 쓰여지거나 판독되어질 수 있는 다양한 독특한 코드에 대해 본질적으로 비제한적인 가능성을 제공할 수 있는 미세담체를 코딩하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 코드가 쓰여진 미세담체를 제공하여 이들 목적을 달성한다. 바람직한 미세담체는 표백될 수 있는 물질, 예를들어 형광분자를 함유하는 미세담체이다. 미세담체를 코딩하는 바람직한 방법은 표백될 수 있는 물질을 수반하는 미세담체를 고 공간 해상력 광원에 노출시켜 미세담체상의 코드를 표백하는 것을 포함한다. 이 방법은 바람직하게는 형광 미세담체상의 코드를 표백하는 것을 포함하며, 여기에서, 표백은 코드의 표백된 부분에 동일하거나 다른 수준의 형광 강도를 생성한다. 미세담체를 코딩하는 추가의 바람직한 방법은 미세담체의 내부깊은 곳에 코드를 쓰기(writing)하는 것이다.
또다른 바람직한 구체예에서, 많은 수의 화학적 화합물 또는 생물학적 분자가 본 발명의 상응하게 많은 수의 미세담체에 결합하고, 미세담체-결합된 리간드를 혼합하여 스크리닝 또는 분석 프로토콜에 따라 동시에 반응시키며, 반응하는 리간드는 그들이 결합된 미세담체상의 코드를 판독하여 확인된다.
본 발명의 코드화된 미세구는 단일 샘플 분취량을 사용하는 단일 반응 용기에서 다수의 분석물의 동시적인 분석을 가능하게 한다. 그러므로, 고-처리량 분석 및 반응에서 본 발명의 미세담체의 사용은 통상적인 마이크로티터 플레이트 기술의 사용에 비교해서 훨씬 우수하다.
본 발명의 미세담체는 또한 미세구상에서 쓰여지고 판독될 수 있는 실질적으로 비제한된 수의 코드를 제공하고, 따라서 보다 제한된 수의 코딩 가능성을 수반하는 칼라 또는 형광 태그로 코드화된 공지된 미세담체보다 우수하다. 본 발명의 미세담체는 또한 미세담체의 표면에 부착된 부위로 코드화된 미세담체보다 우수하다. 이는 본 발명의 미세담체상에 쓰는 것이 미세담체상의 표면에서 일어나는 분석물/리간드 상호작용을 잠재적으로 방해하는 공지된 미세담체와 결합된 위험을 수반하지 않기 때문이다.
본 발명의 추가의 특징 및 잇점은 하기에서 기술되고, 부분적으로 이 기술로부터 명백할 것이며, 본 발명의 실시로부터 알 수 있다. 본 발명의 잇점은 상세한 설명 및 청구범위에서 특히 지적된 코드화된 미세담체 및 방법에 의해 실현되고 얻어질 것이다. 본 발명의 상기 일반적인 기술 및 하기의 상세한 설명은 예시적이고 오직 설명적이며, 청구된 본 발명을 제한하지 않는다.
본 출원은 1999년 4월 16일 출원된 미국 가명세서 출원 제 60/129,551 호에 대해 우선권을 주장한다. 가출원의 내용은 본 명세서에 참고로 인용된다.
본 발명은 코드화된 미세담체, 및 보다 특히 그들상에 쓰여진 코드를 갖는 미세담체에 관한 것이다. 본 개시에서 미세담체"상(on)"에 쓰여진 코드에 대한 참조는 미세담체의 표면에 쓰여진 코드 및 미세담체의 내부 깊은 곳에 쓰여진 코드를 포함한다. 본 발명은 또한 미세담체상에 코드를 쓰는 방법, 코드를 판독하는 방법, 및 코드화된 미세담체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 미세담체를 코딩하는 바람직한 방법은 표백할 수 있는 물질을 수반하는 미세담체를 고 공간 해상력 광원(high spatial resolution light source)에 노출시켜 미세담체상의 코드를 표백하는 것을 포함한다. 코드화된 미세 담체는 예를들어, 화학적 및 생물학적 분석 및 합성에서 지지체 물질로서 사용될 수 있다.
도 1은 통상적인 미세광분해 및 SCAMP의 다수의 원리를 예시한다.
도 2a 및 2b는 각 강도가 도면에 나타난 상이한 칼라에 의해 나타내지는, 상이한 강도를 사용한 바 코드 및 환 코드를 예시한다.
도 3a 및 도 3b는 미세구의 표면하 대략 10㎛에서 3㎛의 스트립을 표백전(상부) 및 후(하부)의 FD148-dex-ma 미세구의 중간 평면의 공촛점 영상을 예시한다.
도 4는 148-dex-ma 미세구중의 FD148(A) 및 FITC 용액중의 침지에 의해 FITC가 적재된 dex-ma 미세구중의 FITC(B)의 형광 회수 곡선을 예시한다.
도 5는 SCAMP에 의해 임의의 기하학을 표백시킨후 FD 148-dex-ma 미세구의 중간 평면의 공촛점 영상을 예시한다.
도 6a 및 6b는 바 코드(도 6a) 및 바 코드 플러스 수(도 6b)를 표백하고 1 시간후 45㎛ FITC-표지된 라텍스 비드에서 중간 평면의 공촛점 영상을 예시한다.
도 7은 코드 R1247을 표백하고 1 시간후 45㎛ FITC-표지된 라텍스 비드에서 중간 평면의 공촛점 영상을 예시한다.
도 8은 Ghent University의 로고를 표백하고 1시간후 45㎛ FITC-표지된 라텍스 비드에서 중간 평면의 공촛점 영상을 예시한다.
도 9는 Tibotec 회사의 로고를 표백하고 1시간후 45㎛ FITC-표지된 라텍스 비드에서 중간 평면의 공촛점 영상을 예시한다.
도 10a는 상이한 강도로 표백된 코드의 공촛점 영상을 예시하고, 도 10b 내지 10d는 그래프적으로 코드내의 상이한 강도를 예시한다.
도 11a 및 12a는 상이한 강도로 표백된 코드의 공촛점 영상을 예시하고, 도 11b 및 12b는 그래프적으로 각각의 코드내의 상이한 강도를 예시한다.
한 구체예에서, 본 발명은 그들에 쓰여진 코드를 갖는 미세담체에 관한 것이다. 본 발명의 미세담체는 예를들어 고-처리량 스크리닝 기술 및 진단에서 일상적으로 사용되는 물질로부터 만들어질 수 있다. 예를들어, 미세담체는 고체, 반고체, 또는 고체와 반고체의 배합물로부터 만들어질 수 있다. 이들 물질의 비제한적인 예는 라텍스, 폴리스티렌, 가교결합된 덱스트란, 메틸스티렌, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌, 셀룰로즈, 폴리아크릴아마이드, 및 디메틸아크릴아마이드를 포함한다. 바람직한 물질은 라텍스, 폴리스티렌, 및 가교결합된 덱스트란을 포함한다. 미세담체는 또는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다.
미세담체는 미세담체를 코딩하고 사용하게 하는 어떠한 모양 및 크기일 수 있다. 예를들어, 미세담체는 구의 형태, 또는 반드시 구형은 아닌 비드의 형태일 수있다. 미세담체는 모양이 예를들어 원통형 또는 타원형일 수 있다. 모양이 구형일 때, 미세담체는 예를들어 직경이 1 내지 200㎛일 수있다.
미세담체에 쓰여진 코드는 미세담체상에 쓰여지고 판독되어질 수 있는 어떤 기하학, 설계, 또는 심볼일 수 있다. 예를들어, 코드는 수 또는 문자, 또는 심볼, 그림, 바 코드, 환 코드, 또는 3차원적 코드 형태의 코드로서 쓰여질 수 있다. 환 코드는 직선보다는 동심의 원이 사용되는 것이외에는 바 코드와 유사하다. 한 환은 예를들어 하나의 바와 정보를 함유할 수 있다. 코드는 미세담체의 표면에 또는 미세담체의 내부 표면에 쓰여질 수 있다. 예를들어, 코드는 미세담체의 내부 깊은 곳에, 보다 특히 미세담체의 중앙(center) 평면에 쓰여질 수 있다. 미세담체의 모양에 따라, 중심 평면은 코드를 쓰기위한 바람직한 위치일 수 있는데, 그이유는 중심 평면이 쓰는데 이용될 수 있는 가장 큰 표면적을 제공할 수 있기 때문이다. 또한, 만곡진 표면을 갖는 미세 담체 경우, 만곡진 표면보다는 내부 깊은 곳에 코드를 쓰는 것이 보다 유리할 수 있다. 이는 내부 깊은 곳이 만곡진 표면보다는 편평한 표면에 코드를 쓰고 판독하는 것이 종종 보다 편리할 수 있기 때문이다.
본 발명의 미세담체는 표백될 수 있는 물질을 함유할 수 있고, 미세담체상의 코드가 미세담체의 표백될 수 있는 부분내에 표백된 패턴의 형태일 수 있다. 미세담체는 미세 담체의 표면에 또는 또는 미세담체의 물체내에 표백될 수 있는 물질을 함유할 수 있다. 본 출원에서 미세담체"상"의 물질을 표백하는 것에 대한 참조는 미세담체 표면에서의 표백 및 미세담체의 내부 표면에서의 표백을 포함한다. 바람직한 표백될 수 있는 물질은 표백될 수 있는 형광 또는 전자기 방사 흡수 물질을 포함한다. 미세담체는 표백될 수 있는 발광체(luminophores)를 함유할 수 있다. 사용될 수 있는 발광체의 예는 형광체, 인광체(phosphorescers), 또는 신틸레이터를 포함한다. 표백될 수 있는 화학적발광(chemiluminescent). 생물학적발광, 또는 착색된 물질이 사용될 수 있다. 표백될 수 있는 물질은 보다특히 플루어레신 이소티오시아네이트("FITC"), 피코에리트린, 쿠마린, 루시퍼 옐로우, 및 로다민일 수 있다. 표백될 수 있는 물질은, 표백이 일어날 때, 코드가 미세담체의 사용에 요구되고 코드를 판독하는데에 필요한 시간동안 미세담체상에 남아있도록 선택되어야한다. 따라서, 표면된 지역으로의 비표백된 분자의 특정량의 확산이 코드의 사용 수명이 보존되는 한 허용될 수 있다.
미세담체상에서 표백된 코드는 또한 미세담체의 표백된 지역내에서 상이한 강도의 형광 또는 칼라를 갖도록 쓰여질 수 있다. 예를들어, 표백된 코딩은 수개의 다른 표백 정도를 함유할 수 있어, 전체로서 표백된 지역내에서 수개의 상이한 형광 강도를 갖는다. 따라서, 미세담체는 미세담체상의 표백된 패턴의 기하학에 의해서 뿐만아니라 패턴내의 상이한 형광 강도의 사용에 의해 코딩될 수 있다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 미세담체상에 코드를 쓰는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 미세담체의 표면에 또는 미세담체의 내부 표면에 코드를 쓰는데 사용될 수 있다. 코드는 고 공간 해상력 광원, 예를들어 레이저, 램프, 또는 X-선, α 및 β선, 이온 빔을 방출하는 공급원, 또는 어떤 형태의 전자기 방사선을 사용하여 미세담체상에 쓰여질 수 있다. 코드는 또한 포토크로밍(photochroming) 또는 화학적 에칭을 통해 미세담체상에 쓰여질 수 있다. 코드를 쓰기위한 바람직한 방법은 고 공간 해상력 광원, 및 특히 공촛점의 현미경과 조합하여 레이저 또는 램프의 사용을 통해서이다. 코드를 쓰는 또다른 바람직한 방법은 담체상의 표백될 수 있는 물질안의 코드를 표백시키는 것이다. 이 방법에서 바람직한 표백될 수 있는 물질은 미세담체의 기술에서 상기 확인된 물질을 포함하고, 형광 분자를 포함한다. 미세담체안에서 표백될 수 있는 물질의 부피와 관련하여, 이러한 부피의 한 예는 미세담체의 1 입방 나노미터 내지 8 입방 밀리미터이다.
미세담체상에 코드를 쓰는 하나의 바람직한 방법은 스캐닝미세광분해(scanning microphotolysis)("SCAMP")의 사용을 통해서이다. SCAMP의 기술적인 특징은 제일먼저 P. Wedekind et al., "Scanning microphotolysis: a new photobleaching technique based on fast intensity modulation of a scanned laser beam and confocal imaging," Journal of Microscopy, vol. 176, pp. 22-32(1994)(이의 내용이 본 명에서에 참고로 인용됨)에 기술되었다. 상기 논문은 매니큐의 얇은 형광층안의 패턴을 표백하고 시각화하기 위해 SCAMP를 사용하는 것을 개시하고 있다. 이 논문은 미세담체를 코딩하기 위하여 SCAMP를 사용하는 것을 제안하고 있지 않다.
본 발명자들은 미세담체안의 형광 분자를 표백하여 미세담체상에 코드를 쓰기위하여 SCAMP를 사용하였다. 광표백은 소정의 색소에 비추었을 때, 특정 파장의 빛이 색소분자가 공진하여 결국에는 파괴하게 한다는 사실에 기인하여 칼러의 희미해지는 것과 관련된 잘 알려진 광현상이다. 이는 또한 형광 분자가 특정 파장의 강력한 레이저 빔으로 여기되었을 때 종종 표백되는 이유이다.
수년간 광표백후 형광 회수("FRAP")하고 또한 불리는 형광 미세광분해("MP") 기술이 세포 및 조직과 같은 생물학적 매체, 및 비생물학적 매체에서 형광 분자의 운동성을 연구하는데 사용하였다. Peters and Scholtz, "Fluorescence photobleaching techniques," in New Techniques of Optical Microscopy and Microspectroscopy, R. J. Cherry(ed.), MacMillan, New York, pp. 199-228(1991); De Smedt et al., "Structual Information on Hyaluroniic Acid Solution as Studied by Probe Diffusion Experiments," Macromolecules, vol. 27, pp. 141-146(1994); De Smedt et al., "Diffusion of Macromolecules in Dextran Methacrylate Solutions and Gels as Studied by Confocal Scanning Laser Microscopy," Macromolecules vol.30, pp. 4863-4870(1997).
형광 분자의 운동성은 특히 레이저 빔일 수 있는 광 빔의 촛점 지역에서 움직이는 형광분자를 표백(광분해)하여 측정할 수 있다(도 1:A, B). 짧은 표백 과정후 즉시, 전형적으로 약 10 밀리초후, 매우 약화된 레이저 빔이 주변 비표백화 지역으로부터 표백된 지역으로의 형광분자의 확산에 기인하여 광표백된 지역에서의 형광의 회수를 측정한다(도 1:B,C). 특징적인 확산 시간, 확산 계수에 대한 측정, 및 각각 비운동성 및 운동성 형광 분자의 분획이 표백된 지역에서의 형광 회수로부터 유도될 수 있다(도 1:D).
운동성 분획, R은 다음과 같이 정의된다:
여기에서, F(i)는 표백전에 표백 반점(bleach spot)의 형광 강도이고, F(0)는 표백 직후 표백 반점의 강도이며, F(∞)는 표백하고 오랜 시간후 표백 반점의 형광 강도이다.
통상적인 (비-스캐닝) 광 현미경을 사용한 광 표백 실험에서, 정지(레이저) 광 빔을 표백 과정 및 회수기간 동안 샘플에 촛점을 맞추었다. 표백 과정동안 (레이저) 광 빔의 정지 위치는 원형 기하학의 광표백된 지역을 만들었다. 비-스캐닝 광 현미경은 기술적으로 직경 2㎛이하의 조사된 지역을 만들지만, 표백 반점의 확대가 종종 정지 레이저 빔에 기인하여 일어난다. 이는 도 1:B-II에 도식적으로 예시된 바와 같이 전형적으로 직경이 10 ㎛-20㎛ 또는 보다 큰 원형의 표백된 반점을 만든다.
레이저 광 스캐닝 현미경의 이용성은 미세광분해 방법에 대해 새로운 기회를 열었다. 광분해, 빔 스캐닝, 및 공촛점 현미경 사용의 조합은 SCAMP의 발달을 가져왔다. SCAMP에서, 표백은 아쿠오스토-광학 모듈레이터(acousto-optical modulator,"AOM")과 같은 강도 변조 장치를 사용하여 마이크로초 미만에서 저 모니터링 및 고 광표백 레이저 강도 수준사이를 스위칭하여 샘플을 스캐닝하는 동안 일어난다. 스캐닝동안 표백 및 AOM의 사용(이는 매우 짧은 표백 펄스를 생성한다)의 조합은 보다 긴 광표백 시간 및 정지 레이저 빔에 기인하여 통상적인 미세광분해에서 일어나는 표백 반점의 확대를 방지한다. SCAMP는 샘플에서 반점을 마이크로미터미만으로 표백하는 것을 가능하게 한다.
도 1 은 SCAMP가 형광분자의 운동성을 측정하기 위하여 어떻게 진행되는지를 도식적으로 예시한다. 먼저, 샘플중의 관심의 대상이 되는 평면의 x-라인에 따른 형광을 이 라인을 스캐닝하여 측정한다(도 1: A-점선). 두 번째로, 확산이 조사되어야 하는 이 x-라인상의 작은 세그먼트(예를들어 3 ㎛)를 선택하여 표백시킨다(도 1:B-I). 세그먼트의 길이, 위치, 및 수는 SCAMP 소프트웨어에 의해 자유로이 선택할 수 있다. 이 세그먼트의 광 표백은 레이저 빔의 강도에서의 일시적인 강한 증가가 수반되어 레이저 빔이 이 세그먼트위에서 스캐닝할 때에 일어난다. 전형적으로, 레이저 빔의 광표백과 모니터링의 강도 수준사이의 비는 100보다 크다.
SCAMP가 공촛점 현미경을 사용하기 때문에, 형광 검출이 샘플의 표면뿐만아니라 종의 촛점밖의 수준으로부터 산란된 조사(통상적인 현미경에서 만나는 바와같이)에 의한 방해가 거의 없이 샘플의 표면에서 뿐만아니라 임의의 깊은 곳에서 허용된다. 대조적으로, 조사(illumination)용 형광 램프 및 통상적인(비-촛점) 현미경이 사용되었을 때, 비드의 표면만이 전형적으로 관찰된다. 그러므로, 내부 깊은 곳에서의 코딩은 보통의 현미경으로 관찰하기가 어려우나 공촛점 광학기기로는 잘 볼 수 있게 된다. 현미경의 공촛점 스캐닝 특징은 미세담체안의 잘-한정된 위치에서 광분해 및 미세영역을 판독하는 것을 가능하게 한다. 본 발명은 예를들어 SCAMP의 고 공간 해상력의 사용이 특정한 깊은 곳에서 안의 미세구를 비가역적으로 표시하고, 공촛점 기술에 의해 그 코딩을 판독할 수 있다는 점에서 지금까지 기술된 모든 다른 적용과 분명히 구별된다.
미세담체에 코드를 쓰기위한 본 발명의 방법은 또한 미세담체를 표백하여 코드안에 표백된 물질중의 강도의 상이한 수준을 생성한다. 정보를 코드 자체의 설계에 전하는 외에 표백된 패턴내의 상이한 강도에 의해 또한 전할 수 있다. 상이한 강도로 미세담체를 코딩하는 능력은 미세담체안에 보다 작은 코드를 허용하여, 따라서 공간을 절약하고, 그러나 여전히 미세담체를 코드화하는데에 동일한 수 또는 그이상의 독특한 정체제(identifiers)를 전한다. 예를들어, 본 발명에 따르면, 비드안에 4개의 상이한 강도를 표백하는 것이 가능하다. 이는 다수의 방법, 예를들어 다른 것에 비해 비드의 일부 부위에 대해 반복된 표백을 하거나, AOM에 상이한 수준의 음향력을 흩트려 코드의 각 부분에 사용된 레이저 광의 파워에 기초하여상이한 강도를 갖는 표백된 패턴을 만드는 다수의 상이한 레이저 파워를 생성하여 달성될 수 있다. 도 2a 및 2b는 상이한 강도를 사용하여 표백된 2개 코드의 예이며, 하나는 바 패턴이고, 다른 하나는 환 패턴이다. 코드에서의 상이한 강도는 도면에서의 상이한 색에 의해 나타낸진다. 강도의 상이한 수준은 바 코드에서의 바와 같은 상이한 폭의 코딩 요소와 또한 조합될 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예는 본 발명의 코드화된 미세구상의 코드를 판독하는 것에 관계한다. 코드의 판독은 코드가 미세담체상의 표면에 있든가, 미세담체가 미세담체의 내부 깊은 곳에서 충분히 투명하면, 보통의 현미경으로 수행될 수 있다. 코드를 판독하는 것은 또한 공촛점 현미경을 사용하여 수행될 수 있다. 특히, 코드는 미세담체를 수성 환경에 현탁시키고, 미세담체를 두 개의 유리 슬라이드사이에 위치시키거나, 미세모세관에 위치시키며, 현미경 또는 공촛점 현미경을 통해 코드를 관찰하여 판독할 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예는 본 발명의 코드화된 미세구를 사용하는 방법에 관한 것이다. 미세담체는 약물 발견, 수용체 결합 분석, 치료, 의학적 진단, 조합 화학, 표적 분자의 분리 및 정제, 분석학적 목적을 위해 거대 분자의 포획 및 검출, 오염물의 선택적 제거, 효소 분석, 화학적 변형, 혼성화 반응 및 토론상의 적용을 위해 생물분자 상호작용의 측정을 위한 지지체로서 사용될 수 있다.
미세담체는 바람직하게는 화학적 및 생물학적 분석 및 합성을 위한 지지체로서 작용할 수 있다. 이 능력에서, 미세담체는 미세담체의 표면에 결합된 하나이상의 리간드를 함유할 수 있다. 리간드-결합된 미세담체는 이어서 표적 분석물과 접촉하여 관심의 대상이 되는 특별한 분석물의 존재 또는 부재를 결정할 수 있거나, 미세담체-결합된 리간드상에서 수행된 조합적인 화학 반응에 대한 지지체로서 작용할 수 있다. 미세담체-결합된 리간드에 대한 표적 분석물의 예는 항원, 항체, 수용체, 합텐, 효소, 단백질, 펩타이드, 핵산, 약제, 호르몬, 병원체, 독소, 또는 관심의 대상이 되는 다른 화학물질, 또는 분자를 포함한다. 미세담체-결합된 리간드가 표적 분석물과 결합하거나 반응하는지는 결정을 위한 분야에서 사용된 통상적인 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를들어, 반응은 루미노메트릭(luminometric) 반응에 의해 나타내질 수 있다. 반응은 열량분석, 화학발광분석, 또는 형광분석 반응에의해 나타내질 수 있다. 관심의 대상이 되는 미세담체에 결합된 리간드는 표적이되는 관심사항의 분석물의 존재하에서 미세구의 광학적 신호가 변하도록 설계될 수 있다. 예를들어, 광학적 신호에서 그러한 변화는 결합 또는 반응이 리간드와 분석물사이에 일어날 때 일어나는 광화학적 반응의 결과일 수 있다. 이때, 미세담체는 광화학적 반응과 결합된 형광을 검출하는 현미경하에서 관찰될 수 있다.
광범위한 화학적 및 생물학적 기능 그룹이 본 발명의 미세담체에 대한 리간드로서 부착될 수 있다. 이들 기능 그룹은 고-처리량 스크리닝 기술 및 진단에서 일상적으로 사용되는 모든 기능 그룹을 포함한다. 리간드는 공유결합에 의해 및 직접적인 부착 또는 링커를 통한 부착을 포함하여 일반적으로 미세담체에 리간드를 부착시키는데에 통상적으로 사용되는 수단에 의해 미세담체에 부착시킬 수 있다. 또한, 미세담체는 초기 반응물의 부착을 허용하는 다양한 방법으로 기능화될 수 있다.
본 발명의 미세담체는 샘플중의 하나이상의 표적 분석물의 존재 또는 부재를 검출하는 방법에서 사용될 수있으며, 이는 미세담체-결합된 리간드를 적어도 하나의 분석물과 접촉시키고, 분석물이 리간드와 반응하거나 결합하는지를 검출하며, 어떤 반응 또는 결합이 일어났을 때, 미세담체의 코드를 판독하는 것을 포함한다.
보다 특히, 본 발명은 샘플중의 하나이상의 표적 분석물의 존재 또는 부재를 검출하는 방법에 관한 것으로, 이는 하나이상의 분석물과 결합하거나 반응하는 하나이상의 리간드를 선택하고, 리간드를 본 발명의 다수의 미세담체와 결합시키며, 리간드의 정체(identity)을 리간드가 결합된 미세담체상의 코드와 상호관련시키며, 하나이상의 분석물을 리간드-결합된 미세담체와 접촉시키며, 분석물이 미세담체 결함된 리간드와 결합하거나 반응하는 미세담체를 관찰하고, 하나이상의 분석물이 반응하는 리간드를 확인하기 위하여 미세담체상의 코드를 판독하며, 이에의해 하나이상의 분석물의 존재 또는 부재를 결정하는 것을 포함한다.
상기 방법의 바람직한 구체예는 표적 분석물이 핵산, 특히 DNA 또 RNA인 경우이며, 여기에서, 적어도 하나의 미세담체-결합된 리간드는 핵산의 역 상보물이다. 따라서 본 발명의 미세담체는 DNA 혼성화에서 유용하다. 미세담체는 또한 효소-기초 분석 및 면역분석에서 또한 유용하다. 미세담체는 또한 샘플중의 특정 화합물을 스크리닝하기위해 수행되는 분석, 및 이들 샘플로부터 화합물을 검출 및 분리하는데에 사용될 수 있다. 미세담체는 또한 조합 화학 라이브러리의 구성원을 만들거나 반응시키기 위한 지지체로서 사용될 수 있다.
본 발명의 미세담체는 또한 많은 수의 성분을 효율적으로 및 급속히 스크리닝하는데에 이용되는 방법 및 장치에서 사용될 수 있으며, 여기에서, 두 개 성분사이에 상호작용이 일어남을 결정하는데에 흥미가 있는 경우, 다양성이 미세담체에 결합된 리간드 또는 가용성 분석물 성분의 어느 하나 또는 두 개에 있을 수 있다. 장치는 예를들어 결합된 리간드가 예정된 레지스트리(restry)로 위치하는 고체 지지체와 같은 미세배열 및 성분들사이의 상호작용을 검출하기 판독기(reader)를 포함한다. 방법은 예를들어 리간드의 부착을 위한 고체 지지체와 같은 미세배열을 제조하고, 리간드와 분석물을 합하여 성분들사이의 상호작용을 수행하고, 이어서 성분과 특별한 부위 사이의 상호작용의 존재를 결정하는 것을 포함할 수 있다.
미세배열은 보통 다수의 상이한 성분들을 포함한다. 이론상으로는 오직 한 성분이 필요하나, 105개와 같이 많을 수 있다. 성분들의 수는 보통 105개를 초과하지 않는 한편, 개개의 코드화된 미세담체의 수는 실질적으로 보다 클 수 있다.
결합된 리간드는 예를들어 유기체, 예를들어 단일 분자 또는 분자의 집합물, 리간드 및 수용체, 핵산 결합 성분, RNA, 단일 가닥 및 이중 가닥 결합 단백질일 수 있으며, 이는 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 단백질에 결합된 결합 리간드일 것을 요구하지 않는다.
미세배열에서 코드화된 미세담체는 트랙(tracks) 으로 배열될 수 있다. 헤더(headers)가 한정 부위에 제공되어, 특별한 상호작용이 빠르게 검출될 수 있다. 특히, 디스크가 트랙상에 헤더 한정 부위를 갖는 원형 트랙을 가져 양성 시그날이 헤더에 의해 제공되는 정보와 관련하여 해석될 수 있다. 원형 트랙은 바람직하게는 동심이고, 5 내지 5000㎛ 범위의 단면을 갖는다. 분석용 디스크에 부착될 수있는 예비-제조된 세그먼트와 같은 다양한 변형이 가능하다.
본 발명은 본 분야에 숙련된자에게 본 발명의 실시 방법을 추가로 교시하는 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 하기 실시예는 단지 본발명을 예시하는 것이고, 본 발명의 특정 구체예의 다양한 이로운 성질을 개시한다. 하기 실시예는 청구된 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
실시예 1
dex-ma 미세구를 제조하는데에 사용되는 덱스트란-메타크릴레이트("dex-ma")는 W.N.E. van Dijk-Wolthius et al, "Reaction of Dextran with Glycidyl Methacrylate: An Unexpected Transesterification, "Macromolecules, vol. 30, pp. 3411 to 3413(1997)(이의 개시는 본 명세서에 참고로 인용됨)에 상세히 기술된 바와 같이 합성되고 특징화되었다. Dex ma 미세구는 dex-ma/폴리에틸렌글리콜(PEG) 유제로부터, N,N,N',N'-테트라메틸렌-에틸렌디아민 및 포타슘 퍼설페이트를 사용하여, 라디칼 중합화에 의해 제조하였다. Stenekes et al., "The Preparation of Dextran Microspheres in All-Aqueous System: Effect of the Formulation Parameters on Particle Characteristics,"Pharmaceutical Research, vol. 15, pp. 557-561(1998)(이의 개시는 본 명세서에 참고로 인용됨)을 참조. dex-ma 용액(pH 7의 포스페이트 버퍼중에서)의 농도는 10%(w/w)이다. 100 글리코피라노실 유니트당 메타크릴레이트 분자의 수인 dex-ma의 치환도는 4이었다. pH 7의 포스페이트 버퍼중의 PEG 용액의 농도는 24%w/w이었고, PEG의 평균 분자량은 10,000 g/mol이었다(Merck). 한 배치의미세구(FD148-dex-ma 미세구)를 플루어레신 이소시아네이트 표지된 덱스트란(148.000 g/mol의 분자량을 가짐)의 존재하에서 제조하였다. 두 번째 배치의 미세구에 제조 완료후 dex-ma 미세구를 FITC 용액(pH 7.2의 포스페이트 버퍼중의 0.01mg/ml)용액에 침지하여 플루어레신 이소시아네이트("FITC")를 적재하였다. FD148 및 FITC를 Sigma로부터 입수하였다. SCAMP 실험을 실시예 2에서 설명되는 바와 같이 양 미세구 배치에 수행하였다.
실시예 2
SCAMP를 Wedekind et al., "Scanning microphotolysis: a new photobleaching technique based on fast intensity modulation of a scanned laser beam and confocal imaging,"Journal of Microscopy, vol. 176, pp. 23-32(1994) 및 Wedekind et al., "Line-Scanning Microphotolysis for Diffraction-Limited Measurements of Lateral Diffusion, "Biophysical Journal, vol. 71, pp. 1621-1632(1996)(이의 개시는 본 명세서에 참고로 인용됨)의 작업에 따라 Bio-Rad MRC1024 공촛점 레이저 스캐닝 현미경("CLSM")에 설치하였다. 극도로 짧은 광표백 시간동안 충분한 광 표백을 얻기위하여 사용된 40x 오일 침지 대물렌즈(objective)및 강력 2 W(최대 가능 출력을 나타냄) 아르곤 레이저(Spectra Physics 2017)를 실시예 1에 따라 만들어진 dex-ma 미세구상에 대한 SCAMP실험에서 사용하였다. 또한 표백동안 레이저 빔의 파장은 488 nm이었다.
본 실시예에서, SCAMP 실험을 dex-ma 미세구의 표면아래 대략 10㎛에서 수행하였다. 이는 다음과 같이 실험적으로 일어났다. 먼저 dex-ma 미세구의 중간 평면의 하나의 x-라인을 따른 형광을 이 라인을 400 밀리초로 스캐닝하여 측정하였다(도 1A:-점선). 두 번째로, 이 x-라인상의 3㎛ 세그먼트를 선택하여 표백하였다(도 1:B-I). 세그먼트의 길이, 위치 및 수는 SCAMP 소프트웨어에 의해 자유롭게 선택할 수 있다. 이 세그먼트의 광표백이 레이저 빔의 강도에 있어서의 일시적인 강한 증가가 수반되어 레이저 빔이 이 세그먼트 위로 스캐닝할 때에 일어난다. 레이저 빔의 모니터링 및 광표백 강도 수준사이의 비는 1:500이다. 표백된 스트라이프에서 형광 회수를 측정하기 위하여, 매우 약화된 레이저 빔이 대략 4 초동안 선택된 x-라인을 따라 스캐닝하였다.
도 3a 및 3b는 3㎛ 세그먼트를 표백하기전 및 하고 2분후 각각 FD-148-dex-ma 미세구안의 중간 평면의 공촛점 영상을 보여준다. 미세구의 직경은 대략 25㎛이다. 후자 영상은 2분후 어떤 형광 회수도 미세구의 표백된 지역에서 일어나지 않음을 나타내면서 표백 반점이 검게 남아있음을 보여준다. 도 4(곡선 A)는 이 실험의 표백된 세그먼트에서의 형광이 회수되지 않음을 나타내어, 이로써, 본 발명인들은 실험의 시간 크기내에 "큰" FD148쇄가 조사중인 dex-ma 미세구의 지역에 완전히 고정화되었다는 결론을 내렸다.
FD148 쇄는 미세구의 형성동안 존재하는데로 dex-ma 중합체 네트웍안에 입체적으로 포획될 수 있는 한편, 이는 완전히 중합화된 dex-ma 구가 FITC 용액에 침지되어 dex-ma 미세구에 적재되었을 때 소형 FITC 분자경우에는 일어날 수 없다. 이 경우에, 완전한 형광 회수가 기대되고, 실험적으로 확인되었다. 도 4(곡선 B)는 미세구 표면 10㎛하 주위에 위치하는 FITC 분자가 이동성으로 남아있음을 보여준다.
샘플중의 조그만 세그먼트를 광표백하는 기술적 능력외에도, 스캐닝 현미경을 사용하는 것은 레이저 빔이 국소적으로 위치함에 따라 표백이 일어나야 하는 샘플중의 미소지역을 특이적으로 선택한다. 더구나, 세그먼트의 길이, 위치 및 수가 SCAMP 실험에서 자유로이 선택될 수 있기 때문에, 샘플중의 어떤 기하학 종류도 광표백될 수 있다. 도 5는 미세구에서 십자형, 원형 및 직사각형을 표백하고 2 분후, FD148-dex-ma 미세구의 중간 평면의 공촛점 영상을 보여준다.
실시예 3
SCAMP 실험을 또한 PolylaB in Antwerp, Belgium에서 구입한 45㎛ FITC 표지된 라텍스 비드에서 수행하였다. SCAMP를 Wedekind et al.(1994) 및 Wedekind et al.(1996)의 작업에 따라 Bio-Rad MRC1024 CSLM상에 설치하였다. 극도로 짧은 광표백 시간동안 충분한 광표백을 얻기위하여 사용된 100x 대물렌즈(objective) 및 강력한 아르곤 레이저(Spectra Physics 2017)(Spectra Physics 2017)를 45㎛ FITC 표지된 라텍스 비드상의 SCAMP 실험에서 사용하였다. Spectra Physics 레이저의 강도는 300 mW로 설정하고, 이는 각각 75 W 및 20 mW(레이저 빔을 공촛점 스캐닝 레이저 현미경에 내보내는 광섬유의 말단에서 측정함)의 모니터링 및 광표백 레이저 강도를 생성했다. 결과적으로, 모니터링 및 광표백 레이저 강도사이의 비는 1:266이었다. 또한, 표백동안 레이저 빔의 파장은 488 nm이었다.
SCAMP측정을 45㎛ FITC 표지된 라텍스 비드의 중간 평면에서 수행하였다. 이는 다음과 같이 일어났다. 먼저, 영상을 라텍스 비드가 픽처를 완전히 덮을 때까지 확대했다. 두 번째로, 관심의 대상이 되는 표지를 한정하고, SCAMP 소프트웨어에 의해 표지를 라텍스 비드상에 표백되어야 하는 곳에 나타냈다. 표지화가 레이저 빔이 45㎛ FITC 표지된 라텍스 비드의 중간 평면위로 스캐닝할 때 일어났다. 레이저 빔의 강도에서의 일시적인 강한 증가가(75W로부터 20 mW로) 레이저 빔이 관심의 대상이 되는 표지를 만들기 위하여 표백되어야 하는 세그먼트위로 스캐닝할 때 일어났다. 스캔이 "x-라인"당 6 ms이고(도 1A), 공촛점 평면의 한 상(즉, 라텍스 비드의 중간 평면)이 512 "x-라인"으로 구성될 때, 라텍스 비드를 표지화하는데에 3.072 초가 소요되었다.
도 6 내지 9는 바 코드(도 6a), 바 코드 더하기 수(도 6b), 수 R1247(도 7), Ghent University의 로고(도 8) 및 Tibotec 회사의 로고(도 9)를 표백하고 1시간후 45㎛ FITC 표지된 라텍스 비드내의 중간 평면의 공촛점 영상을 보여준다. 영상은 어떤 유의적인 형광 회수가 라텍스 비드의 표백화된 세그먼트에서 일어나지 않음을 나타내면서 표백된 세그먼트가 검게 남아있음을 보여준다.
Bio-Rad MRC1024 공촛점 스캐닝 레이저 현미경의 확대 옵션 값이 다음과 같다: 도 6a에서 1.61, 도 6b에서 1.00, 도 7에서 3.07, 도 8에서 1.00 및 도 9에서 1.00. 표지를 표백하는 SCAMP의 고 공간 해상력이 도 6a 및 도 6b에서 관찰된다. 도 6a에서 표지는 3개의 상이한 라인 형으로 구성된다: 하나는 큰 폭(2.5㎛), 하나는 중간 폭(1.25㎛) 및 하나는 소 폭(0.62㎛). 모든 라인은 서로로부터 1.25㎛에 위치한다.
실시예 4
하기 실험은 형광 미세담체안의 코드를 표백하는 방법을 예시하고, 여기에서, 코드는 상이한 표백 정도 때문에 상이한 수준의 강도를 함유한다. 하기 실험에에서 사용된 미세담체는 PolylaB in Antwerp, Belgium으로부터 구입한 45㎛ FITC 표지된 라텍스 비드이었다.
표백 실험의 한 세트 경우, 60x 확대 및 300 mW 레이저 파워를 도 10a에 나타난 패턴을 생성하기 위해서 사용하였다. 도면의 상부줄의 정사각형은 소프트웨어에서 32 화소의 폭(=2.46 ㎛)을 갖고, 또다른 32개 화소로 분리된다. 표백은 실제 그들을 확장시켰다. 도면의 하부줄의 정사각형은 상기 크기의 반이다.
도 10a에 나타난 바와같이, 수개 강도의 표백화가 가능하다. 예를들어, 200 아날로그 대 디지탈 유니트("ADU")의 플래토-수준을 가정할 때, 적어도 대략 50 내지 200 ADU의 수준으로 표백이 가능하다. 그러므로, 본래의 형광 강도의 약 25% 간격에 걸친 수준으로 표백화가 이뤄질 수 있다. 도 10 a의 사진은 예를들어 6개 수준의 표준화가 특정하게 가능하다는 것을 나타낸다. 이들 6개 수준의 표백화는 도 10a의 상부줄에서 표백화된 6개의 정사각형으로부터 명백하다. 이들 정사각형의 형광 강도가 도 10c의 그래프에 나타난다. 상이한 형광 강도의 6개의 정사각형이 반복된 표백화(1 내지 6 회)에 의해 얻어졌다. 6개의 상이한 수준의 형광 광도를 갖는 6개의 코딩 부위를 사용하여 66, 또는 46656 개의 상이한 코드가 얻어진다.
도 10a에 나타내진 일련의 10개의 소형 표백화된 정사각형이 반복된 스캐닝에 의한 표백화가 선형이 아님을 분명히 밝힌다. 이들 정사각형은 폭이 이전의 것의 오직 반이지만 분명히 구별될 수 있게 남아있다. 이들 표시에 대한 강도 수준이 도 10d의 그래프에 나타나 있다. 마지막으로, 6개 및 10개 코딩 부위의 두줄사이의 단일 표백 반점의 강도가 도 10b에 나타나 있다.
제 2 실험이 8개 코딩 부위(1 바의 소프트웨어 폭=24 픽스 x 0.069 ㎛/픽스=1.66㎛; 또다른 24 화소에 의해 분리된)와 8개의 상이한 강도(88=16777216개의 상이한 코드가 가능)로 코드를 효과적으로 표백하기 위하여 수행되었다. 레이저 출력은 200 mW이도록 선택되었다. 이 실험의 미세담체의 사진이 도 11a에 예시되고, 개개 코드의 상이한 강도 수준을 나타내는 그래프가 도 11b에 나타나 있다. 상이한 강도를 분명히 볼 수 있다. 도 11a의 이 코드는 숫자 1 5 2 6 3 7 4 8이다.
도 12a 및 도 12b는 8개의 상이한 강도를 갖는 8개의 코딩 부위의 또다른 예를 예시한다. 이 경우에, 이전 경우에서와 같은 200 mW대신에 250 mW로 수행하고, 0.056 mm/픽스를 사용하여 수행하였다. 본 실시에에서 코드는 1 3 2 6 5 8 7 4이었다. 코드의 사진, 및 코드의 상이한 강도의 그래프가 각각 도 12a 및 12b에 나타나 있다.
본 발명의 다른 구체예가 명세서 및 본 명세서에 개시된 실시로부터 본 분야에 숙련된자에게 명백할 것이다. 명세서 및 실시예는 단지 예시적이며, 본 발명의 진정한 범위 및 취지는 하기 청구범위에 의해 나타내진다.

Claims (26)

  1. 미세담체가 미세담체상에 쓰여진 코드에 의해 코드화됨을 특징으로 하는 코드화된 미세담체.
  2. 제 1 항에 있어서, 코드가 미세담체의 내부 깊은 곳에 쓰여진 것을 특징으로 하는 코드화된 미세담체.
  3. 제 2 항에 있어서, 코드가 미세담체의 중심 평면(center plane)에 쓰여진 것을 특징으로 하는 코드화된 미세담체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서, 미세담체가 미세구인 것을 특징으로 하는 코드화된 미세담체.
  5. 제 3 항에 있어서, 미세담체가 1 내지 200㎛의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 코드화된 미세담체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서, 코드가 미세담체를 고 공간 해상력 광원에 노출시켜 쓰여진 것을 특징으로 하는 코드화된 미세담체.
  7. 미세담체상에 코드를 쓰는 것을 포함하는 미세담체를 코딩하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 코드를 미세 담체의 내부 깊은 곳에 쓰는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 코드를 미세담체의 중심 평면에 쓰는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 7 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 있어서, 미세담체가 미세구인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 미세구가 1 내지 200㎛의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 7 항 내지 제 11 항중 어느 한 항에 있어서, 미세담체를 고 공간 해상력 광원에 노출시켜 미세담체상에 코드를 쓰는 것을 포함하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 광원이 레이저 또는 램프인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 미세담체를 표백하여 코드를 미세담체상에 쓰는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 미세담체가 형광 분자를 포함하는 것을 특징으로 하고, 또한 형광 분자를 표백하여 코드를 쓰는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 코드의 표백된 부분에 두 개이상의 상이한 수준의 결과적인 형광 강도를 생성하도록 형광 분자를 표백하여 코드를 쓰는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 7 항 내지 제 16 항중 어느 한 항에 있어서, 미세담체가 고체, 반고체, 및 고체와 반고체의 배합물로 구성되는 그룹으로부터 선택된 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 7 항 내지 제 17 항중 어느 한 항에 있어서, 미세담체가 원핵 또는 진핵세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 공촛점 현미경으로 코드를 관찰하는 것을 포함하는 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 따른 코드화된 미세담체를 판독하는 방법.
  20. 하나이상의 분석물과 결합하거나 반응하는 하나이상의 리간드를 선택하고, 리간드를 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 따른 복수의 코드화된 미세담체와 결합시키며, 리간드의 정체를 리간드가 결합한 미세담체상의 코드와 상호관련시키고, 하나이상의 분석물을 리간드-결합된 미세담체와 접촉시키며, 분석물이 미세담체-결합된 리간드와 결합하거나 반응한 어느 미세담체를 관찰하고, 미세담체상의 코드를 판독하여 하나이상의 분석물이 반응한 어느 리간드를 확인하여, 하나이상의 분석물의 존재 또는 부재를 결정하는 것을 포함하는, 샘플중의 하나이상의 표적 분석물의 존재 또는 부재를 검출하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 표적 분석물이 핵산인 것을 특징으로 하고, 또한 적어도 하나의 미세담체-결합된 리간드가 핵산의 역 상보물인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, DNA 혼성화를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  23. 미세담체가 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 따른 코드화된 미세담체인 미세담체-결합된 리간드를 적어도 하나의 분석물과 접촉시키고, 분석물이 리간드와 반응하거나 결합하는지를 검출하며, 어떤 반응 또는 결합이 일어난 어느 미세담체의 코드를 판독하는 것을 포함하는, 샘플중의 하나이상의 표적 분석물의 존재 또는 부재를 검출하는 방법.
  24. 미세담체에 결합된 리간드를 갖는 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 따른 코드화된 미세담체를 포함하는, 리간드-결합된 미세담체.
  25. 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 따른 코드화된 다수의 미세담체에 결합된 화학적 라이브러리의 개개 구성원을 포함하는, 화학적 라이브러리.
  26. 제 25 항에 있어서, 라이브러리가 조합적인 화학적 라이브러리인 것을 특징으로 하는 화학적 라이브러리.
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