KR20020013519A - 보편적 및/또는 축퇴성 염기를 포함하는 안티센스올리고뉴클레오티드 - Google Patents

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Abstract

하나 이상의 축퇴성 및/또는 보편적 염기 및 하나 이상의 변형된 백본 링키지를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 표적 RNA 분자 절단에의 그 이용.

Description

보편적 및/또는 축퇴성 염기를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드{Antisense Oligonucleotides Comprising Universal and/or Degenerate Bases}
안티센스 기술은 표적 RNA에 결합하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 유전자 발현을 조절할 수 있다는 발견에 기초하는 것이다. 왓슨-크릭 염기 쌍형성 및 DNA/RNA 하이브리드에서 표적 RNA를 특이적으로 절단하는 특정 뉴클레아제, 특히 RNase H를 리크루팅하는 능력을 이용함으로써, 표적 핵산 분자에 극도로 특이적인 안티센스 분자를 설계할 수 있다. 그러나 어떤 유전자 가족들에게는 이러한 높은 특이성이 해로울 수도 있다. 예컨대, 유전자 가족들의 유전자들이 서로 어떤 시너지 효과가 있거나 함께 비활성화되는 성질을 가졌다면, 이러한 유전자들 중 둘 이상을 표적으로 할 수 있어야 효과적이다.
전형적인 안티센스 화합물은 왓슨-크릭 염기 쌍형성을 통해 그들의 표적 RNA에 결합하는 변형된 핵산이다. 다른 구조들이 표적 RNA의 절단을 매개하는 다양한RNase를 리크루팅할 수 있다. 가장 일반적인 RNase는 DNA/RNA 듀플렉스를 인지한 후 그 표적 RNA를 절단하는 RNase H이다. 이러한 목적에 가장 일반적으로 사용되는 올리고뉴클레오티드는 비변형된(자연발생된) 염기(A, T, G, C)와 올리고뉴클레오티드를 뉴클레아제에 저항할 수 있도록 만드는 포스포로티오에이트라 불리우는 변형된 백본을 포함한다. 2'-O-알킬과 같은 다른 백본 변형은 올리고뉴클레오티드가 표적 RNA의 RNase H 절단을 매개할 수 없도록 만든다. 한 단일 안티센스 올리고뉴클레오티드 내에 비-RNase H 기질 부분과 RNase H 기질 부분의 조합에 대해 많은 보고가 있다. 이러한 비-RNase H 기질 부분은 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 결합 및 특이성 둘다를 제공한다. 이러한 백본의 예로는 메틸포스포네이트, 모르폴리노스, MMI, 펩티드 핵산(PNA) 및 3'-아미데이트를 들 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 결합 및 뉴클레아제 안정성을 증가시키는 슈가 변형으로는, 2'-O-알킬, 2'-O-메톡시에틸, 2'-O-알킬아미노알킬, 2'-플루오로(2'-F) 및 2'-아미노를 들 수 있다.
보편적 또는 축퇴성 염기는 표적에 결합하는 전체 분자의 능력을 파괴하지 않으면서 DNA 듀플렉스 내의 하나 이상의 염기와 수소결합할 수 있는 헤테로사이클릭 부분이다. 비변형된 백본을 가지면서 축퇴성 또는 보편적 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 사용이 PCR 프라이머 문헌에 나타나 있다(Bergstrom et al.,J. Am. Chem. Soc. 117:1201-1209, 1995; Nichols et al.,Nature369:492-493, 1994; Loakes,Nucl. Acids Res.22:4039-4043, 1994; Brown,Nucl. Acids Res.20:5149-5152, 1992). 그러나, 최근까지도 이러한 보편적이고 축퇴성인 염기가 안티센스 기술에 사용된 적이 없었고, 변형된 백본 링키지를 포함하는 올리고뉴클레오티드 내도 통합된 적이 없었다. 본 발명은 이러한 안티센스 조성물 및 방법을 제시하는 것이다.
본 발명은 하나 이상의 보편적(universal) 및/또는 축퇴성(degenerate) 염기를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 조성물 및 그 올리고뉴클레오티드를 표적 RNA 분자에 이용하는 방법에 관한 것이다.
도1은 인간의 bcl-2A 및 인간의 bcl-xL 유전자 간의 높은 상동성 영역의 서열 정렬을 나타낸다. 정렬된 서열 영역에 상보적이며, 하나 이상의 보편적 및/또는 축퇴성 염기를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그 서열 정렬 아래에 나타나 있다. 염기 미스매치(mismatch)는 별표로 표시하였다. B는 보편적 염기를 나타낸다. P 및 K는 각각 어떤 피리미딘 및 어떤 퓨린과 염기쌍을 형성한 축퇴성 염기이다.
도2는 세가지 인간의 단백질 키나아제 C(PKC) 패밀리 멤버의 한 서열의 정렬이다. 정렬된 서열 영역에 상보적이며 하나 이상의 보편적 및/또는 축퇴성 염기를 포함한 안티센스 올리고뉴클레오티드가 그 서열 정렬 아래에 나타나 있다. 이러한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 동시에 둘 이상의 PKC 패밀리 멤버를 표적할 수 있다.
도3은 bcl-2 유전자의 두 대립형질인 bcl-2B와 bcl-2C 사이의 상동성 영역의 서열 정렬을 나타낸다. 하나 이상의 보편적 및/또는 축퇴성 염기를 포함하는 대표적인 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그 서열 정렬 아래에 나타나 있다.
발명의 개요
본 발명의 한 구체예는, 적어도 하나의 비-자연발생적인 백본을 갖고 6 내지 약 50개의 염기를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드로서, 그 염기 중 적어도 하나는 보편적 및/또는 축퇴성 염기인 것이다. 바람직하게는, 약 50% 이하의 염기가 보편적 및/또는 축퇴성 염기인 것이다.
본 발명의 또다른 구체예는, 3 내지 약 15개의 염기를 갖는 제1 비- RNase H 리크루팅 영역, 3 내지 약 15개의 염기를 갖는 RNase H 리크루팅 영역, 그리고 제2 비- RNase H 리크루팅 영역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로서, 그 염기들중 적어도 하나는 보편적 및/또는 축퇴성 염기인 것이다. 바람직하게는 그 염기들 중 약 50% 이하가 보편적 및/또는 축퇴성 염기인 것이다.
본 발명은 또한 비- RNase H 리크루팅 구역 및 RNase H 리크루팅 구역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하는데, 그 염기들 중 적어도 하나는 보편적 및/또는 축퇴성 염기인 것이다. 바람직하게는 그 염기들 중 약 50% 이하가 보편적 및/또는 축퇴성 염기인 것이다.
본 발명의 또다른 구체예는 2'-5' 아데노신 올리고머를 포함하는 RNase L-리크루팅 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드로서, 그 올리고뉴클레오티드의 RNA 표적 영역 내의 염기들 중 적어도 하나는 보편적 및/또는 축퇴성 염기인 것이다. 바람직하게는, 그 염기들 중 약 50% 이하가 보편적 및/또는 축퇴성 염기인 것이다.
본 발명은 또한 RNase P를 리크루팅 하도록 설계된 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것으로서, 그 올리고뉴클레오티드의 RNA 표적 영역 내의 염기들 중 적어도 하나는 보편적 및/또는 축퇴성 염기인 것이다. 바람직하게는 그 RNA 표적 영역 내의 염기들의 약 50% 이하가 보편적 및/또는 축퇴성 염기인 것이다.
본 발명의 또다른 구체예는 리보자임에 관한 것으로서, 그 RNA 표적 영역 내에 적어도 하나의 보편적 및/또는 축퇴성 염기를 갖는 리보자임에 관한 것이다. 바람직하게는 그 RNA 표적화 영역 내의 염기들 중 50% 이하만이 축퇴성 및/또는 보편적 염기인 것이다.
본 발명은 또한 표적을 절단할 수 있는 RNase 활성의 존재하에서 RNA 분자와 상기 기술된 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 단계를 포함하는 표적 RNA 분자를 절단하는 방법을 제공한다. 바람직하게는 RNase는 RNase H, RNase L 또는 RNase P이다.
본 발명은 또한 상기 기술된 리보자임과 RNA 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 표적 RNA 분자를 절단하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 RNA 분자를 상기 기술된 리보자임과 접촉시키는 단계를 포함하는 표적 RNA 분자를 절단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 구체예는 표적 RNA 분자를 절단하는 방법으로서, 그 방법은 RNA 분자를 6 내지 약 50개의 염기를 갖는 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함하며, 그 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 보편적 및/또는 축퇴성 염기를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 서열 모티프를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 해로운 영향을 감소시키는 방법으로서, 그 방법은 상기 하나 이상의 서열 모티프 내의 하나 이상의 염기를 하나 이상의 보편적 및/또는 축퇴성 염기로 교체하는 것을 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게, 그 서열 모티프는 CG 디뉴클레오티드(dinucleotide)이다. 이 바람직한 구체예의 또다른 관점에서, 그 서열 모티프는 폴리-G 서열이다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
본 발명은 하나 이상의 보편적 및/또는 축퇴성 염기를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드와, 그 안티센스 올리고뉴클레오티드에 상보적이거나 거의 상보적인 영역을 포함하는 RNA를 표적하는 방법에 관한 것이다. 단지 자연발생적 뉴클레오티드 염기(A, T, G, C 및 U)만을 포함하는 종래의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그들이 그들의 표적 서열에 완전히 상보적일 때에만 유효하다. 다른 말로 하면, 그 올리고뉴클레오티드는 미스매치된 올리고뉴클레오티드에 충분한 친화력으로 결합할 수 없다는 것이다. 이것으로 인해 단일 뉴클레오티드 폴리모르피즘(SNPs)에 결합하는 종래의 올리고뉴클레오티드의 능력으로는 하나 이상의 미스매치를 갖는 둘 이상의 상동 유전자를 단일 안티센스 올리고뉴클레오티드로 표적시킬 수 없게 된다. 본 발명은 이 문제를, 하나 이상의 보편적 및/또는 축퇴성 염기(하기 정의됨)를 안티센스 올리고뉴클레오티드로 통합시킴으로써 해결한다. 이는 이러한 보편적 및/또는 축퇴성 염기는 뉴클레오티드 미스매치를 무시할 수 있어서 충분한 친화력으로 결합하여 뉴클레아제의 리크루팅을 가능하게 함으로써 이 미스매치 문제를 해결하기 때문이다.
적어도 하나의 보편적 및/또는 축퇴성 염기를 안티센스 올리고뉴클레오티드로 통합함으로써 일련의 또는 한 그룹의 자연발생 염기에 의해 유발되는 유해한 영향을 감소 또는 제거할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 내의 다양한 짧은 염기 서열은 안티센스-특이적이지 않은 현저한 서열-의존적 생물학적 효과를 유발한다. 예컨대, 비메틸화된 "CG" 디뉴클레오티드를 포함하는 거의 모든 뉴클레오티드는 동물에 주입되거나 분리된 골수세포와 인큐베이션시켰을 때 다양한 면역-활성화 효과를 유발한다. 가장 일반적인 면역 활성화 효과는 강화된 B-세포의 증식 및 인터루킨-2와 같은 염증성 사이토킨을 포함하는 사이토킨의 생산이다. 이 면역 활성화 현상으로 인해 많은 치료학적 안티센스 올리고뉴클레오티드 후보의 일부 해로운 부작용이 발생하는 것으로 믿어진다. 본 발명은 그 문제를 이러한 "CG" 반복서열의 "C" 또는 "G"를 축퇴성 또는 보편적 염기로 치환함으로써 해결하는 것이다. 이것은 바람직하지 않은 면역 활성화 작용을 제거하는 반면 유효하고 특정한 안티센스 활성은 유지하는 것으로 믿어진다.
또한, "GGGG" 및 다른 폴리-G 모티프가 세포 배양에서의 성장 저해 및 동물에서 높은 계의 독성과 같은 비-안티센스 효과를 생산하는 데에 되풀이하여 나타나 왔다. 테트라-G 또는 다른 폴리-G 내에서 일어나는 보편적 및/또는 축퇴성 염기의 치환은, 이러한 서열을 깨뜨려서("break-up") 동물 및 세포 배양 모두에 있어 현저한 연구가치와 치료학적 이용성을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 만든다.
여기서 사용된 용어인 "안티센스"란, 유전자 발현을 방해하고 특정한 원하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 인지하거나 결합할 수 있도록 설계된 분자를 말한다. 안티센스 분자는 전형적으로(그러나 필수적이지는 않음) RNA 분자 상에 존재하는 표적 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 그러한 결합으로 인해, 폴리머라제 작용의 방해, RNA 프로세싱 및 RNase H, RNase L 및 RNase P등의 뉴클레아제의 리크루팅 및/또는 활성화를 포함하는 다양한 수단에 의해 번역을 방해한다.
여기서 사용되는 용어인 "리보자임"이란, 폴리뉴클레오티드를 촉매적으로 절단할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 말한다.
"올리고뉴클레오티드"라는 용어는 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 하이브리드로 구성된 한 분자이다.
"올리고뉴클레오티드 유사체"란 용어는, 올리고뉴클레오티드-유사 구조를 포함하는 한 분자인데, 예컨대, 한 백본과 일련의 염기를 갖는 분자로서, 그 백본 및/또는 그 염기 중 하나 이상이 자연발생적인 DNA 및 RNA에서 발견되는 구조가 아닐 수 있는 분자이다. "비-자연적" 올리고뉴클레오티드 유사체는 자연적인 DNA 또는 RNA에서는 발견되지 않는 적어도 하나의 염기 또는 백본 구조를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 유사체의 예로서 DNA, RNA, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드, 펩티드 핵산(PNA), 메톡시에틸 포르포로티오에시트, 데옥시이노신 또는 데옥시 5- 니트로인돌을 포함하는 올리고뉴클레오티드 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
여기서 사용된 "백본"이란 용어는, 한정된 간격을 두고 부착된 복수개의 염기를 지지할 수 있는 일반적으로 선형인 분자를 말한다. 바람직하게는, 그 백본은 표적 폴리뉴클레오티드의 지지된 염기들 간에 혼성화를 수행할 수 있는 기하학적배열로 그 염기들을 지지할 것이다.
"비-자연발생적 염기"란 용어는, A, C, G, T 및 U 이외의 것으로서 자연적 염기 또는 비-자연발생적 염기에 특이적으로 결합할 수 있는 부분들 뿐만 아니라 축퇴성 및 보편적 염기들을 포함한다. 비-자연발생적 염기에는 프로피닐시토신, 프로피닐유리딘, 디아미노퓨린, 5-메틸시토신, 7-데아자아데노신 및 7-데아자구아닌을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
"보편적 염기"란 용어는 어떤 염기라도 치환시킬 수 있는 부분을 말한다. 보편적인 염기는 혼성화에 공헌할 필요는 없지만 혼성화로부터 현저히 동떨어져 있어도 아니된다. 보편적 염기의 예로는 이노신, 5-니트로인돌 및 4-니트로벤즈이미다졸을 들 수 있지만 이에 한정되지는 않는다.
"축퇴성 염기"란 용어는 어떤 퓨린 아니면 어떤 피리미딘과 염기-쌍형성할 수 있지만 퓨린 및 피리미딘 모두에는 염기-쌍형성 할 수 없는 부분을 말한다. 축퇴성 염기의 예로서 6H, 8H-3,4-디히드로피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7-온("P", 피리미딘 모의체) 및 2-아미노-6-메톡시아미노퓨린("K" 퓨린 모의체)를 들 수 있지만 이에 한정되지는 않는다.
"표적 폴리뉴클레오티드"란 용어는 DNA, 예컨대 생체 세포에서 발견되는 DNA로서 안티센스 분자가 결합하거나 반응하려고 하는 DNA를 말한다.
"활성"이라는 용어는, 표적 폴리뉴클레오티드의 전사 및/또는 번역을 방해하기 위해 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화될 때 본 발명의 안티센스 분자의 능력을 언급하는 것이다. 바람직하게는, 그 방해는 그 안티센스 분자가 혼성화시 뉴클레아제를 리크루팅하고/거나 뉴클레아제 기질로서 제공하기 때문에 발생하는 것이다. "방해"라는 용어는 감지될 정도의 저해를 포함한다.
"RNase H 리크루팅"이란 용어는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 및/또는 포스포디에스테르 백본을 갖는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 이 타입의 백본은 RNA/DNA 하이브리드가 형성되면 RNase H에 의해 인지되고 RNase H는 표적 RNA를 절단하도록 한다.
"비-RNase H-리크루팅"이라는 용어는 데옥시포스포디에스테르 또는 데옥시포스포로티오에이트 링키지 이외의 링키지를 갖는 올리고뉴클레오티드를 말하는 것으로서, 2'-O-알킬, PNA, 메틸포스포네이트, 3'-아미데이트, 2'-F, 모르폴리노, 2'-O-알킬아미노알킬 및 2'-알콕시알킬을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 타입의 올리고뉴클레오티드는 DNA/RNA 하이브리드의 형성 이후에 RNase H에 의해 인지되지 않는다.
"RNase L 리크루팅"이란 용어는, 올리고머를 형성하는 2', 5'-링키지 내에서 네개의 연속하는 아데노신 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 이 올리고머는 DNA/RNA 하이브리드가 형성되면 RNase L에 의해 인지된다(미국특허 No.5,583,032 참조).
"RNase P 리크루팅"이라는 용어는, tRNA 전구체 분자의 일부분을 절단함으로써 성숙 tRNA의 생성에 정상적으로 관여하는 효소인 RNase P에 의해 인지되는 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 말하는 것이다. 이 스템-루프 구조는 원래의 tRNA 기질과 닮았으며 이는 Ma et al.(Antisense Nucl. AcidDrug Dev. 8:415-426, 1998) 및 미국특허 No.5,877,162에 의해 기재되어 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체는 바람직하게는 6 내지 약 50염기길이이고, 더 바람직하게는 약 10 내지 30염기길이이고, 가장 바람직하게는 약 15 내지 25염기길이이다. 18개의 염기쌍을 갖는 올리고뉴클레오티드가 특히 바람직하다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체는 전형적으로 적어도 하나의 보편적 또는 축퇴성 염기와 적어도 하나의 변형된 백본 링키지를 포함한다. 일반적으로, 이러한 올리고뉴클레오티드는 약 50% 이상의 보편적 및/또는 축퇴성 염기를 포함하지 않는다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체는 표준 올리고뉴클레오티드 합성 방법(실시예1 참조)에 의해 합성될 수 있다.
결합 도메인 내에서 사용되는 올리고뉴클레오티드는 자연적 DNA 및/또는 RNA에 혼성화하는 한 분자로 귀결될 수 있는 어떤 백본 및 어떤 서열을 사용할 수 있다. 적당한 백본의 예로서는 포스포디에스테르 및 데옥시포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 데옥시포스포로티오에이트, 2'-O-치환된 포스포디에스테르 및 데옥시 유사체, 2'-O-치환된 포스포로티오에이트 및 데옥시 유사체, 모르폴리노, PNA(미국특허 No.5,539,082), 2'-O-알킬메틸포스포네이트, 3'-아미데이트, MMI, 알킬 에테르(미국특허 No.5,223,618) 및 미국특허 제5,378,825, 5,489,677, 5,541,307 등에 기재된 것을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. RNase 활성이 요구되는 경우, RNase 기질로서 작용할 수 있는 백본이 올리고뉴클레오티드의적어도 일부분에 대해 사용된다.
본 발명에 사용되기에 적합한 보편적 염기로는 데옥시 5-니트로인돌, 데옥시 3-니트로피롤, 데옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 데옥시 네불라린, 데옥시이노신, 2'-OMe 이노신, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-OMe-3-니트로피롤, 2'-F 이노신, 2'-F 네불라린, 2'-F 5-니트로인돌, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, 2'-F 3-니트로피롤, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르폴리노-5-니트로인돌, 모르폴리노-네불라린, 모르폴리노-이노신, 모르폴리노-4-인트로벤즈이미다졸, 모르폴리노-3-니트로피롤, 포스포르아미데이트-5-니트로인돌, 포스포르아미데이트-네불라린, 포스포르아미데이트-이노신, 포스포르아미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포르아미데이트-3-니트로피롤, 2'-O-메톡시에틸 이노신, 2'-O-메톡시에틸 네불라린, 2'-O-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-O-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-O-메톡시에틸 3-니트로피롤, 데옥시 RpMP-5-니트로인돌 다이머 2'-OMe RpMP-5-니트로인돌 다이머 등을 들 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 사용하기에 적당한 축퇴성 염기로는 데옥시 P(A&G), 데옥시 K(U&C), 2'-OMe 2-아미노퓨린(U&C), 2'-OMe P(G&A), 2'-OMe K(U&C), 2'-F-2-아미노퓨린(U&C), 2'-F P(G&A), 2'-F K(U&C), PNA-2-아미노퓨린(U&C), PNA-P(G&A), PNA-K (U&C), 모르폴리노-2-아미노퓨린(U&C), 모르폴리노-P(G&A), 모르폴리노-K(U&C), 포스포르아미데이트-2-아미노퓨린(C&U), 포스포르아미데이트-P(G&A), 포스포르아미데이트-K(U&C), 2'-O-메톡시에틸 2-아미노퓨린(U&C), 2'-O-메톡시에틸 P(G&A), 2'-O-메톡시에틸 K(U&C), 데옥시 RPMP-KP 다이머, 데옥시 RPMP-PK 다이머, 데옥시 RPMP-Kk 다이머, 데옥시 RPMP-PP 다이머, 2'-OMe RPMP-KP 다이머, 2'-OMe RPMP-PK 다이머, 2'-OMe RPMP-KK 다이머, 2'-OMe RPMP-PP 다이머 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 하나 이상의 유전자를 표적으로 하는 단일 안티센스 분자를 제공하기 위하여 안티센스 올리고뉴클레오티드에 보편적 및/또는 축퇴성 염기를 사용하는 방법을 제공한다. 이러한 보편적 및/또는 축퇴성 염기는 안티센스 분자의 RNase H 부분 및 비-RNase H 부분 중 어느 하나에 사용될 수 있다. 한 표적에 대해 하나 이상의 염기를 결합시키는 능력으로 인해, 하나 이상의 RNA 서열을 표적으로 하는 한 안티센스 분자를 만들 수 있다.
올리고뉴클레오티드 합성은 변형된 염기 및 백본 링키지를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 합성으로 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명의 한 구체예에서는, 6 내지 약 50개의 염기를 갖고, 그 염기 중 적어도 하나는 보편적 및/또는 축퇴성 염기로 대체된 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 약 50% 이하의 염기들이 보편적 및/또는 축퇴성 염기이다. 본 발명에서 사용되는 또 다른 올리고뉴클레오티드는 3 내지 약 15 염기의 비-RNase 리크루팅 부분을 포함하고 그 다음에 3 내지 약 15 염기의 비-RNase H 리크루팅 부분을 포함하며 그 다음에 3 내지 약 15 염기의 제2 비-RNase H-리크루팅 부분을 포함하는데, 그 올리고뉴클레오티드에 포함된 염기들 중 적어도 하나는 축퇴성 및/또는 보편적 염기이다. 바람직한 구체예에서, 염기들 중 약 50% 이하만이 보편적 및/또는 축퇴성 염기이다. 본 발명에 사용될 수 있는 또다른 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비-RNase H 리크루팅 부분과 그 다음에 RNase H-리크루팅 부분을 포함하며 그 염기들 중 적어도 하나는 보편적 및/또는 축퇴성 염기로 대체된 것이다. 바람직한 구체예에서 그 염기들 중 50% 이하만이 보편적 및/또는 축퇴성 염기이다. RNase H-리크루팅 영역과 그 다음에 비-RNase H-리크루팅 부분을 포함하며 그 염기들 중 적어도 하나는 축퇴성 및/또는 보편적 염기인 안티센스 올리고뉴클레오티드 또한 본 발명의 범위에 속한다. 바람직한 구체예에서는 염기들 중 약 50% 이하만이 보편적 및/또는 축퇴성 염기이다.
본 발명에 사용될 수 있을 것으로 고려되는 다른 안티센스 올리고뉴클레오티드는 RNase L 리크루팅 올리고뉴클레오티드 2'-5' 아데노신 부분을 포함하면서 적어도 하나의 축퇴성 및/또는 보편적 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드; 및 RNase P를 리크루팅하도록 설계된 것이면서 적어도 하나의 축퇴성 및/또는 보편적 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 구체예에서는, 그 염기의 약 50% 이하만이 보편적 및/또는 축퇴성 염기이다.
본 발명의 또다른 구체예는 RNA 표적 서열 내의 적어도 하나의 염기는 축퇴성 및/또는 보편적 염기인 리보자임이다. 바람직한 구체예에서는 그 염기들 중 50% 이하만이 보편적 및/또는 축퇴성 염기이다. 리보자임 활성을 위한 최소한의 서열 요건은 Benseler et al. (J. Am. Chem. Soc.115:8483-8484, 1993). 해머헤드 리보자임 분자는 기질 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 말단 도메인("I" 및 "III"), 촉매 부분 및 그 분자를 함께 모을 수 있는 다양한 다른 구조에 의해 대체될 수 있는 스템 루프 구조("II")를 포함한다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 유전자, 더 바람직하게는 치료학적 유전자, 및 가장 바람직하게는 하기 나타낸 실시예들에서 기술되는 항-아폽토시스 또는 화학저항성(chemoresistance) 유전자에 사용될 수 있다.
본 발명에 사용되는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 대표적인 클래스는 하기 나타낸 바와 같다. 이 도면은 18-머(mer)로 나타나지만 이는 제한의 목적이 아니라 단지 예시의 목적으로 간주되어야 한다.
이러한 서열에서, B는 보편적 염기 또는 축퇴성 염기이고; N은 RNA 표적 염기를 특이적 인지할 수 있는 자연적 또는 비-자연발생적 염기로서 그 예로 A, C,G, T, U, 프로핀일 C, 프로핀일 U, 디아모퓨린, 5-MeC, 7-데아자 A 및 7-데아자 G를 들 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 밑줄은 비-RNase H 리크루팅 구역을 나타내며 그 예로서 2'-O-알킬, PNA, 메틸포스포네이트, 3'-아미데이트. 2'-F, 모르폴리노, 2'-O-알킬아미노알킬 및 2'-알콕시알킬을 들 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. "…"는 링커를 나타내며 미국특허 제5,583,032호에 개시된 것을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. "#"는 리보자임 올리고뉴클레오티드의 리보자임 절단 부분을 나타내며; "&"는 RNase P를 리크루팅하는 스템 루프 구조를 나타내며; "a˙a˙a˙a˙"는 올리고머의 2'-5' 아데노신의 테트라머를 나타낸다. SEQ ID NO:11은 또한 RNase P에 대한 기질인 표적 RNA 상의 루프 구조 형성을 유도함으로써 RNase P를 리크루팅하도록 고안된다(미국특허 제5,877,162 참조).
상기 기술된 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 리보자임은 생체외 또는 생체내에서 하나 이상의 표적 RNA 분자를 절단하는 데에 이용된다.
실시예1
올리고뉴클레오티드 합성
모든 시약은 건조된 상태(<30ppm 물)로 사용되었다. 올리고뉴클레오티드 합성 시약은 Glen Research사로부터 구입하였다. 용액중의 아미디트(amidite)는 Trap-paks(Perkin-Elmer Applied Biosystems, Norwalk, CT)를 거쳐 건조시켰다. 프로필 링커로 보호된 디메톡시 트리틸(DMT)기로 앞서 유도된 고상 지지체를 Perkin-Elmer Applied Biosystems Expedite 합성기(개시 프로필 링커 1mmol)와 상용성이 있는 DNA 합성기 컬럼에 놓았다. 그 DMT기를 블록해제 시약(2.5%의 디클로로메탄중의 디클로로아세트산)으로 제거하였다. RNA 및 DNA 합성을 위한 표준 프로토콜을 아미디트(건조 아세토니트릴 중 0.1M)에 적용하였다. 커플링 시간은 전형적으로 아미디트에 따라 최고 15분까지로 하였다. 포스포니트(phosphonite) 중간체를 산화 Beaucage 황화제로 처리하였다. 각 산화 단계 이후에, 아세틸기를 캡핑되지 않은 5'-OH기 상에 올려놓고 두 캡핑 시약인 CAP A(아세틱 무수물) 및 CAP B(THF 중의 n-메틸이미다졸)의 혼합물로 처리함으로써 캡핑(capping) 단계를 수행하였다. 그 사이클을 원하는 서열을 얻을 때까지 다양한 아미디트로 충분히 반복하였다. 원하는 서열이 얻어진 후 그 지지체를 55℃, 농축 암모늄 하이드록시드에서 16시간 처리하였다. 그 용액을 스피드 백(speed vac) 상에서 농축시키고 잔류물을 100ml의 수성 0.1M 트리에틸암모늄 아세테이트 중에 회수하였다. 이를 HPLC 컬럼(C-18, Kromasil, 5mm, 4.3mm 직경, 250mm 길이)에 적용시키고 아세토니트릴 구배(용매 A, 0.1M TEAA; 용매 B, 0.1M TEAA 및 50% 아세토니트릴)로 30분에 걸쳐 1ml/분의 유속으로 용출하였다. 80% 이상 순수한 산물을 포함하는 분획을 모아서 농축하였다. 결과된 잔류물은 트리틸기를 제거하기 위해 80% 아세트산 수용액 중에 넣고 역상 컬럼에 재적용시킨 후 상기 기술된 바와 같이 정제하였다. 90% 이상의 순도를 갖는 분획을 모아서 농축하였다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 안티센스 활성은 예컨대 실시예 2-4에 기술되는 바와 같은 표준 분석법에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로 공지의 서열을 갖는 표적 폴리뉴클레오티드를 제조하고 그 표적 소열에 결합하여 복합체를 형성하도록 선택된 본 발명의 올리고머로 그 표적을 접촉시키고, 그 복합체를 원하는 표적뉴클레아제로 절단한 후 그 산물을 분석하여 절단이 일어나는 지를 결정할 수 있다. 활성은 절단된 표적 폴리뉴클레오티드를 직접(예컨대, 표지된 프로브와의 혼성화, PCR에 의해 의한 증폭, 젤 상에 가시화 등) 검사함으로써 또는, 숙주세포의 표현형(예컨대, 선택된 단백질의 발현 또는 발현결여)에의 작용을 검사함으로써 결정할 수 있다. RNase H 절단 분석은 하기 기술되는 바와 같다.
실시예2
RNase H 절단 분석
PCR을 사용하여 분비 알칼라인 포스파타제(SEPA)의 일부를 코딩하는 dsDNA 단편을 하기 프라이머를 사용하여 제조하였다.
이러한 프라이머들은 하기 서열을 갖는 SEAP RNA 단편(1 내지 102)에 근거한 것이다.
PCR 증폭을 제조업자(Life Technologies)가 추천하는 반응조건 하에서 수행하였다. 프라이머 P3.1 및 P5를 10nM에서 사용한 반면, 프라이머 P3 및 P4는 0.50μM에서 사용하였다. PCR 프로그램은 94℃에서 5분간, 52℃에서 30초간 35사이클, 72℃에서 1분간, 94℃에서 45초간, 그리고 72℃에서 10분간으로 하였다.
그런 다음에 SEAP dsDNA를 RiboMaxTM의 대규모 RNA 키트(Promega, Madison, WI)를 사용하여 ssRNA로 전사시켰다. 그 SEAP DNA 농도는 30㎍/ml이었다. 그 전사반응은 DNase I을 첨가하여 종료시키고 37℃에서 15분간 인큐베이션시켰다. DNA 단편들과 유리 뉴클레오티드들을 에탄올/소듐 아세테이트에서 침전시켜 제거한 후 70% 에탄올로 세척하였다. 그 RNA를 현탁한 후 RNase H 활성 분석에 사용하기 위해 약 2μM로 희석하였다.
SEAP RNA의 일부에 상보적인 본 발명의 올리고뉴클레오티드들(각각 20μM), SEPA RNA(2μM 용액 중에 10㎕), Tris/EDTA 버퍼(10mM Tris-HCl, pH 7.4 mM EDTA, "TE", 2㎕)를 500㎕의 박벽 반응 튜브에 첨가한 후 40℃에서 3 내지 5분간 인큐베이션시켜서 열평형에 도달시켰다. RNase H 버퍼(10×: 200mM Tris-HCl, pH 7.4-7.5, 1,000mM KCl, 100mM MgCl2-6H2O, 0.5mM 디티오트레이톨, 25% w/v 수크로즈), RNase H(0.4 내지 0.6U, Promega) 및 물(20㎕)를 조합하여 칵테일을 형성하고 3 내지 5분간 40℃에서 인큐베이션시켰다. 그 다음에 8㎕의 칵테일을 각 반응 튜브에 첨가하고 가능한한 빨리 혼합하여 냉각을 막았다. 반응을 MJ Research(Watertown, MA) PCT-100 온도 조절기에서 30분간 40℃에서 인큐베이션시켰다. 반응을 20㎕ FDE 샘플 버퍼(90% v/v 포름아미드, 10% v/v 10× TBE 버퍼, 0.5% w/v 브롬페놀 블루, 25mM EDTA)(1×TBE: 89mM Tris 염기, 89mM 붕산, 2mM EDTA, pH 8.0)을 첨가하여 중단시키고 3 내지 5분간 90℃로 가열하였다.
각 샘플(8 내지 10㎕)을 약 1시간동안 또는 염색 앞부분이 젤의 바닥에 닿을 때까지 200볼트로 변성 15% 젤 상의 폴리아크릴아미드 젤 전기영동시켰다. 그 젤을 1:10,000 희석의 Cyber GoldTM(Molecular Probes, Junction City, OR)에서 1× TBE로 5 내지 10분간 담금으로써 젤 상의 핵산 밴드를 가시화한 후 5 내지 10분간 더 1×TBE에 담그고 단파 UV 조사기 상에서 조사하였다. 그 결과를 CyberGREENTM필터 및 Polaroid Type 667 3000 ASA 블랙 및 화이트 필름을 장착한 Polaroid MP-4 카메라를 사용하여 CyberGoldTM형광물질을 사진찍어서 기록하였다.
듀플렉스 DNA 사다리들(20bp 및 100bp, GenSura, San Diego)를 사이즈 표준으로 사용하였다. 표준 사다리는 젤 상에 로딩하기 전에 가열하지 않았고 변성시키지 않았고 듀플렉스 DNA 단편으로서 변성 및 비변성 젤 모두에 러닝시켰다.
실시예3
단백질 키나아제 C 알파(PKCα)에 대한 세포내 안티센스 활성
단백질 키나아제 C 알파(PKCα)를 본 발명에 의한 축퇴성 및/또는 보편적 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 안티센스 활성을 증명하기 위한 유전자 표적으로 사용하였다. PKCα는 인간 암의 대부분의 유형에서 과발현되는 정상적인 인간 유전자이고 모든 안티센스 표적 유전자 중 가장 대중적인 것 중 하나이다.
과발현 PKCα로 알려진 세포주인 인간의 방광 암종 세포주(T-24, ATCC HTB-4)를 표준 방법을 이용하여 배양하였다: 37℃, 5% CO2, 10% 태아소혈청 및 페니실린-스트렙토마이신을 포함한 McCoy의 5A 배지의 75cm2의 플라스크. 안티센스 실험을 위해, T-24 세포를 12-웰 플레이트에 75,000 셀/웰로 플레이팅시키고 트랜스펙션 전에 밤새 부착 및 회수하도록 하였다. 그 안의 X 잔기가 보편적 및/또는 축퇴성 염기(동일하거나 다른)이고 그 안의 나머지 잔기가 포스포로티오에이트 링키지 이외의 변형된 백본 링키지에 의해 연결된 하기 올리고뉴클레오티드:
및 대조군 올리고뉴클레오티드를 T-24 셀 안으로 양이온 지질-함유 사이토펙션 시약(LipofectACETM)(GibcoBRL, Gaithersburg, MD)을 사용하여 트랜스펙션시켰는데, 그 시약은 T-24에서 본 발명에 의한 형광 표지된 올리고뉴클레오티드의 핵 전달을 효과적으로 수행한다. 이것은 공지의 PKCα 안티센스 분자인 하기와 같은 한 유사체이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 종래의 모든 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 1.5ml의 감소된 혈청 배지 Opti-MEM I(GibcoBRL)안으로 각각 400nM의 농도로 희석하였다. 그런 다음 그 올리고뉴클레오티드 함유 용액을 최종 지질 대 올리고뉴클레오티드의 중량비 5:1로 하기에 충분한 LipofectACE 함유 OPti-MEM I와 같은 부피로 혼합하였다. 최종 올리고뉴클레오티드 농도는 200nM이었다. 그 올리고뉴클레오티드/지질 복합체를 실온에서 20분간 인큐베이션시킨 후 조직 배양 세포에 첨가하였다.
세포를 포스페이트 버퍼 살린(PBS)에서 세척하여 혈청-함유 배지를 헹구어낸 후 1ml의 트랜스펙션 혼합물을 12-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 모든 트랜스펙션을 삼중으로 수행하였다. 그 세포를 통해 총 세포 RNA를 얻기 전에 22시간동안 올리고뉴클레오티드/지질 복합체를 얻을 수 있다. 모의 트랜스펙션은 Opti-MEM 1만을 처리한 세포로 구성되었다.
22시간의 안티센스 처리 후에, 총 RNA를 그 세포로부터 회수하였다. 그 세포를 표준 방법에 따라 트립신/EDTA 처리에 의해 플레이트로부터 회수하였다. 세포의 삼중 군을 풀(pool)화하고 총 세포질 RNA를 RNeasy 키트(QIAGEN)을 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 분리하였다. 그 RNA를 DNase I으로 처리하고 표준 방법에 따라 UV 정량화하였다.
역전사효소/폴리머라제 체인 리액션(RT-PCR)을 GibcoBRL사의 SuperScript One-Step RT-PCR 키트의 방법 및 재료를 가지고 수행하였다. PKCα를 검출하는 RT-PCR 반응을 Oxford Biomedical Research사의 PKCα-특이적 프라이머 및 100ng의 인풋 총 RNA를 가지고 2번의 독립된 런닝으로 수행하였다.
각 PKCα RT-PCR 안으로의 동량 인풋 RNA를 확인하기 위하여, 대조군 멀티플렉스 RT-PCRs(MP RT-PCRs)를 수행하였다. 프라이머, 시약 및 프로토콜은 Maxim Biotech을 따랐다. 그 대조군 MP RT-PCRs는 동량의 온전한 RNA가 PKCα RT-PCRs에 첨가되는 것을 확인하면서, 모든 샘플 내에서 동등하게 BAX 및 LICE 유전자를 증폭시켰다.
모든 RT-PCR 반응을 PTC-1000 써모사이클러(MJ Research)의 하기 프로그램에따라 수행하였다: 단계1, 50℃에서 35분간; 단계2, 94℃에서 2분간; 단계3, 55℃에서 30초간; 단계4, 72℃에서 1분간; 단계5, 94℃에서 30초간; 단계6, 단계3으로 가서 33번 더 반복; 단계7, 72℃에서 10분간; 단계8, 종료. 모든 RT-PCR 산물을 4% Super Resolution Agarose TBE 젤(Apex) 상에서 분리하고 Cyber GoldTM으로 제조업자의 지시에 따라 염색하였다. 젤을 Polaroid Type 667 필름 상에서 사진찍었다.
실시예4
조직 배양 세포에서 인간 Bcl2 유전자에 대한 안티센스 활성
B 세포 림프종-관련 유전자2(Bcl2)는 다수의 인간 암 유형 중에서 과발현되는 "정상적인" 인간 유전자이다. Bcl2 단백질은 세포 사멸을 조절하고 Bcl 과발현은 세포가 화학요법 및 방사선 저항성이 되도록 유도하는 것으로 알려져 있다. 하기 Bcl2-표적화된 안티센스 분자가 합성되어진다:
, 여기서 X는 동일하거나 다른 보편적 및/또는 축퇴성 염기이고, 처음 아홉 잔기들은 비-RNase H 리크루팅 영역(즉, 포스포로티오에이트 링키지 이외의 변형된 백본 링키지를 포함)이다. 이것은 올리고뉴클레오티드의 유사체이다.
T-24 세포를 75,000 셀/웰로 플레이팅하여 올리고뉴클레오티드 트랜스펙션 전에 밤새 부착 및 회수되도록 하였다. 실험군 및 대조군 올리고뉴클레오티드를 T-24 세포 안으로 LipofectACETM을 사용하여 트랜스펙션시켰다. 올리고뉴클레오티드를 1.5ml의 감소된 혈청 배지(OptiMEMTM, GibcoBRL) 안으로 희석시켜 각각 400nM의 농도가 되었다. 그 올리고뉴클레오티드-함유 용액을 최종 지질 대 올리고뉴클레오티드의 중량비가 5:1이 되기에 충분한 LipofectACE를 함유하는 동부피의 Opti-MEM I과 혼합하고 그 올리고뉴클레오티드의 최종 농도를 200nM로 하였다. 그 올리고뉴클레오티드/지질 복합체를 실온에서 20분간 인큐베이션시킨 후 조직배양세포에 첨가하였다. 세포를 PBS 중에서 한번 세척한 후 1ml의 트랜스펙션을 12-웰 플레이트의 각 웰 안으로 첨가하였다. 모든 트랜스펙션은 삼중으로 수행하였다. 세포가 올리고뉴클레오티드/지질 복합체를 24시간동안 흡수하도록 한 후 총 세포 RNA를 최수하였다. 모의 트랜스펙션은 OPti-MEM I 만으로 처리한 세포로 구성되었다. 총 세포질 RNA는 실시예3에서 기술된 바와 같이 분리 및 정량되었다.
RT-PCR은 실시예3에서와 같이 수행하였다. RT-PCR 반응을 bcl-2를 검출하기 위하여 프라이머:및및 1㎍의 인풋 총 RNA를 가지고 수행하였다. β-액틴에 대한 실험군 RT-PCR 반응 또한 프라이머:및및 0.1㎍의 인풋 총 RNA를 사용하여 수행하였다.
모든 bcl-2 및 β-액틴 RT-PCR 반응을 PTC-100 써모사이클러(MJ Research) 상에서 하기 프로그램에 따라 수행하였다: 단계1, 50℃에서 35분간; 단계2, 94℃에서 2분간; 단계3, 60℃에서 30초간; 단계4, 72℃에서 1분간; 단계5, 94℃에서 30초간; 단계6, 단계3으로 가서 35번 더 반복; 단계7, 72℃에서 10분간; 단계8, 종료.모든 RT-PCR 산물을 4% Super Resolution Agarose TBE 젤 상에서 분리하고 CyberGoldTM으로 제조업자의 지시에 따라 염색하였다. 젤을 Polaroid Type 667 필름 상에서 사진찍었다.
실시예5
bcl-2A 및 bcl-xL의 안티센스 표적화
많은 종양들은 다중 화학저항성 유전자들을 동시에 과발현시키므로 한번에 단지 하나의 특정 화학저항성 유전자에 대해서만 안티센스-기초 요법에 반응하지 않을 것이다. 다중 저항성 유전자들을 단일 안티센스 올리고뉴클레오티드로 넉아웃(knockout)시킴으로써 저항성 종양들에 있어서 화학민감성을 증가시킬 수 있다. 그러한 화학저항성 유전자의 동시 발현의 공지의 예는 bcl-2A 및 bcl-xL로서 이들은 개별적이지만 관련이 있고, 형질전환하는 종양유전자(oncogene)들은 많은 인간 암들에서 과발현된다. 가장 중요한 것은 bcl-2 패밀리 멤버 둘다의 과발현이 세포에 화학저항성을 부여하는 것으로 나타나 왔다는 것이다.
양 유전자 모두를 동시에 넉아웃시키기 위한 앞서 보고된 시도들은 한 유전자 아니면 다른 유전자(둘다는 아니고)에 완전히 상보적인 종래의 올리고뉴클레오티드에 기초하였으므로, 표적 유전자 중 하나에 대해 일부 미스매치를 가지면 낮은 활성을 나타낸다. 따라서 이러한 시도들은 긴 올리고뉴클레오티드의 비-특이적 RNase H-의존 활성에 의존되어 왔다. 대조적으로 각 유전자에 대해 표적화된 둘 이상의 올리고뉴클레오티드를 사용하면 더욱 더 독성 효과와 비-특이적 안티센스 활성을 가져온다.
본 발명은 둘 이상의 유전자를 동시에 넉아웃시키는 단일 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 예컨대, bcl-2 및 bcl-xL은 동시에 도1에 나타난 높은 뉴클레오티드 상동성을 갖는 작은 영역에 표적화된 하나 이상의 보편적 및/또는 축퇴성 염기를 포함하는 단일 올리고뉴클레오티드로 표적화된다. 하나이상의 보편적 및/또는 축퇴성 염기를 포함하는 여섯개의 대표적 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 그들이 혼성화하는 영역이 도1에 도시되어 있다. (인간 bcl-2 mRNA(HUMBCL2A)·GenBank#M13994; bcl-xL mRNA(HSBCLXL)-GenBank#Z23115) 별표는 뉴클레오티드 유사성을 갖는 영역에서의 미스매치를 나타낸다. 염기수는 GenBank에 정의되어 있는 바와 같다.
실시예6
둘 이상의 관련 유전자의 표적화
단백질 키나아제 C(PKC) 유전자 패밀리는 세포외 신호에 반응하여 다른 단백질을 인산화함으로써 세포 성장을 조절하는 유전자 산물을 포함한다. PKC 유전자의 과발현은 일부 인간 종양 유형들에서 감지되어 왔고 PKC 유전자는 잠재적인 암 치료 표적인 것으로 믿어진다. 단백질 수준에서 PKC 패밀리 멤버들이 유사함에도 불구하고, 그 뉴클레오티드 서열은 현저히 다를 수 있다. 하나 이상의 보편적 또는 모호한 염기를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 둘 이상의 PKC 패밀리 멤버가 뉴클레오티드 수준에서 표적되도록 한다. 도2는 인간 PKCα mRNA(HSPKCA1; GenBank #X52479), 인간 PKCθ mRNA(HUMPKCTH; GenBank #L07860) 및 인간 PKCδmRNA(HUMPKCD13X; GenBank #L07860의 하나 및 둘의 상동 영역의 서열 정렬을 나타낸다. 이러한 PKC 패밀리 멤버들의 둘 또는 셋을 표적하는 대표적 올리고뉴클레오티드는 도2에 나타나 있다.
실시예7
동일 유전자의 두 대립형질의 표적화
중요한 인간 종양유전자 bcl-2와 같은 대립형질 변이의 비교를 통해 일반적인 인간 군집 내에서 여러 단일 뉴클레오티드 폴리몰피즘(SNPs)이 밝혀진다. 어떤 공지의 bcl-2 대립형질의 과발현으로 인해 인간 종양에 화학 저항성이 부여되는 것으로 나타나 왔고 이는 작은 예후 표시자로서 간주된다. bcl-2 유전자의 둘 이상의 대립형질은 SNPs의 발생에 의한 제한없이 하나 이상의 보편적 또는 축퇴성 염기를 포함하는 단일 올리고뉴클레오티드로 표적화될 수 있다. 인간 bcl-2B(HUMBCL2B; GenBank #M13995) 및 인간 bcl-2C(HUMBCL2C; GenBank #M14745)의 두 영역들이 두 대립형질 모두의 영역을 표적화하는 대표적 올리고뉴클레오티드로서 도3에 나타나 있다.
이는, SNPs의 발생에 의한 제한 없이 수행되도록, 안티센스 올리고뉴클레오티드 유전자 워크(walk), 유전적 대립형질 간의 중첩의 전장에 걸쳐 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드의 가치평가를 가능케 한다. SNPs가 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화된 영역 내에 포함될 수 없다면, 그 유전자 워크가 유전자 발현을 효과적으로 저해할 수 있는 효과적인 안티센스 표적 부위를 알아내는 데에 더욱 덜 효과적이 될 것이다.
실시예8
문제의 안티센스 염기 서열 모티프의 제거
도3의 "###"에 의해 플랭킹된 올리고뉴클레오티드는 보편적 및/또는 축퇴성 염기를 안티센스 올리고뉴클레오티드에 도입시키는 것, 소위 앞서 언급된 바와 같은 해로운 효과를 가질 수도 있는 "CG" 디뉴클레오티드 및 테트라-G 서열의 제거의 또다른 잇점을 나타낸다. 따라서 보편적 및/또는 축퇴성 염기의 사용은, 보편적 및/또는 모호한 염기를 문제의 서열 모티프 안으로 치환함으로써 서열-의존적, 비-안티센스 효과를 제거한다. 이것은 또한 하기 도시된다:
본 발명의 특정 구체예가 상세히 기술되었지마는, 그것은 본 발명을 제한하는 것이 아니라 예시에 불과하다는 것은 당업자에게 명백할 것이며, 본 발명의 실제 범위는 하기 청구범위에서 한정될 것이다.

Claims (19)

  1. 적어도 하나의 비-자연발생적 백본 링키지를 갖고 6 내지 약 50개의 염기를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드로서, 상기 염기들 중 적어도 하나는 보편적 및/또는 축퇴성 염기인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 염기들 중 약 50% 이하가 보편적 및/또는 축퇴성 염기인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  3. 3 내지 약 15개의 염기를 갖는 제1 비-RNase H 리크루팅 영역, 3 내지 약 15개의 염기를 갖는 RNase H 리크루팅 영역 및 제2 비-RNase H 리크루팅 영역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로서, 상기 염기들 중 적어도 하나는 보편적 및/또는 축퇴성 염기인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 염기들 중 약 50% 이하가 보편적 및/또는 축퇴성 염기인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  5. 비-RNase H 리크루팅 구역 및 RNase H 리크루팅 구역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로서, 상기 염기들 중 적어도 하나는 보편적 /또는 축퇴성 염기인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 염기들 중 약 50% 이하가 보편적 및/또는 축퇴성 염기인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  7. 2'-5' 아데노신 올리고머를 포함하는 RNase L-리크루팅 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드의 RNA 표적화 영역은 적어도 하나의 보편적 및/또는 축퇴성 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 RNA 표적화 영역은 약 50% 이하의 보편적 및/또는 축퇴성 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  9. RNase P를 리크루팅하도록 고안된 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드의 RNA 표적화 영역은 적어도 하나의 보편적 및/또는 축퇴성 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 RNA 표적화 영역은 약 50% 이하의 보편적 및/또는 축퇴성 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  11. RNA 표적화 서열을 갖는 리보자임으로서, 적어도 하나의 보편적 및/또는 축퇴성 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 리보자임.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 RNA 표적화 영역은 약 50% 이하의 보편적 및/또는 축퇴성 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 리보자임.
  13. 표적 RNA를 절단하는 방법으로서, 상기 표적을 절단할 수 있는 RNase의 존재하에 상기 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드와 상기 RNA 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 RNase는 RNase H, RNase L 및 RNase P로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 표적 RNA 분자를 절단하는 방법으로서, 제 11 항 또는 제 12 항에 따른 리보자임과 상기 RNA 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 하나 이상의 표적 RNA 분자를 절단하는 방법으로서, 6 내지 약 50개의 염기를 갖는 올리고뉴클레오티드와 상기 RNA 분자를 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 보편적 및/또는 축퇴성 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 하나 이상의 서열 모티프를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 해로운 효과를 감소시키는 방법으로서, 상기 하나 이상의 서열 모티프 내의 하나 이상의 염기를 하나 이상의 보편적 및/또는 축퇴성 염기로 치환하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 서열 모티프는 CG 디뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 서열은 폴리-G 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
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