KR20020009532A - Composition for the inhibition against leucotrienes production - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 류코트리엔 합성 억제용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 p38 MAP 키나제의 제해제로 알려진 하기 화학구조를 가진 이미다졸 화합물이 5-리폭시게나제의 핵막으로 이동을 억제함으로써 류코트리엔의 합성을 억제하여 류코트리엔에 의해서 유발되는 질병을 치료 또는 예방을 하는 약학적 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for inhibiting leukotriene synthesis, more particularly, to inhibit the synthesis of leukotriene by inhibiting migration of an imidazole compound having the following chemical structure known as an inhibitor of p38 MAP kinase to the nuclear membrane of 5-lipoxygenase. The present invention relates to a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease caused by leukotriene.
[화학식1][Formula 1]
류코트리엔(Leucotriene)은 아라키돈산으로부터 생체계에서 생성되는 국소 작용성 호르몬 그룹을 구성한다. 중요한 류코트리엔은 류코트리엔 B4(LTB4), 류코트리엔 C4(LTC4), 류코트리엔 D4(LTD4) 및 류코트리엔 E4(LTE4)이다. 이들 류코트리엔의 생합성은 효소 5-리폭시게나아제가 아라키돈산에 대하여 작용하여 류코트리엔 A4 (LTA4)로서 알려진 에폭사이드를 생성시킴으로써 시작되며, 이것은 연속적인 효소반응 단계에 의해 다른 류코트리엔(LTB4, LTC4, LTD4, LFE4)으로 전환된다(도1참조). 류코트리엔의 생합성 및 대사에 대한 추가의 설명은 문헌[참조 : Leukotrienes and Lipoxygenases, ed. J. Rokach Elsevier, Amsterdam (1989)]에 기술되어 있다.Leucotriene constitutes a group of locally acting hormones produced in vivo from arachidonic acid. Important leukotrienes are leukotriene B4 (LTB4), leukotriene C4 (LTC4), leukotriene D4 (LTD4) and leukotriene E4 (LTE4). Biosynthesis of these leukotrienes begins by the enzyme 5-lipoxygenase acting on arachidonic acid to produce an epoxide known as leukotriene A4 (LTA4), which is produced by successive enzymatic reaction steps (LTB4, LTC4, LTD4, LFE4) (see Fig. 1). Further explanation of the biosynthesis and metabolism of leukotriene can be found in Leukotrienes and Lipoxygenases, ed. J. Rokach Elsevier, Amsterdam (1989).
류코트리엔은 폐동액질환, 예를 들면, 천식, 만성 기관지염 및 관련 폐쇄성 기도 질환, 알러지 및 알러지 반응, 예를 들면, 알러지성 비염, 접촉성 피부염, 알러지성 결막염 등, 염증, 예를 들면, 관절염또는 염증성 장 질환, 통증, 피부 장애, 예를 들면, 건선, 과민성 습진 등, 심장혈관 장애, 예를 들면, 심근 허혈, 고혈압, 혈소판 응결 등에 관여하는 것으로 알려져 있다.Leukotriene can cause pulmonary sinus disease such as asthma, chronic bronchitis and related obstructive airway diseases, allergic and allergic reactions, such as allergic rhinitis, contact dermatitis, allergic conjunctivitis, etc. Inflammatory bowel disease, pain, skin disorders, for example, psoriasis, irritable eczema and the like, cardiovascular disorders, such as myocardial ischemia, hypertension, platelet condensation and the like is known.
따라서 본 발명자들은 류코트리엔 합성을 조절함으로써 상기 다양한 질병의 치료제로 응용될 수 있음을 착안하여, 류코트리엔 합성에 관련된 신호전달계에 관하여 연구를 하던 중 핵막에서 합성되는 아라키도닌산을 류코트리엔 A4로 전환시키는 효소인 5-리폭시게나제 (5-LO)의 핵막으로의 이동에 p38 MAP 키나제가 관여함을 처음으로 밝혀 내었다. 따라서 p38 MAP 키나제의 특이적인 억제제인 상기 화학식 1의 이미다졸 화합물을 사용하여 5-리폭시게나제의 핵막으로의 이동을 저해하여 궁극적으로 류코트리엔의 합성이 저해되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Therefore, the inventors of the present invention focus on the synthesis of leukotriene, and thus can be applied as a therapeutic agent for the various diseases, while studying the signaling system related to leukotriene synthesis, an enzyme converting arachidonic acid synthesized in the nuclear membrane into leukotriene A4. It was first revealed that p38 MAP kinase is involved in the migration of 5-lipoxygenase (5-LO) to the nuclear membrane. Therefore, using the imidazole compound of Formula 1, which is a specific inhibitor of p38 MAP kinase, the present invention was completed by confirming that 5-lipoxygenase inhibited migration to the nuclear membrane and ultimately inhibited the synthesis of leukotriene.
본 발명의 목적은 상기 화학식 1의 이미다졸 화합물인 4-(4-프루로페닐)-2-(4-메틸설피닐페닐)-5-(4-피리딜)1H-이미다졸을 함유하여 5-리폭시게나제의 세포막으로의 이동을 억제하며, 류코트리엔 합성을 저해하는 조성물을 제공함에 있다.It is an object of the present invention to contain 4- (4-fluorophenyl) -2- (4-methylsulfinylphenyl) -5- (4-pyridyl) 1H-imidazole, which is an imidazole compound of Formula 1, It is to provide a composition that inhibits the migration of lipoxygenase to the cell membrane and inhibits leukotriene synthesis.
본 발명의 다른 목적은 류코트리엔에 의하여 유발되는 질병의 치료 및 예방용 조성물을 제공함에 있다.Another object of the present invention to provide a composition for the treatment and prevention of diseases caused by leukotriene.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.Hereinafter, the configuration and operation of the present invention.
도 1은 류코트리엔 합성 경로를 도시한 개략도 이다.1 is a schematic diagram illustrating the leukotriene synthesis route.
도 2는 본 발명의 이미다졸 화합물(SB203580)이 LTB4(Leucotriene B4)의 합성에 미치는 영향을 도시한 그래프이다.2 is a graph showing the effect of the imidazole compound (SB203580) of the present invention on the synthesis of LTB4 (Leucotriene B4).
도 3은 본 발명의 이미다졸 화합물(SB203580)의 5-리폭시게나제의 핵막이동에 미치는 영향을 도시한 그래프이다.3 is a graph showing the effect of the 5-lipoxygenase on the nuclear membrane migration of the imidazole compound (SB203580) of the present invention.
도 4(a)는 오브알부민으로 천식이 유발된 마우스에서 호산구(eosinophil)가 시간에 따라 폐로 침투되는 양을 통계적으로 환산하여 도시한 그래프이다.Figure 4 (a) is a graph showing the statistical conversion of eosinophils (eosinophil) into the lungs with time in the asthma-induced asthma-induced mice.
도 4(b)는 오브알부민에 노출 후 72시간에서 본 발명의 이미다졸 화합물(SB203580)으로 전처리한 마우스와 하지 않은 마우스의 호산구(eosinophil)가 폐로 침투되는 것을 비교한 그래프이다.Figure 4 (b) is a graph comparing the infiltration of eosinophils into the lung of mice pretreated with the imidazole compound (SB203580) of the present invention and mice not exposed to ovalbumin at 72 hours.
도 5는 오브알부민에 의해 천식 유발된 마우스에 본 발명의 이미다졸 화합물(SB203580)를 투여함으로써 폐에 호산구가 침착되는 것이 억제됨을 나타낸 사진이다.FIG. 5 is a photograph showing that eosinophils are inhibited from being deposited in the lung by administering the imidazole compound (SB203580) of the present invention to an asthma-induced mouse.
본 발명은 하기 화학식 1의 이미다졸 화합물인 4-(4-프루로페닐)-2-(4-메틸설피닐페닐)-5-(4-피리딜)1H-이미다졸(4-(4-Fluorophenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-5-(4-pyridyl)1H-imidazol)를 유효성분으로 함유하는 류코트리엔 합성억제용 조성물에 관한 것이다.The present invention is an imidazole compound of the general formula (1), 4- (4-fluorophenyl) -2- (4-methylsulfinylphenyl) -5- (4-pyridyl) 1H-imidazole (4- (4- The present invention relates to a composition for inhibiting leukotriene synthesis containing Fluorophenyl) -2- (4-methylsulfinylphenyl) -5- (4-pyridyl) 1H-imidazol) as an active ingredient.
[화학식1][Formula 1]
MAP 키나제(mitogen-activate protein kinase, 이하 MAPK라 한다.)는 성장인자등이 세포막에 위치한 수용체를 활성화하면 이 신호를 세포막으로부터 핵으로 전달함으로써 세포의 성장과 분화를 조절하는 주요 신호전달계이다. 상기 화학식 1의이미다졸 화합물은 MAPK 의 하나인 p38 키나제를 특이적으로 억제하는 물질로 알려져 있다.MAP kinase (MAPK) is a major signaling system that regulates cell growth and differentiation by transferring these signals from the cell membrane to the nucleus when growth factors activate receptors located on the cell membrane. The imidazole compound of Formula 1 is known as a substance that specifically inhibits p38 kinase, one of MAPKs.
본 발명에서 실험동물의 세포에 p38 키나제의 억제제인 상기 화학식 1의 이미다졸 화합물을 처리하여 면역형광 현미경으로 관찰한 결과 5-리폭시게나제(5-Lipoxygenase, 이하 5-LO라 함)의 핵막으로의 이동이 억제됨을 알 수 있었다. 이는 본 발명에서 5-LO의 핵막으로의 이동에 p38 키나제가 관여한다는 새로운 사실을 밝혀 낸 것이다.In the present invention, the cells of experimental animals were treated with an imidazole compound of Formula 1, which is an inhibitor of p38 kinase, and examined by immunofluorescence microscopy. As a result, a nuclear membrane of 5-lipoxygenase (5-Lipoxygenase, 5-LO) was used. It can be seen that the movement of is suppressed. This reveals a new fact that p38 kinase is involved in the migration of 5-LO to the nuclear membrane.
도 1에 도시된 바와 같이, 류코트리엔의 합성에는 세포질성 포스포리파제 A2(Cytosolic Phospholipase A2)와 5-LO가 관여를 하는 바, 상기 효소의 활성이 저해되면 류코트리엔의 합성이 저해된다. 본 발명에서 확인한 바와 같이 p38 키나제가 5-LO의 핵막으로 이동에 관여를 하므로 p38 키나제의 활성을 저해하면 5-LO의 핵막으로 이동이 저해되어 LTA4가 합성되지 않아 다른 류코트리엔 (LTB4,LTC4,LTD4,LTE4)의 합성이 저해된다.As shown in Figure 1, the synthesis of leukotriene cytoplasmic phospholipase A2 (Cytosolic Phospholipase A2) and 5-LO is involved, when the activity of the enzyme is inhibited the synthesis of leukotriene is inhibited. As confirmed in the present invention, since p38 kinase is involved in the migration of 5-LO nuclear membrane, inhibiting the activity of p38 kinase inhibits migration of 5-LO nuclear membrane, thus preventing the synthesis of LTA4 and other leukotrienes (LTB4, LTC4, LTD4). , Synthesis of LTE4) is inhibited.
따라서 p38 키나제를 억제하는 상기 화학식 1의 이미다졸 화합물은 류코트리엔에 의해 유도되는 질환들의 치료 및 예방에 유용하게 사용될 수 있다. 즉 본 발명의 화합물 및 이의 약제학적 조성물은 포유동물, 특히 사람에 있어서 1) 폐동액질환, 예를 들면, 천식, 만성 기관지염 및 관련 폐쇄성 기도 질환,2) 알러지 및 알러지 반응, 예를 들면, 알러지성 비염, 접촉성 피부염, 알러지성 결막염 등, 3) 염증, 예를 들면, 관절염또는 염증성 장 질환, 4) 통증, 5) 피부 장애. 예를 들면, 건선, 과민성 습진 등, 6) 심장혈관 장애, 예를 들면, 앙기나,심근 허혈, 고혈압,혈소판 응결 등, 7) 면역학적 또는 화학적(사이클로스포린) 병인에 의해 유도되는 허혈로부터 발생하는 신부전증, 8) 편두통 또는 복합 두통, 9) 안 질환, 예를 들면, 포도막염, 10) 화학적, 면역학적 또는 감염성 자극에의해 초래되는 간염, 11) 외상 또는 쇼크 상태, 예를 들면, 화상, 내독혈증 등, 12) 이인자형이식 거부, 13) 사이토킨(예: 인터루킨 II)의 치료학적 투여 및 종양 괴사 인자와 관련된 부작용 예방, 14) 만성 폐질환, 예를 들면, 낭포성 섬유증,기관지염 및 기타의 작고 큰 기도 질환 및 15) 담낭염을 치료하거나 예방하는데 유용하다.Therefore, the imidazole compound of Formula 1, which inhibits p38 kinase, may be usefully used for the treatment and prevention of diseases induced by leukotriene. That is, the compounds of the present invention and pharmaceutical compositions thereof may be used in mammals, especially humans, for example, in 1) pulmonary sinus diseases such as asthma, chronic bronchitis and related obstructive airway diseases, 2) allergic and allergic reactions, such as allergy Rhinitis, contact dermatitis, allergic conjunctivitis, etc., 3) inflammation, such as arthritis or inflammatory bowel disease, 4) pain, 5) skin disorders. For example, psoriasis, irritable eczema, etc. 6) cardiovascular disorders such as angina, myocardial ischemia, hypertension, platelet condensation, etc. 7) resulting from ischemia induced by immunological or chemical (cyclosporine) etiology Renal failure, 8) migraine or multiple headaches, 9) eye diseases such as uveitis, 10) hepatitis caused by chemical, immunological or infectious stimuli, 11) trauma or shock conditions, such as burns, endotomia 12) rejection of heterozygous, 13) therapeutic administration of cytokines (eg interleukin II) and prevention of side effects associated with tumor necrosis factors, 14) chronic lung diseases such as cystic fibrosis, bronchitis and other small It is useful for treating or preventing large airway diseases and cholecystitis.
상기 화학식 1의 화합물의 예방 또는 치료를 위한 투여량은, 물론, 치료할 질환의 중증도 및 이의 투여 경로에 따라 변한다. 이는 또한 환자 개개인의 연령, 체중 및 반응에 따라서도 변한다. 일반적으로, 항천식, 항알러지 또는 소염용으로 사용하기 위한 1일 투여량으로 일반적으로 사용하기 위한 1일 투여량은 단일 또는 분할 투여량으로서, 약 0.1 내지 약 2.5mg/포유동물의 체중 kg, 바람직하게는 0.01 내지 0.5mg/kg. 가장 바람직하게는 0.01 내지 0.25mg/kg 이다. 한편, 몇 명 경우에 있어서는 상기 범위를 벗어나는 투여량으로 사용하는 것이 필요할 수 있다.The dosage for the prophylaxis or treatment of the compound of Formula 1, of course, depends on the severity of the disease to be treated and its route of administration. It also varies with the age, weight and response of each patient. In general, the daily dosage for use for anti-asthma, anti-allergic or anti-inflammatory is a single or divided dose for use as a single or divided dose, about 0.1 to about 2.5 mg / kg body weight of mammal, Preferably 0.01 to 0.5 mg / kg. Most preferably 0.01 to 0.25 mg / kg. On the other hand, in some cases it may be necessary to use a dosage outside the above range.
정맥내 투여용 조성물이 사용되는 경우, 항천식, 소염 또는 항알러지용으로 사용하기에 적합한 투여량은 화학식 1의 화합물 약 0.01 내지 약 2.5mg/체중 kg/일, 바람직하게는 0.01 내지 약 0.25mg/체중 kg/일이다.When a composition for intravenous administration is used, a suitable dosage for use for anti-asthma, anti-inflammatory or anti-allergic doses is from about 0.01 to about 2.5 mg / kg body weight / day, preferably 0.01 to about 0.25 mg of the compound of formula 1 Weight / kg / day.
경구 투여용 조성물이 사용되는 경우에 있어서, 항천식, 소염 또는 항알러지용으로 사용하기에 적합한 투여량 범위는, 예를 들면, 화학식(I)의 화합물 약 1 내지 약 2.5mg/체중 kg/일, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 1.5mg/체중 kg/일이다.When a composition for oral administration is used, a suitable dosage range for use for anti-asthma, anti-inflammatory or anti-allergic reactions is, for example, about 1 to about 2.5 mg / kg body weight / day of compound of formula (I) , Preferably from about 0.5 to about 1.5 mg / kg body weight / day.
안 질환 치료를 위해서는, 허용되는 안용 제형물 중의 화학식 1의 화합물의 용액 또는 현탁액 0.001 내지 1중량%를 포함하는 안 투여용 안용 제제를 사용할 수 있다.For the treatment of eye diseases, ophthalmic formulations for ophthalmic administration comprising 0.001 to 1% by weight of a solution or suspension of the compound of formula 1 in an acceptable ophthalmic formulation may be used.
포유동물, 특히 사람에게 본 발명의 화합물의 유효량을 제공하기 위한 적합한 투여 경로를 이용할 수 있다. 예를 들면,경구, 직장, 국소, 비경구, 안내, 폐내 및 비강내 투여 등을 이용할 수 있다. 투여 형태는 정제, 트로키제, 분산제, 현탁제, 액제, 캡슐제, 크림제, 연고제 및 에어로졸 등이 포함된다.Suitable routes of administration may be used to provide an effective amount of a compound of the invention to a mammal, in particular a human. For example, oral, rectal, topical, parenteral, intraocular, intrapulmonary and intranasal administration may be used. Dosage forms include tablets, troches, dispersants, suspensions, solutions, capsules, creams, ointments, aerosols, and the like.
본 발명의 약제학적 조성물은 활성 성분으로서 화학식 1의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 포함하고, 또한 약제학적으로 허용되는 담체 및 임의로 기타의 치료용 성분을 함유할 수도 있다. 용어 '약제학적으로 허용되는 염'은 약제학적으로 허용되는 무독성 염기 또는 산(여기에는 무기 염기 또는 무기 산 및 유기 염기 또는 유기산이 포함된다)으로부터 제조된 염을 의미한다.The pharmaceutical compositions of the present invention comprise a compound of formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as the active ingredient, and may also contain a pharmaceutically acceptable carrier and optionally other therapeutic ingredients. The term 'pharmaceutically acceptable salts' means salts prepared from pharmaceutically acceptable non-toxic bases or acids, including inorganic bases or inorganic acids and organic bases or organic acids.
조성물에는 경구, 직장, 국소, 피하, 근육내 및 정맥내를 포함하는 비경구, 안내(눈으로), 폐내(비강 흡입법 또는 구강흡입법) 또는 비강내로 투여하기에 적합한 조성물이 포함되며, 어떠한 경우라도 가장 적합한 경로는 치료할 질환의 특성 및 중증도, 및 활성 성분의 특성에 따라 다를 것이다. 조성물은 편리하게는 단위 투여 형태로 존재할 수 있고, 약학 분야에서 잘 공지된 방법 중 하나에 의해 제조될 수 있다.Compositions include compositions suitable for oral, rectal, topical, subcutaneous, intramuscular and intravenous parenteral, intraocular (eye), intrapulmonary (nasal inhalation or oral inhalation) or intranasal administration, in any case The most suitable route will depend on the nature and severity of the disease to be treated and the nature of the active ingredient. The composition may conveniently be presented in unit dosage form and may be prepared by one of the methods well known in the art of pharmacy.
흡입법으로 투여하는 경우, 본 발명의 화합물은 가압된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 분무제 형태로 편리하게 운반된다. 또한, 본 발명의 화합물은 제형화될 수 있는 분말로서 운반될 수 있고 분말 조성물은 통기 분말 흡입 장치를 사용하여 흡입시킬 수 있다.When administered by inhalation, the compounds of the present invention are conveniently delivered in the form of aerosol sprays from a pressurized pack or sprayer. In addition, the compounds of the present invention can be delivered as powders that can be formulated and the powder composition can be inhaled using an aeration powder inhalation device.
화학식 1의 화합물의 적합한 국소 투여용 제형물에는 경피용 제제, 에어로졸, 크림제, 연고제, 로션제 및 살포제가 포함된다. 실제로 사용할 경우, 활성 성분으로서의 화학식1의 화합물을 통상의 약제학적 혼합 기술에 따라 약제학적 담체와 함께 혼합물로 잘 혼합시킬 수 있다. 담체는 목적하는 투여 형태(예를 들면, 경구 또는 정맥내 투여를 포함하는 비경구 투여)에 따라 다양할 수 있다. 경구용 투여 형태의 조성물을 제조할 때, 예를 들면, 현탁제, 엘릭서제 및 액제와 같은 액체 경구용 제제의 경우에, 통상의 약제학적 매질, 예를 들어, 물, 글리콜, 오일, 알콜, 향미제, 방부제 및 착색제 중의 임의의 것을 사용할 수 있거나, 예를 들면, 산제, 캡슐제 및 정제와 같은 고체 경구용 제제의 경우에, 전분, 당, 미정질 셀루로오즈, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제 및 붕해제와 같은 담체를 사용할 수 있으며, 고체 경구용 제제가 액체 제제보다 바람직하다. 정제 및 캡슐제는 이들의 투여 용이성 때문에 가장 이로운 경구 투여 단위 형태이며, 이때 고체 약제학적 담체가 명백하게 사용된다. 경우에 따라, 정제는 표준 수성 또는 비수성 기술에 의해 피복시킬 수 있다.Suitable topical formulations of the compound of formula 1 include transdermal preparations, aerosols, creams, ointments, lotions and dusting agents. In practical use, the compound of formula 1 as active ingredient can be well mixed in a mixture with a pharmaceutical carrier according to conventional pharmaceutical mixing techniques. Carriers can vary depending on the desired dosage form (eg, parenteral administration including oral or intravenous administration). When preparing compositions in oral dosage forms, for example, in the case of liquid oral preparations such as suspensions, elixirs and solutions, conventional pharmaceutical media such as water, glycols, oils, alcohols, Any of flavors, preservatives and coloring agents may be used, or in the case of solid oral preparations such as powders, capsules and tablets, for example, starches, sugars, microcrystalline cellulose, diluents, granulating agents, lubricants Carriers such as, binders and disintegrants may be used, with solid oral formulations preferred over liquid formulations. Tablets and capsules are the most advantageous oral dosage unit form because of their ease of administration, in which solid pharmaceutical carriers are explicitly used. If desired, tablets may be coated by standard aqueous or non-aqueous techniques.
본 발명에서 류코트리엔에 의해 유발되는 질병 중 특히 오브알부민으로 천식을 유발시킨 동물모델에 본 발명의 상기 화학식 1의 이미다졸 화합물을 투여한 결과 호산구(eosinophile)의 폐로의 침투를 크게 감소하는 결과를 관찰하여 본 발명의 화합물이 천식의 치료제로 유용함을 알 수 있었다.In the present invention, as a result of administering the imidazole compound of Formula 1 of the present invention to an animal model causing asthma with ovalbumin, among the diseases caused by leukotriene, a result of greatly reducing the infiltration of eosinophils into the lungs was observed. The compounds of the present invention was found to be useful as a treatment for asthma.
이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의해여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited by the examples.
실시예 1 : LTB4의 합성에 p38 키나제의 영향Example 1 Influence of p38 Kinase on the Synthesis of LTB4
본 발명에서 상기 화학식 1의 이미다졸 화합물은 칼바이오켐(Calbiochem co.)에서 구입(상품명은 SB203580, 카다로그 번호는 559389)하여 사용하였다. Rat-2 섬유아세포(ATCC, CRL 1764)는 미국기탁기관(American Type Culture Collection)으로부터 분양받은 것이다. Rat-2 섬유아세포의 배지조건은 10% FBS이 포함된 DMEM [100 ml FBS, 890ml DMEM, 10ml 비필수 아미노산(Non-essential Amino acids)(100 X), 2ml 젠타마이신(Gentamycin), 1ml 픈기존(Fungizon)]이고, 37℃에서 배양한다.In the present invention, the imidazole compound of Chemical Formula 1 was purchased from Calbiochem co. (Brand name SB203580, catalog number 559389) and used. Rat-2 fibroblasts (ATCC, CRL 1764) were sold from the American Type Culture Collection. The medium condition of Rat-2 fibroblasts was DMEM containing 10% FBS [100 ml FBS, 890ml DMEM, 10ml Non-essential Amino acids (100 X), 2ml gentamycin, 1ml (Fungizon)] and incubated at 37 ° C.
Rat-2 섬유아 세포에 10 ng/ml TNF-a를 처리하기 30분전에 p38 MAP 키나제의 저해물질인 상기 화학식 1의 이미다졸 화합물 (15 uM), 혹은 5-LO의 저해물질인 MK-886 (BIOMOL에서 구입하였으며, catalogue number는 EI-266 (Plymouth Meeting, PA))(50 nM)를 전처리한 것과 전처리 하지 않은 것의 LTB4의 합성되는 양을 측정하여 비교하였다. 생성되는 세포내의 LTB4의 정량은 세포 (3 ×1,000,000)를 60 mm 디쉬(dishes)에서 배양하고 LTB4의 정량을 위해서는 프레이트(plate)를 차가운 PBS(Phosphate buffer saline)액으로 두번 세척하였다. 그리고 동량의 에탄올을 혼합한 후에 4℃ 에서 30 분간 방치하였다. 생성되는 침전물은 10,000 rpm (30 min, 4℃)조건에서 원심분리후에, 상층액은 LTB4 의 정량을 위해 사용하였다. C2 역상컬럼(reverse phase column) (구입처: Amersham Pharmacia Biotech, RPN 1903)을 통과한후, 통과시킨 샘플에서의 메틸 포르메이트(methyl formate)는 제거시키고, 나머지는 ELISA 방법(구입처: Amersham Pharmacia Biotech, RPN 224)를 이용하여 정량을 실시하였다. 효소 면역분석(enzyme immunoassay)은 표준 LTB4 (0.31pg - 40pg per well)을 사용하여 정량하였으며, 정확도를 위하여 ANOVA (p<0.05)를 사용하여 통계처리하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.30 minutes prior to treatment with 10 ng / ml TNF-a in rat-2 fibroblasts, the imidazole compound of Formula 1 (15 uM), an inhibitor of p38 MAP kinase, or MK-886, an inhibitor of 5-LO (Purchased from BIOMOL, catalog number was measured by comparing the amount of LTB4 synthesized with and without pretreatment of EI-266 (Plymouth Meeting, PA)) (50 nM). Quantification of the resulting intracellular LTB4 was incubated cells (3 × 1,000,000) in 60 mm dishes (dishes) and plate was washed twice with cold PBS (Phosphate buffer saline) solution for quantification of LTB4. And after mixing the same amount of ethanol, it was left to stand at 4 degreeC for 30 minutes. The resulting precipitate was centrifuged at 10,000 rpm (30 min, 4 ° C.) and the supernatant was used for quantification of LTB4. After passing through a C2 reverse phase column (purchased from Amersham Pharmacia Biotech, RPN 1903), methyl formate in the passed sample is removed, and the rest is subjected to ELISA method (purchased from Amersham Pharmacia Biotech, Quantification was carried out using RPN 224). Enzyme immunoassay was quantified using standard LTB4 (0.31 pg-40 pg per well), and statistically processed using ANOVA ( p <0.05) for accuracy. The results are shown in FIG. 2.
도 2에 나타낸 바와 같이, TNF-a (일반적인 Leukotrienes의 생성을 위해 처리한 싸이토카인의 일종으로서 10ng/ml을 30분간 처리)을 처리한 후에 살펴보면, 상기 화학식 1의 이미다졸 화합물을 전처리한 경우 종래 5-LO 저해제로 알려진 MK-886 보다 LTB4의 합성이 더 억제되는 것으로 나타나 LTB4의 합성에 p38 키나제가 필수적으로 관여함을 알 수 있었다.As shown in Figure 2, after treatment with TNF-a (10 ng / ml 30 minutes treatment as a kind of cytokine treated for the production of general Leukotrienes), when the pre-treated with the imidazole compound of Formula 1 The synthesis of LTB4 was more inhibited than MK-886, which is known as a -LO inhibitor, indicating that p38 kinase is essential for the synthesis of LTB4.
실시예 2 : 5-리폭시게나제의 핵막으로 이동 억제Example 2: Inhibition of migration into nuclear membrane of 5-lipoxygenase
p38 MAPK를 억제시킴으로서 5-리폭시게나제 (5-LO)의 핵막으로의 이동이 억제되는 지 여부를 실험하지 위하여 혈청(Serum)이 고갈된 Rat-2 혹은 Rat2-RacN17세포 (RacN17이라는 dominant negative Rac 돌연변이가 발현된 Rat-2세포; 참조논문, Journal of Biological Chemistry. 274, 24372-24377 '99)에 GFP-5-LO DNA를 발현시킨 후에, 세포질내의 칼슘을 증가시키는 물질로 알려진 이오노마이신 (ionomycin: 0.5 uM)을 2분간 처리한후에, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 15분간 고정하였다. 세포의 핵모양의 변화와 5-LO의 핵막이동현상을 Axiovert25 inverted microscope (Carl Zeiss, Inc)로 분석하였고, 정확한 이미지는 SPOT software V2.2 (Diagnostic Instruments, Inc)을 사용하여 분석하였다.Serum-depleted Rat-2 or Rat2-RacN17 cells (dominant negative Rac called RacN17) to test whether inhibition of p38 MAPK inhibits migration of 5-lipoxygenase (5-LO) to the nuclear membrane Expression of GFP-5-LO DNA in Rat-2 Cells with Mutated Expression; Journal of Biological Chemistry. 274, 24372-24377 '99, and Ionomycin, a substance that increases calcium in the cytoplasm ionomycin: 0.5 uM) was treated for 2 minutes, and then fixed with 4% paraformaldehyde for 15 minutes. Nuclear cell changes and nuclear membrane movement of 5-LO were analyzed by Axiovert25 inverted microscope (Carl Zeiss, Inc), and accurate images were analyzed using SPOT software V2.2 (Diagnostic Instruments, Inc).
5-LO가 활성화되기 위하여는 염증유발시나, 세포내에 이오노마이신(ionomycin)등과 같이 칼슘(calcium)농도를 증가시킴으로서 핵막으로 이동을 하여, 면역 형광 현미경 하에서 핵막부위가 진하게 보이게 된다.In order to activate 5-LO, when the inflammation is induced or by increasing calcium concentration, such as ionomycin in the cell, the membrane moves to the nuclear membrane, and the nuclear membrane region becomes dark under immunofluorescence microscopy.
도 3에 나타낸 바와 같이, MAP 키나제의 일종인 ERK의 억제제인 PD 98059 [1-(2-amino-3-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one, Catalogue # P-215, RBI Co.(Natick, Massachusetts, USA) 에서 구입](10uM)는 5-LO의 핵막으로 이동을 전혀 억제하지 않으며, 칼슘과 강하게 결합하여 칼슘의 농도를 낮추는 역할을 할 수 있는 EGTA (2mM)에 의해서 5-LO의 핵막으로의 이동이 억제되는 것을 나타났다. 그리고 본 발명 하기 화학식 1의 이미다졸 화합물(15uM)에 의해서 5-LO의 핵막으로 이동을 완벽하게 억제한다.As shown in FIG. 3, PD 98059 [1- (2-amino-3-methoxyphenyl) -4H-1-benzopyran-4-one, Catalog # P-215, RBI Co. (10uM), purchased from Natick, Massachusetts, USA, does not inhibit migration to the 5-LO nucleus at all, and it is strongly influenced by EGTA (2mM), which binds to calcium and acts to lower the concentration of calcium. It has been shown that the migration of LO to the nuclear membrane is inhibited. In addition, the present invention completely inhibits migration to the 5-LO nuclear membrane by the imidazole compound of Formula 1 (15 uM).
상기 실시예 1의 결과와 본 실시예의 결과를 종합하여 판단하건데, p38 키나제 억제제인 본 발명 상기 화학식 1의 이미다졸 화합물이 5-LO의 핵막이동을 억제하여 류코트리엔의 합성을 억제한다. 그리고 5-LO의 핵막이동에 p38 키나제가 필요하다는 것을 알 수 있다.Judging from the results of Example 1 and the results of the present embodiment, the imidazole compound of the formula 1 of the present invention, which is a p38 kinase inhibitor, inhibits nuclear membrane migration of 5-LO to inhibit synthesis of leukotriene. And it can be seen that p38 kinase is required for nuclear membrane migration of 5-LO.
실시예 3 : 본 발명의 화합물이 천식이 유발된 동물모델에 미치는 영향Example 3 Effect of Compounds of the Invention on Animal Models Induced Asthma
조직상해가 일어나면 세포들간의 분비물질을 통한 신호전달을 통해 호산구(eosinophils)와 대식세포 등의 이동이 활성화된다. p38 MAPK의 억제물질인본 발명의 상기 화학식 1의 이미다졸 화합물(2.5 mg/kg)이 호산구(eosinophil)의 이동에 영향을 미치는지를 확인하여 천식 등의 염증질환 치료에 본 발명의 화합물을 응용 할 수 있을지를 알아 보았다.When tissue injury occurs, the transport of eosinophils and macrophages is activated by signaling through secretory substances between cells. To determine whether the imidazole compound of formula 1 (2.5 mg / kg) of the present invention, which is an inhibitor of p38 MAPK, affects the movement of eosinophils, and may apply the compound of the present invention to the treatment of inflammatory diseases such as asthma. See if you can.
C57BL/6 (다물 science [대전]에서 구입하였으며, 암컷 20 마리, 10 주령된 것으로 실험)에 오브알부민과 알루미나겔 (Ovalbumin 500㎍를 생리 식염수에 녹임) 200㎕를 복강내 투여한 후 2 주후에 2% 오브알부임을 분무하여 감작시키고, 1% 오브알부민을 21일, 22일, 23일에 분무하고 25일에 10% 오브알부민을 분무하여 감작시킨다. 감작된 mouse의 BALF(Bronchoalveolar lavage fluid)의 분석을 위해서는 오브알부민(10% w/v)으로 감작된 마우스들을 각 시간대별(0, 24, 48, 72)로 에테르(ether)를 이용하여 희생시킨다. 각각의 희생시킨 마우스들은 기관지(trachea)에 미세관을 연결한 후, 이 관을 통하여 PBS (phosphate-buffered saline, 0.8ml)를 주입하고 이를 다시 회수하는 과정을 2회 반복한다. 이렇게 하여 얻어진 BALF (Bronchoalveolar lavage fluid)는 원심분리를 통하여, 기도 내강(airway lumen)내에 존재하는 세포와 이 세포들 및 허파에서 분비된 여러 단백질들을 분리하고, 분리된 세포는 다시 시토스핀(cytospin)을 이용하여 스라이드(slide)에 고정시킨 후, 디프-퀵 염색용액(Diff-Quick staining solution)을 이용 염색한 후, 각각의 세포의 모포러지(morphology)를 보고 카운팅(counting) 한다. 각 샘플당 5곳의 랜덤 지역(random region)을 카운팅(counting)하여 각 세포의 호산구(eosinophil)의 비를 구하여 그 결과를 도 4의 (a) 및 (b)에 나타내었다.Two weeks after intraperitoneal administration of 200 μl of ovalbumin and alumina gel (500 μg dissolved in physiological saline) into C57BL / 6 (20 females, 10 weeks old). 2% ovalbuim is sensitized by spraying, 1% ovalbumin is sensitized by spraying on days 21, 22 and 23 and 10% ovalbumin on 25 days. For analysis of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) in sensitized mice, mice sensitized with ovalbumin (10% w / v) were sacrificed using ether at each time slot (0, 24, 48, 72). . Each of the sacrificed mice connects the microtubules to the trachea, injects PBS (phosphate-buffered saline, 0.8 ml) through the tubes, and recovers them twice. The BALF (Bronchoalveolar lavage fluid) thus obtained separates cells present in the airway lumen and various proteins secreted from these cells and lungs by centrifugation, and the isolated cells are then subjected to cytospin. After fixing to a slide (slide) using, and then stained using a Diff-Quick staining solution (Diff-Quick staining solution), and counting (counting) by looking at the morphology of each cell. Counting five random regions per each sample (counting) to determine the ratio of the eosinophil (eosinophil) of each cell and the results are shown in Figure 4 (a) and (b).
도 4의 (a)에 나타낸 바와 같이, 폐로 침투되는 호산구의 비율은오브알부민(10% W/V)에 노출 후 50여시간 까지 지속적으로 호산구의 수가 증가됨을 알 수 있다. 그러나 도 4의 (b)에 나타낸 바와 같이 오브알부민(10% W/V)에 노출 후 72시간에서 38 MAPK의 억제제인 본 발명의 화합물을 2.5㎎/㎏으로 전처리 함으로써 호산구의 수가 크게 감소했음을 알 수 있다.As shown in (a) of Figure 4, the ratio of eosinophils penetrated into the lung can be seen that the number of eosinophils continuously increased up to 50 hours after exposure to ob albumin (10% W / V). However, as shown in (b) of FIG. 4, the number of eosinophils was significantly reduced by pretreatment of the compound of the present invention, which is an inhibitor of 38 MAPK at 2.5 mg / kg, at 72 hours after exposure to ovalbumin (10% W / V). Can be.
또한 상기에서 BALF (Bronchoalveolar lavage fluid)를 얻은 후에 침착된 세포를 따로 원심분리후 수거하여 시스토핀(Cytospin)을 사용하여 슬라이드(slide)에 고정시켰다. 그리고 Hematoxilin-Eosin (혹은 Diff-Quick 용액) 용액으로 염색후에, Carzeiss현미경 (model: AXIOVERT 25-CEL)을 사용하여 관찰하고 digital camera로 촬영하여 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 오브알부민으로 천식을 유도한 마우스에 본 발명의 화합물을 2.5㎎/㎏ 전처리 함으로써 호산구가 폐로 침투되는 것을 억제되는 것을 알 수 있었다.In addition, after obtaining the BALF (Bronchoalveolar lavage fluid), the deposited cells were collected after centrifugation and fixed on a slide using cytospin. After staining with Hematoxilin-Eosin (or Diff-Quick solution) solution, the result was observed using a Carzeiss microscope (model: AXIOVERT 25-CEL), photographed with a digital camera, and the results are shown in FIG. 5. As shown in FIG. 5, it was found that eosinophils were inhibited from infiltrating into the lungs by pretreatment of 2.5 mg / kg of the compound of the present invention to mice inducing asthma with ovalbumin.
상기 실시예에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 이미다졸 화합물은 류코트리엔 합성에 관련된 5-리폭시게나제의 핵막으로 이동을 저해하여 효소활성을 억제함으로써 염증성 질환등을 유발하는 류코트리엔의 합성을 억제하는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 화합물은 류코트리엔과 관련된 질병, 즉 천식, 만성 기관지염 및 관련 폐쇄성 기도 질환, 알러지 및 알러지성 질환, 관절염 또는 염증성 질환, 통증, 피부 장애. 예를 들면, 건선, 과민성 습진 등, 심장혈관 장애, 예를 들면, 앙기나,심근 허혈, 고혈압, 혈소판 응결 등, 면역학적 또는 화학적(사이클로스포린)병인에 의해 유도되는 허혈로부터 발생하는 신부전증등의 질환의 치료 또는 예방용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.As described in the above examples, the imidazole compound of the present invention has an effect of inhibiting the synthesis of leukotriene causing inflammatory diseases by inhibiting the enzyme activity by inhibiting migration to the nuclear membrane of 5-lipoxygenase related to leukotriene synthesis. have. Thus, the compounds of the present invention are useful for treating diseases associated with leukotriene, namely asthma, chronic bronchitis and related obstructive airway diseases, allergic and allergic diseases, arthritis or inflammatory diseases, pain, skin disorders. For example, diseases such as cardiovascular disorders such as psoriasis and irritable eczema such as renal failure caused by ischemia induced by immunological or chemical (cyclosporine) etiology, such as angina, myocardial ischemia, hypertension, and platelet condensation. It can be usefully used as a composition for the treatment or prevention of.
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100805155B1 (en) * | 2006-09-15 | 2008-02-21 | 삼성에스디아이 주식회사 | Organic light emitting diode display having thin film transistor and manufacturing the same |
| JP2008531627A (en) * | 2005-02-28 | 2008-08-14 | メルクレ，ゲーエムベーハー | 2-sulfinyl- and 2-sulfonyl substituted imidazole derivatives and their use as cytokine inhibitors |
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| US5965583A (en) * | 1997-04-24 | 1999-10-12 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Substituted imidazoles useful in the treatment of inflammatory disease |
-
2001
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