KR20010108053A - 당뇨병성 허혈성 질환 유전자 치료 - Google Patents

당뇨병성 허혈성 질환 유전자 치료 Download PDF

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무라야마 마사노리
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Abstract

당뇨병성 허혈부위에 HGF(간 실질세포 증식인자) 유전자를 투여함으로써, 당뇨병에 의해 저하된 허혈부위의 혈관신생 촉진을 도모하고, 허혈성 질환을 회복시키는 효과를 갖는다.

Description

당뇨병성 허혈성 질환 유전자 치료{Gene therapy for diabetic ischemic disease}
HGF는, 성숙 간세포에 대한 강력한 증식 촉진인자로서 발견되어, 그 유전자 클로닝이 이루어진 단백질이다(Biochem Biophys Res Commun, 122, 1450(1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 6489, (1986), FEBS Letter, 22, 231(1987), Nature, 342, 440(1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3200(1991)). 그 후의 연구에 의해, HGF는 in vivo에 있어서 간 재생인자로서 장애 간의 수복 재생에 작용할 뿐 아니라 혈관 신생작용을 가져, 허혈성 질환이나 동맥 질환의 치료 또는 예방에 커다란 역활을 하고 있는 것이 명백해졌다(Symp. Soc. Exp. Bio1., 47 cell behavior, 227-234(1993), Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 1937-1941(1993), Circulation, 97, 381-390(1998)). 즉, 토끼의 하지 허혈 모델에 있어서 HGF를 투여하자, 현저한 혈관신생이 보여 혈류량의 개선, 혈압 감소의 억제, 허혈 증상의개선이 생겼다고 보고되어 있다. 이들 보고에 의해, 오늘날에는, 혈관 신생인자의 하나로서 HGF가 발현, 기능하고 있는 것으로 생각할 수 있게 되었다.
이와 같이 HGF는 혈관 신생인자의 기능을 비롯하여 여러 기능을 가지고 있어, 의약품으로서 활용하기 위한 여러 시도가 행해져 왔다. 그러나, 여기에서 문제가 되어 온 것이 HGF의 혈중에서의 반감기이다. HGF 반감기는 약 10분으로 짧아, 혈중 농도를 유지하는 것이 곤란하며, 또한, HGF 유효량의 환부로의 이행성이 문제가 되었다.
일반적으로 단백성 제제의 경우는 정맥내로의 투여가 많다는 것이 상식으로 되어 있어, 상기 허혈성 질환 모델에 대한 HGF 투여에 관해서도, 예를 들면 정맥이나 동맥내로의 투여예가 나타나 있다(Circulation, 97, 381-39O (1998)). 이와 같은 동물 모델에 대한 정맥 또는 동맥내 투여에 의해, 허혈성 질환 또는 동맥 질환에 대한 HGF의 유효성이 명확히 되어 있기는 하지만, 구체적인 HGF의 유효한 투여방법 또는 투여량 등에 대해서는 아직 결론이 나와 있지 않다. 특히 HGF 단백의 경우는, 상기와 같은 반감기의 문제, 환부로의 이행성 문제도 있어, HGF 단백의 유효한 투여법 또는 투여량 등에 대해서는, 아직 결론이 나와 있지 않다.
또한 한편으로, 최근 분자 생물학의 비약적 향상에 의해, 유전자 도입법에 의한 세포 기능의 부활화가 가능해져, 여러 함입이 행해지고 있어, HGF 유전자를 사용하여, 심장 영역으로의 유전자 치료가 시도되도록 하고 있다. 유전자 도입법에 대해서는, 예를 들면, 관동맥내 확산주입법 등 몇 가지 보고가 있기는 하지만, 허혈부위로의 유전자 도입법 등, 특히 골격근에 대한 근육내 도입법을 사용하여, 구체적인 당뇨병성 허혈성 질환에 대해, 효과를 나타낸 예는 발견되지 않고 있다.
더욱이, 당뇨병을 병발하거나 또는 당뇨병성으로 야기되는 허혈성 질환에 있어서는 혈관신생이 일어나기 어렵고, 예후도 불량한 것이 알려져 있지만, 이와 같은 당뇨병성 허혈성 질환에 대해 HGF 유전자의 투여가 유효한지의 여부에 대해서는 조금도 명백하게 되어 있지 않다.
본 발명은, 간 실질세포 증식인자(HGF) 유전자를 사용한 당뇨병성 허혈성 질환의 치료제 및 치료법에 관한 것이다. 구체적으로는, HGF 유전자를 유효성분으로서 함유하는 당뇨병성 허혈성 질환 치료제나 HGF 유전자를 허혈부위에 투여하는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 허혈성 질환 치료법 등에 관한 것이다.
발명의 개시
본 발명의 목적은, HGF 유전자를 사용한 당뇨병성 허혈성 질환의 치료제 및 치료법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자 등은, HGF 유전자가 당뇨병성 허혈성 질환에 적응할 수 있는지 의 여부를 명확하게 하기 위해 예의 검토를 행한 결과, 해당 질환에 대해, 직접 허혈 환부에 HGF 유전자를 투여함으로써, 지극히 유효한 효과를 얻을 수 있음을 명백히 했다. 구체적으로는 하지 허혈성 질환에 있어서, 하지 골격근층에 HGF 유전자를 투여함으로써, 유효한 효과를 얻을 수 있음을 발견했다. 상술과 같이 당뇨병을 병발하거나 또는 당뇨병성으로 야기되는 허혈성 질환에 있어서는 혈관신생이 일어나기 어렵고, 예후도 불량한 것이 알려져 있다. 그 때문에 단순한 허혈성 질환과 달리, 당뇨병성 허혈성 질환에 대해 HGF 유전자가 유효한지의 여부는 지금까지 명백하게 되어 있지 않았지만, 본 발명에 의해 처음으로 그 유효성이 나타내어졌다.
이와 같은 HGF 유전자에 의한 치료는 비침습적인 치료법이기 때문에, 병의 상태에 따라 여러번 상기 유전자를 투여하는 것이 가능하다는 특징을 갖는다.
즉, 본 발명의 요지는 이하와 같다.
(1) 간 실질세포 증식인자(HGF)유전자를 유효 성분으로서 함유하는, 당뇨병성 허혈성 질환 치료제,
(2) 상기(1)에 있어서, 허혈부위로 투여하기 위한 치료제,
(3) 상기(1) 또는 (2)에 있어서, 당뇨병성 허혈성 질환이, 당뇨병성 하지 허혈성 질환, 당뇨병성 허혈성 신경장애 또는 당뇨병성 심근경색인 치료제,
(4) 상기(3)에 있어서, 당뇨병성 허혈성 질환이 당뇨병성 하지 허혈성 질환인 치료제,
(5) 상기(1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 허혈 부위의 근육내로 투여하기 위한 치료제,
(6) 상기(1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, HGF 유전자가 센다이 ·바이러스 (HVJ)-리포솜의 형태로 있는 치료제,
(7) 상기(1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 필요에 따라 복수회 투여하기 위한 치료제,
(8) 상기(1) 내지 (7) 중 어느 하나에 있어서, HGF 유전자로서 적어도 50 ㎍을 사용하는 치료제,
(9) HGF 유전자를 인간에게 도입하는 것을 포함하는, 당뇨병성 허혈성 질환의 치료법,
(l0) 상기(9)에 있어서, HGF 유전자를 허혈부위에 투여하는 치료법,
(11) 상기(9) 또는 (10)에 있어서, 당뇨병성 허혈성 질환이, 당뇨병성 하지 허혈성 질환, 당뇨병성 허혈성 신경장애 또는 당뇨병성 심근경색인 치료법,
(12) 상기(11)에 있어서, 당뇨병성 허혈성 질환이 당뇨병성 하지 허혈성 질환인 치료법,
(13) 상기(9) 내지 (12) 중 어느 하나에 있어서, HGF 유전자를 허혈부위의 근육내로 투여하는 치료법,
(14) 상기(9) 내지 (13) 중 어느 하나에 있어서, HGF 유전자가 센다이 ·바이러스 (HVJ)-리포솜의 형태로 있는 치료법,
(15) 상기(9) 내지 (14) 중 어느 하나에 있어서, HGF 유전자를 필요에 따라 복수회 투여하는 치료법,
(16) 상기(9) 내지 (15) 중 어느 하나에 있어서, HGF 유전자로서 적어도 50 ㎍을 투여하는 치료법,
(17) 당뇨병성 허혈성 질환 치료제의 제조를 위한 HGF 유전자의 사용,
(l8) 상기(17)에 있어서, 당뇨병성 허혈성 질환이, 당뇨병성 하지 허혈성 질환, 당뇨병성 허혈성 신경장애 또는 당뇨병성 심근경색인 사용,
(19) 상기(18)에 있어서, 당뇨병성 허혈성 질환이 당뇨병성 하지 허혈성 질환인 사용,
(20) 상기(17) 내지 (19) 중 어느 하나에 있어서, HGF 유전자가 센다이 ·바이러스 (HVJ)-리포솜의 형태로 있는 사용,
(21) 상기(17) 내지 (20) 중 어느 하나에 있어서, HGF 유전자로서 적어도 50 ㎍을 사용하는 사용.
도면의 간단한 설명
도1은, 참고예1의 당뇨병 하지 허혈 래트군 및 정상 래트에 하지 허혈을 야기한 대조군에 있어서의, 혈액환류비율(Perfusion ratio)의 경시적 변화를 나타낸 그래프이다.
도2는, 참고예1의 당뇨병 하지 허혈 래트군 및 정상 래트에 하지 허혈을 야기한 대조군에 있어서의 허혈 근육내의 내재성 HGF 농도를 나타낸 그래프이다.
도3은, 실시예1의 당뇨병 하지 허혈 래트로의 HGF 유전자 투여군 및 미투여군과, 정상 래트에 하지 허혈을 야기한 대조군에 있어서의, 혈액환류비율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도4는, 실시예2의 당뇨병 하지 허혈 래트로의 HGF 유전자 투여군 및 미투여군과, 정상 래트에 하지 허혈을 야기한 대조군에 있어서의, 하지 허혈부의 골격근을 ALP 염색하고, 단위당 혈관수를 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도5는, 참고예2의 글루코오스를 첨가한 혈관 내피세포의 HGF 첨가군 및 미첨가군과, 글리코오스를 첨가하지 않은 대조군에 있어서의, 배양상청의 MMP-1농도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도6은, 참고예3의 글루코오스를 첨가한 혈관 내피세포의 HGF 첨가군 및 미첨가군과, 글루코오스를 첨가하지 않은 대조군에 있어서의, 혈관 내피세포 속에 발현하는 전사인자 ETS-1의 mRNA량을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명에 있어서 사용되는「HGF 유전자」란, HGF(HGF 단백)을 발현 가능한유전자를 가리킨다. 구체적으로는, Nature, 342, 440(1989), 특허 제2777678호 공보, Biochcm. Biophys. Res. Commun., 163, 967(1989), Biochem. Biophys. Res. Commun., 172, 321(1990) 등에 기재된 HGF의 cDNA를 후술과 같이 적당한 발현벡터(비 바이러스 벡터, 바이러스 벡터)에 삽입한 것을 들 수 있다. 여기에서 HGF를 코드하는 cDNA의 염기서열은, 상기 문헌에 기재되어 있는 것 이외에, Genebank 등의 데이터 베이스에도 등록되어 있다. 따라서 이들의 서열정보를 토대로 적당한 DNA 부분을 PCR의 프라이머로서 사용하여, 예를 들면 간장이나 백혈구 유래의 mRNA에 대해 RT-PCR반응을 행함으로써, HGF의 cDNA를 클로닝할 수 있다. 이들 클로닝은, 예를 들면 Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989) 등의 기본서에 따라, 당업자라면 용이하게 행할 수 있다.
또한, 본 발명의 HGF 유전자는 상술한 것에 한정되지 않고, 발현되는 단백질이 HGF와 실질적으로 동일한 작용을 갖는 유전자인 한, 본 발명의 HGF 유전자로서 사용할 수 있다. 즉, 1) 상기 cDNA와 스트린젠트(stringent)한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA나, 2) 상기 cDNA에 의해 코드되는 단백질의 아미노산 서열에 대해 1 또는 복수(바람직하게는 수개)의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 아미노산 서열로 된 단백질을 코드하는 DNA 등 중에서, HGF로서의 작용을 갖는 단백을 코드하는 것이라면, 본 발명의 HGF 유전자의 범주에 포함된다. 여기에서 상기 1) 및 2)의 DNA는, 예를 들면, 부위 특이적 돌연변이 유발법, PCR법, 또는 통상의 하이브리다이제션법 등에 의해 용이하게 얻을 수 있으며, 구체적으로는 상기 Molecular Cloning 등의 기본서를 참고로 하여 행할 수 있다.
다음으로, 본 발명의 유전자 치료에 있어서 사용되는 유전자 도입법, 도입 형태 및 도입량 등에 대해 기술한다.
HGF 유전자를 유효 성분으로 하는 유전자 치료제를 환자에게 투여하는 경우, 그 투여형태로서는 비 바이러스 벡터를 사용한 경우와, 바이러스 벡터를 사용한 경우의 둘로 크게 구별되며, 실험 안내서 등에 그 조제법, 투여법이 자세히 해설되어 있다(별책 실험의학, 유전자 치료의 기초기술, 요도샤, 1996, 별책 실험의학, 유전자 도입&발현해석 실험법, 요도샤, 1997, 일본 유전자 치료 학회편 유전자 치료 개발연구 핸드북, N ·T ·S, 1999). 이하, 구체적으로 설명한다.
A. 비 바이러스 벡터를 사용하는 경우
관용의 유전자 발현벡터에 목적으로 하는 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터를 사용하여, 이하와 같은 수법에 의해 목적 유전자를 세포나 조직에 도입할 수 있다.
세포로의 유전자 도입법으로서는, 리포펙션법(lipofection method), 인산-칼슘공침법(calcium phosphate co-precipitation method), DEAE-덱스트란법(DEAE-dextran method), 미소유리관(micro glass tube)을 사용한 DNA의 직접 주입법 등을 들 수 있다.
또한, 조직으로의 유전자 도입법으로서는, 내포형 리포솜(internal type liposome)에 의한 유전자 도입법, 정전기형 리포솜(electrostatic type liposome) 에 의한 유전자 도입법, HVJ-리포솜법, 개량형 HVJ-리포솜법(HVJ-AVE 리포솜법), 리셉터 개재성 유전자 도입법, 입자총(particle gun)으로 담체(금속입자)와 함께DNA 분자를 세포에 이입하는 방법, naked-DNA의 직접 도입법, 정전하 중합체에 의한 도입법들 중 어느 하나의 방법에 이용함으로써, 재조합 발현벡터를 세포내에 함입시키는 것이 가능하다.
이 중 HVJ-리포솜은, 지질2중막으로 만들어진 리포솜 속에 DNA를 봉입하고, 이 리포솜과 불활화한 센다이 바이러스(Hemagglutinating virus of Japan : HVJ)를 더 융합시킨 것이다. 해당 HVJ-리포솜법은 종래의 리포솜법과 비교하여, 세포막과의 융합활성이 매우 높은 것을 특징으로 하는 것으로, 바람직한 도입형태이다. HVJ-리포솜의 조제법에 대해서는 문헌(실험의학 별책, 유전자 치료의 기초기술, 요도샤, 1996, 유전자 도입&발현해석 실험법, 요도샤, 1997, J. Clin. Invest. 93, 1458-1464(1994), Am. J. Physiol. 271, R1212-1220(1996)) 등에 자세히 기술되어 있기 때문에, 그것들을 참조하기 바란다. 또한 HVJ-리포솜법이란, 예를 들면, Molecular Medicine, 30, 1440-1448(1993), 실험의학, 12, 1822-1826(1994), 단백질 ·핵산 ·효소, 42, 1806-1813(1997) 등에 기재한 방법으로, 바람직하게는 Circulation, 92(Suppl.II), 479-482(1995)에 기재한 방법을 들 수 있다.
또한, HVJ로서는 Z주(Z strain)(ATCC로부터 입수 가능)가 바람직하지만, 기본적으로는 다른 HVJ주(HVJ strain)(예를 들면 ATCC VR-907이나 ATCC VR-105 등)도 사용할 수 있다.
또한, naked-DNA의 직접 도입법은, 상기 수법중 가장 간편한 수법으로, 이 관점에서 바람직한 도입법이다.
여기서 사용되는 발현벡터로서는, 생체내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있는 벡터라면 어떤 발현벡터이더라도 좋지만, 예를 들면 pCAGGS(Gene 108, 193-200(1991))나, pBK-CMV, pcDNA3. 1, pZeoSV(인비트로겐사, 스트라타진사) 등의 발현벡터를 들 수 있다.
B. 바이러스 벡터를 사용하는 경우
바이러스 벡터로서는, 재조합 아데노 바이러스(adeno virus), 레트로 바이러스 (retro virus) 등의 바이러스 벡터를 사용한 방법이 대표적인 것이다. 보다 구체적으로는, 예를 들면, 무독화한 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 수반(隨伴)바이러스, 헤르페스 바이러스(herpes virus), 백신 바이러스(vaccinia virus), 폭스 바이러스(pox virus), 폴리오 바이러스(polio virus), 신드비스 바이러스(sindbis virus), 센다이 바이러스, SV40, 면역부전증 바이러스(HIV) 등의 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스에 목적으로 하는 유전자를 도입하여, 세포에 재조합 바이러스를 감염시킴으로써, 세포내에 유전자를 도입하는 것이 가능하다.
상기 바이러스 벡터 중, 아데노 바이러스의 감염효율이 다른 바이러스 벡터를 사용한 경우 보다도 훨씬 높은 것이 알려져 있어, 이 관점에서는, 아데노 바이러스 벡터계를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 유전자 치료제의 환자로의 도입법으로서는, 유전자 치료제를 직접 체내에 도입하는 in vivo법 및 인간으로부터 어떤 한 종류의 세포를 떼어 내어 체외에서 유전자 치료제를 상기 세포에 도입하고, 그 세포를 체내로 되돌리는 ex vivo법이 있다(닛케이사이엔스, 1994년 4월호, 20-45페이지, 월간약사, 36(1), 23-48(1994), 실험의학 증간, 12(15), (1994), 일본 유전자 치료 학회편 유전자 치료개발연구 핸드북, N ·T ·S, 1999). 본 발명에서는, in vivo법이 바람직하다.
제제형태로서는, 상기의 각 투여형태에 맞는 여러 제제형태(예를 들면 액제 등)를 취할 수 있다. 예를 들면, 유효 성분인 유전자를 함유하는 주사제로 된 경우, 해당 주사제는 일반적인 방법에 의해 조제할 수 있고, 예를 들면 적절한 용제(PBS 등의 완충액, 생리식염수, 멸균수 등)에 용해한 후, 필요에 따라 필터 등으로 여과 멸균하고, 이어서 무균 용기에 충전함으로써 조제할 수 있다. 해당 주사제에는 필요에 따라 관용의 담체 등을 가하더라도 좋다. 또한, HVJ-리포솜 등의 리포솜에 있어서는, 현탁제, 동결제, 원심분리 농축동결제 등의 리포솜 제제의 형태로 할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 HGF 유전자 이외에, 혈관 신생작용을 갖는 공지의 인자를 병용하거나 또는 단독으로 사용하는 것이 가능하다. 예를 들면, VEGF나 FGF 등의 인자는 혈관 신생작용을 갖는 것이 보고되어 있어, 이들 유전자를 사용할 수 있다. 또한, EGF 등의 증식인자는, 조직의 여러 세포장애를 수복하는 것이 보고되어 있어, 이들 유전자를 사용하는 것도 가능하다.
본 발명에서 말하는 당뇨병성 허혈성 질환이란, 당뇨병성 하지 허혈성 질환, 당뇨병성 허혈성 신경장애 또는 당뇨병성 심근경색 등으로, 이들중 어떠한 질환에 대해서도 본 발명의 유전자 치료제를 적용할 수 있다. 또한 본 발명의 유전자 치료제는, 중증의 당뇨병성 허혈성 질환 환자 뿐만 아니라, 진행중인 경도의 환자에게도 사용할 수 있다.
본 발명의 유전자 치료제는, 치료 목적의 질환, 증상 등에 따른 적당한 투여방법 ·투여부위가 선택된다. 투여방법으로서는, 비경구적으로 투여하는 것이 바람직하다. 또한 투여부위로서는, 허혈부위내에 투여하는 것이 바람직하다. 여기에서「허혈부위」란, 허혈환부 및 그 주변을 포함하는 부위을 가리킨다.
허혈부위에 있어서는, 구체적으로는 혈관내나 근육내 등으로의 투여가 가능하지만, 특히, 허혈부위의 근육내에 투여하는 것이 바람직하다. 즉, 하지 허혈성 질환에 있어서는, 하지 허혈부위의 골격근내에 투여함으로써, 허혈환부의 혈관신생을 촉진시켜 혈류량의 개선을 도모하고, 허혈환부의 기능 회복 정상화를 행할 수 있다. 또한 심근경색 등의 심질환에 있어서는, 심근내에 투여함으로써, 동일한 효과를 올릴 수 있다.
바람직한 투여방법으로서는, 예를 들면, 비침습적인 카테테르 또는 비침습적인 주사기 등에 의한 투여방법을 들 수 있다. 더욱이, 에코 사용하에서의 비침습적인 카테테르 또는 주사기 등에 의한 투여방법을 들 수 있다. 비침습적인 카테테르를 사용하는 투여방법으로서는, 예를 들면, 심질환에 있어서는, 심실내강(心室內腔)으로부터 심근내에 직접 HGF 유전자를 주입하는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 HGF 유전자를 적용함으로써, 당뇨병성 허혈성 질환 환자에 대해 적극적인 유전자 도입에 의한 치료를 행할 수 있으며, 예를 들면, 당뇨병성 하지 허혈성 질환의 환자에 있어서는, 종래라면 외과적인 환부의 절제 이외에는 방법이 없었던 중증 환자에 대해, 기능의 회복이 가능해진다.
본 발명의 치료제 투여량으로서는, 환자의 증상 등에 따라 다르지만, 성인환자 1인당 HGF 유전자로서 약 1 ㎍∼약 50 ㎎의 범위, 바람직하게는 약 l0 ㎍∼약 5mg, 보다 바람직하게는 약 50 ㎍∼약 5 mg의 범위에서 투여량이 선택된다.
본 발명의 치료제는, 수일 내지 수주일에 1회 투여하는 것이 적합하고, 투여횟수는 환자의 증상에 따라 적절히 선택된다. 본 발명의 치료제는, 비침습적인 투여에 이용되는 것이기 때문에, 병의 상태에 따라서 여러번 투여할 수 있다고 하는 특징을 갖는다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 조금도 한정되지는 않는다.
실험재료 및 방법
HVJ-리포솜 제제의 제작
1O mg의 건조지질(포스파티딜세린, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤의 1:4. 8:2 혼합물)과 HGF 유전자(100 ㎍)-HMG1 (high mobility group 1 nuclear protein, 25 ㎍)을 함유하는 등장액(137 μM NaCl, 5.4 μM KCl, 10 μM Tris-HCl; pH7.6) 200 ㎕를 혼합하여, 격하게 교반하고 초음파를 걸어 리포솜을 형성시켰다. 정제 센다이 바리러스(Z주)를 3분간 UV 조사(110erg/㎟/sec)했다. 리포솜 현탁액과 센다이 바이러스(HVJ)를 혼합하여 4℃에서 10분간, 이어서 37℃에서 30분간 가온했다. 유리(遊離)된 HVJ를 제거하여, HVJ-리포솜 제제를 취득했다.
실험동물
투여군 : 당뇨병 래트(DM-래트)의 하지 허혈 래트
대조군 ·래트 : 정상 래트의 하지 허혈 래트
HVJ-리포솜 제제의 투여법
복강내에 스트렙토조토신(streptozotocin)을 투여함으로써 유발시킨 16주 연령의 당뇨병 래트(1군 6마리)에 대해, 편측 대퇴동맥의 일부 외과적 절제를 행하여, 하지부에 허혈상태를 제작했다.
HGF 유전자 함유 HVJ-리포솜 제제를, 하지 허혈 골격근에 주입했다.
검토내용
리포솜 제제 투여 후, 측부 혈행로 형성 및 혈류 개선효과의 지표로서 레이저 산란광 해석에 의한 레이저 ·도플러 ·이메저(laser doppler imager :LDI)를 사용하여 하지 혈류를 측정했다. 정상 하지에 대한 허혈 하지의 색조 히스토그램 (colored histogram)의 평균값을 혈액환류비율(perfusion ratio)로 했다.
하지 허혈부분의 모세혈관 밀도를 알칼리 인산가수분해효소(alkaline phosphatase)(ALP)염색에 의해 측정하여, 당뇨병 하지 허혈 래트군과 대조군의 하지 허혈 래트군을 비교했다. 또는, HGF 유전자의 투여군과 미투여군과도 비교했다.
참고예1
당뇨병 래트의 하지 허혈 부위에 있어서 HGF 발현상황
복강내에 스트렙토조토신을 투여하여 유발시킨 16주 연령의 당뇨병 래트(1군 6마리) 및 대조군으로서 16주 연령의 정상 래트(1군 6마리)에 대해, 편측 대퇴동맥의 일부 외과적 절제를 행하여, 하지부에 허혈상태를 초래했다.
일주일 후, 레이저 · 도플러 ·이메저에 의해 허혈부위의 혈액환류비율을 측정했다. 당뇨병 하지 허혈 래트의 허혈부위의 혈액환류비율은, 대조군의 하지 허혈 래트의 혈액환류비율 보다도 훨씬 낮았다(도1 참조).
3주일 후, 5주일 후에도, 허혈부위의 혈액환류비율을 측정한 바, 마찬가지로 당뇨병 하지 허혈 래트의 허혈부위의 혈액환류비율은, 대조군의 하지 허혈 래트의 혈액환류비율 보다도 훨씬 낮았다(도1 참조).
근육내의 내재성 HGF의 농도는, 당뇨병 하지 허혈 래트의 허혈부위의 근육내에 있어서 대조군의 하지 허혈 래트의 근육내 보다도 현저히 낮았다. 이 결과는, 당뇨병에 있어서 혈관신생의 불량 원인이 근육내의 내재성 HGF 감소에 의한 것임을 나타내고 있다. 이 때문에, 당뇨병 하지 허혈 래트에서는, 혈관신생이 일어나기 어려워져, 측부 혈행로가 발달하지 않는 것으로 생각되어진다(도2 참조).
실시예1
당뇨병 하지 허혈 래트에 대한 HGF 유전자 치료의 효과 (I)
복강내에 스트렙토조토신을 투여함으로써 유발시킨 16주 연령의 당뇨병 래트(1군 6마리) 및 16주 연령의 정상 래트(1군 6마리)에 대해, 편측 대퇴동맥의 일부 외과적 절제를 행하여, 하지부에 허혈상태를 초래했다. 대퇴동맥의 외과적 절제 후, HGF 유전자(50 ㎍) 함유 HVJ-리포솜 제제를 하지 허혈부위의 근육내에 도입했다.
3주일 후, 레이저 ·도플러 ·이메저에 의해 허혈부위의 혈액환류비율을 측정했다. HGF 유전자가 투여된 당뇨병 하지 허혈 래트의 허혈부위의 혈액환류비율은, 대조군의 하지 허혈 래트와 미투여의 상기 당뇨병 하지 허혈 래트와 비교하여, 현저한 증가를 나타냈다.
대조군의 하지 허혈 래트의 혈액환류비율을 100%로 하자, HGF 유전자를 미투여한 당뇨병 하지 허혈 래트에서는 67%이고, HGF 유전자를 투여한 당뇨병 하지 허혈 래트에서는 129%였다. 결과를 도3에 나타낸다(도1 참조).
실시예2
당뇨병 하지 허혈 래트에 대한 HGF 유전자 치료의 결과 (Ⅱ)
상기와 동일하게 처치를 한 당뇨병 하지 허혈 래트, 대조군의 하지 허혈 래트를 제작하여, HGF 유전자 치료를 행했다. 5주일 후에 각 래트의 하지 허혈부위의 골격근을 떼어 내고, ALP 염색하여 단위 면적당 혈관수를 비교했다. HGF 유전자 미투여의 당뇨병 하지 허혈 래트에서는, 대조군의 하지 허혈 래트와 비교하여 유의하게 혈관수가 적고, HGF 유전자 투여의 당뇨병 하지 허혈 래트는 혈관수가 유의하게 증가되어 있었다. 결과를 도4에 나타낸다.
참고예2
혈관 내피세포에 의한 MMP-1의 생산에 대한 글루코오스 농도 및 HGF 첨가의 영향
혈관 내피세포(인간대동맥 유래)를 무혈청하에서, 글루코오스 농도가 0, 25 mM, 50 mM가 되는 3종의 배지에서 배양하여, 24시간 배양 후의 배양액 상청의 MMP-1 농도를 측정했다.
또한 각각, 글루코오스 첨부 30분 전에 HGF를 100 ng/㎖로 첨가한 경우와 비교했다.
상청 중의 MMP-1 농도가, 글루코오스의 농도 의존적으로 유의하게 감소하여, HGF 처리에 의해 MMP-1의 감소가 멈추고 증가하는 것이 나타났다. 결과를 도5에 나타낸다.
참고예3
혈관 내피세포에 대한 HGF의 효과(혈관신생에 관한 전사인자 ETS-1의 변화)
참고예1과 동일하게 혈관 내피세포를 배양하여, 세포 중에 발현하는 전사인자 ETS-1의 mRNA량을 측정했다. 대조군 내피세포의, ETS-1의 mRNA량을 100%로 하자, HGF 미첨가의 혈관 내피세포에서는 고 글루코오스의 조건에 의해 유의하게 감소하고 있었다. 한편, HGF 첨가의 혈관 내피세포에서는 대조군의 발현량과 비교하여 동등 이상으로 되어 있었다(P<0.Ol). 결과를 도6에 나타낸다.
이상과 같이, 고 글루코오스 조건하의 혈관 내피세포에서는, 혈관신생을 위해 필수 매트릭스 분해효소인 MMP-1의 생산이 감소하고, 혈관신생시에 발현, 증가하는 전사인자인 ETS-1의 mRNA 발현이 저하되고 있었다.
상기로부터, 고 글루코오스 조건하에서는 혈관신생이 일어나기 어려워지는 것이 명백해졌다. 한편, 고 글루코오스 조건하의 혈관 내피세포에 HGF를 첨가함으로써, MMP-1의 생산, ETS-1의 mRNA의 발현이 현저히 증가하고, HGF에 의해 혈관신생이 일어나기 쉬워진 것이 나타났다.
본 발명의 HGF 유전자를 유효 성분으로 하는 당뇨병성 허혈성 질환 치료제는, HGF 발현이 감소한 당뇨병성 허혈환부에 특유의 혈관신생 불량을 개선하고, 현저한 혈관 신생작용을 나타냄으로써, 허혈환부의 혈류량를 증대시켜 병의 상태를 개선할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 치료제는 환자의 병의 상태에 따라 1회 이상의투여를 행함으로써, 그 목적인 혈관신생을 촉진할 수 있다. 따라서 이들 효과에 의해, 본 발명의 치료제는 당뇨병성 하지 허혈성 질환, 당뇨병성 허혈성 신경장애 또는, 당뇨병성 심근경색을 보다 정확하게 치료할 수 있다.

Claims (21)

  1. 간 실질세포 증식인자(HGF) 유전자를 유효 성분으로서 함유하는, 당뇨병성 허혈성 질환 치료제.
  2. 제1항에 있어서, 허혈부위로 투여하기 위한 치료제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 당뇨병성 허혈성 질환이, 당뇨병성 하지 허혈성 질환, 당뇨병성 허혈성 신경장애 또는 당뇨병성 심근경색인 치료제.
  4. 제3항에 있어서, 당뇨병성 허혈성 질환이 당뇨병성 하지 허혈성 질환인 치료제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 허혈부위의 근육내로 투여하기 위한 치료제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, HGF 유전자가 센다이 ·바이러스 (HVJ)-리포솜의 형태로 있는 치료제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 필요에 따라 복수회 투여하기 위한 치료제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, HGF 유전자로서 적어도 50 ㎍을 사용하는 치료제.
  9. HGF 유전자를 인간에게 도입하는 것을 포함하는, 당뇨병성 허혈성 질환의 치료법.
  10. 제9항에 있어서, HGF 유전자를 허혈부위로 투여하는 치료법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 당뇨병성 허혈성 질환이, 당뇨병성 하지 허혈성 질환, 당뇨병성 허혈성 신경장애 또는 당뇨병성 심근경색인 치료법.
  12. 제11항에 있어서, 당뇨병성 허혈성 질환이 당뇨병성 하지 허혈성 질환인 치료법.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, HGF 유전자를 허혈부위의 근육내로 투여하는 치료법.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, HGF 유전자가 센다이 ·바이러스(HVJ)-리포솜의 형태로 있는 치료법.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, HGF 유전자를 필요에 따라 복수회 투여하는 치료법.
  16. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, HGF 유전자로서 적어도 50 ㎍을 투여하는 치료법.
  17. 당뇨병성 허혈질환 치료제의 제조를 위한 HGF 유전자의 사용.
  18. 제17항에 있어서, 당뇨병성 허혈성 질환이, 당뇨병성 하지 허혈성 질환, 당뇨병성 허혈성 신경장애 또는 당뇨병성 심근경색인 사용.
  19. 제18항에 있어서, 당뇨병성 허혈성 질환이 당뇨병성 허혈 질환인 사용.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, HGF 유전자가 센다이 ·바이러스(HVJ)-리포솜의 형태로 있는 사용.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, HGF 유전자로서 적어도 50 ㎍을 사용하는 사용.
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