KR20010089672A - 개선된 생체내 세팔로스포린 생산 - Google Patents

개선된 생체내 세팔로스포린 생산 Download PDF

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보벤베르그로엘오브아리란스
케르크만리차드
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윌리암 로엘프 드 보에르
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Abstract

본 발명은 적당한 아실 측쇄 전구체 또는 그것의 염 또는 에스테르의 존재하에서, 익스팬다제, 히드록실라제 및 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현구조체로 형질전환된P. chrysogenum균주를 발효시키서 N-아실화된 7-ACA 화합물이 생산되도록 하는 단계, 생산된 N-아실화된 7-ACA 화합물을 N-탈아실화하는 단계, 그리고, 선택적으로 자유 아미노기를 아실화 및/또는 세팔로스포린 항생제를 형성하기에 적당한 측쇄로 3' 아세테이트기를 치환하는 단계를 포함하는 7-ACA 또는 그것의 유도체의 생산 방법으로서, 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은Acremonium chrysogenum으로부터 유도되고, 이 뉴클레오티드 서열에 존재하는 개방 판독 프레임의 두번째 ATG 에서 시작하는 것을 특징으로 하는 방법을 개시한다.

Description

개선된 생체내 세팔로스포린 생산{IMPROVED IN VIVO PRODUCTION OF CEPHALOSPORINS}
본 발명은 세팔로스포린의 생산 방법 및 구체적으로는, 적당한 아실 측쇄 전구체 또는 그것의 염 또는 에스테르의 존재하에서, 익스팬다제, 히드록실라제 및 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현구조체로 형질전환된P. chrysogenum균주를 발효시키서 N-아실화된 7-ACA 화합물이 생산되도록 하는 단계, 생산된 N-아실화된 7-ACA 화합물을 N-탈아실화하는 단계, 그리고, 선택적으로 자유 아미노기를 아실화 및/또는 세팔로스포린 항생제를 형성하기에 적당한 측쇄로 3' 아세테이트기를 치환하는 단계를 포함하는 7-ACA 또는 그것의 유도체의 생산방법에 관한 것이다.
세팔로스포린을 생산하는 반-합성 경로는 예를 들어, K. Matsumoto, Bioprocess. Techn.,16,, 67-88 (1993), J. G. Shewale & H. Sivaraman, Process Biochemistry, August 1989,146-154, T. A. Savidge, Biotechnology of Industrial Antibiotics (Ed. E. J. Vandamme) Marcel Dekker, New York, 1984, 또는 J. G. Shewale et al., Process Biochemistry International, June 1990,97-103 에 개시된 방식으로, 대부분 상응하는 β-락탐 핵으로 전환되는 페니실린 G, 페니실린 V 및 세팔로스포린 C 와 같은 발효 산물로부터 시작한다. 그중에서도 특히,EP 0 339 751, JP 53005185 및 CH 640 240 에 개시된 대로, 얻어진 β-락탐 핵은 연이어, 적당한 측쇄와의 결합에 의해 원하는 항생제로 전환된다. 측쇄 및 β-락탐 핵과의 다른 조합에 의해, 다양한 페니실린 및 세팔로스포린 항생제가 획득될 수 있다.
세팔로스포린 핵 7-아미노 데스아세톡시세팔로스포란산 (7 ADCA) 및 7-아미노 세파로스포란산 (7-ACA)이 제약 산업에서 사용된 항생제 제품의 가장 중요한 중간생성물로 알려진다.
세팔로스포린 C 가 단연, 7-ACA 뿐만아니라 다른 치료적으로 사용된 세팔로스포린의 생산에 가장 중요한 시발물질이다. 그러나, 세팔로스포린 C 는 어느 pH 에도 매우 수용성이고, 이것은 산물로부터 비-전환 세팔로스포린 C 를 제거하기 위해 방해되고 비싼 컬럼 기술을 사용하는 시간 및 비용 소모적인 분리 과정을 의미한다. 게다가, 세팔로스포린 C 의 α-아미노아디포일 측쇄는 7-ACA 생산에 필요한 효소적 또는 화학적 분해가 매우 어렵다.
상기에 언급된 몇 개의 단점을 극복하기 위해서, 측쇄가 간단한 효소적 또는 화학적 절단 반응으로 쉽게 제거될 수 있는, 어떤 N-치환 세팔로스포린의 발효 산물을 포함하는 7-ACA 의 생산에 관한 발효 방법이 개시되었다.
아디포일-7-ACA 와 같은 이러한N-치환 세팔로스포린의 발효 산물은 데스아세톡시세팔로스포린 합성효소 (또한, "익스팬다제.로 알려짐), 데스아세틸세팔로스포린 C 합성효소 ("히드록실라제") 뿐만 아니라 세팔로스포린 C 합성효소 ("아세틸트랜스퍼라제") 를 활성화하는 효소를 발현할 수 있는 재조합Penicilliumchrysogenum균주에 의해 획득된다. (EP 0 540 210).
재조합P. chrysogenum균주를 사용한, 아디포일-7-ACA 의 생체내 생산 방법에서 아디포일-7-ACA , 아디포일-7-아미노 데스아세틸세팔로스포란산(아디포일-7-ADAC)에 관한 전구체는 아디포일-7-ACA 와 비교하여 상당한 양으로 존재했다는 것이 관찰되었다. 분명하게, 아세틸트랜스퍼라제 유전자는 아디포일-7-ADAC 의 아디포일-7-ACA 로 상당한 전환을 획득할 만한 충분한 양으로 발현되지 않는다.
본 발명은 아세틸트랜스퍼라제의 높은 발현 수준을 얻기위해 설계된 아세틸트랜스퍼라제 발현 구조체를 개시한다. 이러한 방법으로, 증가된 양의 전구체 아디포일-7-ADAC 가 아피도일-7-ACA 로 전환되었다.
Acremonium chrysogenum(cdfG) 로부터 아세틸트랜스퍼라제의 클로닝 및 뉴클레오티드 서열을 개시하는 문헌은 아세틸트랜스퍼라제 개방 판독 프레임 (ORF) 내의 첫번째 (EP 0 437 378; Gutierrez et al,, J.Bacteriol.174: 3056-3064 (1992)), 두번째 (Mathisonet al., Curr Genet.23: 33-41 (1992)) 또는 세번째 ATG (EP 0 450 758) 중 어느 하나에서 시작하는 암호화서열을 개시한다. 게다가,A. chrysogenum에서 아세틸트랜스퍼라제를 발현하는 다양한 프로모터의 효율성에 기초한 연구에서, 시험될 하나의 구조체는 두번째 ATG 에서 시작하는 아세틸트랜스퍼라제 암호화 서열을 포함하는 융합 구조체였다. (Gutierrez et al., Appl. Microbiol.Biotechnol.48: 606-614 (1997)).
본 명세서에 언급된 어떤 문헌도 7-ACA 또는 그것의 유도체 생산를 위한 발효 방법에서 사용하는 재조합P.chrysogenum균주에서 효과적인 아세틸트랜스퍼라제 발현을 획득하기 위한cefG ORF 의 특정 개시 코돈의 선택의 잇점을 개시하지 않는다.
본 발명은 적당한 아실 측쇄 전구체 또는 그것의 염 또는 에스테르의 존재하에서, 익스팬다제, 히드록실라제 및 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현구조체로 형질전환된P. chrysogenum균주를 발효시키서 N-아실화된 7-ACA 화합물이 생산되도록 하는 단계, 생산된 N-아실화된 7-ACA 화합물을 N-탈아실화하는 단계, 그리고, 선택적으로 자유 아미노기를 아실화 및/또는 세팔로스포린 항생제를 형성하기에 적당한 측쇄로 3' 아세테이트기를 치환하는 단계를 포함하는 7-ACA 또는 그것의 유도체의 생산 방법으로서, 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은A. chrysogenum으로부터 유도되고, 이 뉴클레오티드 서열에 존재하는 개방 판독 프레임의 두번째 ATG 에서 시작하는 것을 특징으로 하는 방법을 개시한다.
본 발명에 의해A. chrysogenum으로부터 아세틸트랜스퍼라제를 암호화 서열을 포함하는 발현 구조체는 암호화 서열이 개방 판독 프레임 (ORF)의 첫번째 또는 세번째 ATG 에서 시작하는 경우보다 이 0RF 의 두번째 ATG 에서 시작하는 경우에 더욱 효율적으로 발현된다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다. 더욱 효율적인 아세틸트랜스퍼라제 발현의 효과는 N-아실화 7-ADAC 유도체가 더욱 효과적으로 N-아실화 7-ACA 유도체로 전환된다는 것이다.
본 발명의 방법에서, 형질전환된P. chrysogenum균주는 3'-아세틸화 세팔로스포린 화화물 생산을 유도하는 세팔로스포린 생합성 경로의 3 가지 효소 활성을발현하는 데 사용된다.
상기 3 개의 효소 활성을 암호화하는 유전자의 적당원 원은 익스팬다제 및 히드록실라제 유전자cefF 의 경우, 세균Streptomyces clavuligerus또는Nocardia lactamdurans(cefE 에 대해 EP 0 341 892 및cefF 에 대해 EP 0 465 189 참조) 또는 2 기능을 지닌 익스팬다제/히드록실라제 유전자cefEF및 아세틸트랜스퍼라제 유전자cefG의 경우, 균류A. chrysogenum이다. (cefEF의 경우 EP 0 281 391 및 Coque et al., Mol. Gen. Genet.236: 453-458 (1993) 및cefG의 경우 EP 0 437 378 및 EP 0 450 758 참조).
본 발명에 따르면, 아세틸트랜스퍼라제 효소 활성은A. chrysogenum에서 획득될 때,cefG 유전자에 의해 제공된다. 구체적으로는, 본 발명은 개시 코돈으로서cefG 의 두 번째 ATG 를 사용하는 것이 유리하다는 것을 보여준다. 개시코돈으로서cefG ORF 의 두 번째 ATG 의 사용은 본 발명의 방법에서 사용될 때 아세틸트랜스퍼라제 효소가 메티오닌-루신-아르기닌-아스파라트산-세린을 가지고 시작하는 N-말단 아미노산서열을 가진다는 것을 암시한다.
본 발명의 방법에서, 3가지 효소 활성 익스팬다제, 히드록실라제 및 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자는 문제의 유전자 본래의 5' 및 3' 조절 서열을 가지고 제공되거나, 상기 유전자에 비상동인 조절서열을 가지고 제공될 수 있다.
사상균 숙주 세포에서 재조합 유전자 발현이라면, 적당한 5' 및 3' 조절 서열, 즉, 프로모터 및 종결자의 예는 Van den Hondelet al. (in: More Gene Manipulations in Fungi, Eds. Bennett and Lasure, 396-427 (1991)) 또는 AppliedMolecular Genetics of filamentous fungi (Kinghorn, Turner (eds.), Blackie, Glasgow, UK, 1992) 에 언급된다. 바람직한 프로모터는 ACV 합성효소, 이소페니실린 N 합성효소, 아세틸트랜스퍼라제, 포스포글리세르에이트 키나제 또는 유전자 Y 를 암호화하는 유전자로부터 유도된Aspergillus niger글루코아밀라제 프로모터 또는P. chrysogenum프로모터이다. 전사 종결자가 또한 같은 유전자로부터 획득될 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 7-ACA 또는 그것의 유도체의 발효성 생산 방법은 익스팬다제, 히드록실라제 및/또는 아세틸트랜스퍼라제 활성을 암호화하는 유전자의 암호화 서열은 이 암호화 서열에 비상동인 프로모터 서열과 융합된, 발현 구조체로 형질전환된P. chrysogenum균주의 사용을 포함하여 제공된다. 이 비상동 프로모터 서열의 예는P. chrysogenum의 IPNS(pcbC) 이다.
발명의 다른 구체예에서, 선택 프로모터 서열 및 익스팬다제, 히드록실라제 및/또는 아세틸트랜스퍼라제 활성을 암호화하는 암호화 서열의 개시 코돈 사이의 정확한 융합은 PCR 기술을 사용하여 용이하게 얻어질 수 있다.
P. chrysogenum숙주세포의 형질전환은 일반적으로 PEG-Ca 매개 원형질 흡수, 전기천공 또는 입자 건 기법, 및 형질전환체의 연이은 선택과 같은 서로 다른 수단의 DNA 송달에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어, Van den Hondel en Punt, Gene and Transfer and Vector Development for Filamentous Fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi (Peberdy, Laten, Ogden, Bennett, eds.), Cambridge University Press (1991) 참조. 우성 및 비-우성 선택 마커의 적용이 개시되었다.(Van den Hondel,supra). 상동 (P. chrysogenum유도됨) 및 비상동(non P. chrysogenum유도됨) 기원 모두의 선택 마커가 개시되었다. (Goukaet al., J. Biotechnol.20189-200 (1991)).
형질전환체의 선택에 있어서, 벡터 서열의 존재 또는 부재하에서 비-선택적 DNA 에 연결되거나 연결되지 않은, 상동 또는 비상동인 다른 형질 전환체 선택 마커의 이용은 당업계에서 잘 알려진다.
형질전환된P. chrysogenum균주의 발효는 발효가 적당한 측쇄 전구체의 존재하에서 일어난다고 가정하면, 당업계에서 알려진 어느 적당한 발효 배지에서 행해질 수 있다. 이러한 관점에서, 적당한 측쇄 전구체는 발효적으로 생산된 세펨 화합물의, 간단한 화학 또는 효소적 제거로 제거될 수 있는 N-아실 측쇄를 유도하는 N-아실 측쇄 전구체로 정의된다. 구체적으로는, 적당한 측쇄 전구체는 디카르복실산, 더욱 구체적으로는 화학식 (1) 에 따르는 디카르복실산 또는 그것의 염 또는 에스테르이고,
HOOC-X-(CH2)n-COOH
여기에서
n은 적어도 2 의 짝수, 및
X는 (CH2)p-A-(CH2)q, 여기에서,
p 및 q 는 각각 0,1,2,3 또는 4, 및
A 가 CH=CH-CH=CH 인 경우 p+q 는 0 또는 1 , A 가 CH=CH 또는 CC 인 경우 p + q 는 2 또는 3, 또는 A 가 CHB, C=0, O, S 또는 NH 인 경우 p + q 는 3 또는 4 인 것을 전제로, A 는 CH=CH-CH=CH, CH=CH, CC, CHB, C=O, O, S, NH, 선택적으로 치환되는 질소 또는 선택적으로 산화되는 황이고, B 는 수소, 할로겐, C1-3알콕시, 히드록실, 또는 선택적으로 치환 메틸이다.
화학식(1) 에 따른 적당한 측쇄 전구체의 예는 아디프산, 3'-카르복시메틸티오프로피온산(WO 95/04148), 3,3' 티오디프로피온산(WO 95/04149) 또는 WO 98/48034 또는 WO 98/48035 에서 제시된 측쇄 전구체이다. 바람직한 측쇄 전구체는 아디프산 또는 트랜스-β-히드로뮤콘산이다.
예를 들어, 아디프산과 같은 적당한 아실 측쇄 전구체의 존재하에서 발효에 의해 얻어질 때, 예를 들어, 아디포일-7-ACA 와 같은 N-아실화 7-ACA 화합물은 예를 들어, 하기와 같은 간단한 용매 추출 방법과 같은 종래의 회수 기법을 통해 발효 배지로부터 효율적으로 회수될 수 있다.
육즙을 여과하고 물과 섞이지 않는 유기 용매를 여과액에 첨가했다. 수성층으로부터 세팔로스포린을 추출하기 위해 pH 를 조정한다. pH 범위는 4.5 보다 낮아야만 하고; 바람직하게는 4 내지 1 사이, 더욱 바람직하게는 2 내지 1 이다. 이러한 방법으로 세팔로스포린은 발효 육즙에 존재하는 많은 다른 불순물로부터 분리된다. 바람직하게는 세팔로스포린의 더욱 많은 농축 용액을 산출하면서, 용량 유동 속도의 감소를 달성하고자 적은 부피의 유기 용매가 사용된다. 제 2 의 가능성은pH 4 또는 그 이하에서 전육즙 추출이다. 바람직하게는 육즙을 pH 4 및 1 사이에서 물과 섞이지 않는 유기 용매로 추출한다.
세팔로스포린 분자를 방해하지 않는 어느 융매도 사용될 수 있다. 적당한 용매는 예를 들어, 부틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 메틸 이소부틸 케톤, 부탄올같은 알콜등이다.
지금부터는 세팔로스포린은 pH 4 내지 10 에서, 바람직하게는 6 내지 9 에서, 물로 다시 추출될 수 있다. 다시 최종 부피를 감소시킬 수 있다. 회수를 0 내지 50 ℃, 및 바람직하게는 0 내지 10 ℃ 온도에서 수행할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 생산된 N-아실화 세팔로스포린 유도체는 7-아미노기가 적당한 아실 측쇄의 존재로 적당하게 보호되기 때문에, 반합성 세팔로스포린의 화학 합성에서 중간 매개물로 사용될 수 있다.
대안적으로, 예를 들어, 아디포일과 같은 N-아실 측쇄를 제거하고 원하는 7-ACA 를 얻기 위해서, 결과적으로 얻어진 수성 N-아실화 세팔로스포린 용액을 적당한 효소로 처리한다.
바람직하게는, 효소를 반복적으로 사용할 수 있기 위해서 고정화된 효소가 사용된다. 이러한 입자 생산를 위한 방법학 및 효소의 고정화는 EP 0 222 462 에 포괄적으로 개시되었다. 수용액의 pH 는 세팔로스포린의 분해 반응이 최소화되고, 효소에 의한 원하는 전환이 최적화 될 때, 예를 들어, pH 4 내지 pH 9 의 값을 가진다. 따라서, 효소는 예를 들어, 수산화칼륨 용액과 같은 무기 염기를 첨가하거나, 양이온 교환 수지를 적용하는 것에 의해 적당한 수준에서 pH 를 유지시키는 동안 수성 세팔로스포린 용액에 첨가된다. 반응이 종결되는 경우, 고정화된 효소는 여과에 의해 제거된다. 다른 가능성은 고정 또는 유동 베드 컬럼에 고정화된 효소의 적용 또는 용액에서 효소의 사용 및 막 여과에 의한 생성물의 제거이다. 이어서, 수용액의 pH 는 2 내지 5 사이의 값, 바람직하게는 3 내지 4 의 값으로 조정된다. 그 다은, 수정질 7-ACA 는 여과되어 제거된다.
적당한 효소는 예를 들어, 위치 62,177,178 및 179 의 하나 이상에서 돌연변이를 가지는PseudomonasSY77 미생물로부터 유도된다.PseudomonasSY77 에서 62, 177, 178 및 179 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에서 돌연변이를 가지는 다른Pseudomonas미생물, 바람직하게는PseudomonasSE83 로부터의 효소 또한 선택적으로 사용될 수 있다.
탈아실화는 예를 들어, 10 ℃ 보다 낮은 온도에서 5 염화인, 이어서 주변온도 또는 그 이하에서 이소부탄올과 같은 알콜을 첨가하는 것에 의해서 이미노클로라이드 측쇄의 형성을 통해 당업계에서 알려진대로 화학적으로 수행될 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 탈아실화 후에 얻어질 때, N-아실화 7-ACA 유도체 또는 7-ACA 를 함유하는 수용액은 이 수용액에서 존재할 수 있는 어느 (아실)-7-ADAC 를 상응하는 (아실)-7-ACA 유도체로 전환시키는 적당한 아세틸화제에 의해 처리될 수 있다. 상기 아세틸화는 예를 들어, US 5,221,739 에 개시된 방법에 의해 아세트산 무수물, 또는 EP 667 396 에 개시된 적당한 리파제 또는 에스테르아제를 사용하여 달성될 수 있다.
더 이상의 양태에서, 본 발명의 방법에 의해 얻을 때, 7-ACA 화합물은 다양한 세팔로스포린 항상제의 생산에서 시발 화합물, 결과 산물 뿐만 아니랄 중간매개물로도 사용된다. 7-ACA 의 자유 아미노기는 일반적으로 알려진 화학적 또는 효소적 결합 방법을 사용하여, 예를 들어, 어느 적당한 측쇄로 아세틸화되어 N-아세틸화 7-ACA 유도체를 초래할 수 있다. 게다가, 3'위치에서 치환이 일어날 수 있다. 이렇게-생산된 세팔로스포린 화합물의 예는 세포탁심, 세파졸린, 세프트리아존, 세푸록심, 세프프로질, 세프타지딤 및 세파크로르이다.
실시예 1
Penicillium chrysogenum 에서 아세틸트랜스퍼라제 발현을 위한 plCG 1 WA, plCG 2 WA 및 plCG 3 WA 의 생산
Penicillium chrysogenum pcbC 프로모터 및penDE 종결자를 포함하는 야생형Acremonium chrysogenum cefG 유전자를 내포하는 데스아세틸세팔로스포린 C 아세틸트랜스퍼라제 (cefG) 발현 카세트 pICG1WA 를 하기에 개시된 대로 생산했다.cefG 유전자의 N-말단 부분, 즉, ORF 의 첫번째 ATG 에서 시작하는 부분을 프라이머 #1 및 #2 (각각 SEQ ID NO 1 및 2)를 사용하여 PCR 반응에서A. chrysogenum염색체 DNA 로부터 유도했다. cefG 유전자의 C-말단 부분을 프라이머 #3 및 #4 (각각 SEQ ID NO 3 및 4)를 사용하여 PCR 반응에서 같은 주형으로부터 유도했다. 프라이머 #1 및 # 4 및 주형으로 상기 단편을 사용하여 융합 PCR 후에, 내부Sfil 및Hindlll 위치가 결실되고 새로운Nsil 위치가 생성된, 완전한cefG 유전자(이하 명세서에서cefG1유전자로서 표시)를 만들었다.
다음 단계에서,pcbC 프로모터의 첫번째 부분을 프라이머 # 5 및 # 6 (각각 SEQ ID NO 5 및 6)를 사용하여 PCR-증폭 했고, 프라이머 # 5 및 # 4 를 사용하여 융합 PCR 후에,cefG1유전자의 앞에 직접 도입했다.PstllNsil 로 분해후에, 1592 bp 단편을 pISEWA-N 의 4.3 kbPstlINsil 벡터 단편에 연결하여(W098/46772 에 이전에 개시된 벡터),Penicillium형질전환 벡터 pICG1WA 를 산출했다.
pICG2WA 의 생산에 필요한cefG2유전자의 N-말단 부분, 즉, ORF 의 두번째 ATG 에서 시작하는 부분을 프라이머 p#5 및 #7 (SEQ ID NO:7)을 사용하여 PCR 반응에서 pICG1WA 로부터 유도했다.cefG2유전자의 C-말단 부분을 프라이머 #8 및 #9 (각각 SEQ ID NO 8 및 9)를 사용하여 PCR 반응에서 같은 주형으로부터 유도했다. 프라이머 #5 및 # 9 및 주형으로 상기 단편을 사용하여 융합 PCR 후에, 완전한cefG2 유전자를 만들었다.
plCG3WA 의 생산에서,cefG 유전자는 세번째 ATG 에서 시작하고, plCG2WA 의 생산에 개시된 대로 같은 과정을 사용했다. 이 제조의 경우에, 프라이머 # 5 /#10 (각각, SEQ ID NO 5/10) 및 #11/#9 (SEQ ID NO 11/9) 를 사용했다.
내부Pstl/Ncol 위치에서 분해후에,cefG2/cefG3융합 단편을Penicilliumfusion 형질전환 벡터 plCG2WA and plCG3WA 를 생산하는 pICG1WA 의PstllNcol 벡터 단편에 연결했다.
실시예 2
아세틸트랜스퍼라제의 발현상에서 서로 다른 ATG 개시 코돈 사용의 효과
다른 pICGWA 구조체의Notl 분해 후에, 분리cefG 단편을 EP 635 574 에 개시된 대로 Ca-PEG 매개 원형질 형질전환에 의해P. chrysogenum에 도입했다.
사용할P. chrysogenum균주를P. chrysogenum pcbC 프로모터 및penDE 종결자의 조절 컨트롤하에A. chrysogenum로부터 2 기능 엑스판다제/히드록실라제 암호화 서열 (cefEF) 을 포함하는 발현 구조체로 미리 형질전환했다.
단편을P. chrysogenum형질전환체가 유일한 질소원으로 아세타마이드를 함유하는 선택 배지에서 자라게 하는amdS (EP 635 574) 와 함께 공-형질전환했다. 형질전환체를 선택 배지상에서 반복 배양에 의해 정제했다. 단일의 안정한 콜로니를 PCR 에 의해cefG 유전자의 존재를 더 스크리닝 하기 위해 사용했다 .CefG 양성 콜로니를 형질전환체의 아디포일-7-ACA 의 생산능력을 측정함으로서cefG 발현을 더 스크리닝하는 데 사용했다.
마지막으로, 형질전환체를 WO 95/04149 에 개시된 대로 액상 배지에 접종했고, 생산 시험을 위해 측쇄 전구체로서 0.5-3 mg/ml 소듐 아디페이트로 보충했다. 잘 배양된 배양물의 여과액을 아디포일-7-ACA 생산에 관하여 HPLC 및 NMR 에 의해 분석했다. 표 1 에 제시된 결과는 첫 번째 ATG (ATG1 으로 표시됨) 또는 3 번째 ATG (ATG3 로 표시됨)에서 개시하는cefG 를 포함하는 형질전환체에 비하여, ORF 의 2 번째 ATG (ATG2 로 표시됨)에서 시작하는cefG 를 포함하는 형질전환체의 경우 증가된 아이포일-7-ACA 생산을 분명하게 보여준다.
첫 번째, 2 번째 또는 3 번째 ATG 에서 시작하는cefG 암호화 서열을 포함하는P. chrysogenum형질전환체의 아디포일-7-ACA 생산성
개시코돈 생산성
ATG1 49
ATG2 100
ATG3 77

Claims (3)

  1. 적당한 아실 측쇄 전구체 또는 그것의 염 또는 에스테르의 존재하에서, 익스팬다제, 히드록실라제 및 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현구조체로 형질전환된P. chrysogenum균주를 발효시키서 N-아실화된 7-ACA 화합물이 생산되도록 하는 단계, 생산된 N-아실화된 7-ACA 화합물을 N-탈아실화하는 단계, 그리고, 선택적으로 자유 아미노기를 아실화 및/또는 세팔로스포린 항생제를 형성하기에 적당한 측쇄로 3' 아세테이트기를 치환하는 단계를 포함하는 7-ACA 또는 그것의 유도체의 생산 방법으로서, 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은Acremonium chrysogenum으로부터 유도되고, 이 뉴클레오티드 서열에 존재하는 개방 판독 프레임의 두번째 ATG 에서 시작하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 측쇄 전구체는 아디프산, 3'-카르복시메틸티오프로피온산, 3,3'-티오디프로피온 산 및 트랜스-β-히드로뮤콘산인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 측쇄 전구체는 아디프산인것을 특징으로 하는 방법.
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