KR20010054727A

KR20010054727A - 멜라닌 합성 저해물질 및 그것을 함유하는 조성물

Info

Publication number: KR20010054727A
Application number: KR1019990055670A
Authority: KR
Inventors: 성창근; 박정훈; 전형오; 이찬호; 김영호; 홍승서; 이현수
Original assignee: 박종헌; 주식회사 삼양제넥스
Priority date: 1999-12-08
Filing date: 1999-12-08
Publication date: 2001-07-02
Also published as: KR100344751B1; WO2001041778B1; WO2001041778A1; JP2003516358A; AU2026801A

Abstract

본 발명은 고미신 N 또는 γ-쉬잔드린을 함유하는 멜라닌 생성 억제제에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 멜라닌 생성 억제 효과가 우수하고 세포 독성이 없다. 또한 본 발명은 멜라닌 생성 억제 효과가 우수하고 세포 독성이 없는 오미자 추출물에 관한 것이다.

Description

멜라닌 합성 저해물질 및 그것을 함유하는 조성물 {Melanin synthesis inhibiting compound and composition containing the same}

본 발명은 멜라닌 합성 저해 효과가 있는 화합물 및 그것을 함유하는 조성물에 관한 것이다.

햇볕에 피부가 노출되면 자외선을 막기 위해 멜라닌 색소가 합성되고 이것이 피부표면으로 올라와 피부를 검게 하는 것으로 알려져 있다.

멜라닌은 자연계에 널리 분포하는 페놀류의 생물고분자 물질로 검은 색소와 단백질의 복합체이다. 멜라닌은 물리·화학적으로 노란색-적갈색의페오멜라닌(pheomelanin), 갈색-검은색의 멜라닌(eumelanin) 그리고 특성이 유사한 트리코크롬(trichochrome)으로 크게 3종류로 분류하나 생합성 경로는 모두 타이로시네이즈(EC 1.14.18.1)의 작용에 의해 이루어지는 것으로 보고되고 있다. 사람의 피부색은 이 색소의 종류와 양에 의해 결정되며 이 색소의 과잉생산은 인체에 기미, 주근깨를 형성하고, 피부노화를 촉진하며, 피부암의 유발에 관여하는 것으로 알려졌으며, 식품에서는 채소, 과일, 생선 등의 질을 저하시키기도 한다.

멜라닌 합성 저해제는 의약품, 화장품, 식품 등에서 피부질환 치료제, 피부 미백제, 식품 갈변방지제 등에 적용되고 있으며 최근 그 수요가 급증하고 있다. 멜라닌 합성 저해제에 대한 연구는 주로 타이로시네이즈 저해제 개발에 집중되어 왔으며, 그 결과 다양한 미백제가 개발되어 사용되고 있으나, 여러 가지 문제점이 제기되고 있다.

4-하이드록시아니솔 및 하이드로퀴논 등은 기미, 주근깨, 반점 및 임신기의 과잉색소증과 같은 과잉 색소증 치료에 국부적으로 사용되고 있다. 이들 화합물은강력한 멜라닌 생성 저해활성을 보이지만 색소 세포의 변성 또는 치사를 일으키고 세포 본래의 기능을 손상시키는 등의 부작용을 인해 일부 국가에서만 사용이 허가되고 있는 실정이다. 또 코지산[5-hydroxy-2-(hydroxymethyl-γ-pyrone)]과 알부틴(hydroquinone-β-D-glucopyranoside) 등은 아스코르빈산과 함께 식품의 갈변 방지제, 화장품, 의약물용 미백제 성분으로 사용되고 있는 주요 활성성분이나 낮은 저해활성, 사용중의 변색, 물질 자체의 불안정성 등의 문제점이 제기되고 있다.

한편, 고미신 N과 γ-쉬잔드린은 서로 입체이성질체로서 구조식은 다음과 같다.

고미신 N

γ-쉬잔드린

고미신 N은 콜레스테롤 아실트렌스퍼레이즈의 활성을 저해하며(Planta med. 1999, 65: 74-76), 진균류의 세포벽 합성 효소인 키틴신테이즈 II의 활성을 저해하는 것이 보고되었다 (약학회지, 1995, 43(4): 509-515).

γ-쉬잔드린에 대해서는 특별한 생리활성 효과가 알려져 있지 않다.

본 발명의 목적은 멜라닌 저해 활성이 있는 오미자 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 멜라닌 합성을 저해하는 물질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 멜라닌 합성을 억제하는 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 고미신 N과 γ-쉬잔드린의 타이로시네이즈 활성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.

도 2는 고미신 N과 γ-쉬잔드린의 항산화 활성을 나타내는 그래프이다.

도 3은 고미신 N과 γ-쉬잔드린의 아스퍼질린(aspergillin) 합성 저해 활성을 나타내는 사진이다.

도 4는 세포 배양에서의 멜라닌 합성 저해 활성을 나타내는 사진이다.

본 발명은 오미자 추출물을 함유하는 멜라닌 생성 억제제에 관한 것이다. 본 발명의 오미자 추출물은 바람직하게는 고미신 N 또는 γ-쉬잔드린을 함유한다.

오미자는 1996년 보건복지부에 의해 필요에 따라 특별한 인허가 없이 식품으로 사용될 수 있도록 규정되어 있으며, 따라서 본 발명의 조성물은 안정성 문제가 없다.

또한 본 발명은 고미신 N 및/또는 γ-쉬잔드린을 함유하는 멜라닌 생성 억제제 조성물에 관한 것이다.

본 발명자들은 고미신 N과 γ-쉬잔드린은 세포 독성은 거의 없으며 미백효과가 뛰어나다는 것을 밝혔다.

고미신 N과 γ-쉬잔드린은 미백효과가 있는 종래의 물질 예를 들어 코지산 또는 알부틴과 비교할 때 타이로신 저해 활성이 상당히 낮다. 이로부터 고미신 N과 γ-쉬잔드린의 멜라닌 저해 활성은 타이로시네이즈 저해에 의한 기작이 아님을 알수 있다. 또한 항산화 활성이 낮은 것으로 보아 고미신 N과 γ-쉬잔드린은 타이로신에서 시작하는 멜라닌 합성 단계의 산화과정을 저해하는 것이 아니라는 것을 알 수 있다. 또, 고미신 N과 γ-쉬잔드린은 세포에 대한 세포독성 없이 색소합성만을 선택적으로 저해한다.

고미신 N 또는 γ-쉬잔드린은 생물체로부터 추출하거나, 합성 또는 기타 알려진 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어 고미신 N 또는 γ-쉬잔드린은 오미자로부터 추출할 수 있다.

본 발명에 따른 고미신 N 또는 γ-쉬잔드린 함유 조성물은 멜라닌 합성 억제제로 사용될 수 있으며, 화장품, 의약용 미백제, 식품 갈변제 등으로 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 구체적인 조성은 그것이 속하는 기술분야의 통상의전문가에 의해 어렵지 않게 결정될 수 있을 것이다.

본 발명에서 미백제 활성을 확인하기 위하여 사용한 활성 측정 방법은 다음과 같다.

항산화 활성의 측정

화합물의 항산화 활성은 각각의 화합물 0.1㎎을 메탄올 0.1㎖에 녹여 리놀레인산 58㎎이 녹아있는 에탄올 5㎖에 가하고 여기에 0.2M 포스페이트 완충액(pH 7.0) 5㎖과 증류수를 가하여 12㎖로 맞추어 40℃ 배양기에 방치한다. 24시간 후 75% 에탄올 7ml에 반응액 0.1㎖, 0.02M FeCl₂용액 150㎕ 와 30% 암모니움 티오시아네이트 150㎕를 3분간 반응시켜 500㎚에서 흡광도를 측정한다.

Streptomyces bikiniensis 멜라닌 합성에 대한 저해활성 측정

S.bikiniensis를 V-8 쥬스 200㎖, 글루코스 2g, 효모추출물 2g, CaCO₃1g, 박토 아가 2g과 증류수 800㎖을 함유한 pH 7.2의 Papavizas VDYA 사면배지에 접종한다. 28℃에서 2일간 배양한 사면배양물 표면에 2㎖의 증류슈를 가한 후 기균사에 형성된 포자를 백금이로 긁어내어 포자 현탁액을 만들고, 글루코스 1.5%, L-타이로신 0.5%, L-아스파라긴 0.1%, K₂HPO₄0.05%, MgSO₄·7H₂O 0.05%, NaCl 0.05%, FeSO₄·7H₂O 0.001%, 박토 아가 2%를 함유한 타이로신 아가 배지 조성에 박토-효모 추출물 0.2%를 첨가하여 고체 배지를 만들어 멸균한 후 페트리디쉬에 평판배지를 제조한다. 아가 플레이트당 0.4㎖의S.bikiniensis포자 현탁액을 가하여 균일하게 도포하고 50㎕의 시료를 적신 8㎜ 직경의 페이퍼 디스크를 올려놓고 28℃ 조건에서 48시간 배양한다.

생성된 멜라닌 생성 저해환의 크기를 배지의 배면에서 계측한다. 대조구로는 ρ-하이드록시아니솔을 사용한다.

Aspergillus niger 포자의 멜라닌 합성 저해활성 측정

A.niger를 감자 덱스트로오스 아가 배지(감자 20%, 덱스트로오스 2%, 아가 1.5%; PDA 배지)에 37℃에서 6일간 배양한 후 플레이트 표면에 10㎖의 0.01% Tween 80 용액을 가하여 균사에 형성된 포자를 긁어내어 포자 현탁액을 만든다. 포자현탁액을 PDA 배지에 5% 되도록 첨가한 후, 배지를 24 웰에 1㎖씩 넣어 굳히고 시료를50㎕ 에탄올에 녹여 플레이트 표면에 직접 가한 후 37℃에서 2일간 배양하여 포자의 색소합성을 육안으로 관찰한다. 포자현탁액 1㎖당 포자수는 1.5×10⁵CFU가 되도록 조정한다. 대조구로서 ρ-하이드록시아니솔을 사용한다.

멜라노마 세포의 멜라닌 합성 저해활성 측정

B16 마우스 멜라노마 세포를 5×10³cells/㎖의 농도로 10% FCS(fetal calf serum)을 포함하는 DMEM(Dulbescco's Modified Eagle's Medium, Gibco BRL) 배지에 현탁시킨 후 현탁세포 5㎖을 조직배양용 플라스크(Falcon, Becton dickinson)에 넣고 검정시료를 농도별로 첨가한 후 5% CO₂-95% 공기 조건으로 37℃에서 배양한다. 4일간 배양 후 플라스크 바닥에 흡착된 세포들을 PBS(phosphate bufferd saline)로 씻은 후, 0.05% 트립신, 0.53mM EDTA 용액으로 세포를 떼어 내고 1500rpm에서 10분간 원심분리하여 튜브에 모은 후 세포의 수를 측정한다. 각 튜브의 세포 수를 일정하게 조절한 후, 원심분리하여 모은 세포의 색깔을 알부틴을 첨가한 대조구와 육안으로 비교한다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명할 것이나, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 멜라닌 생성 억제 물질의 분리

오미자 500g를 분쇄한 시료에 메탄올 10L를 가한 후 48시간 동안 상온에서 진탕하면서 2회 추출하였다. 추출한 후 여지로 여과하고, 50℃에서 감압 농축하여 농축 추출물 298g을 얻었다. 여기에 헥산:물:메탄올=10:9:1의 혼합물을 2L 첨가하여 헥산층과 물층으로 분획하였다.A. niger포자의 멜라닌 합성 저해 활성을 보이는 헥산 층 추출물 (21.4g)을 실리카겔 컬럼크로마토그라피(사용 용매: 벤젠:아세톤, 98:2→3:7)를 하여 200ml씩 모두 12 개의 분획을 얻었다.A. niger포자의 멜라닌 합성 저해 활성을 보이는 분획 2~5을 대상으로 각각 멜라노마 세포의 멜라닌 합성 저해활성 측정을 한 결과 분획 3이 10 μg/ml의 농도까지 세포수의 감소 없이 멜라닌 합성 저해 활성을 보였다. 분획 3(3.1g)을 RP 컬럼크로마토그라피(70% 메탄올→100% 메탄올)를 실시하였다. 50ml씩 모두 25 개의 분획을 얻었다. 그 중 활성이 강한 14번 분획을 예비 TLC (헥산: 에틸아세테이트 = 6:1)로 전개하여A. niger포자의 멜라닌 합성 저해 활성을 나타내는 밴드 부분만 수집하였다. 수집된 활성 밴드 부분을 예비 HPLC (컬럼: Vydac ODS, 5㎛, 250×10㎜ I.D, 유동속도: 2㎖/min, UV 디텍터: 220㎚, 용매: 70% 아세토나이트릴)를 실시하여 두 개의 화합물을 분리하여 각각 SHC1과 SHC1으로 명명하였다. 최종 분리된 2종의 물질들의¹H-NMR 및¹³C-NMR 스펙트럼을 분석한 결과를 표 1에 나타낸다.

	SHC1	SHC2
	δ¹H(ppm)^a	δ¹³C(ppm)^b	δ¹H(ppm)	δ¹³C(ppm)
1		151.5		152.8
2		140.0		139.7
3		151.5		151.4
4	6.56	110.6	6.55	107.4
5		134.0		132.5
6	2.55	39.0	2.47	38.8
7	1.78∼1.91	33.5	1.81∼1.91	33.8
8	1.78∼1.91	40.6	1.81∼1.91	40.7
9	2.20∼2.27	35.4	2.28∼2.35	35.4
10		137.7		139.4
11	6.48	102.8	6.49	105.9
12		148.6		147.6
13		134.5		134.8
14		141.0		141.2
15		121.3		122.2
16		123.2		122.4
-CH₃	0.99	21.4	1.01	21.9
-CH₃	0.75	12.7	0.75	12.3
-OCH₃	3.55	55.8	3.54	55.8
	3.82	59.5	3.83	59.5
	3.89	60.9	3.89	60.9
	3.90	60.4	3.90	60.5
-OCH₂O-	5.94	100.6	5.96	100.7

^a(CDCl₃, 300MHz).^b(CDCl₃, 75MHz).

SHC1과 SHC2는 모두 무색의 오일이고 EI-MS 상에서 모두m/z400으로 분자량이 일치하였다. 이러한 실험 결과를 바탕으로 SHC1과 SHC2는 모두 C₂₃H₂₈O₆의 분자식을 갖는 입체이성질체로서 SHC1은 고미신 N(gomisin N), SHC2는 γ-쉬잔드린(γ-schizandrin)으로 추정되었다. 고미신 N과 γ-쉬잔드린의 표준품을 HPLC로 분석한 결과와 문헌에 수록된 고미신 N과 γ-쉬잔드린의 물리·화학적 성질 및 NMR 데이타를 비교하여 SHC1은 고미신 N, SHC2는 γ-쉬잔드린임을 확인하였다

실시예 2. 타이로시네이즈 저해 활성 측정

실시예 1에서 얻은 고미신 N과 γ-쉬잔드린을 200ppm의 농도에서부터 1/2씩 희석하여 타이로시네이즈 저해활성을 측정하고 양성대조구인 코지산, 알부틴, ρ-하이드록시아니솔과 활성을 비교하였다. 그 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1에서 ▲: 코지산, ■: 알부틴, ●: p-하이드록시아니솔, ○:γ-쉬잔드린, □: 고미신 N을 표시한다. 코지산은 10ppm 정도의 농도에서 50% 이상의 저해율을 나타내었고, 알부틴은 25ppm의 농도에서, p-하이드록시아니솔은 50ppm의 농도에서 50% 이상의 저해율을 보였으나 고미신 N과 γ-쉬잔드린은 200ppm 이상의 농도에서도 매우 미약한 활성을 나타내었다.

실시예 3. 항산화 활성 측정

실시예 1에서 분리한 고미신 N과 γ-쉬잔드린을 100㎍씩 각각 리놀린산이 포함된 반응액에 첨가하여 24시간 후의 항산화 활성을 측정하였다. 대조구로는 아스코르빈산, α-토코페롤, p-하이드록시아니솔을 사용하여 실험하였다. 결과를 도 2에 나타낸다. 도 2에서 A: 아스코르빈산, B: α-토코페롤, C: p-하이드록시아니솔, D: 고미신 N, E: γ-쉬잔드린을 나타낸다. 실험 결과 24시간 후에 아스코르빈산은 72%의 항산화 활성을 나타내었고 α-토코페롤과 ρ-하이드록시아니솔도 각각 41%, 38%의 활성을 보였으나 고미신 N과 γ-쉬잔드린은 각각 24%, 22%의 활성을 나타내었다.

실시예 4.Streptomyces bikiniensis에 대한 멜라닌 합성 저해 활성 측정

실시예 1에서 분리한 고미신 N과 γ-쉬잔드린의Streptomyces bikiniensis에 대한 멜라닌 생성 저해 활성을 측정하였으며 그 결과를 표 2에 나타낸다. 그 결과 γ-쉬잔드린은 강력한 멜라닌 생성 저해제로서 피부암 환자에 대한 임상 실험이 시도된 바 있는 p-하이드록시아니솔에 비해 50㎍ 이상의 고농도에서는 다소 활성이 약하지만 20㎍부근의 농도에서 거의 유사한 활성을 나타내었고 고미신 N은 p-하이드록시아니솔과 γ-쉬잔드린에 비해 다소 활성이 미약하나 12.5㎍의 농도까지 활성을 나타내었다.

화합물	억제 지역의 지름 (㎜)
화합물	100㎍	50㎍	25㎍	12.5㎍	6㎍
ρ-하이드록시아니솔	35	25	15	12	10
고미신 N	20	18	12	10	0
γ-쉬잔드린	25	20	15	12	10

실시예 5. 아스퍼질린(aspergillin) 합성 저해 활성

24 웰 플레이트에A.niger의 포자현탁액이 첨가된 PDA 배지를 분주하여 굳히고 그 표면에 실시예 1에서 분리한 고미신 N과 γ-쉬잔드린을 각각 500㎍/㎖의 농도에서부터 단계적으로 에탄올로 희석하여 처리한 후 포자의 색소합성을 육안으로 관찰하였다. 그 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3에서 C: 100% 에탄올, H: p-하이드록시아니솔, G: 고미신 N, S: γ-쉬잔드린을 사용한 것을 나타낸다. 37℃에서 2일간 배양한 후에 고미신 N과 γ-쉬잔드린은 모두 120㎍/㎖ 농도에서 활성을 나타내었으며 대조구인 p-하이드록시아니솔 처리구에서는 60㎍/㎖의 농도에서도 강한 활성을 나타내었다. 그러나 고미신 N과 γ-쉬잔드린은 500㎍/㎖ 이상의 농도에서도A.niger에 대한 항균활성 없이 포자의 색소합성만을 저해하는데 반해, p-하이드록시아니솔의 경우 500㎍/㎖과 250㎍/㎖ 농도 처리구에서A.niger에 대한 세포독성이 관찰되었다.

실시예 6. 멜라닌 합성 저해 활성 측정

B16 마우스 멜라노마 세포에 고미신 N과 γ-쉬잔드린을 10㎍/㎖과 20㎍/㎖의 농도로 처리하여 배양하고 세포를 원심분리하여 육안으로 관찰한 결과 10㎍/㎖의 농도에서도 양성대조구로 사용된 알부틴 100㎍/㎖ 농도 처리구에서 나타나는 활성보다도 더 강한 활성을 보였을 뿐만 아니라 100㎍/㎖ 이상의 농도에서도 세포치사 현상이 나타나지 않았다. 결과를 도 4에 나타낸다. 따라서 오미자에서 분리한 물질들은 세포에 손상없이 강한 멜라닌 합성 저해 효과를 가진 것으로 판단되었다.

본 발명에 의해 미백효과가 뛰어나고 세포독성은 낮은 멜라닌 합성 제해제가 제공된다. 이러한 멜라닌 합성 제해제는 화장품, 의약용 미백제 또는 식품 갈변방제제 등으로 이용될 수 있다.

Claims

오미자 추출물을 함유하는 멜라닌 생성 억제제
제1항에 있어서, 상기 오미자 추출물이 고미신 N 또는 γ-쉬잔드린을 함유하는 멜라닌 생성 억제제
고미신 N 또는 γ-쉬잔드린을 함유하는 멜라닌 생성 억제제 조성물
제3항에 있어서, 상기 조성물이 미백제인 조성물.
제3항에 있어서, 상기 조성물이 화장품, 의약용 미백제 또는 식품 갈변방지제인 조성물.