KR20010043649A - 신규한 글루타미나제, 이의 유전자 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

글루타미나제를 아스퍼질러스 오리재로부터 정제하여, 이의 부분 아미노산 서열을 결정하고, 글루타미나제 유전자의 부분 서열을 수득된 정보를 기초로 하여 PCR에 의해 수득하고, 당해 부분 서열을 프로브로서 사용하는 하이브리드화에 의해 아스퍼질러스 오리재 게놈 라이브러리 및 cDNA 라이브러리, 및 아스퍼질러스 니둘란스 게놈 라이브러리로부터 글루타미나제 유전자를 함유하는 DNA 단편을 수득한다.

Description

신규한 글루타미나제, 이의 유전자 및 이의 제조 방법{Novel glutaminase, gene thereof and process for producing the same}

＜110＞ AJINOMOTO K.K.

＜120＞ Novel glutaminase, gene thereof and process for producing the

same

＜130＞ 5-1998-096241-9

＜150＞ JP 98-134080

＜151＞ 1998-05-15

＜150＞ JP 98-258974

＜151＞ 1998-09-11

＜150＞ JP 98-292443

＜151＞ 1998-10-14

＜150＞ JP 99-89157

＜151＞ 1999-03-30

＜160＞ 26

＜170＞ KopatentIn 1.71

＜210＞ 1

＜211＞ 4013

＜212＞ DNA

＜213＞ Aspergillus oryzae

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (1174)..(1370)

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (1446)..(1741)

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (1800)..(2242)

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (2297)..(2880)

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (2932)..(3134)

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (3181)..(3324)

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (3380)..(3515)

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (3562)..(3628)

＜220＞

＜221＞ intron

＜222＞ (1371)..(1445)

＜220＞

＜221＞ intron

＜222＞ (1742)..(1799)

＜220＞

＜221＞ intron

＜222＞ (2243)..(2296)

＜220＞

＜221＞ intron

＜222＞ (2881)..(2931)

＜220＞

＜221＞ intron

＜222＞ (3135)..(3180)

＜220＞

＜221＞ intron

＜222＞ (3325)..(3379)

＜220＞

＜221＞ intron

＜222＞ (3516)..(3561)

＜220＞

＜221＞ sig_peptide

＜222＞ (1174)..(1233)

＜220＞

＜221＞ mat_peptide

＜222＞ (1234)..(1370)

＜220＞

＜221＞ mat_peptide

＜222＞ (1446)..(1741)

＜220＞

＜221＞ mat_peptide

＜222＞ (1800)..(2242)

＜220＞

＜221＞ mat_peptide

＜222＞ (2297)..(2880)

＜220＞

＜221＞ mat_peptide

＜222＞ (2932)..(3134)

＜220＞

＜221＞ mat_peptide

＜222＞ (3181)..(3324)

＜220＞

＜221＞ mat_peptide

＜222＞ (3380)..(3515)

＜220＞

＜221＞ mat_peptide

＜222＞ (3562)..(3628)

＜400＞ 1

ctcgagagac tccttgccac ctgatactat cacaattgtc ggtcacacgc gactggctac 60

tactacttcg taggcaccgt agtatacccc agtctcttta ggatggcaat accttgttgt 120

atagatgttg tagtcatgta ggattccctg gagattccct gatcggacgg caagagtgac 180

cccacttcca agtattgact ccatctcagc tcgatgtatc actttcctgt ttagggcacg 240

ggagcatcac tgacggctct ctgcctcagg ccatgattgt ttcttttgtc aattcgactt 300

ctccaaatcg agctgcagat ctgtcgaccc catcccagtt gatgcagtag ctcggctacc 360

ggaagagatt tattcttagt cccttgttgg gattgggatt caccctcgct tctgtttctc 420

accgtattta tatcgcgcaa tgagattgat ccggatataa aatgtctgtg atgcactctt 480

tctcacgcac cgaggtaatc aatatcatat gctttcccct catatcactg ccgaaaagac 540

taactcggtc taccccatag tcaccagcca ctagcgcttc ttgggcctct ccttgtttgc 600

tcagtggatc taaagccaag actatcatgg ttagtgtcgg gttgtcttca ttagatcgtc 660

tgcagcccca gagtgtatcg gcttaggact ggtcgagccc gacgcggcta aggataaggt 720

acatactccc actctatcga cccttgcttg ttaatctccg atcttgtctc ctgtccaatt 780

gtcgggcttc tcctggaatt ccaggtttct ttcacctgtc gggcagccgg atcgaggccg 840

catgaattgc tcccccacag agactgacag gtcaggcgat attgggggag tcacaatcat 900

gcgcgccccc attccgcatt ccgtttctcg accctcatgc agcgtgctaa acttccatag 960

tccctcctga attgtctgcc ctgccctccg gtatgcgggc tggaccaact atataagtgt 1020

gcctaacatt ccttcagcat tcttcaggcc cacattctcg ggggcacgtt ttttggcgga 1080

tctcgatcct actctttcat tctttgaaga aacctggaat tattacgtgt ataaatgaag 1140

gatgtaccct gtgtgaatcc ctcaatacgg atc atg atg cat ttc ctc 1188

Met Met His Phe Leu

-20

tcg ttc tgt ctg tcg gtg gcc tcc ctg gtg tct tac gcg gga gct gcg 1236

Ser Phe Cys Leu Ser Val Ala Ser Leu Val Ser Tyr Ala Gly Ala Ala

-15

tca aca ttc tcc cct gcg agg cca ccc gcc ctg ccc ttg gct gtc aaa 1284

Ser Thr Phe Ser Pro Ala Arg Pro Pro Ala Leu Pro Leu Ala Val Lys

2

tcg ccg tac ttg agc aca tgg ctc tct gcg ggc aca gat ggc ggt aat 1332

Ser Pro Tyr Leu Ser Thr Trp Leu Ser Ala Gly Thr Asp Gly Gly Asn

18

gga ggg tac ctg gcc ggc caa tgg cct acc ttc tgg tt gtgagtagtc 1380

Gly Gly Tyr Leu Ala Gly Gln Trp Pro Thr Phe Trp Phe

34

ccgagctgt agaaatgaag acatccatct tgatgtacat tggctaaacc acgtccctcgt 1440

ggcag c ggc cag gtg acc ggc tgg gcg ggt cag atc cgg gtc gat aat 1488

Gly Gln Val Thr Gly Trp Ala Gly Gln Ile Arg Val Asp Asn

47

tcg acc tac aca tgg atg ggg gcg atc cct aac acc cct acg gtg aac 1536

Ser Thr Tyr Thr Trp Met Gly Ala Ile Pro Asn Thr Pro Thr Val Asn

61

cag aca tcc ttc gag tac acc tcg acg tcg agc gtg ttc acg atg cgt 1584

Gln Thr Ser Phe Glu Tyr Thr Ser Thr Ser Ser Val Phe Thr Met Arg

77

gtt ggg gat atg gtg gaa atg aaa gtg aaa ttc ctg tcc cct atc aca 1632

Val Gly Asp Met Val Glu Met Lys Val Lys Phe Leu Ser Pro Ile Thr

93

cca gat gat ctc cgg aga cag tcg ctt gtg ttt tcc tat ctg gac gta 1680

Pro Asp Asp Leu Arg Arg Gln Ser Leu Val Phe Ser Tyr Leu Asp Val

109

gat gtc gaa tcg atc gac ggc aaa gcg cat gac ata cag gtg tac gca 1728

Asp Val Glu Ser Ile Asp Gly Lys Ala His Asp Ile Gln Val Tyr Ala

125

gac att tca gca g gtaagcaa gacgacaacc cacctggaac agtgcaaatatc 1781

Asp Ile Ser Ala

141

catctaac cgggtctta gaa tgg gcg tcc ggg gac cga aac gcc att gcg 1831

Glu Trp Ala Ser Gly Asp Arg Asn Ala Ile Ala

145

cag tgg gac tat ggt gtc aca gat gat ggc gtt gcc tat cac aag gtt 1879

Gln Trp Asp Tyr Gly Val Thr Asp Asp Gly Val Ala Tyr His Lys Val

156

tac cgc caa acg cag ctg ctg ttt tcc gaa aac act gag cag gcc gaa 1927

Tyr Arg Gln Thr Gln Leu Leu Phe Ser Glu Asn Thr Glu Gln Ala Glu

172

tgg ggc gag tgg tac tgg gcc aca gac gac caa gat ggt ctg agc tac 1975

Trp Gly Glu Trp Tyr Trp Ala Thr Asp Asp Gln Asp Gly Leu Ser Tyr

188

cag tcc gga ccg gat gtt gat gtg cga ggg gca ttc gca aag aac gga 2023

Gln Ser Gly Pro Asp Val Asp Val Arg Gly Ala Phe Ala Lys Asn Gly

204

aag ttg gcg aat tcg gat gat aaa aat tat cgt gca atc tcg acc aat 2071

Lys Leu Ala Asn Ser Asp Asp Lys Asn Tyr Arg Ala Ile Ser Thr Asn

220

tgg ccc gtg ttt gcc ttc tcc cgc gat ctt ggc tcg gtg aag acg tct 2119

Trp Pro Val Phe Ala Phe Ser Arg Asp Leu Gly Ser Val Lys Thr Ser

236

gct ggc acg tta ttc tcc att ggc ctt gcg cag gac agt gcc ata cag 2167

Ala Gly Thr Leu Phe Ser Ile Gly Leu Ala Gln Asp Ser Ala Ile Gln

252

tac agt ggg aaa cct gaa ggg aca act gtg atg cct tca ctc tgg aag 2215

Tyr Ser Gly Lys Pro Glu Gly Thr Thr Val Met Pro Ser Leu Trp Lys

268

agc tac ttc agc act gcg act gct gcg gtaagtg gcccactgct gtttcggacc 2269

Ser Tyr Phe Ser Thr Ala Thr Ala Ala

284

tagaacataa tctgaccatc tatgtag ctt gag ttc ttc cat cat gat tat 2320

Leu Glu Phe Phe His His Asp Tyr

293

gct gct gca gct gca cta tcg aag gat ctc gat gac cgg ata tcc aag 2368

Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Lys Asp Leu Asp Asp Arg Ile Ser Lys

301

gat tcc att gat gcc gct ggc cag gac tac ctg aca atc acc tcc ctc 2416

Asp Ser Ile Asp Ala Ala Gly Gln Asp Tyr Leu Thr Ile Thr Ser Leu

317

acg gtc cgt caa gtc ttt gct gcc gtg caa ttg acc ggc acg ccc gag 2464

Thr Val Arg Gln Val Phe Ala Ala Val Gln Leu Thr Gly Thr Pro Glu

333

gac ccc tac atc ttc atg aag gag atc tcg tcc aat ggc aac atg aac 2512

Asp Pro Tyr Ile Phe Met Lys Glu Ile Ser Ser Asn Gly Asn Met Asn

349

act gtg gac gtc atc ttc ccc gct cac ccg atc ttt ttg tac acc aat 2560

Thr Val Asp Val Ile Phe Pro Ala His Pro Ile Phe Leu Tyr Thr Asn

365

ccc gag ctc ctc aaa ctg att ctg aag cca atc tat gag att caa gag 2608

Pro Glu Leu Leu Lys Leu Ile Leu Lys Pro Ile Tyr Glu Ile Gln Glu

381

aac gga aag tat ccc aac aca tac gcc atg cac gat att gga acc cac 2656

Asn Gly Lys Tyr Pro Asn Thr Tyr Ala Met His Asp Ile Gly Thr His

397

tac ccg aac gcc acg ggc cat cct aag ggc gac gac gag aaa atg cca 2704

Tyr Pro Asn Ala Thr Gly His Pro Lys Gly Asp Asp Glu Lys Met Pro

413

ctc gag gag tgt gga aac atg gtt atc atg gcc ctt gcc tac gcc cag 2752

Leu Glu Glu Cys Gly Asn Met Val Ile Met Ala Leu Ala Tyr Ala Gln

429

aag gcc aag gac aac gac tat ctt tca cag cac tat ccc atc ctc aac 2800

Lys Ala Lys Asp Asn Asp Tyr Leu Ser Gln His Tyr Pro Ile Leu Asn

445

aaa tgg aca aca tac ctc gtc gag gat tct att tac ccg gcg aac cag 2848

Lys Trp Thr Thr Tyr Leu Val Glu Asp Ser Ile Tyr Pro Ala Asn Gln

461

atc tct acg gat gac ttt gct ggc tcg cta gc gtaagtgat atacatacac 2899

Ile Ser Thr Asp Asp Phe Ala Gly Ser Leu Ala

477

gacacaggcg gtgatactaa tagtatgtaca g a aac cag acc aac ctg 2947

Asn Gln Thr Asn Leu

488

gca ttg aag gga atc att gga atc cag gca atg gct gtg atc agc aat 2995

Ala Leu Lys Gly Ile Ile Gly Ile Gln Ala Met Ala Val Ile Ser Asn

493

acg aca gga cac ccg gac gat gcc tcc aac cac tcc agc att gcc aag 3043

Thr Thr Gly His Pro Asp Asp Ala Ser Asn His Ser Ser Ile Ala Lys

509

gac tac atc gcg agg tgg cag aca cta ggc gta gct cac gat gcc aat 3091

Asp Tyr Ile Ala Arg Trp Gln Thr Leu Gly Val Ala His Asp Ala Asn

525

cct ccg cat aca acg ctg tcg tac gga gcg aac gag act cat ggtcag 3139

Pro Pro His Thr Thr Leu Ser Tyr Gly Ala Asn Glu Thr His

541

ttagccgctc cgggtgcact tataatactg actttctccag gg ctt ctg tac aat 3194

Gly Leu Leu Tyr Asn

555

ctg tat gcg gat cgt gaa ttg ggc ttg aac ttg gtt cct cag tcg gtc 3242

Leu Tyr Ala Asp Arg Glu Leu Gly Leu Asn Leu Val Pro Gln Ser Val

560

tat gac atg caa aac acc ttc tat ccg acg gtg aag gag aag tat gga 3290

Tyr Asp Met Gln Asn Thr Phe Tyr Pro Thr Val Lys Glu Lys Tyr Gly

576

gtg ccg ctc gat act cga cac gtg tac act aag ggtaag ctcgatatgt 3339

Val Pro Leu Asp Thr Arg His Val Tyr Thr Lys

592

tctttctaat gtttgacatt gaatattgac ttgtccccag cg gat tgg gag ctt 3393

Ala Asp Trp Glu Leu

603

ttc aca gct gcg gtt gcg tcg gag agt gtc cga gac atg ttc cac cag 3441

Phe Thr Ala Ala Val Ala Ser Glu Ser Val Arg Asp Met Phe His Gln

608

gcg ctc gcg acg tgg atc aac gag aca ccg acc aac cgt gcc ttt acg 3489

Ala Leu Ala Thr Trp Ile Asn Glu Thr Pro Thr Asn Arg Ala Phe Thr

624

gat ctc tat gat acc caa act gga aa gtaa gtgtttgcca aggggctgct 3539

Asp Leu Tyr Asp Thr Gln Thr Gly Asn

640

tgggccttgc tgaccaatat ag t tat ccg gcg ggc att acg ttc att 3586

Tyr Pro Ala Gly Ile Thr Phe Ile

649

gcg cgg ccc gtc atg ggt ggt gcc ttt gcg ttg tta att ctc t 3629

Ala Arg Pro Val Met Gly Gly Ala Phe Ala Leu Leu Ile Leu

657

agagtcgttt cattgtatat tgattttatt cgcttctggg cgcgagtgga gacacttgct 3689

tactttgttt ccaattttat tattaccgtg gctatgggac cagattgacc gttgttaata 3749

gcgtacctca tacatagcat ttttattctg caaatagtgt tgttgtattt gggtctccaa 3809

taataatgcg ttcgtagacg atgctccaaa ggaactatct ggtctgcaag ctgcttatat 3869

caagcatata taaagatcta cgtatccagt cgtgcttatc caagtggctc tggccatcta 3929

ccgcagatcg taagtggact cgaccgagcc atcccacgca tcaaaagcgc gaataagatc 3989

tacaaagtca gcaatcatac tcct 4013

＜210＞ 2

＜211＞ 690

＜212＞ PRT

＜213＞ Aspergillus oryzae

＜400＞ 10

Met Met His Phe Leu Ser Phe Cys Leu Ser Val Ala Ser Leu Val Ser

-20

Tyr Ala Gly Ala Ala Ser Thr Phe Ser Pro Ala Arg Pro Pro Ala Leu

-4

Pro Leu Ala Val Lys Ser Pro Tyr Leu Ser Thr Trp Leu Ser Ala Gly

13

Thr Asp Gly Gly Asn Gly Gly Tyr Leu Ala Gly Gln Trp Pro Thr Phe

29

Trp Phe Gly Gln Val Thr Gly Trp Ala Gly Gln Ile Arg Val Asp Asn

45

Ser Thr Tyr Thr Trp Met Gly Ala Ile Pro Asn Thr Pro Thr Val Asn

61

Gln Thr Ser Phe Glu Tyr Thr Ser Thr Ser Ser Val Phe Thr Met Arg

77

Val Gly Asp Met Val Glu Met Lys Val Lys Phe Leu Ser Pro Ile Thr

93

Pro Asp Asp Leu Arg Arg Gln Ser Leu Val Phe Ser Tyr Leu Asp Val

109

Asp Val Glu Ser Ile Asp Gly Lys Ala His Asp Ile Gln Val Tyr Ala

125

Asp Ile Ser Ala Glu Trp Ala Ser Gly Asp Arg Asn Ala Ile Ala Gln

141

Trp Asp Tyr Gly Val Thr Asp Asp Gly Val Ala Tyr His Lys Val Tyr

157

Arg Gln Thr Gln Leu Leu Phe Ser Glu Asn Thr Glu Gln Ala Glu Trp

173

Gly Glu Trp Tyr Trp Ala Thr Asp Asp Gln Asp Gly Leu Ser Tyr Gln

189

Ser Gly Pro Asp Val Asp Val Arg Gly Ala Phe Ala Lys Asn Gly Lys

205

Leu Ala Asn Ser Asp Asp Lys Asn Tyr Arg Ala Ile Ser Thr Asn Trp

221

Pro Val Phe Ala Phe Ser Arg Asp Leu Gly Ser Val Lys Thr Ser Ala

237

Gly Thr Leu Phe Ser Ile Gly Leu Ala Gln Asp Ser Ala Ile Gln Tyr

253

Ser Gly Lys Pro Glu Gly Thr Thr Val Met Pro Ser Leu Trp Lys Ser

269

Tyr Phe Ser Thr Ala Thr Ala Ala Leu Glu Phe Phe His His Asp Tyr

285

Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Lys Asp Leu Asp Asp Arg Ile Ser Lys

301

Asp Ser Ile Asp Ala Ala Gly Gln Asp Tyr Leu Thr Ile Thr Ser Leu

317

Thr Val Arg Gln Val Phe Ala Ala Val Gln Leu Thr Gly Thr Pro Glu

333

Asp Pro Tyr Ile Phe Met Lys Glu Ile Ser Ser Asn Gly Asn Met Asn

349

Thr Val Asp Val Ile Phe Pro Ala His Pro Ile Phe Leu Tyr Thr Asn

365

Pro Glu Leu Leu Lys Leu Ile Leu Lys Pro Ile Tyr Glu Ile Gln Glu

381

Asn Gly Lys Tyr Pro Asn Thr Tyr Ala Met His Asp Ile Gly Thr His

397

Tyr Pro Asn Ala Thr Gly His Pro Lys Gly Asp Asp Glu Lys Met Pro

413

Leu Glu Glu Cys Gly Asn Met Val Ile Met Ala Leu Ala Tyr Ala Gln

429

Lys Ala Lys Asp Asn Asp Tyr Leu Ser Gln His Tyr Pro Ile Leu Asn

445

Lys Trp Thr Thr Tyr Leu Val Glu Asp Ser Ile Tyr Pro Ala Asn Gln

461

Ile Ser Thr Asp Asp Phe Ala Gly Ser Leu Ala Asn Gln Thr Asn Leu

477

Ala Leu Lys Gly Ile Ile Gly Ile Gln Ala Met Ala Val Ile Ser Asn

493

Thr Thr Gly His Pro Asp Asp Ala Ser Asn His Ser Ser Ile Ala Lys

509

Asp Tyr Ile Ala Arg Trp Gln Thr Leu Gly Val Ala His Asp Ala Asn

525

Pro Pro His Thr Thr Leu Ser Tyr Gly Ala Asn Glu Thr His Gly Leu

541

Leu Tyr Asn Leu Tyr Ala Asp Arg Glu Leu Gly Leu Asn Leu Val Pro

557

Gln Ser Val Tyr Asp Met Gln Asn Thr Phe Tyr Pro Thr Val Lys Glu

573

Lys Tyr Gly Val Pro Leu Asp Thr Arg His Val Tyr Thr Lys Ala Asp

589

Trp Glu Leu Phe Thr Ala Ala Val Ala Ser Glu Ser Val Arg Asp Met

605

Phe His Gln Ala Leu Ala Thr Trp Ile Asn Glu Thr Pro Thr Asn Arg

621

Ala Phe Thr Asp Leu Tyr Asp Thr Gln Thr Gly Asn Tyr Pro Ala Gly

637

Ile Thr Phe Ile Ala Arg Pro Val Met Gly Gly Ala Phe Ala Leu Leu

653

Ile Leu

669

＜210＞ 3

＜211＞ 17

＜212＞ PRT

＜213＞ Aspergillus oryzae

＜400＞ 3

Ala Ser Thr Phe Ser Pro Ala Arg Pro Pro Ala Leu Pro Leu Ala Val

1 5 10 15

Lys

＜210＞ 4

＜211＞ 10

＜212＞ PRT

＜213＞ Aspergillus oryzae

＜220＞

＜221＞ misc_feature

＜222＞ (2)

＜223＞ Xaa =Gly or Pro

＜220＞

＜221＞ misc_feature

＜222＞ (3)

＜223＞ Xaa=Asn or Val

＜220＞

＜221＞ misc_feature

＜222＞ (4)

＜223＞ Xaa=Thr or Pro

＜220＞

＜221＞ misc_feature

＜222＞ (8)

＜223＞ Xaa=Arg or Ser

＜400＞ 4

Tyr Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Met Xaa Asp Ile

1 5 10

＜210＞ 5

＜211＞ 9

＜212＞ PRT

＜213＞ Aspergillus oryzae

＜220＞

＜221＞ misc_feature

＜222＞ (4)

＜223＞ Xaa=Thr or Gly

＜220＞

＜221＞ misc_feature

＜222＞ (8)

＜223＞ Xaa is uncertain

＜400＞ 5

Val Gln Tyr Xaa Glu Tyr Asp Xaa Tyr

1 5

＜210＞ 6

＜211＞ 14

＜212＞ PRT

＜213＞ Aspergillus oryzae

＜400＞ 6

Asp Asn Asp Tyr Leu Ser Gln His Tyr Pro Ile Leu Asn Lys

1 5 10

＜210＞ 7

＜211＞ 15

＜212＞ PRT

＜213＞ Aspergillus oryzae

＜400＞ 7

Trp Thr Ala Tyr Leu Val Glu Asp Thr Ile Tyr Pro Ala Asn Gln

1 5 10 15

＜210＞ 8

＜211＞ 10

＜212＞ PRT

＜213＞ Aspergillus oryzae

＜400＞ 8

Val Leu Leu Gln Ser Ala Ile Glu Gly His

1 5 10

＜210＞ 9

＜211＞ 10

＜212＞ PRT

＜213＞ Aspergillus oryzae

＜400＞ 9

Gly Ile Ile Gly Ile Gln Ala Met Ala Val

1 5 10

＜210＞ 10

＜211＞ 10

＜212＞ PRT

＜213＞ Aspergillus oryzae

＜220＞

＜221＞ misc_feature

＜222＞ (1)

＜223＞ Xaa is uncertain

＜220＞

＜221＞ misc_feature

＜222＞ (6)

＜223＞ Xaa is uncertain

＜220＞

＜221＞ misc_feature

＜222＞ (8)

＜223＞ Xaa is uncertain

＜220＞

＜221＞ misc_feature

＜222＞ (9)

＜223＞ Xaa is uncertain

＜400＞ 10

Xaa Ile Leu Lys Phe Xaa Tyr Xaa Xaa Gln

1 5 10

＜210＞ 11

＜211＞ 30

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Description of Artificial Sequence:primer

＜400＞ 11

taccccaaca cctatgctat gcgcgatatc 30

＜210＞ 12

＜211＞ 36

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Description of Artificial Sequence:primer

＜400＞ 12

ttggttcgcc ggataaatag tatcttcgac caagta 36

＜210＞ 13

＜211＞ 29

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Description of Artificial Sequence:primer

＜400＞ 13

gatcatgatg catttcctct cgttctgtc 29

＜210＞ 14

＜211＞ 28

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Description of Artificial Sequence:primer

＜400＞ 14

gcaaagtcat ccgtagagat ctggttcg 28

＜210＞ 15

＜211＞ 30

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Description of Artificial Sequence:primer

＜400＞ 15

ggcgaaccag atctctacgg atgactttgc 30

＜210＞ 16

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Description of Artificial Sequence:primer

＜400＞ 16

ctgatctaga cctgcaggct c 21

＜210＞ 17

＜211＞ 2269

＜212＞ DNA

＜213＞ Aspergillus oryzae

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (1)..(2070)

＜220＞

＜221＞ sig_peptide

＜222＞ (1)..(60)

＜220＞

＜221＞ mat_peptide

＜222＞ (61)..(2070)

＜400＞ 17

atg atg cat ttc ctc tcg ttc tgt ctg tcg gtg gcc tcc ctg gtg tct 48

Met Met His Phe Leu Ser Phe Cys Leu Ser Val Ala Ser Leu Val Ser

-20

tac gcc gga gct gcg tca aca ttc tcc cct gcg agg cca ccc gcc ctg 96

Tyr Ala Gly Ala Ala Ser Thr Phe Ser Pro Ala Arg Pro Pro Ala Leu

-4

ccc ttg gct gtc aaa tcg ccg tac ttg agc aca tgg ctc tct gcg ggc 144

Pro Leu Ala Val Lys Ser Pro Tyr Leu Ser Thr Trp Leu Ser Ala Gly

13

aca gat ggc ggt aat gga ggg tac ctg gcc ggc caa tgg cct acc ttc 192

Thr Asp Gly Gly Asn Gly Gly Tyr Leu Ala Gly Gln Trp Pro Thr Phe

29

tgg ttc ggc cag gtg acc ggc tgg gcg ggt cag atc cgg gtc gat aat 240

Trp Phe Gly Gln Val Thr Gly Trp Ala Gly Gln Ile Arg Val Asp Asn

45

tcg acc tac aca tgg atg ggg gcg atc cct aac acc cct acg gtg aac 288

Ser Thr Tyr Thr Trp Met Gly Ala Ile Pro Asn Thr Pro Thr Val Asn

61

cag aca tcc ttc gag tac acc tcg acg tcg agc gtg ttc acg atg cgt 336

Gln Thr Ser Phe Glu Tyr Thr Ser Thr Ser Ser Val Phe Thr Met Arg

77

gtt ggg gat atg gtg gaa atg aaa gtg aaa ttc ctg tcc cct atc aca 384

Val Gly Asp Met Val Glu Met Lys Val Lys Phe Leu Ser Pro Ile Thr

93

cca gat gat ctc cgg aga cag tcg ctt gtg ttt tcc tat ctg gac gta 432

Pro Asp Asp Leu Arg Arg Gln Ser Leu Val Phe Ser Tyr Leu Asp Val

109

gat gtc gaa tcg atc gac ggc aaa gcg cat gac ata cag gtg tac gca 480

Asp Val Glu Ser Ile Asp Gly Lys Ala His Asp Ile Gln Val Tyr Ala

125

gac att tca gca gaa tgg gcg tcc ggg gac cga aac gcc att gcg cag 528

Asp Ile Ser Ala Glu Trp Ala Ser Gly Asp Arg Asn Ala Ile Ala Gln

141

tgg gac tat ggt gtc aca gat gat ggc gtt gcc tat cac aag gtt tac 576

Trp Asp Tyr Gly Val Thr Asp Asp Gly Val Ala Tyr His Lys Val Tyr

157

cgc caa acg cag ctg ctg ttt tcc gaa aac act gag cag gcc gaa tgg 624

Arg Gln Thr Gln Leu Leu Phe Ser Glu Asn Thr Glu Gln Ala Glu Trp

173

ggc gag tgg tac tgg gcc aca gac gac caa gat ggt ctg agc tac cag 672

Gly Glu Trp Tyr Trp Ala Thr Asp Asp Gln Asp Gly Leu Ser Tyr Gln

189

tcc gga ccg gat gtt gat gtg cga ggg gca ttc gca aag aac gga aag 720

Ser Gly Pro Asp Val Asp Val Arg Gly Ala Phe Ala Lys Asn Gly Lys

205

ttg gcg aat tcg gat gat aaa aat tat cgt gca atc tcg acc aat tgg 768

Leu Ala Asn Ser Asp Asp Lys Asn Tyr Arg Ala Ile Ser Thr Asn Trp

221

ccc gtg ttt gcc ttc tcc cgc gat ctt ggc tcg gtg aag acg tct gct 816

Pro Val Phe Ala Phe Ser Arg Asp Leu Gly Ser Val Lys Thr Ser Ala

237

ggc acg tta ttc tcc att ggc ctt gcg cag gac agt gcc ata cag tac 864

Gly Thr Leu Phe Ser Ile Gly Leu Ala Gln Asp Ser Ala Ile Gln Tyr

253

agt ggg aaa cct gaa ggg aca act gtg atg cct tca ctc tgg aag agc 912

Ser Gly Lys Pro Glu Gly Thr Thr Val Met Pro Ser Leu Trp Lys Ser

269

tac ttc agc act gcg act gct gcg ctt gag ttc ttc cat cat gat tat 960

Tyr Phe Ser Thr Ala Thr Ala Ala Leu Glu Phe Phe His His Asp Tyr

285

gct gct gca gct gca cta tcg aag gat ctc gat gac cgg ata tcc aag 1008

Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Lys Asp Leu Asp Asp Arg Ile Ser Lys

301

gat tcc att gat gcc gct ggc cag gac tac ctg aca atc acc tcc ctc 1056

Asp Ser Ile Asp Ala Ala Gly Gln Asp Tyr Leu Thr Ile Thr Ser Leu

317

acg gtc cgt caa gtc ttt gct gcc gtg caa ttg acc ggc acg ccc gag 1104

Thr Val Arg Gln Val Phe Ala Ala Val Gln Leu Thr Gly Thr Pro Glu

333

gac ccc tac atc ttc atg aag gag atc tcg tcc aat ggc aac atg aac 1152

Asp Pro Tyr Ile Phe Met Lys Glu Ile Ser Ser Asn Gly Asn Met Asn

349

act gtg gac gtc atc ttc ccc gct cac ccg atc ttt ttg tac acc aat 1200

Thr Val Asp Val Ile Phe Pro Ala His Pro Ile Phe Leu Tyr Thr Asn

365

ccc gag ctc ctc aaa ctg att ctg aag cca atc tat gag att caa gag 1248

Pro Glu Leu Leu Lys Leu Ile Leu Lys Pro Ile Tyr Glu Ile Gln Glu

381

aac gga aag tat ccc aac aca tac gcc atg cac gat att gga acc cac 1296

Asn Gly Lys Tyr Pro Asn Thr Tyr Ala Met His Asp Ile Gly Thr His

397

tac ccg aac gcc acg ggc cat cct aag ggc gac gac gag aaa atg cca 1344

Tyr Pro Asn Ala Thr Gly His Pro Lys Gly Asp Asp Glu Lys Met Pro

413

ctc gag gag tgt gga aac atg gtt atc atg gcc ctt gcc tac gcc cag 1392

Leu Glu Glu Cys Gly Asn Met Val Ile Met Ala Leu Ala Tyr Ala Gln

429

aag gcc aag gac aac gac tat ctt tca cag cac tat ccc atc ctc aac 1440

Lys Ala Lys Asp Asn Asp Tyr Leu Ser Gln His Tyr Pro Ile Leu Asn

445

aaa tgg aca aca tac ctc gtc gag gat tct att tac ccg gcg aac cag 1488

Lys Trp Thr Thr Tyr Leu Val Glu Asp Ser Ile Tyr Pro Ala Asn Gln

461

atc tct acg gat gac ttt gct ggc tcg cta gca aac cag acc aac ctg 1536

Ile Ser Thr Asp Asp Phe Ala Gly Ser Leu Ala Asn Gln Thr Asn Leu

477

gca ttg aag gga atc att gga atc cag gca atg gct gtg atc agc aat 1584

Ala Leu Lys Gly Ile Ile Gly Ile Gln Ala Met Ala Val Ile Ser Asn

493

acg aca gga cac ccg gac gat gcc tcc aac cac tcc agc att gcc aag 1632

Thr Thr Gly His Pro Asp Asp Ala Ser Asn His Ser Ser Ile Ala Lys

509

gac tac atc gcg agg tgg cag aca cta ggc gta gct cac gat gcc aat 1680

Asp Tyr Ile Ala Arg Trp Gln Thr Leu Gly Val Ala His Asp Ala Asn

525

cct ccg cat aca acg ctg tcg tac gga gcg aac gag act cat ggg ctt 1728

Pro Pro His Thr Thr Leu Ser Tyr Gly Ala Asn Glu Thr His Gly Leu

541

ctg tac aat ctg tat gcg gat cgt gaa ttg ggc ttg aac ttg gtt cct 1776

Leu Tyr Asn Leu Tyr Ala Asp Arg Glu Leu Gly Leu Asn Leu Val Pro

557

cag tcg gtc tat gac atg caa aac acc ttc tat ccg acg gtg aag gag 1824

Gln Ser Val Tyr Asp Met Gln Asn Thr Phe Tyr Pro Thr Val Lys Glu

573

aag tat gga gtg ccg ctc gat act cga cac gtg tac act aag gcg gat 1872

Lys Tyr Gly Val Pro Leu Asp Thr Arg His Val Tyr Thr Lys Ala Asp

589

tgg gag ctt ttc aca gct gcg gtt gcg tcg gag agt gtc cga gac atg 1920

Trp Glu Leu Phe Thr Ala Ala Val Ala Ser Glu Ser Val Arg Asp Met

605

ttc cac cag gcg ctc gcg acg tgg atc aac gag aca ccg acc aac cgt 1968

Phe His Gln Ala Leu Ala Thr Trp Ile Asn Glu Thr Pro Thr Asn Arg

621

gcc ttt acg gat ctc tat gat acc caa act gga aat tat ccg gcg ggc 2016

Ala Phe Thr Asp Leu Tyr Asp Thr Gln Thr Gly Asn Tyr Pro Ala Gly

637

att acg ttc att gcg cgg ccc gtc atg ggt ggt gcc ttt gcg ttg tta 2064

Ile Thr Phe Ile Ala Arg Pro Val Met Gly Gly Ala Phe Ala Leu Leu

653

att ctc tagagtcgtt tcattgtata ttgattttat tcgcttctgg gcgcgagtgg 2120

Ile Leu

669

agacacttgc ttactttgtt tccaatttta ttattaccgt ggctatggga ccagattgac 2180

cgttgttaat agcgtacctc atacatagca tttttattct gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2240

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2269

＜210＞ 18

＜211＞ 690

＜212＞ PRT

＜213＞ Aspergillus oryzae

＜400＞ 18

Met Met His Phe Leu Ser Phe Cys Leu Ser Val Ala Ser Leu Val Ser

-20

Tyr Ala Gly Ala Ala Ser Thr Phe Ser Pro Ala Arg Pro Pro Ala Leu

-4

Pro Leu Ala Val Lys Ser Pro Tyr Leu Ser Thr Trp Leu Ser Ala Gly

13

Thr Asp Gly Gly Asn Gly Gly Tyr Leu Ala Gly Gln Trp Pro Thr Phe

29

Trp Phe Gly Gln Val Thr Gly Trp Ala Gly Gln Ile Arg Val Asp Asn

45

Ser Thr Tyr Thr Trp Met Gly Ala Ile Pro Asn Thr Pro Thr Val Asn

61

Gln Thr Ser Phe Glu Tyr Thr Ser Thr Ser Ser Val Phe Thr Met Arg

77

Val Gly Asp Met Val Glu Met Lys Val Lys Phe Leu Ser Pro Ile Thr

93

Pro Asp Asp Leu Arg Arg Gln Ser Leu Val Phe Ser Tyr Leu Asp Val

109

Asp Val Glu Ser Ile Asp Gly Lys Ala His Asp Ile Gln Val Tyr Ala

125

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141

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157

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173

Gly Glu Trp Tyr Trp Ala Thr Asp Asp Gln Asp Gly Leu Ser Tyr Gln

189

Ser Gly Pro Asp Val Asp Val Arg Gly Ala Phe Ala Lys Asn Gly Lys

205

Leu Ala Asn Ser Asp Asp Lys Asn Tyr Arg Ala Ile Ser Thr Asn Trp

221

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237

Gly Thr Leu Phe Ser Ile Gly Leu Ala Gln Asp Ser Ala Ile Gln Tyr

253

Ser Gly Lys Pro Glu Gly Thr Thr Val Met Pro Ser Leu Trp Lys Ser

269

Tyr Phe Ser Thr Ala Thr Ala Ala Leu Glu Phe Phe His His Asp Tyr

285

Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Lys Asp Leu Asp Asp Arg Ile Ser Lys

301

Asp Ser Ile Asp Ala Ala Gly Gln Asp Tyr Leu Thr Ile Thr Ser Leu

317

Thr Val Arg Gln Val Phe Ala Ala Val Gln Leu Thr Gly Thr Pro Glu

333

Asp Pro Tyr Ile Phe Met Lys Glu Ile Ser Ser Asn Gly Asn Met Asn

349

Thr Val Asp Val Ile Phe Pro Ala His Pro Ile Phe Leu Tyr Thr Asn

365

Pro Glu Leu Leu Lys Leu Ile Leu Lys Pro Ile Tyr Glu Ile Gln Glu

381

Asn Gly Lys Tyr Pro Asn Thr Tyr Ala Met His Asp Ile Gly Thr His

397

Tyr Pro Asn Ala Thr Gly His Pro Lys Gly Asp Asp Glu Lys Met Pro

413

Leu Glu Glu Cys Gly Asn Met Val Ile Met Ala Leu Ala Tyr Ala Gln

429

Lys Ala Lys Asp Asn Asp Tyr Leu Ser Gln His Tyr Pro Ile Leu Asn

445

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461

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477

Ala Leu Lys Gly Ile Ile Gly Ile Gln Ala Met Ala Val Ile Ser Asn

493

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509

Asp Tyr Ile Ala Arg Trp Gln Thr Leu Gly Val Ala His Asp Ala Asn

525

Pro Pro His Thr Thr Leu Ser Tyr Gly Ala Asn Glu Thr His Gly Leu

541

Leu Tyr Asn Leu Tyr Ala Asp Arg Glu Leu Gly Leu Asn Leu Val Pro

557

Gln Ser Val Tyr Asp Met Gln Asn Thr Phe Tyr Pro Thr Val Lys Glu

573

Lys Tyr Gly Val Pro Leu Asp Thr Arg His Val Tyr Thr Lys Ala Asp

589

Trp Glu Leu Phe Thr Ala Ala Val Ala Ser Glu Ser Val Arg Asp Met

605

Phe His Gln Ala Leu Ala Thr Trp Ile Asn Glu Thr Pro Thr Asn Arg

621

Ala Phe Thr Asp Leu Tyr Asp Thr Gln Thr Gly Asn Tyr Pro Ala Gly

637

Ile Thr Phe Ile Ala Arg Pro Val Met Gly Gly Ala Phe Ala Leu Leu

653

Ile Leu

669

＜210＞ 19

＜211＞ 27

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Description of Artificial Sequence:primer

＜400＞ 19

gacgaccaag atggtctgag ctaccagt 27

＜210＞ 20

＜211＞ 30

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Description of Artificial Sequence:primer

＜400＞ 20

gcaaagtcat ccgtagagat ctggttcgcc 30

＜210＞ 21

＜211＞ 6191

＜212＞ DNA

＜213＞ Aspergillus nidulans

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (1807)..(2000)

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (2061)..(2353)

＜220＞

＜221＞ CDS

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＜220＞

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＜220＞

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＜220＞

＜221＞ CDS

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＜220＞

＜221＞ CDS

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＜220＞

＜221＞ CDS

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＜220＞

＜221＞ intron

＜222＞ (2001)..(2060)

＜220＞

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＜220＞

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＜220＞

＜221＞ intron

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＜220＞

＜221＞ intron

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＜220＞

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＜220＞

＜221＞ intron

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＜220＞

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＜220＞

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＜220＞

＜221＞ mat_peptide

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＜220＞

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＜222＞ (2412)..(2854)

＜220＞

＜221＞ mat_peptide

＜222＞ (2915)..(3498)

＜220＞

＜221＞ mat_peptide

＜222＞ (3554)..(3756)

＜220＞

＜221＞ mat_peptide

＜222＞ (3806)..(3949)

＜220＞

＜221＞ mat_peptide

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＜220＞

＜221＞ mat_peptide

＜222＞ (4180)..(4246)

＜400＞ 21

gatatccaat gtctagggcg tacggcattc tgaaatgatc cgtgtactgc acgaatactc 60

catactacgt accacaagat tgaacaccct attatcaaac ttcgagagtc tgctgggcgt 120

ataactgctg ggtggcgaac cgcgaaatta ttatacctta ggaggctccg gtctcaacgt 180

gtaagcacta acgaaccctg gtccgctatg ctgtgcaagt atcagcacct cagcttgcag 240

cgttcgccta cttaatccgt aacccgagga ccggaccggc aagactcgat tgtcccatgt 300

gctctgtacc tgcgtggatg gcactcccag catctgctgt gccaaacgaa gcggatcgct 360

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cgcagggggg caagtagtgg gttaatgacg ggacctccgc atttctcttt gaatctggct 540

gttagcgtgt cacttggctc gggttgggct gggtcatgca cggatctgca tcaagtcagt 600

ctcttgtgat gtacgctgat ccggtgatgt acatatgagg ggtagaagat actcggggca 660

gacactgact ttgtatggtg ggaacgatgt cacacaatgc aggcacagac atccagccaa 720

cacctttgta cagagtatgc aaacaatgag ttggccagtc ggttgccagg attctcgttg 780

cagcgcagga cagccaagag aagaaccaga gagatgaggg caatatctaa tccagtctct 840

tgcatggtcc tctcccgcgt cattccgtac tggaatgtga ggggccgtat gtggaaatat 900

tgcttgggat gacaaagggc gtgaagagtg aagggtttct tcaagtgctg gacggaagag 960

tagggaggac tttgagcatg gcactttcct cttagggtac tctccagtcc cacgttttcg 1020

cctcgctcct cgctctccaa ctcctctatt ttcccacaaa acacttctct ccttcgtatg 1080

ctcctgctct gaatcagctt ggaaccctct cataaccctc cggggggggg gcccgcgttc 1140

gttgataacc catgctacca tggcaaatga ccttactgac ggcgtaacag atctacttcg 1200

cttggtcgaa cttcatgctt atttctaagc ttggttacta taggctcccg cgccgttttg 1260

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caagaaatac tcatgattga ttcttatagg agcggatctc ctctgtggag tatacaccca 1380

atttcaaacc cctgttccct tcgctcgatt ggctattttc tttcgttttc catgtgtata 1440

gtggcgacgg catgcgctgg tgcagataga atgatcggtc agacgacatt attcgagaaa 1500

gttatgccta tgcatgtgca gatgcttctg cctcgattcg aaagagtcta gacagggctt 1560

tccacatgct ggcaccaaga gtccactcct agaattctat aaagaaacct tcatccgcct 1620

ggaatgcaag atatatccac tgtacagccg tgcctagcat tccgctgccc attcccaagg 1680

cccacattgc tgctcgatta tttgtcactc cttgaaattg cttcataatt ctcctgttgt 1740

tgagtctttt aaacggggcc tattagaagg gggttgcacg gctgaggatc acctacccag 1800

atcaat atg cgt act ttt cta cta ggc atc ctg tgc gca ccc ctg gct 1848

Met Arg Thr Phe Leu Leu Gly Ile Leu Cys Ala Pro Leu Ala

-19

atc ctt aca gga gcc gca tcg act ttt tct cca gca cgc cct ccg gct 1896

Ile Leu Thr Gly Ala Ala Ser Thr Phe Ser Pro Ala Arg Pro Pro Ala

-5

ctt cct cta gcg gtc aaa tct ccg tac ttg agt act tgg ctg ccg gcg 1944

Leu Pro Leu Ala Val Lys Ser Pro Tyr Leu Ser Thr Trp Leu Pro Ala

12

ggg aaa gac ggc ggc aat gga ggc tac ctt gca ggg gaa tgg cca gcg 1992

Gly Lys Asp Gly Gly Asn Gly Gly Tyr Leu Ala Gly Glu Trp Pro Ala

28

ttc tgg ga gtgagtgcta tgaacctggc ataacaatta cagagagctg aaaaagaatc 2050

Phe Trp Glu

44

attgttatag a ggc caa ata aca gga tgg gct ggc ctt att cgt 2094

Gly Gln Ile Thr Gly Trp Ala Gly Leu Ile Arg

47

gtg gat ggc cag gtc tat aca tgg atg ggc ctt cca ggc tca gcc act 2142

Val Asp Gly Gln Val Tyr Thr Trp Met Gly Leu Pro Gly Ser Ala Thr

58

gtg aac cag act gcg tat gag tac act tca acg aag agc att ttc acc 2190

Val Asn Gln Thr Ala Tyr Glu Tyr Thr Ser Thr Lys Ser Ile Phe Thr

74

atg cat att ggt gat atg gta gag atg aag ata acc ttc ctt tca cca 2238

Met His Ile Gly Asp Met Val Glu Met Lys Ile Thr Phe Leu Ser Pro

90

att aca ccg aat gat ctt cga cgg cag tcc cta gtg ttt tcg tat ctt 2286

Ile Thr Pro Asn Asp Leu Arg Arg Gln Ser Leu Val Phe Ser Tyr Leu

106

gac gtg agt gtc acc tca ctc gac ggc cag tcc cac agt gta cag gtg 2334

Asp Val Ser Val Thr Ser Leu Asp Gly Gln Ser His Ser Val Gln Val

122

tac gct gac ata tca gct ggtgagtt tacctggaca tacttcagcc aagtgaaaaa 2390

Tyr Ala Asp Ile Ser Ala

138

ccattattga ttgttccctag aa ttt gcg tct ggc gac cgt tcc gcc ata gca 2443

Glu Phe Ala Ser Gly Asp Arg Ser Ala Ile Ala

144

caa tgg aac tat ggt gtt acc agt gac ggc gta gcc tat cat aag atc 2491

Gln Trp Asn Tyr Gly Val Thr Ser Asp Gly Val Ala Tyr His Lys Ile

155

tat cgc cag acg ccg ctc cta ttc tct gag cat aga gac caa gct gaa 2539

Tyr Arg Gln Thr Pro Leu Leu Phe Ser Glu His Arg Asp Gln Ala Glu

171

tgg ggt gat tgg tac tgg gca act gac aat gta gca gga ctc act tac 2587

Trp Gly Asp Trp Tyr Trp Ala Thr Asp Asn Val Ala Gly Leu Thr Tyr

187

cag gct ggt cca gat gtt gat gtc cgg gaa gct ttt gcg cgc aat gga 2635

Gln Ala Gly Pro Asp Val Asp Val Arg Glu Ala Phe Ala Arg Asn Gly

203

aag cta acc aat aac aac gac gtc aac tac aga gct atc tcc aac aac 2683

Lys Leu Thr Asn Asn Asn Asp Val Asn Tyr Arg Ala Ile Ser Asn Asn

219

tgg ccg gtg ttt ggt ttt gcc cat gac ctt ggg tct atc agc tct tct 2731

Trp Pro Val Phe Gly Phe Ala His Asp Leu Gly Ser Ile Ser Ser Ser

235

act aag gtg ctt ttc tca ata ggg cta acc cag cga gag gca atc cag 2779

Thr Lys Val Leu Phe Ser Ile Gly Leu Thr Gln Arg Glu Ala Ile Gln

251

tat agc ggg aac tct tcc acc ctt tct cct ttg cct gct ctg tgg acg 2827

Tyr Ser Gly Asn Ser Ser Thr Leu Ser Pro Leu Pro Ala Leu Trp Thr

267

agc tat ttc agc act gcc ttg gat gcc gtgagt gctccccgtg tagaagctag 2880

Ser Tyr Phe Ser Thr Ala Leu Asp Ala

283

acaccctggg acttactcaa aaaccctatt ttag ctt gac ttc ttc cac 2929

Leu Asp Phe Phe His

292

cat gat tat cag aag tca aac tct ctt tct tca gat ctt gat cgg cga 2977

His Asp Tyr Gln Lys Ser Asn Ser Leu Ser Ser Asp Leu Asp Arg Arg

297

att gca caa gat tcc gtt gcc gct gcc ggt cac gac tac ctt acc att 3025

Ile Ala Gln Asp Ser Val Ala Ala Ala Gly His Asp Tyr Leu Thr Ile

313

aca tcc ctc agc att cgt caa gct ttc gct gca acc cag ctg tgt ggg 3073

Thr Ser Leu Ser Ile Arg Gln Ala Phe Ala Ala Thr Gln Leu Cys Gly

329

cca gca aat gat ccg tat ctc ttt atg aaa gaa atc tcc tcc aac ggc 3121

Pro Ala Asn Asp Pro Tyr Leu Phe Met Lys Glu Ile Ser Ser Asn Gly

345

aac atg aac acg gta gat gtg atc ttc cct gct cat ccc gtc ttc tta 3169

Asn Met Asn Thr Val Asp Val Ile Phe Pro Ala His Pro Val Phe Leu

361

tac aca aac cca gca ctg ctt aaa tat ctc ctg cgc cca cat ttg gag 3217

Tyr Thr Asn Pro Ala Leu Leu Lys Tyr Leu Leu Arg Pro His Leu Glu

377

atc cag gag tct gga aat tac ccc aac tcc tat gct atg cat gat atc 3265

Ile Gln Glu Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Ser Tyr Ala Met His Asp Ile

393

ggt gct cat tac cct aac gct aca ggc cat ccg gat ggc aat gac gag 3313

Gly Ala His Tyr Pro Asn Ala Thr Gly His Pro Asp Gly Asn Asp Glu

409

cca atg ccg ttg gag gag tgc ggt aat atg gtg atc atg gct cta gca 3361

Pro Met Pro Leu Glu Glu Cys Gly Asn Met Val Ile Met Ala Leu Ala

425

tat gcg cag aag gcc ggg gac aca gcg tac ctg gaa agc cac tac aca 3409

Tyr Ala Gln Lys Ala Gly Asp Thr Ala Tyr Leu Glu Ser His Tyr Thr

441

ata ctg aga cgt tgg acg gac tac ttg atc gaa gat tct ctt tat ccg 3457

Ile Leu Arg Arg Trp Thr Asp Tyr Leu Ile Glu Asp Ser Leu Tyr Pro

457

gcg aac caa ata tcg aca gat gat ttc gca ggt cca ttg gc gt 3500

Ala Asn Gln Ile Ser Thr Asp Asp Phe Ala Gly Pro Leu Ala

473

acgtccctac tggcgtatag gtgcttctca aaccaaacta atggcgtctc taga 3554

aat caa acc aac ctc gcc ctg aag gga atc atc ggt atc gag gcc atg 3602

Asn Gln Thr Asn Leu Ala Leu Lys Gly Ile Ile Gly Ile Glu Ala Met

487

tct gtc atc gct agc ctg aca gga gac tct gat gat aag atg aat ctc 3650

Ser Val Ile Ala Ser Leu Thr Gly Asp Ser Asp Asp Lys Met Asn Leu

503

acc aat tac gcc cac gat tac atc gaa aaa tgg ctg att ttg gga att 3698

Thr Asn Tyr Ala His Asp Tyr Ile Glu Lys Trp Leu Ile Leu Gly Ile

519

gca cgt aac aca acg tat ccg cat aca aca ttg tcg tac gga tca aac 3746

Ala Arg Asn Thr Thr Tyr Pro His Thr Thr Leu Ser Tyr Gly Ser Asn

535

gag tct cat ggttt gtgtactcct cactgtgatg cttggccaat actgattgtt 3800

Glu Ser His

551

ccaag ga ctc ctg tac aac ctt tac gca gat cgc gag cta ggc ttg 3846

Gly Leu Leu Tyr Asn Leu Tyr Ala Asp Arg Glu Leu Gly Leu

554

aac ctg gtc ccg caa tct gtg tat gac atg cag agc aac ttc tac ccg 3894

Asn Leu Val Pro Gln Ser Val Tyr Asp Met Gln Ser Asn Phe Tyr Pro

568

aca atc aag ggt caa tac gga gtg cca ctg gat acc cgc cat caa tac 3942

Thr Ile Lys Gly Gln Tyr Gly Val Pro Leu Asp Thr Arg His Gln Tyr

584

acg aaa gg tatgtggcca tctactcgtc gcggctgtat aattgacggt ctcag gt 3997

Thr Lys Gly

600

gat tgg gag ctc ttc acg gcg gca gtc gca tca gta agc aca cga 4042

Asp Trp Glu Leu Phe Thr Ala Ala Val Ala Ser Val Ser Thr Arg

603

gac atg ttc atc aaa cta ctt gcc cag tgg ata aac gag acg cca acg 4090

Asp Met Phe Ile Lys Leu Leu Ala Gln Trp Ile Asn Glu Thr Pro Thr

618

aac cgt cca ctt acg gat ctc tat gac act gta acc gga ga gtaagtgta 4140

Asn Arg Pro Leu Thr Asp Leu Tyr Asp Thr Val Thr Gly Asp

634

cctacctaaa cctaggagac gctttgctga ttcactcagc tac cca ccg gta gtt 4195

Tyr Pro Pro Val Val

648

ttc atc gct cga cct gtc atg ggc gcg gca ttc act ttg ttg ctt ctc 4243

Phe Ile Ala Arg Pro Val Met Gly Ala Ala Phe Thr Leu Leu Leu Leu

653

gac tgaa attctttcca ggtacataca tgctttatca ggacaaaaga gcggctaggc 4300

Asp

669

ggtccattcc cagtatttgt gttagatgtg atatatatgg tcgtgtttaa gttgtgtaat 4360

attgtgtggt agtatatagc atcagttata gcctttttca atccctctgg gtagctgaaa 4420

gtgatgtact atgaatgcag atctgtagag cttgcattga tactagtcaa catattcata 4480

gtgttacata ggcaagacga cgagaaccaa tgcagtcttt tgcttctgca tttcttccgt 4540

taaaccgaat ttataccgtc atcagattat cgcgtcagtt gtctagtact aaccttgtac 4600

ctcaaaggtc tgaggtttgt tgttccgcag cgtcccatgc atcaaaggcc cggatcagat 4660

ctgtgatact tagctaccca gctcgtgcaa cgatgaagaa gacctaccat aatacagcat 4720

catcgcctcg aggtgagcat caatgccaac tctttcatcc acagtgtgga tattcaacgc 4780

acggccctcg cgcgcgggac tccagcggta aatgtttggc gataggttcc agtaaagcct 4840

ggtatccgtg ttgccggtgg tgatgtcccc accaacaacg acagttttgc ctttcagact 4900

tggaacagac tcgaagaccg agcgggcgac accggcaaac cgtgcccaaa cgggacttgt 4960

atcgatatca gtagggctaa cgggggctgg ctcgagagga gaatttaggg tcgagagcgt 5020

gagatgacca ctgcttgcca cttcactgct gatctcgtcc ttgttggtat ccaagaatct 5080

ggaccaggtc aaattgaact tctctacaat gggctctatg atcttctccg ctcggtcttg 5140

gagcatcttc ggggtttggt gcaatgcgat gcgataattc acgacagcgg tgatcttttc 5200

cggaagcgcg ttgctcttta tgcctccatt gaatatatcc gctgcctggg acgactggag 5260

agtgaatcga acgctttctc cacgagacct agcaattgct tcggccgttg ctgcctgatc 5320

atccgagtca agcgcagaag caagccagtc ctccacatat tcaggagaat ggcggacctg 5380

gcactcaaac actcggcgag aagggtgatt agaccctaaa atgggcgtga aaatgtcaag 5440

ctcagtattc tctagcttgt aaataatttc cgacattatg ccgaccccgg tatgtctggg 5500

cggaacggaa ctatggccac cagggacagc gagggtaagg acgatcgtga cggcgccttt 5560

ctcgccaaca tccgggagcg cgtaaatcac actctcgtcc tcaaattcct ctccagcgga 5620

agataacgat gagcgaaggg tggtgatacc gccacctcct tcgtcaagga tgaattctac 5680

tccatctttc ccatatcttt cctccagaac cggagcgatt cgcgcagcac caatataccc 5740

ttgtgcctcc tcgtcgaatc caaacgccag gacaatcggt cgagatggcg tccagttctg 5800

agataggaga tcctcggcta cagagagaag accgataagg ccgtttttgc agtcgctgct 5860

tcctcgtccc cagagaaact cgccatcaaa ataccctgag aagggaggat gcgtccagtc 5920

tgaggcatcg ttaataggga ccacatcttg atgagccgta aagagaaggg gctttctctt 5980

ttctacagtt tccgagggag gttcaagtgt tattataaga ttgaagcggt tgacgtgctc 6040

gatcttggct ttggagtagc tgtctcaggt tagttttggg aagagagatc ctgagctggg 6100

aaggatacgc gggtgacgcg agggtcattg aagtaaggag gaaaagggta ggtgagctca 6160

cacaagagga aagagcccag caagaagctt a 6191

＜210＞ 22

＜211＞ 688

＜212＞ PRT

＜213＞ Aspergillus oryzae

＜400＞ 22

Met Arg Thr Phe Leu Leu Gly Ile Leu Cys Ala Pro Leu Ala Ile Leu

-19

Thr Gly Ala Ala Ser Thr Phe Ser Pro Ala Arg Pro Pro Ala Leu Pro

-3

Leu Ala Val Lys Ser Pro Tyr Leu Ser Thr Trp Leu Pro Ala Gly Lys

14

Asp Gly Gly Asn Gly Gly Tyr Leu Ala Gly Glu Trp Pro Ala Phe Trp

30

Glu Gly Gln Ile Thr Gly Trp Ala Gly Leu Ile Arg Val Asp Gly Gln

46

Val Tyr Thr Trp Met Gly Leu Pro Gly Ser Ala Thr Val Asn Gln Thr

62

Ala Tyr Glu Tyr Thr Ser Thr Lys Ser Ile Phe Thr Met His Ile Gly

78

Asp Met Val Glu Met Lys Ile Thr Phe Leu Ser Pro Ile Thr Pro Asn

94

Asp Leu Arg Arg Gln Ser Leu Val Phe Ser Tyr Leu Asp Val Ser Val

110

Thr Ser Leu Asp Gly Gln Ser His Ser Val Gln Val Tyr Ala Asp Ile

126

Ser Ala Glu Phe Ala Ser Gly Asp Arg Ser Ala Ile Ala Gln Trp Asn

142

Tyr Gly Val Thr Ser Asp Gly Val Ala Tyr His Lys Ile Tyr Arg Gln

158

Thr Pro Leu Leu Phe Ser Glu His Arg Asp Gln Ala Glu Trp Gly Asp

174

Trp Tyr Trp Ala Thr Asp Asn Val Ala Gly Leu Thr Tyr Gln Ala Gly

190

Pro Asp Val Asp Val Arg Glu Ala Phe Ala Arg Asn Gly Lys Leu Thr

206

Asn Asn Asn Asp Val Asn Tyr Arg Ala Ile Ser Asn Asn Trp Pro Val

222

Phe Gly Phe Ala His Asp Leu Gly Ser Ile Ser Ser Ser Thr Lys Val

238

Leu Phe Ser Ile Gly Leu Thr Gln Arg Glu Ala Ile Gln Tyr Ser Gly

254

Asn Ser Ser Thr Leu Ser Pro Leu Pro Ala Leu Trp Thr Ser Tyr Phe

270

Ser Thr Ala Leu Asp Ala Leu Asp Phe Phe His His Asp Tyr Gln Lys

286

Ser Asn Ser Leu Ser Ser Asp Leu Asp Arg Arg Ile Ala Gln Asp Ser

302

Val Ala Ala Ala Gly His Asp Tyr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Ser Ile

318

Arg Gln Ala Phe Ala Ala Thr Gln Leu Cys Gly Pro Ala Asn Asp Pro

334

Tyr Leu Phe Met Lys Glu Ile Ser Ser Asn Gly Asn Met Asn Thr Val

350

Asp Val Ile Phe Pro Ala His Pro Val Phe Leu Tyr Thr Asn Pro Ala

366

Leu Leu Lys Tyr Leu Leu Arg Pro His Leu Glu Ile Gln Glu Ser Gly

382

Asn Tyr Pro Asn Ser Tyr Ala Met His Asp Ile Gly Ala His Tyr Pro

398

Asn Ala Thr Gly His Pro Asp Gly Asn Asp Glu Pro Met Pro Leu Glu

414

Glu Cys Gly Asn Met Val Ile Met Ala Leu Ala Tyr Ala Gln Lys Ala

430

Gly Asp Thr Ala Tyr Leu Glu Ser His Tyr Thr Ile Leu Arg Arg Trp

446

Thr Asp Tyr Leu Ile Glu Asp Ser Leu Tyr Pro Ala Asn Gln Ile Ser

462

Thr Asp Asp Phe Ala Gly Pro Leu Ala Asn Gln Thr Asn Leu Ala Leu

478

Lys Gly Ile Ile Gly Ile Glu Ala Met Ser Val Ile Ala Ser Leu Thr

494

Gly Asp Ser Asp Asp Lys Met Asn Leu Thr Asn Tyr Ala His Asp Tyr

510

Ile Glu Lys Trp Leu Ile Leu Gly Ile Ala Arg Asn Thr Thr Tyr Pro

526

His Thr Thr Leu Ser Tyr Gly Ser Asn Glu Ser His Gly Leu Leu Tyr

542

Asn Leu Tyr Ala Asp Arg Glu Leu Gly Leu Asn Leu Val Pro Gln Ser

558

Val Tyr Asp Met Gln Ser Asn Phe Tyr Pro Thr Ile Lys Gly Gln Tyr

574

Gly Val Pro Leu Asp Thr Arg His Gln Tyr Thr Lys Gly Asp Trp Glu

590

Leu Phe Thr Ala Ala Val Ala Ser Val Ser Thr Arg Asp Met Phe Ile

606

Lys Leu Leu Ala Gln Trp Ile Asn Glu Thr Pro Thr Asn Arg Pro Leu

622

Thr Asp Leu Tyr Asp Thr Val Thr Gly Asp Tyr Pro Pro Val Val Phe

638

Ile Ala Arg Pro Val Met Gly Ala Ala Phe Thr Leu Leu Leu Leu Asp

654

＜210＞ 23

＜211＞ 27

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Description of Artificial Sequence:primer

＜400＞ 23

gcttcataat tctcctgttg ttgagtc 27

＜210＞ 24

＜211＞ 30

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Description of Artificial Sequence:primer

＜400＞ 24

ggctataact gatgctatat actaccacac 30

＜210＞ 25

＜211＞ 2298

＜212＞ DNA

＜213＞ Aspergillus nidulans

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (88)..(2151)

＜220＞

＜221＞ mat_peptide

＜222＞ (145)..(2151)

＜400＞ 25

gcttcataat tctcctgttg ttgagtcttt taaacggggc ctattagaag ggggttgcac 60

ggctgaggat cacctaccca gatcaat atg cgt act ttt cta cta ggc atc 111

Met Arg Thr Phe Leu Leu Gly Ile

-19

ctg tgc gca ccc ctg gct atc ctt aca gga gcc gca tcg act ttt tct 159

Leu Cys Ala Pro Leu Ala Ile Leu Thr Gly Ala Ala Ser Thr Phe Ser

-11

cca gca cgc cct ccg gct ctt cct cta gcg gtc aaa tct ccg tac ttg 207

Pro Ala Arg Pro Pro Ala Leu Pro Leu Ala Val Lys Ser Pro Tyr Leu

6

agt act tgg ctg ccg gcg ggg aaa gac ggc ggc aat gga ggc tac ctt 255

Ser Thr Trp Leu Pro Ala Gly Lys Asp Gly Gly Asn Gly Gly Tyr Leu

22

gca ggg gaa tgg cca gcg ttc tgg gaa ggc caa ata aca gga tgg gct 303

Ala Gly Glu Trp Pro Ala Phe Trp Glu Gly Gln Ile Thr Gly Trp Ala

38

ggc ctt att cgt gtg gat ggc cag gtc tat aca tgg atg ggc ctt cca 351

Gly Leu Ile Arg Val Asp Gly Gln Val Tyr Thr Trp Met Gly Leu Pro

54

ggc tca gcc act gtg aac cag act gcg tat gag tac act tca acg aag 399

Gly Ser Ala Thr Val Asn Gln Thr Ala Tyr Glu Tyr Thr Ser Thr Lys

70

agc att ttc acc atg cat att ggt gat atg gta gag atg aag ata acc 447

Ser Ile Phe Thr Met His Ile Gly Asp Met Val Glu Met Lys Ile Thr

86

ttc ctt tca cca att aca ccg aat gat ctt cga cgg cag tcc cta gtg 495

Phe Leu Ser Pro Ile Thr Pro Asn Asp Leu Arg Arg Gln Ser Leu Val

102

ttt tcg tat ctt gac gtg agt gtc acc tca ctc gac ggc cag tcc cac 543

Phe Ser Tyr Leu Asp Val Ser Val Thr Ser Leu Asp Gly Gln Ser His

118

agt gta cag gtg tac gct gac ata tca gct gaa ttt gcg tct ggc gac 591

Ser Val Gln Val Tyr Ala Asp Ile Ser Ala Glu Phe Ala Ser Gly Asp

134

cgt tcc gcc ata gca caa tgg aac tat ggt gtt acc agt gac ggc gta 639

Arg Ser Ala Ile Ala Gln Trp Asn Tyr Gly Val Thr Ser Asp Gly Val

150

gcc tat cat aag atc tat cgc cag acg ccg ctc cta ttc tct gag cat 687

Ala Tyr His Lys Ile Tyr Arg Gln Thr Pro Leu Leu Phe Ser Glu His

166

aga gac caa gct gaa tgg ggt gat tgg tac tgg gca act gac aat gta 735

Arg Asp Gln Ala Glu Trp Gly Asp Trp Tyr Trp Ala Thr Asp Asn Val

182

gca gga ctc act tac cag gct ggt cca gat gtt gat gtc cgg gaa gct 783

Ala Gly Leu Thr Tyr Gln Ala Gly Pro Asp Val Asp Val Arg Glu Ala

198

ttt gcg cgc aat gga aag cta acc aat aac aac gac gtc aac tac aga 831

Phe Ala Arg Asn Gly Lys Leu Thr Asn Asn Asn Asp Val Asn Tyr Arg

214

gct atc tcc aac aac tgg ccg gtg ttt ggt ttt gcc cat gac ctt ggg 879

Ala Ile Ser Asn Asn Trp Pro Val Phe Gly Phe Ala His Asp Leu Gly

230

tct atc agc tct tct act aag gtg ctt ttc tca ata ggg cta acc cag 927

Ser Ile Ser Ser Ser Thr Lys Val Leu Phe Ser Ile Gly Leu Thr Gln

246

cga gag gca atc cag tat agc ggg aac tct tcc acc ctt tct cct ttg 975

Arg Glu Ala Ile Gln Tyr Ser Gly Asn Ser Ser Thr Leu Ser Pro Leu

262

cct gct ctg tgg acg agc tat ttc agc act gcc ttg gat gcc ctt gac 1023

Pro Ala Leu Trp Thr Ser Tyr Phe Ser Thr Ala Leu Asp Ala Leu Asp

278

ttc ttc cac cat gat tat cag aag tca aac tct ctt tct tca gat ctt 1071

Phe Phe His His Asp Tyr Gln Lys Ser Asn Ser Leu Ser Ser Asp Leu

294

gat cgg cga att gca caa gat tcc gtt gcc gct gcc ggt cac gac tac 1119

Asp Arg Arg Ile Ala Gln Asp Ser Val Ala Ala Ala Gly His Asp Tyr

310

ctt acc att aca tcc ctc agc att cgt caa gct ttc gct gca acc cag 1167

Leu Thr Ile Thr Ser Leu Ser Ile Arg Gln Ala Phe Ala Ala Thr Gln

326

ctg tgt ggg cca gca aat gat ccg tat ctc ttt atg aaa gaa atc tcc 1215

Leu Cys Gly Pro Ala Asn Asp Pro Tyr Leu Phe Met Lys Glu Ile Ser

342

tcc aac ggc aac atg aac acg gta gat gtg atc ttc cct gct cat ccc 1263

Ser Asn Gly Asn Met Asn Thr Val Asp Val Ile Phe Pro Ala His Pro

358

gtc ttc tta tac aca aac cca gca ctg ctt aaa tat ctc ctg cgc cca 1311

Val Phe Leu Tyr Thr Asn Pro Ala Leu Leu Lys Tyr Leu Leu Arg Pro

374

cat ttg gag atc cag gag tct gga aat tac ccc aac tcc tat gct atg 1359

His Leu Glu Ile Gln Glu Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Ser Tyr Ala Met

390

cat gat atc ggt gct cat tac cct aac gct aca ggc cat ccg gat ggc 1407

His Asp Ile Gly Ala His Tyr Pro Asn Ala Thr Gly His Pro Asp Gly

406

aat gac gag cca atg ccg ttg gag gag tgc ggt aat atg gtg atc atg 1455

Asn Asp Glu Pro Met Pro Leu Glu Glu Cys Gly Asn Met Val Ile Met

422

gct cta gca tat gcg cag aag gcc ggg gac aca gcg tac ctg gaa agc 1503

Ala Leu Ala Tyr Ala Gln Lys Ala Gly Asp Thr Ala Tyr Leu Glu Ser

438

cac tac aca ata ctg aga cgt tgg acg gac tac ttg atc gaa gat tct 1551

His Tyr Thr Ile Leu Arg Arg Trp Thr Asp Tyr Leu Ile Glu Asp Ser

454

ctt tat ccg gcg aac caa ata tcg aca gat gat ttc gca ggt cca ttg 1599

Leu Tyr Pro Ala Asn Gln Ile Ser Thr Asp Asp Phe Ala Gly Pro Leu

470

gca aat caa acc aac ctc gcc ctg aag gga atc atc ggt atc gag gcc 1647

Ala Asn Gln Thr Asn Leu Ala Leu Lys Gly Ile Ile Gly Ile Glu Ala

486

atg tct gtc atc gct agc ctg aca gga gac tct gat gat aag atg aat 1695

Met Ser Val Ile Ala Ser Leu Thr Gly Asp Ser Asp Asp Lys Met Asn

502

ctc acc aat tac gcc cac gat tac atc gaa aaa tgg ctg att ttg gga 1743

Leu Thr Asn Tyr Ala His Asp Tyr Ile Glu Lys Trp Leu Ile Leu Gly

518

att gca cgt aac aca acg tat ccg cat aca aca ttg tcg tac gga tca 1791

Ile Ala Arg Asn Thr Thr Tyr Pro His Thr Thr Leu Ser Tyr Gly Ser

534

aac gag tct cat gga ctc ctg tac aac ctt tac gca gat cgc gag cta 1839

Asn Glu Ser His Gly Leu Leu Tyr Asn Leu Tyr Ala Asp Arg Glu Leu

550

ggc ttg aac ctg gtc ccg caa tct gtg tat gac atg cag agc aac ttc 1887

Gly Leu Asn Leu Val Pro Gln Ser Val Tyr Asp Met Gln Ser Asn Phe

566

tac ccg aca atc aag ggt caa tac gga gtg cca ctg gat acc cgc cat 1935

Tyr Pro Thr Ile Lys Gly Gln Tyr Gly Val Pro Leu Asp Thr Arg His

582

caa tac acg aaa ggt gat tgg gag ctc ttc acg gcg gca gtc gca tca 1983

Gln Tyr Thr Lys Gly Asp Trp Glu Leu Phe Thr Ala Ala Val Ala Ser

598

gta agc aca cga gac atg ttc atc aaa cta ctt gcc cag tgg ata aac 2031

Val Ser Thr Arg Asp Met Phe Ile Lys Leu Leu Ala Gln Trp Ile Asn

614

gag acg cca acg aac cgt cca ctt acg gat ctc tat gac act gta acc 2079

Glu Thr Pro Thr Asn Arg Pro Leu Thr Asp Leu Tyr Asp Thr Val Thr

630

gga gac tac cca ccg gta gtt ttc atc gct cga cct gtc atg ggc gcg 2127

Gly Asp Tyr Pro Pro Val Val Phe Ile Ala Arg Pro Val Met Gly Ala

646

gca ttc act ttg ttg ctt ctc gac tgaaattct ttccaggtac atacatgctt 2180

Ala Phe Thr Leu Leu Leu Leu Asp

662

tatcaggaca aaagagcggc taggcggtcc attcccagta tttgtgttag atgtgatata 2240

tatggtcgtg tttaagttgt gtaatattgt gtggtagtat atagcatcag ttatagcc 2298

＜210＞ 26

＜211＞ 688

＜212＞ PRT

＜213＞ Aspergillus nidulans

＜400＞ 26

Met Arg Thr Phe Leu Leu Gly Ile Leu Cys Ala Pro Leu Ala Ile Leu

-19

Thr Gly Ala Ala Ser Thr Phe Ser Pro Ala Arg Pro Pro Ala Leu Pro

-3

Leu Ala Val Lys Ser Pro Tyr Leu Ser Thr Trp Leu Pro Ala Gly Lys

14

Asp Gly Gly Asn Gly Gly Tyr Leu Ala Gly Glu Trp Pro Ala Phe Trp

30

Glu Gly Gln Ile Thr Gly Trp Ala Gly Leu Ile Arg Val Asp Gly Gln

46

Val Tyr Thr Trp Met Gly Leu Pro Gly Ser Ala Thr Val Asn Gln Thr

62

Ala Tyr Glu Tyr Thr Ser Thr Lys Ser Ile Phe Thr Met His Ile Gly

78

Asp Met Val Glu Met Lys Ile Thr Phe Leu Ser Pro Ile Thr Pro Asn

94

Asp Leu Arg Arg Gln Ser Leu Val Phe Ser Tyr Leu Asp Val Ser Val

110

Thr Ser Leu Asp Gly Gln Ser His Ser Val Gln Val Tyr Ala Asp Ile

126

Ser Ala Glu Phe Ala Ser Gly Asp Arg Ser Ala Ile Ala Gln Trp Asn

142

Tyr Gly Val Thr Ser Asp Gly Val Ala Tyr His Lys Ile Tyr Arg Gln

158

Thr Pro Leu Leu Phe Ser Glu His Arg Asp Gln Ala Glu Trp Gly Asp

174

Trp Tyr Trp Ala Thr Asp Asn Val Ala Gly Leu Thr Tyr Gln Ala Gly

190

Pro Asp Val Asp Val Arg Glu Ala Phe Ala Arg Asn Gly Lys Leu Thr

206

Asn Asn Asn Asp Val Asn Tyr Arg Ala Ile Ser Asn Asn Trp Pro Val

222

Phe Gly Phe Ala His Asp Leu Gly Ser Ile Ser Ser Ser Thr Lys Val

238

Leu Phe Ser Ile Gly Leu Thr Gln Arg Glu Ala Ile Gln Tyr Ser Gly

254

Asn Ser Ser Thr Leu Ser Pro Leu Pro Ala Leu Trp Thr Ser Tyr Phe

270

Ser Thr Ala Leu Asp Ala Leu Asp Phe Phe His His Asp Tyr Gln Lys

286

Ser Asn Ser Leu Ser Ser Asp Leu Asp Arg Arg Ile Ala Gln Asp Ser

302

Val Ala Ala Ala Gly His Asp Tyr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Ser Ile

318

Arg Gln Ala Phe Ala Ala Thr Gln Leu Cys Gly Pro Ala Asn Asp Pro

344

Tyr Leu Phe Met Lys Glu Ile Ser Ser Asn Gly Asn Met Asn Thr Val

350

Asp Val Ile Phe Pro Ala His Pro Val Phe Leu Tyr Thr Asn Pro Ala

366

Leu Leu Lys Tyr Leu Leu Arg Pro His Leu Glu Ile Gln Glu Ser Gly

382

Asn Tyr Pro Asn Ser Tyr Ala Met His Asp Ile Gly Ala His Tyr Pro

398

Asn Ala Thr Gly His Pro Asp Gly Asn Asp Glu Pro Met Pro Leu Glu

414

Glu Cys Gly Asn Met Val Ile Met Ala Leu Ala Tyr Ala Gln Lys Ala

430

Gly Asp Thr Ala Tyr Leu Glu Ser His Tyr Thr Ile Leu Arg Arg Trp

446

Thr Asp Tyr Leu Ile Glu Asp Ser Leu Tyr Pro Ala Asn Gln Ile Ser

462

Thr Asp Asp Phe Ala Gly Pro Leu Ala Asn Gln Thr Asn Leu Ala Leu

478

Lys Gly Ile Ile Gly Ile Glu Ala Met Ser Val Ile Ala Ser Leu Thr

494

Gly Asp Ser Asp Asp Lys Met Asn Leu Thr Asn Tyr Ala His Asp Tyr

510

Ile Glu Lys Trp Leu Ile Leu Gly Ile Ala Arg Asn Thr Thr Tyr Pro

526

His Thr Thr Leu Ser Tyr Gly Ser Asn Glu Ser His Gly Leu Leu Tyr

542

Asn Leu Tyr Ala Asp Arg Glu Leu Gly Leu Asn Leu Val Pro Gln Ser

558

Val Tyr Asp Met Gln Ser Asn Phe Tyr Pro Thr Ile Lys Gly Gln Tyr

574

Gly Val Pro Leu Asp Thr Arg His Gln Tyr Thr Lys Gly Asp Trp Glu

590

Leu Phe Thr Ala Ala Val Ala Ser Val Ser Thr Arg Asp Met Phe Ile

604

Lys Leu Leu Ala Gln Trp Ile Asn Glu Thr Pro Thr Asn Arg Pro Leu

622

Thr Asp Leu Tyr Asp Thr Val Thr Gly Asp Tyr Pro Pro Val Val Phe

638

Ile Ala Arg Pro Val Met Gly Ala Ala Phe Thr Leu Leu Leu Leu Asp

654

간장, 미소, 및 기타 단백질 가수분해물을 함유하는 천연 조미료의 제조에 국균(아스퍼질러스 속에 속하는 사상균)을 이용하여 왔다. 예를 들어, 간장은 누룩 제조 및 발효의 2단계 공정을 통해 제조된다. 누룩 제조 단계에서, 출발 물질은 주로 국균에 의해 생산된 효소에 의해 분해된다. 이러한 공정에서, 보다 강한 간장의 우마미를 수득하기 위해 각종 맛을 내는 물질 중에서 글루탐산의 양을 증가시키는 것이 중요하다.

글루탐산은 2가지 경로를 통해 제조된다. 첫 번째 경로는 프로테아제 및 펩티다제에 의해 야기되는 단백질로부터의 글루탐산의 유리이다. 두 번째 경로는 글루타미나제(글루타민 아미도하이드롤라제)에 의해 촉매되는 글루타민의 가수분해를 통한 글루탐산의 생성이다.

간장의 제조에서, 출발 물질 중의 글루탐산의 함유량에 대한 글루탐산의 유리율이 그다지 높지 않을 경우, 이는 국균의 불충분한 글루타미나제 활성에 기인하는 것으로 간주된다. 따라서, 고체 누룩내에서 프로테아제 활성이 높은 균주 및 글루타미나제 활성이 높은 균주의 세포 융합에 의한 프로테아제 및 글루타미나제의 활성이 높은 균주의 육종이 또한 시도되어 왔다[참고문헌: Ushijima, S. et al., Agric. Biol. Chem., 51(4), 1051 (1987) 및 일본 특허 공보(KOKOKU) 제(평)3-73271호].

글루타미나제의 경우, 각종 세균 및 동물로부터 유래된 것들이 충분히 연구되어 있다[참고문헌: Wakayana, M. et al., J. Ferment. Bioeng., 82, No. 6, 592-597 (1996), Chung-Bok, Mi, et al., Biochem. J., 324, 193-200 (1997), Duran, S. et al., Biochem. Genet., 34, 453-465 (1996)]. 한편, 국균의 글루타미나제에 관한 연구는 지체되었으나, 균체외 글루타미나제 및 균체내 글루타미나제는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)의 한 균주로부터 정제되어 있고, 이들은 특성화되어 있다[참고문헌: Yano, T. et al., J. Ferment. Technol., Vol. 66, No. 2, 137-143 (1988)]. 이들 글루타미나제의 분자량은 약 113,000이고, 이들의 특성은 실질적으로 유사하다.

또한, 아스퍼질러스 오리재 HG 균주로부터 유래된 글루타미나제의 N-말단 영역의 아미노산 서열[참고문헌: Fukuoka Industrial Technology Center, Institute of Biology and Food, Research Summary of 1996 (1997)], 및 정제된 글루타미나제에 대한 아스퍼질러스 오리재로부터 유래된 글루타미나제의 N-말단 영역내의 아미노산 서열[참고문헌: Food Research Institute, Aichi Prefectural Government, Japan, Annual Report of 1995(Research Report) pp. 3-4, (1996)]은 결정되어 있다.

한편, 국균은 단백질을 균체외에 분비하는 능력이 우수하기 때문에, 이는 재조합 단백질을 생산하기 위한 숙주로서 주목을 받아왔으며, 특정 효소에서 실용화되어 있다.

본 발명은 신규한 글루타미나제 및 이를 암호화하는 유전자에 관한 것이다. 본 발명의 글루타미나제는 글루타민을 보다 강한 "우마미(umami)"의 맛(지미)을 나타내는 글루탐산으로 전환시키는 식품 가공용 효소로서 이용할 수 있다.

상술한 바와 같이, 국균은 이미 유전자 재조합 기술에 대한 재료로서 성과를 거두었으며, 이의 글루타미나제도 또한 어느 정도까지는 연구되어 있다. 그러나, 충분히 연구되지 않은 것으로 여겨져, 이의 추가 연구가 요망되어 왔다. 또한, 국균의 글루타미나제를 암호화하는 유전자는 분리되어 있지 않다.

본 발명은 당해 분야의 상술한 현상을 고려하여 수행되었으며, 이의 목적은 국균으로부터 유래된 글루타미나제를 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 성공적으로 글루타미나제를 아스퍼질러스 오리재로부터 정제하였고, 이의 부분 아미노산 서열을 결정하였으며, 수득된 정보를 기초로 하여 글루타미나제를 암호화하는 DNA를 분리함으로써, 본 발명을 달성하였다. 또한, 본 발명자들은 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans)의 글루타미나제를 암호화하는 DNA를 분리하는데 성공하였다.

즉, 본 발명은

(1) 하기 (A) 내지 (D) 중 어느 하나에 정의된 단백질:

(A) 서열 목록에서 서열 2의 아미노산 번호 1 내지 670의 아미노산 서열을 갖는 단백질;

(B) 서열 목록에서 서열 22의 아미노산 번호 1 내지 669의 아미노산 서열을 갖는 단백질;

(C) 서열 목록에서 서열 2의 아미노산 번호 1 내지 670의 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어져 있고, 글루타민의 글루탐산 및 암모니아로의 가수분해를 촉매시키는 활성을 갖는 단백질; 및

(D) 서열 목록에서 서열 22의 아미노산 번호 1 내지 669의 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어져 있고, 글루타민의 글루탐산 및 암모니아로의 가수분해를 촉매시키는 활성을 갖는 단백질;

(2) 하기 (A) 내지 (D) 중 어느 하나에 정의된 단백질을 암호화하는 DNA:

(A) 서열 목록에서 서열 2의 아미노산 번호 1 내지 670의 아미노산 서열을 갖는 단백질;

(B) 서열 목록에서 서열 22의 아미노산 번호 1 내지 669의 아미노산 서열을 갖는 단백질;

(C) 서열 목록에서 서열 2의 아미노산 번호 1 내지 670의 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어져 있고, 글루타민의 글루탐산 및 암모니아로의 가수분해를 촉매시키는 활성을 갖는 단백질; 및

(D) 서열 목록에서 서열 22의 아미노산 번호 1 내지 669의 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어져 있고, 글루타민의 글루탐산 및 암모니아로의 가수분해를 촉매시키는 활성을 갖는 단백질;

(3) 다음 (a) 내지 (d) 중 어느 하나에 정의된 DNA인 (2)의 DNA:

(a) 서열 목록에서 서열 1의 뉴클레오타이드 서열 중 뉴클레오타이드 번호 1174 내지 1370, 1446 내지 1741, 1800 내지 2242, 2297 내지 2880, 2932 내지 3134, 3181 내지 3324, 3380 내지 3515 및 3562 내지 3628의 뉴클레오타이드 서열을 순서대로 함유하는 DNA;

(b) 서열 목록에서 서열 21의 뉴클레오타이드 서열 중 뉴클레오타이드 번호 1807 내지 2000, 2061 내지 2353, 2412 내지 2854, 2915 내지 3498, 3554 내지 3756, 3806 내지 3949, 3996 내지 4131 및 4180 내지 4246의 뉴클레오타이드 서열을 순서대로 함유하는 DNA;

(c) (a)의 DNA와 엄격한 조건하에 하이브리드화하고, 글루타민의 글루탐산 및 암모니아로의 가수분해를 촉매시키는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA; 및

(d) (b)의 DNA와 엄격한 조건하에 하이브리드화하고, 글루타민의 글루탐산 및 암모니아로의 가수분해를 촉매시키는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA;

(4) 서열 1 또는 서열 17에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 (2)의 DNA;

(5) 서열 21 또는 서열 25에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 (3)의 DNA;

(6) 벡터내에 삽입된 (2)의 DNA를 포함하는 재조합 벡터;

(7) (2)의 DNA가 발현되어 글루타미나제를 생산할 수 있는 방식으로 도입된 미생물의 형질전환체;

(8) 사상균 또는 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 세균으로부터 유래된 (7)의 형질전환체; 및

(9) (7)의 형질전환체를 배양 배지에서 배양시켜, 배양물에서 글루타미나제를 제조함을 포함하는 글루타미나제의 제조 방법을 제공한다.

본원에서 사용되는 용어 "글루타미나제 활성"은 L-글루타민의 L-글루탐산 및 암모니아로의 가수분해를 촉매시키는 활성을 의미하고, 상기 활성은 D-글루타민의 D-글루탐산 및 암모니아로의 가수분해를 촉매시키는 활성을 포함할 수 있다. 또한, 상기 활성은 L-글루타민의 L-글루탐산 및 암모니아로의 가수분해를 촉매시키는 활성, D-글루타민의 D-글루탐산 및 암모니아로의 가수분해를 촉매시키는 활성, 및 L-γ-글루타밀 화합물의 글루타밀 그룹의 전이 반응 또는 가수분해 반응을 촉매시키는 활성을 포함할 수도 있다. 본 명세서에는, 2가지 양태가 본 발명의 글루타미나제로서 기재되어 있다. 상기 양태 중 하나 또는 둘다, 또는 이의 동등물을 때때로 본 발명의 글루타미나제로 칭하기도 한다. 또한, 본 발명의 글루타미나제를 암호화하는 DNA를 때때로 글루타미나제 유전자로 칭하기도 한다.

본 발명의 글루타미나제는 효소학적 특성을 기초로 하여 국균으로부터 유래된 공지된 글루타미나제와는 구별되므로, 이는 신규한 글루타미나제로서 간주된다.

이후, 본 발명을 상세히 설명한다.

＜1＞ 본 발명의 글루타미나제

본 발명의 글루타미나제는 아스퍼질러스 오리재 RIB40(ATCC 42149)의 배양물로부터, 예를 들어, 다음과 같이 이를 정제하여 수득할 수 있다.

아스퍼질러스 오리재 RIB40(ATCC 42149)을 소맥피와 함께 배양하여, 수득된 소맥피 누룩을 완충액에 침지시켜 조 효소 추출물을 제조한다. 당해 조 효소 추출물을 동결 융해한 다음, 불용성 분획을 제거하여 상청액을 수득한다. 당해 상청액을 황산암모늄 분획화시켜, 55% 포화 황산암모늄에서는 침전되지 않으나, 85% 포화 황산암모늄에서는 침전되는 분획을 수득한다. 황산암모늄을 상기 분획으로부터 제거한 다음, 생성물을 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피에 의해 추가로 분획화시켜, 정제된 글루타미나제를 제공할 수 있다. 크로마토그래피용 수지로서는, 음이온 교환 크로마토그래피용 DEAE-TOYOPEARL(Tosoh), 소수성 크로마토그래피용 Phenyl Sepharose(Pharmacia) 및 겔 여과 크로마토그래피용 Superdex(Pharmacia)를 예로 들 수 있다. 이들 정제 공정은 반복하여 수행할 수 있다.

글루타미나제의 정제를 위한 각각의 단계에서, 목적하는 분획은 글루타미나제 활성을 기초로 하여 선택한다. 글루타미나제 활성은 하트만(Hartman) 방법의 개질된 변법[참고문헌: Hartman, S.C., J. Biol. Chem., 243, 853-863 (1968), 하이드록사메이트 방법]에 의해 측정할 수 있다.

상기한 바와 같은 아스퍼질러스 오리재 RIB40(ATCC 42149)의 소맥피 누룩으로부터 수득된 글루타미나제의 효소학적 특성은 공지된 글루타미나제인 아스퍼질러스 오리재로부터 유래된 글루타미나제[참고문헌: Yano, T. et al., J. Ferment. Technol., Vol. 66, No. 2, 137-143 (1988)] 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis)로부터 유래된 글루타미나제[참고문헌: Shimazu, H. et al., J. Brew. Soc. Japan, 86, No. 6, 441-446 (1991)]의 효소학적 특성과 함께 표 1에 제시한다.

본 발명의 글루타미나제 및 공지된 글루타미나제의 효소학적 특성

	본 발명의글루타미나제	에이. 오리재로부터 유래된글루타미나제(Yano. T. et al.)	비. 서브틸리스로부터 유래된글루타미나제(Shimazu, H. et al.)
분자량	82,0901)	113,0002)	55,000
최적 pH	pH 9	pH 9	pH 6
pH 안정성	pH 7	pH 9	pH 5-8
최적 온도	37-45℃	45℃	50℃
온도 안정성	0-45℃	0-37℃	0-45℃
내염성3)	5% NaCl에서 50%	5% NaCl에서 50%	10% NaCl에서 100%
	18% NaCl에서 20%	18% NaCl에서 10%	25% NaCl에서 85% 이상
기질 특이성4)	L-Gln(100%)	L-Gln(100%)	L-Gln(100%)
	D-Gln(106%)	D-Gln(2%)	D-Gln(67%)
	L-Asn(97%)	L-Asn(0%)	L-Asn(0%)
	D-Asn(104%)	D-Asn(0%)	D-Asn(0%)
반응 특이성	γ-Glu-p-NA	γ-Glu-p-NA	γ-Glu-p-NA(시험되지 않음)
전이5)	(10%)	(0%)	(0%)
가수분해6)	(16%)	(131%)	(0%)
Km치	1.24x10-3M	9.6x10-5M	6.4x10-4M
1) MALDI-TOFMS에 의해 측정2) 겔 여과에 의해 측정3) 100%로 지정된 NaCl의 부재하에서의 활성을 기준으로 한 비교치4) 100%로 지정된 L-글루탐산(L-Gln)에 대한 활성을 기준으로 한 D-글루탐산(D-Gln)에 대한활성의 비교치5) L-γ-글루타밀-p-니트로아닐라이드 + GlyGlu → L-γ-글루타밀-GlyGlu + p-니트로아닐라이드6) L-γ-글루타밀-p-니트로아닐라이드 + H2O → L-γ-글루타메이트 + p-니트로아닐라이드

위에서 제시된 효소학적 특성, 특히 기질 특이성에서의 현저한 차이를 근거로 하여, 본 발명의 글루타미나제는 신규하며, 공지의 아스퍼질러스 오리재로부터 유래된 글루타미나제와 상이한 것으로 단정지어진다.

본 발명의 글루타미나제는 상기한 바와 같은 아스퍼질러스 오리재의 배양물로부터 이를 정제함으로써 수득할 수 있는 한편, 이는 또한 하기한 바와 같은 아스퍼질러스 오리재의 글루타미나제 유전자를 이후 기술하는 바와 같은 적합한 숙주내에서 발현시킴으로써 제조할 수 있다.

이후 기술하는 바와 같이, 아스퍼질러스 오리재로부터 유래된 글루타미나제는 글루타미나제 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 기본으로 하는 서열 2에서 아미노산 번호 1 내지 670의 아미노산 서열을 갖는 것으로 예상된다. 상기 아미노산 서열로부터 계산된 분자량은 약 76,000이고, 이를 MALDI-TOFMS에 의해 측정된 분자량 값과 비교하면, 본 발명의 글루타미나제는 당단백질인 것으로 예상된다.

본 발명의 또 다른 양태의 글루타미나제는 아스퍼질러스 니둘란스로부터 유래된다. 아스퍼질러스 니둘란스로부터 유래된 글루타미나제는 상기한 바와 동일한 방식으로 아스퍼질러스 니둘란스의 배양물로부터 정제하거나, 아스퍼질러스 니둘란스의 글루타미나제 유전자를 적합한 숙주내에서 발현시킴으로써 제조할 수 있다. 아스퍼질러스 니둘란스로부터 유래된 글루타미나제는 글루타미나제 유전자의 뉴클레오타이드 서열로부터 서열 22의 아미노산 번호 1 내지 669의 추정된 아미노산 서열이다.

본 발명의 글루타미나제의 경우, 글루타미나제의 글루탐산 및 암모니아로의 가수분해를 촉매시키는 활성을 갖는 한, 상기한 아미노산 서열은 하나 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 글루타미나제의 양태로서 서열 22에 제시된 아미노산 서열을 갖는 아스퍼질러스 니둘란스의 글루타미나제를 제공한다. 당해 글루타미나제는 상기한 바와 유사한 방식으로 아스퍼질러스 니둘란스의 배양물로부터 정제하거나, 아스퍼질러스 니둘란스의 글루타미나제 유전자를 적합한 숙주내에서 발현시킴으로써 제조할 수 있다.

＜2＞ 본 발명의 DNA

본 발명의 DNA는 아스퍼질러스 오리재 RIB40(ATCC 42149)의 게놈 DNA로부터, 예를 들어, 다음과 같이 수득할 수 있다.

정제된 글루타미나제의 부분 아미노산 서열을 결정하고, PCR(폴리머라제 연쇄 반응)용 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 수득된 아미노산의 정보를 기초로 하여 합성하여, 아스퍼질러스 오리재 RIB40(ATCC 42149)의 균체로부터 제조된 게놈 DNA를 주형으로서 사용하는 PCR을 수행한다. 하기한 본 발명의 실시예에서 결정된 부분 서열은 서열 3 내지 서열 10에 제시한다. 이들 서열 중, 서열 3은 글루타미나제 단백질의 N-말단 아미노산 서열이고, 나머지 서열은 글루타미나제의 내부 아미노산 서열이다. 서열 5 및 서열 8에 제시된 아미노산 서열은 글루타미나제 유전자로부터 예상되는 글루타미나제의 아미노산 서열에 존재하지 않았다. 서열 7에 제시된 아미노산 서열에서 3번째 Ala 및 9번째 Thr은 각각 글루타미나제 유전자로부터 예상되는 글루타미나제의 아미노산 서열에서 Thr 및 Ser로 치환되었는데, 이들은 펩타이드 서열분석기에서의 판독 오류인 것으로 간주된다.

게놈 DNA는 고미(Gomi) 방법[참고문헌: Gomi K. et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 35, 225 (1989)]에 의해 수득할 수 있다.

서열 목록에서 서열 11 및 서열 12에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용함으로써, 약 230bp의 DNA 단편을 상기한 PCR에 의해 수득할 수 있다.

다음, PCR에 의해 증폭된 DNA 단편을 DNA 프로브로서 사용함으로써, λ파아지를 벡터로서 사용하는 아스퍼질러스 오리재 RIB40(ATCC 42149)의 게놈 DNA 라이브러리에 대해 플라크 하이브리드화를 수행하여 포지티브 클론을 수득한다.

상기한 바와 같이 수득된 클로닝된 단편내에서, 약 4.8kb를 갖는 영역(XhoI 단편)내에서 길이가 약 4kb인 부분의 뉴클레오타이드 서열을 결정하여, 이를 서열 목록의 서열 1에 제시한다. 서열 1에서, 뉴클레오타이드 번호 1234 내지 1284의 뉴클레오타이드에 의해 암호화된 아미노산 서열은 서열 3에 제시된 글루타미나제 단백질의 N-말단 아미노산 서열에서 아미노산 번호 1 내지 17의 아미노산 서열에 상응한다. 서열 4, 서열 6, 서열 7, 서열 9 및 서열 10에 제시된 아미노산 서열은 각각 서열 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열 중 뉴클레오타이드 번호 2618 내지 2647, 2762 내지 2803, 2804 내지 2848, 2957 내지 2986 및 2576 내지 2605의 뉴클레오타이드에 의해 암호화된 아미노산 서열에 상응한다.

상기한 사실로부터, 서열 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA는 글루타미나제 유전자임이 명백하다.

서열 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 이후 기술할 글루타미나제 cDNA의 뉴클레오타이드 서열을 비교한 결과, 서열 1의 뉴클레오타이드는 8개의 엑손(뉴클레오타이드 번호 1174 또는 1135 내지 1370, 1446 내지 1741, 1800 내지 2242, 2297 내지 2880, 2932 내지 3134, 3181 내지 3324, 3380 내지 3515 및 3562 내지 3628)을 함유하며, 이들 엑손은 690개의 잔기로 이루어진 아미노산 서열을 암호화한다. 상기 아미노산 서열을 서열 1 및 서열 2에 제시한다. 상기 아미노산 서열과 서열 3에 제시된 글루타미나제 단백질의 N-말단의 아미노산 서열을 비교한 결과, 아미노산 -20 내지 -1의 서열이 시그널 펩타이드이고, 아미노산 1 내지 670의 서열의 서열 2에서 성숙 단백질인 것으로 추정된다. 개시 코돈은 뉴클레오타이드 번호 1174 내지 1176의 ATG인 것으로 추정되나, 뉴클레오타이드 번호 1135 내지 1138에 존재하는 ATG로 구성될 가능성을 부인할 수는 없다.

상기한 사실로부터, 서열 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA는 프로모터 글루타미나제를 암호화하는 영역(시그널 펩타이드 포함)을 함유하는 것으로 강력히 시사된다.

본 발명의 DNA는 인트론이 제거된 서열 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열의 DNA일 수 있으며, 당해 DNA는 본 발명의 글루타미나제를 암호화하는 한, 뉴클레오타이드 번호 1174 내지 1370, 1446 내지 1741, 1800 내지 2242, 2297 내지 2880, 2932 내지 3134, 3181 내지 3324, 3380 내지 3515 및 3562 내지 3628의 뉴클레오타이드 서열을 순서대로 포함한다. 상기 DNA는, 예를 들어, 상기한 글루타미나제 유전자의 cDNA로서 수득할 수 있다.

글루타미나제 cDNA는, 예를 들어, 서열 1의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 이의 부분(예를 들어, 상기한 약 230bp의 프로브)을 사용하는 하이드리드화에 의해 아스퍼질러스 오리재의 폴리(A) RNA로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 제조할 수 있다.

글루타미나제 cDNA는 서열 13 및 서열 14의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하는 PCR 및 서열 15 및 서열 16의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하는 3'-PACE에 의해 수득할 수도 있다. 높은 글루타미나제 생산능을 갖는 아스퍼질러스 오리재 균주로부터 수득된 cDNA의 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 서열 목록의 서열 17에 제시한다. 상기 뉴클레오타이드로부터 추정된 아미노산 서열은 서열 17 및 서열 18에 제시한다. 상기 cDNA의 뉴클레오타이드 서열을 실시예 2에서 수득된 게놈 유전자내의 암호화 영역의 서열과 비교할 경우, 이들은 cDNA(서열 17) 중 뉴클레오타이드 번호 54의 "C"가 게놈 유전자(서열 1)에서 "G"(뉴클레오타이드 번호 1227)인 것을 제외하고는 일치한다. cDNA의 뉴클레오타이드와 게놈 유전자간의 이러한 차이는 균주간의 유전자 서열의 상이함으로로 인한 것으로 추정된다.

본 발명의 DNA는 글루타미나제를 암호화하는 DNA 중 하나일 수 있고, 이는 서열 1 또는 서열 17에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 이외에, 5' 영역에서 불필요한 부분이 제거된 DNA를 포함한다. 사용 목적에 따라, 이는 단지 성숙 단백질만을 암호화하는 DNA일 수 있다. 암호화 영역에서 아미노산을 암호화하는 하나 이상의 코돈이 동일한 아미노산을 암호화하는 등가의 코돈으로 치환된 DNA는 본 발명의 DNA에 포함된다. 또한, 본 발명의 DNA는 글루타미나제의 활성이 저하되지 않는 한 하나 또는 복수개의 아미노산의 하나 또는 복수개의 위치에서 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 글루타미나제를 암호화하는 DNA일 수 있다. 표현 "복수"가 의미하는 아미노산의 수는 글루타미나제 단백질의 3차원 구조내의 아미노산 잔기의 위치 또는 종류에 따라 달라질 수 있으나, 이는 통상적으로 2 내지 300개, 바람직하게는 2 내지 170개, 보다 바람직하게는 2 내지 50개, 가장 바람직하게는 2 내지 10개일 수 있다.

이후 기술하는 바와 같이, 서열 2에 제시된 아스퍼질러스 오리재의 글루타미나제의 아미노산 서열 및 서열 22에 제시된 아스퍼질러스 니둘란스의 글루타미나제의 아미노산 서열은 약 73%의 상동성을 가지며, 약 170개의 아미노산 잔기가 성숙 단백질 부분에 대해 상이하다.

상기한 DNA와 같은 글루타미나제와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는 글루타미나제 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 변경시킴으로써, 예를 들어, 특정 부위에서 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 첨가되도록 부위-특이적 돌연변이유발시킴으로써 수득할 수 있다. 상기한 바와 같이 변경된 DNA는 통상적으로 공지된 돌연변이유발 처리에 의해 수득할 수도 있다. 이러한 돌연변이유발 처리로서는, 글루타미나제를 암호화하는 DNA를 하이드록실아민 등으로 시험관내에서 처리함을 포함하는 방법 및 에스케리키아 속에 속하는 세균을 자외선 조사하거나, 이를 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 및 아질산과 같은 돌연변이유발을 위해 통상적으로 사용되는 돌연변이유발제로 처리함을 포함하는 방법을 언급할 수 있다.

상기한 치환, 결실, 삽입, 부가 및 역위는 균주간의 차이로 인한 것 및 천연 발생 돌연변이를 포함한다.

글루타미나제와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는 상기한 바와 같은 돌연변이를 갖는 DNA를 적합한 균체내에서 발현시키고, 발현 생성물을 글루타미나제 활성에 대해 조사함으로써 선택할 수 있다. 또한, 글루타미나제와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는 서열 목록 중 서열 1의 뉴클레오타이드 서열에서 뉴클레오타이드 번호 1174 내지 1370, 1446 내지 1741, 1800 내지 2242, 2297 내지 2880, 2932 내지 3134, 3181 내지 3324, 3380 내지 3515 및 3562 내지 3628의 뉴클레오타이드 서열 중 하나를 갖는 DNA, 또는 서열 17의 뉴클레오타이드 서열 중 뉴클레오타이드 번호 1 내지 2070의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA와 엄격한 조건하에 하이브리드화한 다음, 글루타미나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 분리함으로써 수득할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "엄격한 조건"은 소위 특이적 하이브리드가 형성될 수는 있으나, 비특이적인 하이브리드는 형성되지 않는 조건을 의미한다. 이 조건을 수치를 사용하여 명확하게 표현하기는 어려우나, 이러한 조건의 예는, 예를 들어, 상동성이 높은 DNA, 예를 들어, 상동성이 65% 이상인 DNA가 서로 하이브리드화할 수 있으나, 이보다 상동성이 낮은 DNA는 서로 하이브리드화할 수 없는 조건, 및 하이브리드화를 통상의 서던 하이브리드화의 세척 단계의 염 농도에 상응하는 염 농도, 즉, 1xSSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 0.1xSSC, 0.1% SDS에서 수행되는 조건을 포함한다. 상기한 조건하에서 하이브리드화할 수 있는 유전자는 또한 발생되어 암호화 유전자를 방해하는 종결 코돈을 갖는 유전자, 활성 중심에서의 돌연변이로 인하여 활성을 상실한 유전자 등을 포함하나, 이들은 상기 유전자를 시판중인 활성 발현 벡터에 연결시켜, 이후 기술하는 방법에 의해 글루타미나제 활성을 측정함으로써 용이하게 제거할 수 있다.

또한, 본 발명의 DNA는 아스퍼질러스 속에 속하는 또 다른 종의 미생물, 예를 들어, 아스퍼질러스 니둘란스의 염색체 DNA 또는 cDNA로부터 수득할 수 있다. 구체적으로는, 이는 아스퍼질러스 니둘란스, 예를 들어, 아스퍼질러스 니둘란스 A26 균주의 염색체 DNA 라이브러리로부터 하이브리드화시킴으로써 수득할 수 있다. 하이브리드화용 프로브는 상기한 아스퍼질러스 오리재의 글루타미나제 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 기본으로 하여 PCR용 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 합성하고, 아스퍼질러스 니둘란스, 예를 들어, 아스퍼질러스 니둘란스 A26 균주의 균체로부터 제조된 게놈 DNA를 주형으로서 사용하여 PCR을 수행함으로써 제조할 수 있다. PCR용 프라이머로서는, 서열 19 및 서열 20의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 언급할 수 있다.

상기한 방식으로 이후 기술하는 실시예에서 수득된 아스퍼질러스 니둘란스 A26의 글루타미나제 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은 서열 21에 제시한다. 또한, 아미노산 서열은 또한 서열 22에 제시한다. 아스퍼질러스 니둘란스의 글루타미나제 유전자 및 아스퍼질러스 오리재의 글루타미나제 유전자간의 상동성은 유전자 전체에 대해서는 약 58%이고, 암호화 영역에 대해서는 약 68%이고, 암호화된 아미노산 서열에 대해서는 약 73%이다.

또한, 글루타미나제 cDNA는, 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열 23 및 서열 24를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 PCR에 의해 아스퍼질러스 니둘란스의 폴리(A) RNA로부터 제조된 cDNA로부터 수득할 수 있다. 아스퍼질러스 니둘란스 A26으로부터 수득된 cDNA의 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 서열 목록의 서열 25에 제시한다. 상기 뉴클레오타이드 서열로부터 추정된 아미노산 서열은 서열 25 및 서열 26에 제시한다.

본 발명의 DNA는 하나 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위되고, 글루타민의 글루탐산 및 암모니아로의 가수분해를 촉매시키는 활성을 가지며, 서열 목록에서 서열 22의 아미노산 번호 1 내지 669의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 포함한다. 또한, 본 발명의 DNA는 서열 목록에서 서열 21의 뉴클레오타이드 서열 중 뉴클레오타이드 번호 1807 내지 2000, 2061 내지 2353, 2412 내지 2854, 2915 내지 3498, 3554 내지 3756, 3806 내지 3949, 3996 내지 4131 및 4180 내지 4246의 뉴클레오타이드 서열을 순서대로 함유하는 DNA, 및 상기한 DNA와 엄격한 조건하에 하이브리드화하고, 글루타민의 글루탐산 및 암모니아로의 가수분해를 촉매시키는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 암호화하는 DNA를 포함한다.

본 발명의 DNA는 이후 기술하는 실시예에서 상기한 바와 같이 수득된다. 그러나, 이의 뉴클레오타이드 서열은 밝혀졌기 때문에, 이는 아스퍼질러스 오리재 RIB40(ATCC 42149), 아스퍼질러스 니둘란스 A26, 또는 이외의 아스퍼질러스 오리재 및 아스퍼질러스 니둘란스 균주의 게놈 DNA로부터 PCR, 하이브리드화 등에 의해 용이하게 클로닝시킬 수 있다.

＜3＞ 본 발명의 DNA의 이용

본 발명의 DNA는 국균과 같은 사상균의 육종 또는 글루타미나제의 제조를 위해 이용할 수 있다. 예를 들어, 글루타미나제 활성은 본 발명의 DNA를, 바람직하게는 이의 다중 복제물로서 사상균내에 균체내 도입함으로써 증강시킬 수 있다. 글루타미나제는 본 발명의 DNA를 적합한 숙주내에서 발현시킴으로써 제조할 수 있다. 국균과 같은 사상균 및 상기한 바와 같이 수득된 글루타미나제는 간장, 미소, 및 기타 단백질 가수분해물을 함유하는 조미료의 제조에 이용할 수 있다.

본 발명의 DNA를 도입하는 사상균으로서는, 아스퍼질러스 오리재, 아스퍼질러스 니거(Aspergillus Niger) 및 아스퍼질러스 니둘란스와 같은 아스퍼질러스 속에 속하는 사상균, 네우로스포라 크라싸(Neurospora crassa)와 같은 네우로스포라 속에 속하는 사상균, 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei)와 같은 리조무코르 속에 속하는 사상균 등을 언급할 수 있다.

본 발명의 DNA를 상술한 것와 같은 사상균으로 도입하기 위한 벡터는 특별히 제한되지 않으며, 사상균 등을 육종하기 위해 통상적으로 사용되는 것들을 사용할 수 있다. 아스퍼질러스 오리재에 대해 사용되는 것들로서는, 예를 들어, pUNG[참고문헌: Lee, B.R. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 44, 425-431 (1995)], pMARG[참고문헌: Tsuchiya, K. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 40, 327-332 (1993)], pSUC[참고문헌: Gomi et al., Agric. Biol. Chem. 51, 2549-2555 (1987)] 등을 언급할 수 있다. pUNG는 아스퍼질러스 오리재 niaD300[참고문헌: Minetoki, T. et al., Curr. Genet. 30, 432-438 (1996)]의 niaD^-(니트레이트 동화능 결손)를 상보하는 마커를 함유하고, pMARG는 아스퍼질러스 오리재 M2-3[참고문헌: Gomi et al., Agric. Biol. Chem. 51(9), 2549-2555 (1987)]의 argB^-(아르기진 영양요구체)를 상보하는 마커를 함유하고, pUSC는 아스퍼질러스 오리재 NS4[참고문헌: Yamada, O. et al., Biosci. Biotech. Biochem., 61(8), 1367-1369 (1997)]의 sC^-(ATP 설푸릴라제 결손)를 상보하는 마커를 함유한다.

상기 벡터 가운데, pUNG 및 pMARG는 글루코아밀라제 유전자(glaA)의 프로모터 및 α-아밀라제 유전자(amyB의 종결인자)의 프로모터를 함유하고, 프로모터의 하류에 본 발명의 DNA(서열 1에서 뉴클레오타이드 번호 1136 내지 4777 또는 1177 내지 4777의 영역)를 프레임이 일치하는 방식으로 삽입함으로써, 프로모터의 제어하에 발현시켜, 글루타미나제를 생산할 수 있다. pUSC를 사용할 경우, pUSC는 프로모터를 함유하지 않기 때문에, 본 발명의 유전자의 발현은 본 발명의 DNA와 함께 삽입된 pUC19와 같은 플라스미드 및 pUSC의 공형질전환을 통해 숙주 사상균내로 도입시킴으로써 획득할 수 있다. 서열 1의 뉴클레오타이드 서열은 이후 기술하는 바와 같은 프로모터를 함유할 가능성이 있기 때문에, 글루타미나제는 본 발명의 DNA가 프로모터와 함께 상술된 벡터내로 삽입된 경우에도 발현될 수 있는 것으로 간주된다.

또한, 아래에 언급한 문헌에 기술된 벡터, 프로모터 및 마커를 숙주 사상균에 따라 사용할 수도 있다. 표 2에는, 프로모터를 상응하는 유전자에 의해 암호화된 효소명에 의해 표시한다.

문헌	프로모터	마커	숙주 사상균
일본 국제 특허 공보(KOHYO)제(평)4-503450호(1992)	중성 α-아밀라제	argBargBtrpCamdSpyrrDHFR	아스퍼질러스 니거아스퍼질러스 니거아스퍼질러스 니둘란스아스퍼질러스 니둘란스아스퍼질러스 니둘란스네우로스포라 크라싸네우로스포라 크라싸
일본 특허 미심사 공보(KOKAI)제(소)62-272988호(1987)	Taka-아밀라제아스파르트산 프로테아제리파제글루코아밀라제, 리파제아밀라제, 글루코아밀라제,셀룰라제, 프로테아제,당분해 경로 효소		아스퍼질러스 오리재리조무코르 미에헤이리조무코르 미에헤이아스퍼질러스 니거
일본 특허 미심사 공보제(평)7-51067호(1995)	Taka-아밀라제		아스퍼질러스 속
일본 특허 미심사 공보제(평)7-115976호(1995)	신규한 프로모터 서열 언급		아스퍼질러스 오리재
일본 특허 미심사 공보제(평)7-59571호(1995)	신규한 프로모터 서열 언급		아스퍼질러스 니거
일본 농예 화학회지Vol. 71, No. 10 (1997) 1018-1023	α-아밀라제(amyB)글루코아밀라제(glaA)글루코사이다제(agdA)		아스퍼질러스 오리재아스퍼질러스 오리재아스퍼질러스 오리재

사상균의 형질전환은 상술한 문헌에서 언급된 방법 및 기타 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 아스퍼질러스 오리재는 하기한 바와 같이 형질전환시킬 수 있다.

균체(분생자)를 DPY 배양 배지(2% 글루코즈, 1% 펩톤, 0.5% 효모 추출물, pH 5.0)에 접종시켜, 30℃에서 약 24시간 동안 격렬하게 교반시키면서 배양한다. 배양 배지를 Miracloth(CALBIO CHEM), 멸균 거즈 등을 통해 여과시켜, 균체를 회수한 다음, 균체를 멸균수로 세척하고, 수분을 균체로부터 충분히 제거한다. 균체를 시험관에 이송시킨 다음, 효소액(1% 야탈라제(Takara Shuzo), 또는 0.5% 노보자임(Novo Nordisk) 및 0.5% 셀룰라제(예: Cellulase Onizuka, Yakult), 0.6M (NH₄)₂SO₄, 50mM 말산, pH 5.5)을 첨가하여, 30℃에서 약 3시간 동안 완만하게 진탕시킨다. 프로토플라스트화 정도를 현미경으로 관찰한 다음, 양호한 프로토플라스트화가 나타날 경우 이들은 얼음 중에 보관한다.

상기한 효소 반응 혼합물을 Myracloth를 통해 여과시켜 균체 잔사를 제거한 다음, 프로토플라스트를 함유하는 여액에 등량의 완충액 A(1.2M 솔비톨, 50mM CaCl₂, 35mM NaCl, 10mM Tris-HCl, pH 7.5)를 첨가하여 얼음 중에 위치시킨다. 혼합물을 0℃ 및 2,500rpm에서 8분 동안 원심분리한 다음, 완만하게 정지시킨 후, 펠릿을 완충액 A로 세척하고, 완충액 A의 최적 용적에 현탁시킨다.

20㎕(5 내지 10㎍) 이하의 DNA 용액을 프로토플라스트 현탁액 100 내지 200㎕에 가한 다음, 얼음 중에 20 내지 30분 동안 위치시킨다. 당해 혼합물에 완충액 B(폴리에틸렌 글리콜 6000, 50mM CaCl₂, 10mM Tris-HCl, pH 7.5) 250㎕를 가하여 완만하게 혼합한 후, 완충액 B 850㎕를 추가로 가하여 완만하게 혼합한 다음, 혼합물을 실온에서 20분 동안 정치시킨다. 이후, 완충액 A 10ml를 혼합물에 가하여, 시험관을 반전시켜 0℃ 및 2,000rpm에서 8분 동안 원심분리한다. 후속적으로, 펠릿을 완충액 A 500㎕에 현탁시킨다.

상기 현탁액의 적당량을 상면 아가 5ml에 가하여, 이를 미리 분주하여 가온한 다음, 하층 배양 배지(마커의 종류에 따라 제조된 1.2M 솔비톨을 함유하는 선택 배지) 상에 도포하여 30℃에서 배양한다. 생육한 균체를 선택 배지 상에 옮겨, 형질전환체임을 확인한다. 재조합 DNA를 상기 균체로부터 제조한다. 제한 효소 분석, 서던 분석 등에 의해 본 발명의 DNA가 재조합 DNA에 도입되었음을 확인하는 것이 바람직하다.

상기한 바와 같이 수득된 형질전환체를 사용되는 프로모터에 적합한 조건하에 배양할 경우, 글루타미나제 유전자는 발현되어, 글루타미나제가 생성된다.

본 발명의 유전자와 함께 도입되어 글루타미나제 활성이 증강된 형질전환체의 배양물을 단백질과 반응시킴으로써, 글루탐산나트륨의 함유량이 보다 높고 우마미가 보다 강한 단백질 가수분해물을 수득할 수 있다. 배양물과 반응시킬 단백질의 예는, 예를 들어, 대두, 소맥, 소맥 글루텐 등의 단백질을 포함하고, 이는 탈지 대두의 단백질, 또는 식품 가공, 예를 들어, 팽창 및 가용화 처리된 각종 단백질, 또는 상기한 각종 물질로부터 분리된 단백질일 수 있다.

형질전환체의 배양물과 단백질과의 반응 조건으로서, 예를 들어, 농도가 0.2 내지 50%인 출발 물질을 단백질분해 효소의 존재하에 형질전환체의 배양물과 혼합하여, 5 내지 60℃에서 4시간 내지 10일 동안 반응시킬 수 있다.

반응 완료 후, 불용성 미반응 단백질, 균체 등을 원심분리 또는 여과와 같은 통상의 분리 방법에 의해 제거할 수 있다. 필요한 경우, 반응 혼합물을 진공 농축, 역삼투압 등에 의해 농축시킬 수 있으며, 농축물은 동결 건조, 감압 건조 및 분무 건조와 같은 건조 공정에 의해 분말 또는 과립으로 제조할 수 있다. 이와 같이, 글루탐산나트륨 함유량이 높고 우마미가 보다 강한 단백질 가수분해물은 글루탐산나트륨을 외부로부터 첨가하지 않고 수득할 수 있다.

본 발명은 추가로 하기 실시예를 참고로 하여 더욱 상세하게 설명될 것이다.

실시예 1: 아스퍼질러스 오리재로부터 글루타미나제의 정제

아스퍼질러스 오리재 RIB40(ATCC 42149) 균주를 소맥피와 함께 배양한 다음, 글루타미나제를 배양물로부터 정제한다. 정제 단계에서, 글루타미나제 활성은 하트만 방법의 개질된 변법[참고문헌: Hartman, S.C., J. Biol. Chem., 243, 853-863 (1968), 하이드록사메이트 방법]에 의해 측정할 수 있다. 즉, 200mM Tris-HCl(pH 7.0), 100mM 하이드록실아민 하이드로클로라이드, 50mM L-글루타민 및 10mM 환원된 글루타치온을 함유하는 용액 125㎕에 효소 용액 25㎕를 가한 다음, 37℃에서 1시간 동안 정치시킨다. 이후, 혼합물에 등량의 3N 염산, 12% 트리클로로아세트산 용액 및 5% FeCl₃·6H₂O 용액(0.1N HCl에 용해)을 가한 다음, 혼합물의 525mm에서의 흡광도를 측정한다. 활성에 대해서는, L-글루탐산 γ-모노하이드록사메이트 1μmol을 형성하는 효소 활성을 1단위로 정의한다.

(1) 배양

소맥피(Nisshin Flour Milling, 600g), 인산칼륨(12g) 및 증류수(600ml)를 잘 혼합하여, 직경이 15cm인 딥 페트리 디쉬 6세트에 각각 160g의 양으로 유입한 다음, 120℃에서 20분 동안 오토클레이빙시켜 배양 배지를 제조한다.

포자를 충분히 형성시킨 아스퍼질러스 오리재 RIB40(ATCC 42149)의 사면 배양물에 멸균수(5ml)를 부은 다음, 교반시켜 포자 현탁액을 제조한다. 현탁액을 상기 배양 배지에 접종시킨다. 포자를 접종시킨 배양 배지를 잘 혼합하여, 30℃에서 14일 동안 배양한다. 배양 배지를 배양 개시로부터 24시간째에 교반시켜 준다.

(2) 효소의 추출

상기한 바와 같이 제조된 소맥피 누룩을 3배 용적의 인산칼륨 완충액(pH 7.4), 1mM PMSF(페닐메탄설포닐 플루오라이드), 0.1mM EPNP(1,2-에톡시-3-(p-니트로페녹시)프로판), 1mM EDTA에 침지시켜, 4℃에서 16시간 동안 정치시킨 다음, 거즈로 여과시키고 원심분리(4℃, 7,500rpm에서 30분 동안)하여 상청액을 수득하고, 이를 조 효소 추출물로서 사용한다.

(3) 황산암모늄 침전에 의한 분획화

조 효소 추출물을 -80℃에서 동결시킨 후, 4℃에서 서서히 융해시킨 다음, 불용성 분획을 여과 제거한다. 생성물에 황산암모늄(1010g/2,880ml)을 가하여, 55% 포화 황산암모늄 용액을 수득한다. 용액을 4℃에서 4시간 동안 교반시킨 다음, 원심분리(4℃, 7,500rpm에서 30분 동안)하여 침전물을 제거한다. 상청액에 황산 암모늄(703g/3,180ml)을 가하여 85% 포화 황산암모늄 용액을 수득한다. 용액을 4℃에서 16시간 동안 교반시켜, 생성된 침전물을 원심분리(4℃, 7,500rpm에서 30분 동안)에 의해 회수한 다음, 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0) 100ml에 용해시킨다. 이를 공극 직경이 0.45㎛인 필터를 통해 여과시킨다.

(4) 탈염

상기 (3)에서 수득된 여액 100ml 중 5ml를 20mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0), 100mM NaCl로 예비 평형화시킨 탈염화용 칼럼에 로딩시킨 다음, 동일한 완충액으로 용출시킨다. 탈염 조작은 여액 100ml로부터 분액화된 각각의 5ml에 대해 20회를 수행한다. 활성 분획의 양이 300ml가 되도록 합한 다음, 한외여과에 의해 50ml로 농축 및 탈염시킨다.

(5) 음이온 교환 크로마토그래피

수득된 20mM 인산칼륨 완충액(pH 7.4)로 예비 평형화시킨 DETA-TOYOPEARL 650M(Tosoh) 250ml로 충전시킨 칼럼 상에 상기에서 수득한 샘플을 흡착시킨 다음, 칼럼 용적의 4배량의 동일한 완충액으로 세척한다. 세척 후, 완충액의 NaCl 농도를 0M로부터 0.5M로 칼럼 용적의 8배량에서 증가시키는 선형 구배로 칼럼을 용출시킨다. 용출액 중에서 회수된 활성 분획(340ml)을 한외 여과에 의해 12ml로 농축 및 탈염시킨다.

(6) 소수성 크로마토그래피

이후, HiLoad 26/10 Phenyl Sepharose High Performance(Pharmacia)를 사용하는 FPLC 시스템(Pharmacia) 상에서 흡착 크로마토그래피에 의한 분획을 수행한다. 이러한 크로마토그래피 조작은, DEAE-TOYOPEARL 활성 분획의 단백질을 2회로 나누어 수행한다. 1N 황산암모늄을 첨가한 DEAE-TOYOPEARL 활성 분획 6ml를 50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.4) 및 1M 황산암모늄으로 예비 평형화시킨 칼럼 상에 흡착시킨 다음, 칼럼을 칼럼 용적의 4배량의 동일한 완충액으로 세척한다. 세척 후, 완충액의 NaCl 농도를 1M로부터 0M로 칼럼 용적의 16배량에서 감소시키는 선형 구배로 칼럼을 용출시킨다. 용출액 중에서 회수된 활성 분획 300ml를 한외 여과 및 원심분리(Centriprep 10, AMICON)에 의해 10ml로 농축 및 탈염시킨다.

(7) 겔 여과 크로마토그래피

상기한 샘플을 HiLoad 26/60 Superdex 200pg(Pharmacia)을 사용하는 FPLC 시스템 상에서 겔 여과 크로마토그래피에 의한 분획을 수행한다. 이러한 크로마토그래피 조작은, DEAE-TOYOPEARL 활성 분획의 단백질을 5회로 나누어 수행한다. 상기에서 수득한 활성 분획 2ml를 40mM 인산나트륨 완충액(pH 7.4) 및 150ml NaCl로 예비 평형화시킨 칼럼 상에 로딩시킨 다음, 칼럼을 동일한 완충액으로 용출시켜 활성 분획을 회수한다. 이러한 겔 여과 크로마토그래피는 2회 반복한다.

(8) 정제의 결과

상기한 정제 공정에 의해, 정제된 글루타미나제 500㎍을 수득한다. 정제 효소의 분자량을 MALDI-TOFMS(Matrix assisted laser desorption inoization-time of filght mass spectrometer)에 의해 측정한 결과, 이는 8,290으로 밝혀졌다. 다양한 정제 단계에서 총단백질량, 총활성, 비활성, 수율 및 순도(조 효소 추출물의 순도를 1로 한다)를 표 3에 요약한다.

정제 단계	글루타미나제활성(단위)	단백질량(mg)	특이적 활성(단위/mg)	수율(%)	순도(배율)
조 추출물	44.8	2528	0.018	100	1
동결-융해	51	2230	0.023	114	1.28
황산암모늄 침전	16.2	665	0.024	36	1.33
DEAE-TOYOPEARL	7.2	186	0.039	16	2.2
Phenyl Sepharose	4.3	78.7	0.055	9.6	3.1
1차 겔 여과	0.8	1.1	0.73	1.6	39.4
2차 겔 여과	0.4	0.5	0.88	1	48.9

(9) 글루타미나제의 부분 아미노산 서열의 결정

500mM Tris 염산(pH 8.1), 6M 구아니딘 및 2mM EDTA 중의 정제된 글루타미나제(97㎍)에 DTT(263㎍)를 가하고, 질소로 치환시킨 다음, 50℃에서 3시간 동안 정치시킨다. 반응 혼합물을 빛으로부터 보호하면서 환원 반응을 실온에서 밤새 수행한다. 혼합물에 요오도아세트산(2900㎍)을 추가로 가하여, 실온에서 30분 동안 반응시킨 다음, Sephadex G-25(Pharmacia) 칼럼 상에서 탈염시킨다. 탈염된 샘플을 원심 농축기 VC-960(TAITEC) 상에서 농축시킨 다음, 50mM 탄산수소암모늄(pH 8.5) 및 라이실 엔도펩티다제(SIGMA) 1㎍을 가하여 37℃에서 13시간 동안 제한 분해를 수행한다. 반응 후, 생성된 펩타이드를 역상 HPLC(Vydac Capillary C₁₈, Vydac)에 의해 분리한 다음, 각각을 펩타이드 서열분석기 PPSQ-10(Shimazu Corporation) 상에서 서열분석하여, 글루타미나제의 내부 부분 아미노산 서열을 결정한다. 별개로, 라이실 엔도펩티다제 처리를 하지 않은 펩타이드를 또한 펩타이드 서열분석기 상에서 서열분석하여, 이의 N-말단 아미노산 서열을 결정한다. 결정된 아미노산 서열은 아래에 기재한다.

N-말단: ASTFSPARPPALPLAVK(서열 3)

52번: Y(G/P)(N/V)(T/P)YAM(R/S)DI(서열 4)

55번: VQY(T/G)EYDXY(서열 5)

59번: DNDYLSQHYPILNK(서열 6)

67번: WTAYLVEDTIYPANQ(서열 7)

62.5번: VLLQSAIEGH(서열 8)

63번: GIIGIQAMAV(서열 9)

62번: XILKFXYXXQ(서열 10)

상기한 서열에서, "X"는 불명확한 아미노산을 나타내고, "/"는 상응하는 아미노산이 이의 앞 또는 뒤에 있는 것임을 의미한다.

실시예 2: 아스퍼질러스 오리재의 글루타미나제 유전자의 클로닝

글루타미나제 유전자를 아스퍼질러스 오리재의 게놈 라이브러리로부터 플라크 하이드리드화에 의해 분리한다.

(1) PCR에 의한 프로브의 제조

아스퍼질러스 오리재 RIB40의 균체로부터, 게놈 DNA를 고미 방법[참고문헌: Gomi et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 35, 225 (1989)]에 따라 다음과 같이 제조할 수 있다.

2개의 사면 배양 튜브로부터의 아스퍼질러스 오리재 RIB40의 포자를 0.85% NaCl에 현탁시킨 다음, YPD 배양 배지(2% 글루코즈, 1% 펩톤, 0.5% 효모 추출물, pH 5.0) 1L에 접종시켜, 30℃에서 24시간 동안 배양한다. 균체를 거즈를 통한 여과에 의해 회수한 다음, 즉시 액체 질소를 사용하여 동결시켜, 액체 질소를 사용하여 냉각시키면서, 균질화기(18000rpm, 15분)내에서 또는 유발내에서 분쇄한다. 생성물에 50mM EDTA, 0.5% SDS, pH 8.0 및 프로테이나제 K 100ml를 최종 농도 0.1mg/ml로 첨가한 다음, 50℃에서 4시간 동안 배양한다. 당해 용액을 페놀, 페놀/클로로포름 및 클로로포름으로 각각 2회 처리한다. 상기 유기 용매로의 처리는 용액 및 유기 용매를 완만하게 혼합하여, 수성 층을 분리함으로써 수행한다.

상기한 바와 같이 단백질이 제거된 용액에 1/10 용적으로 3M 아세트산나트륨(pH 5.2) 및 2.5배 용적의 에탄올을 가하여, -20℃에서 밤새 정치시킨 다음, 0℃ 및 10,000rpm에서 20분 동안 원심분리한다. 생성된 침전물을 세정한 다음, TE 완충액에 조심스럽게 용해시킨다. 당해 용액에 RNase A(10㎍/ml)를 가한 다음, 37℃에서 30분 동안 배양하여 RNA를 분해한다. 용액을 1/2 용적의 페놀과 혼합하여 37℃에서 10분 동안 정치시킨 다음, 1/2 용적의 클로로포름과 혼합하여 0℃ 및 10,000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 수성 층을 분리한다. 당해 수성 층을 디에틸 에테르와 혼합하여, 0℃ 및 10,000rpm에서 원심분리한 다음, 디에틸 에테르 층을 제거하여, 용액에 잔류된 페놀을 제거한다. 생성된 수성 층에 3M 아세트산나트륨(500㎕) 및 에탄올(5ml)을 가하여, -80℃에서 1시간 동안 정치시킨 다음, 10,000rpm에서 20분 동안 원심분리하여, 침전물을 수득한다. 상기 침전물을 세정하여, TE 완충액(5ml)에 용해시킨 다음, 소량의 클로로포름을 가하여 냉장하에 보관한다.

상기한 바와 같이 수득한 게놈 DNA를 주형으로서 사용하고, 부분 아미노산 서열(52번 및 67번)을 기본으로 하여 합성되고 하기 서열을 갖는 올리고머뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하여 PCR을 수행한 후, 글루타미나제 유전자의 부분 서열을 수득하여, 이를 하이브리드화용 프로브로서 사용한다. 이들 프라이머의 서열은 아스퍼질러스 니둘란스의 코돈 빈도[참고문헌: Andrew, T. Lloyd et al., Mol. Gen. Genet., 230, 288-294 (1991)]를 조사함으로써 디자인한다.

(5' 말단 프라이머)

TAC CCC AAC ACC TAT GCT ATG CGC GAT ATC(서열 11)

(3' 말단 프라이머)

TTG GTT CGC CGG ATA AAT AGT ATC TTC GAC CAA GTA(서열 12)

PCR 반응은 95℃에서 9분간의 열-변성 후, 94℃에서 1분간, 53℃에서 1분간, 72℃에서 1.5분간의 사이클을 35사이클 반복함으로써 수행한다. 이로써 약 230b 글루타미나제 유전자 단편을 제공한다.

(2) 아스퍼질러스 오리재 게놈 라이브러리의 스크리닝

아스퍼질러스 오리재 게놈 라이브러리의 스크리닝은 상기한 PCR 반응에서 수득된 유전자 단편을 프로브로서 사용하여 수행한다.

아스퍼질러스 오리재 게놈 DNA를 BamHI로 약 10kb 단편으로 절단하고, 이들을 λ 파아지 벡터(λ DASH II, STRATAGENE)의 BamHI 부위에 삽입한다. 수득된 재조합 DNA를 시험관내에서 패키징시켜 λ 파아지 라이브러리를 작제한다.

상기한 λ 파아지 라이브러리를 사용하여, 약 5,000개 플라크를 직경이 15cm인 플레이트마다 형성시킨다. 플라크가 형성된 10개의 플레이트를 제조하여, 각각의 플레이트를 2편의 나일론 막(Hybond-N+, Amersham)에 블롯팅시킨다. 즉, 나일론 막을 제1편에 대해 플레이트 상에 3분 동안 두거나, 제2편에 대해 5분 동안 둔 다음, 변성 용액(1.5M NaCl, 0.5M NaOH)으로 침지된 여과지 시이트 상에 7분 동안 둔다. 이후, 막을 중화 용액(1.5M NaCl, 0.5M Tris-HCl(pH 7.4))으로 침지된 여과지 시이트 상에 3분 동안 둔 다음, 중화를 위해 동일한 완충액으로 침지된 다른 여과지 시이트 상에 둔 후, 공기 건조시킨다. 건조 후, 막을 0.4M NaOH로 침지된 여과지 시이트 상에 20분 동안 둔 다음, 5xSSC내에서 1분 동안 진탕시켜 공기 건조시킨다.

상기한 나일론 막을 각각 예비-하이브리드화 완충액(50% 포름아미드, 5xDenhardt 용액, 5xSSPE, 0.5% SDS)에 침지시킨 다음, 42℃에서 2시간 동안 정치시킨다. PCR에서 수득된 프로브를 랜덤 라벨 키트(Random Label Kit; 제조원: BOEHRINGER MANNHEIM)를 사용하여 [³²P-γ]-CTP로 라벨링시킨다. 라벨링된 프로브를 100℃에서 3분 동안 정치시킨 후, DNA 2본쇄가 변성되도록 즉시 얼음 중에 옮기고, 예비-하이브리드화 완충액에 가한 다음, 42℃에서 밤새 하이브리드화시킨다.

상기한 나일론 막을 2xSSC, 0.1% SDS로 65℃에서 15분 동안 2회 세척하고, 1xSSC, 0.1% SDS로 65℃에서 15분 동안 2회 세척하고, 0.1xSSC, 0.1% SDS로 65℃에서 15분 동안 2회 세척한다. 세척 후, 막을 영상화 플레이트(FUJIX)와 접촉시켜, 영상 분석기 BAS2000(FUJIX)으로 검출한다. 그 결과, 21개의 포지티브 시그널이 약 50,000개 플라크로부터 검출되었다.

21개의 포지티브 플라크를 회수하여, 제2 스크리닝을 수행한다. 제2 스크리닝에서, 약 50개의 플라크를 직경이 10cm인 플레이트 상에 형성시키고, 제1 스크리닝에서와 동일한 방식으로 하이브리드화를 수행한다. 4종류의 포지티브 플라크를 제2 스크리닝에서 검출한다. 제3 스크리닝을 제2 스크리닝에서와 동일한 방식으로 수행하여, 4종류의 포지티브 클론을 최종적으로 수득한다.

상기 4종류의 클론을 뉴클레오타이드 서열분석한 결과, 모든 클론이 동일한 서열을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 상기 클론 중 하나로부터 유래된 XhoI 단편의 뉴클레오타이드 서열 및 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 서열 1에 제시한다. 아미노산 서열 단독은 서열 2에 제시한다.

상기한 XhoI 단편을 플라스미드 pBluescript로 삽입함으로써 수득된 플라스미드로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 DH5α 균주에 공인 번호 제AJ13495호를 부여받았고, 이는 기탁기관[National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry(우편번호: 305-8566, 일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1-3)]에 1998년 9월 9일자로 기탁되었고, 수탁번호 제FERM BP-6490호를 부여받았다.

실시예 3: 아스퍼질러스 오리재의 글루타미나제 cDNA의 클로닝

높은 글루타미나제 생산능을 갖는 아스퍼질러스 오리재 균주를 DPY 배양 배지(50ml)에서 30℃에서 48시간 동안 배양한다. 균체를 거즈를 통한 여과에 의해 회수하여 균체 1g을 수득한다. 균체를 즉시 액체 질소로 동결시켜, 유발내에서 분쇄한 다음, 이로부터 전체 RNA 0.2mg을 구아니딘-세슘 클로라이드 초원심분리 방법[참고문헌: Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press (1989)]에 따라 수득한다. 전체 RNA로부터, mRNA를 mRNA 정제 키트(Pharmacia)를 사용하여 정제한 다음, cDNA를 cDNA PCR 라이브러리 키트(Takara Shuzo)를 사용하여 합성한다. 이들 키트를 사용함으로써, CA 카세트 어댑터 서열을 수득된 cDNA의 5' 말단에 연결시키고, 올리고 dT-RA 서열을 3' 말단에 연결시킨다.

상기한 바와 같이 수득된 cDNA를 주형으로서 사용하고 글루타미나제 게놈의 뉴클레오타이드 서열을 기본으로 하여 합성되고 하기 서열을 갖는 뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용함으로써, 글루타미나제 cDNA를 PCR 및 3'-RACE에 의해 증폭시킨다.

(5' 말단 프라이머)

GAT CAT GAT GCA TTT CCT CTC GTT CTG TC(서열 13)

(3' 말단 프라이머)

GCA AAG TCA TCC GTA GAG ATC TGG TTC G(서열 14)

(3'-RACE용 5' 말단 프라이머)

GGC GAA CCA GAT CTC TAC GGA TGA CTT TGC(서열 15)

(3'-RACE용 3' 말단 프라이머)

CTG ATC TAG ACC TGC AGG CTC(서열 16)

PCR 반응은 95℃에서 9분간의 열-변성 후, 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간, 72℃에서 1분간의 사이클을 30사이클 반복함으로써 수행한다. 서열 13 및 서열 14의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 약 1500bp DNA 단편을 제공하고, 서열 15 및 서열 16의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 약 780bp DNA 단편을 제공한다.

상기 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열은 서열 17에 제시한다. 상기 뉴클레오타이드 서열로부터 추정된 아미노산 서열은 서열 17 및 서열 18에 제시한다.

실시예 4: 글루타미나제 cDNA의 에스케리키아 콜라이내에서의 발현

Lac 프로모터, T7 프로모터 또는 Trp 프로모터를 글루타미나제 cDNA의 상류에 연결시켜, pBluescript(Stratagene)의 다중 클로닝 부위에 삽입한다. 에스케리키아 콜라이 DH5α를 수득된 재조합 플라스미드와 통상의 방식으로 형질전환시킨 다음, 수득된 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml를 함유하는 아가 배지 상에서 선택한다. 선택된 형질전환체를 LB 배양 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl)에서 37℃에서 배양한다. 상기 배양 배지(1ml)를 LB 배양 배지(50ml)로 옮긴 다음, 37℃에서 배양한다. 이의 OD가 3시간 후에 0.6에 이를 경우, IPTG(이소프로필-β-D-티오갈라토피라노사이드)를 최종 농도 1mM로 가하여 lac 프로모터를 유도한 다음, 37℃에서의 배양을 4시간 동안 추가로 계속한다. 배양 후, 균체를 회수한 다음, 완충액에 현탁시키고, 초음파처리하여 단백질 봉입체를 수득한다. 이들 봉입체를 변성 용액(8M 우레아, 10mM DTT, 50mM NaCl, 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 5mM EDTA)에 용해시키고, 불용성 분획을 원심분리에 의해 제거한다. 단백질의 재중첩을 가용화된 용액 중의 우레아 농도를 서서히 저하시킴으로써 달성할 수 있다.

상기한 글루타미나제 cDNA 단편을 플라스미드 pBluescript로 삽입함으로써 수득된 플라스미드로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 DH5α 균주에 공인 번호 제AJ13496호를 부여받았고, 이는 기탁기관[National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry(우편번호: 305-8566, 일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1-3)]에 1998년 9월 9일자로 기탁되었고, 수탁번호 제FERM BP-6491호를 부여받았다.

실시예 5: 아스퍼질러스 니둘란스의 글루타미나제 유전자의 클로닝

(1) PCR에 의한 프로브의 제조

실시예 1 및 실시예 2에서 결정된 아스퍼질러스 오리재의 글루타미나제 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 기분으로 하여, PCR용 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 합성한 다음, 아스퍼질러스 니둘란스 26A의 균체로부터 제조된 게놈 DNA를 주형으로서 사용함으로써 PCR을 수행한다. 게놈 DNA를 고미 방법[참고문헌: Gomi et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 35, 225 (1989)]에 따라 실시예 2에서와 동일한 방식으로 제조한다.

서열 목록에서 서열 1의 뉴클레오타이드 번호 1952 내지 1979 및 2839 내지 2868의 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 PCR 프라이머로서 합성한다.

(5' 말단 프라이머)

GAC GAC CAA GAT GGT CTG AGC TAC CAG T(1952 내지 1979)(서열 19)

(3' 말단 프라이머)

GCA AAG TCA TCC GTA GAG ATC TGG TTC GCC(2839 내지 2868)(서열 20)

PCR 반응은 95℃에서 3분간의 열-변성 후, 94℃에서 1분간, 37℃에서 1분간, 72℃에서 1분간의 사이클을 30사이클 반복함으로써 수행한다. 이로써 약 900b 글루타미나제 유전자 단편을 제공한다.

(2) 아스퍼질러스 니둘란스 게놈 라이브러리의 스크리닝

아스퍼질러스 니둘란스 게놈 라이브러리의 스크리닝은 상기한 PCR 반응에서 수득된 유전자 단편을 프로브로서 사용하여 수행한다.

아스퍼질러스 니둘란스 게놈 라이브러리는 구입원(Fungal Genetics Strain Center; 미국 캔사스 시티 소재)으로부터 수득한다. 상기 라이브러리를 사용하여, 아가 배지를 직경이 10cm인 플레이트에 제조하여, 나일론 막 Hybond-N+(Amersham)를 이 위에 덮어둔다. 균체를 나이론 막 상에 접종시켜, 하나의 막에 약 50개의 콜로니를 형성시킨다. 콜로니가 형성된 플레이트 30편을 제조하고, 나일론 막을 각각의 플레이트로부터 회수한다. 각각의 나일론 막은 변성 용액(1.5M NaCl, 0.5M NaOH)으로 침지된 여과지 시이트 상에 7분 동안 둔다. 이후, 막을 중화 용액(1.5M NaCl, 0.5M Tris-HCl(pH 7.4))으로 침지된 여과지 시이트 상에 3분 동안 둔 다음, 중화를 위해 동일한 완충액으로 침지된 다른 여과지 시이트 상에 둔 후, 2xSSC 중에 3분 동안 정치시키고, 공기 건조시킨다. 건조 후, 막을 0.4M NaOH로 침지된 여과지 시이트 상에 20분 동안 둔 다음, 5xSSC내에서 1분 동안 진탕시켜 공기 건조시킨다.

상기한 나일론 막을 각각 예비-하이브리드화 완충액(50% 포름아미드, 5xDenhardt 용액, 5xSSPE, 0.5% SDS)에 침지시킨 다음, 65℃에서 2시간 동안 정치시킨다. PCR에서 수득된 프로브를 랜덤 라벨 키트(Random Label Kit; 제조원: BOEHRINGER MANNHEIM)를 사용하여 [³²P-γ]-CTP로 라벨링시킨다. 라벨링된 프로브를 100℃에서 3분 동안 정치시킨 후, DNA 2본쇄가 변성되도록 즉시 얼음 중에 옮겨, 예비-하이브리드화 완충액에 가한 다음, 65℃에서 밤새 하이브리드화시킨다.

상기한 나일론 막을 2xSSC, 0.1% SDS로 65℃에서 15분 동안 2회 세척하고, 1xSSC, 0.1% SDS로 65℃에서 15분 동안 2회 세척하고, 0.1xSSC, 0.1% SDS로 65℃에서 15분 동안 2회 세척한다. 세척 후, 막을 영상화 플레이트(FUJIX)와 접촉시켜, 영상 분석기 BAS2000(FUJIX)으로 검출한다. 그 결과, 4개의 포지티브 시그널이 약 1500개 플라크로부터 검출되었다.

상기 4종류의 클론을 뉴클레오타이드 서열분석한 결과, 모든 클론이 동일한 서열을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 상기 클론 중 하나로부터 유래된 HindIII-EcoRV 단편의 뉴클레오타이드 서열 및 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 서열 21에 제시한다. 또한, 아미노산 서열 단독은 서열 22에 제시한다.

상기한 HindIII-EcoRV 단편을 플라스미드 pBluescript로 삽입함으로써 수득된 플라스미드로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 DH5α 균주에 공인 번호 제AJ13509호를 부여받았고, 이는 기탁기관[Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry(현재 National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)]에 1998년 9월 22일자로 기탁되었고, 수탁번호 제FERM BP-6520호를 부여받았다.

실시예 6: 아스퍼질러스 니둘란스의 글루타미나제 cDNA의 클로닝

아스퍼질러스 니둘란스 A26을 YG 배양 배지(0.5% 효모 추출물, 2.5% 글루코즈, 0.1% 미량 원소^*) 50ml에서 37℃, 21시간 동안 진탕 배양한다. 균체를 여과지 시트 상에 회수한 다음, 최소 배지(0.6% NaNO₃, 0.152% KH₂PO₄, 0.052% KCl, 0.052% MgSO₄·7H₂O, 1% 글루코즈, 0.1% 미량 원소^*, 2x10^-5% 비오틴, 1.5% 아가)를 함유하는 플레이트에서 37℃, 24시간 동안 배양한다(미량 원소^*: 0.1% FeSO₄·7H₂O, 0.88% ZnSO₄·7H₂O, 0.04% CuSO₄·5H₂O, 0.015% MnSO₄·4H₂O, 0.01% Na₂B₄O₇·10H₂O, 0.005% (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O).

균체를 플레이트로부터 회수하여, 액체 질소에 의해 동결시킨 후, 유발을 사용하여 분쇄한다. 분쇄물로부터 RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)를 사용하여 전체 RNA를 제조하고, 전체 RNA로부터 mRNA Purification Kit(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 mRNA를 제조한다. cDNA 라이브러리를 cDNA Synthesis Kit 및 cDNA PCR Library Kit(Takara)를 사용하여 mRAN로부터 제조한다.

cDNA 라이브러리를 주형으로서 하고, 아스퍼질러스 니둘란스 게놈 DNA 서열을 기본으로 하여 디자인된 하기한 프라이머를 사용함으로써, 글루타미나제 cDNA의 클로닝을 PCR에 의해 수행한다.

(5' 말단 프라이머)

GCT TCA TAA TTC TCC TGT TGT TGA GTC(서열 23)

안티센스 프라이머

(3' 말단 프라이머)

GGC TAT AAC TGA TGC TAT ATA CTA CCA CAC(서열 24)

PCR의 반응은, 94℃에서 5분 동안의 열-변성, 및 [94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 2분간]의 30사이클에 수행한다. 그 결과, 약 2300bp의 증폭된 단편이 관찰되어, 전장 글루타미나제 cDNA이 성공적으로 수득된다. 이러한 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 서열 25에 제시한다. 이들 뉴클레오타이드 서열로부터 추정되는 아미노산 서열은 서열 26에 제시한다.

상기한 아스퍼질러스 니둘란스 글루타미나제 cDNA 단편을 pGEM T Easy Vector(Promega)의 TA 클로닝 부위에 삽입함으로써, 수득된 플라스미드와 형질전환된 에스케리키아 콜라이 DH5α 균주에 공인 번호 제AJ13575호를 부여받았고, 이는 기탁기관[National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry(우편번호: 305-8566, 일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1-3)]에 1999년 3월 11일자로 기탁되었고, 수탁번호 제FERM BP-6679호를 부여받았다.

실시예 7: 글루타미나제의 제조

프로모터 서열을 함유하는 글루타미나제 유전자를 마커 유전자 sC를 함유하는 벡터에 연결시켜, 형질전환용 벡터를 제공한다. 당해 플라스미드 DNA 10㎍을 사용함으로써 형질전환을 수행한다.

DPY 배양 배지에 분생자를 접종하여, 격렬하게 진탕하면서 30℃에서 24시간 동안 배양한다. 배양 배지를 멸균 거즈로 여과하여, 균체를 회수하고, 멸균수로 세정한 다음, 수분을 균체로부터 충분히 제거한다. 이들 균체를 시험관에 옮긴 다음, 효소액(20ml, 1.0% 야탈라제, Tagara Shuzo)를 가하여, 30℃에서 3시간 동안 완만하게 진탕한다. 프로토플라스트화의 정도를 현미경으로 관찰한 다음, 얼음 중에 보관한다.

상기한 효소 반응 혼합물을 Myracloth로 여과하여, 균체 잔사를 제거한 다음, 프로토플라스트를 함유하는 여액에 등량의 완충액 A(1.2M 솔비톨, 50mM CaCl₂, 35mM NaCl, 10mM Tris-HCl, pH 7.5)를 첨가하여 얼음 중에 위치시킨다. 혼합물을 0℃ 및 1,500rpm에서 5분 동안 원심분리한 다음, 완만하게 정지시킨 후, 펠릿을 완충액 A로 2회 세척하고, 완충액 A의 1ml에 현탁시킨다.

DNA 용액(10㎕, 10㎍)을 프로토플라스트 현탁액 100㎕에 가한 다음, 얼음 중에 30분 동안 위치시킨다. 당해 혼합물에 완충액 B(60% PEG(폴리에틸렌 글리콜) 6000, 50mM CaCl₂, 10mM Tris-HCl, pH 7.5) 250㎕를 가하여 완만하게 혼합한 후, 완충액 B 850㎕를 추가로 가하여 완만하게 혼합한 다음, 혼합물을 실온에서 20분 동안 정치시킨다. 이후, 완충액 A 10ml를 혼합물에 가하여, 시험관을 반전시켜 0℃ 및 1,500rpm에서 5분 동안 원심분리한다. 후속적으로, 펠릿을 완충액 A 500㎕에 현탁시킨다.

상기 현탁액을 상면 아가 배양 배지 5ml에 가하여, 이를 분획으로 나누고 미리 가온한 다음, M 배양 배지(1.2M 솔비톨, 0.2% 염화암모늄, 0.1% 황산암모늄, 0.05% 염화칼륨, 0.05% 염화나트륨, 0.1% 인산이수소칼륨, 0.05% 황산마그네슘 6수화물, 0.002% 황산철, 2% 글루코즈, pH 5.5) 상에 30℃에서 배양한다. 생육한 균체를 M 배지 상에 옮겨, 형질전환체임을 확인한다. 재조합 DNA를 상기 균체로부터 제조하여, 이를 서던 분석 등에 의해 적어도 2개의 복사체의 본 발명의 DNA가 존재함을 확인한다.

상기에서 수득된 형질전환체를 소맥피와 함께 배양하여, 글루타미나제 활성을 이의 추출물에 대해 측정한다. 소맥피(Nisshin Flour Milling, 160g), 인산칼륨 3.2g) 및 증류수(160ml)를 잘 혼합하여, 직경이 15cm인 딥 페트리 디쉬에 유입한 다음, 120℃에서 20분 동안 오토클레이빙시켜 배양 배지를 제조한다.

포자를 충분히 형성시킨 형질전환체의 사면 배양물에 멸균수(10ml)를 부은 다음, 교반시켜 포자 현탁액을 제조한다. 현탁액을 상기 배양 배지에 접종시킨다. 포자를 접종시킨 배양 배지를 잘 혼합하여, 30℃에서 14일 동안 배양한다. 배양 배지를 배양 개시로부터 24시간째에 교반시켜 준다.

상기한 바와 같이 제조된 소맥피 누룩을 3배 용적의 20mM 인산칼륨 완충액(pH 7.4), 1mM PMSF(페닐메탄설포닐 플루오라이드), 0.1mM EPNP(1,2-에톡시-3-(p-니트로페녹시)프로판), 1mM EDTA에 침지시켜, 4℃에서 16시간 동안 정치시킨 다음, 거즈로 여과시키고 원심분리(4℃, 10,000rpm에서 15분 동안)하여 상청액을 수득하고, 이를 조 효소 추출물로서 사용한다.

당해 조 효소 추출물의 글루타미나제 활성을 측정한다. 또 다른 조 효소 추출물을 대조군으로서 마커 유전자만을 갖는 벡터 DNA를 형질전환시킴으로써 수득된 형질전환체로부터 유사하게 수득한 다음, 이의 글루타미나제 활성을 측정한다.

	글루타미나제 활성(누룩 mg당)
형질전환체	1.43U/mg
대조용 균주	0.38U/mg

그 결과, 본 발명의 유전자를 도입시킨 균주에서 현저한 활성의 상승이 관찰되어, 도입된 글루타미나제가 발현되어 생성됨이 입증되었다.

본 발명은 국균으로부터 유래하는 글루타미나제를 암호화하는 신규한 유전자를 제공한다. 당해 유전자는 국균의 육종, 글루타미나제의 제조, 및 간장과 같은 조미료의 제조에 사용할 수 있다.

Claims (9)

1. 하기 (A) 내지 (D) 중 어느 하나에 정의된 단백질:

   (A) 서열 목록에서 서열 2의 아미노산 번호 1 내지 670의 아미노산 서열을 갖는 단백질;

   (B) 서열 목록에서 서열 22의 아미노산 번호 1 내지 669의 아미노산 서열을 갖는 단백질;

   (C) 서열 목록에서 서열 2의 아미노산 번호 1 내지 670의 아미노산 서열에 있어서, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어져 있고, 글루타민의 글루탐산 및 암모니아로의 가수분해를 촉매시키는 활성을 갖는 단백질; 및

   (D) 서열 목록에서 서열 22의 아미노산 번호 1 내지 669의 아미노산 서열에 있어서, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어져 있고, 글루타민의 글루탐산 및 암모니아로의 가수분해를 촉매시키는 활성을 갖는 단백질.
2. 하기 (A) 내지 (D) 중 어느 하나에 정의된 단백질을 암호화하는 DNA:

   (A) 서열 목록에서 서열 2의 아미노산 번호 1 내지 670의 아미노산 서열을 갖는 단백질;

   (B) 서열 목록에서 서열 22의 아미노산 번호 1 내지 669의 아미노산 서열을 갖는 단백질;

   (C) 서열 목록에서 서열 2의 아미노산 번호 1 내지 670의 아미노산 서열에 있어서, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어져 있고, 글루타민의 글루탐산 및 암모니아로의 가수분해를 촉매시키는 활성을 갖는 단백질; 및

   (D) 서열 목록에서 서열 22의 아미노산 번호 1 내지 669의 아미노산 서열에 있어서, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어져 있고, 글루타민의 글루탐산 및 암모니아로의 가수분해를 촉매시키는 활성을 갖는 단백질.
3. 제2항에 있어서, 하기 (a) 내지 (d) 중 어느 하나에 정의된 DNA:

   (a) 서열 목록에서 서열 1의 뉴클레오타이드 서열 중 뉴클레오타이드 번호 1174 내지 1370, 1446 내지 1741, 1800 내지 2242, 2297 내지 2880, 2932 내지 3134, 3181 내지 3324, 3380 내지 3515 및 3562 내지 3628의 뉴클레오타이드 서열을 순서대로 함유하는 DNA;

   (b) 서열 목록에서 서열 21의 뉴클레오타이드 서열 중 뉴클레오타이드 번호 1807 내지 2000, 2061 내지 2353, 2412 내지 2854, 2915 내지 3498, 3554 내지 3756, 3806 내지 3949, 3996 내지 4131 및 4180 내지 4246의 뉴클레오타이드 서열을 순서대로 함유하는 DNA;

   (c) (a)의 DNA와 엄격한 조건하에 하이브리드화하고, 글루타민의 글루탐산 및 암모니아로의 가수분해를 촉매시키는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA; 및

   (d) (b)의 DNA와 엄격한 조건하에 하이브리드화하고, 글루타민의 글루탐산 및 암모니아로의 가수분해를 촉매시키는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
4. 제2항에 있어서, 서열 1 또는 서열 17에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA.
5. 제3항에 있어서, 서열 21 또는 서열 25에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA.
6. 벡터에 삽입된 제2항에 따르는 DNA를 포함하는 재조합 벡터.
7. 제2항에 따르는 DNA가 발현되어 글루타미나제를 생산할 수 있는 방식으로 해당 DNA가 도입된 미생물의 형질전환체.
8. 제7항에 있어서, 사상균 또는 에스케리키아 속에 속하는 세균으로부터 유래된 형질전환체.
9. 제7항에 따르는 형질전환체를 배양 배지내에서 배양하여 배양물내에서 글루타미나제를 생성시킴을 포함하는, 글루타미나제의 제조 방법.