JP3904185B2

JP3904185B2 - グルタミナーゼ、グルタミナーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びグルタミナーゼの製造法

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Publication number: JP3904185B2
Application number: JP2001187433A
Authority: JP
Inventors: 健一朗松島; 考太郎伊藤; 泰二小山
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 2001-06-21
Filing date: 2001-06-21
Publication date: 2007-04-11
Anticipated expiration: 2021-06-21
Also published as: US20030040098A1; JP2003033183A; NL1020885A1; CN100408680C; NL1020885C2; US6919195B2; CN1394953A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルタミナーゼ、グルタミナーゼ遺伝子、新規な組み換え体DNA及びグルタミナーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルタミナーゼは、L-グルタミンを加水分解して、アンモニア及びうま味成分であるL-グルタミン酸を生成させる酵素である。グルタミナーゼは、食品加工業において重要な役割を果たしており、例えば、醤油あるいはタンパク質を酵素的に分解して得られる調味食品を製造する際に有用である。グルタミナーゼは、種々の生物種から単離されており、その酵素学的性質及びその遺伝子についての報告がなされている（例えば、特公平６−３８７４８号公報）。
醤油製造並びに麹菌を利用した調味食品の製造において、グルタミナーゼを遺伝子工学的手法で更に向上させ本酵素を多量に生産するためには、麹菌由来の本酵素の取得が重要である。
これにより、容易にタンパク質加水分解物（例えば、醤油）の品質を向上させることができ、かつ安価に提供することが可能となる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、麹菌由来のグルタミナーゼ、グルタミナーゼ遺伝子、新規な組み換え体DNA及びグルタミナーゼの製造法の提供を目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者等は、上記課題について種々検討した結果、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）由来のグルタミナーゼ遺伝子を単離し、構造決定することに成功し、本発明を完成した。
即ち、第１の発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のグルタミナーゼである。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタミナーゼ活性を有するタンパク質
第２の発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするグルタミナーゼ遺伝子である。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタミナーゼ活性を有するタンパク質
第３の発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のDNAからなるグルタミナーゼ遺伝子である。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるDNA
（ｂ）(ａ)の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、グルタミナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
第４の発明は、上記グルタミナーゼ遺伝子をベクターDNAに挿入したことを特徴とする新規な組み換え体DNAである。
第５の発明は、上記組み換え体DNAを含む形質転換体又は形質導入体である。
第６の発明は、上記形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からグルタミナーゼを採取することを特徴とするグルタミナーゼの製造法である。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．グルタミナーゼ及びそれをコードする遺伝子。
本発明のグルタミナーゼは、以下の（ａ）又は（ｂ）のグルタミナーゼである。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタミナーゼ活性を有するタンパク質
(a)に示すタンパク質は、アスペルギルス（Aspergillus）属糸状菌の染色体DNA又はcDNA由来の天然型グルタミナーゼ遺伝子をクローニングし、これを適当なベクター−宿主系に導入して発現させることにより得られる。
なお、該タンパク質は、(b)に示す通り、グルタミナーゼ活性を有する限り、(a)のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されていてもよい。本発明において「複数」とは、アミノ酸残基のグルタミナーゼタンパク質の立体構造における位置又は種類によっても異なり、通常２〜３００個、好ましくは、２〜１７０個、更に好ましくは、２〜50個、最も好ましくは、２〜10個を意味する。
【０００６】
そのような変異型グルタミナーゼ、すなわち上記（ｂ）のタンパク質は、天然型グルタミナーゼ遺伝子の塩基配列に対して置換、欠損、挿入、付加又は逆位等の変異を導入して変異型グルタミナーゼ遺伝子を作製し、これを適当なベクター−宿主系に導入して発現させることにより得られる。
遺伝子への変異導入法としては、例えば、部位特異的変異誘導法、PCRによるランダム変異導入法、更には、遺伝子を選択的に開裂し、次いで、選択されたヌクレオチドを除去又は付加した後、遺伝子を連結する方法等が挙げられる。
本発明のグルタミナーゼ遺伝子は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするDNAを含む遺伝子である。なお、本発明のグルタミナーゼ遺伝子は、（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、グルタミナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。本発明において「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ナトリウム濃度が５０〜３００ｍＭ、好ましくは１５０ｍＭであり、温度が４２〜６８℃、好ましくは６５℃での条件をいう。
【０００７】
上記（ａ）のタンパク質をコードするDNAを含む遺伝子の一例としては、配列番号１記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。このDNAは、天然型グルタミナーゼ遺伝子である。
天然型グルタミナーゼ遺伝子は、アスペルギルス属に属する糸状菌の染色体DNA又はcDNA由来の天然型遺伝子をクローニングすることにより得られる。遺伝子のクローニング方法としては、例えば、グルタミナーゼを精製して部分アミノ酸配列を決定した後、適当なプローブDNAを合成し、これを用いてアスペルギルス・ソーヤ染色体DNAからスクリーニングする方法が挙げられる。又、部分アミノ酸配列に基づき適当なプライマーDNAを作製して、5’-RACE法又は3’-RACE法等の適当なポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲ法と略称する。）により、該遺伝子の断片を含むDNAを増幅させ、これらを連結させて全長の遺伝子を含むDNAを得る方法も挙げられる。
より詳細には、天然型グルタミナーゼ遺伝子は、以下のようにして取得できる。先ず、アスペルギルス・ソーヤFERM BP-6820を培養し、得られた菌体を液体窒素中で凍結させた後、乳鉢等を用いて物理的に磨砕することによりこまかい粉末状の菌体片とし、該菌体片から通常の方法により全RNA画分を抽出する。該抽出操作には、市販のRNA抽出キットが利用できる。
【０００８】
得られたRNA抽出液からエタノール沈殿によりRNAを回収し、このRNAから通常の方法によりポリA鎖を有するRNAを分画してもよい。該分画操作には市販のOligo dTカラムが利用できる。
配列番号１のDNA配列を参考としてPCRに用いるプライマーを合成する。このプライマーDNAと上記のようにして得られたRNAを使用し、5’-RACE法や3’-RACE法等の適当なRT-PCR反応により、該遺伝子の断片を含むDNAを増幅させ、これらを連結させて全長の遺伝子を含むDNAを得る。5’-RACE法や3’-RACE法による部分cDNA合成操作には市販のキットが利用できる。
前記cDNAを鋳型として、5’末端配列及び3’末端配列に相補的な合成プライマーを用いてPCRを行なうことにより、DNAを増幅する。増幅されたDNAは、通常の方法に準じてクローニングできる。
増幅されたDNAを適当なベクターに挿入して組み換え体DNAを得る。クローニングには、TA Cloning Kit (Invitrogen社)等の市販のキットや、pUC119（宝酒造社製）、pBR322（宝酒造社製）、pBluescript SK+（Stratagene社製）等の市販のプラスミドベクターDNA、λEMBL3（Stratagene社製）等の市販のバクテリオファージベクターDNAが使用できる。
【０００９】
得られた組み換え体DNAを用いて、例えば、大腸菌K-12、好ましくは大腸菌JM109（宝酒造社製）、XL-Blue（Stratagene社製）等を形質転換又は形質導入して、夫々形質転換体又は形質導入体を得る。形質転換は、例えば、D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology, 68, 326-331, 1979）により行なうことができる。また、形質導入は、例えば、B.Hohnの方法（Methods in Enzymology, 68, 299-309, 1979）により行なうことができる。宿主細胞としては、大腸菌の他、他の細菌、酵母、糸状菌、放線菌等の微生物や動物細胞等が利用できる。
上記で増幅されたDNAの全塩基配列（配列番号１参照）は、例えば、Li-COR MODEL 4200Lシークエンサー（アロカ社より購入）、370DNAシークエンスシステム（パーキンエルマー社製）、CEQ2000XL DNAアナリシスシステム（ベックマン社製）を用いて解析できる。塩基配列を、部分アミノ酸配列の情報と比較することにより、天然型グルタミナーゼ遺伝子が取得できたか否かを確認することができる。
そして、天然型グルタミナーゼ遺伝子の解析により、翻訳されるポリペプチド、すなわち、（a）のタンパク質のアミノ酸配列が確定される。
【００１０】
２．グルタミナーゼの製造法
本発明のグルタミナーゼを製造する場合は、先ず、グルタミナーゼ遺伝子を含有する組み換え体DNAを作製する。次いで、該組み換え体DNAを含む形質転換体又は形質導入体を作製し、これらを培養し、培養物からグルタミナーゼを採取すればよい。
本発明のグルタミナーゼ遺伝子を用いて、グルタミナーゼ活性を有するタンパク質を生産するためには、好適なベクター-宿主系を選択する必要がある。そのような系としては、pST14（Unkles et al., 1989, Mol. Gen. Genet., 218, 99-104）及び糸状菌〔アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）, アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）,アスペルギルス・ニドゥランス（ Aspergillus nidulans）,アスペルギルス・ニガー（ Aspergillus niger）, ペニシリウム・チリゾゲナム（Penicillium chrysogenum）等〕の系、酵母発現ベクターpYES2（Invitrogen社製）及び酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の系、大腸菌発現ベクターpTE（Stratagene社製）及び大腸菌エッシェリシア・コリ（Escherichia coli）の系等が挙げられる。タンパク質への糖鎖付加がおこるという点で糸状菌又は酵母の系を使用することが好ましい。
組み換え体DNAは、グルタミナーゼ遺伝子を適当なベクターに挿入することにより得られる。ベクターとしては、市販品、例えば、酵母発現ベクターpYES2、pYD1（Invitorogen社製）、pUR123（宝酒造社製）、pYEX-BX、pYEX-S1、pYEX-4T（CLONTECH社製）、大腸菌発現ベクターpSET（Invitorogen社製）、pTE（Stratagene社製）等が使用できる。
【００１１】
次いで、該組み換え体DNAを宿主細胞に形質転換又は形質導入する。酵母への形質導入は、例えば、Becker DM等の方法（Methods in Enzymology, 194, 182-187, 1991）により行なうことができる。宿主細胞としては、大腸菌又は酵母の他、他の細菌、糸状菌、放線菌等の微生物あるいは動物細胞が使用可能である。
以上によりグルタミナーゼ生産能を有する形質転換体又は形質導入体が得られる。形質転換体又は形質導入体を培養するには、通常の固体培養法で培養しても良いが、可能なかぎり液体培養法を採用することが好ましい。
宿主として酵母を用いた場合、培地としては、例えば、YPD培地あるいはＹＭ培地等の一般的な富栄養培地が使用できる。また、宿主の遺伝的性質から選択培地を使用する場合は、最小培地であるSD培地が使用できる。選択培地を使用する場合は、使用した宿主ベクター系によって選択圧が異なるため、適宜、宿主の遺伝的要求性に応じて、選択圧以外のアミノ酸あるいは核酸等を、最小培地に添加する。
その他、必要により、培地に無機塩類、糖質原料、ビタミン類等を適宜添加してもよい。なお、培地の初発ｐＨは、ｐＨ６〜９に調製するのが適当である。更に、使用するベクターによってはタンパク質の発現を調節できるものもある。それらのベクターを使用する場合は、ベクターに応じた誘導剤、例えば、ガラクトースや銅イオンを添加してグルタミナーゼを誘導することができる。
酵母を培養する場合は、２５〜３５℃、好ましくは３０℃前後で、２４〜４８時間通気撹拌深部培養、振盪培養、静置培養等により培養することが好ましい。発現したグルタミナーゼを、特開平11-332553号公報記載の方法を一部改変した方法により精製できる。
酵母の場合では、該形質転換酵母を上記の適当な方法で培養後、培養液を遠心分離して菌体を得る。該菌体に細胞壁溶解酵素を加え充分に細胞壁を溶解させた後、遠心分離して上澄み液を得る。この上澄み液に硫酸アンモニウムを添加し塩析させ、更に、遠心分離して不溶性タンパク質を除きグルタミナーゼを含む粗酵素液を得る。
粗酵素液からフェニルセファロースカラム、DEAE-セファロースカラム、ゲル濾過カラム、HPLCを用いて、グルタミナーゼ活性画分を精製することにより精製されたグルタミナーゼを得ることができる。
なお、本発明における遺伝子工学的方法は、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd edition」（１９８９）、Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-8769-309-6、「Current Protocols in Molecular Biology」（１９８９）、John Wiely &Sons, Inc. ISBN 0-471-50338-X等の記載に準じて実行可能である。
【００１２】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
実施例１グルタミナーゼcDNAの取得
（１）アスペルギルス（Aspergillus）属菌におけるグルタミナーゼ相同遺伝子の検索
既知のクリプトコッカス由来グルタミナーゼ遺伝子（特願2000-270371号公報）と相同性の高い遺伝子を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターの麹菌ESTライブラリーから検索したところ、711塩基からなるESTクローンContig Mix0010110003775_1を得た。該クローンをグルタミナーゼ遺伝子の断片であると推定し、該遺伝子のcDNAのクローニングを行なった。
【００１３】
アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）からの全RNA抽出
アスペルギルス・ソーヤFERM BP-6820の胞子を大豆粉培地 (3% 大豆粉、1% KH₂PO₄、pH6.0)50mlに３×10⁵/mlとなるように接種し、150ml三角フラスコ中で３０℃、４８時間、150r.p.m.で振盪培養した。
培養終了後得られた培養液をMiracloth（CALBIOCHEM社製）で濾過して菌体を集めた。集めた菌体を滅菌水で洗浄した後、液体窒素中で凍結させ乳鉢を用いて物理的に磨砕し、細かい粉末状の菌体片とした。菌体片からISOGEN（ニッポンジーン社製）を用いて全RNAを抽出した。全ての操作は添付のプロトコールに従った。
【００１４】
（２） RACE法を用いたグルタミナーゼcDNAの取得
上記で得られた全RNA約200μgからOligotex-dT30<Super> mRNA Purification Kit（宝酒造社製）を用いて4μgのmRNAを得た。そのうち1μgのmRNAからMarathon cDNA Amplification Kit（Clontech社製）、Advantage cDNA PCR kit（Clontech社製）を用いて5’-RACE及び3’-RACEを行なった。RACE法に使用するプライマーとして配列番号３〜６で夫々表されるオリゴDNAを合成した。すなわち5’-RACEを行なうためにESTクローンCONTIG MIX0010110003775_1に対してアンチセンスのプライマー（配列番号３及び４）及び3’-RACEを行なうためのセンスのプライマー（配列番号５及び６）である。全ての操作は添付のプロトコールに従った。PCRの装置としてGeneAmp5700 DNA det ection system （Perkin Elmer社製）を使用した。その結果、グルタミナーゼcDNA 5’領域に相当する約1.7kbのDNA断片及び3’領域に相当する約0.8kbのDNA断片の増幅を確認した。
増幅されたDNA断片を0.7%アガロースゲル中で分離し、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて抽出した。操作は添付のプロトコールに従った。抽出されたDNA断片は、TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen社製）を用いてpCR2.1-TOPOベクターに組み込んだ。得られた組み換え体プラスミドは、Thermo Sequenase Cycle Sequencing Kit （Amersham Pharmacia Biotech社製）を用いてシークエンス反応を行ない、LI-COR MODEL4200Lシークエンサー（アロカ社より購入）で塩基配列を決定した。その結果配列番号１に示す約1.9kbのオープンリーディングフレーム（ORF）のDNA配列が明らかとなり、ESTクローンCONTIG MIX0010110003775_1はその部分断片であることが明らかとなった。
【００１５】
このDNAは、643アミノ酸からなるタンパク質をコードしていた。このアミノ酸配列は、配列番号2に記載する。更に、このアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して相同性検索した。相同性検索には、NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用いた。その結果公知のタンパク質で該ORFと一致するものはなかった。
しかし、クリプトコッカス・アルビダス及びクリプトコッカス・ノダエンシス由来グルタミナーゼとの相同性検定を行なったところ、活性中心と予想される領域で相同性が認められ、該ORFがグルタミナーゼをコードしていることが示唆された
。
5’-RACEを行なう際作製したcDNAを鋳型としてＰＣＲを行ない、グルタミナーゼの全長cDNAをクローニングした。プライマーには配列番号７及び８に示すオリゴDNAを用いた。得られた約2.1kbの増幅DNA断片は、既に述べた方法で抽出しTOPO TA Cloning Kit（Invitrogen社製）を用いてpCR2.1-TOPOベクターに組み込み、グルタミナーゼ全長cDNAを含む組み換え体プラスミドpASglnを得た。
組み換え体プラスミドpASglnの塩基配列を再び解析し、グルタミナーゼcDNAの塩基配列を確定した（配列番号１）。
全長グルタミナーゼcDNA、すなわち、配列番号１の塩基番号1〜1932で表される塩基配列を含むplasmid pASglnは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM BP-7634として寄託されている。
【００１６】
実施例２グルタミナーゼcDNAの発現
上記のplasmid pASglnを制限酵素Bam HI及びSph I(共に宝酒造社製)で酵素処理した後、0.7%アガロースゲル電気泳動に供し、目的の大きさ(約2.0 kbp)のDNA断片を切り出し精製した。
次いで、これらDNA断片を同制限酵素で酵素処理した酵母発現ベクターpYES2（Invitorogen社製）に組み込み、組み換え体プラスミドpYES-ASglnを作製した。上記の組み換え体プラスミドは、ガラクトースにより目的タンパク質グルタミナーゼの誘導発現が可能である。宿主は、添付のINVSc1 (Genotype:MATa、his3Δ1、leu2、trp1-289、ura3-52/ MATα、his3Δ1、leu2、trp1-289、ura3-52)を使用し、酢酸リチウム法により、上記の組み換え体プラスミド pYES-ASglnで宿主酵母を形質転換した。選択培地には、0.67% Yeast Nitrogenbase without amino acids (Difco社製)、2% raffinose (和光純薬工業社製)及び0.192% Yeast Synthetic Dropout Medium Supplement without uracil (SIGMA社製）を使用した。酢酸リチウム法は、「タンパク質実験プロトコール-機能解析編-」(細胞工学別冊：秀潤社)の記載に従った。
次いで、得られた形質転換体を用いて、pYES2ベクター（Invitorogen社製）に添付のプロトコールに従い、タンパク質の発現を行なった。200 ml用コブ付三角フラスコを用いて選択培地20 mlに形質転換体をコロニーより植菌し、30 ℃、140 r.p.m.で約14時間振盪培養し、これを種培養とした。
【００１７】
次いで、種培養の濁度(OD₆₀₀)を測定し、初期濁度がOD₆₀₀ = 0.4となるようにタンパク質発現誘導培地へ種培養を接種した。タンパク質発現誘導培地による培養は500 ml用坂口フラスコを使用し、培地50 mlで30 ℃、140 r.p.m.で振盪培養した。タンパク質発現誘導培地は、1% Yeast Extract (Difco社製)、2% Poly Peptone(日本製薬株式会社製)、1% raffinose及び2% galactose (以上SIGMA社製)を使用した。遠心、集菌した菌体を蒸留水に懸濁し酵素液として供した。
グルタミナーゼ活性は、特開平11-332553号公報記載の方法を一部改変した方法で測定した。すなわち、2%(W/V)L-グルタミン溶液250 μlに0.2 Mリン酸緩衝液(pH 6.5) 500 μl及び酵素液500 μlを加え、37℃、30分間反応させた後、0.75 N過塩素酸液250 μlを添加して反応を停止させ、これに1.5N水酸化ナトリウム液125 μlを加え、反応液を中和した。上記の反応液を遠心(10000 r.p.m.、10分)し、上清100μlに0.1 M塩酸ヒドロキシルアミン緩衝液1.0 ml (pH 8.0)、20 mM NAD+溶液(オリエンタル酵母社製)1.0 ml及び500単位/mlのL-グルタミン酸脱水素酵素液(SHIGMA社製)50 μlを添加し、37℃で30分間反応させ、分光光度計により340 nmにおける吸光度を測定した。上記の条件下で1分間あたり1μモルのグルタミン酸を生成する酵素量を1単位(U)とした。
【００１８】
形質転換体のグルタミナーゼ活性測定の結果を表１に示す。表中の数値は、培養24時間後（OD₆₀₀=15）の培養液１ml当たりのグルタミナーゼ活性（mU/ml）を示す。「pYES2」は、プラスミドpYES2による形質転換体、「pYES-ASgln」は、プラスミドpYES-ASglnによる形質転換体を夫々示す。また「−」は、ガラクトースを含まないタンパク質発現非誘導培地、「＋」は、ガラクトースを含むタンパク質発現誘導培地で誘導したことを示す。
表１

プラスミドpYES-ASglnの形質転換体は、ガラクトースを含むタンパク質発現誘導培地で培養した際にプラスミドpYES2の形質形質転換体と比較してグルタミナーゼ活性が上昇していた。また、プラスミドpYES-ASglnの形質形質転換体をガラクトースを含まないタンパク質非発現誘導培地で培養した時はグルタミナーゼ活性は、上昇しなかった。このことからプラスミドpYES-ASglnの形質形質転換体のグルタミナーゼ活性は、導入したグルタミナーゼ遺伝子に由来することが明らかとなった（表１）。宿主にINVSc1を用いてグルタミナーゼを発現させた場合にもアスペルギルス属菌と同様にグルタミナーゼ活性は、菌体表面に発現した。
【００１９】
【発明の効果】
本発明によれば、グルタミナーゼを効率よく生産することができるので、本発明は、産業上極めて有用である。
【００２０】
【配列表】

Claims

以下の（ａ）又は（ｂ）のグルタミナーゼ。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは２〜１０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタミナーゼ活性を有するタンパク質
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするグルタミナーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは２〜１０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタミナーゼ活性を有するタンパク質
以下の（ａ）又は（ｂ）のDNAからなるグルタミナーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるDNA
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるDNAとナトリウム濃度が５０ｍＭ、温度６５℃であるストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、グルタミナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
請求項２又は３記載のグルタミナーゼ遺伝子をベクターDNAに挿入したことを特徴とする新規な組み換え体DNA。
請求項４記載の組み換え体DNAを含む形質転換体又は形質導入体。
請求項５記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からグルタミナーゼを採取することを特徴とするグルタミナーゼの製造法。