KR20010035532A - 마늘의 생장점에서 유래한 캘러스를 칼슘 알지네이트로코팅한 인공종자 및 그 제조방법 - Google Patents

마늘의 생장점에서 유래한 캘러스를 칼슘 알지네이트로코팅한 인공종자 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 마늘(Allium sativum L.)의 생장점 부위에서 유래한 캘러스를 계대배양하고 배지와 유식물체 분화를 위한 호르몬이 함유된 칼슘 알지네이트로 캘러스를 코팅하여 인공종자를 제조하는 것으로 마늘의 정단 부위를 1.0mm 정도로 절취하여 식물성장호르몬이 함유된 MS(Murashige and Skoog)한천배지에 치상하고 배양함으로써 양질의 캘러스를 유도한 후, 유도된 캘러스를 캘러스 증식배지에서 대량 증식시킨다음 증식된 캘러스들이 유식물체로 완전 발아할 수 있는 조성의 호르몬을 함유한 1/2 MS 배지에 소디움 알지네이트를 용해하여 얻은 소디움 알지네이트 용액에 대량 증식된 캘러스를 넣은 후 이 소디움 알지네이트 용액을 칼슘 클로라이드 용액에 방울로 떨어뜨려 교반하면 캘러스를 중심부에 함유한 칼슘 알지네이트 구슬 형태의 인공종자가 제조되며 본 발명의 인공종자를 분화유도 배지위에 치상하여 배양하면 유식물체로의 분화가 진행될 뿐 아니라 저장과 운반이 용이하며 특히, 기존의 체세포배(somatic embryo)를 이용한 인공종자 제조와는 달리 캘러스를 이용함으로써 체세포 배 유도에 필요한 별도의 처리기간과 노력이 절감되며, 체세포 배의 유도가 힘든 작물에 대하여도 캘러스를 이용한 인공종자의 제조가 가능한 뛰어난 효과가 있다.

Description

마늘의 생장점에서 유래한 캘러스를 칼슘 알지네이트로 코팅한 인공종자 및 그 제조방법{artificial gallic seed coated with calcium arginate and manufacturing method thereof}
본 발명은 마늘의 생장점에서 유래한 캘러스를 이용하여 마늘 인공종자를 제조하는 방법 및 그 인공종자에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 기존의 체세포배를 이용한 인공종자의 제조와는 달리 캘러스를 칼슘 알지네이트로 코팅한 마늘 인공종자제조에 관한 것이다.
우수한 형질을 가진 기존의 작물이나 새롭게 창출된 작물은 교잡에 의한 형질 변화를 방지하고, 영양번식을 하는 작물 즉, 마늘, 감자, 고구마 등에 대해서는 실수요자에게 종자번식이 주는 번식의 용이성을 살릴 수 있는 인공종자가 개발되고 있다. 인공종자는 수확이 연중 계속적으로 가능하며, 유전적으로 동일한 인공종자를 대량으로 생산할 수 있으므로 노동 집약적인 종묘산업과 농업에 있어서 효과가 기대된다.
인공종자는 수정란이 아닌 일반 체세포가 기내(in vitro)에서 생장조절제의 자극에 의해 수정란의 난할과 같은 과정을 거쳐서 발달된 배(somatic embryo)를 천연의 겔의 캡슐에 넣은 것으로 미국의 플랜트 제네틱스사(plant Genetics, Inc.)가 이 분야에 많은 연구를 하였고, 이들은 셀러리와 알팔파의 체세포 배를 알긴산 캡슐에 넣어 제조한 인공종자를 공개한 바 있다.
그러나 지금까지 보고된 인공종자는 상기 공개된 기술을 포함하여 대부분 쌍자엽 식물의 체세포 배를 대상으로 한 것이며, 단자엽 식물에 있어서는 국내에서 체세포 배를 생산하여 인공종자를 제조한바 있다(벼의 체세포 배를 알진산 캡슐에 넣어 제작한 건조형 인공종자, 식물조직배양학회지, 1995년)
다만, 마늘에 있어선 체세포 배발생이 힘들 뿐만 아니라(마늘 캘러스 배양을 통한 식물체 생산, 한국원예학회지, 1993년)오랫동안의 영양번식에 의하여 바이러스에 감염될 확률이 높고, 바이러스에 감염될 경우 퇴화가 심하여 종구의 수량이 30%이상 감소되고, 종자비용이 차지하는 비율이 커서 마늘 생산에 문제점이 되어왔으므로 비교적 바이러스 감염이 적은 주아를 대량으로 배양하여 번식에 이용하고 있는 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술을 감안하여 안출한 것으고 본 발명의 목적은 생장점으로부터 쉽게 유도되는 캘러스를 이용하여 바이러스가 없는 대량의 인공종자를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 체세포 배 유도를 위한 별도의 처리기간 없이 시간과 노력이 획기적으로 절약되는 캘러스를 이용한 인공종자 제조방법을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 체세포 배의 유도가 힘든 단자엽 식물들의 인공종자 제조방법을 제공하고 더 나아가 영양번식을 하는 작물들에 있어서도 종자번식이 주는 번식의 용이성을 제공하는데 있다.
본 발명의 상기 목적을 마늘 생장점으로부터 캘러스를 유도하고 이를 증식배양하여 유식물체를 생산하고, 인공종자를 얻어 기내(in vitro)배양을 수행한 후 인공종자를 평가함으로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구체적인 구성 및 효과를 설명하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명은 그 일실시예에 의하면,
(1)마늘의 생장점으로부터 캘러스를 유도하는 단계;
(2)캘러스를 호르몬이 첨가된 배지에서 계대배양하면서 캘러스를 증식시키는 단계; 및
(3)캘러스의 분화를 유도하는 배지와 호르몬을 포함한 칼슘 알지네이트에 캘러스를 고정화하는 단계;
를 포함하는 캡슐 제조방법이 제공된다.
본 발명의 다른 실시예에 의하면,
일정 조건에서 분화 가능한 캘러스가 칼슘 알지네이트에 고정화 된 인공종자가 제공된다.
본 발명에서는 영양번식에 의한 바이러스 감염에 의해 구의 퇴화로 수량의 감소를 일으킬 수 있는 마늘에 있어서, 바이러스가 없는 마늘의 생장점으로부터 캘러스를 유도하여 인공종자화함으로써 무병종구의 대량생산과 종자번식이 주는 번식의 용이성이 극대화된다.
본 발명의 방법은 체세포 배의 유도가 쉬운 쌍자엽 식물 및/또는 체세포 배의 유도가 비교적 어려운 단자엽 식물 모두에 적용할 수 있으나, 특히 체세포 배의 유도가 어려운 단자엽 식물의 경우는 별도의 호르몬 처리로 체세포배를 유도할 필요가 없어짐으로 인해 시간과 노력을 절감할 수 있는 장점이 있다.
또한, 인공종자를 수화형으로 제조해 발아시킬 뿐 아니라 제조된 인공종자를 건조하여 발아시킴으로써 발아시에 오염에 의한 영향을 줄일 수 있으며 저장과 운반이 더 용이해질 수 있다.
본 발명에서는 먼저 마늘의 생장점을 절취하여 배지에 치상한 다음, 캘러스를 유도하고 유기된 캘러스를 계대배양 함으로써 양질의 캘러스를 다량 확보한 후 캘러스와 배양액은 캘슐내에 겔상태로 고정화된다.
즉, 유식물체 분화를 위한 호르몬이 첨가된 1/2 MS(Murashige and Skoog)기본 배양액에 소디움 알지네이트를 용해한다. 멸균한 소디움 알지네이트 용액에 캘러스를 넣고 이 용액을 칼슘 클로라이드 용액에 떨어뜨려 교반한다.
교반함에따라 소디움 알지네이트 용액 중의 알지네이트 이온과 칼슘 클로라이드 용액 중의 칼슘이온이 두 액체의 경계면에서 이온결합하여 칼슘 알지네이트 막이 형성된다. 이때 형성되는 칼슘 알지네이트는 겔상태로서 캘러스를 둘러싸는 비드(bead)막을 형성한다.
제조된 인공종자를 1% 칼슘 클로라이드(CaCl2)용액에서 10분간 담궈둔 뒤 건져내어 표면에 잔존한 칼슘 클로라이드를 제거하고 1/2 MS 기본배지에 치상하거나, 또는 건조시킨 후 1/2 MS 기본배지에 치상하여 배양한다.
이와 같은 본 발명의 마늘 인공종자 제조방법은 영양번식을 하는 작물들에 있어서는 종자번식이 주는 번식의 이점을 살릴 수 있고 특히 체세포 배의 유도가 어려운 단자엽식물은 캘러스 유도를 통해 단기간에 대량으로 증식시켜 인공종자 제조에 사용된다. 즉, 본 발명의 방법은 체세포 배의 유도과정이 규명되어 있지 않고 기관분화로의 과정이 보다 쉽게 진행되는 식물을 인공종자화하는 데 보다 더 바람직한 것이다.
이하, 본 발명의 구체적인 구성 및 효과를 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시 태양이므로 당업자간에 얼마든지 그 순서와 수치를 변경할 수 있으며, 이와같은 변경은 본 발명의 권리범위에 속하는 것이므로 본 발명을 이에 한정하는 것은 아니다.
실시예 1 : 마늘 생장점으로부터 캘러스의 유도와 증식
마늘 종구를 10% 치아염소산 나트륨 용액에 30분간 표면살균 한 후 멸균수로 3회 세척한 다음, 클린벤치 내에서 정단을 1.0mm 내외로 절단하였다. 생장조절물질 2,4-D, 엔에이에이(NAA), 키네틴(kinetin)이 각 2mg/L씩 첨가된 MS(Murashige and Skoog) 한천배지(0.8% 한천, 3% 설탕)를 pH 5.8로 조정하여 121℃, 1.2기압하에서 멸균하였다. 준비된 배지에 절단한 생장점을 이식하여 16시간의 일장과 22±2℃에서 배양하였다. 배양 4주 후 단단하고 치밀한 캘러스가 유도되었다. 유기된 캘러스들을 0.221mg/L 2,4-D와 0.2152mg/L 키네틴(kinetin)이 첨가된 LS(Linsmaier and Skoog) 한천배지에서 약 4주 간격으로 7-8회 이상 계대배양하면서 대량 증식하였다.
실시예 2 : 마늘의 캘러스 배양을 통한 유식물체 생산
계대배양하여 바이러스가 제거된 캘러스 조직 3∼5mm를 취하여 1.122mg/L NAA와 2.152mg/L kinetin이 첨가된 MS 배지에 치상한 후, 16시간 일장의 명조건으로 22±2℃에서 배양하였다. 치상한 캘러스들은 배양 1주 후부터 발아가 시작되었으며 1개월 경과후 100%의 발아율을 보였다.
실시예 3 : 마늘 캘러스의 인공종자제조
1/2 MS 기본배지에 상기 실시예 2에서 사용된 호르몬을 함유한 배양액을 제조한 후에 1.5% 소디움 알지네이트를 용해한 다음 15분간 멸균하였다. 멸균한 소디움 알지네이트 용액에 2-3mm의 캘러스를 넣고, 약 15cm 높이에서 회전하고 있는 50mM 칼슘 클로라이드 용액에 방울방울 떨어뜨려 배양액이 함유된 칼슘 알지네이트의 얇은 껍질막이 둘러싼 외부 직경이 4∼5mm인 캡슐을 제조하였다.
실시예 4 : 마늘 인공종자의 기내(in vitro)발아
상기 실시예 3에서 제조된 알진산 캡슐 표면의 잔존한 칼슘 클로라이드 용액을 제거한 후 멸균된 흡수지로 인공종자의 여분의 물기를 제거하여 호르몬이 함유되지 않은 1/2 MS 기본배지에 치상하였다. 1/2 MS 배지상에서 알진산 캡슐화한 수화형 인공종자는 100%의 발아율을 보였으며, 캡슐화하지 않은 상기 실시예 2 캘러스의 발아율과 차이가 없었다.
실시예 5 : 기화 건조시킨 마늘 인공종자의 기내(in vitro)발아
상기 실시예 3에서 제조된 수화형 인공종자를 페트리디쉬에 20립씩 넣고 뚜껑을 약간 열리도록 비스듬히 덮어 무균상의 클린벤치내에서 건조속도가 0.15-0.2g/h 되도록 하여 수분 손실율 60-90%로 건조하였다. 건조된 인공종자는 호르몬이 함유되지 않은 1/2 MS 기본배지에 치상하여 25℃, 16시간의 명조건에서 배양한 결과 공시재료 모두가 발아하였다.
실시예 6 : 동결건조 된 마늘 인공종자의 기내(in vitro)발아
상기 실시예 3에서 제조된 수화형 인공종자를 -55℃에서 동결건조(freeze drying)시켜 30%, 60%로 각각 수분을 제거한 후, 호르몬이 함유되지 않은 1/2 MS 기본배지에 치상하여 25℃, 16시간의 명조건에서 배양시킨 결과 공시재료 모두가 발아하였다.
실시예 7 : 건조된 인공종자의 저장
상기 실시예 6에서 동결건조 된 인공종자를 4℃의 암실에서 25일간 저장하여도 인공종자는 발아하지 않았다.
실시예 8 : 동결건조와 저장을 거친 인공종자의 기내 발아
상기 실시예 6과 7에서 동결건조하고 25일간 4℃에서 냉장보관한 인공종자를 호르몬이 함유된 1/2 MS 기본배지와 호르몬이 함유되지 않은 1/2 MS 기본배지에 치상하여둔 경우 모두 25℃, 16시간의 명조건에서 배양한 결과 발아하였다.
실시예 9 : 인공종자에서 발아 후 성장
발아한 인공종자는 1/2 MS 한천 배지가 들어있는 멸균된 삼각 플라스크 내에서 3개월간 배양하여 자엽과 뿌리가 정상적으로 발달한 균일한 유식물체로 성장하였다.
이상 실시예에 따라 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 마늘의 생장점으로부터 캘러스를 대량으로 증식시켜 체세포 배를 유도하지 않고 캘러스 자체를 캡슐화하는 방법을 제공하는 효과가 있으며, 이와 같은 방법으로 제조된 인공종자를 재배하여 수확할 경우, 마늘 바이러스에 의한 구의 퇴화와 그로 인한 수량 감소를 줄일 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 영양번식을 하는 다른 식용 작물과 체세포 배의 유도가 힘든 식물에서도 종자번식이 주는 이점을 살릴 수 있어 단기간내에 인공종자를 대량 확보할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 식물종자산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (5)

  1. (1) 단자엽식물의 생장점으로부터 캘러스를 유도하는 단계와;
    (2) 계대배양하여 바이러스가 제거된 캘러스 조직을 NAA와 Kinetin이 첨가된 MS배지에 치상하여 칼슘 알지네이트를 용해하여 멸균한 용액에 캘러스를 넣어 캡슐로 고정화하는 단계;
    를 포함하는 단자엽식물의 인공종자의 제조방법
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 캘러스는 그 크기를 2∼3mm로하고 칼슘 알지네이트에 고정화하여 캡슐화하는 것이 특징인 단자엽 식물의 인공종자의 제조방법.
  3. 제 1 또는 제 2항에 있어서, 상기 인공종자는 캘러스로부터 기관발생이 가능한 마늘, 벼, 보리, 옥수수인 것이 특징인 단자엽식물의 인공종자제조방법.
  4. 분화가능한 캘러스조직이 칼슘 알지네이트에 고정화된 단자엽식물의 인공종자
  5. 제4항에 있어서, 상기 단자엽식물이 마늘, 벼, 보리, 옥수수인 인공종자
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