KR101963644B1 - 기내배양을 통한 이고들빼기 대량생산방법 및 이고들빼기 캘러스 또는 현탁배양액으로부터 추출된 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장품 조성물 - Google Patents

기내배양을 통한 이고들빼기 대량생산방법 및 이고들빼기 캘러스 또는 현탁배양액으로부터 추출된 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장품 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은, (a) 파종된 이고들빼기 종자를 소독하는 단계; (b) 상기 소독된 이고들빼기 종자를 파종하여 발아시키는 단계;및 (c) 상기 발아된 종자의 유모의 자엽을 α-나프탈렌 초산(Naphthaleneacetic acid, NAA), 벤질아데닌(Benzyl adenine, BA) 또는 이들의 혼합물을 첨가한 배지에 치상하여 이고들빼기를 조직배양하는 단계를 포함하는 기내배양을 통한 이고들빼기 대량생산방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 이고들빼기의 대량생산 과정에서 요구되는 우량유묘번식의 효율을 높이고, 향후 유전자변형을 통한 유전자 기능연구 및 염색체 배가를 통한 우량 이고들빼기 품종 개발을 위해 활용될 수 있도록 식물조직배양기술을 이용한 이고들빼기 대량번식시스템을 확립하기 위하여 이고들빼기 기내배양 기술의 개발할 수 있도록, 이고들빼기의 기내배양을 위한 종자소독 조건 확립, 기내 발아된 이고들빼기 유묘의 자엽으로부터 뿌리 및 재분화능을 갖는 미분화세포조직 유도조건 확립, 그리고 미분화식물세포로부터 재분화 식물체를 유도할 수 있는 최적의 배지 조성 확립할 수 있다.
또한, 본 발명의 이고들빼기 조직배양방법에 의하여 조직배양된 이고들빼기 캘러스 및 배양액으로부터 항산화 효과가 우수한 추출물을 수득하여 화장품 조성물 제조에 이용할 수 있다.

Description

기내배양을 통한 이고들빼기 대량생산방법 및 이고들빼기 캘러스 또는 현탁배양액으로부터 추출된 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장품 조성물{Method of Cultivating Youngia denticulate using Plant Tissue Culture Techniques and Cosmetic Composition containing an Extract from Callus or Suspension Culture}
본 발명은 기내배양을 통한 이고들빼기 대량생산방법 및 이고들빼기 캘러스 또는 현탁배양액으로부터 추출된 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장품 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유전자변형 작물 개발, 염색체 배가를 통한 생장 촉진 품종 개발 및 이고들빼기 기내배양을 통한 대량 번식 시스템 개발을 위한 재분화능 식물체의 재배조건 확립을 위한 이고들빼기 대량생산방법 및 이에 의하여 생산된 이고들빼기 캘러스 및 기내배양액으로부터 추출된 기능성 물질을 포함하는 화장품 조성물에 관한 것이다.
캘러스란 분화되지 않은 부정형의 세포덩어리로 식물체에 상처가 났을 때 상처 주변에 생기는 분열조직이 형성한 종양조직이 대표적이다. 식물은 크게 세포분열을 하는 분열조직과 그렇지 않은 영구조직으로 구성되어 있는데, 처음 분열 조직의 세포를 영양 배지에 넣고 키우면 캘러스가 형성된다. 그 후 부정배가 형성되고 식물체로 분화된다. 이 캘러스는 흔히 식물의 줄기세포라고도 불린다.
인삼 등 몇몇 특화된 약용식물에 있어 다양한 조직배양기술들이 적용되었고 그 기술이 발전되었으나, 이고들빼기의 대량번식을 위한 기내배양 기술에 관한 연구는 국내외 모두 없었다. 이전 타 작물에서의 조직배양 기술개발은 산업적 활용을 위한 뿌리조직 (예: 인삼부정근) 배양 또는 연구활용을 위한 재분화체 유도를 목표로 수행되었다.
고부가가치 기능성천연물소재의 산업화를 위해서는 경제성 있는 생산시스템의 확립과 천연물 소재의 고품질화, 고부가가치화가 중요하다. 이고들빼기는 이전 연구를 통해 간기능회복 관련 생리활성이 보고되었고, 제약회사로의 기술이전을 통해 산업화 단계로 가는 유망 기능성천연물 소재이다.
천연물식물소재 우량유묘의 안정적 확보는 대량생산체계로 가기 위한 첫 번째 조건으로, 식물조직 배양 기술을 이용한 미세번식시스템(micropropagation)의 경우 균일한 품질의 개체들을 무균상태하에서 대량으로 외부 환경에 따른 영향 없이 안정적으로 생산할 수 있는 식물번식기술이다. 미세번식시스템의 확립은 각기 다른 식물 종에 따라 적합한 최적의 배양 조건을 개별적으로 확립해야하는 어려움이 있으나, 한번 조건이 확립되면 그 식물소재를 이용한 다양한 후속 연구 등에 유용하게 이용될 수 있다는 장점이 있다. 작물의 대량번식 기술은 기존 많은 노동력과 농업적 재배기술이 요구되는 종자 채종 및 파종, 발아 및 유묘 관리 체계들을 효과적으로 대체할 수 있고, 나아가 양액 또는 인공토양을 이용하는 식물공장재배시스템과 효율적으로 연계되어 기능성천연물생산 시스템 확립을 위해 핵심적으로 이용될 수 있는 기술이다. 또한, 다양한 생명공학기술을 적용한 우량 품종 개발을 위해서도 이고들빼기 조직배양기술이 활용될 수 있다. 염색체 배가를 통한 유량 이고들빼기 배수체 육성을 위해서도 재분화 식물체 유도를 위한 조직배양 기술의 확립이 선행되어야 한다. 따라서 본 발명을 통해 이고들빼기의 기내배양을 위한 무균 종자 발아, 이고들빼기 자엽으로부터 뿌리 및 재분화가능 미분화세포 유기, 그리고 최종적으로 새로운 재분화 완전체의 유도 조건을 확립하고자 수행하였다.
한국등록특허공보 제10-1209574호 한국등록특허공보 제10-1236233호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 이고들빼기의 대량생산 과정에서 요구되는 우량유묘번식의 효율을 높이고, 향후 유전자변형을 통한 유전자 기능연구 및 염색체 배가를 통한 우량 이고들빼기 품종 개발을 위해 활용될 수 있도록 식물조직배양기술을 이용한 이고들빼기 대량번식시스템을 확립하기 위하여 이고들빼기 기내배양 기술의 개발하는 데 그 목적이 있다.
본 발명의 다른 목적은 이고들빼기의 식물조직배양 연구를 위해, 이고들빼기의 기내배양을 위한 종자소독 조건 확립, 기내 발아된 이고들빼기 유묘의 자엽으로부터 뿌리 및 재분화능을 갖는 미분화세포조직 유도조건 확립, 그리고 미분화식물세포로부터 재분화 식물체를 유도할 수 있는 최적의 배지 조성 확립하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 이고들빼기 조직배양기술을 통하여 배양된 캘러스 및 배양액으로부터 항산화 효과의 유용물질을 추출하여 기능성 화장품 조성물 제조에 이용하도록 하는 것이다.
본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위한 것으로, (a) 파종된 이고들빼기 종자를 소독하는 단계; (b) 상기 소독된 이고들빼기 종자를 파종하여 발아시키는 단계;및 (c) 상기 발아된 종자의 유모의 자엽을 α-나프탈렌 초산(Naphthaleneacetic acid, NAA), 벤질아데닌(Benzyl adenine, BA) 또는 이들의 혼합물을 첨가한 배지에 치상하여 이고들빼기를 조직배양하는 단계를 포함하는 기내배양을 통한 이고들빼기 대량생산방법을 제공한다.
또한, 상기 (c)단계에서 상기 이고들빼기 배양시 1 내지 10mg/L의 α-나프탈렌 초산(Naphthaleneacetic acid, NAA)를 첨가한 배지에 배양함으로써, 뿌리 조직이 발달된 식물체의 형태로 유도하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (c)단계에서 상기 이고들빼기 배양시 0 내지 3mg/L의 α-나프탈렌 초산(Naphthaleneacetic acid, NAA) 및 4 내지 20mg/L의 벤질아데닌(Benzyl adenine, BA)를 첨가한 배지에 배양함으로써, 재분화 신초의 형태로 유도하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (c)단계에서 상기 이고들빼기 배양시 0.5 내지 7mg/L의 α-나프탈렌 초산(Naphthaleneacetic acid, NAA) 및 5 내지 20mg/L의 벤질아데닌(Benzyl adenine, BA)를 첨가한 배지에 배양함으로써, 캘러스(callus)의 형태로 유도하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (c)단계 후에 유도된 캘러스의 조각을 0.5 내지 1.5mg/L의 α-나프탈렌 초산(Naphthaleneacetic acid, NAA) 및 5 내지 15mg/L의 벤질아데닌(Benzyl adenine, BA)를 첨가한 배지에 현탁배양하여 이고들빼기 캘러스를 배양하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (a)단계에서 이고들빼기 종자를 70% 에탄올에 침지 후, 현탁소독, 10% chlorox 용액에 현탁소독 후, 멸균수로 세척하여 무균발아하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, 상기의 현택배양된 이고들빼기 캘러스 또는 현탁배양액으로부터 추출된 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장품 조성물을 제공한다.
본 발명에 의하면, 이고들빼기의 대량생산 과정에서 요구되는 우량유묘번식의 효율을 높이고, 향후 유전자변형을 통한 유전자 기능연구 및 염색체 배가를 통한 우량 이고들빼기 품종 개발을 위해 활용될 수 있도록 식물조직배양기술을 이용한 이고들빼기 대량번식시스템을 확립하기 위하여 이고들빼기 기내배양 기술의 개발할 수 있도록, 이고들빼기의 기내배양을 위한 종자소독 조건 확립, 기내 발아된 이고들빼기 유묘의 자엽으로부터 뿌리 및 재분화능을 갖는 미분화세포조직 유도조건 확립, 그리고 미분화식물세포로부터 재분화 식물체를 유도할 수 있는 최적의 배지 조성 확립할 수 있다.
또한, 본 발명의 이고들빼기 조직배양방법에 의하여 조직배양된 이고들빼기 캘러스 및 배양액으로부터 항산화 효과가 우수한 추출물을 수득하여 화장품 조성물 제조에 이용할 수 있다.
도 1은 이고들빼기 뿌리, 재분화능 미분화조직 및 재분화 신초 유도 조건 확립을 위한 서로 다른 농도의 NAA와 BA 혼합처리 배지 위에서 유도된 조직배양 개체 대표그림을 나타낸 이미지.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 재분화된 식물체의 뿌리 유도 및 재배 이미지를 나타낸 사진.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 배양액의 DPPH 라디칼 소거능을 2주마다 측정한 결과.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 배양액의 ABTS 라디칼 소거능을 2주마다 측정한 결과.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 배양액의 캘러스의 DPPH 라디칼 소거능을 2주마다 측정한 결과,
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 배양액의 ABTS 라디칼 소거능을 2주마다 측정한 결과.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 배양액의 이고들빼기 캘러스의 무게 변화를 나타낸 그래프.
본 발명은, (a) 파종된 이고들빼기 종자를 소독하는 단계; (b) 상기 소독된 이고들빼기 종자를 파종하여 발아시키는 단계;및 (c) 상기 발아된 종자의 유모의 자엽을 α-나프탈렌 초산(Naphthaleneacetic acid, NAA), 벤질아데닌(Benzyl adenine, BA) 또는 이들의 혼합물을 첨가한 배지에 치상하여 이고들빼기를 조직배양하는 단계를 포함하는 기내배양을 통한 이고들빼기 대량생산방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 첨부한 도면을 참조하여 상세히 설명한다.
상기와 같은 조직배양에 의한 이고들빼기 생산방법에 있어서, 재분화 식물체를 재배하는데 있어, 캘러스를 현탁배양하는 배지 조성의 식물호르몬의 함량을 조절함으로써 재분화 식물체의 발달 타입을 제어할 수 있다.
즉, 상기 이고들빼기의 유모의 자엽을 치상하는 단계에서 1 내지 10mg/L의 α-나프탈렌 초산(Naphthaleneacetic acid, NAA)를 첨가한 배지에 배양시 뿌리 조직이 발달된 식물체의 형태로 유도할 수 있으며, 0 내지 3mg/L의 α-나프탈렌 초산(Naphthaleneacetic acid, NAA) 및 4 내지 20mg/L의 벤질아데닌(Benzyl adenine, BA)를 첨가한 배지에 배양시 재분화 신초의 형태로 유도할 수 있고, 0.5 내지 7mg/L의 α-나프탈렌 초산(Naphthaleneacetic acid, NAA) 및 5 내지 20mg/L의 벤질아데닌(Benzyl adenine, BA)를 첨가한 배지에 배양시 캘러스(callus)의 형태로 유도할 수 있다.
또한, 유도된 캘러스를 개체로 분화시키지 않고, 그대로 배양하여 대량생산함으로써 유용물질 대량생산할 수 있다. 즉. 상기 (c)단계 후에 유도된 캘러스의 조각을 0.5 내지 1.5mg/L의 α-나프탈렌 초산(Naphthaleneacetic acid, NAA) 및 5 내지 15mg/L의 벤질아데닌(Benzyl adenine, BA)를 첨가한 배지에 현탁배양하여 이고들빼기 캘러스를 대량 배양할 수 있다.
따라서 본 발명의 또 다른 양태는 이와 같이 현탁배양에 의하여 미세번식된 이고들빼기 캘러스 및 배양액의 증가된 항산화 활성을 이용하는 것으로, 이로부터 추출된 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장품 조성물에 관한 것이다.
또한, 이고들빼기의 조직배양시 무균 발아 및 배양을 위해 오염을 최소화하는 종자소독 조건이 중요하며, 실험 결과 상기 (a)단계에서 이고들빼기 종자를 70% 에탄올에 침지 후, 현탁소독, 10% chlorox 용액에 현탁소독 후, 멸균수로 세척하여 무균발아하는 것이 오염을 최소화하는데 가장 효과적임을 알 수 있었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
1. 이고들빼기 무균발아 조건 확립
이고들빼기 종자의 무균 기내발아 조건 확립을 위해 70% 에탄올과 10% chlorox 용액 내 5, 10, 15, 20분 세척 조건을 실험한 결과 5 ~ 15분 동안 세척한 경우 종자 곰팡이 오염이 발견되었고, 20분 동안 세척한 경우 종자오염을 최소화 하면서 정상 식물의 발아를 확인할 수 있었다.
2. 이고들빼기 재분화 조건 확립.
도 1은 이고들빼기 뿌리, 재분화능 미분화조직 및 재분화 신초 유도 조건 확립을 위한 서로 다른 농도의 α-나프탈렌 초산(Naphthaleneacetic acid, NAA)와 벤질아데닌(Benzyl adenine, BA) 혼합처리 배지 위에서 유도된 조직배양 개체 대표그림을 나타낸 이미지이다.
이고들빼기 뿌리유도조건, 캘러스(greenish callus type) 유도조건, 그리고 재분화 식물체 유도조건 확립을 위해 무균상태에서 발아된 이고들빼기 유묘의 자엽을 서로 다른 농도의 NAA와 BA를 포함하는 MS배지에 치상하여 총 5주 동안 16 hour/day 형광등 조건하에서 배양하였다. 각각의 배지조건 당 9개의 절편을 치상하여 처리구 당 3반복으로 실험을 진행하였고, 배양실 내 온도조건은 24±2℃로 배양시작 2주마다 같은 조건의 새 재분화 배지에 절편을 계대배양하였다. 5주 후 재분화실험 결과를 측정한 결과, 뿌리의 발달은 1 ~ 5mg/L NAA를 포함하는 배지에서 가장 효과적으로 유도되었고, 재분화능을 갖는 greenish callus의 유도는 고농도 BA (10 ~ 20 mg/L)를 포함하는 배지에서, 그리고 재분화 신초의 유도는 저농도 NAA와 고농도 BA를 포함하는 배지에서 효과적으로 유도되었다(도 1).
각기 다른 처리에서 이고들빼기 자엽으로부터 유도된 뿌리의 수를 측정한 결과, NAA 1mg/L와 BA 0 mg/L를 포함하는 배지에서 절편 당 2.3개로 가장 많이 유도되었고, BA 처리에 따른 뿌리유도 억제효과와 고농도 NAA (20 mg/L) 처리에서의 억제효과가 확인되었다(표 1). 이러한 결과는 이고들빼기의 뿌리배양을 목적으로 할 때 NAA 1mg/L를 포함하는 배지조건이 가장 효과적인 것을 나타내며, 유도된 뿌리의 형태적 측면에서도 고농도의 NAA (10mg/L) 처리시 나타난 잔뿌리의 유도 결과에서 보여진 바와 같이 저농도의 NAA 단독 처리가 뿌리배양을 위해 효과적임을 알 수 있었다.
표 1은 서로 다른 농도의 NAA와 BA 혼합처리 배지 위에서 유도된 뿌리의 수를 측정한 결과를 나타내었다.
NAA(mg/L) 0 1 5 10 20


BA(mg/L)
 0 0.2±0.1 2.3±0.1 1.7±1.2 2.0±0.3 0.5±0.3
1 0.0±0.0 0.4±0.2 0.4±0.4 0.3±0.2 0.0±0.0
5 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.1±0.2 0.0±0.0
10 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0
20 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0
재분화능을 갖는 greenish callus type의 대량 유기는 이고들빼기 조직배양 기술적용을 통한 식물체 대량번식을 위해 필수적인 조건이다. 본 실험에서 고농도 BA (10 ~ 20 mg/L)를 포함하는 배지에서 greenish callus의 유기가 확인되었으며(도 1), greenish callus의 수를 측정한 결과, BA 무처리구에서는 greenish callus의 유도가 전혀 나타나지 않았고, NAA 농도가 높아질수록, 그리고 NAA 무처리구 보다는 저농도의 NAA (1 ~ 5 mg/L)를 포함하는 배지에서 유도가 증대되는 경향을 나타내었다(표 2). 가장 많은 수의 greenish callus가 유도된 조건은 1mg/L NAA와 20mg/L BA를 포함하는 배지로 저농도의 NAA와 고농도의 BA를 포함하는 배지조성이 greenish callus 대량 유기에 효과적임을 알 수 있었다.
표 2는 서로 다른 농도의 NAA와 BA 혼합처리 배지 위에서 유도된 재분화능 미분화조직(greenish callus)의 수를 측정한 결과를 나타내었다.
NAA(mg/L) 0 1 5 10 20


BA(mg/L)
 0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0
1 0.4±0.1 1.3±0.2 1.1±0.8 0.5±0.1 0.0±0.0
5 0.2±0.0 4.0±2.6 1.3±0.7 2.4±1.8 0.0±0.0
10 0.5±0.6 3.9±3.2 4.7±0.8 0.0±0.0 0.0±0.0
20 0.3±0.3 8.3±4.8 3.3±2.9 1.7±0.2 0.8±0.8
서로 다른 농도의 NAA와 BA 혼합처리를 통한 이고들빼기 재분화체 유도는 0 mg/L NAA 와 20 mg/L BA를 포함하는 배지조성, 그리고 1 mg/L NAA와 5-20 mg/L BA를 포함하는 배지조성에서 확인되었다(도 1). 재분화된 신초의 개수를 측정한 결과, 절편 당 2.3개의 재분화체가 0 mg/L NAA와 20 mg/L BA를 포함하는 배지에서 유도된 것이 확인되었다(표 3). 비록 가장 높은 효율의 재분화체 유도는 0 mg/L NAA와 20 mg/L BA를 포함하는 배지에서 확인되었으나, 위 조건 하에서는 완전 재분화체의 유도 보다는 많은 수의 작은 신초 다발의 유도가 진행되는 것으로 관찰되었으며, 1 mg/L NAA와 5mg/L BA를 포함하는 배지조성에서는 유도된 재분화체의 수는 절편 당 1.2개로 가장 높은 효율은 아니었으나, 유도된 재분화 신초의 형태가 완전 식물체에 가까워 재분화 식물체 유도를 목적으로 조직배양기술을 적용할 경우 위 조건이 가장 이상적인 것으로 판단되었다. 본 실험을 통해 얻어진 재분화 신초는 뿌리유도 및 완전식물체로의 재배를 위해 1/2 MS 배지로 치상되었으며 현재 정상적인 뿌리 발달과 잎 생장이 이루어지는 바, 본 실험에서 확립된 기내배양 조건이 이고들빼기의 재분화를 위해 효과적임을 확인할 수 있었다(도 1).
표 3은 서로 다른 농도의 NAA와 BA 혼합처리 배지 위에서 유도된 재분화 신초의 수를 측정한 결과를 나타내었다.
NAA(mg/L) 0 1 5 10 20


BA(mg/L)
 0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0
1 0.3±0.3 0.1±0.1 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0
5 0.0±0.0 1.2±1.7 0.0±0.1 0.0±0.0 0.0±0.0
10 0.9±1.4 1.0±0.9 0.2±0.3 0.0±0.0 0.0±0.0
20 2.3±4.0 1.7±2.2 0.03±0.1 0.0±0.0 0.0±0.0
도 2는 재분화된 식물체의 뿌리 유도 및 재배 이미지를 나타낸 사진이다.
3. 이고들빼기 캘러스 현탁배양 조건 확립
(1) 250 ml 삼각플라스크에 MS 배지 70 ml 을 넣고 121℃, 15 min 멸균.
(2) Callus 의 크기를 직경 1 mm 로 잘라 20개의 callus 조각을 채취 후 멸균된 배지에 넣어줌 - 이때 확립된 callus 유도 호르몬 조건인 NAA 1 mg/L 와 BA 10 mg/L 를 넣어줌.
(3) 26℃, 200rpm, 16 hr 빛쏘임 / 8 hr 암전 상태로 배양. 2주마다 배지 교환 - 2주마다 배지 교환시 배양액 및 callus 일부의 항산화능 측정.
도 3은 상기 배양액의 DPPH 라디칼 소거능을 2주마다 측정한 결과이며, 도 4는 ABTS 라디칼 소거능을 2주마다 측정한 결과이다.
도 5는 상기 캘러스의 DPPH 라디칼 소거능을 2주마다 측정한 결과이며, 도 6은 ABTS 라디칼 소거능을 2주마다 측정한 결과이다.
도 3 내지 도 6에서 볼 수 있듯이, 실시예 중 12, 13, 14번 샘플의 배양액과 배양체(캘러스)에서 높은 항산화 활성을 보였고, 배양액 보다는 배양체에서의 항산화 활성이 높은 것을 알 수 있었다. 또한 2주, 4주, 6주 현탁배양 동안 항산화 활성이 배양액과 배양체 모두에서 유지되는 결과를 보여 최소 6주 현탁배양 기간 동안 배양체의 양적 증가와 함께 항산화 활성 또한 유지되는 결과를 확인하였다.
일반적으로 현탁배양의 경우 일정기간마다 액체배지를 교환하여 배양을 하게 되므로 배지의 교환시 배양체의 활성이나 품질이 저하되는 경우가 많은데 반해, 본 발명의 실시예에 따른 방법에 의하면 실험을 진행한 기간인 최소 6주 동안은 배양체의 활성이 유지되는 것을 볼 수 있어 장기 배양의 경우에도 활성이 유지된다는 것을 증명할 수 있다.
표 4는 이고들빼기 callus 무게 및 상태 변화 측정한 결과를 나타낸 것이다.
기간
 최초 캘러스 무게(mg) 수득시 캘러스 무게(mg)
1차 2차 3차 1차 2차 3차
0일 145.6 156.6 174.6
6일 151.6 140.2 123.6 263.5 409.7 308.4
12일 127.6 100.3 99.9 1096.6 850.4 757.9
18일 95.2 79.9 95.2 1780 1740.9 2174.3
24일 104.3 94.6 105.2 4600 2807.8 4168.8
30일 106.7 131.1 113.3 5146 4976.6 5757.4
도 7은 상기 이고들빼기 캘러스의 무게 변화를 나타낸 그래프이다.
위의 표 4 및 도 7에서 볼 수 있듯이, 캘러스의 현택배양에 의하여 캘러스의 무게가 기간에 비례하여 꾸준히 증가하는 것을 알 수 있다.

Claims (7)

  1. (a) 파종된 이고들빼기 종자를 소독하는 단계;
    (b) 상기 소독된 이고들빼기 종자를 파종하여 발아시키는 단계;및
    (c) 상기 발아된 종자의 유모의 자엽을 α-나프탈렌 초산(Naphthaleneacetic acid, NAA), 벤질아데닌(Benzyl adenine, BA) 또는 이들의 혼합물을 첨가한 배지에 치상하여 이고들빼기를 조직배양하는 단계
    를 포함하는 기내배양을 통한 이고들빼기 대량생산방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (c)단계에서 상기 이고들빼기 배양시 1 내지 10mg/L의 α-나프탈렌 초산(Naphthaleneacetic acid, NAA)를 첨가한 배지에 배양함으로써, 뿌리 조직이 발달된 식물체의 형태로 유도하는 것을 특징으로 하는 기내배양을 통한 이고들빼기 대량생산방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (c)단계에서 상기 이고들빼기 배양시 0 내지 3mg/L의 α-나프탈렌 초산(Naphthaleneacetic acid, NAA) 및 4 내지 20mg/L의 벤질아데닌(Benzyl adenine, BA)를 첨가한 배지에 배양함으로써, 재분화 신초의 형태로 유도하는 것을 특징으로 하는 기내배양을 통한 이고들빼기 대량생산방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (c)단계에서 상기 이고들빼기 배양시 0.5 내지 7mg/L의 α-나프탈렌 초산(Naphthaleneacetic acid, NAA) 및 5 내지 20mg/L의 벤질아데닌(Benzyl adenine, BA)를 첨가한 배지에 배양함으로써, 캘러스(callus)의 형태로 유도하는 것을 특징으로 하는 기내배양을 통한 이고들빼기 대량생산방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 (c)단계 후에 유도된 캘러스의 조각을 0.5 내지 1.5mg/L의 α-나프탈렌 초산(Naphthaleneacetic acid, NAA) 및 5 내지 15mg/L의 벤질아데닌(Benzyl adenine, BA)를 첨가한 배지에 현탁배양하여 이고들빼기 캘러스를 배양하는 것을 특징으로 하는 기내배양을 통한 이고들빼기 대량생산방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (a)단계에서 이고들빼기 종자를 70% 에탄올에 침지 후, 현탁소독, 10% chlorox 용액에 현탁소독 후, 멸균수로 세척하여 무균발아하는 것을 특징으로 하는 기내배양을 통한 이고들빼기 대량생산방법.
  7. 삭제
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