KR20010032775A - 형질감염 입자 - Google Patents

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KR20010032775A
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쟝뽈 베르
토마스 블레싱
에른스트 바그너
수잔 쉴러
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유니베르시떼 루이 파스퇴르 드 스트라스보로
디터 라우디엔, 만프레드 크라이스
베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하
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Abstract

유기 양이온성 분자들에 의해 농축된 하나 이상의 핵산 분자들을 포함하는 생체내 및 시험관 내에서 핵산을 고등 진핵 세포내로 전달하기 위한 형질감염 입자들. 독립되고 안정된 입자들은 핵산 분자들을 가교시킴이 없이 핵산 분자들을 동일하거나 또는 상이한 유기 양이온성 전구체 분자들과 복합체를 형성시키고, 전구체 분자들을 핵산 주형 상에서 서로 공유적으로 연결시킴으로써 얻어진다. 특수한 세포의 표적화를 위해, 입자들은 표적화 분자들, 예컨대 당류를 함유해도 좋다. 바람직한 양이온성 전구체 분자들은 연결되어 지질을 형성하는 친지성 세제들이다. 입자들은 이들을 유전자 치료 및 큰 DNA 분자들의 전달에 유용하게 하는 단 하나의 핵산 분자를 함유하는 것이 바람직하다.

Description

형질감염 입자{Transfection particles}
현대의 재조합 핵산 기술의 중요한 단계는 외래 유전자 물질을 사용한 시험관내 및 생체내에서 세포의 효율적인 형질감염이다.
통상, 재조합 바이러스들이 세포 내로의 외래 유전자 물질을 시험관내 및 생체내에서 효율적으로 운반하기 위해 사용된다(Mulligan, 1993). 재조합 바이러스들은 간혹 세포 특이성이어서 개별 실험에 따라서 유리한 것일 수도 있고 불리할 수도 있다. 외래 물질 이외에 이들은 또한 이들 자신의 유전자 물질을 운반하며 복제 동안 돌연변이적 변화를 겪기가 아주 쉽다. 면역계를 지닌 생물체에 있어서 생체내 바이러스들의 추가의 불리한 점은 캡시드 항원 등의 바이러스 입자들에 의해 유발되는 가능한 원치 않는 면역 응답이다. 중요한 것은 오늘까지도 유전자 재조합을 위한 재조합 바이러스의 제조는 고가이며 힘든 과업이라는 것이다.
본 발명은 특히 유전자 요법에 응용하기 위한 고등 진핵 세포 내로의 핵산 전달의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 시험관내 및 생체내에서 고등 진핵 세포를 형질감염시키는데 유용한 신규의 형질감염 입자들을 제공한다.
도 1: 양이온 세제-유발 플라스미드 DNA의 단일분자 붕괴의 개략도.
도 2: 친지성 구아니딜-시스테인 아미드 세제의 합성.
도 3: 시스테인 잔기 C10CG+의 시스테인 지질 (C10CG+)2로의 산화율은 주형 DNA의 존재하에서 더 빠르게 진행된다.
도 4: (C10CG+)2양이온성 지질/DNA 입자들의 미여과 용액의 투과 전자현미경.
도 5: (C10CG+)2/DNA 복합체의 물리 및 화학적 안정성(아가로스 겔 전기영동).
도 6: C10CG+로 농축시킨 DNA 입자의 나노크기화, 입도의 측정
A: 파아지 람다 DNA
B: 파아지 T4 DNA
C: CMVL DNA
도 7A,B: C10CG+로 농축시킨 DNA 입자의 나노크기화, 단일분자 DNA 농축의 증거.
도 8: 세포주 BNL CL.2로의 친지성 구아니딜 시스테인 아미드(C10CG+)/DNA의 형질감염.
도 9: 친지성 알코올 시스테인 에스테르 세제의 합성.
도 10: DNA를 포함 및 포함하지 않는 친지성 알코올 시스테인 에스테르 세제의 임계 마이셀 농도(c.m.c.)의 측정.
C8, C10, C11 및 C12 시스테인을 포함하는 세제의 c.m.c.
도 11: DNA를 포함 및 포함하지 않는 친지성 알코올 시스테인 에스테르 세제의 임계 마이셀 농도(c.m.c.)의 측정.
A: DNA를 포함 및 포함하지 않는 C10 시스테인의 c.m.c.
B: DNA를 포함 및 포함하지 않는 C11 시스테인의 c.m.c.
도 12: DNA를 포함 및 포함하지 않는 C10 시스테인의 산화.
도 13: 친지성 알코올 구아니딜-시스테인 에스테르 세제의 합성.
도 14: 친지성 오르니틸-시스테인 아미드 세제의 합성.
도 15: 친지성 알코올 갈락토실-시스테인 에스테르 세제의 합성.
도 16: 스퍼민-N1, N12-비스-시스테인아미드 또는 스퍼민 입자들의 UV 분광도.
도 17: 아가로스 겔 전기영동. 스퍼민 또는 스퍼민-N1,N12-비스-시스테인아미드 중 하나로 형성시킨 입자들의 안정도.
도 18: (C10CG+)2/DNA 복합체와 상이한 양의 PE1 25KDa와의 상호작용으로부터 초래된 입자들의 크기 측정.
도 19: (C10CG+)2/PE1 25KDa-Gal4/DNA 복합체의 크기 측정.
도 20: C10CG+/DNA/PEl 25 KDa 복합체를 사용한 SKOV3의 형질감염.
도 21: C10CG+/DNA/PEl 25 KDa 및 C10CG+/DNA/PEl 25 KDa-Gal4 복합체를 사용한 BNL CL.2 세포의 형질감염.
도 22: 단백질에 연결된 폴리양이온을 사용한 (C10CG+)2/DNA 복합체의 코팅.
도 23: 트랜스퍼린-폴리리신-피복된 (C10CG+)2/DNA 입자들의 제타 전위의 측정.
도 24: K562 세포의 형질감염: (C10CG+)2/DNA 복합체의 전달에 대한 트랜스페린-폴리리신의 효과.
도 25: B16F10 세포의 형질감염: (C10CG+)2/DNA 복합체의 전달에 대한 트랜스페린-폴리리신의 효과.
도 26: K562 세포의 형질감염: (C10CG+)2/DNA 복합체의 전달에 대한 불활성하된 아데노바이러스 입자들의 효과.
도 27: 생체내 (C10CG+)2/DNA 복합체의 피내 전달.
도 28: 생체내 (C10CG+)2/DNA 복합체의 피내 전달.
도 29: 생체내 (C10CG+)2/pCMVL/MannlTC-PEl(25KDa) 복합체의 피내 전달.
도 30: (C12CO)2/DNA 복합체를 사용한 BNL.CL.2 세포의 형질감염.
약어
Ac=CH3-C(O)
DCC=디시클로헥실카르보디이미드
DMAP=디메틸아미노피리딘
DCU=디시클로헥실우레아
DDT=디티오트레이톨
DMEM=둘베코 변형 최소 필수 배지
EDC=N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸-카르보디이미드 하이드로클로라이드
Et=C2H5
Ether=디에틸에테르
HEPES=히드록시에틸피페라지노 에탄 술폰산
Me=메틸
MES=PE1=폴리에틸렌이민
BocON=2-tert-부톡시카르보닐-옥시이미노)-2-페닐아세토니트릴
μM bp= 염기쌍 당 계산된 DNa의 마이크로몰 농도(분자량=660)
C10CG+=친지성 구아니딜-시스테인 아미드
TA=Tris-아세테이트
THF=테트라히드로푸란
TLC= 박층 크로마토그래피
바이러스가 없는 뉴클레오타이드 입자들도 또한 세포를 형질감염시키는데 유용하다. 이러한 목적으로, 핵산 분자의 복합체, 양이온성 폴리머에 의해 축합된 대이온 (Tang and Szoka, 1997) 또는 양이온성 지질(Labatmoleur et al., 1996)이 유전자 전달에 이용된다. 이들 폴리머 및 지질 농축된 핵산 분자들은 배양시 세포를 형질감염시키는데 있어서 효율적이다. 이들 대이온-농축 뉴클레오타이드는 일반적으로 다분자 및 다분산 응집물을 유발하기 때문에 이들은 조직내에서 분산 또는 혈관을 빠져나가는 데에 있어서 매우 낮다.
양이온 세제들도 또한 DNA를 분리된 입자들로 농축하는 것으로 밝혀졌으며(Behr, 1986), 이는 흥미롭게도 단일 핵산 분자만으로 이루어질 수 있다(Melnikov et ak., 1995). 그러나, 세제들은 지질보다 더 높은 수용해도를 가지며 환경으로의 이들의 신속한 방출은 DNA-탈농축 및 세제-관련된 세포독성을 유발한다. 결과적으로, 이 부류의 양친성 물질들은 그 자체로는 세포를 혈질감염시킬 수 없다(Behr, 1993).
현대 생물학적 및 의학적 연구 및 치료, 예컨대 유전자 치료를 위한 유전자 전달의 중요성으로 인해, 시험관내 및 생체내 적용에 유용한 안정되고, 저가이며 편리한 형질감염 시스템에 대한 요구가 점점 증가하고 있다.
〈발명의 개요〉
본 발명의 목적은 종래 기술의 양이온성 형질감염 시스템의 결점을 극복한 것으로서 고등 진핵 세포 내로의 핵산을 전달하기 위한 신규의 형질감염 시스템을 제공하는데 있다.
본 발명은 유기 양이온성 분자에 의해 농축된 하나 이상의 핵산 분자를 포함하고, 입자들은 핵산 분자를 동일하거나 또는 상이한 유기 양이온성 전구체 물질로 핵산분자를 가교시킴이 없이 복합체를 형성시키고 전구체 분자들을 핵산 분자 주형 상에서 서로에 대해 공유결합시킴으로서 얻어지는 것인, 시험관내 및 생체내에서 핵산 분자들로 고등 진핵 세포들을 형질감염시키기 위한 입자들을 제공한다.
본 발명의 입자들은, 큰 양이온성 분자들 대신에 작은 양이온성 전구체 분자들을 사용함으로써 응집된 핵산이 본질적으로 없다. 더욱이, 입자들은 전구체 분자들의 공유 결합에 의해 형성된 다이머 또는 올리고머성 양이온에 의해 안정화된다.
이하, 달리 정의하지 않으면, 용어 DNA는 편의상 DNA 및 RNA를 모두 포함하여 사용된다.
입자들의 안정성은 DNA를 세포내에서 그의 바람직한 생물학적 효과에 대하여 유용하도록 하기 위해서는 가역적이어야 한다. 이를 위해서는, 본 발명의 바람직한 실시태양에 있어서, 양이온성 분자들 사이의 결합은 입자들이 세포내로의 도입후 접해있는 조건하에서 가역적이어야 한다. 결합의 파괴는 산성 조건 및(또는) 환원조건 및(또는) 세포내 분획, 예컨대 엔도솜의 효소적 기작에 의해 약하게 유발될 수도 있다.
DNA를 농축하는 양이온성 분자들은 양이온성 전구체 물질들을 공유 결합시킴으로써 얻어진다.
본 발명에 따른 양이온성 전구체 분자들은 이들이 DNA를 농축되게 유지하는 양이온성 분자의 제조를 위한 빌딩 블럭(building blocks)으로 정의된다.
본 발명의 일반적인 개념은 본질적으로 이들을 응집 또는 가교시킴이 없이 핵산분자들의 복합체를 만들기 위해서는 한편으로는 양이온이고, 다른 한편으로는 이 입자를 안정화시키기 위한 입자 구조의 동일하거나 또는 상이한 양이온성 전구체에 공유적으로 연결될 수 있는, 하나 이상의 적어도 이관능성인 전구체 분자를 요한다.
신규 형질감염 입자를 안정화시키기 위한 동일하거나 또는 상이한 양이온성 전구체 분자에 공유적으로 연결시키기 위한 기능은 동일하고 상보적인 관능기 또는 동일한 관능기들에 의해 특성화될 수 있다. 동일한 관능기의 일례로는 동일하거나 또는 상이한 전구체 양이온성 분자 사이의 이황화 다리를 제공할 수 있는 티올이다. 단일 양이온성 전구체 분자 사이의 연결을 위한 관능기의 수에 따라서 양이온성 분자들은 상이하거나 또는 동일한 전구체 분자의 다이머 또는 올리고머일 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 양이온성 분자들이 다이머화 또는 올리고머화된 동일하거나 및(또는) 상이한 양이온성 전구체 분자들로부터 제조됨을 특징으로 하는 형질감염 입자들에 관한 것이다.
핵산 분자들을 농축시키기 위한 양이온성 관능기는 일반적으로 생리학적인 조건하에서 추가의 수소를 얻는 염기성 관능기이므로 양으로 하전된다. 그러한 양이온성 관능기의 예로는 아미노 관능기 또는 그의 유도체가 있다. 별법으로, 양이온성 관능기는 양자화를 요하지 않는 4급화된 아민이 있다.
본 발명의 바람직한 실시태양에 있어서, 전구체 물질들은 상기 정의한 요건을 만족하는 양이온성 세제 분자들이다.
이 바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명은 초분자 화학의 기초를 고려하여 기반을 두며 바이러스를 염두에 둔 안정된 형질감염 입자들의 형성을 향한 두가지 타입의 DNA 전달제(한편으로는 양이온성 계면활성제 및 다른 한편으로는 양이온성 지질)의 본질을 이용한다. 이 바람직한 실시태양을 예로 들어, 본 발명의 원리를 도 1에 도식적으로 나타냈다:
음이온성 DNA 분자들을 적절히 설계된 양이온성 세제로 개별적으로 농축시키고 얻어진 입자들을 주형 DNA 상에서 세제들을 공기 유도된 다이머화를 경유하여 지질로 화학적으로 전환시킴으로서 "동결"시킨다.
본 발명의 세제 분자들은 양이온성 극성 부분, 비극성 부분 및 다른 세제 분자들을 연결시키기 위한 반응성 관능기를 포함한다. 둘 이상의 세제 분자들을 서로 연결시킬 때 원래의 전구체 분자의 세제 특성은 감소되고 이어서 이들은 친지성 및 지질과의 구조적 특성으로 인해 지질로서 정의된다. 이점에 있어서 독자들은 평범한 지질들을 핵산 분자에 첨가함으로써 제조된 형질감염 입자들은 큰 다분자 및 다분산 응집물을 초래했으며(Labatmoleur et al., 1996) 이는 본 발명의 일부가 아님을 염두에 둬야할 것이다.
추가의 일면에 있어서, 본 발명은 양이온 분자들이 핵산 분자들의 존재하에서 하나 이상의 동일 또는 상이한 세제에 연결된 세제 분자로부터 제조되는 것인 형질감염 입자들에 관한 것이다.
바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명은 양이온성 분자들이 세제 분자들의 다이머화 또는 올리고머화에 의해 제조된 형질감염 입자들에 관한 것이다. 명백하게, 세제들은 구조에 있어서 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
일반적으로, 양이온성 전구체 물질로서 사용하기 위한 양이온성 세제 분자들은 이들의 뚜렸한 기능적 특성에 의해 특성화될 수 있다.
본 발명의 추가의 일면에 있어서 형질감염 입자들은 양이온성 세제 분자들이
(a) 하나 이상의 다른 세제 분자들에 결합시키기 위한 하나 이상의 관능기,
(b) 하나 이상의 친지성 잔기,
(c) 비독성 수용체 골격,
(d) DNA에 결합시키기 위한 양이온성 그룹을 포함하는데 특징이 있다.
전구체 분자들에 결합시기 위한 관능성 잔기들은 예를 들면 이들에 한정되지 않고 이황화 다리(-S-S-)를 제공하는 티올 잔기, 히드라존(-C=N-N-)을 제공하는 히드라지드 및 알데히드, 스치프 염기(Schiff bases, 이민, -C=N-)를 제공하는 아민 및 알데히드, 적절히 치환되어(예컨대, 할라이드) 엔아민(-C=C-N-)을 제공하는 에틸렌 잔기와 반응하는 아민이 있다.
이와 관련하여, 형질감염 입자들은 다른 세제 분자에 결합시키기 위한 양이온성 세제 분자들의 관능기가 티올, 산 히드라지드류, 알데히드류, 아민류, 적절히 치환되어 엔아민류를 제공하는 에틸렌 잔기 등의 다이머화 또는 중합체화가 가능한 것들로 부터 선택된다는 특징을 갖는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 형질감염 입자는 세제의 친지성 잔기가 친지성 아미드류, 에스테르류 또는 에테르류로부터 선택되는 것에 특징이 있다. 친지성 잔기들이 원하는 농도에서 분별된 입자들을 제공하는데 적합한 세제 전구체의 임계적인 마이셀 농도를 결정하므로 전구체 분자로서 세제를 사용할 때 양이온성 분자들의 친지성 기능들은 중요하다. 원하는 DNA의 농도가 더 높을수록, 필요한 세제의 c.m.c.도 더 높아진다.
핵산 분자들에 결합시키기 위해서 특히 세제 분자들에 대한 바람직한 양이온성 분자들의 관능성 잔기들은 아민류 또는 기타 그의 염기성 및 양이온성 유도체이다. 적합한 아민류 및 그의 유도체는 후술한다.
바람직하게는, 본 발명의 형질감염 입자는 핵산 분자들에 결합하기 위한 관능기가 아민 또는 그의 유도체로부터 선택된 것임을 특징으로 한다.
본 발명에 적합한 아미노 관능기들은 하전 의존성 이온력에 의해 가역적으로 핵산 분자에 결합시키기 위한 양성의 하전을 제공하는 그들의 능력에 의존한다. 아민류 및 유도체들이 생리학적인 조건 하에서 양으로 한전되는 능력은 아민의 구조적 근접성에 의존한다. 따라서 가깝고 강력한 전자 끌기 치환체를 갖는 일부 구조들은 생리학적 조건하에서 충분히 염기성이지 않을 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명의 양이온성 분자의 아미노 관능기들은 강력한 염기성일 수 있다. 한 염기성 및 생리학상 허용되는 아미노 관능기는 본 발명의 양이온성 분자들에 특히 유용한 구아니딘이다. 적합한 아미노 관능기의 추가의 예는 아미딘이다. 이들 관능기 모두는 인산염 디에스테르 그룹과 강력한 상호작용을 나타낸다.
바람직하게는, 본 발명의 형질감염 입자들은 핵산 분자에 대한 결합을 위한 관능기가 구아니딘인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 세제 분자에 대한 수용체 골격의 요건은 명백하며, 제조가 용이하고 세포에 대해 비독성이다.
바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명은 양이온성 전구체 분자들이 하기 화학식 (I)에 대응하는 형질감염 입자들에 관한 것이다.
식 중,
R1은 (C1-C10-알킬렌)-SH를 나타내고, 여기서 알킬렌 라디칼은 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 나타낼 수 있으며;
R2는 -NR4R5, -NHR4R5 +, -N(R4)2R5 +, -C(=NR4)NR5R6, -C(=X)-C1-C10-알킬렌이며, 여기서 알킬렌 라디칼은 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 나타낼 수 있으며, 4개 이하의 디알킬 아미노 그룹 또는 티오모노사카라이드에 의해 치환될 수 있고,
R3은 직쇄 또는 분지쇄이고, 바람직하게는 하나 이상의 할로겐 원자 또는 디알킬아미노 그룹으로 임의 치환된 C5-C30-알킬이거나,
10개 이하의 C=C-이중 결합을 가지는, 직쇄 또는 분지쇄이고, 바람직하게는 하나 이상의 할로겐 원자 또는 디알킬아미노 그룹으로 임의로 치환된 C5-C30-알케닐이거나,
10개 이하의 C≡C-삼중 결합을 가지는, 직쇄 또는 분지쇄이고, 바람직하게는 하나 이상의 할로겐 원자 또는 디알킬아미노 그룹으로 임의로 치환된 C5-C30-알키닐이거나,
임의로 치환된 C6-C10-아릴이거나,
임의로 치환된 C7-C16-아랄킬이거나,
10개 이하의 아미노 그룹 -NR4-에 의해 단속되고 아미노산에 의해 임의로 치환된 아미노 그룹을 임의로 갖는 C5-C30-알킬쇄이며,
R4, R5및 R6은 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C4-알킬을 나타내며,
X는 O 또는 S를 나타내며,
Y는 C=O 또는 C=S이며,
Z는 O, S 또는 -NR4-이다.
더욱 바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명은 양이온성 전구체 분자들이 다음의 치환기를 갖는 화학식 (I)에 대응하는 것임을 특징으로 하는 형질감염 입자에 관한 것이다.
R1은 (C1-C6-알킬렌)-SH를 나타내고, 여기서 알킬렌 라디칼은 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 나타낼 수 있으며;
R2는 -NR4R5, -NHR4R5 +, -N(R4)2R5 +, -C(=NR4)NR5R6, -C(=X)-C1-C4-알킬렌이며, 여기서 알킬렌 라디칼은 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 나타낼 수 있으며, 4개 이하의 아미노 라디칼 -NR4R5, 또는 모노사카라이드에 의해 치환될 수 있고,
R3은 직쇄 또는 분지쇄이고, 바람직하게는 F, Cl, Br, 또는 -NR4R5로 임의 치환된 C5-C20-알킬이거나,
5개 이하의 C=C-이중 결합을 가지는, 직쇄 또는 분지쇄이고, 바람직하게는 F, Cl, Br, 또는 -NR4R5로 임의로 치환된 C5-C20-알케닐이거나,
5개 이하의 C≡C-삼중 결합을 가지는, 직쇄 또는 분지쇄이고, 바람직하게는 F, Cl, Br, 또는 -NR4R5로 임의로 치환된 C5-C20-알키닐이거나,
바람직하게는 C1-C4알킬, F, Cl, Br 또는 -NR4R5로 임의로 치환된 C6-C10-아릴이거나,
바람직하게는 C1-C4알킬, F, Cl, Br 또는 -NR4R5로 임의로 치환된 C7-C14-아랄킬이거나,
10개 이하의 아미노 그룹 -NR4-에 의해 단속되고 임의로 아미노산에 의해 임의로 치환된 아미노 그룹을 갖는 C5-C20-알킬쇄이며,
R4, R5및 R6은 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C4-알킬을 나타내며,
X는 O 또는 S를 나타내며,
Y는 C=O 또는 C=S이며,
Z는 O, S 또는 -NR4-이다.
더욱 바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명은 양이온성 전구체 분자들이 다음의 치환기를 갖는 형질감염 입자들에 관한 것이다:
R1은 (C1-C3-알킬렌)-SH를 나타내고, 여기서 알킬렌 라디칼은 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 나타낼 수 있으며;
R2는 -NR4R5, -NHR4R5 +, -N(R4)2R5 +, -C(=NR4)NR5R6, -C(=X)-C1-C4-알킬이며, 여기서 알킬 라디칼은 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 나타낼 수 있으며, 4개 이하의 아미노 라디칼 -NR4R5, 또는 C6-모노사카라이드에 의해 치환될 수 있고,
R3은 직쇄 또는 분지쇄이고, 바람직하게는 F, Cl, Br, 또는 -NH2로 임의 치환된 C5-C12-알킬이거나,
7개 이하의 아미노 그룹 -NR4-에 의해 단속되고 임의로 아미노산 시스테인에 의해 치환된 아미노 그룹을 임의로 갖는 C5-C15-알킬쇄이며,
R4, R5및 R6는 각각 독립적으로 수소 또는 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸 또는 tert-부틸을 나타내며,
X는 O 또는 S를 나타내며,
Y는 C=O 또는 C=S이며,
Z는 O, S 또는 -NR4-이다.
가장 바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명은 상기한 화학식에 따른 양이온성 전구체 분자들이 다음의 치환체를 갖는 형질감염 입자들에 관한 것이다:
R1은 -CH2-SH를 나타내고,
R2는 직쇄 또는 분지쇄이고 임의로 F, Cl, Br 또는 -NH2로 치환된 -NH2, -NH3 +, -NH3 +, -C(=NH2 +)NH2, -C(=O)-C1-C4-알킬쇄이거나,
오르니틴 라디칼 또는 S-갈락토실 라디칼이며,
R3은 직쇄 또는 분지쇄이고, 바람직하게는 F, Cl, Br, 또는 -NH2로 임의 치환된 C6-C15-알킬 라디칼이며,
Y는 C=O 이며,
Z는 O 또는 -NH-이다.
바람직한 형질감염 입자들은 R1이 C1-C4-알킬렌-SH인 것이다. 더욱 바람직한 형질감염 입자들은 R1이 메틸렌티올인 것들이다.
바람직한 형질감염 입자들은 R2가 아민인 것들이다. 더욱 바람직한 형질감염 입자들은 R2가 구아니딘인 것들이다. 또한 더욱 바람직한 것들은 R2가 오르니틴인 것들이다.
바람직한 것들은 R3이 데실 라디칼인 형질감염 입자들이다.
바람직한 것들은 Y가 카르보닐인 형질감염 입자들이다.
바람직한 것들은 Z가 아민인 형질감염 입자들이다.
가장 바람직한 것들은 R1이 메틸렌티올이고, R2가 구아니딘이고, R3이 데칸이고, Y가 카르보닐이고, Z가 아민인 화합물 및 제약학상 허용되는 그의 염들인 형질감염 입자들이다.
특히 바람직한 것들은 양이온성 분자가 N-데실-2-구아니디늄-시스테인인 형질감염 입자들이다.
또한 가장 바람직한 것들은 R1이 메틸렌티올이고, R2가 오르니틴이고, R3이 직쇄의 데실 라디칼이고, Y가 카르보닐이고, Z가 아민인 형질감염 입자들 및 제약학상 허용되는 그의 염들이다.
또한 특히 바람직한 것들은 양이온성 분자가 N-데실-2-오르니티닐-시스테인인 형질감염 입자들이다.
C1-C6-알킬은 일반적으로 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있는 하나 또는 수개의 할로겐 원자-바람직하게는 불소에 의해 임의로 치환될 수 있는 1 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 나타낸다. 다음의 라디칼을 예로서 언급할 수 있다:
메틸, 에틸, 프로필, 1-몌틸(이소프로필), 부틸, 1-메틸프로필, 2-메틸프로필, 1,1-디메틸에틸, n-펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, 1,1-디메틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 2,2-디메틸프로필, 1-에틸프로필, 헥실, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 3,3-디메틸부틸, 1-에틸부틸, 2-에틸부틸, 1,1,2-트리메틸프로필, 1,2,2-트리메틸프로필, 1-에틸-1-메틸프로필 및 1-에틸-2-메틸-프로필.
알칸디일 라디칼에 대해서도 동일한 정의를 적용한다.
C5-C30-알킬은 구체적으로 5 내지 30 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 의미하며-예를 들면 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 트리데실,테트라데실, 펜타데실, 헥사데실, 도데카데실, 노나데실, 에이코실, 헤니코실, 도코실 및 트리아콘틸을 들 수 있다.
달리 언급하지 않으면, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, tert-부틸, n-펜틸 또는 이소펜틸 등의 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 저급 알킬 그룹이 바람직하다. 동일한 정의를 알칸디일 라디칼에도 적용한다.
일반적으로 알케닐은 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있는 하나 또는 몇 개의 할로겐 원자-바람직하게는 불소-에 의해 임의로 치환될 수 있는 3 내지 20 개의 탄소 원자 및 하나 이상의 이중 결합, 바람직하게는 하나의 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 나타낸다. 예로는 다음을 포함한다:
2-프로페닐(알릴), 2-부테닐, 3-부테닐, 1-메틸-2-프로페닐, 2-메틸-2-프로페닐, 2-펜테닐, 3-펜테닐, 4-펜테닐, 1-메틸-2-부테닐, 2-메틸-2-부테닐, 3-메틸-2-부테닐, 1-메틸-3-부테닐, 2-메틸-3-부테닐, 3-메틸-3-부테닐, 1,1-디메틸-2-프로페닐, 1,2-디메틸-2-푸로페닐, 1-에틸-2-프로페닐, 2-헥세닐, 3-헥세닐, 4-헥세닐, 5-헥세닐, 1-메틸-2-펜테닐, 2-메틸-2-펜테닐, 3-메틸-2-펜테닐, 4-메틸-2-펜테닐, 1-메틸-3-펜테닐, 2-메틸-3-펜테닐, 3-메틸-3-펜테닐, 4-메틸-3-펜테닐, 1-메틸-4-펜테닐, 3-메틸-4-펜테닐, 4-메틸-4-펜테닐, 1,1-디메틸-2-부테닐, 1,1,-디메틸-2-부테닐, 1,1,-디메틸-3-부테닐, 1,2-디메틸-2-부테닐, 1,2-디메틸-3-부테닐, 1,3-디메틸-2-부테닐, 1,3-디메틸-3-부테닐, 2,2-디메틸-3-부테닐, 2,3-디메틸-2-부테닐, 2,3-디메틸-3-부테닐, 1-에틸-2-부테닐, 1-에틸-3-부테닐, 2-에틸-1-부테닐, 2-에틸-2-부테닐, 2-에틸-2-부테닐, 2-에틸-3-부테닐, 1,1,2-트리메틸-2-프로페닐, 1-에틸-1-메틸-2-프로페닐 및 1-에틸-2-메틸-2-프로페닐.
일반적으로 알키닐은 3 내지 20 개의 탄소 원자 및 하나 이상의 삼중 결합 또는 하나 이상의 삼중 결합 및 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 나타낸다.
2-프로피닐(프로파길), 2-부티닐, 3-부티닐, 1-메틸-2-프로피닐, 2-펜티닐, 3-펜티닐, 4-펜티닐, 1-메틸-2-부티닐, 1-메틸-3-부티닐, 2-메틸-3-부티닐, 1,1-디메틸-2-프로피닐, 1-에틸-2-프로피닐, 2-헥시닐, 3-헥시닐, 4-헥시닐, 5-헥시닐, 1-메틸-2-펜티닐, 4-메틸-2-펜티닐, 1-메틸-3-펜티닐, 2-메틸-3-펜티닐, 1-메틸-4-펜티닐, 3-메틸-4-펜티닐, 1,1-디메틸-2-부티닐, 1,1-디메틸-3-부티닐, 1,2-디메틸-3-부티닐, 1,3-디메틸-2-부티닐, 1,3-디메틸-3-부티닐, 2,2-디메틸-3-부티닐, 2,3-디메틸-2-부티닐, 2,3-디메틸-2-부티닐, 2,3-디메틸-3-부티닐, 1-에틸-2-부티닐, 1-에틸-3-부티닐, 2-에틸-3-부티닐 및 1-에틸-1-메틸-2-프로피닐.
본 발명의 의미에 있어서 단단류는 C5- 및 바람직하게는 C6-단당류 및 예로는 다음의 그룹으로부터 선택된다:
D- 또는 L-형의 각각의 갈락토오스, 락토오스, 글루코오스, 아라비노오스, 푸락토오스, 소르보오스, 크실로오스, 리보오스, 만노오스.
일반적으로 아릴은 6 내지 10 개의 탄소 원자를 갖는 방향족 라디칼을 나타내며- 또한 결합하여 방향족 고리는 동일하거나 또는 상이할 수 있는 하나 이상의 저급 알킬 그룹, 알콕시 그룹, 니트로 그룹, 아미노 그룹 및(또는) 하나 이상의 할로겐 원자에 의해 치환될 수 있다. 바람직한 아릴 그룹은 달리 언급하지 않는한 페닐이다.
일반적으로 아랄킬은 알킬렌 쇄를 경유하여 결합된 7 내지 14 개의 탄소 원자를 갖는 아릴 라디칼을 의미하며, 방향족 고리는 동일하거나 또는 상이할 수 있는 하나 이상의 저급 알킬 그룹, 알콕시 그룹, 니트로 그룹, 아미노 그룹 및(또는) 동일하거나 또는 상이할 수 있는 하나 이상의 할로겐 원자에 의해 치환될 수 있다. 지방족 부분 구조에 1 내지 6 개의 탄소 원자 및 방향족 부분에 6 내지 10 개의 탄소 원자를 갖는 아랄킬 라디칼들이 바람직하다.
일반적으로 알콕시는 알킬이 상기한 바와 같이 정의된 O-알킬을 나타낸다. 바람직한 알콕시 라디칼들은 상기 정의한 바의 저급 알킬 그룹들을 가진다.
알킬 또는 디알킬아미노는 서로 동일하거나 또는 상이한 하나 또는 두 개의 알킬 그룹들에 의해 치환된 아미노 라디칼을 나타낸다. 바람직한 알킬 또는 디알킬아미노 치환체는 하나 이상의 저급 알킬 그룹을 갖는 아미노 라디칼들이다.
본 발명의 추가의 실시태양에 있어서, 유기 양이온성 전구체 분자는 친지성 잔기들이 없다. 이 타입의 적합한 분자들은 DNA를 가교 또는 응괴시킴이 없이 DNA 분자에 결합할 수 있다. 이 요건을 수행하기 위해, 이들은 하나 이상의 다른 DNA 분자에 결합함이 없이 단일 DNA 분자에만 부착되기에 충분히 적어야 한다. 또한, 양이온성 분자들은 이들을 다른 동일한 또는 상이한 양이온성 전구체 분자에 공유적으로 연결하는 것을 허용하는 관능기들을 함유한다.
관능성 그룹들에 대한 요건은 세제 전구체 분자들에 대해서 기술한 바와 같다. 양이온성 물질들은 이들을 DNA 와 접촉시키고 공유 결합 전후에 예컨대 전자 현미경, 레이져 광 분산 또는 원자력 현미경에 의해 얻어진 복합체를 이들의 입도에 대해 물리적으로 시험함으로써 본발명에 대하여 이들의 안정성을 시험할 수 있다. 적합한 양이온성 분자들은 연결전후에 응괴 형성을 나타내지 않으며; 반대로 이들은 연결 후, 임의로 또한 연결 전에 입자 형성을 나타내야 한다.
양이온성 비-친지성 전구체 분자들은 양으로 하전된 그룹들을 지닌 골격을 갖는 분자들을 포함하는 그룹으로부터 선택된다. 이 골격은 중요하지 않으며, 이는 주쇄 또는 측쇄 중 어느 하나에서 양 하전을 지닌 임의의 유기 분자일 수 있다. 일례로서, 이 골격은 펩티드로, 양전하는 양으로 하전된 아미노산, 예컨대 리신, 아르기닌, 오르니틴에 의해 제공될 수 있다. 적합한 양으로 하전된 그룹들은 상기 세제 분자들에 대해 정의한 바와 같은 것일 수 있다. 상기 요건을 수행하는 한, 유기 양이온 전구체 분자는 DNA를 복합체화하기위한 WO 93/07283에 기술된 것들일 수 있다.
공유적 연결을 위한 관능성 그룹들은 골격 그 자체에 의해 제공될 수 있으며, 예를 들면 분자는 펩티드이며 시스테인 잔기를 가지거나 또는 그것들은 이들을 골격에 연결시킴으로써 얻을 수 있다.
알킬 또는 디알킬아미노는 서로 동일하거나 또는 상이한 하나 또는 두 개의 알킬 그룹에 의해 치환된 아미노 라디칼을 나타낸다. 바람직한 알킬 또는 디알킬아미노 치환체들은 하나 이상의 저급 알킬 그룹들을 갖는 아미노 라디칼들이다.
바람직한 실시태양에 있어서, 형질감염 입자들은 양이온성 전구체 분자가 아민 또는 폴리아민임을 특징으로 한다.
바람직한 실시태양에 있어서, 형질감염 입자들은 양이온성 전구체 분자가 스퍼민-N1,N12-비스-시스테인아미드(SC2)임을 특징으로 한다.
상기 언급한 스퍼민 유도체는 본 발명을 수행하는데 필요한 모든 요건을 충족한다. 1급 및 2급 아민은 생리학적 조건 하에서 양이온성 관능기를 제공하며 두 티올 그룹들은 DNA에 가교 또는 응괴없이 다이머화 또는 올리고머화를 허용한다.
양이온성 전구체 분자 스퍼민-N1,N2-비스-시스테인아미드 (SC2)는 상업상 입수가능한 시약으로부터 제조될 수 있다. 본 발명의 실험에 있어서, SC2로부터 제조된 형질감염 입자들의 생물리학적 변수들을 결정하였으며 이 결과는 스퍼민으로 제조된 입자와는 반대로 이들은 안정한 것으로 나타났다.
SC2분자는 두 개의 유리 티올 관능기를 갖는 두 개의 시스테인 분자에 아미드 결합을 통해 연결된 스퍼민 분자로 구성되어 있다. 이들 두 분자들의 선택은 보다 중요하다. 다른 폴리아민류, 예컨데 푸트레신, 스퍼미딘 뿐만 아니라 스퍼민은 바이러스의 DNA를 축합된 형태로 유지시키는데 관련되어 있다. 다양한 시험관내 연구에 의해 폴리아민류는 DNA를 압축시키고, 최적 조건하에서 스퍼민은 DNA를 직경 0.1 ㎛의 토로이드 구조 내로 압축시킬 수 있는 것으로 나타났다.
그럼에도 불구하고 이들 토로이드들은, 시간이 지남에 따라 비교적 안정하기는 하지만, 배지의 식염수 농도에 민감하다. 사실상, 150 mM NaCl 농도에서(세포 배양 배지의 이온 농도임) 스퍼민은 DNA로 부터 탈복합체화하여 토로이드 구조의 손실을 초래한다. 따라서 스퍼민과 복합된 DNA의 입자들은 형질감염에 이용될 수 없다. DNA 복합체의 입자 구조를 안정화시키기 위해, 각각의 유리 티올 관능기를 지닌 두 그루을 스퍼민의 각 말단에 그라프트시킨다. 특정 최적화 조건하에서, SC2분자는 DNA의 마이너 그루브에 존재하며, 이는 주형으로 작용하여 이황화 결합을 경유하여 서로에 결합하여 토로이드 형태를 안정화시킬 수 있는 DNA의 골격을 제공한다.
본 발명은 형질감염 입자 내의 한 타입의 양이온성 전구체 분자에 결코 한정되지 않는다. 형질감염 입자들은 둘 이상의 상이한 양이온성 전구체 분자들을 공유적으로 연결시킴으로써 제조될 수 있다. 양이온성 전구체 분자들이 상이한 양이온성 전구체 분자들에 연결되기 위해서는 이들은 상보적이어야 하기 때문에 이들의 관능성 그룹에 관하여 다른 반응 파트너와는 다르다. 본 발명의 양이온성 전구체 분자들은 또한 다른 양이온성 전구체 분자들을 연결함에 있어서 기능적 다양성 뿐만 아니라 구조적 다양성을 제공할 수 있다. 구체적인 적용을 위해, 당업자는 구조적으로 상이한 양이온성 전구체 분자들을 합하여 특이한 요건을 만족시키는 형질감염 입자들을 설계하는 것이 유용함을 알게 될 것이다.
형질감염 입자들은 이들의 목적지, 예컨대 표적 세포 또는 조직에 도달하는데 필요한 시간 동안 안정해야 한다. 표적 부위에서, 예컨대 표적 세포 내에서 이는 물론 이 세포에 유용한 형질감염 입자들의 핵산들을 만들 필요가 있다.
세포에 대해 외래의 물질은 일반적으로 내식작용에 의해 흡수되어 일련의 구획, 그중에서도 엔도솜을 통과한다. 엔도솜 내에서, 외래 물질들은 약 6의 보다 산성인 pH의 조건 및 아주 다양한 효소, 특히 가수분해효소들과 직면하게 된다. 본 발명에 따른 형질감염 입자들은 세포에 의해 흡수되어 결과적의로 엔도솜의 구획으로 옮겨진다. 세포내 구획 내에서 본 발명의 형질감염 입자들은 이들의 해리를 유발하는 조건에 직면하고, 특히 다이머 또는 올리고머의 양이온 분자들의 분해에 의해 탈농축을 위한 핵산을 방출한다. 양이온성 분자들의 파괴는 이황화 다리의 환원에 의해 유발되며; 결합에 용이한 산의 예로는 히드라존류, 스치프 염기(이민), 엔아민류, 아세탈 또는 케탈 관능기들이다. 본 발명은 엔도솜의 절단에 대해 상기 언급한 결합에 결코 한정되지 않으며 당업자는 양이온 분자들에 대한 요건을 충족하고 엔도솜 또는 기타의 세포내 구획에서 분해 가능한 별도의 결합에 대해 알고 있을 것임에 유의해야 한다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시태양에 있어서, 형질감염 입자들은 세포내 구획의 조건하에서 분해 가능한 양이온성 분자들 사이의 결합에 특징이 있다.
이 신규한 형질감염 입자들은 핵산 분자들을 가진 세포들을 시험관내 뿐만 아니라 생체내에서 형질감염시키는데 유용하다. 이 신규한 형질감염 입자들은 시험관내 및 생체내에서 고등 진핵 세포들을 형질감염시키는데 특히 유용하다.
핵산 분자의 효율적인 전달을 위해 특정 세포의 표적화 관능기를 제공하는 것이 바람직할 수도 있다. 생체내 적용을 위해서는 표적 유전자를 특정 세포, 조직 또는 기관에 표적화시키는 것이 중요하다. 형질감염 효율은 일단 이들이 표적 세포에 결합되면 입자들의 세포 내로의 증가된 내식작용에 의한 흡수에 의해 더욱 증가될 수 있다.
따라서 본 발명은 추가의 일면에 있어서 이들이 추가로 특정 세포의 표적화 및(또는) 내식작용을 위한 하나 이상의 관능기를 지님을 특징으로 하는 형질감염 입자들에 관한 것이다.
형질감염 입자들의 효율적인 세포의 흡수는 세포 표면에서 세포 구조에 결합하거나 및(또는) 결합된 구조의 내부화(internalization)을 유발하는 리간드에 의해 성취될 수 있다.
세포의 표적화 관능기로는 예를 들면 단백질 리간드 또는 당 잔기들이 있다. 리간드의 예로는 면역글로불린 및 그의 단편 또는 유도체, 렉틴류, 부착 분자들, 사이토카인류 또는 케모카인류 뿐만 아니라 특정 세포 표면 구조들을 인식하고 특이적 표적화 및(또는) 내부화가 가능한 작은 유기 구조물, 예컨대 당 잔기들이 있다. 표적 관능기의 잘-확립된 예들은 트랜스퍼린, 폴산, RGD 펩티드, 다양한 수의 단클론 항체 및 다클론 항체가 있다. 표적 세포에 결합하여 입자들을 세포내로 내부화시킬 수 있는 임의의 리간드를 사용할 수 있으며, 그 본 발명에 사용해도 좋은 적합한 리간드의 예는 WO 93/07283에 나타나 있다.
따라서 한 바람직한 실시태양에 있어서 본 발명은 표적화 및(또는) 내식세포성 관능기가 세포의 단백질 리간드임을 특징으로 하는 형질감염 입자들에 관한 것이다.
추가의 실시태양에 있어서 본 발명은 표적화 및(또는) 내식세포성 관능기가 당 잔기인 본 발명의 형질감염 입자들에 관한 것이다.
표적화 리간드들 외에, 본 발명의 입자들은 막 융합, 붕괴 또는 공극 형성(이후, 이 기능들은 엔도솜용해 기능(endosomolytic function)이라고 한다) 중 어느 하나에 의해 이들을 세포막을 횡단하게 하는 관능기를 포함할 수도 있다. 양이온성 전구체 분자들이 세제들인 경우, 이들은 자체로 막 탈안정화/엔도솜 용해성 기능을 갖는다. 공유적 연결이 생체내 가역적이어서 세포내 환경에서 파괴될 경우, 세제 분자들은 이들의 엔도솜 용해 기능을 발휘할 수 있다. 별도로 또는 세제의 막 탈안정화 기능회에, 이 기능은 엔도솜 용해 시약에 의해 제공되어도 좋다.
본 발명에서 사용해도 좋은 적합한 엔도솜용해제의 예들은 WO 93/07283호에 기재되어 있다. 엔도솜 용해제의 바람직한 예들은 불활성화된 아데노바이러스 입자들, 막 활성 펩티드류(예컨대, 이들의 예들이 WO 93/07283호 및 Plank et al., 1994; Mechtler and Wagner, 1997; Gottschalk et al., 1996에 기술되어 있는 융합생성(fusogenic) 또는 용해성 펩티드, Wyman et al., 1997에 의해 공개된 DNA 결합 막 활성 펩티드; Legendre and Szoka, 1993 및 Legendre and Supersaxo, 1995에 의해 공개된 양친성 양이온성 펩티드 그라미디신); 및 Wilson et al; 1987 Hughes et al., 1996 및 그안의 참고문헌에 의해 공개된 N-알킬-이미다졸 등의 pH 감수성 계면활성제들이 있다.
본 발명의 형질감염 입자들의 표적화 및(또는) 엔도솜용해성 관능기들은 본 발명의 소수의, 많은 또는 모든 양이온성 분자에 공유적으로 연결될 수 있으며 단일 형질감염 입자 내에서 동일하거나 또는 상이한 표적화 관능기일 수 있다. 표적화 및 엔도솜용해성 관응기의 존재는 타입 및 양의 의미에 있어서 특정의 적용, 특히 도달되는 세포 타입에 의존하며 특정 요건에 맞도록 조정할 수 있다. 일반적으로 그러한 관능기를 지닌 양이온성 분자들은 약 1 내지 80%, 바람직하게는 약 10 내지 50%일 수 있다.
본 발명의 양이온성 물질들의 전구체 분자들을 공유적으로 연결시킬 수 있는 표적 관능기를 지닌 전구체 물질의 예는 친지성 갈락토실 시스테인이다(Remy et al., 1995) (실시예 5 참조). 이 친지성 갈락토실 시스테인은 그 자체로는 핵산 분자의 복합체화를 위해 필요한 기능성을 제공하지는 않으나 양이온성 전구체 분자들에 공유적으로 연결되어 본 발명의 형질감염 입자들의 일부인 양이온성 분자(이합체다이머)를 제공할 수 있다. 갈락토실 잔기들은 간 세포에 의해 특이적으로 인식되는 표적 관능기들인 것으로 알려졌다.
표적화/엔도솜용해성 관능기는 또한 접합체의 형태로도 존재할 수 있으며, 이 경우 이는 올리고머화 가능한 전구체 분자에 더하여 존재하는 DNA 결합 분자에 부착될 수 있다. 이 분자는 올리고리신 등의 올리고양이온 또는 이합체화 가능한 관능기가 없는 폴리에틸렌이민 등의 폴리머일 수 있다. 이들 표적화/엔도솜용해 접합체는 복합체 형성 전 또는 그 동안 형질감염 입자의 다른 복합체 파트너에 첨가될 수 있다.
리간드/엔도솜용해성 관능기는 다음의 방식으로 형질감염 입자 내로 혼입될 수 있다:
a) 복합체 형성 전 또는 동안 표적화/엔도솜용해성 관능기를 갖춘 양이온성 전구체 분자 및(또는) 비-올리고머화 가능한 작은 DNA 결합 분자를 제공하고,
b) 복합체 형성 후 전구체 분자들을 공유적으로 연결시키기 전 또는 그 동안 양이온성 전구체 분자들 및(또는) 비-올리고머화 가능한 작은 DNA 결합분자들에 표적화/엔도솜 용해성 관능기를 부착시키고,
c) 표적화/엔도솜 용해성 관능기를 전구체 분자들을 공유적으로 연결시킨 후에 부착시킨다.
b) 및 c)의 경우에 전구체 분자들 또는 비-올리고머화 가능한 분자들은 표적화/엔도솜 용해 관능기를 결합하는 것을 허용하는 반응성 그룹으로 부착시킨다. 반응성 그룹은 화학적으로 반응성인, 예컨대 활성화된 에스테르류, 이황화물류 또는 생화학적 상호작용, 예컨대 스트렙타비딘/비오틴 결합(이 경우 분자들은 스트렙토비딘 또는 비오틴과 결합시켜 반응시킨다)을 허용하는 것들을 의미한다. 이 반응성 그룹들은 이것이 전구체 분자들을 공유적으로 결합시키는 공정을 방해하지 않도록 선택해야 한다.
실시태양 a)는 표적화/엔도솜 용해성 관능기를 지닌 분자를 정제된 형태로 대량으로 제조할 수 있고 잘-특정된 시약으로서 용이하게 입수할 수 있다. 이 실시태양은 특별히 형질감염 입자 내에서 이러한 기능을 가지는 것이 요망될 때 엔도솜 용해성 기능에 적용된다.
실시태양 b) 및 c)는 이들 리간드/시약들은 작은 입자들로의 DNA 복합체의 농축을 방해할 수도 있기 때문에 단백질 표적화 리간드 등의 큰 리간드들 또는 아데노바이러스 등의 엔도솜 용해제에 바람직하다. 이들은 이 관능기가 입자의 표면에 위치하는 것을 보장할 수 있다는 것이 이들 실시태양의 이점이 있다. 실시태양 c)는 리간드가 전구체 분자들을 농축 및(또는) 공유적 연결에 사용되는 조건에 민감할 경우라면 더 유리하다.
추가의 실시태양에 있어서, 본 발명은 표적화 관능기가 당 잔기에 의해 제공된 형질감염 입자들에 관한 것이다.
바람직한 실시태양에 있어서, 당은 갈락토오스이다.
다른 바람직한 실시태양에 있어서, 당은 만노오스이다.
추가의 실시태양에 있어서, 엔도솜용해 기능은 융합생성 펩티드에 의해 제공된다.
표적화/엔도솜 용해성 관능기들을 제공하는 시약들, 예를 들면 당류 등의 작은 유기 분자 또는 단백질 또는 전체 바이러스 등의 더 큰 구조물을 양이온성 분자들에 부착시키는 방법들은 당업자에게 유용하다.
화학적 결합에 의한 결합은 펩티드의 커플링에 이미 공지된 방식으로 수행하고, 필요시 개별 성분들은 커플링 방응 전에 링커 물질을 제공한다(이 수단은 커플링에 적합한 유용한 관능성 그룹, 예컨대 머르캅토 또는 알코올 그룹이 없을 경우에 필요하다). 링커 물질들은 먼저 개별 성분들의 관능성 그룹과 반응되고, 그후 개질된 개별 성분들이 커플링되는 이관능성 화합물들이다.
커플링은 다음의 수단에 의해 수행될 수 있다.
a) 환원 조건하에서 다시 분해될 수 있는 이황화 다리(예컨대, 숙신이미딜-피리딜디티오프로피오네이트를 사용할 경우);
b) 생리학적인 조건 하에서 본질적으로 안정한 화합물들(예컨대, 말레이미도 링커와 제2 성분에 결합된 링커의 술피히드릴 그룹의 반응에 의한 티오에테르류);
c) 생물학적 조건하에서 불안정한 다리, 예컨대 약산성의 조건하에서 불안정한 에스테르 결합 또는 아세탈 또는 케탈 결합;
d) 이소티오시아네이트, 활성화된 에스테르 등의 반응성 그룹들;
e) 알데히드와 아미노그룹과의 반응성 커플링.
바람직한 실시태양에 있어서, 형질감염 입자들의 핵산은 DNA이다.
이 DNA는 선형 또는 환형, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
DNA의 크기에 관련하여, 본 발명은 대략 20 뉴클레오티드를 함유하는 작은 올리고뉴클레오티드 내지 약 100 내지 200 kb의 인공 크로모솜 등의 매우 큰 분자들 사이에서 넓은 범위를 허용한다.
바람직한 실시태양에 있어서, 입자들은 DNA에 관련하여 단일분자인데, 이는 이들이 단일 DNA 분자를 함유함을 의미한다. 이 실시태양은 생리학적인 장벽들의 크기 제한을 극복하기 위해 작은 입자들을 가하는 것이 바람직한 경우 생체내 DNA의 전달에 특히 유용하다.
더욱이, 단일분자의 뚜렸한 안정된 입자들의 유용성은 그러한 분자들이 큰 응괴 보다 세포에 의해 보다 용이하게 흡수되기 때문에 DNA 분자를 시험관내 및 생체내 전달하는데 유용하다는데 있다.
그러한, 이들 입자들은 특히 올리고뉴클레오티드 등의 더 적은 DNA 분자들이 가해지는 경우 하나 이상의 DNA 분자를 함유해도 좋다.
본 발명의 입자들은 일반적으로 구형의 구조이며, 이들의 직경은 대략 25 nm (플라스미드 DNA의 경우) 내지 수백 nm까지 다양할 수 있다. 형성된 입자들의 부피는 DNA의 길이에 직접적으로 비례한다. 이는 DNA 분자의 농축이 단일분자임을 강력히 시사한다.
추가의 일면에 있어서, 본 발명은 신규 뉴클레오티드 형질감염 입자들의 제조를 위한 양이온성 분자 및(또는) 양이온성 전구체 분자들의 용도를 포함한다.
추가의 일면에 있어서, 본 발명은 양이온성 전구체 분자들을 적합한 완충액 중의 핵산 분자에 첨가하고 핵산과의 복합체를 형성하도록 허용하고 핵산 주형 상에서 동일하거나 또는 상이한 양이온성 전구체 분자들에 공유적으로 연결되는 것을 허용하는 것을 특징으로 하는 형질감염 입자들의 제조 방법을 포함한다.
이 방법의 첫 번째 단계에서, 완충액 중의 한 타입의 DNA 분자 또는 상이한 분자들의 혼합물을 함유한 DNA 용액을 전구체 분자의 용액과, 임의로 상이한 전구체 분자 용액들과 혼합시킨다.
특정 적용에 따르는 최종 형질감염 제형에 바람직한 DNA 농도 및 주어진 양 및 음하전으로부터 출발하여, 전구체 분자의 양 및 물리적 특성(용해도, c.m.c., 등)을 결정한다. 특정 적용은 혈액 성분과의 바람직하지 못한 반응을 피하기 위하여 형질감염 입자들은 양으로 하전되지 않아야 하기 때문에 투여 경로, 예컨대 전신계 또는 정맥내 경로로 정의될 수 있거나, 또는 하전된 입자를 결합시키는데 특이적인 선호도의 고려를 요할 수도 있는 표적화되는 세포로 정의할 수 있다. 전구체 분자로서 적합한 세제를 선별하기 위해, 주어진 세제에 대해 알려지거나 또는 랑뮈르 밸런스(Langmuir balance)의 수단에 의해 결정될 수 있는 그의 임계적 마이셀(c.m.c.)농도가 중요하다. 본 발명의 개념상, 최적의 결과는 세제의 농도가 c.m.c. 이하인 경우에 얻어진다.
성분들은 복합체의 형성을 허용하는 조건하에서 인큐베이션시킨다; 통상 이 복합체들은 단기간 동안, 예컨대 수분 내지 수시간 동안 실온에서 형성될 수 있다. 복합체 파트너들을 혼합시킨 후, 전구체 분자들은 공유적으로 연결되고, 이는 복합체 형성의 속도에 따라 혼합 바로 후 또는 필요한 더 오랜 시간 후에 일어날 수 있다. 연결에 필요한 반응성 그룹들에 따라, 연결은 DNA에 결합되었을 때 전구체 분자들의 접촉시 자발적으로 일어날 수 있다. 별법으로, 연결은 산소 등의 추가의 시약에 의해 매개될 필요도 있다. 조건들은 이들이 DNA 분자들에 영향을 미치지 않도록 함으로써 본 발명에 바람직하게 사용될 수 있는 대부분의 전구체 분자들은 단순히 공기에 의해 다이머화 되거나 또는 올리고머화 될 수 있다.
적합한 반응 조건 및 반응 단계의 시간 경로들은 다양하며, (중간) 반응 산물(복합체 및 축소된 입자들)의 물리적 특성들, 예를 들면 레이저 광 산란에 의해 입도 측정을 모니터링한다.
표적화/엔도솜 용해성 관능기가 존재하거나 또는 전구체 분자 상에 또는 추가의 다이머 불가능한 양이온성 분자들 상에 제공되는 경우, 복합체 형성을 위한 인큐베이션 시간의 부분에서 또는 양이온성 분자들의 개질을 위한 추가의 단계를 도입하는 방법들을 채택해도 좋다.
신규 형질감염 입자를 제조하기 위한 적합한 완충액들은 복합체 형성을 허용하거나 및(또는) 개별 양이온성 전구체 분자들 사이의 공유적 연결 및 임의의 표적화/엔도솜 용해성 관능기에 대한 조건화 혼화성인 임의의 완충액들이다. 최적 pH 값, 인큐베이션 시간, 온도 및 핵산의 농도 및 양이온성 전구체 분자들 및 임의로 표적화/엔도솜 용해를 위한 분자 등의 기타의 변수들은 각각의 개별 실시태양에 의존한다. 이들 변수들은 예를 들면, 핵산 분자를 변형시키지 않는 적절한 시스템 및 적절한 조건들에 한정되기 때문에 전문가에게 과도한 부담을 지우지 않고도 통상의 개별 실험으로 최적화시킬 수 있다. 더욱이, 실시예에서는 용이하게 변형시킬 수 있는 그러한 변수들을 기술하였다. 예를 들면 데칸 친수성 관능기 및 구아니딘 양이온성 관능기를 포함하여 이황화 다리를 제공하는 핵산 분자의 존재하에 시스테인 전구체 분자들을 산화시키기 위한 적합한 변수들은 3회의 진공/산소 대기 주기로부터 산소로 포화시킨 15 mM TrisHCl, pH 8.4의 완충 원액, 60 μM(최종 농도) 플라스미드 DNA의 첨가 전에 첨가되는 90 μM(최종 농도) 양이온성 전구체 분자들이다.
본 발명의 신규한 형질감염 입자들의 바람직한 용도는 치료상의 적용을 위한 핵산의 포유류 세포 내로의 생체내 전달이다.
이 경우 핵산은 치료학상 유효하며, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 치료학상 유효한 단백질을 코딩하는 플라스미드이다. DNA 서열의 의미에서 아무런 제한이 없고 치료에서 유용한 임의의 서열, 예컨대 체세포 유전자 요법 또는 면역 요법에 사용되는 임의의 서열을 사용할 수도 있다. 비제한적인 실시예가 WO 93/07283에 기재되어 있다.
따라서, 추가의 일면에 있어서, 본 발명은 치료학상 유효량의 핵산을 함유한 형질감염 입자들을 포함하는 유전자 전달용 제약 조성물에 관한 것이다.
그러한 제약학적 조성물은 투여전에 새로이 제조된 형질감염 입자들, 또는 찬 액체로서, 동결된 형태로 또는 동결건조된 것으로서 보관될 수 있는 완제품(off-the-shelf)을 포함하며, 안정화제, 저온 보존제 등의 추가의 첨가제를 함유해도 좋다. 적합한 첨가제는 당업계에 공지되어 있으며; 제약학적 조성물을 제형화는 방법에 대하여 Remington's Pharmaceutical Science, 1980을 참조하기 바란다. 본 발명의 실험부에서, 본 발명의 형질감염 입자들을 함유하는 조성물들은 피내 유전자 전달에 효율적인 것으로 밝혀졌다.
바람직한 실시태양에 있어서, 제약 조성물은 피내 투여에 적합하다.
생체내 DNA 전달과는 별도로, 본 발명의 입자들은 큰 DNA 분자, 예컨대 인공 염색체를 포유류 세포 내로 도입시키는데 특히 유용한데, 이것은 제어된 장기간 유전자 발현에 중요할 수도 있다.
생체내 및 시험관내 형질감염을 위해 바람직한 핵산 분자들을 가진 형질감염 입자들의 제제의 킷트의 부분들은 아주 편리함을 제공할 수 있다. 그러한 킷트의 부분들은, 예를 들면 이들의 특성을 최적화하기 위한 상이한 조합으로 사용될 수도 있는 하나 이상의 형태의 양이온성 전구체 분자들, 세포 특이성 표적화/엔도솜 용해성 관능기에 대한 하나 이상의 분자들, 적합한 완충액 및 시험관내 및 생체 내에서 신규한 형질감염 입자들을 제조하거나, 정제하거나 투여하는데 유용한 기타의 시약 또는 기계적 장치를 포함해도 좋다.
이하, 본 발명은 양이온성 전구체 분자 N-데실-2-구아니디늄-시스테인에 대하여 설명한다.
세제 분자는 새로이 고안되었다(실시예 1). 온화한 화학 및 내인성-유사 화합물들에 대한 선호도로 인하여, 티올을 다이머 가능한 관능기로서 선택하고, 시스테인을 다관능성 분자를 제작하기 위한 비독성 수용체 골격으로서 선택하였다. 일단 엔도솜 구획의 내부에 있게 되면 친지성 시스테인 에스테르 또는 아미드 벡터들 모두는 시스테인 및 지방족 알코올 또는 아민으로 재차 효소적으로 분해됨과 동시에 DNA 탈농축 및 가능한 엔도솜 용해가 일어날 것으로 예상할 수 있다.
깨끗한 단일분자 DNA 붕괴가 일반적으로 임계 마이셀 농도 (c.m.c.) 이하의 세제 농도에서만 예상된다. 몇몇 시스테인의 n-알킬 에스테르를 DMAP-촉매화 디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 탈수에 의해 합성하고 이들의 c.m.c.를 Langmuir balance(20 mM MES 완충액, pH 6)을 사용하여 결정하여, 다음의 결과를 제공하였다(N-알킬 쇄 길이/c.m.c.): 도데칸/ 15 μM; 운데칸/ 80 μM; 데칸/ 320μM; 옥탄 1〉2000 μM. 유전자 전달 실험을 위한 대표적인 작업 플라스미드 농도는 50 μM 범위있고, 데칸쇄는 안전한 선택이다. 시스테인 에스테르 일급 아민 관능기의 약염기 성질(pKa=6.8)은 약 염기성 배지 중의 동시적인 DNA 결합(양자화된 세제를 요함) 및 염기합리적인 티올 산화율에는 불충분하다. 따라서, 아민 관능기는 DNA와 강력하게 상호작용하는 것으로 알려진 고도로 염기성인 구아니딘으로 전환시켰다(C10CG+, 도 2).
산화적 세제 다이머화는 DNA의 주형 효과를 감소시키는 것으로 예견되었다(도 1). 빠른 복합체내 반응(intracomplex reaction)은 DNA 결합에 앞서 세제의 지질로의 광범위한 다이머화는 시스템을 고전적인 양이온 지질/DNA 복합체 형성/응집 과정으로 되돌리기 때문에 작고 안정한 입자의 형성에 대한 중대한 관점이다(도 3).
c.m.c. 이하에서, 주된 인력은 단리된 양이온성 양친성 분자들을 향한 음이온성 DNA의 것이다. 산화에 앞서, 따라서 복합체들은 세제가 약간 과량일 때 조차도 전자중성에 근접해야 한다. 따라서, 플라스미드 DNA (15 mM TrisHCl pH 8.4 중의 60 μM)를 C10CG+(90μM 까지) 혼합하고 호기성 조건하에서 24 시간 동안 방치시켰다. 즉석의 복합체 형성 단계 동안, 260 nm에서 중심을 이룬 DNA의 대표적인 UV 흡수 스펙트럼은 15%까지 증가되었고; 산화동안 아무런 변화(이황화물 흡수에 대해 한번 보정한 후) 및 아무런 혼탁도 관찰되지 않았다. 복합체의 CD 스펙트럼은 B-DNA 의 전형으로서, 복합체 중의 결정성 Y-DNA 상의 발생을 제거하였다. 이는 24 시간에 걸쳐 시간 의존적으로 남아 있었다. 그러나, 안정성의 가장 엄밀한 시험은 생리학적으로 적절한 이온 농도에서 수행된 것으로, 양이온성 지질/DNA 복합체들은 응집된 것으로 나타났다. 현저하게, (C10CG+)2/DNA 복합체의 UV 스펙트럼은 150 mM NaCl 중에서 3일 후에 변하지 않고 남아 있었다. 따라서, 분광학은 작고 안정한 양친성/DNA 복합체의 형성에 대한 간접적인 증거를 나타냈다.
이들 복합체의 비여과 용액의 투과 전자현미경(TEM)은 놀랍게도 약간 큰 구조를 가진 거의 구형인 대상물(71% 단량체, n=109)의 균질한 집단을 나타내었다(도 4a). 더욱이, 더 큰 구조들은 명백히 다이머이거나(도 4b) 또는 우연히 발생한 올리고머들이었고 양이온성 지질 do3로서 더욱 친밀히 융합된 응괴로 병합되는 경향을 나타내지 않았다. 세제의 농도를 C10CG+의 c.m.c. 이상으로 단계적으로 올리자 발상하의 가설에 일치되게 시간 의존적인 응집으로 인하여 덜 선명한 UV 및 TEM 결과들이 초래되었다(데이터는 나타내지 않음). 최대로 확대시(도 4c) 입도는 23±4 nm로 측정되었다. 대표적인 DNA 및 양친성 분자 크기를 사용한 거친 순환에 의해 5.5 Kbp 플라스미드의 부피들을 5,500 지질 분자의 것에 첨가하였을 때 28nm 직경의 구가 초래되었다. 따라서 TEM 은 단일분자 DNA 붕괴에 대한 강력한 증거를 제공하였다.
일련의 실험에 있어서, 분해에 대한 복합체 DNA의 안정성 뿐만 아니라 복합체 형성의 가역성은 전기영동에 의해 평가하였다(도 5).
추정하기로는 침전이 일어난 c.m.c. 이상의 농도를 제외하고는(데이터로 나타내지 않음) C10CG+은 DNA 이동을 저지할 수 없었던 반면, 산화된 (C10CG+)2/DNA 입자들은 이동하지 않았고 전기영동 동안 안정하였다(도 5, 레인 2). 여전히 양이온성 지질/DNA 입자들은 과량의 황산 도데실 나트륨 세제(SDS. 레인 3)으로 또는 지질을 과량의 환원 디티오트레이톨(DTT, 레인 4)를 가진 원래의 C10CG+세제로 다시 전환시키는 것 중 어느 하나에 의해 파괴시킬 수 있었다. 세포 배양 배지 중에 존재하는 혈청 뉴클레아제들은 초나선형 플라스미드 DNA(레인 1 및 8)을 많은 틈(nick, 레인 5)를 가진 단편의 얼룩으로 급격히 분해시켰다. 그러나 지질/DNA 입자들은 이 배지 중에서 (레인 6) 물리적으로 안정하였고, 플라스미드가 본질적으로 더 느리게 이동하는 환형의 이완된 형태로 전환됨에 따라(SDS 처리 후에 나타남, 레인 7) 핵산을 분해로부터 상당히 보호하였다.
3-배 과량의 세제로 형성시킨 양이온성 입자들을 사용한 초기의 실험은 BNL CL 2 쥐의 간세포에서 유전자 발현을 초래하였는데 이는, 일단 세포에서, 복합체의 운명은 비-바이러스성 벡터의 것이었음을 확인시켜준다. 추가의 실험은 폴리양이온 접합체 또는 폴리양이온-리간드 접합체 또는 불활성화된 아데노바이러스를 함유한 입자로 피복된 DNA 복합체를 사용하여 시험관내 발현을 입증하였다. 또한, 피내 복합체 전달 후 생체내 유전자 발현을 입증할 수 있었다.
실시예 1
a) 친지성 구아니딜-시스테인 아미드 세제의 합성
친지성 화합물의 합성은 도 2 에 나타낸 도식에 따라 수행하였다.
단계 1
N-tert-부톡시카르보닐-피라졸-1-카르복시아미딘의 제조
디클로로메탄 11.3 ml 중의 디-tert-부틸 디카르보네이트 7.43g(33 mmol)의 용액에, N,N-디이소프로필에틸아민 11.3 ml (66 mmol) 및 1H-피라졸-1-카르복스아미딘 하이드로클로라이드 4.40g (30 mmol)을 첨가하였다. 이 용액을 3 시간 동안 실온에서 교반시킨 다음 증발 건조시켰다. 얻은 백색의 고체를 에틸아세테이트 200 ml 중에 용해시키고, 유기 상을 5% (w/w) 탄산 수소 나트륨으로 세척하고 황산 마그네슘 상에서 건조시키고 마지막으로 증발 건조시켰다. 잔류물을 끓는 헥산 중에 용해시켰다. 이 용액을 실온에서 밤새 방치시키고 이이서 4℃에서 24 시간 동안 보관하였다. 이와 같이 형성된 결정들은 여과에 의해 희석하고 찬 헥산(0 ℃) 중에서 세척하였다. 건조후, 백색 결정 5.28g을 얻었다(25 mmol 수율=84%).
C9H14O2; 210,24 g/mol
TLC: Rf(20% AcOEt/헥산)= 0.3
역상의 TLC: Rf (60% CH3CN/30% H2O/10% MeOH)= 0.5
(여기 및 기타의 NMR 스펙트럼에서, 신호에 할당된 수소 원자는 굵은 활자체이다.)
MS(FAB+), m/z: 211,1[MH+]; 155,0 [MH+-t-부틸].
단계 2
N,N'-비스-tert-부톡시카르보닐-피라졸-1-카르복스아미딘
테트라히드로푸란 70 ml 중의 수소화나트륨 1.60g (40 mmol)의 현탁액에 0℃에서 N-tert-부톡시카르보닐-피라졸-1-카르복스아미딘 2.10g(10 mmol)을 첨가하였다. 이 현탁액을 0 ℃에서 1 시간 동안 강하게 교반시켰다. 이어서 디-tert-부틸 디카르보네이트 4.5g (20mmol)을 첨가하고 실온에 위치시킨 다음 점차로 환류 온도까지 가열시켰다. 환류하에서 하룻밤 후 반응 매질을 0 ℃까지 냉각시키고; 아세트산 2.3 ml을 첨가하고 용액을 15 분 동안 교반시켰다. 유기 상을 5%(w/w) 탄산수소나트륨 60 ml, 포화 NaCl 용액 60 ml로 세척하고 황산 마그네슘 상에 건조시키고 증발 건조시켰다. 얻은 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(헥산 중의 5 내지 15% 에틸아세테이트 구배)에 의해 정제하여 백색 고체 2.48g을 얻었다(8.0 mmol, 수율=80%).
C14H22N4O4; 310.36 g/mol
TLC: Rf(20% AcOEt/헥산)= 0.3
역상의 TLC: Rf (60% CH3CN/30% H2O/10% MeOH)= 0.4
단계 3
N,S-비스-tert-부톡시카르보닐시스테인-데실아민의 제조
디클로로메탄 6 ml 및 테트라히드로푸란 200 ㎕ 중의 N,S-비스-부톡시카보닐시스테인 1g (3.11 mmol)의 용액에 N-히드록시숙신이미드 430 mg (3.73 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 713 mg(3.42 mmol)을 첨가하였다. 0℃에서 2 시간 동안 반응시킨 후, 데실아민 680 ㎕ (3.42 mmol)을 도입시키고 용액을 주위 온도에서 6 시간 동안 교반시켰다. 이어서 반응 매질을 여과하고 증발 건조 시킨 후 에틸아세테이트 200 ml 중에 용해시켰다. 유기 상을 순서대로 5%(w/w) 탄산 수소 나트륨 100 ml, 물 100 ml, 0.5M 시트르산 100 ml, 물 100 ml로 세척하고 이어서 황산 마그네슘 상에서 건조시키고 이어서 건조 증발시켰다. 얻어진 잔류물을 실리카 크로마토그래피(디클로로메탄 중의 1 내지 3% 메탄올 구배)에 의해 정제하여 투명 오일 1.27g을 얻었다(2.75 mmol, 수율=88%).
단계 4
S-tert-부톡시카르보닐시스테인-데실아미드의 제조
N,S-비스-tert-부톡시카르보닐-L-시스테인-데실아민 461 mg (1 mmol)을 2N HCl/AcOEt 3 ml에 0 ℃에서 첨가하고 1 시간 동안 교반시켰다. 이 용액을 건조 증발시키고 에틸아세세이트 100 ml 중에 용해시켰다. 유기 상을 5%(w/w) 탄산 수소 나트륨으로 2회 세척하고 황산 마그네슘 상에 건조시키고 증발 건조시켰다. 얻은 오일을 실리카 크로마토그래피(디클로로메탄 중의 0 내지 3% 메탄올 구배)에 의해 정제하여 투명 오일 233 mg을 얻었다(0.65 mmol, 수율=65%).
단계 5
N,N'-비스-tert-부톡시카르보닐-구아니딜-S-tert-부톡시카르보닐시스테인-데실아미드의 제조
N,N'-비스-tert-부톡시카르보닐-피라졸-1-카르복스아미딘 178 mg (0.572 mmol)을 아세토니트릴 3 ml 중의 S-tert-부톡시카르보닐시스테인-데실아미드 227mg (0.630 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2 일 동안 교반시킨 다음 건조시켰다. 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(헥산 중의 10-15% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 백색 고체를 얻었다(281 mg; 0.47 mmol, 81%).
단계 6
a) 구아니딜-시스테인-데실아미드(C10CG+)의 제조
N,N'-비스-tert-부톡시카르보닐-구아니딜-S-tert-부톡시카르보닐시스테인-데실아미드 60 mg (0.1 mmol)을 트리플루오로아세트산 1 ml 중에 용해시키고 아르곤 분위기하의 실온에서 2 시간 동안 교반시켰다. 혼합물을 건조시키고 얻어진 무색의 오일을 중수에탄올 1 ml 중에 용해시켰다. 얻어진 0.1 M 원액을 -80 ℃에서 아르곤 분위기하에 보관하였다. 티올 함량은 Riddles et al의 방법에 따라 엘만(Elmann's) 시약으로 결정하였다(87%).
b) 시스테인 세제 C10CG+의 시스테인 지질(C10CG+)2로의 산화율을 주형 DNA의 존재하에서 더 빠르다. 완충 원액 (TrisHCl 15 mM pH 8.4)를 3회의 진공/산소 주기에 의해 산소로 포화시켰다. C10CG+을 원액으로부터 90μM의 최종 농도로 주사하였다. 각 시점에서 0.5 ml 분취량을 제거하여 2X 엘만시약(Elmann's reagent)과 혼합시켰다. 잔류 유리 티올을 Riddles et al(1979)에 따라 분광학적으로 정량화하였다. 주형 실험을 위해, pCMVL 플라스미드 DNA(WO 93/07283호에 기술된 대로 제조함)을 세제의 첨가 전에 60 μM의 최종 농도로 첨가하였다. 이 실험의 결과는 도 3에 나타냈다.
c) 투과 전자 현미경 (도 4)
(C10CG+)2양이온성 지질/DNA 입자의 미여과 용액의 투과 전자현미경은 (a) 매우 균질한 집단, 약 23 nm의 직경을 가진(c,d) 구(b)를 나타낸다; 눈금자는 모든 도면에 대해 100 nm에 해당한다. 시료 용액은 세제(90μM 최종 농도)를 HEPES 완충액 (15 mM, pH 7.4) 중의 60 μM pCMVL DNA 용액에 첨가하고 이 용액을 호기성 조건하에서 밤새 방치함으로써 제조하였다. 탄소 피막을 새로이 분해시킨 마이카 상에서 승화에 의해 제조하여 Cu/Rh 그리드 상에서 부유에 의해 회수하였다(300 메쉬, Touzard＆Matignon, France). 밤새 건조시킨 후, 그리드들을 페트리 디쉬 중의 블롯팅지 상에 보관하였다. 시료 추가 직전에, 그리드들을 글로우-방전시켰다(110 mV, 25 s). 한 방울의 시료액(5 ㎕)을 그리드 상에 1 분 동안 남겼다. 복합체들은 20초 동안 30㎕ 수용성 우라닐아세세티이트 (1% w/w)로 음으로 염색하고, 과량의 액체는 블롯팅지로 제거하였다. 관찰은 Phillips EP 410 투과 전자현미경으로 80 kV에서 수행하였다. 유사한 결과가 0.15 M NaCl에서 관찰한 복합체에서 얻어졌다(도 4).
d) (C10CG+)2/DNA 복합체의 물리 및 화학적 안정성(도 5)
0.4 ㎍(레인 1-4) 또는 0.2 ㎍ (레인 5-8) pCMV-luc 플라스미드 DNA를 함유하는 20 ㎕ 시료의 1% 아가로스 겔 전기영동(40mM Tris-아세테이트 완충액, pH 8 중의 8V/cm에서 90분). 복합체들은 100-배 농축시킨 C10CG+세제 용액(90 μM 최종 농도)를 HEPES 완충액 (15 mM, pH 7.4) 중의 플라스미드 (60 μM)의 용액에 첨가함으로써 제조하였다. 이 용액을 가볍게 한번 혼합시키고 24 시간 동안 방치시켜 산화시켰다. 레인 1: 60 μM 플라스미드, 레인 2: 60 μM 산화된 (C10CG+)2/DNA 복합체, 레인 3, 부하전에 3 mM 최종 황산 도데실 나트륨 중의 레인 2와 동일, 레인 4: 부하전에 6 mM 중의 디티오트레이톨 중의 레인 2화 동일. 레인 5: 10% 혈청을 함유한 동일한 부피의 DMEM 세포 배지로 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션시킨 60 μM 플라스미드. 레인 6: 레인 5와 같이 인큐베이션시킨 산화된 (C10CG+)2/DNA 복합체, 레인 7: 부하전에 황산 도데실 나트륨 최종 농도 3 mM 중의 레인 6과 같음. 레인 8: 30 μM pCMV-luc 플라스미드 DNA.
e) C10CG+로 농축된 DNA 입자들의 나노크기화
복합체들은 Tris-HCl (15 mM, pH 8.4) 중의 15 μM의 농도의 플라스미드 CMV-luc (5.6 kbp), λ 파아지 DNA (48 Kbp) 및 T4 DNA (167 Kbp)로 형성시켰다. 24 시간의 인큐베이션 후, 측정을 수행하였다. 그 결과를 도 6에 나타냇다(도 6A: 파아지 람다. 도 6B: 파아지 T4, 도 6C: CMV-luc. 1 eq.=30 μM; 1.2 eq.=36 μM; 1.4 eq.=42μM)
DNA 분자의 단일분자 농축의 경우에 형성된 펩티드의 부피는 DNA 길이에 직접 비레한다. 부피=상수 x /DNA의 길이(bp)
구형 입자들의 경우에 부피는 직경의 3제곱에 비례하며(vol=4PiR3/3), 이는 다음의 방정식으로 나타낼 수 있다: 입경= 상수 x (DNA의 길이(bp))1/3. 상이한 DNA들로부터 유도한 최소 입도(7B)는 이들의 크기의 세제곱근의 함수로 나타냈을 때(도 7A), 기원을 포함한 점들을 통해 직선을 그을 수 있다. 이는 단일분자 농축에 대한 증거이다.
f) 친지성 알코올 시스테인 아미드 (C10CG+)/DNA 복합체의 세포주 BNL CL.2 내로의 형질감염
형질감염 24 시간 전에 세포들(ATCC로 부터 입수)을 24 웰 플레이트(웰당 50,000 세포)에 분배하였다. 세포들을 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM, GIBCO), 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신(GIBCO, 100 국제 단위의 페니실린( GIBCO), 0.286 g/ml의 글루타민(글루타맥스, Lancaster) 중에서 75-cm2플라스크 (Costar) 중에 37℃에서 5% CO2-함유 대기 중에서 배양시켰다.
플라스미드 CMV-luc과의 복합체는 농축된 C10CG+용액의 분취량을 산소-포화된 Tris-HCl 15 mN, pH 8.4 중의 플라스미드 (30 μM bp)의 용액에 첨가함으로써 형성시켰다. 이어서 이 용액을 산소 대기 중에서 24 시간 동안 인큐베이션시켰다. 형질감염 직전에, 배지를 혈청이 없는 새로운 배지로 교체하였다. 복합체를 함유한 형질감염 용액 100㎕을 각 웰에 첨가하였다(2 ㎍ DNA). 형질감염 3 시간 후에, 1% 혈청을 첨가하고, 1 시간 후에 9% 혈청을 첨가하였다. 형질감염 6 시간 후에, 형질전환된 배지를 10% 혈청을 보충한 배지로 교체하였다. 24시간 후 루시퍼라아제 발현을 상업적으로 입수 가능한 킷(Promega)을 사용하여 발광측정기(Berthold)에서 검사하였다. 각 실험은 2회 반복하였으며, 그 결과들은 단백질 mg 당 빛 단위로 나타냈다(비신초닌산 (BCA 시험), Pierce). 내부 표준으로서 PEl(폴리에틸렌아민, 25 kDa)의 10 하전 상당량을 포함하는 DNA 복합체를 사용하였다(도 8).
실시예 2
a) 친지성 알코올 시스테인 세제의 합성
이 합성은 도 9에 나타낸 반응도에 따라서 수행하였다.
단계 1
N,S-비스-tert-부톡시카르보닐-L-시스테인의 제조
L-시스테인 클로로하이드레이트 945 mg(6 mmol)을 가스를 진공에 의해 제거한 탈이온수 10 ml 중에 용해시켰다. THF 10 ml 및 트리에틸아민 5.4 ml (39 mmol) 중의 BocOBoc 2.625 g(12 mmol)을 이 용액에 첨가하였다. 아르곤 분위기 및 주위 온도에서 2 시간 동안 교반시킨 후, 반응 배지를 10 ml 보다 약간 적은 부피로 증발시켰다. 이어서, 탈이온수 10 ml을 첨가하고 수층을 잔류 미반응 BocOBoc를 제거하기 위하여 에테르로 세척하였다. 이어서 수층을 포화 시트르산으로 pH 3으로 산성화시키고, 에테르로 추출하였다( 3 x 60 ml). 에테르 층들을 0.5 M 시트르산으로 세척하고(2 x 100 ml), MgSO4상에서 건조시키고 증발시켰다. 실리카 컬럼 상의 크로마토그래피(0% 내지 2%의 CH2Cl2/1% 아세트산을 함유한 MeOH 구배로 용출함)에 의해 N,S-비스-tert-부톡시카르보닐-시스테인 1.34 g을 얻었다(4.2 mmol, 수율=70%).
TLC: Rf (CH2Cl2, MeOH 5%, AcOH 1%)= 0.5
얻은 생성물의 구조는 핵자기 공명 NMR1H(CDCl3) 및 화학적 이동δ(ppm)에 의해 확인하였다:
단계 2
N,S-비스-tert-부톡시카르보닐-L-시스테인의 친지성 알코올 에스테르의 제조
무수 디클로로메탄 2.5 ml 중의 친지성 알코올 1.2 mmol의 용액에 N,S-비스-tert-부톡시카르보닐-L-시스테인 321 mg (1 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 24 mg(0.2 mmol)을 첨가하였다. 이어서 용액을 0℃까지 냉각시키고 DCC 268 mg(1.3 mmol; 또는 EDC)을 첨가하였다. 용액을 0℃에서 2 시간 동안에 이어서 실온에서 밤새 교반시켰다. 이어서 반응 매질을 증발 건조시키고 잔류물을 에틸아세테이트 10 ml 중에 현탁시켰다. 현탁액을 여과하고 여액을 에틸 아세테이트 10ml 중에 현탁시켰다. 유기층을 증류수 20 ml, 5% 탄산 나트륨 수용액 20 ml 및 증류수 20 ml로 세척하였다. 유기층을 MgSO4 상에 건조시키고 이어서 증발 건조시켰다. 얻은 오일을 최종적으로 실리카 칼럼(0 % 내지 7%의 헥산/에틸아세테이트로 용출) 상에서 크로마토그래피시켜 투명 오일을 얻었다. C10 시스테인(n=2)의 경우에 73%의 수율을 얻었다. TLC(헥산, AcOEt 10%) Rf=0.50.
얻어진 생성물의 구조는 다음과 같이 핵자기 공명 NMR1H(CDCl3) 및 화학적 이동δ(ppm)에 의해 확인하였다.
단계 3
친지성 알코올 시스테인 에스테르의 제조
트리플루오로아세트산 1.5 ml 중에 용해된 N,S-비스-tert-부톡시카르보닐-L-시스테인의 친지성 알코올 에스테르 0.2 mmol을 아르곤 분위기 하에서 1 시간 동안 교반시켰다. 반응 매질을 증발시키고 얻은 투명 오일을 1ml 중수-에탄올 중에 용해시키고 -80℃에서 아르곤 분위기 하에서 유지시켰다. Ellman's 시약을 사용한 티올 그룹들의 측정(Riddles et al., 1979)은 탈보호 반응이 정량적이었음을 나타냈다.
C10 시스테인의 경우에(n=2): 얻어진 생성물의 구조는 다음과 같이 핵자기 공명 NMR1H(CDCl3) 및 화학적 이동δ(ppm)에 의해 확인하였다: 0.91(t, J=6.8 Hz, 3H, H5); 1.24-1.48(m, 14H, H3, H4); 1.66-1.78 (m, 2H, H2); 3.06-3.22 (m, 2H, Ha); 4.18-4.40 (m, 3H, Hb, H1)
MS(FAB+): 262.2 (MH+).
b) DNA를 포함 및 포함하지 않는 친지성 알코올 시스테인 에스테르의 임계 마이셀 농도(c.m.c.)의 측정.
c.m.c.의 측정은 DTT 10 mM을 함유하는 MES 완충액 (20 mM, pH 6) 중에서 Langmuir 밸런스로 수행하였다. 표면 장력을 세제 농도의 로그 함수로 나타냈을 때, c.m.c.에서 중단(break)이 관찰되었다(도 10).
이 방법을 적용하여 상이한 길이(C8, C10, C11, C12)를 갖는 화합물의 c.m.c.를 결정하였다.
Cn-시스테인 CMC
C8 〉2mM
C10 320 μM
C11 80 μM
C12 15 μM
ii) DNA를 포함 및 포함하지 않는 C10 및 C11의 c.m.c.
상기한 바와 유사한 방식으로 C10 시스테인 및 C11 시스테인의 c.m.c.를 결정하였으며, 완충액은 30 μM bp의 소 흉선 DNA를 함유하였다(도 11 A,B).
Cn시스테인 DNA 없는 CMC DNA 있는 CMC
C10 320 μM 50μM
C11 80μM 32μM
c) DNA를 포함 및 포함하지 않는 C10 시스테인의 산화.
C10 시스테인의 산화 속도는 Ellman 시약을 사용하여 시간의 함수로서 티올 그룹을 측정하였다(Riddles et al., 1979). 측정은 DNA 가 없는 또는 30 μM bp CMV-luc의 존재하에서 MES 20 mM pH 6 중의 60 μM C10 시스테인의 용액 중에서 수행하였다(도 12).
실시예 3
구아니딜-시스테인 에스테르 세제의 친성 알코올의 합성
합성은 도 13에 나타낸 도식에 따라 수행하였다.
단계 1
S-tert-부톡시카르보닐시스테인-데실에스테르의 제조
N,S-비스-tert-부톡시카르보닐-시스테인-데실에스테르 231 mg(0.5 mmol)을 2.2N HCl/AcOEt 1.1 ml 중에 용해시켰다. 이 용액을 주위 온도에서 1 시간 동안 교반시키고 증발 건조시켰다. 얻어진 잔류물을 에틸아세테이트 50 ml 중에 용해시켰다. 유기층을 5%(w/w) 탄산 수소 나트륨 25 ml로 2 회 세척하고, 황산 마그네슘 상에서 건조시키고 증발 건조시켰다. 얻어진 오일을 실리카 크로마토그래피(디클로로메탄 중의 0 내지 3% 메탄올 구배)에 의해 정제하여 황색 오일 141 mg을 얻었다(0.39mmol, 수율=78%)
단계 2
N,N'-비스-tert-부톡시카르보닐-구아니딜-S-tert-부톡시카르보닐시스테인-데실에스테르의 제조
아세토니트릴 1 ml 중의 S-tert-부톡시카르보닐시스테인-데실에스테르 99 mg (0.275 mmol)의 용액에 N,N'-비스-tert-부톡시카르보닐-피라졸-1-카르복스아미딘 78 mg(0.25 mmol)을 첨가하였다. 반응 배지를 주위 온도에서 2 일 동안 교반시킨 다음 증발 건조시켰다. 얻어진 잔류물을 실리카 크로마토그래피(헥산 중의 0-7% 에틸 아세테이트 구배)에 의해 정제하여 투명 오일을 얻었다(127 mg; 0.21 mmol, 84%).
단계 3
구아니딜-시스테인-데실에스테르의 제조
트리플루오로아세트산 1 ml 중의 N,N'-비스-tert-부톡시카르보닐-구아니딜-S-tert-부톡시카르보닐시스테인-데실에스테르 30 mg (0.05 mmol)을 아르곤 분위기하의 주위 온도에서 2 시간 동안 교반시켰다. 반응 매질을 증발 건조시키고 얻어진 투명 오일을 중수에탄올 1 ml 중에 용해시켰다. 얻어진 원액을 -80 ℃에서 아르곤 분위기하에 보관하였다. 반응물의 수율은 티올 관능기의 양을 엘만 시약(Riddles et. al., 1979)을 사용하여 측정함으로써 결정하였다. 반응 수율은 80%이었다.
실시예 4
친지성 오르니틸-시스테인 아미드 세제의 합성
합성은 도 14에 나타낸 반응식에 따라 수행하였다.
단계 1
S-tert-부톡시카르보닐시스테인 하이드로클로라이드의 제조
N,S-비스-tert-부톡시카르보닐-L-시스테인 642 mg (2 mmol)을 2.9 N HCl/AcOEt 3 ml에 용해시키고 이 용액을 주위 온도에서 20 분 동안 교반시켰다. 에테르 3 ml을 반응 매질에 첨가하고 얻어진 결정들을 여과에 의해 수집하고 에테르로 세척하고 마지막으로 진공하에서 건조시켰다. 이에 의해 백색 결정 405 mg을 얻었다(1.57 mmol, 수율=79%).
단계 2
N,N'-비스-tert-부톡시카보닐오르니틸-S-tert-부톡시카르보닐시스테인의 제조
디클로로메탄 1 ml 중의 N,N'-비스-tert-부톡시카보닐오르니틴 160mg (0.48 mmol)의 용액에 N-히드록시숙신이미드 60 mg (0.52 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 99 mg(0.48 mmol)을 첨가하였다. 0℃에서 2 시간 동안 교반시킨 후, 트리에틸아민 234 ㎕ (1.68 mmol)을 포함하는 메탄올 1 ml 중에 용해시킨 S-tert-부톡시카르보닐시스테인 130 mg(0.50 mmol)을 첨가하고, 이어서 용액을 주변 온도에서 밤새 교반시켰다. 이어서 반응 매질을 증발 건조시킨후 에틸아세테이트 10 ml 중에 용해시키고 여과하였다. 에틸 아세테이트 50 ml로 희석시킨 후, 여액을 5%(w/w) 시트르산으로 2회 세척하고, 황산 마그네슘 상에서 건조시키고 이어서 건조 증발시켰다. 얻어진 잔류물을 실리카 크로마토그래피(디클로로메탄 중의 2 내지 15% 메탄올 구배)에 의해 정제하여 백색 고체 242 mg을 얻었다(0.45 mmol, 수율=94%).
단계 3
N,N'-비스-tert-부톡시카보닐오르니틸-S-tert-부톡시카르보닐시스테인-n-알킬아미드의 제조
디클로로메탄 0.5 ml 중의 N,N'-비스-tert-부톡시카보닐오르니틸-S-tert-부톡시카르보닐시스테인의 용액에 N-히드록시숙신이미드 26 mg (0.224 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 42 mg(0.205 mmol)을 첨가하였다. 0℃에서 2 시간 동안 교반시킨 후, n-알킬아민 0.205 mmol)을 도입시킨 후 용액을 주변 온도에서 밤새 교반시켰다. 이어서 반응 매질을 증발 건조시킨후 에틸아세테이트 5 ml 중에 용해시키고 여과하였다. 에틸 아세테이트 25 ml로 희석시킨 후, 여액을 물 10 ml, 5%(w/w) 탄산 수소 나트륨 10 ml, 및 물 10ml로 순서대로 세척하고, 황산 마그네슘 상에서 건조시키고 이어서 건조 증발시켰다. 얻어진 잔류물을 실리카 크로마토그래피(디클로로메탄 중의 0 내지 1% 메탄올 구배)에 의해 정제하여 백색 고체를 얻었다.
N.N'-비스-tert-부톡시카르보닐오르니틸-S-tert-부톡시카르보닐시스테인-도데실아미드의 경우에 백색 고체 85 mg을 얻었다(0.121 mmol, 수율= 65%).
단계 4
오르니티닐-시스테인-n-알킬아미드의 제조
트리플루오로아세트산 1 ml 중의 N,N'-비스-tert-부톡시카르보닐-오르니틸-S-tert-부톡시카르보닐시스테인-n-알킬아민 0.11 mmol을 아르곤 분위기 하의 주위 온도에서 1.5 시간 동안 교반시켰다. 반응 매질을 증발 건조시키고 얻어진 투명 오일을 중수에탄올 1 ml 중에 용해시켰다. 용액을 -80 ℃에서 아르곤 분위기하에 보관하였다. 반응물의 수율은 티올 관능기의 양을 엘만 시약(Riddles et. al., 1979)을 사용하여 측정함으로써 결정하였다. 오르니틸-시스테인-도데실아민의 경우에, 수율은 84%이었다.
실시예 5
친지성 알코올 갈락토실-시스테인 에스테르 세제의 합성
합성은 도 15에 나타낸 반응식에 따라 수행하였다.
단계 1
S-tert-부톡시카르보닐시스테인-브로모아세트아미드-데실에스테르
디클로로메탄 1 ml 중의 S-tert-부톡시카르보닐시스테인-데실에스테르 108 mg(0.30 mmol)의 용액에, 트리에틸아민 63 ㎕ (0.45 mmol)의 용액에 이어 브로모아세트산 무수물 86 mg(0.33 mmol)을 첨가하였다. 반응 매질을 주위 온도에서 1 시간 동안 교반시키고 이어서 증발 건조시켰다. 얻어진 잔류물을 실리카 크로마토그래피(헥산 중의 5 내지 10% 에틸아세테이트 구배)에 의해 정제하여 투명 오일 88 mg을 얻었다(0.18 mmol, 수율=61%).
단계 2
S-tert-부톡시카르보닐시스테인-티오갈락토아세트아미드-데실에스테르의 제조
디메틸포름아미드 1 ml 중의 S-tert-부톡시카르보닐시스테인-브로모아세트아미드-데실에스테르 48 mg (0.1 mmol)의 용액에, 1-티오-D-칼락토피라노오스 23 mg (0.1 mmol)을 첨가하였다. 용액을 주위 온도에서 3 시간 동안 교반시킨 후 증발 건조시켰다. 얻어진 잔류물을 실리카 크로마토그래피(디클로로메탄 중의 3 내지 20% 메탄올 구배)에 의해 정제하여 유리상 고체 52 mg을 얻었다(0.087 mmol, 수율=87%).
단계 3
시스테인-티오갈락토실아세트아미드-데실에스테르의 제조
트리플루오로아세트산 1 ml 중의 S-tert-부톡시카르보닐시스테인-티오갈락토실앗트아미드-데실에스테르 49mg (0.082 mmol)을 아르곤 분위기하의 주위 온도에서 1.5 시간 동안 교반시켰다. 이어서, 반응 매질을 증발 건조시키고 얻어진 오일을 중수에탄올 중에 용해시켰다. 용액을 -80 ℃에서 아르곤 분위기하에 보관하였다. 반응물의 정량은 티올 관능기의 양을 엘만 시약(Riddles et. al., 1979)을 사용하여 측정함으로써 결정하였다.
실시예 6
비-지질 분자에 의해 안정화되는 단분산 DNA 형질감염 입자들을 형성하기 위하여, 스퍼민-N1, N12-비스-시스테인아미드(SC2)에 기초한 별도의 벡터형을 합성하였다.
이 분자는 아미드 결합을 통해 유리 티올 관능기를 가진 2-시스테인 분자에 연결된 스퍼민 분자로 이루어져 있다.
a) 스퍼민-N1,N12-비스-시스테인아미드의 합성
N,N-비스-tert-부톡시카르보닐-N,N'-(2-시아노에틸)-1,4-디아미노부탄 2
1.4-디아미노부탄 1 2ml(20 mmol)을 함유하는 용액에, 아세토니트릴 10 ml 중의 아크릴로니트릴 2.63 ml (40 mmol)을 아르콘 분위기 하에서 주변 온도에서 교반시키고, 어둠하에 노출시켰다. 18 시간의 교반후, BocoN 10.835 g (44 mmol) 및 트리에틸아민 6.2 ml(44 mmol)을 이 용액에 도입시켰다. 3일 후, 반응 매질을 에테르 100 ml 중에 희석시켰다. 유기 층을 2 M NaOH (2 x 50 ml), 증류수 50 ml 및 5%(w/w) 시트르산 50 ml로 세척하였다. 이어서, 유기층을 MgSO4상에서 건조시키고 증발시켜 백색의 고상물 4.27g을 얻었다. 후자를 에테르 중에서 결정화시켜서 백색 결정의 형태로 화합물 2 3.50g을 얻었다(8.9mmol, 수율=44%).
(신호에 할당된 수소 원자는 굵은 활자체이다.)
N,N'-비스-tert-부톡시카르보닐-N,N-(2-아미노프로필)-1,4-디아미노부탄 3.
메탄올 6 ml 및 2M NaOH 2 ml 중의 N,N-디-tert-부톡시카르보닐-N,N'-(2-시아노에틸)-1,4-디아미노부탄 2 1.176g (3 mmol)을 수소 분위기 하에서 촉매량의 라니 니켈의 존재하에서 교반시켰다. 4 시간 동안 교반시킨 후, 니켈을 셀라이트 여과에 의해 제거하였다. 여액을 증발시키고, 얻어진 잔류물을 디클로로메탄 50 ml 중에 재현탁시켰다. 이어서 유기층을 2M NaOH 50 ml로 세척하고, MgSO4상에 건조시키고 증발시켜 황색 점성 액체의 형태로 화합물 3 810 mg을 얻었다(2 mmol; 수율=67%).
C20H42N4O4: 402.58 g/mol
TLC: Rf (CH2Cl220%/MeOH 60%, NEt320%)= 0.4
스퍼민-N4,N9-비스-tert-부톡시카르보닐-N1,N12-비스-시스테인(N,S-비스-tert-부톡시카르보닐)아미드 6
디클로로메탄 1.5 ml 중의 N,N'-비스-tert- 부톡시카르보닐-N,N'-(2-아미노프로필)-1,4-디아미노부탄 3 242 mg(0.6 mmol) 및 N,S-비스- tert-부톡시카르보닐-시스테인 388 mg (1.2 mmol)을 함유하는 용액에, 디클로로메탄 1.5 ml 중에 용해된 DCC 248 mg(1.2 mmol)을 첨가하였다. 용액을 형성된 DCU를 제거하기 위해 1 일동안 교반시키킨 후 여과하였다. 잔류물을 에틸아세테이트 100 ml 중에 재현탁시키고, 증류수 100 ml, 0.5 M 탄산 나트륨 수용액 100 ml, 포화 NaCl 수용액 100 ml, 0.2 M 시트르산 수용액 100 ml, 및 마지막으로 포화 NaCl 수용액 100 ml로 세척하였다. 유기층을 MgSO4상에 건조시키고 증발시켰다. 생성물을 실리카 칼럼에 전개하여 화합물 6 401 mg을 백색 고체의 형태로 얻었다(0.4 mmol; 수율=66%).
스퍼민-N1,N12-비스-시스테인아미드 7
트리플루오로아세트산 1 ml 및 디클로로메탄 1 ml 중에 용해된 화합물 6 50mg(0.05 mmol)을 아르곤 분위기하에 2 시간 동안 교반시켰다. 반응 매질을 증발시키고 황색 점성 액체 85 mg을 얻었다. 생성물을 트리플루오로아세트산 약 11 당량의 존재하에 유지시켜 관능성 티올 그룹들의 산화를 피하였다. Ellman's 시약을 사용한 티올 그룹들의 측정(Riddles et al., 1979)은 탈보호 반응이 정량적이었음을 나타냈다.
b) 스퍼민-N1,N12-비스-시스테인아미드의 생물리학적 특성화
i) UV 분광학
형성된 입자들의 UV 분광학에 의한 특성화는 다른 이유로 인해 수행하였다. 용액 중의 DNA는 240 내지 310 nm의 특징적인 흡수 스펙트럼을 갖는다. 흡수(광학 밀도)는 260nm에서 최대이고 310 nm을 향해서는 0이다. DNA 형태에 있어서 하전은 흡수 스펙트럼의 프로필을 변화시켜야 한다. 더욱이, 입자의 형성은 광학 밀도의 증대에 의해 UV에서 감지될 수 있는 확산의 증대를 초래한다. 파장을 310 nm 보다 약간 높은 값으로 조정했을 때(용액 중의 DNA가 흡수되지 않는 파장임) 입자 형성의 효과를 모니터링할 수 있다.
소 흉선 DNA를 Naroditsky et al에 의해 기재된 바와 같이 토로이드 구조들을 얻기 위해 최적의 조건하에서 스퍼민과 복합체를 형성시켰다(76 μM DNA 염기들, 65 mM 스퍼민, 25 mM NaCl). 230 및 330 nm 사이에서 관찰된 흡수는 DNA의 복합화가 일어나는 동안 10 분 동안에 증가하였다. 결과적으로, 광학 밀도의 감소는 260 nm의 범위에서 검출될 수 있는 반면 (이는 DNA의 흡수 최적임), 이것은 300 nm를 향해서는 안정되게 남아 있었다. 마지막으로 흡수는 1시간 30분 후에 안정화되었다(도 16A).
NaCl 농도를 100 mM로 증가시켰을 때, 관찰된 스펙트럼은 스퍼민과 복합체를 형성하기 전에 관찰되었던 DNA의 스펙트럼과 동일하였다(도 16B).
상기 실험으로부터 스퍼민을 사용한 농축은 UV에서 가시적임을 결론지을 수 있다. 더욱이 이 과정의 역이 배지의 이온 농도를 증가시켰을 때 일어날 수 있음을 나타낼 수 있다.
상기 실험과 동일한 실험을 스퍼민 대신에 스퍼민-N1,N12-비스-시스테인 (SC2)의 존재하에서 동일한 농도에서 수행하였다(도 16C).
SC2에 의한 DNA의 복합체화(complexation) 동력학은 스퍼민을 사용하여 얻은 것과 비교할만 하다.
Ellman's 시약을 사용한 티올 그룹들의 측정(Riddles et al., 1979)은 물 중의 산소를 제외하고는 산소가 존재하지 않았을 때 10 분후에 50%의 티올 관능기들이 산화되었음을 나타냈다(1M NaCl 수용액 중의 산소의 용해도는 0.8 mM이다). 더욱이, SC2및 DNA의 혼합 후 1시간 반 후에 NaCl 농도의 증대는 스퍼민에 비하여 흡수 스펙트럼의 효과에 단지 미미한 효과만을 가졌다.
결과적으로, SC2는 스퍼민과 동일한 방식으로 DNA와 복합체를 형성하여 농축시킨다. 반대로, 형성된 입자들은 티올 관능기의 산화에 관련되어 매질의 이온 농도에 관련하여 더욱 안정해지는 것으로 보인다.
ii) 아가로스 겔 전기영동
스퍼민 또는 SC2중 하나를 사용하여 형성한(76 μM 염기들 RSV-Luc, 65 μM 스퍼민 또는 SC2, 25 mM NaCl, pH 6.5; 2 시간 산화) 입자들의 안정성은 아가로스 겔 전기영동에 의해 시험하였다(1%; Tris 완충액 pH 6.5). 부피가 커지고 덜 하전된 축소된 DNA는 아가로스 겔 중에서 덜 이동하거나 전혀 이동하지 않은 것을 관찰될 수 있었다(도 17).
스퍼민을 사용하여 형성한 입자들은 전기영동에 사용된 조건하에서는 안정하지 않았다(DNA 단독 및 스퍼민과 복합체를 이룬 DNA의 동일한 이동; 레인 1 및 2.) SC2를 사용하여 형성한 입자들은 안정하였다(레인 3). DNA-SC2입자들은 증대된 이온 농도에서 조차도 비교적 안정하게 남아 있었다(레인 5). 복합체의 안정성은 SC2의 산화에 기인한다. 결과적으로, SC2와 복합체를 이룬 DNA의 용액에 이황화 다리의 환원제를 첨가할 경우, 복합체는 전기영동에 사용되는 조건하에서 더 이상 안정하지 않다.
실시예 7
(C10CG+)2/DNA 복합체와 상이한 양의 PE1 25KDa와의 상호작용으로부터 초래된 입자들의 크기 측정.
용액은 세제 C10CG+(30μM)을 Tris/HCl 15 mM, pH 8.4 중의 pCMVL DNA 용액 (30μM)에 첨가하고 이 용액을 24 시간 동안 호기성 조건하에 놓음으로써 제조하였다. 이어서 원하는 양의 PEl 25 KDa(Alldrich)를 첨가하고 5 분 후에 문헌 [Blessing et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 (4), 1427-1431]에 의해 기술된 바와 같이 Dynamic Light Scattering에 의해 측정하였다(도 18).
실시예 8
(C10CG+)2/PEl 25KDa-Gal4/DNA 복합체의 크기 측정.
복합체 용액은 세제 C10CG+(30μM)을 Tris/HCl 15 mM, pH 8.4 중의 pCMVL DNA 용액 (30μM 인산염)에 첨가하고 이 용액을 24 시간 동안 호기성 조건하에 놓음으로써 제조하였다. 이어서, 10 당량의 PEl 25KDa-Gal4를 첨가하였다. (PEl-Gal4는 Zanta et al., 1997에 기술된 바와 같이 PE125K 및 테트라갈락토오스(Galα3GalB4Galα3Gal) 사이의 환원성 아민화에 의해 얻었다.) 측정들은 폴리머 첨가 후 1 분 후에 수행하였다(원). 17 시간 후, 진한 NaCl 용액을 최종 농도 150mM로 첨가하였다(삼각형). 대조군으로서, pCMVL DNA를 Boussif et al., 1995에 기술된 바와 같이 10 당량 PEl 25KDa-Gal4와 복합체를 형성시켰다(도 19). (C10CG+)2/PEl 25KDa-Gal4/DNA 복합체들은 PEl 25KDa-Gal4/DNA 복합체들보다 훨씬 더 적었던 것으로 밝혀졌다.
실시예 9
C10CG+/DNA/PEl 25 KDa 복합체를 사용한 SKOV3의 형질감염.
이 용액은 pCMVL DNA (30μM 인산염)과 Tris/HCl 15 mM, pH 8.4 중의 C10CG+30μM을 혼합하고, 이 용액을 24 시간 동안 호기성 조건하에 놓음으로써 제조하였다. 이어서, 목적하는 양의 PEI 25KDa를 첨가하였다. SKOV3 세포(난소 암종, European Collection of Animal Cell Cultures (E.C.A.C.C.)를 형질감염 18 시간 전에 24 웰 디쉬의 웰당 50,000 세포로 종배양시켰다. 복합체 혼합물의 분취량(웰 당 플라스미드 2㎍에 해당함)을 무혈청 RPMI 1640 배지에서 유지시킨 세포에 첨가하였다. 2 시간 후 10% 혈청을 첨가하였다. 루시퍼라아제 유전자 발현은 24 시간 후에 모니터링하였다. DNA 바아는 pCMVL 단독(웰 당 플라스미드 2㎍)에 해당한다(도 20).
실시예 10
C10CG+/DNA/PEl 25 KDa 및 C10CG+/DNA/PEl 25 KDa-Gal4 복합체를 사용한 BNL CL.2 세포의 형질감염.
이 용액은 pCMVL DNA (30μM 인산염)과 Tris/HCl 15 mM, pH 8.4 중의 C10CG+30μM을 혼합하고, 이 용액을 24 시간 동안 호기성 조건하에 놓음으로써 제조하였다. 이어서, 목적하는 양의 PEI 25KDa 또는 PEI 25KDa-Gal4(전체 아민 당 5% 그라프팅)를 첨가하였다. 세포들을 형질감염 18 시간 전에 24 웰 디쉬의 웰당 50,000 세포로 종배양시켰다. 복합체 혼합물의 분취량(웰 당 플라스미드 2㎍에 해당함)을 무혈청 RPMI 1640 배지에서 유지시킨 세포에 첨가하였다. 2 시간 후 10% 혈청을 첨가하였다. 루시퍼라아제 유전자 발현은 24 시간 후에 모니터링하였다(도 21).
실시예 11
단백질에 연결된 폴리양이온을 사용한 (C10CG+)2/DNA 복합체의 코팅.
(C10CG+)2/DNA 복합체와 트랜스퍼린-폴리양이온 접합체(TfpL36; 실시예 13 참조)와의 상호작용에 기인한 입자들의 크기 측정.
복합체 용액은 세제 C10CG+(30μM)을 Tris/HCl 15 mM, pH 8.4 중의 pCMVL DNA 용액 (30μM 인산염)에 첨가하고 이 용액을 24 시간 동안 호기성 조건하에 놓음으로써 제조하였다. 이어서 목적하는 양의 PLL36-Tf(전체 아민 당 5% 그라프팅)를 첨가하였다. 측정들은 폴리머 첨가 후 1 분후에(열린 원) 및 30 분후에(채워진 원) 수행하였다. 이어서, 진한 NaCl 용액을 최종 농도 150mM로 첨가하였다(열린 삼각형). 30 분 입도를 재측정하였다(채워진 삼각형). 결과는 (C10CG+)2/DNA 복합체들이 단백질에 연결된 폴리양이온으로 코팅될 수 있으머 작게 남아있음을 나타낸다.
실시예 12
트랜스퍼린-폴리리신-피복된 (C10CG+)2/DNA 입자들의 제타 전위의 측정
복합체 용액은 세제 C10CG+(30μM)을 Tris/HCl 15 mM, pH 8.4 중의 pCMVL DNA 용액 (30μM 인산염)에 첨가하고 이 용액을 24 시간 동안 호기성 조건하에 놓음으로써 제조하였다. 이어서 목적하는 양의 TfpL (전체 아민 당 2% 그라프팅)를 첨가하였다. 측정전, 진한 NaCl 용액을 최종 농도 150mM로 첨가하였다(도 23). 결과는 트랜스퍼린-폴리리신-피복된 (C10CG+)2/DNA 입자들이 음으로 하전되어 남아있음을 나타낸다.
실시예 13
K562 세포의 형질감염: (C10CG+)2/DNA 복합체의 전달에 대한 트랜스페린-폴리리신의 효과.
형질감염을 위해, DNA/C10CG+복합체들은 먼저 최종 농도 30μM(1 당량)의 HEPES (15 mM, pH=8.5) 1 ml 중의 pCMVL 10 ㎍을 최종 농도 30μM(1 당량)의 C10CG+세제 30μM과 혼합시킴으로서 제조하였다. 이 용액을 부드럽게 혼합하고 실온에서 24 시간 동안 방치시켜 산화시켰다. 다음에 복합체들을 0.1;0.2;0.4;1.0의 폴리리신 질소 원자 대 DNA 인산염의 몰비(N/P)로 HEPES (15 mM, pH=8.5) 50㎕ 중의 hTf-pL36 접합체[인간 트랜스퍼린 및 폴리-L-리신의 접합체, 36 리신 단량체의 중합의 평균 분자량도; 트랜스페린:폴리리신의 몰비=1/1.5]와 혼합시키고, 실온에서 30 분 동안 인큐베이션시켰다.
K562 현탁 세포(ATCC CCL 243)을 10% 태아 송아지 혈청(FCS), 1% L-글루타민 및 항생제를 보충한 RPMI1640 중에 성장시키고, 37℃에서 인큐베이션시켰다. 형질감염을 위해, 세포들을 웰 당 500,000 세포의 밀도로 24-웰 플레이트 중에 플레이팅시켰다. 배지를 최종 농도 100 μM의 형질감염 복합체 1.05 ml 및 RPMI1640 (10% FCS, 1% L-글루타민, 항생제) + 클로로퀸의 혼합물로 교체하였다.37℃에서 4 시간 인큐베이션시킨 후, 형질감염 배지를 새로운 배양 배지 2 ml로 교체하였다. 세포들을 형질감염 24 시간 후에 수확하고, PBS로 세척하고 Tris (0.25 M, pH=7.9) 100 ㎕ 중에 재현탁시켰다. 세포들을 동결-해동 사이클에 의해 용해시켰다. 루시퍼라아제 빛 단위들은 상층액 10 ㎕로부터 기록되었다. 도 24에 나타낸 빛 단위는 형질감염 세포의 시료 당 전체 루시퍼라아제 활성을 나타낸다.
실시예 14
B16F10 세포의 형질감염: (C10CG+)2/DNA 복합체의 전달에 대한 트랜스페린-폴리리신의 효과.
형질감염을 위해, DNA/C10CG+복합체들은 먼저 최종 농도 30μM의 HEPES (15 mM, pH=8.5) 0.5 ml 중의 pCMV-Luc 5 ㎍을 최종 농도 30μM(1 당량)의 C10-CG+세제 30μM과 혼합시킴으로서 제조하였다. 이 용액을 부드럽게 혼합하고 실온에서 24 시간 동안 방치시켜 산화시켰다. 다음에 복합체들을 0.1;0.2;0.5;1.0의 폴리리신 질소 원자 대 DNA 인산염의 몰비(N/P)로 HEPES (15 mM, pH=8.5) 50㎕ 중의 hTf-pL36 접합체와 혼합시키고, 실온에서 30 분 동안 인큐베이션시켰다.
B16F 부착 세포(NIH DCT Tumour Depository)을 10% 태아 송아지 혈청(FCS), 1% L-글루타민 및 항생제를 보충한 DMEM 중에 성장시키고, 37℃에서 인큐베이션시켰다. 세포들을 25 cm2조직 배양 플라스크 중에 형질감염시켰다. 플라스크 당 400,000 세포들을 형질감염 18 시간 전에 플레이팅시켰다. 배지를 최종 농도 100 μM의 형질감염 복합체 0.55 ml 및 DMEM (10% FCS, 1% L-글루타민, 항생제) 1ml + 클로로퀸의 혼합물로 교체하였다.
37℃에서 4 시간 인큐베이션시킨 후, 형질감염 배지를 새로운 배양 배지 2 ml로 교체하였다.
루시퍼라아제 활성은 형질감염 24 시간 후에 분석하였다.
실험의 결과는 도 25에 나타냈다.
실시예 15
B16F10 세포의 형질감염: (C10CG+)2/DNA 복합체의 전달에 대한 불활성화된 아데노바이러스 입자들의 효과.
형질감염을 위해, DNA/C10CG+복합체들은 먼저 HEPES (15 mM, pH=8.5) 0.5 ml 중의 pCMV-Luc 5 ㎍을 최종 농도 30μM(1 당량)의 C10-CG+세제와 혼합시킴으로서 제조하였다. 이 용액을 부드럽게 혼합하고 실온에서 24 시간 동안 방치시켜 산화시켰다. 다음 단계에서 복합체에 다음을 첨가하고,
1) HEPES (15 mM, pH=8.5) 50㎕ 중의 스트렙타비디닐화된 폴리리신 (250)으로 처리된 비오티닐화된, 8-MOP(메톡시프소라렌)-불활성화된 아데노바이러스 입자 dl1014(8.6 x 109입자), 실온에서 30 분 동안 인큐베이션시켰다.
2) HEPES (15 mM, pH=8.5) 50㎕ 중의 0.4 또는 1.0의 PEI 질소 원자 대 DNA 인산염(N/P)의 몰비로 폴리에틸렌이민(PEI, 분자량 25 kDa)와 혼합된 비오티닐화된, 8-MOP-불활성화된 아데노바이러스 입자 dl1014(8.6 x 109입자), 실온에서 30 분 동안 인큐베이션시켰다.
30 분 후 복합체들을 형질감염 실험에 사용하였다.
B16F 부착 세포 를 10% 태아 송아지 혈청(FCS), 1% L-글루타민 및 항생제를 보충한 DMEM 중에 성장시키고, 37℃에서 인큐베이션시켰다. 세포들을 25 cm2조직 배양 플라스크 중에 형질감염시켰다. 플라스크 당 500,000 세포들을 형질감염 18 시간 전에 플레이팅시켰다. 배지를 최종 농도 100 μM의 형질감염 복합체 0.55 ml 및 DMEM (10% FCS, 1% L-글루타민, 항생제) 1 ml + 클로로퀸의 혼합물로 교체하였다.
37℃에서 4 시간 인큐베이션시킨 후, 형질감염 배지를 새로운 배양 배지 2 ml로 교체하였다.
세포들은 형질감염 24 시간 후에 수확하고, 추출물들을 제조하였다. 결과의 루시퍼라아제 활성(500,000 세포에 대응함)은 도 26에 나타냈다.
실시예 16
생체내 적용을 위한 복합체 형성 및 농축
복합체들은 농축 C10CG+원액(에탄올 중의 7.2 mM; Elmann's 시약으로 티올 분석에 의해 결정한 후)을 HEPES (15 mM, pH=8.5) 0.5 ml 중의 pCMVL 플라스미드 DNA 의 용액에 첨가함으로써 pCMVL 플라스미드 DNA 및 세제 C10-CG+로 형성시켰다. pCMV-Luc 80 ㎍을 세제의 첨가 전에 최종 농도 30μM(완충액 8 ml 중의)에 첨가하였다. C10-CG+은
1) 30 μM (1 eq)
2) 21 μM (0.7 eq)
의 최종 농도로 주입하였다.
용액들을 부드럽게 혼합하고 실온에서 24 시간 동안 방치하여 산화시켰다. 다음 단계에서, 50% 글루코오스 0.8 ml을 첨가하여 용액을 5% 글루코오스 농도가 되게 하였다.
시료들을 비바스핀 4 농축기, 100,000 MW 막으로 농축시켰다. 4000 rpm 이하에서 원심분리시킨 후,
1) pCMVL DNA 44 ㎍ (55% 수율)
2) pCMVL DNA 50 ㎍ (63% 수율)
를 함유하는 복합체 0.3 ml을 얻었다.
실시예 17
생체내 (C10CG+)2/DNA 복합체의 피내 유전자 전달.
복합체들은 실시예 16에 기재된 바와 같이 제조하였다.
pCMV-Luc (완충액 8 ml 중의 80 ㎍; 30μM)의 용액에 C10-CG+세제를
1) 21 μM (0.7 eq)
2) 30 μM (1.0 eq)
3) 37.5 μM (1.25 eq)
4) 45 μM (1.5 eq)
의 최종 농도로 주입하였다.
비바스핀 4 농축기로 농축시킨 후,
1) pCMVL DNA 43 ㎍ (53% 수율)
2) pCMVL DNA 53 ㎍ (65% 수율)
3) pCMVL DNA 47 ㎍ (58% 수율)
4) pCMVL DNA 33 ㎍ (41% 수율)를 함유하는 복합체 0.3 ml을 얻었다.
복합체들은 각 경우에 pCMVL DNA 10 ㎍을 도입하기에 적절한 양으로 가하였다.
다음의 부피/마우스들을 다양한 그룹에 주사하였다:
1) 70 ㎍ 용액 중의 C10CG+/DNA 0.7 eq
2) 57 ㎍ 용액 중의 C10CG+/DNA 1.0 eq
3) 64 ㎍ 용액 중의 C10CG+/DNA 1.25 eq
4) 90 ㎍ 용액 중의 C10CG+/DNA 1.5 eq
생체내 실험을 위해, 8 내지 12 주령의 암컷 A/J 마우스들(Harlan)을 사용하였다. 복합체들의 피내 적용 방법, 조직 시료의 제조 및 화학발광 분석에 의해 발현된 루시퍼라아제의 정량화는 모든 실험 그룹에 대해 동일하였다. 하루 전에 마우스들의 등을 면도한 후, C10CG+/Luc DNA 복합체들을 (0.40 x 21 mm) 주사기를 사용하여 피내 주사하였다. 주사 부위들을 표시하였다. 24 시간 후에, 마우스들을 희생시킨 후, 평균 직경 15 mm의 주사 부위를 잘라내었다. 바로 밑의 지방 조직을 포함한 피부를 TRIS 완충액 600 ㎕에 첨가하고 동결시켰다. 루시퍼라아제 발현을 정량화하기 위하여, 얼린 피부 부위들을 분쇄하였다. 그후 시료들을 4℃에서 8 분 동안 원심분리시켰다(15000 rpm). 루시퍼라아제 발현은 상층액으로부터 측정하였다.
주사한지 24 시간 후의 루시퍼라아제 유전자 발현(상대적 빛 단위/부위)는 도 27에 나타낸다(모든 그룹의 평균값 및 STDEV). 유사한 발현 레벨은 C10CG+/DNA의 0.7 Eq. 내지 1.25 Eq.의 범위에서 얻어졌다.
실시예 18
생체내 (C10CG+)2/DNA 복합체의 피내 전달.
복합체들(그룹 1)은 실시예 16에 기술한 바와 같이 제조하였다.
pCMVL DNA (완충액 10 ml 중의 100 ㎍; 30μM)의 용액에 C10-CG+세제를 30 μM (1 Eq.)의 최종 농도로 첨가하여 방치하여 산화시켰다. 마지막에, 50% 글루코오스 1 ml을 첨가하여 용액을 5% 글루코오스 농도가 되게 하였다. 비바스핀 농축기로 농축시킨 후, pCMVL DNA 60 ㎍ (60% 수율)를 함유하는 복합체 0.4 ml을 얻었다.
그룹 2)는 물 229 ㎕(아쿠아 비데스트) 및 50% 글루코오스 30 ㎕와 혼합된 동일한 pCMVL DNA 원액 41 ㎕을 함유하여 pCMVL DNA 10 ㎍/용액 50 ㎕의 최종 농도를 얻었다.
그룹 3)는 물 268 ㎕(아쿠아 비데스트) 및 50% 글루코오스 30 ㎕와 혼합된 동일한 pCMVL DNA 원액 2 ㎕을 함유하여 0.5 ㎍/ 50 ㎕의 최종 농도를 얻었다.
3 개의 그룹에서 다음의 양의 DNA 또는 복합체를 가하였다:
1) C10CG+/DNA 1.0 eq (10㎍)
2) 네이키드 pCMVL DNA (10 ㎍/50 ㎕)
3) 네이키드 pCMVL DNA (0.5 ㎍/50 ㎕)
상이한 그룹들을 피내 주사하고 주사 부위들을 실시예 17에 기술한 바와 같이 24 시간 후에 얻었다. 단백질 추출물들의 루시퍼라아제 발현(상대적 빛 단위/부위)는 도 28에 나타낸다(모든 그룹의 평균값 및 STDEV).
실시예 19
생체내 C10CG+/pCMVL/MannlTC-PEl(25KDa) 복합체의 피내 전달.
그룹 1에 대하여, C10CG+/DNA 복합체들은 실시예 17에 기재된 바와 같이 제조하고, 이어서 만노실화된 폴리에틸렌이민(PEI)으로 코팅시켰다. pCMVL DNA (완충액 10 ml 중의 100 ㎍; 30μM)의 용액에 C10-CG+세제를 30 μM (1 Eq.)의 최종 농도로 첨가하여 방치하여 산화시켰다. 다음 단계에서 복합체들을 2.4의 PEI 질소 원자 대 DNA 인산염의 몰비(N/P)로 그의 제조를 후술하는 MannlTC-PEl(25KDa) 접합체 30μM과 혼합하고, 실온에서 30 분 동안 인큐베이션시켰다. 마지막에, 50% 글루코오스 1 ml을 첨가하여 용액을 5% 글루코오스 농도가 되게 하였다. 농축시킨 후, pCMVL DNA 21 ㎍ (21% 수율)를 함유하는 복합체 0.25 ml을 얻었다.
그룹 2)에 대하여, 유사하지만 C10-CG+이 없는 복합체를 2.4의 PEI 질소 원자 대 DNA 인산염의 몰비(N/P)로 pCMVL DNA와 MannlTC-PEl(25KDa)을 혼합시킴으로써 제조하였다. 120 ㎕ 중의 pCMVL DNA 60 ㎍ 및 150 ㎕ 중의 MannlTC-PEl(25KDa) 18 ㎍의 혼합물을 실온에서 20 분 동안 인큐베이션시켰다.
다음의 그룹들을 투여하였다(50 ㎕/마우스의 DNA 10 ㎍ 및 만노오스 TC-변형된 PEl(25KDa) 3 ㎍):
1) C10-CG+/pCMVL/MannlTC-PEl(25KDa) N/P=2.4
2) pCMVL/MannlTC-PEl(25KDa) N/P=2.4
피부 부위들을 피하 주사 24 시간 후에 얻어 루시퍼라아제 발현을 측정하였다. 발현 (상대적 빛 단위/부위)는 도 29에 나타낸다(모든 그룹의 평균값 및 STDEV).
페닐이소티오시아네이트 다리를 경유하여 만노오스에 연결된 접합체인 MannlTC-PEl(25KDa)은 커플링제로서 만노피라노실페닐이소티오시아네이트 (MnaITC, Sigma)을 사용함으로써 제조하였다. 커플링은 250 mM 염화나트륨 수용액 0.33 ml 중의 PEI (25 kDa 분자량, Aldrich) 25 mg과 디메틸술폭시드 0.2 ml 중의 ManITC 25 mg을 적어도 1일 동안 반응시킴으로써 수행하고, 이어서 물 4 ml로 희석하고, 0.5M 염화 나트륨에 조정하고, 양이온 교환 크로마토그래피 (Biorad Macroprep High S, 0.5 M 내지 3 M 염화나트륨의 염 구배) 및 염화 나트륨 150 mM에 대하여 투석을 행하였다. 이는 매 10분의 1의 PEI (25 kDa) 질소와 만노오스의 평균 수식을 나타낸다.
실시예 20
(C12CO)2/DNA 복합체를 사용한 BNL.2 세포의 형질감염.
이 용액은 pCMVL DNA (30μM 인산염)과 Tris/HCl 15 mM, pH 8.4 완충액 중의 상이한 양의 오르니틸-시스테인-도데실아미드 세제 C12CO (실시예 4, 단계 4; 4 eq는 60 30μM C12CO에 대응함)을 혼합하고, 이 용액을 24 시간 동안 호기성 조건하에 놓음으로써 제조하였다. 세포들을 형질감염 18 시간 전에 24 웰 디쉬의 웰당 50,000 세포로 종배양시켰다. 복합체 혼합물의 분취량(웰 당 플라스미드 2㎍에 해당함)을 무혈청 DMEM 배지에서 유지시킨 세포에 첨가하였다. 2.5 시간 후 10% 혈청을 첨가하였다. 루시퍼라아제 유전자 발현은 24 시간 후에 모니터링하였다. 결과는 도 30에 나타낸다.

Claims (47)

  1. 유기 양이온성 분자에 의해 농축된 하나 이상의 핵산 분자를 포함하고, 핵산 분자를 동일하거나 또는 상이한 유기 양이온성 전구체 분자들로 핵산분자를 가교시킴이 없이 복합체를 형성시키고 전구체 분자들을 핵산 주형 상에서 서로에 대해 공유결합시킴으로서 얻어지는 시험관내 및 생체내에서 핵산 분자들로 고등 진핵 세포들을 형질감염시키기 위한 입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 양이온성 분자들이 양이온성 세제 전구체 분자들의 다이머화 또는 올리고머화에 의해 얻어지는 지질들인 형질감염 입자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 양이온성 세제 전구체 분자들이
    (a) 하나 이상의 다른 세제 분자들에 결합하기 위한 하나 이상의 관능기,
    (b) 하나 이상의 친지성 잔기,
    (c) 비독성 수용체 골격,
    (d) 핵산 분자에 결합하기 위한 양이온성 그룹을 포함하는 형질감염 입자.
  4. 제3항에 있어서, 다른 세제 분자들에 결합하기 위한 양이온성 전구체 세제 분자들의 관능기가 티올류, 산 히드라지드류, 알데히드류, 아민류 및 적절히 치환되어 엔아민류를 제공하는 에틸렌 잔기들로 이루어진 군 중에서 선택되는 다이머화 가능하거나 중합 가능한 관능기인 형질감염 입자.
  5. 제4항에 있어서, 친지성 잔기가 친지성 아미드류, 에스테르류 또는 에테르류로부터 선택되는 형질감염 입자.
  6. 제3항에 있어서, 핵산 분자에 결합하기 위한 관능기가 아민 또는 그의 유도체인 형질감염 입자.
  7. 제6항에 있어서, 핵산 분자들에 결합하기 위한 관능기가 구아니딘인 형질감염 입자.
  8. 제1항에 있어서, 유기 양이온성 전구체 분자가 하기 화학식 (I)로 표시되는 것인 형질감염 입자.
    〈화학식 I〉
    식 중,
    R1은 (C1-C10-알킬렌)-SH를 나타내고, 여기서 알킬렌 라디칼은 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 나타낼 수 있으며;
    R2는 -NR4R5, -NHR4R5 +, -N(R4)2R5 +, -C(=NR4)NR5R6, -C(=X)-C1-10-알킬렌이며, 여기서 알킬렌 라디칼은 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 나타낼 수 있으며, 4개 이하의 디알킬 아미노 그룹 또는 티오모노사카라이드에 의해 치환될 수 있고,
    R3은 직쇄 또는 분지쇄이고, 바람직하게는 하나 이상의 할로겐 원자 또는 디알킬아미노 그룹으로 임의 치환된 C5-C30-알킬이거나,
    10개 이하의 C=C-이중 결합을 가지는, 직쇄 또는 분지쇄이고, 바람직하게는 하나 이상의 할로겐 원자 또는 디알킬아미노 그룹으로 임의로 치환된 C5-C30-알케닐이거나,
    10개 이하의 C≡C-삼중 결합을 가지는, 직쇄 또는 분지쇄이고, 바람직하게는 하나 이상의 할로겐 원자 또는 디알킬아미노 그룹으로 임의로 치환된 C5-C30-알키닐이거나,
    임의로 치환된 C6-C10-아릴이거나,
    임의로 치환된 C7-C16-아랄킬이거나,
    10개 이하의 아미노 그룹 -NR4-에 의해 단속되고 아미노산에 의해 임의로 치환된 아미노 그룹을 임의로 갖는 C5-C30-알킬쇄이며,
    R4, R5및 R6은 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C4-알킬을 나타내며,
    X는 O 또는 S를 나타내며,
    Y는 C=O 또는 C=S이며,
    Z는 O, S 또는 -NR4-이다.
  9. 제8항에 있어서, 양이온성 전구체 분자가 다음의 치환기를 갖는 화학식 (I)에 대응하는 것인 형질감염 입자.
    R1은 (C1-C6-알킬렌)-SH를 나타내고, 여기서 알킬렌 라디칼은 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 나타낼 수 있으며;
    R2는 -NR4R5, -NHR4R5 +, -N(R4)2R5 +, -C(=NR4)NR5R6, -C(=X)-C1-C4-알킬렌이며, 여기서 알킬렌 라디칼은 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 나타낼 수 있으며, 4개 이하의 아미노 라디칼 -NR4R5, 또는 티오모노사카라이드에 의해 치환될 수 있고,
    R3은 직쇄 또는 분지쇄이고, 바람직하게는 F, Cl, Br, 또는 -NR4R5로 임의 치환된 C5-C20-알킬이거나,
    5개 이하의 C=C-이중 결합을 가지는, 직쇄 또는 분지쇄이고, 바람직하게는 F, Cl, Br, 또는 -NR4R5로 임의로 치환된 C5-C20-알케닐이거나,
    5개 이하의 C≡C-삼중 결합을 가지는, 직쇄 또는 분지쇄이고, 바람직하게는 F, Cl, Br, 또는 -NR4R5로 임의로 치환된 C5-C20-알키닐이거나,
    바람직하게는 C1-C4알킬, F, Cl, Br 또는 -NR4R5로 치환된 C6-C10-아릴이거나,
    바람직하게는 C1-C4알킬, F, Cl, Br 또는 -NR4R5로 임의로 치환된 C7-C14-아랄킬이거나,
    10개 이하의 아미노 그룹 -NR4-에 의해 단속되고 임의로 아미노산에 의해 임의로 치환된 아미노 그룹을 갖는 C5-C20-알킬쇄이며,
    R4, R5및 R6은 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C4-알킬을 나타내며,
    X는 O 또는 S를 나타내며,
    Y는 C=O 또는 C=S이며,
    Z는 O, S 또는 -NR4-이다.
  10. 제8항에 있어서, 양이온성 전구체 분자가 다음의 치환기를 갖는 화학식 (I)에 대응하는 것인 형질감염 입자.
    R1은 (C1-C4-알킬렌)-SH를 나타내고, 여기서 알킬렌 라디칼은 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 나타낼 수 있으며;
    R2는 -NR4R5, -NHR4R5 +, -N(R4)2R5 +, -C(=NR4)NR5R6, -C(=X)-C1-C4-알킬이며, 여기서 알킬 라디칼은 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 나타낼 수 있으며, 4개 이하의 아미노 라디칼 -NR4R5, 또는 티오모노사카라이드에 의해 치환될 수 있고,
    R3은 직쇄 또는 분지쇄이고, 바람직하게는 F, Cl, Br, 또는 -NH2로 임의 치환된 C5-C12-알킬이거나,
    7개 이하의 아미노 그룹 -NR4-에 의해 단속되고 임의로 아미노산 시스테인에 의해 치환된 아미노 그룹을 임의로 갖는 C5-C15-알킬쇄이며,
    R4, R5및 R6는 각각 독립적으로 수소 또는 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸 또는 tert-부틸을 나타내며,
    X는 O 또는 S를 나타내며,
    Y는 C=O 또는 C=S이며,
    Z는 O, S 또는 -NR4-이다.
  11. 제8항에 있어서, 양이온성 전구체 분자가 다음의 치환기를 갖는 화학식 (I)에 대응하는 것인 형질감염 입자.
    R1은 -CH2-SH를 나타내고,
    R2는 직쇄 또는 분지쇄이고 임의로 F, Cl, Br 또는 -NH2로 치환된 -NH2, -NH3 +, -C(=NH2 +)NH2, -C(=O)-C1-C4-알킬이거나,
    오르니틴 라디칼 또는 S-갈락토실 라디칼이며,
    R3은 직쇄 또는 분지쇄이고, 바람직하게는 F, Cl, Br, 또는 -NH2로 임의 치환된 C6-C15-알킬 라디칼이며,
    Y는 C=O 이며,
    Z는 O 또는 -NH-이다.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 구아니딘 또는 오르니틴인 형질감염 입자.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, R3이 데실 라디칼인 형질감염 입자.
  14. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 메틸렌티올이고, R2가 구아니딘이고, R3이 직쇄 데실 라디칼이고, Y가 카르보닐이고, Z가 아민인 화합물 및 제약학상 허용되는 그의 염인 형질감염 입자.
  15. 제14 항에 있어서, 양이온성 분자가 N-데실-2-구아니디늄-시스테인인 형질감염 입자.
  16. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 메틸렌티올이고, R2가 오르니틴이고, R3이 직쇄의 데칸이고, Y가 카르보닐이고, Z가 아민인 화합물 및 제약학상 허용되는 그의 염인 형질감염 입자.
  17. 제16 항에 있어서, 양이온성 분자가 양이온성 분자가 N-데실-2-오르니티닐-시스테인인 형질감염 입자.
  18. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 황원자를 경유하여 결합된 단당류가 각각 D- 또는 L-형의 갈락토오스, 락토오스, 글루코오스, 아라비노오스, 푸락토오스, 소르보오스, 크실로오스, 리보오스, 만노오스로 이루어진 군 중에서 선택되는 형질감염 입자.
  19. 제1항에 있어서, 양이온성 전구체 분자가 폴리아민인 형질감염 입자.
  20. 제19항에 있어서, 양이온성 전구체 분자가 스퍼민 유도체인 형질감염 입자.
  21. 제20항에 있어서, 양이온성 전구체 분자가 스퍼민-N1,N12-비스-시스테인아미드인 형질감염 입자.
  22. 제1항 내지 21항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 분자 사이의 결합이 세포 조건 하에서 분해 가능한 것인 형질감염 입자.
  23. 제1항에 있어서, 단일 핵산 분자를 포함하는 형질감염 입자.
  24. 제1항 또는 제23항에 있어서, 핵산 분자가 DNA 분자인 형질감염 입자.
  25. 제24항에 있어서, DNA 분자가 플라스미드인 형질감염 입자.
  26. 제1항에 있어서, 핵산 분자가 RNA 분자인 형질감염 입자.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 세포의 표적화 관능기들 및(또는) 하나 이상의 내식작용을 촉진할 수 있는 관능기들을 지닌 것을 특징으로 하는 형질감염 입자.
  28. 제27항에 있어서, 상기 관능기들이 양이온성 분자들에 연결되어 있는 형질감염 입자.
  29. 제27항에 있어서, 상기 관능기들이 양이온성 분자들 이외에 존재하는 핵산 결합 분자들에 연결되어 있는 형질감염 입자.
  30. 제27항에 있어서, 표적화 관능기가 세포의 단백질 리간드인 형질감염 입자.
  31. 제27항에 있어서, 표적화 관능기가 당 잔기인 형질감염 입자.
  32. 제31항에 있어서, 당이 갈락토오스인 형질감염 입자.
  33. 제31항에 있어서, 당이 만노오스인 형질감염 입자.
  34. 제1항에 있어서, 하나 이상의 엔도솜 용해성 관능기들을 지닌 형질감염 입자.
  35. 제34항에 있어서, 상기 엔도솜 용해성 관능기들이 양이온성 분자들에 연결된 형질감염 입자.
  36. 제34항에 있어서, 상기 관능기들이 양이온성 분자들 이외에 존재하는 핵산 결합 분자들에 연결되어 있는 형질감염 입자.
  37. 제34항에 있어서, 엔도솜 용해성 관능기가 융합발생성 펩티드인 형질감염 입자.
  38. 제34항에 있어서, 엔도솜 용해성 관능기가 바이러스인 형질감염 입자.
  39. 제38항에 있어서, 바이러스가 아데노바이러스인 형질감염 입자.
  40. 양이온성 전구체 분자들을 적합한 완충액 중의 핵산 분자에 첨가하고 핵산과의 복합체를 형성하도록 허용하고 핵산 주형 상에서 동일하거나 또는 상이한 양이온성 전구체 분자들에 공유적으로 결합되게 하는, 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 형질감염 입자의 제조 방법.
  41. 제40항에 있어서, 양이온성 전구체 분자들이 친지성이며 온화한 산화적 조건 하에서 공유적으로 결합되는 것을 허용하는 것인 방법.
  42. 핵산 분자가 치료학적으로 활성인 것인, 제약학상 유효량의 제1항의 형질감염 입자를 포함하는 제약 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 핵산 분자가 치료학적으로 활성인 단백질을 코딩하는 플라스미드인 제약 조성물.
  44. 제1항의 형질감염 입자를 포유류에 피내 투여하는 것인, 치료학적으로 활성인 핵산을 포유류 내로 도입시키는 방법.
  45. 하나 이상의 핵산 분자들, 하나 이상의 양이온성 전구체 분자들, 적합한 완충액들, 및 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 형질감염 입자들을 제조, 정제 및 시험관내 또는 생체 내에 적용하는데 유용한 기타의 시약 또는 기계적 장치를 포함하는 부분들의 킷트.
  46. 제45항에 있어서, 추가로 하나 이상의 세포의 표적화 관능기들을 포함하는 부분들의 킷트.
  47. 제45항에 있어서, 추가로 하나 이상의 많은 엔도솜 용해성 관능기들을 포함하는 부분들의 킷트.
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