KR20010025078A - 불수용성 α-1,4-글루칸을 제조하는 방법 - Google Patents
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Abstract
불수용성 α-1,4-글루칸(water-insoluble α-1,4-glucan)을 제조하는 생체외 방법(in-vitro method)이 기술되고, 여기서 사카로스(saccharose)는 아밀로사카라제(amylosaccharase)를 사용해서 버퍼-프리 시스템(a buffer-free system)에서 반응한다.
Description
종래 유기 합성 경로의 경로를 이용할 수 없거나 또는 상당한 어려움이 있는 다당류(polysaccharides), 보다 구체적으로 불수용성 α-1,4-글루칸을 제조하는 생명 공학적인 방법에 상당한 산업적인 관심이 있다. 그러나, 비용 문제 때문에, 이러한 방법들 중 일부만이 현재까지 상업적으로 이용되었다. 생명공학적인 방법은 종래의 유기 화학 합성 경로에 대해서 장점을 갖고 있다. 따라서, 효소-촉매 반응(enzyme-catalyzed reaction)은 일반적으로 더 약한 반응 조건에서 더 빠른 반응 속도로 훨씬 더 높은 특이성(specificities)[위치특이성(regiospecificity), 입체특이성(stereospecificity)]을 갖고 진행되고 더 높은 수율을 낸다. 이러한 인자들(factors)은 새로운 다당류를 제조하는데 있어서 무척 중요하다.
생체변환(biotransformation), 즉 정제되거나 또는 부분적으로 정제된 효소에 의한 물질의 생체외(in vitro) 변환은, 생명공학적인 생체내 방법에 비해 추가적인 장점을 제공한다. 이것은 생체내 방법과 비교해서 향상된 제어성(controllability)과 더욱 큰 재현성(reproducibility)에 의해 구분되는데, 이것은 생체외 반응 조건이 생체 조직의 조건과는 달리 정의된 방식(defined manner)으로 설정될 수 있기 때문이다. 이것은 상당한 균일성과 순도 및 이에 따른 높은 품질의 일정한 생성물을 제조할 수 있도록 하고, 이것은 또한 산업상의 용도에 매우 중요하다. 일정한 품질의 제품 워크업(workup)은 비용의 감소를 초래하는데, 이것은 워크업에 필요한 반응 파라미터(process paramater)가 각각의 워크업 배치(workup batch)에 대해 또 다시 최적화될 필요가 없기 때문이다. 생체외 방법의 추가적인 장점은, 생체내 방법과는 달리 생성물이 유기체로부터 자유롭다는 것이다. 이것은 식품 산업과 제약 산업에서 특정한 적용에 절대적으로 필요하다. 산업적인 규모로 불수용성 α-1,4-글루칸의 유익한 특성을 사용하기 위해서는, 이들이 저렴하게 제공되어야 하는 절박한 필요가 있다. 산업적인 규모에서, 현재까지는, 예를 들어 아밀로스(amylose) 형태인 불수용성 α-1,4-글루칸만이 이용가능하다. 불수용성 α-1,4-글루칸을 제조하기 위해, 현재까지 특허 출원 WO 95/31553과 리마우드-사이몬 등[Remaud-Simon, in Petersen, Svenson and Pedersen (Eds.) 탄수화물 생물공학; Elsevier Science B.V., 암스테르담, 네델란드(1995), pp. 313-320]에는 나이세리아 폴리사카레아(Neisseria polysaccharea)로부터 얻어진 아밀로수크라제(amylosucrase)를 이용하는 방법이 기술되어 있다. 이러한 생체외 방법은, 부분적으로 정제된 아밀로수크라제를 사용해서 수크로스(sucrose)를 α-1,4-글루칸과 프룩토스(fructose)로 변환시키는 것에 기초하고, 구연산 나트륨 버퍼(sodium citrate buffer)(pH 6.5) 또는 말린산 나트륨 버퍼(sodium maleate buffer)(pH 6.4)에서 실행된다. 다음의 반응 메카니즘은 WO 95/31553에서 가정되었다:
수크로스 + (α-1,4-글루칸)n→ 프룩토스 + (α-1,4-글루칸)n+1
이러한 반응식을 기초로, 직쇄형 올리고머성(oligomeric) 또는 중합성(polymeric) α-1,4-글루칸은, 불수용성 α-1,4-글루칸 중합체가 되는 사슬-확장 반응(chain-extending reaction)에 대한 수용체(acceptors)로서 작용한다. WO 95/31553과 달리, 상기 리마우드-사이몬 등은 글리코겐 0.1g/ℓ를 외인성 다당류 수용체(exogenous polysaccharide acceptor)로서 추가적으로 사용했다. 이러한 측쇄형 다당류 수용체는 외인성 다당류 수용체 부존재시의 생체변환과 비교해서 반응 속도의 증가를 가져왔다.
현재까지 기술된 아밀로수크라제를 사용해서 폴리글루칸을 제조하는 시스템은 버퍼 수용액에서 진행된다. 이러한 모든 방법들이 불수용성 α-1,4-글루칸을 생성하지는 않는다. 버퍼 화학약품의 사용과 필요한 버퍼 조건을 성립시키는데 필요한 작업 시간은 상당한 반응 비용을 초래하고, 따라서 이러한 시스템의 상업적인 사용을 더욱 어렵게 한다. 추가 비용은 정제 단계에 의해 발생하는데, 이것은 생체변환 생성물(α-1,4-글루칸과 프룩토스)로부터 버퍼 솔트(buffer salt)의 잔류물을 제거하는데 필요하다. 이것은 이러한 생성물이 식품 및 제약 산업에서 사용될 때는 특히 중요하다. 그러므로 상업적으로 이용가능하고 높은 순도의 생성물이 되는 불수용성 α-1,4-글루칸의 효과적인 제조 방법에 대한 필요성이 있다.
본 발명은 버퍼-프리 시스템(a buffer-free system)에서 불수용성 α-1,4-글루칸(water-insoluble α-1,4-glucan)을 제조하는 생체외 방법(in-vitro method)에 관한 것이다.
도 1은 다른 버퍼 솔트 농도를 이용해서 나이세리아 폴리사카레아로부터 얻어지는 아밀로수크라제에 의한 불수용성 α-1,4-글루칸의 생체외 제조의 효율 비교를 도시하는 도면.
따라서 본 발명의 기초를 이루는 목적은, 또한 높은 순도의 생성물이 되는 불수용성 α-1,4-글루칸의 산업적인 제조에 적당한 방법을 제공하는 것이다.
이 목적은 특허 청구항에서 특징되는 실시예를 제공함으로써 이루어진다.
따라서 본 발명은, 아밀로수크라제의 효소 활성을 갖는 효소에 의해 수크로스가 불수용성 α-1,4-글루칸과 프룩토스로 변환되는 불수용성 α-1,4-글루칸 제조 방법에 관한 것으로, 이 방법은 버퍼-프리 수용액 시스템(aqueous, buffer-free system)에서 변환을 실행하는 것을 포함한다.
놀랍게도, 나이세리아 폴리사카레아(Neisseria polysaccharea)로부터 얻어진 아밀로수크라제에 의한 불수용성 α-1,4-글루칸의 생체외 제조에 대해서, 버퍼-프리 수용액 시스템이 사용될 수 있다는 것이 알려졌다. 프룩토스 방출(fructose release) 또는 수크로스 소비(sucrose consumption)를 기초로 결정될 수 있는 이러한 방법의 효율은, 버퍼 시스템(buffered system)의 효율과 일치한다. 사용되는 효소의 기능성(functionality)이 종래에는 버퍼 용액에서만 감지될 수 있었기 때문에[MacKenzie et al., Can. J. Microbiol. 23(1977), 1303-1307; Okada and Hehre, J. Biol. Chem. 249(1974), 126-135; Tao et al., Carbohydrate Res. 182(1988), 163-174; Buttcher et al., J. Bacteriol. 179(1997), 3324-3330; WO 95/31553], 이것은 놀라움을 준다.
이제 본 발명의 방법은 불용성 α-1,4-글루칸의 생체외 제조 비용을 상당히 감소시킬 수 있다. 특히 버퍼 용액의 제조 및 또한 설정과 적절하다면 pH의 유지와 연관된 작업 단계 및 장치를 피할 수 있다. 본 발명 방법의 보다 결정적인 장점은 또한 생성물의 증가된 순도(degree of purity)로, 이것은 식품 분야 및 식품, 화장품과 제약 산업에 적용할 때 특히 상당히 중요하다. 또한 버퍼-프리 시스템은, 생성물이 버퍼 솔트를 함유하지 않는다는 장점을 제공한다. 따라서 식품 및 제약 산업에서의 특정한 적용을 방해하는 이러한 염들을 제거하는 복잡한 정제 단계들은 필요하지 않다. 이것은 비용에서 보다 많은 감소를 가져온다. 불수용성 α-1,4-글루칸 외에도, 본 발명의 방법에서는 프룩토스가 생성된다. 이것은 "고급 프룩토스 시럽(high fructose syrups)"(HFS)의 저렴한 제조를 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은, 버퍼-프리 반응 조건 때문에, 고순도의 생성물을 초래한다. 따라서, 이온 교환(ion exchange)에 의해 버퍼 솔트를 제거하는 고비용의 공정 단계를 포함하는, 옥수수전분(cornstarch)으로부터 HFS를 제조하는 종래의 방법[Crabb and Mitchinson, TIBTECH 15(1997), 349-352]과는 달리, 복잡한 프룩토스 정제가 필요하지 않다.
본 발명을 위한 "생체외 변환"은 변환, 즉 생명체 외부에서 진행되는 반응이다. "생체외"라는 것은 구체적으로 반응 용기(reaction vessel)에서 일어나는 본 발명의 방법을 의미한다.
아밀로수크라제의 효소 활성을 갖는 효소(E.C.2.4.1.4.)는 다음 반응을 촉매화하는 효소를 의미하는 것으로 사용된다:
수크로스 + (α-1,4-글루칸)n→ 프룩토스 + (α-1,4-글루칸)n+1
아밀로수크라제의 효소 활성은, 예를 들어 본 출원서의 실시예에서 기술된 것과 같이 감지될 수 있다.
본 발명에서, 아밀로수크라제는 수크로스 및 글리코겐, 아밀로펙틴 또는 덱스트린과 같은 측쇄형 다당류 수용체(branched polysaccharide acceptor)로부터 출발해서, 이러한 다당류 수용체에서 수크로스 및 직쇄형 α-1,4-글루칸 사슬의 합성을 촉매화하는 효소를 의미하는 것으로 또한 사용된다. 즉 아밀로수크라제는 이러한 측쇄형 수용체에서 α-1,4-글루칸 사슬 확장을 촉매화한다. 사용된 측쇄형 출발물질(starting material)과 비교해서, 얻어진 생성물은 더 낮은 측쇄도(degree of branching)를 갖는다. 이러한 생성물은 본 발명에서 불수용성 α-1,4-글루칸으로 또한 불린다.
원칙적으로, 본 발명의 방법에서는 어떠한 아밀로스크라제도 사용될 수 있다. 바람직하게, 원핵 생물기원(prokaryotic origin)의 아밀로수크라제가 사용된다. 예를 들어, 이러한 타입의 효소는, 나이세리아 퍼플라바(Neisseria perflava)[Okada and Hehre, J. Biol. Chem. 249(1974), 126-135; MacKenzie et al., Can. J. Microbiol. 23(1977), 1303-1307] 또는 나이세리아 카니스(Neisseria canis), 나이세리아 세네레아(Neisseria cinerea), 나이세리아 데니트리피칸스(Neisseria denitrificans), 나이세리아 시카(Neisseria sicca) 및 나이세리아 서브플라바(Neisseria subflava)[MacKenzie et al., Can. J. Microbiol. 24(1978, 357-362)]로부터 알려져 있다. 또한, WO 95/31553은 나이세리아 폴리사카레아로부터 얻어지는 아밀로수크라제를 기술한다. 특히 바람직하게, 원핵생물(prokaryote)에 의해 자연적으로 분비되는(secreted) 아밀로수크라제가 사용된다.
본 발명의 방법의 바람직한 실시예에서, 나이세리아 속(the genus Neisseria)의 박테리아로부터 얻이진 아밀로수크라제, 특히 바람직하게는 나이세리아 폴리사카레아 종(species)으로부터 얻어진 아밀로수크라제가 사용된다.
본 발명을 위해서, 불수용성 α-1,4-글루칸은 아밀로수크라제를 이용하는 수크로스의 상술된 변환에 의해 제조되는 다당류이다. "불수용성 글루칸"이라는 용어는, 특히 아밀로수크라제를 사용하는 수크로스의 상술된 변환에 의해 제조되는 다당류를 의미하는 것으로 사용되는데, 이것은 독일 약전(German Pharmacopeia)(DAB = Deutsches Arzneimittelbuch, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, Govi-Verlag GmbH, Frankfurt, 9th edition, 1987)의 정의에 따라, "용해되기 어려운(sparingly soluble)" 화합물, "매우 용해되기 어려운(very sparingly soluble)" 화합물 또는 "실질적으로 불용성인(virtually insoluble)" 화합물의 범주에 속한다.
본 발명을 위해서, "버퍼-프리 시스템"이라는 용어는 기본적으로 버퍼 솔트를 함유하지 않는 수용액 시스템이다. "버퍼 솔트"라는 용어는 이와 관련해서 무기 및 유기염, 특히 약산과 약염기의 염을 의미하는 것으로 사용된다. "기본적으로 없는(essentially no)"이라는 용어는 이와 관련해서 최대 25mM, 바람직한 실시예에서 최대 10mM, 더욱 바람직한 실시예에서 최대 5mM 및 아주 특별히 바람직한 실시예에서는 최대 1mM의 버퍼 솔트 농도를 의미하는 것으로 사용된다.
본 발명의 방법의 더욱 특히 바람직한 실시예에서, 무기 및 유기염을 불순물로 미량(＜ 1mM)으로만 함유하는 수용액 시스템이 사용될 수 있다. 매우 특히 바람직하게 버퍼-프리 수용액 시스템은 순수한 물이다.
본 발명의 방법의 특히 바람직한 실시예에서는, 정제된 아밀로수크라제가 사용된다. 여기서 정제된 아밀로수크라제는 단백질이 합성되는 세포들의 세포 구성성분(cell constituents)으로부터 실질적으로 유리된(free) 효소를 의미하는 것으로 사용된다. 바람직하게, "정제된 아밀로수크라제"라는 용어는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 및 특히 바람직하게는 적어도 95%의 순도를 갖는 아밀로수크라제를 의미한다.
α-1,4-글루칸을 제조하기 위한 정제된 단백질의 사용은 여러 가지 장점을 제공한다. 부분적으로 정제된 단백질 추출물을 이용해서 행하는 방법과 비교해서, 본 발명 방법의 반응 배지(reaction medium)는, 단백질의 정제 또는 생명공학적인 제조에 사용되는 제조 균주(production strain)[미생물(microorganism)]의 잔류물을 함유하지 않는다.
또한, 정제된 단백질을 이용해서, 식품 및 제약 산업에서 적용하기 위한 장점들을 볼 수 있다. 모든 불필요한 구성성분으로부터 유리된, 한정된 반응 배지 조성물로 인해서, 생성물의 구성성분은 또한 더욱 세밀하게 한정될 수 있다. 이것은 식품 및 제약 산업에서 생명공학에 의해 제조된 이러한 생성물에 대한 상당히 덜 광범위한 승인 과정을 초래하는데, 이것은 특히 이러한 생성물들이 미량의 트랜스제닉 미생물(transgenic microorganism)을 갖지 말아야만 하기 때문이다.
본 발명 방법의 특히 바람직한 실시예에서, 아밀로수크라제는 재조합체(recombinant)로 제조되는 단백질이다. 본 발명의 상기 내용에서, 이것은 단백질을 코딩하는 DNA 서열(DNA sequence coding)을 호스트 세포(host cell)에 도입하고 그곳에서 발현(expressing)시킴으로써 제조되었던 단백질을 의미하는 것으로 사용된다. 다음으로 단백질은 호스트 세포 및/또는 배양 배지(culture medium)로부터 분리될 수 있다. 이러한 경우에 호스트 세포는, 예를 들어 슈레겔의 "Allgemeine Mikrobiologie" [일반 미생물학] (Georg Thieme Verlag, 1985, 1-2)에 정의된 바와 같이, 바람직하게는 박테리아 또는 원생생물(protist)[예를 들어, 곰팡이, 특히 이스트, 조류(algae)]이다. 특히 바람직하게, 아밀로수크라제는 호스트 세포에 의해 분비된다. 재조합체 아밀로수크라제의 제조를 위한 상기 타입의 호스트 세포는 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
여러 발현 시스템의 리뷰(review)는, 예를 들어 효소학 방법 153(1987), 385-516 및 비터 등의 [효소학 방법 153(1987), 516-544]에서 발견될 수 있다. 발현 벡터(expression vector)는 문헌에 대부분 기술되어 있다. 선택 표지 유전자(selection marker gene) 및 선택된 호스트에서 복제(replication)를 보증하는 복제 오리진(replication origin) 외에도, 일반적으로 이것은 박테리아성 또는 바이러스성 프로모터(viral promoter)를 함유하고, 일반적으로 전사(transcription)를 위한 종료 신호(termination signal)를 함유한다. 프로모터와 종료 신호 사이에는 코딩 DNA 서열을 삽입할 수 있도록 하는 적어도 하나의 제한 자리(restriction site) 또는 폴리링커(polylinker)가 위치한다. 사용되는 프로모터 서열은, 이것이 만일 선택된 호스트 유기체에서 활성이면, 해당되는 유전자의 전사를 자연스럽게 통제하는 DNA 서열이 될 수 있다. 그러나, 또한 이러한 서열은 다른 프로모터 서열에 의해 치환될 수 있다. 유전자의 구조 발현(constitutive expression)을 일으키는 프로모터가 사용될 수 있거나, 다음 유전자 발현의 특정 조절을 허용하는 유도 프로모터(inducible promoter)가 사용될 수 있다. 이러한 특성들을 갖는 박테리아성 및 바이러스성 프로모터 서열은 문헌에 광범위하게 기술된다. 미생물(예를 들어 E. coli, S. cerevisiae)에서의 발현을 위한 조절 서열(regulatory sequence)은 문헌에 적절하게 기술되어 있다. 다음 유전자의 특히 높은 발현을 허용하는 프로모터는, 예를 들어 T7 프로모터[Studier et al., 효소학 방법 185(1990), 60-89], lacuv5, trp, trp-lacUV5 [DeBoer et al., in Rodriguez and Chamberlin(Eds), 프로모터, 구조 및 기능; Praeger, New York, (1982), 462-481; DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 21-25], lpl, rac [Boros et al., Gene 42 (1986), 97-100]이다. 일반적으로, 단백질의 양은 미생물 성장 주기의 대수상태 말기(the end of the logarithmic phase)로 가면서 중간으로부터 이들의 최대치에 이른다. 따라서, 단백질 합성을 위해서는, 바람직하게 유도 프로모터가 사용된다. 이것은 흔히 구조 프로모터(constitutive promoter)보다 더 높은 단백질의 수율을 초래한다. 흔히 강한 구조 프로모터의 사용은, 복제된 유전자(cloned gene)의 일정한 전사 및 번역(translation)을 통해서 다른 필수적인 세포 기능들을 위한 에너지가 상실되는 것을 초래하고, 이에 따라 세포 성장이 지연된다[Bernard R. Glick/Jack J. Pasternak, Molekulare Biotechnologie(1995), Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg Berlin Oxford, p. 342]. 따라서, 적절한 단백질 양을 얻기 위해서, 흔히 두 단계의 방법이 사용된다. 첫 번째로, 최적 조건에서 호스트 세포는 상대적으로 높은 세포 밀도로 배양된다. 두 번째 단계에서, 다음으로 사용된 프로모터의 타입에 따라 전사가 유도된다. 상기 내용에서 특히 적절한 프로모터는, 락토오스 또는 IPTG(=이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드)에 의해 유도될 수 있는 tac 프로모터이다[DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80(1983), 21-25]. 또한 전사에 대한 종료 신호는 문헌에 기술되어 있다.
일반적으로 호스트 세포는, 예를 들어 샘브룩 등의 [Molecular Cloning: A Laboratory Course Manual, 2th edition(1989), Cold Spring Harbor Press, New York]에 기술되어 있는 바와 같이, 표준 방법에 의한 아밀로수크라제-코딩 DNA를 사용해서 변형될 수 있다. 호스트 세포는, 사용되는 각각의 호스트 세포의 필요 조건을 충족시키는 영양 배지(nutrient media)에서, 특히 pH, 온도, 염 농도, 폭기(aeration), 항생제, 비타민, 미량 원소 등을 고려해서 배양된다.
호스트 세포에 의해 생산되는 효소는, 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 HPLC 등과 같은 종래의 정제 방법에 의해 정제될 수 있다.
아밀로수크라제에 대한 호스트 세포 및 코드에서 발현되는 DNA의 변이에 의해, 폴리펩타이드는 특정한 특성으로 인해서, 배양 배지로부터 보다 쉽게 분리될 수 있는 호스트 세포에서 생성될 수 있다. 따라서, 단백질을 추가적인 폴리펩타이드 서열을 갖는 융합 단백질(fusion protein)로 발현되도록 발현시킬 가능성이 있고, 이것의 특정한 결합 특성은 친화 크로마토그래피에 의해 융합 단백질이 분리될 수 있도록 한다[예를 들어, Hopp et al., Bio/Technology 6 (1988), 1204-1210; Sassenfeld, Trends Biotechnol. 8 (1990), 88-93].
본 발명 방법의 바람직한 실시예에서, 재조합체에 의해 생성되고 호스트 세포에 의해 영양 배지로 분비되는 아밀로수크라제가 사용되므로, 세포 소화(cell digestion) 및 단백질의 추가적인 정제가 필요하지 않은데, 이것은 분비된 단백질이 상층액(supernatant)으로부터 분리될 수 있기 때문이다. 배양 배지의 잔류 구성성분을 제거하기 위해서, 예를 들어 투석(dialysis), 역삼투(reverse osmosis), 크로마토그래피 방법 등의 공정 공학(process engineering)상의 종래 방법이 사용될 수 있다. 또한 이와 동일한 것이 배양 배지로 분비되는 단백질을 농축하기 위해 적용된다. 일반적으로 미생물에 의한 단백질의 분비는 N-말단 신호 펩타이드[신호 서열, 리더 펩타이드(leader peptide)]에 의해 조정된다. 이러한 신호 서열을 갖는 단백질은 미생물의 세포막을 투과할 수 있다. 단백질의 분비는, 해당하는 아밀로수크라제-코딩 영역에 결합되어 있는 이러한 신호 펩타이드에 대해 코드화된 DNA 서열에 의해 이루어진다. 바람직하게, 신호 펩타이드는 발현된 아밀로수크라제, 특히 바람직하게는 나이세리아 폴리사카레아로부터 얻어진 아밀로수크라제의 자연적인 신호 펩타이드이다.
매우 특히 바람직하게, 신호 펩타이드는 클레브시엘라 옥시토카 M5A1(Klebsiella oxytoca M5A1)로부터 얻어진 α-CGTase의 신호 펩타이드이거나[Fiedler et al., J. Mol. Biol. 256 (1996), 279-291] 또는 액세스 번호(access number) X864014로 젠뱅크(GenBank)에서 얻을 수 있는 서열의 뉴클레오티드(nucleotides) 11529-11618에 의해 코드화된 것과 같은 신호 펩타이드이다.
대안적으로, 본 발명의 방법에서 사용되는 아밀로수크라제는 미생물을 사용하지 않고 단백질의 발현을 초래하는 생체외 전사 및 번역 시스템을 사용해서 또한 제조될 수 있다.
본 발명의 방법의 바람직한 실시예에서, 외부 탄수화물 수용체(external carbohydrate acceptor)는 아밀로수크라제에 의한 수크로스의 변환에서 첨가된다.
본 발명을 위해서, 외부 탄수화물 수용체는 아밀로수크라제에 의해 수크로스의 변환 개시 속도(initial rate)를 증가시킬 수 있는 분자이다. 바람직하게, 외부 탄수화물 수용체는 변환 초기에 반응 혼합물에 첨가된다. 외부 수용체의 사용은 공정 시간의 감소 및 이에 따른 공정 비용의 감소를 초래한다. 바람직하게 탄수화물 수용체는 과당류(oligosaccharide) 또는 다당류, 바람직하게 직쇄형 다당류이고, 특히 바람직하게 측쇄형 다당류로, 예를 들어 덱스트린, 글리코겐 또는 아밀로펙틴이다. α-1,4-글루칸 사슬 확장이 이러한 수용체에서 일어난다면, 측쇄형 출발물질과 비교했을 때 상당히 더 낮은 측쇄도(degree of branching)를 갖는 생성물이 형성된다. 이러한 경우에 측쇄도의 감소 정도는 중합도(degree of polymerization)(n)에 의존한다. 수용체와 비교했을 때 상당한 몰 과량(molar excess)으로 수크로스가 사용된다면, 생성물에서 α-1,6-측쇄(branches)는 메틸화 분석(methylation analysis)에 의해 더 이상 측정될 수 없다(측쇄도 ＜ 1%). 이러한 생성물은 또한 본 발명에서 불수용성 α-1,4-글루칸으로 불린다.
보다 바람직한 실시예에서, 아밀로수크라제의 효소 활성을 갖는 효소는 지지 물질(support material)에 고정되어 있다. 아밀로수크라제의 고정(immobilization)은 효소가 합성 반응의 촉매로서 간단한 방법으로 반응 혼합물로부터 회수되고 반복적으로 사용될 수 있다는 장점을 제공한다. 효소의 정제는 일반적으로 비용 집약적이고 시간 소비적이기 때문에, 효소의 고정 및 재사용은 상당한 비용 절감을 가능하게 한다. 추가적인 장점은, 단백질 잔류물을 함유하지 않는 반응 생성물의 순도이다.
지지물질의 다중성(multiplicity)은 단백질의 고정에 이용될 수 있고, 지지물질에 대한 결합은 공유 또는 비공유 결합을 통해 일어날 수 있다(효소학 방법 135, 136, 137 참조). 지지물질로 광범위하게 사용되는 물질은, 예를 들어 아가로스(agarose), 알지네이트(alginate), 셀룰로우스, 폴리아크릴아미드, 실리카 또는 나일론이다.
상기 방법의 효율은 수크로스 양의 감소를 기준으로 결정되었다.
다음 아래의 실시예들은 본 발명을 예시한다.
실시예 1
아밀로수크라제의 정제
아밀로수크라제를 제조하기 위해, 나이세리아 폴리사카레아로부터 얻어진 아밀로수크라제를 이용해서 변환된 E. coli 세포가 사용되었다(WO 9531553 참조). DNA는 N. 폴리사카레아 지놈 라이브러리(N. polysaccharea genome library)에서 기원한다.
나이세리아 폴리사카레아로부터 얻어진 아밀로수크라제를 분비하는 이러한 E. coli 세포를 하룻밤 동안 배양한 배양세포는 원심분리되고, 구연산 나트륨 버퍼(pH 6.5) 50mM, DTT[디티오트레이톨(dithiothreitol)] 10mM, PMSF(페닐메틸술포닐플루어라이드) 1mM의 약 1/20 부피로 재부유(resuspend)되었다. 다음에 세포들은 16000 psi인 프렌치 프레스(French press)를 사용해서 두 번 붕괴되었다. 다음으로, MgCl2및 벤조나제(Benzonase)(머크사; 100000 단위; 250 단위 ㎕-1) 1mM이 ml 당 12.5 단위(12.5 units ml-1)의 최종 농도로 세포 추출물에 첨가되었다. 다음으로 용액은 37℃에서 적어도 30분 동안 천천히 저어주면서 배양되었다. 추출물은 적어도 1.5시간 동안 얼음에 방치되었다. 다음으로 추출물은 상층액이 상대적으로 맑아질 때까지 약 40000g로 4℃에서 30분 동안 원심분리되었다. 0.45㎛의 구멍 직경(pore diameter)을 갖는 PVDF 막[밀리포어(millipore) "Durapore", 또는 유사물]의 선여과(prefiltration)가 실행되었다. 추출물은 4℃에서 하룻밤 동안 방치되었다. 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)(HI) 크로마토그래피를 실행하기 전에, 고체 NaCl이 추출물에 첨가되었고, 2M 농도의 NaCl이 생성되었다. 다음으로 추출물은 4℃에서 30분 동안 약 40000mg으로 또 원심분리되었다. 추출물은 0.22㎛의 구멍 직경을 갖는 PVDF 막(밀리포어 "Durapore", 또는 유사물)로 여과시킴으로써 E.coli 최종 잔류물로부터 유리되었다. 여과된 추출물은 부틸세파로스-4B 컬럼(butylsepharose-4B column)(Pharmacia)(컬럼 부피: 93ml, 길이: 17.5cm)에서 분리되었다. ㎕ 당 1 내지 5 단위(units ㎕-1)의 아밀로수크라제 활성을 갖는 약 50ml의 추출물이 컬럼에 가해졌다. 다음으로, 비결합 단백질은 버퍼 B(버퍼 B: pH 6.5의 구연산 나트륨 50mM, 2M NaCl) 150ml를 사용해서 컬럼으로부터 세척되었다. 최종적으로 아밀로수크라제는 감소하는 선형 NaCl 그래디언트(falling linear NaCl gradient)[유입속도(inflow rate)가 1.5ml min-1일 때 부피가 433ml인 구연산 나트륨 50mM에서 NaCl은 2M에서 0M로 감소]를 사용해서 용출(elute)되는데, 이것은 자동 펌프 시스템(FPLC, Pharmacia)을 사용해서 생성되었다. 아밀로수크라제는 0.7M 내지 0.1M NaCl로 용출된다. PD10 세파덱스 컬럼(Pharmacia)을 통해서 단편(fraction)이 수집되고 탈염(desalt)되며, 8.7% 글리세롤로 안정화되고, 아밀로수크라제 활성 테스트를 거쳐서, 최종적으로 저장 버퍼(storage buffer)(8.7% 글리세롤, 50mM 구연산염)에서 냉각된다.
실시예 2
아밀로수크라제의 활성 측정
정제된 단백질 또는 원(crude) 단백질 추출물은, 5% 수크로스, 0.1% 글리코겐 및 pH 6.5의 100mM 구연산염을 함유하는 1ml 배치(batch) 안의 여러 희석액에서 37℃로 배양되었다. 5분, 10분, 15분, 20분, 25분 및 30분 뒤에, 이러한 용액 각각으로부터 10㎕를 취하고 95℃까지 신속하게 가열함으로써 아밀로수크라제의 효소 활성이 종료된다. 결합 광도 측정 테스트(a coupled photometric test)에서, 아밀로수크라제에 의해 방출되는 프룩토스의 함량이 측정된다. 이것에 대해, 비활성화된 샘플 1㎕ 내지 10㎕가, pH 6.9의 50mM 이미다졸 버퍼, 2mM MgCl2, 1mM ATP, 0.4mM NAD 및 헥소키나제(hexokinase) 0.5 U/ml 1ml에 첨가된다. 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제[레우코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides)로부터 얻어짐]와 포스포글루코스 이소메라제(phosphoglucose isomerase)를 순서대로 첨가한 후에, 340nm에서의 흡수 변화가 측정되었다. 다음으로, 람베르트-비어 법칙을 이용해서, 방출된 프룩토스의 양이 계산된다.
만일 얻어진 값이 샘플링 시간(sampling time)과 관계가 있다면, 단위수(the number of units)(1U = μmol 프룩토스/min)(단백질 추출물 ㎕ 당 또는 정제된 단백질 ㎍ 당)가 측정될 수 있다.
실시예 3
버퍼 시스템과 비교되는 버퍼-프리 시스템에서의 반응
용액 부피: 50ml
효소 활성: 5 단위/ml
버퍼: 0mM(=물) 내지 200mM에서 변화하는 pH 6.5의 Na 아세테이트(머크)
기질: 10% 수크로스(ICN)
프라이머(primer): 0.1% 덱스트린, 타입 IV 포테이토(시그마)
방법
10% 수크로스, 0.1% 덱스트린, 250 단위의 아밀로수크라제 및 농도가 서로 다른 반응 버퍼(pH 6.5인 25mM, 50mM, 100mM 또는 200mM Na 아세테이트)를 함유하는 50ml 반응 부피의 각각의 용액이 46시간 및 73.25 시간 동안 37℃에서 배양되었다. 또한, 반응 혼합물은 버퍼-프리, 즉 탈광수(demineralized water)(pH 7.0)에서 제조되었다. 버퍼 물질을 제외하고는, 이 반응 용액은 상기 언급된 모든 성분들을 함유했다.
수크로스가 아밀로스 및 프룩토스로 변환되는 것을 측정하기 위해, 여러 시점에서 6개의 반응 용액 각각으로부터 1ml 알리쿼츠(aliquots)를 취했다. 95℃까지 10분간 가열함으로써 취해진 샘플에서의 반응이 종료되었다. 광도계(photometer)에서 결합 효소 테스트를 사용해서, 형성된 프룩토스를 측정하거나 또는 활성화되지 않은 샘플에 여전히 존재하는 수크로스의 농도를 측정함으로써 변환 속도가 측정되었다.
효소 분석(Enzyme assay)
분석 부피: 1ml
효소: 이스트로부터 얻어진 헥소키나제, 포스포글루코스 이소머라제, 레우코노스톡 메센테로이드로부터 얻어진 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제, 이스트로부터 얻어진 β-프룩토시다제(모든 효소: Boehringer Mannheim)
분석 버퍼: 1mM ATP
0.4mM NAD+
pH 6.9의 50mM 이미다졸
상기 테스트는 헥사키나제와 포스포글루코스 이소머라제를 사용해서 프룩토스를 글루코스-6-포스페이트로 변환하는 것에 기초한다. 다음으로, 글루코스-6-포스페이트는 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제를 통해 6-포스포-글루코네이트로 변환된다. 이러한 반응은 NAD+에서 NADH + H+로의 변환과 연결되어 있고, 이것은 340nm의 파장에서 광도측정에 의해 측정될 수 있다. 람베르트-비어 법칙을 이용해서, 프룩토스의 양은 최종 흡수로부터 계산될 수 있다.
수크로스의 농도를 측정하기 위해서, β-프룩토시다제(β-fructosidase)는 상술된 반응 혼합물 외에 측정될 샘플에 첨가된다. 이러한 효소는 수크로스를 프룩토스와 글루코스로 분리시킨다. 다음으로 이러한 반응으로부터 얻어진 2개의 단당류의 농도는, NAD+에서 NADH + H+로의 변환을 이용해서 상술된 바와 같이 측정된다. 수크로스 농도는 측정된 총 단당류로부터 계산될 수 있다.
결과:
약 73시간 후에, 모든 반응 조건에서 반응 용액에 존재하는 수크로스는 아밀로스와 프록토스로 거의 100% 변환된다.
본 발명은 바람직한 실시예와 함께 기술되고 있다. 다수의 대안적인 변경, 변형 및 사용은 앞서 진술한 설명의 관점에서 당업자들에게 자명할 것이다.
Claims (8)
- 아밀로수크라제(amylosucrase)의 효소 활성을 갖는 효소에 의해 수크로스(sucrose)가 불수용성 α-1,4-글루칸(water-insoluble α-1,4-glucan)과 프룩토스(fructose)로 생체외(in vitro) 변환되는 불수용성 α-1,4-글루칸 제조 방법으로, 버퍼-프리 수용액 시스템(aqueous, buffer-free system)에서 반응을 실행시키는 것을 포함하는, 불수용성 α-1,4-글루칸 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 아밀로수크라제는 원핵 생물(prokaryotic organism)로부터 얻어지는 효소인, 불수용성 α-1,4-글루칸 제조 방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 원핵 생물은 나이세리아 속(the genus Neisseria)에 속하는, 불수용성 α-1,4-글루칸 제조 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 원핵 생물은 나이세리아 폴리사카레아(Neisseria polysaccharea)인, 불수용성 α-1,4-글루칸 제조 방법.
- 제 1항 내지 제 4항 중 한 항에 있어서, 상기 아밀로수크라제는 재조합체(recombinant)로 제조되는, 불수용성 α-1,4-글루칸 제조 방법.
- 제 1항 내지 제 5항 중 한 항에 있어서, 정제된 아밀로수크라제(purified amylosucrase)가 사용되는, 불수용성 α-1,4-글루칸 제조 방법.
- 제 1항 내지 제 6항 중 한 항에 있어서, 상기 아밀로수크라제는 지지 물질(support material)에 결합되는, 불수용성 α-1,4-글루칸 제조 방법.
- 제 1항 내지 제 7항 중 한 항에 있어서, 외부 탄수화물 수용체(external carbohydrate acceptor)가 첨가되는, 불수용성 α-1,4-글루칸 제조 방법.
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