KR20010022352A - A cDNA ENCODING C6 β-CHEMOKINE LEUKOTACTIN-1(LKN-1) ISOLATED FROM HUMAN - Google Patents
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Abstract
Description
케모카인은 저분자량의 염기성 단백질로 이루어진 사이토카인류에 속하는 물질로서, 공통적으로 4개의 시스테인을 가지고 있으며, 처음 두개의 시스테인이 서로 인접해 있는가 혹은 하나의 아미노산이 두개의 시스테인 사이에 위치하는가의 여부에 따라, CXC(α), CC(β), C(γ) 및 CX3C의 4가지 부계열(subfamily)로 분류된다(참조: Baggiolini M. et al., Immunol. Today, 15:127, 1994; Kelner S.G., et al., Science, 266:1395, 1994; Bazan J.F. et al., Nature, 385:640, 1997). 케모카인 부계열의 유전자는 같은 염색체상에 무리지어 존재하는데, 예를 들면, α-케모카인 유전자는 사람의 염색체 4q12-21상에, β-케모카인 유전자는 사람의 염색체 17q11-32 및 마우스 염색체 11상에 위치한다.Chemokines are members of the cytokine family of low molecular weight basic proteins, which have four cysteines in common, and whether the first two cysteines are adjacent to each other, or whether an amino acid is located between two cysteines. Thus, it is classified into four subfamily of CXC (α), CC (β), C (γ) and CX 3 C (Baggiolini M. et al., Immunol. Today, 15: 127, 1994). Kelner SG, et al., Science, 266: 1395, 1994; Bazan JF et al., Nature, 385: 640, 1997). The chemokine subfamily genes are clustered on the same chromosome, for example, the α-chemokine gene is on human chromosome 4q12-21 and the β-chemokine gene is on human chromosome 17q11-32 and mouse chromosome 11 Located.
이들 케모카인류는 HIV-억제 작용, 면역조절 작용, 백혈구 이동 또는 조혈 간세포의 분열 억제 작용 등의 생물학적 활성을 나타내는 것으로 보고되고 있다(참조: Cocci F. et al., Science, 270:1811, 1995; Wolpe S.D. et al., J. Exp. Med., 167:570, 1998; Graham G.J. et al., Nature, 344:442, 1990; Broxmeyer H.E. et al., Blood, 76:1110, 1990; and Youn B.S. et al., J. Immunol., 155:2661, 1995)These chemokines have been reported to exhibit biological activities such as HIV-inhibitory activity, immunomodulatory activity, leukocyte migration or inhibiting the division of hematopoietic stem cells (Cocci F. et al., Science, 270: 1811, 1995; Wolpe SD et al., J. Exp. Med., 167: 570, 1998; Graham GJ et al., Nature, 344: 442, 1990; Broxmeyer HE et al., Blood, 76: 1110, 1990; and Youn BS et al., J. Immunol., 155: 2661, 1995)
또한, 케모카인은 막통과부위 G 단백질이 연관된 수용체(transmembrane domain G protein-coupled receptors)에 결합하여 백혈구를 활성화시키며, 그 중의 일부 수용체는 HIV-1 감염시 보조수용체(coreceptor)로도 이용되는 것으로 보고되고 있다(참조: Oh K.-O. et al., J. Immunol., 147:2978, 1991; Alkbatih G. et ak., Science, 272;1955, 1996). 예를 들면, β-케모카인(CC 케모카인)의 수용체 아형에는 8가지 즉, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8이 있는데, 이중에서 CCR1, CCR2, CCR3 및 CCR5는 다양한 케모카인에 결합능을 나타내지만, CCR4, CCR6 및 CCR8는 한 가지 케모카인에 대하여 고친화력을 나타내는 것으로 밝혀졌다.In addition, chemokines bind to transmembrane domain G protein-coupled receptors to activate leukocytes, some of which are reported to be used as coreceptors in HIV-1 infection. (Oh K.-O. et al., J. Immunol., 147: 2978, 1991; Alkbatih G. et ak., Science, 272; 1955, 1996). For example, there are eight receptor subtypes of β-chemokine (CC chemokine), namely CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, and CCR8, of which CCR1, CCR2, CCR3 and CCR5 are present in various chemokines. Although exhibiting binding capacity, CCR4, CCR6 and CCR8 have been found to exhibit high affinity for one chemokine.
지금까지, β-케모카인 부계열에 속하는 9개의 케모카인이 발견되었고(참조: Wilson S.D. et al., J. Exp. Med., 171:1301, 1990; Modi W.S. et al., Hum. Genet., 84:185, 1990), 그들 중 뮤린 MRP-1(murine macrophage inflammatory protein-related protein-1, mMRP-1)(참조: Orlafsky A. et al., Cell Regul., 2:403, 1991) 및 뮤린 MRP-2(mMRP-2)(참조: Youn B.-S. et al., J. Immunol., 155:2661, 1995)는 β-케모카인 부계열에 속하는 다른 케모카인보다 두개의 시스테인 잔기가 더 존재하므로, 제 3의 이황화결합이 가능하고, N-말단 부위가 상당히 길어. 이들 MRPs는 C6 β-케모카인으로 분류되었다.To date, nine chemokines belonging to the β-chemokine subfamily have been identified (Wild SD et al., J. Exp. Med., 171: 1301, 1990; Modi WS et al., Hum. Genet., 84 : 185, 1990), among them murine macrophage inflammatory protein-related protein-1, mMRP-1 (Orlafsky A. et al., Cell Regul., 2: 403, 1991) and murine MRP -2 (mMRP-2) (Youn B.-S. et al., J. Immunol., 155: 2661, 1995) has two more cysteine residues than other chemokines belonging to the β-chemokine subsequence. Tertiary disulfide bonds are possible, and the N-terminal region is quite long. These MRPs were classified as C6 β-chemokines.
현재로서는 사람의 MRPs에대하여 MRP-1 및 MRP-2만이 보고되어 있을 뿐이나, HIV-1 감염시의 치료 혹은 화학요법이나 방사선치료시의 골수간세포 보호등의 목적으로 응용될 수 있는 MRP류의 잠재적 효용성 때문에, 신규한 사람 MRP에 대한 분리 및 성질 규명이 절실히 요구되어 왔다.Currently, only MRP-1 and MRP-2 have been reported for human MRPs, but MRPs that can be applied for the treatment of HIV-1 infection or for the protection of bone marrow stem cells during chemotherapy or radiation therapy. Because of their potential utility, isolation and characterization of new human MRPs is urgently needed.
발명의 요약Summary of the Invention
이에, 본 발명자들은 각종 사람 세포주로부터의 신규의 MRP 유전자를 분리하고자 예의 노력한 결과, 사람의 단핵세포주로부터 C6 β-케모카인에 속하는 신규한 MRP cDNA를 분리하여, 그의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 결정하였으며, 나아가 전기 MRP cDNA를 재조합 대장균 또는 곤충세포에서 발현시켰다. 아울러, 발현된 재조합 단백질이 생체외(in vitro) 및 생체내(in vivo)에서 골수양간세포(myeloid stem cell)의 증식과 집락(colony) 형성을 억제하며, 말초혈액 백혈구의 서브셋(림프구, 단핵구, 호중구)을 유인하는 화학주성을 가지는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다. 이에, 이하에서는 사람에서 분리된 전기 MRP cDNA를 "Lkn-1(leukotactin-1) cDNA"로, 재조합 MRP를 "재조합 Lkn-1"으로 명명하였다.Accordingly, the present inventors have made efforts to isolate novel MRP genes from various human cell lines. As a result, the present inventors have isolated new MRP cDNAs belonging to C6 β-chemokine from human mononuclear cell lines, and their base sequences and amino acid sequences inferred therefrom. In addition, the electric MRP cDNA was expressed in recombinant E. coli or insect cells. In addition, the expressed recombinant protein inhibits the proliferation and colony formation of myeloid stem cells in vitro and in vivo, and a subset of peripheral blood leukocytes (lymphocytes, monocytes). And neutrophils) were confirmed to have a chemotaxis to complete the present invention. Thus, hereinafter, the electric MRP cDNA isolated from human was named "Lkn-1 (leukotactin-1) cDNA", and recombinant MRP was named "recombinant Lkn-1".
결국, 본 발명의 첫번째 목적은 신규한 C6 β-케모카인(Lkn-1)의 cDNA 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 제공하는 것이다.After all, the first object of the present invention is to provide cDNA of novel C6 β-chemokine (Lkn-1) and amino acid sequences inferred therefrom.
본 발명의 두번째 목적은 전기 Lkn-1 cDNA를 포함하는 발현벡터 및 그로부터 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.It is a second object of the present invention to provide an expression vector comprising the aforementioned Lkn-1 cDNA and a recombinant microorganism transformed therefrom.
본 발명의 세번째 목적은 전기 형질전환된 재조합 미생물로부터 재조합 Lkn-1의 제조방법을 제공하는 것이다.It is a third object of the present invention to provide a method for preparing recombinant Lkn-1 from an electrotransformed recombinant microorganism.
본 발명의 네번째 목적은 재조합 Lkn-1을 사용하여 항암제 및 방사선으로부터 골수양세포(myeloid cell)를 보호하는 방법을 제공하는 것이다.A fourth object of the present invention is to provide a method of protecting myeloid cells from anticancer agents and radiation using recombinant Lkn-1.
본 발명은 사람에서 분리한 신규 C6 β-케모카인의 cDNA 및 C6 β-케모카인의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 C6 β-케모카인에 속하며 말초혈액 백혈구의 서브셋(subsets)을 유인하는 신규의 단백질을 암호화하는 cDNA의 발현 벡터를 이용한 제조 및 전기 단백질의 약제학적 응용에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing cDNA and C6 β-chemokine of novel C6 β-chemokine isolated from humans. More specifically, the present invention relates to the preparation and use of electrical proteins with expression vectors of cDNA belonging to C6 β-chemokine and encoding novel proteins that attract subsets of peripheral blood leukocytes.
도 1a는 202bp DNA 절편의 염기서열(서열번호 1) 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열(서열번호 2)을 나타낸다.1A shows the nucleotide sequence of the 202 bp DNA fragment (SEQ ID NO: 1) and the amino acid sequence inferred therefrom (SEQ ID NO: 2).
도 1b는 Lkn-1의 아미노산 서열(서열번호 2)을 mMRP-2의 87번째 내지 110번째 아미노산 서열(서열번호 3)과 비교한 것을 나타낸다.FIG. 1B shows a comparison of the amino acid sequence of Lkn-1 (SEQ ID NO: 2) with the 87th to 110th amino acid sequences of mMRP-2 (SEQ ID NO: 3).
도 2는 다양한 사람의 세포주로부터 분리한 총 RNA를 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)한 결과를 나타낸 사진이다.Figure 2 is a photograph showing the results of reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) of total RNA isolated from various human cell lines.
도 3은 Lkn-1 cDNA의 염기서열(서열번호 4) 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열(서열번호 5)을 나타낸다.3 shows the nucleotide sequence of Lkn-1 cDNA (SEQ ID NO: 4) and the amino acid sequence inferred therefrom (SEQ ID NO: 5).
도 4는 성숙한 Lkn-1의 아미노산 서열(서열번호 7)을 mMRP-1(서열번호 8), mMRP-2(서열번호 9), hMIP-1α(서열번호 10), mMIP-1α(서열번호 11) 또는 hMIP-1β(서열번호 12)의 아미노산 서열과 비교한 것을 나타낸다.4 shows the amino acid sequence of mature Lkn-1 (SEQ ID NO: 7), mMRP-1 (SEQ ID NO: 8), mMRP-2 (SEQ ID NO: 9), hMIP-1α (SEQ ID NO: 10), and mMIP-1α (SEQ ID NO: 11). ) Or the amino acid sequence of hMIP-1β (SEQ ID NO: 12).
도 5a는 골수에서 골수양세포의 집락형성에 대한 Lkn-1의 영향을 나타내는 그래프이다.Figure 5a is a graph showing the effect of Lkn-1 on the colonization of myeloid cells in the bone marrow.
도 5b는 비장에서 골수양세포의 집락형성에 대한 Lkn-1의 영향을 나타내는 그래프이다.Figure 5b is a graph showing the effect of Lkn-1 on the colonization of myeloid cells in the spleen.
도 5c는 골수에서 골수양세포의 증식율에 대한 Lkn-1의 영향을 나타내는 그래프이다.5c is a graph showing the effect of Lkn-1 on the proliferation rate of myeloid cells in bone marrow.
도 5d는 비장에서 골수양세포의 증식율에 대한 Lkn-1의 영향을 나타내는 그래프이다.5D is a graph showing the effect of Lkn-1 on the proliferation rate of myeloid cells in the spleen.
도 6a는 골수에서 골수양세포의 증식에 대한 Lkn-1의 농도의존적 억제영향을 나타내는 그래프이다.Figure 6a is a graph showing the concentration-dependent inhibitory effect of Lkn-1 on the proliferation of myeloid cells in bone marrow.
도 6b는 비장에서 골수양세포의 증식에 대한 Lkn-1의 농도의존적 억제영향을 나타내는 그래프이다.Figure 6b is a graph showing the concentration-dependent inhibitory effect of Lkn-1 on the proliferation of myeloid cells in the spleen.
도 7a는 골수에서 CFU-GM의 증식율에 대한 Lkn-1의 시간의존적 억제영향을 나타내는 그래프이다.7A is a graph showing the time dependent inhibition of Lkn-1 on the proliferation rate of CFU-GM in bone marrow.
도 7b는 골수에서 BFU-E의 증식율에 대한 Lkn-1의 시간의존적 억제영향을 나타내는 그래프이다.7B is a graph showing the time-dependent inhibition of Lkn-1 on the proliferation rate of BFU-E in bone marrow.
도 7c는 골수에서 CFU-GEMM의 증식율에 대한 Lkn-1의 시간의존적 억제영향을 나타내는 그래프이다.7C is a graph showing the time-dependent inhibition of Lkn-1 on the proliferation rate of CFU-GEMM in bone marrow.
도 7d는 비장에서 CFU-GM의 증식율에 대한 Lkn-1의 시간의존적 억제영향을 나타내는 그래프이다.7D is a graph showing the time-dependent inhibition of Lkn-1 on the proliferation rate of CFU-GM in the spleen.
도 7e는 비장에서 BFU-E의 증식율에 대한 Lkn-1의 시간의존적 억제영향을 나타내는 그래프이다.7E is a graph showing the time dependent inhibition of Lkn-1 on the proliferation rate of BFU-E in the spleen.
도 7f는 비장에서 CFU-GEMM의 증식율에 대한 Lkn-1의 시간의존적 억제영향을 나타내는 그래프이다.7F is a graph showing the time dependent inhibition of Lkn-1 on the proliferation rate of CFU-GEMM in the spleen.
도 8a는 재조합 Lkn-1 및 RANTES(regulated-upon activation, normal T cell expressed and secreted)에 의하여 화학적으로 유인된 림프구를 보여주는 그래프이다.8A is a graph showing lymphocytes chemically attracted by recombinant Lkn-1 and regulated-upon activation, normal T cell expressed and secreted (RANTES).
도 8b는 재조합 Lkn-1 및 hMIP-1α에 의하여 화학적으로 유인된 단핵구를 나타내는 그래프이다.8B is a graph showing monocytes chemically attracted by recombinant Lkn-1 and hMIP-1α.
도 8c는 재조합 Lkn-1 및 IL-8에 의하여 화학적으로 유인된 호중구를 나타내는 그래프이다.8C is a graph showing neutrophils chemically attracted by recombinant Lkn-1 and IL-8.
도 9a는 일련의 RANTES 및 재조합 Lkn-1에 의하여 자극된 림프구의 상대적 형광도를 나타낸 그래프이다.9A is a graph showing the relative fluorescence of lymphocytes stimulated by a series of RANTES and recombinant Lkn-1.
도 9b는 일련의 재조합 Lkn-1 및 RANTES에 의하여 자극된 림프구의 상대적 형광도를 나타낸 그래프이다.9B is a graph showing the relative fluorescence of lymphocytes stimulated by a series of recombinant Lkn-1 and RANTES.
도 9c는 일련의 hMIP-1α 및 재조합 Lkn-1에 의하여 자극된 단핵구의 상대적 형광도를 나타낸 그래프이다.9C is a graph showing the relative fluorescence of monocytes stimulated by a series of hMIP-1α and recombinant Lkn-1.
도 9d는 일련의 재조합 Lkn-1 및 hMIP-1α에 의하여 자극된 단핵구의 상대적 형광도를 나타낸 그래프이다.9D is a graph showing the relative fluorescence of monocytes stimulated by a series of recombinant Lkn-1 and hMIP-1α.
도 9e는 일련의 IL-8 및 재조합 Lkn-1에 의하여 자극된 호중구의 상대적 형광도를 나타낸 그래프이다.9E is a graph showing the relative fluorescence of neutrophils stimulated by a series of IL-8 and recombinant Lkn-1.
도 9f는 일련의 재조합 Lkn-1 및 IL-8에 의하여 자극된 호중구의 상대적 형광도를 나타낸 그래프이다.9F is a graph showing the relative fluorescence of neutrophils stimulated by a series of recombinant Lkn-1 and IL-8.
도 10a는 일련의 다양한 물질에 의하여 자극된 CCR1을 발현하는 HOS 세포주의 상대적 형광도를 나타낸 그래프이다.10A is a graph showing the relative fluorescence of HOS cell lines expressing CCR1 stimulated by a series of different substances.
도 10b는 일련의 다양한 물질에 의하여 자극된 CCR3를 발현하는 HOS 세포주의 상대적 형광도를 나타낸 그래프이다.10B is a graph showing the relative fluorescence of HOS cell lines expressing CCR3 stimulated by a series of different substances.
도 10c는 Lkn-1 및 hMIP-1α의 농도에 따른 칼슘의 반응을 피크 높이로 나타낸 그래프이다.Figure 10c is a graph showing the peak height of the reaction of calcium with the concentration of Lkn-1 and hMIP-1α.
도 10d는 Lkn-1, 에오탁신 및 RANTES의 농도에 따른 칼슘의 반응을 피크 높이로 나타낸 그래프이다.Figure 10d is a graph showing the peak height of the reaction of calcium with the concentration of Lkn-1, eotaxin and RANTES.
본 발명자들은 사람 세포주로부터 신규한 Lkn-1 유전자를 분리하기 위하여, 우선 프로브(probe)의 제공에 이용될 Lkn-1 유전자의 엑손(exon) 부위를 클로닝하였다. 즉, 사람의 게놈 DNA를 HindⅢ 제한효소로 절단한 다음, 아가로스 젤상에서 분리하고,32P로 표지된 mMRP-2 cDNA(참조: Youn B.S. et al., J. Immunol., 155:2661, 1995)를 프로브로 사용하여 서던블랏(southern blot)을 시행하여, mMRP-2와 혼성화되는 7.0kb의 DNA 단편을 얻었다. 이어, 7.0kb의 HindⅢ DNA 단편으로부터 Lkn-1 cDNA의 엑손 서열을 분리하기 위하여, 사람의 게놈 DNA를 HindⅢ로 완전히 절단하고 아가로스 젤상에서 분리 후, 그 단편을 벡터에 삽입하여 숙주세포로 도입 및 배양한 다음, 상기 mMRP-2 cDNA 프로브와 혼성화 반응을 나타내는 집락(colony)을 선별하였다. 선별된 집락(colony)로부터 7.0kb의 DNA 단편을 분리하고, AluI으로 절단하여, mMRP-2 cDNA와 혼성화되는 202bp의 DNA 단편을 클로닝하여 염기서열을 결정한 후, 인트론(intron)과 엑손(exon) 부분을 확인하였다.In order to isolate the novel Lkn-1 gene from human cell lines, we first cloned the exon region of the Lkn-1 gene to be used for the provision of a probe. In other words, human genomic DNA was digested with HindIII restriction enzymes, isolated on agarose gels, and labeled with 32 P mMRP-2 cDNA (Youn BS et al., J. Immunol., 155: 2661, 1995). Southern blot was performed using the probe as a probe to obtain a 7.0 kb DNA fragment hybridized with mMRP-2. Then, in order to separate the exon sequence of Lkn-1 cDNA from the 7.0 kb HindIII DNA fragment, the human genomic DNA was completely cleaved with HindIII and separated on agarose gel, and then the fragment was inserted into a vector and introduced into the host cell. After incubation, colonies exhibiting hybridization with the mMRP-2 cDNA probe were selected. 7.0 kb DNA fragments were isolated from selected colonies, cleaved with AluI, cloned 202 bp DNA fragments hybridized with mMRP-2 cDNA to determine sequencing, and then intron and exon. The part was confirmed.
그런 다음, 사람의 세포주로부터 신규의 Lkn-1 cDNA를 클로닝하기 위하여, 상기에서 확인된 Lkn-1 엑손 서열로부터 100bp를 증폭시킬 수 있는 Lkn-1의 PCR 프라이머를 고안하고, 여러가지 사람 세포주에서 분리한 총 RNA를 주형으로 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)을 시행하여, Lkn-1의 mRNA가 탐지되는 세포주를 선별하였다. 이렇게 선별된 세포주 중에서 IL-4(interleukin-4)로 활성화된 사람 단핵세포 THP-1 세포주의 cDNA 라이브러리를 제조하는 한편, 다른 한편으로는 전기 THP-1 세포주의 총 RNA를 주형으로 하고, 상기 Lkn-1 PCR 프라이머를 사용하여 RT-PCR함으로써, Lkn-1 엑손의 100bp DNA 단편을 제조하였다. 상기 제조된 THP-1 세포주의 cDNA 라이브러리를 프로브인 Lkn-1 엑손의 100bp DNA 단편과 혼성화(hybridization)시킨 결과, 양성신호(positive signal)를 나타내는 Lkn-1 cDNA를 발견하였다.Then, to clone the novel Lkn-1 cDNA from human cell lines, we devised a PCR primer of Lkn-1 capable of amplifying 100 bp from the Lkn-1 exon sequence identified above and isolated from various human cell lines. RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction) was carried out using the total RNA as a template to select cell lines in which mRNA of Lkn-1 was detected. The cDNA library of human mononuclear THP-1 cell line activated with IL-4 (interleukin-4) among the selected cell lines was prepared, while the total RNA of the electric THP-1 cell line was used as a template, and the Lkn 100-bp DNA fragments of Lkn-1 exons were prepared by RT-PCR using -1 PCR primers. As a result of hybridizing the cDNA library of the prepared THP-1 cell line with 100 bp DNA fragment of the probe Lkn-1 exon, Lkn-1 cDNA showing a positive signal was found.
상기 Lkn-1 cDNA의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 결정한 결과, Lkn-1 cDNA는 지금까지 보고된 적이 없는 신규한 것으로서, Lkn-1 cDNA의 개방해독틀(open reading frame)은 21개의 아미노산으로 이루어진 신호 펩타이드를 포함하여 총 113개의 아미노산을 암호화하고 있으며, 그 중 92개의 아미노산으로 구성된 성숙한 Lkn-1 단백질의 분자량은 10,162Da으로 추정되었다. 또한, Lkn-1 cDNA는 N-글리코실화(N-glycosylation) 부위를 갖지 않으며, β-케모카인 계열이 공유하는 4개의 시스테인 잔기 외에, mMRP-1 및 mMRP-2에서 발견되는 두개의 시스테인 잔기를 추가로 가지는 C6 β-케모카인계열에 속함을 알 수 있었다.As a result of determining the nucleotide sequence of the Lkn-1 cDNA and the amino acid sequence inferred therefrom, the Lkn-1 cDNA is a novel one that has not been reported so far, and the open reading frame of the Lkn-1 cDNA is 21 amino acids. Including a signal peptide consisting of a total of 113 amino acids are encoded, of which 92 amino acids of the mature Lkn-1 protein molecular weight was estimated to be 10,162 Da. In addition, Lkn-1 cDNA does not have an N-glycosylation site and adds two cysteine residues found in mMRP-1 and mMRP-2 in addition to the four cysteine residues shared by the β-chemokine family. The branch was found to belong to the C6 β-chemokine family.
이렇게 클로닝된 신규의 Lkn-1 cDNA을 발현벡터에 삽입하고, 그를 대장균 또는 곤충세포 등의 숙주세포내에 도입시켜 재조합 Lkn-1으로 발현시켰다.The cloned novel Lkn-1 cDNA was inserted into an expression vector and introduced into recombinant Lkn-1 by introducing it into host cells such as E. coli or insect cells.
한편, 재조합 Lkn-1의 골수양세포 억제능의 여부를 골수 및 비장으로부터 유래된 모세포(progenitor cell) 또는 골수양간세포(myeloid stem cell)를 대상으로 시행한 결과, 생체내(in vivo) 및 실험실적(in vitro) 조건에서 재조합 Lkn-1이 골수세포의 집락형성과 증식을 농도의존적 및 시간의존적으로 억제함을 확인할 수 있었다. 아울러, 정제된 재조합 Lkn-1은 사람의 말초혈액 호중구, 단핵구 및 림프구에 대하여 강력한 화학주성을 나타내며, 이들 세포에서의 칼슘 유출을 유도하였다. 특히, 재조합 Lkn-1은 IL-8처럼 호중구에 대하여 강한 화학주성을 나타내며, RANTES(regulated-upon activation, normal T cell expressed and secreted) 및 hMIP(human macrophage inflammatory protein)-1α의 수용체에 결합하지만, IL-8의 수용체에는 결합하지 않는 것으로 나타났다. 또한, 재조합 Lkn-1의 수용체는 CCR1 및 CCR3인 것으로 확인되었다. 재조합 Lkn-1은 CCR1(CC chemokine receptor 1) 수용체에 결합하는 것으로 이미 공지된 hMIP-1α 또는 RANTES 보다 더 강력한 CCR1 수용체의 작용물질(agonist)이고, CCR3 수용체에 대해서는 에오탁신(eotaxin)에는 미치지 못하지만, RANTES 보다는 훨씬 강력한 작용물질인 것으로 밝혀졌다.On the other hand, the inhibition of myeloid cell proliferation of recombinant Lkn-1 was performed in progenitor cells or myeloid stem cells derived from bone marrow and spleen. In vitro conditions, recombinant Lkn-1 inhibited the concentration and time-dependent colony formation and proliferation of bone marrow cells. In addition, purified recombinant Lkn-1 showed potent chemotaxis against human peripheral blood neutrophils, monocytes and lymphocytes, and induced calcium outflow from these cells. In particular, recombinant Lkn-1 exhibits a strong chemotaxis against neutrophils like IL-8 and binds to receptors of regulated-upon activation, normal T cell expressed and secreted (RANTES) and human macrophage inflammatory protein (hMIP) -1α. It did not appear to bind to the receptor of IL-8. In addition, the receptors of recombinant Lkn-1 were found to be CCR1 and CCR3. Recombinant Lkn-1 is an agonist of the CCR1 receptor that is more potent than hMIP-1α or RANTES, which is known to bind to CCC chemokine receptor 1 (CCR1) receptors, but does not reach eotaxin for the CCR3 receptor. It has been found to be a much more potent agent than RANTES.
상술한 특징을 가지는 본 발명의 재조합 Lkn-1을 항체 제조, HIV-1 감염시의치료, 화학요법이나 방사선치료시의 골수 간세포 보호 및 백혈병 억제 등에 이용할 수 있다.The recombinant Lkn-1 of the present invention having the above-described characteristics can be used for antibody production, treatment during HIV-1 infection, bone marrow hepatocyte protection during chemotherapy or radiation therapy, and inhibition of leukemia.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples.
실시예 1: Lkn-1 게놈 DNA에서 엑손(exon) 부위의 클로닝Example 1 Cloning of Exon Sites in Lkn-1 Genomic DNA
mMRP-2와 염기서열 상동성을 가지는 게놈 유전자를 사람으로부터 클로닝하기 위하여, 사람의 총 게놈 DNA를 BamHI, EcoRI, HindⅢ, PstI, XbaI 및 XhoI으로 절단한 다음, 1.0% 아가로스 젤상에서 분획화하고,32P로 표지된 mMRP2 cDNA를 프로브로 사용하여 서던블럿(southern blot)을 시행하여, 양성신호(positive signal)를 보이는 7.0kb의 HinⅢ 단편을 얻었다.To clone genomic genes with sequencing homology with mMRP-2 from humans, human total genomic DNA was digested with BamHI, EcoRI, HindIII, PstI, XbaI and XhoI, and fractionated on 1.0% agarose gels. , Southern blot using a 32 P-labeled mMRP2 cDNA as a probe was performed to obtain a 7.0 kb HinIII fragment showing a positive signal.
상기 HindⅢ 단편의 서브라이브러리를 제조하기 위하여, 100㎍의 사람 게놈 DNA를 HindⅢ로 완전히 절단하고, 20V 전압으로 16시간 동안 1% 아가로스 젤상에서분획화한 다음, 7.0kb 부근의 DNA를 Gene-clean kit(Bio 101, U.S.A.)로 정제하여, HindⅢ로 절단된 탈인산화 pBluescript SK+벡터(Stratagene, U.S.A.)에 삽입하였다. 이렇게 제조된 재조합 벡터를 일렉트로-맥스(GIBCO-BRL, U.S.A.) 형질전환 가능 세포(competent cell)에 일렉트로포레이션(electroporation) 방법으로 도입하고 고체배지에서 배양한 다음, 약 2×105로 형성된 집락을 mMRP-2 프로브와 혼성화시킨 결과, 단 하나의 집락만이 혼성화 양성신호를 나타내었고, 그 콜로니는 7.0kb의 삽입체(insert) DNA를 포함하고 있었다.To prepare a sublibrary of the HindIII fragment, 100 μg of human genomic DNA was completely cleaved with HindIII, fractionated on 1% agarose gel for 16 hours at 20V voltage, and then DNA near 7.0 kb was Gene-clean. Purified by kit (Bio 101, USA) and inserted into dephosphorylated pBluescript SK + vector (Stratagene, USA) digested with HindIII. The recombinant vector thus prepared was introduced into an electro-transformable cell (GIBCO-BRL, USA) by electroporation, cultured in a solid medium, and then colonized to about 2 × 10 5 . Was hybridized with the mMRP-2 probe, and only one colony showed a hybridization positive signal, and the colony contained 7.0 kb of insert DNA.
상기 7.0kb의 게놈 DNA 단편으로부터 엑손 서열을 분리하기 위하여, 혼성화 양성신호를 나타낸 상기 집락으로부터 7.0kb의 삽입체 DNA를 포함하는 pBluescript SK+벡터를 분리하고, AluI으로 절단하여 1.5% 아가로스 젤상에서 분획화한 다음, 서던블럿 분석하여 mMRP-2 cDNA와 혼성화되는 202bp의 DNA 단편을 클로닝하였다.To separate the exon sequence from the 7.0 kb genomic DNA fragment, the pBluescript SK + vector containing 7.0 kb of insert DNA was isolated from the colonies showing hybridization positive signals, cleaved with AluI, on 1.5% agarose gels. Fractionation was followed by Southern blot analysis to clone a 202 bp DNA fragment that hybridized with mMRP-2 cDNA.
상기 202bp DNA 단편의 염기 서열(참조: 서열번호 1)을 결정하여, 인트론과 아미노산으로 번역되는 엑손 부분을 확인하였다(참조: 도 1a). 이 엑손 부위는 87번부터 110번까지의 아미노산 서열이 mMRP와 50% 상동성을 나타내고, mMRP-1과 mMRP-2의 공통적 특징인 두개의 부가적인 시스테인 중 두번째 시스테인(""로 표시)이 Lkn-1에서 보존되고 있음을 확인하였다(참조: 도 1b). 도 1b에서, 네모부분은 Lkn-1과 mMRP-2 사이에서 보존된 아미노산을 각각 나타낸다.The base sequence (see SEQ ID NO: 1) of the 202 bp DNA fragment was determined to identify the exon moiety translated into intron and amino acid (see FIG. 1A). This exon region has a amino acid sequence from 87 to 110 that is 50% homologous to mMRP and is the second of two additional cysteines that are common to mMRP-1 and mMRP-2. It is confirmed that "is stored" in Lkn-1 (see Figure 1b). In Figure 1b, the squares represent amino acids that are conserved between Lkn-1 and mMRP-2, respectively.
실시예 2: Lkn-1 cDNA의 클로닝Example 2: Cloning of Lkn-1 cDNA
사람의 세포주로부터 Lkn-1 cDNA를 클로닝하기 위하여, 우선 도 1b에 개시된 아미노산 서열(참조: 서열번호 2)로부터 Lkn-1 엑손의 100bp를 증폭시킬 수 있는 PCR 프라이머 즉, 정방향 프라이머 5'-TTCCTCACCAAGAAGGGG-3'(참조: 서열번호 13) 및 역방향 프라이머 5'-CTTTTTCATGCAATCCTG-3'(참조: 서열번호 14)를 고안한 다음, 실시예 1에서 제조된 202bp DNA 단편을 PCR 수행하였는데, 이때, 100㎍/㎖의 IL-4(interleukin-4)로 24시간 동안 자극된 사람의 단핵세포 THP-1 세포주(ATCC TIB202)의 총 RNA, 대식세포의 세포주 U937(ATCC CRL1593)의 총 RNA 및 HL-60 세포주(ATCC CCL240)의 총 RNA를 주형으로 하고 PCR을 수행하였다(참조: 도 2).To clone Lkn-1 cDNA from human cell lines, firstly a PCR primer, ie forward primer 5′-TTCCTCACCAAGAAGGGG-, capable of amplifying 100 bp of Lkn-1 exon from the amino acid sequence shown in FIG. 1B (see SEQ ID NO: 2) 3 ′ (see SEQ ID NO: 13) and reverse primer 5′-CTTTTTCATGCAATCCTG-3 ′ (see SEQ ID NO: 14) were devised, followed by PCR of the 202 bp DNA fragment prepared in Example 1, wherein 100 μg / Total RNA of human mononuclear THP-1 cell line (ATCC TIB202), macrophage cell line U937 (ATCC CRL1593) and HL-60 cell line stimulated for 24 hours with ml of IL-4 (interleukin-4) PCR was performed with the total RNA of ATCC CCL240) as a template (see Figure 2).
도 2에서, 제 1레인 내지 4레인은 양성대조군이며 차례대로, 제 2레인은 THP-1 세포주의 총 RNA, 제 3레인은 U937 세포주의 총 RNA, 제 4레인은 HL-60세포주의 총 RNA 및 제 M레인은 DNA 크기마커로서 100bp 래더(ladder)를 각각 나타낸다. 도 2에서 보듯이, IL-4로 활성화된 THP-1 세포주가 Lkn-1 mRNA를 생성함을 알 수 있었다.In Figure 2, lanes 1 to 4 are positive controls and in turn, lane 2 is the total RNA of THP-1 cell line, lane 3 is the total RNA of U937 cell line, and lane 4 is the total RNA of HL-60 cell line. And M-lane represent 100 bp ladders as DNA size markers, respectively. As shown in Figure 2, it can be seen that the THP-1 cell line activated with IL-4 produces Lkn-1 mRNA.
이와 관련하여, THP-1 cDNA 라이브러리를 제조하기 위하여, IL-4로 활성화된 THP-1 세포주에서 사람의 mRNA를 분리하고, 그로부터 Time Saver cDNA kit(Pharmacia Biotech., U.S.A.)를 이용하여 이중사슬의 cDNA로 역전사한 다음, 여기에 BstXI 어댑터(Invitrogen, U.S.A.)를 부착하였다. 이어, 아가로스 젤상에서 0.5kb 이상의 cDNA를 분리하고, BstXI으로 절단된 PRc/CMV(Invitrogen, U.S.A.)벡터에 삽입하여 cDNA 라이브러리를 제조한 다음, 상기에서 PCR로 증폭된 Lkn-1 엑손으 ㅣ100bp DNA 단편을 프로브로 사용하여 혼성화 반응시켰다. 그 결과, 양성신호를 보이는 1가지 cDNA 즉, Lkn-1 cDNA를 분리하였다.In this regard, in order to prepare a THP-1 cDNA library, human mRNA was isolated from an IL-4 activated THP-1 cell line, from which a double-chained protein was purified using a Time Saver cDNA kit (Pharmacia Biotech., USA). Reverse transcription with cDNA was followed by attachment of a BstXI adapter (Invitrogen, USA). Subsequently, at least 0.5kb of cDNA was isolated on an agarose gel and inserted into a PRc / CMV (Invitrogen, USA) vector digested with BstXI to prepare a cDNA library. The PCR amplified Lkn-1 exon l 100bp Hybridization was performed using the DNA fragment as a probe. As a result, one cDNA showing a positive signal, that is, Lkn-1 cDNA, was isolated.
실시예 3: Lkn-1 cDNA 염기서열의 분석Example 3: Analysis of Lkn-1 cDNA Sequences
실시예 2에서 클로닝된 Lkn-1 cDNA의 염기서열(참조: 서열번호 4) 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열(참조: 서열번호 5)을 도 3에 나타내었다. 도 3에서, 밑줄친 부분은 신호 펩타이드; 네모부분은 THP-1 cDNA 라이브러리의 스크리닝시 프로브로 사용된 부분으로서 도 1b의 Lkn-1 아미노산 서열(참조: 서열번호 2); 및 ( )표시는 번역종결코돈을 나타낸다.The base sequence of Lkn-1 cDNA cloned in Example 2 (see SEQ ID NO: 4) and the amino acid sequence inferred therefrom (see SEQ ID NO: 5) are shown in FIG. In Figure 3, the underlined portions are signal peptides; The square part is the part used as a probe in the screening of the THP-1 cDNA library and the Lkn-1 amino acid sequence of FIG. 1B (see SEQ ID NO: 2); And ( ) Indicates a translation stop codon.
도 3에서 보듯이, Lkn- cDNA의 개방해독틀은 21개의 아미노산의 신호 펩타이드 및 분자량 10,161Da으로 추정되는 92개의 아미노산의 성숙 단백질로 구성된 총 113개의 아미노산으로 이루어져 있음을 알 수 있었다. 또한, 유추되는 Lkn-1 아미노산 서열(참조: 서열번호 5)은 N-글리코실화 부위를 갖지 않았다.As shown in FIG. 3, the open reading frame of Lkn-cDNA was composed of a total of 113 amino acids consisting of a signal peptide of 21 amino acids and a mature protein of 92 amino acids estimated to have a molecular weight of 10,161 Da. In addition, the inferred Lkn-1 amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) did not have an N-glycosylation site.
도 4는 성숙한 Lkn-1의 아미노산 서열(참조: 서열번호 7)을 mMRP-1(참조: 서열번호 8), mMRP-2(참조:서열번호 9), hMIP-1α(참조: 서열번호 10)(참조: Youn B.S. et al., J. immunol., 155:2661, 1995), mMIP-1α(참조: 서열번호 11)(참조: Kwon B.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:1963, 1989) 및 hMIP-1β(참조: 서열번호 12)(참조: Sherry B. et al., J. Exp. Med., 168:2251. 1988)의 아미노산 서열과 비교한 그림이다. 도4에서, 네모부분은 보존된 4개의 시스테인 잔기, (·)는 2개의 추가된 시스테인 잔기를 나타낸다. 도 4에서 보듯이, Lkn-1은 케모카인계열이 공유하는 4개의 시스테인 잔기 중 처음 두개 시스테인 잔기의 앞쪽에 긴 N-말단을 가지고, β-케모카인 계열이 공유하는 네 개의 시스테인 잔기외에, mMRP-1 및 mMRP-2에서 발견되는 두개의 시스테인 잔기를 추가로 가지는 C6 β-케모카인 계열에 속함을 알 수 있었다.4 shows the amino acid sequence of mature Lkn-1 (see SEQ ID NO: 7) for mMRP-1 (see SEQ ID NO: 8), mMRP-2 (SEQ ID NO: 9), hMIP-1α (see SEQ ID NO: 10). (Youn BS et al., J. immunol., 155: 2661, 1995), mMIP-1α (SEQ ID NO: 11) (Kwon BS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1963, 1989) and hMIP-1β (SEQ ID NO: 12) (Sherry B. et al., J. Exp. Med., 168: 2251. 1988). In Fig. 4, the square part represents four conserved cysteine residues, and (.) Represents two additional cysteine residues. As shown in FIG. 4, Lkn-1 has a long N-terminal in front of the first two cysteine residues among the four cysteine residues shared by the chemokine family, and besides the four cysteine residues shared by the β-chemokine family, mMRP-1 And C6 β-chemokine family having two cysteine residues found in mMRP-2.
아울러, 사람에서 분리된 성숙한 Lkn-1의 염기서열(참조: 서열번호 7)은 mMRP-2에 대응하지만, mMRP-1 또는 mMRP-22와는 약 43% 정도의 염기서열 상동성만을 가지며, hMIP-1α와는 40%의 아미노산 상동성을 가지는 것으로 밝혀졌다.In addition, the nucleotide sequence of mature Lkn-1 isolated from human (SEQ ID NO: 7) corresponds to mMRP-2, but has only about 43% sequence homology with mMRP-1 or mMRP-22, and hMIP- It was found to have 40% amino acid homology with 1α.
실시예 4: 재조합 Lkn-1의 발현Example 4: Expression of Recombinant Lkn-1
실시예 4-1: 대장균에서의 재조합 Lkn-1의 발현 및 정제Example 4-1 Expression and Purification of Recombinant Lkn-1 in Escherichia Coli
신호 펩타이드로 추정되는 부분을 제외한 성숙한 Lkn-1만을 재조합 단백질로서 발현시키기 위하여, 우선 실시예 2에서 클로닝된 Lkn-1 cDNA를 주형으로 하고, 하기의 PCR 프라이머 및 Pfu 중합효소(Stratagene, U.S.A.)을 이용하여 성숙 Lkn-1의 개방해독틀을 PCR 하였다:In order to express only mature Lkn-1 as a recombinant protein except a portion estimated to be a signal peptide, the cloned Lkn-1 cDNA in Example 2 was used as a template, and the following PCR primers and Pfu polymerase (Stratagene, USA) were used. The open reading frame of mature Lkn-1 was PCR:
정방향 프라이머 5'-CGAATTCCATATGCAGTTCACAAATGATGCAGAG-3'Forward Primer 5'-CGAATTCCATATGCAGTTCACAAATGATGCAGAG-3 '
역방향 프라이머 5'-CGCCGCTCGAGTTGAGTAGGGCTTCAGC-3'Reverse primer 5'-CGCCGCTCGAGTTGAGTAGGGCTTCAGC-3 '
상기에서 증폭된 DNA 단편을 NdeI/XhoI 제한효소로 절단하여, 플라스미드 pET21a(Novagen, U.S.A)에 클로닝한 다음, 재조합 플라스미드를 pET21a-Lkn-1이라 명명하고, 대장균 XL-1 Blue에 도입하였다. 상기와 같이 제조된 재조합 플라스미드 pET21a-Lkn-1은 성숙한 Lkn-1의 N-말단에 하나의 메티오닌 잔기가, C-말단에 6개의 히스티딘이 첨가된 재조합 Lkn-1을 발현하게 된다.The amplified DNA fragment was digested with NdeI / XhoI restriction enzyme, cloned into plasmid pET21a (Novagen, U.S.A), and the recombinant plasmid was named pET21a-Lkn-1 and introduced into E. coli XL-1 Blue. The recombinant plasmid pET21a-Lkn-1 prepared as described above expresses recombinant Lkn-1 having one methionine residue at the N-terminus of mature Lkn-1 and six histidines added at the C-terminus.
이렇게 제조된 형질전환체는 'Escherichia coli(XL-1 Blue) hMRP-2'라 명명되어, 1996년 9월 10일 국제기탁기관인 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 ATCC 98166으로 기탁되었다.The transformant thus prepared was named 'Escherichia coli (XL-1 Blue) hMRP-2' and was deposited on September 10, 1996 under the accession number ATCC 98166 to the American Type Culture Collection (ATCC).
전기 형질전환체를 배양하여 Lkn-1을 발현시킨 다음, 봉입체를 얻어 20㎖ 변성용 완충용액(6M guanidine-HCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9, 500mM NaCl, 4mM n-octylglucopyranoside)에 용해시키고, 원심분리하여 얻은 상등액을 활성화된 Ni-컬럼(Novagen, U.S.A.) 및 헤파린 아가로스 컬럼(Pharmacia Fine Chemiclas, U.S.A.)을 사용하여 크로마토그래피하여, 히스티딘-태그 재조합 Lkn-1(His-tagged recombinant Lkn-1)을 분리·정제하였다. 재조합 Lkn-1의 분자량은 전기영동 결과, 약 12kDa인 것으로 밝혀졌다.After culturing the transformants to express Lkn-1, the inclusion bodies were obtained and dissolved in 20 ml denatured buffer (6M guanidine-HCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9, 500 mM NaCl, 4 mM n-octylglucopyranoside). The supernatant obtained by centrifugation was chromatographed using activated Ni-column (Novagen, USA) and heparin agarose column (Pharmacia Fine Chemiclas, USA), and histidine-tagged recombinant Lkn-1. ) Was isolated and purified. The molecular weight of the recombinant Lkn-1 was found to be about 12 kDa by electrophoresis.
실시예 4-2: 곤충세포내에서의 재조합 Lkn-1의 발현 및 정제Example 4-2 Expression and Purification of Recombinant Lkn-1 in Insect Cells
신호 펩타이드를 포함하는 재조합 Lkn-1을 발현시키기 위하여, 신호 펩타이드 염기서열을 포함하는 Lkn-1 cDNA의 N-말단에 PstI 제한효소 인식부위, C-말단에 XbaI 제한효소 인식부위를 삽입하여 Lkn-1 cDNA를 PCR 증폭시켰다. 이어, 증폭된 PCR산물을 분리하고, PstI/XbaI 제한효소로 절단된 벡터 PVL 1392(Invitrogen, U.S.A.)에 삽입시켜 재조합 플라스미드 PVL 1392-Lkn-1을 제조하였다. 그런 다음, 전기 재조합 플라스미드 및 AcNPV(Autographa california nuclear polyhedrosis baculovirus)를 Sf-21 곤충세포에 감염(transfection)시킴으로써, 전기 재조합 플라스미드에 삽입된 Lkn-1 cDNA를 AcNPV로 옮겼다. 이어, 비리온(virion)의 특성인 포획된 세포내 결정성 단백질을 형성하지 않음(occlusion-negative)을 기준으로 AcNPV-Lkn-1 바이러스 플라크(plaque)를 분리하고, 무혈청의 Ex-Cell 400 배지(JRH Biosciences, U.S.A.)에서 SF-21 곤충세포를 성장시켜 스톡(stock)으로 이용하였다.In order to express recombinant Lkn-1 including a signal peptide, a PstI restriction enzyme recognition site was inserted at the N-terminus of the Lkn-1 cDNA containing the signal peptide sequence and an XbaI restriction enzyme recognition site was inserted at the C-terminus, and the Lkn- 1 cDNA was PCR amplified. Subsequently, the amplified PCR product was isolated and inserted into vector PVL 1392 (Invitrogen, U.S.A.) digested with PstI / XbaI restriction enzymes to prepare recombinant plasmid PVL 1392-Lkn-1. Then, the Lkn-1 cDNA inserted into the recombinant recombinant plasmid was transferred to AcNPV by transfecting Sf-21 insect cells with the recombinant recombinant plasmid and AcNPV (Autographa california nuclear polyhedrosis baculovirus). Subsequently, AcNPV-Lkn-1 virus plaques were isolated on the basis of occlusion-negative, which is a characteristic of the virion, and the serum-free Ex-Cell 400. SF-21 insect cells were grown in media (JRH Biosciences, USA) and used as stock.
재조합 Lkn-1은 Ex-Cell 400 배지에서 배양한 High five 세포주(Invitrogen, U.S.A.)에서 발현시켰으며, 발현된 Lkn-1은 Hitrap-Heparin 컬럼(Pharmacia biotech., U.S.A.) 및 Hitrap-SP 컬럼(Pharmacia Biotech., U.S.A.)으로 정제하여, 웨스턴블럿(western blot)을 시행한 결과, 재조합 Lkn-1의 분자량이 약 12kDa인 것으로 예측되었다.Recombinant Lkn-1 was expressed in High five cell lines (Invitrogen, USA) cultured in Ex-Cell 400 medium, and expressed Lkn-1 was expressed in Hitrap-Heparin column (Pharmacia biotech., USA) and Hitrap-SP column (Pharmacia). Biotech., USA) and Western blot showed that the molecular weight of recombinant Lkn-1 was estimated to be about 12 kDa.
실시예 5: 재조합 Lkn-1의 골수억제기능Example 5 Myelosuppression Function of Recombinant Lkn-1
실시예 5-1: 실험실적(in vitro) 조건에서 재조합 Lkn-1에 의한 골수세포의 콜로니 형성의 억제Example 5-1 Inhibition of Colony Formation of Bone Marrow Cells by Recombinant Lkn-1 in Laboratory Conditions
일부 β-케모카인은 실험실적 조건에서 골수억제기능(myelosuppressive activity)을 가지므로, 실시예 4-1에서 정제된 재조합 Lkn-1이 사람의 골수에 존재하는 골수양 모세포(myeloid progenitor cell)에 의한 콜로니 형성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 하였다.Since some β-chemokines have myelosuppressive activity under laboratory conditions, colony by myeloid progenitor cells in which recombinant Lkn-1 purified in Example 4-1 is present in human bone marrow The purpose of this study was to investigate the effect on formation.
즉, 골수세포의 콜로니를 CFU-GM(colony forming unit-granulocyte-macrophage)에 의해 형성시키고자, Ficoll-Hypaque 구배(Ficoll-Hypaque gradient, 1.070㎎/㎤, Sigma Chemicla Co., U.S.A.)하에서 원심분리하여 수득한 저밀도의 사람 골수세포를 10% FBS가 포함된 0.3% 아가 배양배지에 5×104세포/㎖로 도말하고, rhGM-CSF(recombinant human granulocyte-macrophage-colony stimulating factor, 100U/㎖, Immunex Corporation, U.S.A.)와 rhSLF(recombinant human steel factor, 50ng/㎖, Immunex Corporation, U.S.A.)로 자극시켰다. 한편, 골수세포의 콜로니를 CFU-GM, BFU-E(burstforming unit -erythoid) 및 CFU-GEMM((colony forming unit-granulocyte-erythroid-macrophage-megakaryote)에 의해 형성시키고자, 전기 골수 세포를 30% FBS가 포함된 1% 메틸셀룰로스 배양배지에 5×104세포/㎖로 도말하고, rhEPO(recombinant human erythropoietin, 1U/㎖, Amgen Corporation, U.S.A.), rhIL-3(recombinant human interleukin-3, 100U/㎖, Immunex Corporation, U.S.A.) 또는 rhSLF로 자극시켰다.In other words, to form colonies of bone marrow cells by colony forming unit-granulocyte-macrophage (CFU-GM), centrifugation under a Ficoll-Hypaque gradient (Ficoll-Hypaque gradient, 1.070 mg / cm 3, Sigma Chemicla Co., USA) The low density human bone marrow cells obtained by smearing in a 0.3% agar culture medium containing 10% FBS at 5 × 10 4 cells / ㎖, rhGM-CSF (recombinant human granulocyte-macrophage-colony stimulating factor, 100U / ㎖, Immunex Corporation, USA) and rhSLF (recombinant human steel factor, 50 ng / ml, Immunex Corporation, USA). On the other hand, to form colonies of bone marrow cells by CFU-GM, BFU-E (burstforming unit -erythoid) and CFU-GEMM (colony forming unit-granulocyte-erythroid-macrophage-megakaryote), electric bone marrow cells 30% Smear 5 × 10 4 cells / ml in a 1% methylcellulose culture medium containing FBS, rhEPO (recombinant human erythropoietin, 1U / ml, Amgen Corporation, USA), rhIL-3 (recombinant human interleukin-3, 100U / Ml, Immunex Corporation, USA) or rhSLF.
상기의 자극이 가해진 후에 BNP-210 배양기(Tabai ESPEC Corp., U.S.A.)에서 5% CO2및 5% O2의 조건하에 배양하고, 14일 경과후에 집락수를 산정하였다(참조: 표 1). 이때, 재조합 Lkn-1은 플레이트당 3-50ng/㎖로 첨가하였다.After the above stimulus was applied, the cells were cultured in a BNP-210 incubator (Tabai ESPEC Corp., USA) under conditions of 5% CO 2 and 5% O 2 , and colony counts were calculated after 14 days (see Table 1). At this time, recombinant Lkn-1 was added at 3-50ng / ml per plate.
a: 반응용액에 재조합 Lkn-1을 첨가하지 않은 실험군a: Experimental group without adding recombinant Lkn-1 to the reaction solution
b: 집락형성을 촉진하기 위하여 사용된 성장인자(growth factor)b: growth factor used to promote colony formation
c: 대조군을 기준으로 비교한 수치의 변화량(%)c: amount of change in% compared to the control group
d: 대조군을 기준으로 비교한 수치의 유의적인 변화량(%)(p<0.001)d: Significant change in% of the values compared to the control group (p <0.001)
상기 표 1에서 보듯이, 재조합 Lkn-1은 농도의존적으로 CFU-GM, BFU-E 및 CFU-GEMM에 의한 콜로니 형성을 유의적으로 억제함을 알 수 있었다. 억제 정도는 대조군의 22 내지 63%에 해당하는 양이었다. 한편, 재조합 Lkn-1은 GM-CSF 단독으로 자극된 CFU-GM이나, EPO 단독으로 자극된 BFU-E에 의해서 형성되는 콜로니를 억제하지 못하는 것으로 나타났는 바, 이로부터 재조합 Lkn-1은 여러가지 성장인자에 의한 자극에 반응하는 미성숙 모세포에 억제효과를 나타낼 것으로 예측되었다.As shown in Table 1, the recombinant Lkn-1 was found to significantly inhibit colony formation by CFU-GM, BFU-E and CFU-GEMM in a concentration-dependent manner. The degree of inhibition was an amount corresponding to 22-63% of the control. On the other hand, recombinant Lkn-1 did not appear to inhibit the colony formed by CFU-GM stimulated with GM-CSF alone or BFU-E stimulated with EPO alone. It was predicted to have an inhibitory effect on immature blasts in response to factor-induced stimulation.
실시예 5-2: 생체내(in vivo) 조건에서 골수세포의 증식억제Example 5-2 Inhibition of Proliferation of Bone Marrow Cells in In Vivo Conditions
Lkn-1의 생물학적 활성을 생체내(in vivo) 조건에서 측정하기 위하여, 우선 정제된 Lkn-1을 C3H/HeJ 마우스에 정맥주사로 주입시켰다. 이때, 과립대식세포(granulocyte macrophage)의 절대적인 수는 CFU-GM으로, 적혈구 모세포(erythroid progenitor cells)의 절대적인 수는 BFU-E로, 다잠재력 모세포(multipotential progenitor cells)의 절대적인 수는 CFU-GEMM으로 측정하고, 골수와 비장에서 이들의 증식률을 각각 측정하였다. 즉, C3H/HeJ 마우스의 꼬리정맥에 0.1㎖의 발열물질이 없는 멸균된 생리식염수 및 정제된 재조합 Lkn-1 8㎍의 희석액(발열물질이 없는 멸균된 생리식염수에 희석한 액)을 주사하여, 24시간 후에, 저밀도의 골수양세포를 실시예 5-1과 동일한 방법으로 마우스의 대퇴골의 골수 및 비장에서 취하였다. 이어, CFU-GM을 0.3% 아가 배양배지에 도말하고, 10% PWM 마우스 비장세포 조건배양액에 의하여 자극시켰다. 한편, BFU-E 또는 CFU-GEMM을 각각 0.9% 메틸 셀룰로오즈 배양배지에 도말시키고, 1unit의 rhEPO, 0.1mmole/ℓ의 헤민(hemin)이 포함된 1% PWM 마우스 비장세포 조건배양액에 의하여 자극시켰다. 이때, 골수세포는 7.5×104세포/㎖로, 비장세포는 1.0×106세포/㎖로 도말하고, 자극후에 세포를 실시예 5-1의 조건과 동일하게 배양하고, 5 내지 7일 후에 집락수를 산정하였다(참조: 도 5a 및 5(B)).In order to measure the biological activity of Lkn-1 in vivo, purified Lkn-1 was first injected intravenously into C3H / HeJ mice. At this time, the absolute number of granulocyte macrophage is CFU-GM, the absolute number of erythroid progenitor cells is BFU-E, and the absolute number of multipotential progenitor cells is CFU-GEMM. The proliferation rate was measured in the bone marrow and spleen, respectively. That is, by injecting sterilized saline without 0.1 ml of pyrogenic material and dilutions of 8 µg of purified recombinant Lkn-1 (diluted in sterile saline without pyrogen) into the tail vein of C3H / HeJ mice. After 24 hours, low-density myeloid cells were taken from the bone marrow and spleen of the mouse femur in the same manner as in Example 5-1. CFU-GM was then plated in 0.3% agar culture medium and stimulated with 10% PWM mouse splenocytes culturing medium. On the other hand, BFU-E or CFU-GEMM were plated in 0.9% methyl cellulose culture medium, respectively, and stimulated with 1% PWM mouse splenocyte conditioned medium containing 1 unit of rhEPO and 0.1 mmol / L hemin. At this time, the bone marrow cells were plated at 7.5 × 10 4 cells / ml, the splenocytes at 1.0 × 10 6 cells / ml, and after stimulation, the cells were cultured in the same manner as in Example 5-1, and 5 to 7 days later. Colony numbers were calculated (see FIGS. 5A and 5B).
한편, 증식율 즉, CFU-GM, BFU-E, CFU-GEMM의 증식주기율(cycling rates)은 세포주기의 S기(S-phase) 상태의 세포비율로 측정하였다: 다시 말해서, 실험실적(in vitro)조건에서 세포에 방사성 동위원소3H로 표지된 티미딘을 20분간 펄스노출(pulse exposure) 시킨후에 집락수의 감소를 방사성 동위원소 표지가 되지 않은 티미딘을 처리한 세포와 비교하여 산정하는 것에 근거하여, DNA 합성기(S기)의 모세포(progenitors)의 비율을 비활성(20Ci/mmol)과3H로 표지된 티미딘(50μCi/㎖) 사멸기술(3H thymidine kill technique)의 방법을 사용하여 측정하였다(참조: 도 5c 및 도 5d).On the other hand, the proliferation rate, ie, the cycling rates of CFU-GM, BFU-E and CFU-GEMM, was measured by the cell rate of the S-phase state of the cell cycle: In other words, in vitro In the following conditions, after a 20-minute pulse exposure of radioisotope 3 H-labeled thymidine to a cell, the decrease in colony counts was compared with cells treated with thymidine that had not been radioisotope labeled. Based on the ratio of progenitors of the DNA synthesizer (S phase), the method of inactivation (20 Ci / mmol) and 3 H labeled thymidine (50 μCi / ml) killing technique ( 3 H thymidine kill technique) was used. Measurements were made (see FIGS. 5C and 5D).
도 5a 내지 5(D)에서 보듯이, Lkn-1은 골수 및 비장에서 골수양모세포에 의한 집락형성 및 증식율(세포주기율)을 현저히 감소시킴을 확인할 수 있는 한편, 골수, 비장, 혈액에서 유핵(nucleated)의 세포성(cellularity)은 대조군에 비하여 크게 영향을 받지 않는 것으로 판명되었다.As shown in Figures 5a to 5 (D), it can be seen that Lkn-1 significantly reduced colony formation and proliferation rate (cell cycle rate) caused by myeloid hair cells in bone marrow and spleen, while nucleus ( The cellularity of nucleated was found to be not significantly affected compared to the control.
이러한 Lkn-1의 억제효과가 농도의존적인지를 규명하기 위하여, CFU-GM, BFU-E, CFU-GEMM의 주기율을 Lkn-1의 농도가 0.1 내지 20㎍로 변화시키는 것을 제외하고는,상술한 방법과 동일하게 측정하였다(참조: 도 6a 및 6(B)). 도 6a 및 도 6b에서 보듯이, 3내지 10㎍의 Lkn-1이 처리된 마우스의 CFU-GM, BFU-E, CFU-GEMM은 골수 및 비장 모두에서 주기율을 갖지 않거나 저주기상태(slow cycling state)를 갖는데 비하여, 0.1 내지 1㎍의 Lkn-1이 처리된 마우스에선 비장의 CFU-GEMM을 제외하고는 주기율의 변화가 없었다. 또한, 전체 세포주기율은 Lkn-1 처리에 의하여 80 내지 90%로 감소되었으며, BFU-E 또는 CFU-GEMM은 CFU-GM보다 Lkn-1에 민감한 것으로 나타났다.In order to determine whether the inhibitory effect of Lkn-1 is concentration-dependent, the above-described periodic rates of CFU-GM, BFU-E and CFU-GEMM are changed except that the concentration of Lkn-1 is changed from 0.1 to 20 µg. Measurements were made in the same manner as the method (see FIGS. 6A and 6B). 6A and 6B, CFU-GM, BFU-E, and CFU-GEMM of mice treated with 3 to 10 μg of Lkn-1 have no periodic rate or a low cycling state in both bone marrow and spleen. Compared to), mice treated with 0.1 to 1 μg of Lkn-1 showed no change in periodicity except for CFU-GEMM in the spleen. In addition, the overall cell cycle rate was reduced to 80 to 90% by Lkn-1 treatment, BFU-E or CFU-GEMM was more sensitive to Lkn-1 than CFU-GM.
아울러, Lkn-1의 억제효과가 시간의존적인지를 규명하기 위하여, C3H/HeJ에 8㎍의 Lkn-1을 주입시키고, 골수 또는 비장에서 CFU-GM, BFU-E, CFU-GEMM의 세포주기상태를 시간간격으로 비교하였다(참조: 도 7a 내지 7(F)). 도 7a 내지 7(F)에서 보듯이, Lkn-1의 억제효과는 골수 또는 비장에서 시간의존적이며 가역적임을 확인할 수 있었다. 즉, Lkn-1은 CFU-GM, BFU-E, CFU-GEMM을 12시간만에 비주기상태(noncylcing) 또는 저주기상태(slow cycling state)로 변화시키며, 72시간후엔 대조군의 수치로 되돌아오게 하였다. 상술한 생체내(in vivo)조건에서 골수세포의 증식에 시간의존적이며 가역적으로 작용하는 Lkn-1의 억제효과는 Lkn-1이 세포독성을 가진 항암제 또는 방사선으로부터 정상 조혈세포를 보호하는 임상적 용도를 갖고 있음을 나타낸다.In addition, to determine whether the inhibitory effect of Lkn-1 is time-dependent, 8 μg of Lkn-1 was injected into C3H / HeJ and the cell cycle state of CFU-GM, BFU-E, and CFU-GEMM in bone marrow or spleen. Were compared at time intervals (see FIGS. 7A-7 (F)). As shown in Figure 7a to 7 (F), it was confirmed that the inhibitory effect of Lkn-1 is time-dependent and reversible in the bone marrow or spleen. That is, Lkn-1 changes CFU-GM, BFU-E, and CFU-GEMM into nocyclic or slow cycling state after 12 hours, and returns to control value after 72 hours. It was. The inhibitory effect of Lkn-1, which is time-dependent and reversible on the proliferation of bone marrow cells in the above-described in vivo conditions, is clinically used to protect normal hematopoietic cells from anticancer drugs or radiation with Lkn-1. Indicates that it has
실시예 6: 재조합 Lkn-1의 주화인자로서의 작용능 조사Example 6: Investigation of the function of recombinant Lkn-1 as a coin factor
재조합 Lkn-1의 화학주성을 알아보기 위하여, 우선 건강한 사람의 말초혈액 단핵세포(pheripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 Ficoll-Hypaque 구배(1,077㎎/㎤)하에서 원심분리하여 수득하였다. 그런 다음, PBMC로부터의 단핵구(monocytes) 분리는 플라스틱 표면에의 부착능으로서 수행하고, 이와 같은 단핵구 분리를 2회 시행한 후 남은 세포를 림프구로서 수득하였다. 전술한 바와 같이 수득한 단해구 및 림프구의 순도는 Diff-Quik(Baxter Scientific, U.S.A.)으로 염색된 시토스핀(cytospin)의 현미경 관찰에 의해 측정하였으며, 그 결과 각각 90% 및 80%이었다.In order to determine the chemotaxis of recombinant Lkn-1, first, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of healthy humans were obtained by centrifugation under a Ficoll-Hypaque gradient (1,077 mg / cm 3). Then, monocytes separation from PBMC was performed as an ability to adhere to the plastic surface, and the cells remaining after two such monocyte separations were obtained as lymphocytes. The purity of mononuclear and lymphocytes obtained as described above was determined by microscopic observation of cytospin stained with Diff-Quik (Baxter Scientific, U.S.A.), resulting in 90% and 80%, respectively.
또한, 사람의 호중구(neutrophil)는 2% Dextran T 500(Pharmacia Fine Chemicals, U.S.A.)로 적혈구를 침전시킨 다음, 그를 Ficoll-Hypaque 구배하에서 원심분리하여 수득하고, 수득한 적혈구를 저장액(hypotonic solution)에서 용해시킴으로써 제조하였다. 이렇게 얻은 호중구의 순도는 형태(morphology)로 결정하였는데 95%로 나타났다.Human neutrophils are also obtained by precipitating erythrocytes with 2% Dextran T 500 (Pharmacia Fine Chemicals, USA), then centrifuging them under a Ficoll-Hypaque gradient, and obtaining the erythrocytes from a hypotonic solution. Prepared by dissolving at. The purity of neutrophils thus obtained was determined by morphology, which was 95%.
상기에서 분리한 단핵구와 림프구는 0.5% 저 엔도톡신 BSA(Sigma Chemical Co., U.S.A.) 및 20mM Hepes가 첨가된 RPMI1640(GIBCO-BRL, U.S.A.)에 각각 2×106세포/㎖과 8×106세포/㎖의 농도로 현탁시키고, 호중구는 HBSS에 1×106세포/㎖의 농도로 현탁시켰다.Monocytes and lymphocytes isolated from the above were 2 × 10 6 cells / ml and 8 × 10 6 cells in 0.5% low endotoxin BSA (Sigma Chemical Co., USA) and RPMI1640 (GIBCO-BRL, USA) added with 20 mM Hepes, respectively. Suspension at a concentration of / ml and neutrophils were suspended in HBSS at a concentration of 1 x 10 6 cells / ml.
어어, 48웰 마이크로쳄버(Neuroprobe, U.S.A.)에서의 세포이동 정도를 다음과 같이 측정하였다. 마이크로쳄버의 하층 웰에는 완충용액만이(대조구), 혹은 재조합 Lkn-1, hMIP-1α(PeproTech., U.S.A.), RANTES(PeproTech., U.S.A.), IL-8(PeproTech., U.S.A.) 또는 에오탁신(eotaxin, PeproTech., U.S.A.)을 포함한 완충용액이 채워져 있고, 상층의 웰에는 전술한 세포 현탁액 50㎕가 채워져 있으며, 이들 두 층은 폴리비닐피롤리돈이 없는 적절한 공경의 필터로 분획되어 있다. 측정하고자 하는 세포가 호중구와 림프구인 경우에 사용하는 필터의 공경 직경은 3㎛이고, 단핵구인 경우에사용하는 필터의 공경 직경은 5㎛이었다. 37℃에서 1시간(호중구의 경우), 2시간(단핵구의 경우), 4시간(림프구의 경우) 상기 마이크로쳄버를 방치한 다음, 필터를 쳄버로부터 제거하여 세척하고, 이어 세포 고정시키고 Diff-Quick으로 염색하여 세포수를 산정하였다(참조: 도 8a 내지 8(C)).Er, the degree of cell migration in 48 well microchamber (Neuroprobe, U.S.A.) was measured as follows. The lower well of the microchamber contains only buffer (control) or recombinant Lkn-1, hMIP-1α (PeproTech., USA), RANTES (PeproTech., USA), IL-8 (PeproTech., USA) or eotaxin (eotaxin, PeproTech., USA) is filled with buffer, the upper well is filled with 50 μl of the cell suspension described above, and these two layers are fractionated with a suitable pore filter free of polyvinylpyrrolidone. The pore diameter of the filter used when the cells to be measured were neutrophils and lymphocytes was 3 μm, and the filter diameter used when the monocytes were monocytes was 5 μm. 1 hour (for neutrophils), 2 hours (for monocytes), 4 hours (for lymphocytes) at 37 ° C. The microchamber was left to stand, then the filter was removed from the chamber and washed, followed by cell fixation and Diff-Quick The cell number was calculated by staining with (see FIGS. 8A to 8C).
도 8a 내지 8(C)에서는 케모카인으로 이동한세포수를 대조군의 이동 세포수로 나눈 수치를 주화인자의 지표(chemotactic index)로 하였다. 도 8a는 림프구에 대한 재조합 Lkn-1 및 RANTES의 화학주성을 나타내는 그래프이고, 도 8b는 단핵구에 대한 재조합 Lkn-1 및 hMIP-1α의 화학주성을 나타내는 그래프이며, 도 8c는 호중구에 대한 재조합 Lkn-1 및 IL-8의 화학주성을 나타내는 그래프이다.In FIGS. 8A to 8C, the number of cells transferred to chemokines divided by the number of cells moved to the control group was used as a chemoactic index. Figure 8a is a graph showing the chemotaxis of recombinant Lkn-1 and RANTES for lymphocytes, Figure 8b is a graph showing the chemotaxis of recombinant Lkn-1 and hMIP-1α for monocytes, Figure 8c is a recombinant Lkn for neutrophils It is a graph showing the chemotaxis of -1 and IL-8.
도 8a 내지 8(C)에서 보듯이, 재조합 Lkn-1은 사람의 말초혈액 호중구, 단핵구 및 림프구에 대한 강력한 주화인자임을 알 수 있었다. 또한, 재조합 Lkn-1은 호중구에 대해서 IL-8과 유사하게 화학주성을 보이며(참조: 도 8c), 단핵구에는 대해서 hMIP-1α와 유사한 정도의 화학주성을 나타내고(참조: 도 8b); 림프구에 대해서는 RANTES보다 낮은 화학주성을 나타내지만, 10㎍/㎖dml Lkn-1 농도까지는 농도의존적으로 향상된 화학주성을 나타냄을 알 수 있었다(참조: 도 8a).As shown in Figures 8a to 8 (c), recombinant Lkn-1 was found to be a potent chemotactic factor for human peripheral blood neutrophils, monocytes and lymphocytes. In addition, recombinant Lkn-1 exhibits chemotaxis similar to IL-8 for neutrophils (see FIG. 8C), and shows chemotaxis similar to hMIP-1α for monocytes (FIG. 8B); The lymphocytes exhibited lower chemotaxis than RANTES, but up to 10 μg / ml dml Lkn-1 concentration showed improved chemotaxis (see FIG. 8A).
실시예 7: 재조합 Lkn-1에 의한 칼슘 유출(clacium flux)정도의 분석Example 7: Analysis of the degree of calcium flux by recombinant Lkn-1
실시예 7-1: 림프구, 단해구, 호중구에서의 칼슘 유출 분석Example 7-1: Calcium Outflow Analysis in Lymphocytes, Mononuclear Cells, Neutrophil
재조합 Lkn-1이 수용체에 결합하여 림프구, 단핵구, 호중구를 활성화시켜 이들에서의 칼슘 유출을 유도하는지, 그리고 그 수용체에 대해 다른 작용인자(agonist)와는 어떠한 경쟁 관계에 있는지를 알아보고자 하였다.The aim of this study was to determine whether recombinant Lkn-1 binds to receptors, activates lymphocytes, monocytes and neutrophils to induce calcium efflux from them and how they compete with other agonists for that receptor.
수용체의 활성화는 정제된 말초혈액 백혈구 서브셋(림프구, 단핵구, 호중구)에서의 [Ca2+] 변화를 MSⅢ 형광분석기(fluorimeter, Photon Technology International, U.S.A.)로 측정하였다. 즉, 세포와 2μM의 fura-2AM(Sigma Chemicla co., U.S.A.)을 37℃에서 45분간 반응시키고, 2번 세척하여 0.05% BSA가 포함된 HBSS(pH 7.4)에 1×107세포/㎖의 농도로 현탁시켰다. 이 세포 현탁액 2㎖을 37℃ 수욕상에서 교반되는 큐벳(a stirred, water-jacketed cuvette)에 넣고, 340nm와 380nm에서 연속적으로 여기시키고, 방출되는 형광은 25nM 작용물질(agonist)(재조합 Lkn-1, hMIP-1α, RANTES, IL-8 또는 에오탁신)의 첨가 전, 후에 510nm에서 측정하였다(참조: 도 9a 내지 9(F)).Activation of the receptor was measured by [Ca 2+ ] changes in purified peripheral blood leukocyte subsets (lymphocytes, monocytes, neutrophils) with an MSIII fluorimeter (Photon Technology International, USA). That is, cells and 2 μM of fura-2AM (Sigma Chemicla co., USA) were reacted at 37 ° C. for 45 minutes and washed twice to 1 × 10 7 cells / ml in HBSS (pH 7.4) containing 0.05% BSA. Suspended to concentration. 2 ml of this cell suspension is placed in a stirred, water-jacketed cuvette in a 37 ° C. water bath, continuously excited at 340 nm and 380 nm, and the fluorescence emitted is 25 nM agonist (recombinant Lkn-1, Measurements were made at 510 nm before and after addition of hMIP-1α, RANTES, IL-8 or eotaxin (see FIGS. 9A-9F).
도 9a 내지 9(F)에서의 상대적 형광은 340nm와 380nm에서 여기된 형광의 상대적 비율로서 표시하였다. 도 9a는 림프구에 가해진 일련의 RANTES과 재조합 Lkn-1의 자극에 대해서 측정된 상대적 형광도; 도 9b는 림프구에 가해진 일련의 재조합 Lkn-1과 RANTES의 자극에 대해서 측정된 상대적 형광도; 도 9c는 단핵구에 가해진 일련의 MIP-1α과 재조합 Lkn-1의 자극에 대해서 측정된 상대적 형광도; 도 9e는 림프구에 가해진 일련의 IL-8과 재조합 Lkn-1의 자극에 대해서 측정된 상대적 형광도; 그리고, 도 9f는 림프구에 가해진 일련의 재조합 Lkn-1과 UL-8의 자극에 대해서 측정된 상대적 형광도를 각각 나타낸다. 도 9a 내지 9(F)에서 보듯이, 재조합 Lkn-1은 림프구, 단핵구 및 호중구에서의 칼슘 유출을 유도함을 알 수 있었다.Relative fluorescence in FIGS. 9A-9F is expressed as relative ratio of fluorescence excited at 340 nm and 380 nm. 9A shows relative fluorescence measured for a series of RANTES and stimulation of recombinant Lkn-1 applied to lymphocytes; 9B shows relative fluorescence measured for stimulation of a series of recombinant Lkn-1 and RANTES applied to lymphocytes; 9C shows relative fluorescence measured for a series of MIP-1α and recombinant Lkn-1 stimuli applied to monocytes; 9E shows relative fluorescence measured for a series of IL-8 and recombinant Lkn-1 stimuli applied to lymphocytes; 9F shows the relative fluorescence measured for stimulation of a series of recombinant Lkn-1 and UL-8 applied to lymphocytes, respectively. As shown in Figures 9a to 9 (F), it can be seen that recombinant Lkn-1 induces calcium outflow in lymphocytes, monocytes and neutrophils.
한편, G 단백질 연관의 수용체(G protein-coupled receptors)가 수용체 시그날의 동일한 결합부위를 갖는 리간드에 짧은 시간내에 연속적으로 노출되면, 전기 수용체가 탈감작(desensitization)되는 것으로 알려져 있다. 이러한 현상은 전술한 수용체 발현 세포에 재조합 Lkn-1로 자극을 가했을 경우에도 나타났다.On the other hand, when G protein-coupled receptors are continuously exposed to a ligand having the same binding site of the receptor signal within a short time, it is known that the electrical receptor is desensitized. This phenomenon was also observed when the receptor-expressing cells were stimulated with recombinant Lkn-1.
또한, 도 9a 내지 9(F)에서 보듯이, RANTES 및 hMIP-1α에 의한 추후 자극이 있는 경우, 재조합 Lkn-1은 림프구 및 단핵구를 완전히 탈감작시키거나(참조: 도 9b 및 9(D)), 재조합 Lkn-1에 의한 추후 자극이 있는 경우에 RANTES 및 hMIP-1α 각각은 림프구 및 단핵구를 완전히 탈감작시키지 못함(참조: 도 9a 및 9(C))을 알 수 있었다. 이는 재조합 Lkn-1이 RANTES 및 hMIP-1α와 수용체를 공유하고, RANTES나 hMIP-1α보다 칼슘 유출을 더 잘 유도한다는 것을 나타낸다. 아울러, 재조합 Lkn-1이 호중구에서 칼슘 유출을 유도할지라도, 호중구는 IL-8에 의한 추후 자극에 의해 탈감작되지 않으며(참조: 도 9f), IL-8은 재조합 Lkn-1에 의한 자극이후에 호중구를 탈감작시키지 못함(참조: 도 9e)을 알 수 있는 바, 이는 재조합 Lkn-1이 IL-8과 마찬가지로 호중구에서의 칼슘 유출을 유도하는 하나의 강력한 인자일지라도, IL-8과 수용체를 공유하지 않는다는 것을 나타낸다.In addition, as shown in FIGS. 9A-9F, in the event of subsequent stimulation by RANTES and hMIP-1α, recombinant Lkn-1 completely desensitizes lymphocytes and monocytes (see FIGS. 9B and 9 (D)). In case of subsequent stimulation by recombinant Lkn-1, RANTES and hMIP-1α, respectively, did not completely desensitize lymphocytes and monocytes (see FIGS. 9A and 9 (C)). This indicates that recombinant Lkn-1 shares receptors with RANTES and hMIP-1α and induces calcium efflux better than RANTES or hMIP-1α. In addition, even though recombinant Lkn-1 induces calcium efflux from neutrophils, neutrophils are not desensitized by subsequent stimulation by IL-8 (see FIG. 9F), and IL-8 is induced after stimulation by recombinant Lkn-1. It can be seen that it does not desensitize neutrophils (FIG. 9E), which does not share receptors with IL-8, even though recombinant Lkn-1, like IL-8, is one potent factor inducing calcium efflux from neutrophils. It does not.
실시예 7-2: CC 케모카인 수용체를 발현하는 세포주에서의 칼슘 유출 분석Example 7-2 Calcium Leakage Analysis in Cell Lines Expressing CC Chemokine Receptor
상기 실시예 7-1에서 재조합 Lkn-1은 RANTES 및 hMIP-1α에 의해 활성화되는 수용체를 활성화시키는 것으로 나타났는 바, 이를 시험하기 위하여, CC 또는 CXC 케모카인 수용체를 발현하는 세포주를 재조합 Lkn-1이 활성화시키는지 조사하였다. 여기서는 정제된 백혈구 서브셋을 사용하는 대신에, 재조합 CCR1, CCR2B, CCR3, CCR4, CCR5 및 CXCR4를 발현하는 HOS 세포주(참조: AIDS Research and Reference Reagent Program of NIH, U.S.A.)를 사용하는 점을 제외하고는 실시예 7-1과 동일하게 실험하였다. hMIP-1α는 CCR1과 CCR5에 모두 결합하고, RANTES는 CCR1, CCR3, CCR5 모두에 결합하는 것으로 알려져 있다.In Example 7-1, recombinant Lkn-1 was found to activate receptors activated by RANTES and hMIP-1α. To test this, a cell line expressing a CC or CXC chemokine receptor was selected from recombinant Lkn-1. Activation was investigated. Here, instead of using a purified leukocyte subset, except for using HOS cell lines expressing recombinant CCR1, CCR2B, CCR3, CCR4, CCR5 and CXCR4 (AIDS Research and Reference Reagent Program of NIH, USA). The experiment was performed in the same manner as in Example 7-1. hMIP-1α binds to both CCR1 and CCR5, and RANTES is known to bind to both CCR1, CCR3, CCR5.
도 10a는 CCR1을 발현하는 HOS 세포주에 가해진 각종 작용물질의 일련의 자극에 대해서 측정된 상대적 형광도, 도 10b는 CCR3을 발현하는 HOS 세포주에 가해진 각종물질에 의한 일련의 자극에 대해서 측정된 상대적 형광도를 나타내는 그래프이다. 도 10a 및 10(B)에서 보듯이, 재조합 Lkn-1은 CCR1 및 CCR3를 발현하는 HOS 세포에서의 칼슘 유출을 강하게 유도함을 알 수 있었다. 그러나, CCR1 및 CCR3 이외의 수용체를 발현하는 HOS 세포에서는 칼슘 유출이 관찰되지 않았다.FIG. 10A shows relative fluorescence measured for a series of stimuli of various agents applied to CCR1 expressing HCR cell lines, and FIG. 10B shows relative fluorescence measured for a series of stimuli by various substances applied to HCR cell lines expressing CCR3. It is a graph showing degrees. As shown in Figures 10a and 10 (b), it can be seen that recombinant Lkn-1 strongly induces calcium outflow in HOS cells expressing CCR1 and CCR3. However, no calcium efflux was observed in HOS cells expressing receptors other than CCR1 and CCR3.
또한, 도 10a에서 보듯이, CCR1-HOS 세포가 먼저 재조합 Lkn-1으로 자극되는 경우, 추후의 재조합 hMIP-1α 또는 RANTES 자극에 대해서는 반응이 없는 반면에, CCR1-HOS 세포가 먼저 hMIP-1α 또는 RANTES로 자극되는 경우, 추후의 재조합 Lkn-1 자극에 대한 반응은 영향을 받지 않는 것을 알 수 있었다. 도 10a의 결과로부터, 재조합 Lkn-1은 hMIP-1α 또는 RANTES보다 CCR1에 대한 강력한 작용물질임을 알 수 있는 바, 이는 재조합 Lkn-1 및 hMIP-1α의 농도에 따른 반응을 조사한 도 10c의 결과에서도 명백히 입증되고 있다.In addition, as shown in FIG. 10A, when CCR1-HOS cells are first stimulated with recombinant Lkn-1, there is no response to subsequent recombinant hMIP-1α or RANTES stimulation, whereas CCR1-HOS cells first receive hMIP-1α or When stimulated with RANTES, it was found that the response to the subsequent recombinant Lkn-1 stimulation was not affected. From the results of FIG. 10A, it can be seen that recombinant Lkn-1 is a stronger agonist for CCR1 than hMIP-1α or RANTES, which is also shown in the results of FIG. 10C examining the reaction according to the concentration of recombinant Lkn-1 and hMIP-1α. It is clearly proven.
아울러, 도 10b에서 보듯이, CCR3-HOS 세포가 먼저 에오탁신으로 자극되는 경우, 추후의 에오탁신 또는 재조합 Lkn-1 자극에 대해서 거의 완전한 탈감작 반응이 나타나고; CCR3-HOS 세포가 먼저 재조합 Lkn-1으로 자극되는 경우, 추후의 RANTES 자극에 대해서는 거의 완전한 탈감작 반응이 나타나는 반면에; CCR-HOS 세포가 먼저 재조합 Lkn-1 또는 RANTES로 자극되는 경우, 추후의 에오탁신 자극에 대한 반응은 영향을 받지 않는 것을 알 수 있었다. 또한, 에오탁신, 재조합 Lkn-1, RANTES의 농도에 따른 반응을 조사한 결과(참조: 도 10d), 재조합 Lkn-1은 에오탁신보다 강력하지 못하나, RANTES보다는 CCR3에 대한 강력한 작용물질임을 알 수 있었다.In addition, as shown in FIG. 10B, when CCR3-HOS cells are first stimulated with eotaxin, a nearly complete desensitization response to subsequent eotaxin or recombinant Lkn-1 stimulation occurs; When CCR3-HOS cells are first stimulated with recombinant Lkn-1, an almost complete desensitization response to subsequent RANTES stimulation occurs; When CCR-HOS cells were first stimulated with recombinant Lkn-1 or RANTES, it was found that subsequent responses to eotaxin stimulation were not affected. In addition, as a result of examining the reaction according to the concentrations of eotaxin, recombinant Lkn-1 and RANTES (see FIG. 10D), it was found that recombinant Lkn-1 was not as strong as eotaxin, but was a potent agonist for CCR3 than RANTES. .
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 사람의 단핵세포주에서 분리한 신규의 C6 β-케모카인 Lkn-1 cDNA 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 제공한다. Lkn-1 cDNA 개방해독틀은 21개의 아미노산으로 이루어진 신호 펩타이드를 포함하여 총 113개의 아미노산을 암호화하고 있으며, 그 중 92개의 아미노산으로 구성된 성숙 단백질의 분자량은 10,162Da으로 추정되었다. 전기 Lkn-1 cDNA를 재조합 대장균 또는 곤충세포에서 발현시켜 순수분리한 재조합 Lkn-1은 집락형성을 유의적으로 억제하고, 림프구, 단핵구, 호중구를 유인하는 화학주성을 가지며, CCR1 및 CCR3의 수용체에 결합하는 것으로 확인되었다. 이 재조합 Lkn-1 단백질은 항체 제조, HIV-1 감염시의 치료, 화학요법이나 방사선치료시의 골수양간세포 보호 및 백혈병 억제 등에 이용할 수 있다.As described and demonstrated in detail above, the present invention provides a novel C6 β-chemokine Lkn-1 cDNA isolated from human mononuclear cell lines and amino acid sequences inferred therefrom. The Lkn-1 cDNA open reading frame encodes a total of 113 amino acids, including a signal peptide consisting of 21 amino acids, of which the molecular weight of the mature protein consisting of 92 amino acids is estimated to be 10,162 Da. Recombinant Lkn-1 purified by expressing the aforementioned Lkn-1 cDNA in recombinant E. coli or insect cells significantly inhibits colony formation, has chemotaxis that attracts lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the receptors of CCR1 and CCR3 It was confirmed to bind. The recombinant Lkn-1 protein can be used for antibody production, treatment during HIV-1 infection, bone marrow hepatocyte protection during chemotherapy or radiation therapy, and inhibition of leukemia.
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