KR20010022075A - T세포활성화를유도하는슈퍼항원접합체에의한표적세포의세포용해 - Google Patents

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KR20010022075A
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Abstract

슈퍼항원(SAG)과 면역 조절인자 중의 하나 이상이 "자유" 슈퍼항원(Sag)과 접합체를 표적 세포에 표적화시키는 잔기 간의 접합체의 형태로 존재함을 특징으로 하는, 두 가지 유형의 세포를 면역 조절인자의 존재하에서 상기 슈퍼항원과 접촉시킴으로써 T 세포의 존재하에서 표적 세포를 불활성화시키는 방법. 다음 화학식 Ⅰ에 해당하는 슈퍼항원 접합체.
화학식 Ⅰ
(T)x(Sag)y(IM)z
상기식에서,
a) T는 표적화 잔기이고, Sag는 자유 슈퍼항원에 상응하며, IM은 슈퍼항원이 아닌 면역 조절인자이고, T, Sag 및 IM은 유기 링커 B를 통하여 함께 연결되어 있으며;
b) x, y 및 z는 전형적으로 0 내지 10 중에서 선택되는 정수이고, 제시된 접합체 분자 내에서 각각 잔기 T, Sag 및 IM의 수를 나타내는데, 단 y>0이고 또한 x 및 z 중의 하나 또는 둘 다가 >0이어야 한다.
이러한 슈퍼항원 접합체는 바람직하게는 삼중 융합 단백질이다.
표적화 잔기(T'")와 변형된 면역 조절인자(IM'") 간의 접합체임을 특징으로 하는 표적화된 면역 조절인자. 이러한 접합체는 변형된 면역 조절인자가 반드시 존재한다는 것을 제외하고는 화학식 Ⅰ과 유사한 화학식에 부합된다. 슈퍼항원 잔기가 존재할 수도 있다. 슈퍼항원과 면역 조절인자를 암호화하는 DNA 분자.

Description

표적 세포의 지시된 세포용해, 세포용해를 유발시키는 제제 및 조성물, 및 이러한 제제를 제조하는데 사용될 수 있는 화합물{Directed cytolysis of target cells, agents and compositions causing cytolysis, and compounds that can be used to produce the agents}
슈퍼항원의 치료학적 용도
접합되지 않은 야생형 슈퍼항원 및 돌연변이된 슈퍼항원은 치료하고자 하는 질병과 연관된 세포를 발현하는 부류 II에 국부적으로 면역 시스템을 활성화시키거나 또는 전신 활성화시킴으로써 수행되는 것으로 여겨지는 치료 효과를 나타내는 치료법에 제시된 바 있다[참조: Kalland et al WO 9104053; Terman et al WO 9110680 and WO 9324136; Antonsson et al WO 9736932; and Newell et al 1991]. 야생형 슈퍼항원의 극도의 독성으로 인해, 암 치료에 관한 이러한 접근 방식은 모든 암의 극히 일부분에만 적용되어야만 한다.
또한, 표적-추적 잔기와 접합된 슈퍼항원의 사용이 제안된 바 있다[참조: Dohlsten et al WO 9201470; Abrahmsen et al WO 9601650; Antonsson et al WO 9736932 and Ochi et al 1993; 모든 공보는 본원에 참조문헌으로 삽입되어 있다].
생체내에서 IL-2에 의한 T 세포 매개된 세포독성 활성의 슈퍼항원 유도된 하향 조절 방지에 관한 연구와 관련하여, IL-2를 접합되지 않은 야생형 슈퍼항원 및 항체에 접합된 야생형 슈퍼항원과 함께 투여하는 것이 유익한 것으로 인식되어 왔다[참조: Belfrage Thesis August/September 1996; Belfrage et al 1994; Belfrage et al 1995; Belfrage et al 1997a; Belfrage et al 1997b(야생형 슈퍼항원)].
세포막 고정된 CD80이 MHC 부류 II 항원의 부재하에서 T 세포의 슈퍼항원 활성화에 역할을 하는 것으로 제시되었다[참조: Lando et al 1993 and 1996].
상기 문헌[Lando et al 1996]에서의 도 4는 항체에만 접합되거나 IL-2와 함께 항체에 접합된 슈퍼항원의 휴지기 사람 T 세포의 증식 유도 능력에 관하여 분석한 실험 결과가 도시되어 있다. 이러한 4일 간의 실험에서는, 상기와 같이 접합된 슈퍼항원이 모 CHO 세포와 형질감염된 CHO 세포 상에 존재하여 부류 II 또는 C215 또는 부류 II + C215를 발현시킨다. IL-2의 효과는 별로 대단치 않다.
문헌[Kappler et al WO 9314634]에는 Vβ 또는 MHC 부류 II 결합 능력을 상실하도록 돌연변이된(백신의 맥락에서 및 슈퍼항원의 독성 효과를 중화시키기 위한 제제로서) 접합되지 않은 야생형 SEB가 제안되었다. 문헌[Abrahmsen et al WO 9601650]에는 부류 II 항원과의 결합 능력이 변형된, 아마도 저하된 접합된 슈퍼항원을 이용한 암 치료법이 제안되었다. 문헌[Antonsson et al WO 9736932]에는 키메라형 슈퍼항원과 혈청반응성이 저하된 슈퍼항원을 이용한 치료법이 제안되었다[또한 Abrahmsen et al 참조]. 문헌[Abrahmsen et al WO 9601650 and Antonsson et al WO 9736932]에 기재된 바와 같은 돌연변이는 치료받고자 하는 포유동물에서의 전신 독성이 저하되고, 면역원성이 저하되며/되거나 혈청 반응성이 저하된 슈퍼항원을 나타낼 것이다.
야생형 슈퍼항원을 암호화하는 핵산 투여를 이용한 치료법이 제시되었다[참조: Terman et al WO 9110680; WO 9324136, and Dow et al WO 9636366]. 다우(Dow) 등은 사이토킨 또는 케모카인을 암호화하는 핵산을 슈퍼항원을 암호화하는 핵산과 함께 투여하는 것을 제안하였다. 실험적인 뒷받침은 이루어질 수 없었지만, WO 9636366은 하나의 시스트론이 슈퍼항원을 암호화하는 유전자를 함유하고 다른 시스트론이 사이토킨이나 케모카인을 암호화하는 유전자를 함유하고 있는 비스시스트론성 유전자 작제물 형태의 작제물을 제안하고 있다.
실험적인 뒷받침은 이루어질 수 없었지만, 문헌[Pouletty P(Sangstat, EP 510949)]에는 IL-2와 같은 표적화 잔기와 야생형 슈퍼항원 간의 접합체가 IL-2 수용체를 발현하는 세포를 불활성화시키는데 유용할 지도 모른다고 제시되어 있다.
불활성화되는 세포에 대해 특이적인 항체와 조합된 면역 조절인자의 치료학적 용도
항체를 생물학적 반응 변형인자, 예를 들면, 케모카인 또는 사이토킨(예: 인터루킨-2)와 접합시키는 것은 앞서 제안된 바 있다[참조: Fell et al EP 439095; Rosenblum et al EP 396387, Pancook et al 1996; and Becker et al 1996].
본 발명이 해결하고자 하는 문제점
본 발명은 치료하고자 하는 포유동물에서 바람직하지 못한 표적 세포를 불활성화시키기 위하여 면역 시스템의 활성화와 관련된 슈퍼항원 치료법에 관한 개선책을 제공하고자 한다. 특히, 이러한 개선책은 1) 제1 치료 주기 동안에 활성화 기간을 국부적으로, 예를 들면, 종양에서의 활성화 기간을 연장시키고; 2) 활성화된 T 세포가 아네르기(anergy)로 빠져나가는 경향으로 인한 반응성 저하 현상을 길항시키며; 3) 종양 부위에서 MHC 부류 II 독립적인 T 세포 활성화를 촉진시키고; 4) 슈퍼항원 활성화를 통한 세포용해에 대한 치료학적 영역을 확장시키는 것에 관한 것이다. 슈퍼항원(SAG)을 가용성 형태의 면역 조절인자의 투여와 조합하여 투여하는 경우에(이들 슈퍼항원과 면역 조절인자 중의 하나 이상이 불활성화될 세포에 대한 표적화 특성을 지닌 잔기와의 접합체 형태로 존재한다) 상기 개선책이 전적으로 또는 부분적으로 달성될 수 있다는 사실이 본 발명에 의해 밝혀졌다.
본 발명의 제1 주요 양태: 표적 세포를 불활성화시키는 방법
본 발명의 제1 양태는 치료법과 시험관내 검정 모두를 포괄하며; 2가지 유형의 세포를, 슈퍼항원(Sag)이 아닌 면역 조절인자(IM)의 존재하에서 슈퍼항원(SAG), 특히 TCRVβ에 대한 결합을 통하여 T 세포를 활성화시키는 슈퍼항원과 접촉시킴으로써 T 세포의 존재하에서 바람직하지 못한 표적 세포를 불활성화시키는 방법에 관한 것이다. 가장 광범위한 양태에 있어서, 상기 방법은 상기 슈퍼항원과 면역 조절인자 중의 하나 이상이 불활성화될 세포에 대한 표적화 특성을 지니고 있는 잔기(T)와의 접합체 형태로 존재하는 것을 특징으로 한다. 아양태에 있어서, 상기 방법은
a. 슈퍼항원(SAG)과 면역 조절인자가 슈퍼항원(Sag), 표적 세포에 대한 표적화 잔기(T) 및 면역 조절인자(IM)를 포함하는 삼중 접합체의 형태로 사용됨을 특징으로 하고(T, IM, Sag-접합체);
b. 슈퍼항원(SAG)이, 면역 조절인자(IM)와 표적 세포에 대한 표적화 잔기(T') 간의 이중 접합체와 조합하여, 슈퍼항원(Sag)과 표적 세포에 대한 표적화 잔기(T) 간의 이중 접합체의 형태로 사용됨을 특징으로 하며(T, Sag-접합체 + T', IM-접합체);
c. 슈퍼항원(SAG)이 슈퍼항원(Sag)과 표적 세포에 대한 표적화 잔기(T) 간의 이중 접합체의 형태로 사용되고 면역 조절인자(IM)가 자유 형태, 즉 표적 세포에 대한 표적화 잔기와 접합되지 않은 형태로 사용됨을 특징으로 하고(T, Sag-접합체 + IM);
d. 슈퍼항원(SAG)이 자유 형태(Sag)로 사용되고 면역 조절인자가 접합체 형태, 즉 면역 조절인자(IM)와 슈퍼항원(Sag) 간의 이중 접합체의 형태로 사용됨을 특징으로 하며(Sga + T,IM-접합체);
e. 슈퍼항원(SAG)과 면역 조절인자가 슈퍼항원(Sag)과 면역 조절인자(IM) 간의 이중 접합체의 형태로 사용됨을 특징으로 한다(Sag,IM-접합체).
슈퍼항원 및 면역 조절인자는 동일한 유형의 세포, 예를 들면, 동일하거나 상응하는 구조물/에피토프를 표적으로 할 수 있거나, 또는 동일한 조직 내의 상이한 유형의 세포를 표적으로 할 수 있다. 표적화는 정상 세포에 대해서일 수 있거나 하나의 조직 및 동일한 조직과 연관된 질병이 든 세포에 대해서일 수 있다. 슈퍼항원과 면역 조절인자 중의 하나 또는 둘 다는 하나 또는 수 개의 항체를 이용하여 표적화될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 치료받고자 하는 질병
치료받고자 하는 질병은 원칙적으로, 앞서 언급된 슈퍼항원에 대해 제시된 바와 동일하다. 이의 예로는 암, 자가면역 질환, 기생충 감염, 바이러스성 감염, 및 세포 표면 상에 MHC 부류 II 항원이 발현되는 세포 및/또는 각각의 질병에 특이적이고 본 발명의 개념에 따라서 슈퍼항원에 혼입된 표적-추적 잔기와 결합되는 기타 구조물과 연관된 기타 질환이 있다(화학식 Ⅰ). 또한, 세균성 감염을 치료하기 위해 본 발명을 사용할 수도 있다.
본 발명의 맥락에서 중요한 암은 흑색종, 암종, 조혈 종양 및 섬유육종이며, 이의 구체적인 형태로는 편평상피 세포 암종, 유방암, 두암종 및 경암종, 갑상선 암종, 연조직 암종, 골육종, 고환암, 전립선암, 난소암, 방광암, 피부암, 뇌암, 혈관육종, 유선 세포 종양, 1차 간암, 폐암, 경관암, 신장 세포 암종, 백혈병 및 임파종이 있다. 어떠한 유형의 악성 또는 양성 종양 뿐만 아니라 다발성 약물 내성 암, 전이성 암, 각종 형태의 화학적 또는 바이러스적(헤르페스, SV40, HIV 등) 유도된 암도 이에 포함된다.
본 발명의 제2 주요 양태: 본 발명에 따른 슈퍼항원 접합체
이러한 본 발명의 양태는 다음 화학식 Ⅰ에 해당하는 접합체를 포함한다:
(T)x(Sag)y(IM)z
상기식에서,
T는 표적화 잔기이고, Sag는 자유 슈퍼항원에 상응하며, IM은 슈퍼항원이 아닌 면역 조절인자이다. T, Sag 및 IM은 하나 및 동일한 접합체 분자 또는 물질 내에서 상이하거나 동일할 수 있는 유기 링커 B를 통하여 함께 연결되어 있다. 화학식 Ⅰ에 따르는 접합체는 화학적 접합체 뿐만 아니라 재조합적으로 제조된 접합체(융합 단백질)을 포괄한다. x, y 및 z는 전형적으로 0 내지 10, 예를 들면, 0 내지 5 중에서 선택되는 정수이고, 제시된 접합체 분자 내에서 각각 잔기 T, Sag 및 IM의 수를 나타내는데, 단 y>0이고 또한 x 및 z 중의 하나 또는 둘 다가 >0이어야 한다. 화학적 접합체는 통상적으로, 상이한 접합체 분자의 혼합물을 함유하는 접합체 물질이다. 따라서, 화학적 접합체에서는, x, y 및 z가 0 내지 10, 예를 들면, 0 내지 5의 범위 내의 비-정수일 수 있다.
화학식 Ⅰ의 제1 아양태에 있어서, Sag와 IM과 T는 접합체로 존재한다(x 및 y 및 z>0; T,Sag,IM-접합체). x, y 및 z는 전형적으로 1 내지 3의 정수, 바람직하게는 1 내지 2의 정수이다. x, y 및 z 간의 전형적인 관계는 다음과 같다: x=y=z; x=y=0.5z; x=0.5y=0.5z; 및 x=0.5y=z.
화학식 Ⅰ에 따르는 접합체의 제2 아양태에서는, 표적화 잔기가 존재하지 않으며(IM,Sag-접합체, x=0), y 및 z가 전형적으로 1 내지 3의 정수이다. x 및 y 간의 바람직한 관계는 다음과 같다: x=y; x=0.5y, 0.5x=y; x=1/3y 및 1/3x=y.
양 아양태에서는, 정수 또는 관계가 주로, 표적화 잔기가 1, 2, 3 또는 4개의 폴리펩티드 쇄를 함유하는 단백질일 수 있고 각 접합체 분자 내에 하나의 T가 존재하는 융합 단백질을 지칭한다.
상기 제2 아양태에 따르는 접합체에 대한 화학식 Ⅰ은 다음 화학식 Ⅱ로 단축된다:
(Sag)y(IM)z
이러한 유형의 접합체는 1차적으로, MHC 부류 II 항원을 발현하는 세포, 특히 부류 II 발현성 암, 예를 들면, 조혈 시스템의 암, 및 특정한 자가 면역 질환, 바이러스성 감염 및 기생충 감염과 연관된 질환 뿐만 아니라 면역 조절인자에 대한 세포막 고정된 수용체와 연관된 질환, 예를 들면, IL-2 수용체를 발현하는 T 세포 임파종을 치료하는 것에 적용된다.
A. 화학식 Ⅰ에서의 면역 조절인자 IM
IM은 자유 또는 접합된 슈퍼항원이 아닌 면역 조절인자를 나타낸다.
이러한 면역 조절인자는 사이토킨 또는 케모카인일 수 있다. 사이토킨의 예로는 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 종양 괴사 인자 α 또는 β(TNFα 또는 TNFβ), 마크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF), 과립구 자극 인자(G-CSF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 및 IGF가 있다. 케모카인의 예로는 C5a, IL-8, 단구 화학주성 단백질 알파(MIP1알파) 또는 단구 화학주성 단백질 1β(MIP1β), 단구 화학유인성 단백질 1(MCP-1), 단구 화학유인성 단백질 2(MCP-2), 단구 화학유인성 단백질 3(MCP-3), 혈소판 활성화 인자(PAFR), N-포밀-메티오닐-류실-페닐알라닌(FMLPR), 루코트리엔 B4(LTB4R), 가스트린 방출 펩티드(GRP), RANTES, 에오탁신(eotaxin), 림포탁틴(lymphotactin), IP10, I-309, ENA78, GCP-2, NAP-2, MGSA/gro, DC-CK1, Flt3L(엑토픽 도메인), 프락탈킨, PF-4 등이 있다.
또 다른 유형의 면역 조절인자는 촉발된 면역 반응의 조절, 예를 들면, 공자극에 관여된 세포막 고정된 수용체/리간드 쌍(예를 들면, 임파구 표면 결합된 수용체 및 상응하는 세포 결합된 리간드)으로부터 유도된 것이다. 이의 예로는 CD40L/CD40, 4-BB1/4-BB1L, CD28/B7, CTLA-4/B7 쌍 등 중에서 선택된 것이 있다. B7에는 CD80 및 CD86 등의 변이체가 포함되며, 전자가 바람직하다. 바람직한 형태는 세포외 부분(엑토픽 도메인)을 함유하는 가용성 형태이며 세포내 및 막 고정된 부분이 결여되어 있다.
특히 바람직한 면역 조절인자는 예를 들면, 슈퍼항원 활성화된 T 세포가 아네르기로 빠져나가는 것을 길항함으로써 생체내에서 슈퍼항원의 효과를 증진시킬 수 있다. 전형적인 적절한 세포 결합된 수용체/리간드는 상기 정의된 바와 같은 동족체 및 단편을 포함한 CD28/B7이다. 이러한 그룹의 전형적인 사이토킨은 CD28/B7 시그날링의 주요 하부 이펙터로서의 IL-2, 및 IL-2 유사 사이토킨 IL-7 및 IL-15이다. T 세포 표면 결합된 수용체/리간드 쌍 중에서, 활성화될 T 세포에 결합되지 않은 것을 본 발명에 따르는 접합체에 혼입시키는 것이 바람직하다. CD40L/CD40, 4-BB1/4-BB1L 및 CD28/B7의 경우, 이는 가용성 형태 CD40, 4-BB1L 및 B7을 의미하고 상기 정의된 것이 바람직하다. 이러한 본문 내용과 관련된 실험 결과를 나타내는 단원에는 본원 우선일에 본 발명에 최적인 것으로 밝혀진 면역 조절인자 변이체가 예시되어 있다.
면역 조절인자는 바람직하게는 치료받고자 하는 개개인과 동일한 종 기원의 것이어야 한다. 천연의 면역 조절인자, 예를 들면, 사이토킨 및 케모카인은 종종 포유동물에서 높은 전신 독성과 비교적 짧은 반감기를 나타낸다. 당해 분야의 문헌에는 산화에 대한 안정성을 증가시키고, 생체내 반감기를 증가시키며, 독성을 저하시키고, 재조합 기술에 의해 제조되는 경우에 재폴딩을 증진시키기 위하여 면역 조절인자를 변형시키는 방법에 대해 광범위하게 제시되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,229,109호(Grimm et al)에는 고 친화성 IL-2 수용체(IL-2R)의 p55 α아단위에 대한 결합을 결여시킴으로써 상기 수용체(IL-2R)에 대한 친화성을 저하시킨 IL-2의 저 독성 동족체가 기재되어 있다. 이러한 동족체는 1차적으로, IL-2 중의 33번 내지 46번 위치의 아미노산에 대한 코돈을 돌연변이시킴으로써 제조한다(예를 들면, Arg38Ala 및 Phe42Lys 또는 Phe42Ala). Asp20Lys 돌연변이체는 p55에 대한 결합에 영향을 미치지 않으면서도 IL-2 수용체의 p75/β-쇄에 대한 친화도가 100 내지 500배 감소된 것이다[참조: Collins et al 1988]. 기타 돌연변이, 예를 들면, Asp20Ser은 덜 심각하다[참조: Berndt et al 1994]. 쥐의 IL-2에 대한 연구 결과는 사람 IL-2의 Asp84 및 Asn88이 또한 p75 결합에 연관이 있다는 것을 지시해준다[참조: Zurawski et al 1993]. 이는 사람 IL-2와 이의 수용체 간의 결합을 모델링함으로써 뒷받침된다[참조: Bamborough et al 1994]. 이들 돌연변이물의 예상되는 친화도 감소 순위는 다음과 같다: Asp20>Asn88>Asp84.
Arg38 및 Phe42에서의 돌연변이와 88번 및 20번 위치에서의 돌연변이를 조합하게 되면, IL-2R에 대한 친화도는 훨씬 더 낮을 것이다. 또 다른 강력하고 우선일에 바람직한 IL-2 돌연변이는 보다 낮은 세포 내부이행(internalization) 속도를 나타내고 이의 면역 조절 효과 기간이 연장된 IL-2 동족체를 제공해주는 Thr51Pro이다[참조: Chang et al 1996].
아미노산 위치에 번호를 매기는 것은 문헌[Taniguchi et al 1983]에 따른 것이다.
간행물[Grimm et al; Collins et al 1988; Berndt et al 1994; Zurawski et al 1993; Bamborough et al 1994; Chang et al 1996; and Taniguchi et al 1983]이 본원에 참조문헌으로 삽입되어 있다.
상기 정의된 바와 같은 접합체에 그들의 정상적인 수용체에 대한 친화도가 저하된 사이토킨 및 케모카인 동족체를 사용하는 것은 예비선택된 표적 세포에 대한 이들의 표적화를 증강시킬 것이다. 이들 각각의 세포 수용체에 대한 결합시 세포 내부이행 속도를 저하시키도록 돌연변이되어 화학식 Ⅰ에 따르는 접합체에 혼입된 사이토킨 및 케모카인이 천연 형태의 면역 조절인자를 지닌 상응하는 접합체와 비교해서 연장된 슈퍼항원 활성을 지닐 것으로 추정된다.
따라서, 면역 조절인자(IM)란 용어는 상응하는 천연 형태의 면역 조절인자의 효과를 증진시키거나 길항시킬 수 있는 어떠한 변형된 형태, 예를 들면, 돌연변이된 형태도 포괄한다.
B. 화학식 Ⅰ에서의 슈퍼항원 부분 SAG
화학식 Ⅰ에서의 Sag는 상기 자유 슈퍼항원에 대해 정의된 바와 같은 슈퍼항원을 나타내는데, 즉 예를 들면, 돌연변이에 의해, 가능하게는
a. 상응하는 야생형 슈퍼항원과 비교해서 MHC 부류 II 항원에 대한 결합 능력이 저하되도록 변형되고[예를 들면, Abrahmsen et al(WO 9601650) 참조];
b. 상응하는 야생형 슈퍼항원과 비교해서 사람 혈청에서의 혈청 반응성이 저하되도록 변형되며[예를 들면, Abrahmsen et al(WO 9601650) and Antonsson et al(WO 9736932) and Antonsson et al 1997 참조];
c. 상응하는 야생형 슈퍼항원과 비교해서 사람에서의 면역원성이 저하되도록 변형되고[예를 들면, Antonsson et al(WO 9736932) and Antonsson et al 1997 참조];
d. 하나의 제1 야생형 슈퍼항원에서의 하나의 영역이 제2의 유사한 슈퍼항원에서의 상응하는 영역으로 대체된 둘 이상의 유사한 야생형 슈퍼항원 간의 키메라(여기서 문제의 영역은, 예를 들면, SEE/SEA 및 SEA/SEE 키메라에 대해 정의된 바와 같이 TCRVβ에 대한 결합을 결정하는 영역일 수 있다)가 되도록 변형된[예를 들면, Antonsson et al WO 9736932; Antonsson et al 1997; and Lamphaer et al 1996 참조] 야생형 슈퍼항원을 나타낸다.
적절한 것으로 밝혀질 수 있는 기타 변형/돌연변이에는 예를 들면, 진핵 세포에서 생성될 때 바람직하지 못한 글리코실화를 피하도록 한 변형/돌연변이가 포함된다.
우선권에서 SEA/SEE-유사 슈퍼항원에 대한 전형적인 돌연변이(Antonsson et al, 1997 및 Antonsson et al WO 9736932에 의해 사용된 바와 같이 번호 매겨짐)는 다음과 같다:
a. 저하된 MHC 부류 II 결합: Asp227Ala(=SEAm9), Phe47Ala 및/또는 Asp70Arg. 돌연변이체 Phe47Ala/Asp227Ala = SEAm23.
b. 및 d. 상응하는 접합된 슈퍼항원의 SADCC 능력을 보유하면서 사람에게서 혈청 반응성 저하를 목표로 하고 있는 SEA와 SEE 간의 키메라 : 다음 치환체 Gly20Arg, Thr21Asn, Gly24Ser, Lys27Arg를 수반하는 SEE.
실험에 사용된 돌연변이는 SEA(Asp227Ala) = SEAm9, SEA(Phe47Ala/Asp227Ala) = SEAm23 및 SEA(Phe47Ala/Asn102Q/Asn149Asp/Thr218Val/Asp227Ala) = SEAm57이다.
우선권 출원에서 바람직한 슈퍼항원은
1. 2개의 MHC 부류 II 결합 부위를 나타내는 슈퍼항원(Sag)(예를 들면, 스타필로코쿠스성 장독소 A 및 E),
2. 돌연변이되지 않은 형태에서 MHC 부류 II에 대한 최적의 결합을 위해 Zn 이온을 필요로 하는 슈퍼항원(Sag)(예를 들면, SEA, SEE 및 SEH),
3. 스타필로코쿠스성 장독소 중에서 선택된다.
본 발명에 따르는 접합체 내로 혼입되는 Sag 분자는 작용성 슈퍼항원일 필요는 없으며, 주요 이슈는 최종 접합체가 앞서 언급된 바와 같은 SADCC 및 SDCC 중의 어느 하나 또는 둘 다를 발휘하느냐는 것이다.
C. 화학식 Ⅰ에서 표적화 잔기 T
T는 원칙적으로, 세포 표면 구조물, 바람직하게는 질병 특이적 구조물에 결합할 수 있는 어떠한 구조물일 수 있다. T의 지시 대상이 되는 구조물은 통상적으로, (a) Sag가 결합되는 다형성 TCR 쇄 에피토프와 상이하고 (b) Sag가 결합되는 MHC 부류 II 에피토프와도 상이하다. 이러한 표적-추적 잔기는 인터루킨(예: 인터루킨-2), 호르몬, 항체(항체의 항원 결합 단편을 포함함), 성장 인자 등 중에서 선택될 수 있다[참조: Woodworth 1993, 본원에 참조문헌으로 삽입됨].
따라서, 표적화 잔기는 1, 2, 3 또는 4개의 폴리펩티드 쇄를 함유하는 단백질일 수 있다.
우선일에, T가 항체[완전한 길이의 항체, Fab, F(ab)2, Fv, ScFv(단일쇄 항체), 다중 단일쇄 항체(ScFv)n및 기타 모든 항원 결합성 항체 단편; 이러한 항체 형태의 작용적으로 활성인 절단형태 모두를 포함함]인 것이 바람직하다. 기타 변이체는 단일 특이적 및 이중 특이적이다. 상기 항체는 원칙적으로, 질병 연관된/특이적 세포 표면 구조물, 예를 들면, 앞서 제시된 모든 암 형태에 연결된 구조물에 대해 지시될 수 있으며, 특히 항체 활성 단편(예: Fab)이 강조된다. 전형적으로, 상기 항체는 결장 및/또는 췌장 특이적 에피토프, 예를 들면, 소위 C242 에피토프[참조: Lindholm et al WO 9301303], 폐암 특이적 에피토프, 예를 들면, 5T4 항체에 대한 에피토프[참조: Stern et al WO 8907947], 임파종 특이적 에피토프, 예를 들면, CD19, 흑색종 특이적 에피토프, 예를 들면, HMW-MAA 등에 대해 지시될 수 있다.
용어 "항체"는 모노클로날 뿐만 아니라 폴리클로날 변이체를 포괄하며, 모노클로날 제제가 바람직하다.
표적화 잔기가 Fab 단편인 경우에는, Fab 중쇄와 경쇄를 통상적으로 함께 연결하는 시스테인 잔기가 디설파이드 형성을 허용하지 않는 아미노산, 예를 들면, 세린으로 대체되었다[참조: Antonsson et al WO 9736932].
이는 T가 특정 질환의 진행을 조절하거나 억제시키는 다소 건강한 세포 상의 독특한 구조물에 대해 지시될 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
D. 링커 B
링커 B는 선행 문헌[Dohlsten et al WO 9201470; Abrahmsen et al WO 9601650; and Antonsson et al WO 9736932]에서 언급된 바와 같이 선택될 수 있는데, 즉 B는 바람직하게는 친수성이어야 하고 아미드, 티오에테르, 디설파이드 등 중에서 선택된 하나 이상의 구조를 나타내야 한다. 가장 뛰어난 링커는 재조합 기술에 의해 수득된 것인데, 즉 접합이 게놈 수준에서 일어나 올리고펩티드 링커가 생성된다. 전형적으로, 올리고펩티드 링커는 1 내지 30개, 예를 들면, 1 내지 20개의 아미노산 잔기를 함유하며, 이들은 링커 전부가 친수성이 되도록 선택되는 것이 바람직하다. 따라서, 이러한 링커 잔기는 바람직하게는, 친수성 아미노산 잔기, 예를 들면, Gln, Ser, Gly, Glu, Pro, His 및 Arg 중에서 선택된다. 전형적인 올리고펩티드 링커는 트리펩티드 GlyGlyPro를 포함하거나, 또는 가능하게는 아미노 말단에서 gly-pro로 변형된 소위 Q 링커[참조: Wootton et al 1989, 이는 본원에 참조문헌으로 삽입됨]를 포함한다.
E. T, SAG 및 IM에 대한 부착점
화학적 접합체는 전형적으로 연결 위치가 상이한 접합체 분자의 혼합물을 함유할 것이다. 이러한 접합체 물질은 이종 접합체 뿐만 아니라 동종 접합체를 함유할 것이다.
재조합 접합체(융합 단백질)의 경우에는, 수득된 접합체 물질이 연결 위치 측면에서 균일할 것이다. 각각의 개별적인 아단위(T, Sag, IM)의 경우, 아미노 말단을 바람직하게는 삽입된 올리고펩티드 브릿지를 통하여 또 다른 아단위의 카복시 말단에 융합시키거나 그 반대도 가능하다. 접합체가 각각의 T, IM, Sag를 함유하는 경우의 조합은 T-IM-Sag, IM-T-Sag, Sag-IM-T, Sag-T-IM, T-Sag-IM, IM-Sag-T일 것이다(B의 링커 구조 발생은 제시되지 않음). 이러한 아단위의 하나 이상이 둘 이상의 폴리펩티드 쇄를 함유하는 경우에는, 조합의 수가 증가하게 된다. T가 항체 Fab 단편인 경우에는, 조합의 수가 다음과 같을 것이다(올리고펩티드 링커 B는 제시되지 않았음):
1. Sag-Fab(경쇄)-IM 2. Fab(경쇄)
Fab(중쇄) Sag-Fab(중쇄)-IM
3. Sag-Fab(경쇄) 4. Fab(경쇄)-IM
Fab(중쇄)-IM Sag-Fab(중쇄)
5. Sag-Fab(경쇄) 6. IM-Fab(경쇄)
IM-Fab(중쇄) Sag-Fab(중쇄)
7. Fab(경쇄)-Sag 8. Fab(경쇄)-IM
Fab(중쇄)-IM Fab(중쇄)-Sag
추가의 변이체에서는, 면역 조절인자와 슈퍼항원을 항체 쇄 중의 어느 말단에서든 차례 차례로 융합시킬 수 있다.
우선일에는, 재조합 접합체가 바람직하며, 가장 바람직한 것은 Fab 단편이 표적화 잔기로서 이용되고 자유 슈퍼항원의 아미노 말단을 항체 중쇄(Cμ1) 또는 경쇄의 첫 번째 불변 영역에 연결시키고 면역 조절인자를 나머지 카복시 말단에 연결시키는 것이다(화학식 Ⅰ 내지 Ⅳ에 부합됨).
최적의 생성과 기능을 위해서, 상기 융합 단백질은, 슈퍼항원을 3 내지 11개 잔기의 가요성의 친수성 아미노산 링커를 통하여 항체 Fab 단편의 Cμ1 영역에 C-말단적으로 융합시킨 2쇄 생성물로서 재조합적으로 발현시킨다. 이러한 링커는 서열 Gly-Gly-Pro 또는 Pro-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro(서열 번호 19) 또는 서열 번호 19에 근거한 4 내지 9개 잔기를 가질 수 있으며, 서열 번호 19가 바람직하다. 면역 조절인자 잔기는 친수성이고 중성이거나 양성적으로 하전된 10 내지 20개 잔기의 링커(링커 Q)를 통하여 경쇄에 C-말단적으로 융합된다. 바람직하게는, 링커 Q는 다음 서열을 가질 수 있다: Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Asn-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg(서열 번호 23), Gly-Pro-Arg-Gln-Ser-Asn-Glu-Thr-Pro-Gly-Ser-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg(서열 번호 20), Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Thr-Thr-Arg(서열 번호 21) 또는 Gly-Pro-Thr-Glu-Ala-Asp-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Glu-Glu-Glu-Thr(서열 번호 22), 이중에서 서열 번호 20 및 21이 가장 바람직하다(보다 상세한 설명은 실시예 2 참조).
아미노 말단에서의 유사한 조합 또는 VH 및 VL 영역의 아미노 및 카복시 말단에서의 부착 조합은 본 단계에서 활성를 나타내긴 하지만 덜 효과적인 접합체를 생성시키는 것으로 여겨진다.
F. 화학식 Ⅰ에 부합되지는 않지만 본 발명의 방법에서 상기 조합 a 내지 e에 따라서 사용된 활성 물질
자유 슈퍼항원(Sag): 상기 "정의"편을 참조하기 바람. 전형적인 Sag는 상기 "배경" 및 "B. 화학식 Ⅰ에서 Sag의 슈퍼항원 부분"이란 제목하의 기재 내용에 제시되어 있다.
접합되지 않은 면역 조절인자: 상기 "정의"편을 참조하기 바람. 원칙적으로, "A. 화학식 Ⅰ에서 면역 조절인자 IM"이란 제목하에 제시된 바와 동일한 면역 조절인자가 사용될 수 있다. 사이토킨 및 케모카인이 바람직하고, 특히 IL-2 및 IL-2 유사 사이토킨이 바람직하다.
표적화된 면역 조절인자(T,IM-접합체): 이들 접합체는 다음 화학식 Ⅲ에 부합된다:
(T')x(IM')z
상기식에서, T' 및 IM'는 유기 링커 B'에 의해 함께 연결된다. T', IM' 및 B'는 T, IM 및 B와 동일한 그룹의 화합물/구조물 중에서 선택된다. x 및 z는 화학식 Ⅰ에서와 동일한 방식으로 정의되며(y=0), T' 및 접합체 분자당 1개 또는 2개의 IM'이 바람직하다. T'와 IM' 간의 부착점은 화학식 Ⅰ에 대해 정의된 바와 같다["E. ... 부착점"이란 제목하의 기재 내용 참조; 여기서는 화학식 1 내지 8과 이에 대한 언급이 Sag가 생략되는 것을 제외하고는 또한 T,IM 접합체에 대해서도 적용 가능하다]. 화학식 Ⅲ의 접합체는 공지된 기술, 즉 통상적인 화학적 연결 기술 또는 재조합 기술(융합 단백질)에 따라서 제조할 수 있으며, 후자 기술이 바람직하다[참조: Fell et al EP 439095; Rosenblum et al EP 396387]. 특히 중요한 T,IM-접합체는 상기 정의된 바와 같이 친화도를 감소시키고/시키거나 내부이행 속도를 저하시키도록 변형시킨, 예를 들면, 돌연변이시킨 IM'-잔기를 포함한다.
표적화된 슈퍼항원(T,Sag-접합체). 이들 접합체는 다음 화학식 Ⅳ에 해당한다:
(T")x(Sag")y
상기식에서, T" 및 Sag"는 유기 링커 B"에 의해 함께 연결된다. T", Sag" 및 B"는 T, IM 및 B와 동일한 그룹의 화합물/구조물 중에서 선택된다. x 및 y는 화학식 Ⅰ에서와 동일한 방식으로 정의되며(z=0), T" 및 접합체 분자당 1개 또는 2개의 Sag"이 바람직하다. T"와 Sag" 간의 부착점은 화학식 Ⅰ에 대해 정의된 바와 같다["E. ... 부착점"이란 제목하의 기재 내용 참조; 여기서는 화학식 1 내지 8과 이에 대한 언급이 상기 화학식으로부터 IM이 생략되는 것을 제외하고는 또한 T,Sag-접합체에 대해서도 적용 가능하다]. 화학식 Ⅱ의 접합체는 공지된 기술, 즉 통상적인 화학적 연결 기술 또는 재조합 기술(융합 단백질)에 따라서 제조할 수 있으며, 전자 기술이 바람직하다[참조: Dohlsten et al WO 9201470; Abrahmsen et al WO 9601650; Antonsson et al WO 9736932].
본 발명의 제3 주요 양태: 변형된 면역 조절인자를 함유하는 접합체
이들 신규한 접합체는 다음 화학식 Ⅴ에 해당한다:
(T'")x(Sag'")y(IM'")z
상기식에서, T'" 및 Sag'"는 화학식 Ⅰ에 대한 T 및 Sag와 동일한 화합물 중에서 선택된다. IM'"은 (상응하는 천연 형태와 비교해서) 이의 세포막 고정된 수용체에 대한 친화도가 감소되고/되거나 이의 수용체에 대한 결합을 통한 내부이행 속도가 저하되도록 변형시킨, 예를 들면, 돌연변이에 의해 변형시킨 면역 조절인자이다. IM'"은 바람직하게는 사이토킨 또는 케모카인이다[추가의 내용은 "A. 화학식 Ⅰ에서 면역 조절인자 IM"이란 제목하의 기재 내용을 참조]. 본 발명의 당해 양태에 중요한 한 가지 면역 조절인자는 변형된 IL-2이다. x, y 및 z는 화학식 Ⅰ에서와 동일한 방식으로 정의된다.
화학식 Ⅴ에 따르는 접합체의 제1 아양태에서는, T'", Sag'" 및 IM'"이 항상 존재하는데(모든 x, y 및 z>0이다), 즉 T,Sag,IM-접합체이다. x, y 및 z는 전형적으로 정수 1 내지 3이며, 1 내지 2가 바람직하다. x, y 및 z 간의 전형적인 관계는 다음과 같다: x=y=z; x=y=0.5z; x=0.5y=0.5z; 및 x=0.5y=z.
화학식 Ⅴ에 따르는 접합체의 제2 아양태에서는, 슈퍼항원 잔기가 존재하지 않으며(즉, T,IM-접합체, y=0), x 및 z가 전형적으로 1 내지 3의 정수이다. x 및 z 간의 바람직한 관계는 다음과 같다: x=z; x=0.5z, 0.5x=z; x=1/3z 및 1/3x=z.
화학식 Ⅴ에 따르는 접합체의 양 아양태에서는, 정수 또는 이들의 관계에 대해 제시된 범위가 주로, 표적화 잔기가 1, 2, 3 또는 4개의 폴리펩티드 쇄를 함유하는 단백질일 수 있고 각 접합체 분자 내에 하나의 T가 존재하는 융합 단백질을 지칭한다. 화학식 Ⅴ의 융합 단백질에서의 부착점은 화학식 Ⅰ에 부합되는 상응하는 융합 단백질에 대해서와 동일하다["E. ... 부착점"이란 제목하의 기재 내용 참조; 여기서는 화학식 1 내지 8과 이에 대한 언급이 제2 아양태의 경우에 Sag가 생략되는 것을 제외하고는 또한 T,IM-접합체에 대해서도 적용 가능하다].
상기 정의된 접합체의 제조
접합체의 제조는 원칙상 다음 2가지 주요 경로에 따라서 수행될 수 있다:
1. 개별적인 아단위 T, Sag 및 IM을 함께 화학적으로 연결시킴. 각각의 개별적인 아단위 또는 이들의 조합은 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다.
2. 상기 제시된 화학식 중의 어느 것에서도 정의된 바와 같은 접합체를 직접적으로 제공하는 재조합 기술.
실제의 방법은 당해 분야의 숙련인에게 널리 인식되어 있으며 수 많은 변형 법을 포함한다.
화학적 연결법은 전형적으로, 본래 슈퍼항원, 단백질성 면역 조절인자 및 단백질성 표적화 잔기의 여러 위치에 존재하는 작용성 그룹(예를 들면, 1급 아미노 그룹, 카복시 그룹, 머캅토, 탄수화물 그룹)을 이용한다. 이러한 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
슈퍼항원과 면역 조절인자 간의 본 발명에 따르는 접합체를 대규모로 재조합 생성시키기 위한 주요 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli)이다. 이러한 숙주 세포는 원칙적으로 다음 2가지 경로로 제공된다: 세포내 생성 및 분비. 후자가 바람직한데, 이는 외질 및 세포배양 배지로부터 정확하게 폴딩된 단백질의 정제를 제공하기 때문이다. 상기 사실은 기타 숙주 세포, 예를 들면, 진핵성 세포(예: 효모 또는 포유동물 세포)에서도 또한 활성 접합체를 제조하는 것이 가능하다는 것을 배제하지는 않는다. 지금까지의 예비 결과는 진핵성 세포, 예를 들면, 포유동물 세포가 CD28과 상호작용하는 면역 조절인자, 예를 들면, B7 및 이의 동족체를 혼입시키는데 바람직할 수 있다는 것을 지시하고 있다.
본 발명의 제4 양태: 본 발명의 신규한 접합체를 암호화하는 유전자 작제물
본 발명의 제4 양태는 상기 정의된 바와 같은 슈퍼항원 및 면역 조절인자(IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, RANTES, CD80의 엑토픽 영역, CD86의 엑토픽 영역, 4-BB1L 및 Flt3L, 및 상기 정의된 바와 같은 이들의 동족체가 바람직하다)를 암호화하는 재조합 핵산 분자, 바람직하게는 DNA, 예를 들면, cDAN, 또는 RNA이다. 이러한 본 발명의 양태에서는, 상기 핵산이 전형적으로, 면역 조절인자와 슈퍼항원이 발현되는 숙주 세포와 상용성인, 조절성 컨트롤 서열, 예를 들면, 해독 조절 서열, 복제 기점, 면역 조절인자와 슈퍼항원 중의 어느 하나 또는 둘 다에 대한 분비성 시그날 서열 등을 함유해야 한다. 슈퍼항원과 면역 조절인자를 암호화하는 부분 서열 간의 영역은 비스시스트론성 유전자 작제물에서와 같은 리보좀 유입 부위를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 후자는 당해 접합체 내에 포함된 각 폴리펩티드 쇄를 별도로 발현시킬 것이다. IM, Sag, 표적화 잔기 접합체 및 적절한 시그날 서열을 함유하는 다중쇄 접합체 조합물의 경우에는, 비스시스트론성 작제물이 상기 쇄들 중의 하나에 결합된 IM을 갖는 완전한 활성의 접합체로의 폴딩 및 어셈블리를 촉진시킬 것이다. 이는 표적화 잔기가 2쇄 항체 분자이고 슈퍼항원(Sag) 및 면역 조절인자 중의 하나 이상이 항체 쇄의 말단에 융합되는 경우에 중요하다[상기 참조].
약제학적 조성물, 투여량 및 투여 경로
본 발명의 제4 양태는 슈퍼항원(Sag), 표적화 잔기(T) 및 면역 조절인자(IM)의 본 발명의 조합물을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 본 발명의 양태의 특징적인 양상은 슈퍼항원과 면역 조절인자 중의 하나 이상이 상기 기재된 바와 같이 불활성화시킬 세포에 대한 표적화를 허용하는 접합체의 형태라는 것이다.
본원에서 고려된 조성물은 당해 분야에 공지되어 있지만, 단 본원에서는 이들 조성물이 신규의 접합체 조합물을 함유하고 있다. 특정한 조성물에서, 상기 조합물은
a. 슈퍼항원(Sag), 표적 세포에 대한 표적화 잔기(T) 및 면역 조절인자(IM)를 포함하는 삼중 접합체(T,IM,Sag-접합체);
b. 2개의 이중 접합체 - 표적화 항체(T)와 슈퍼항원 간의 하나의 접합체 및 표적화 항체(T')와 면역 조절인자 간의 하나의 접합체(즉, T,Sag-접합체 + T',IM-접합체). T 및 T'는 에피토프 특이성에 관하여 동일하거나 상이할 수 있다;
c. 슈퍼항원(Sag)과 표적화 잔기(T) 간의 하나의 이중 접합체, 및 자유 형태의 면역 조절인자(T,Sag-접합체 + IM);
d. 면역 조절인자(IM)와 표적화 잔기(T) 간의 하나의 이중 접합체, 및 자유 형태의 슈퍼항원(Sag)(T,IM-접합체 + Sag); 또는
e. 이중 접합체 형태의 슈퍼항원(Sag) 및 면역 조절인자(IM)(Sag,IM-접합체)를 포함한다.
상기 내용은 본 발명에 따르는 방법의 기재 내용을 추가로 참조할 수 있다. 당해 조성물이 2개의 활성 성분을 함유하는 경우에는(상기 b 내지 d), 투여시까지 이들 성분을 별도로 관리할 수 있다.
이들 조성물은 동결건조된 미립형 물질, 멸균성 또는 무균적으로 제조된 용액, 정제, 앰풀 등의 형태일 수 있다. 물(바람직하게는, 예를 들면, PBS에 의해 생리학적으로 허용되는 pH치로 완충됨) 또는 기타 불활성 고체 또는 액체 물질 등의 비히클이 존재할 수도 있다. 일반적으로, 조성물이란 용어는 필요에 따라 적합한 첨가제 및 보조제와 함께 하나 이상의 수용성 또는 수-불용성 수성 또는 비-수성 비히클과 혼합되거나, 이에 용해되거나, 이에 결합되거나, 또는 이와 조합된 결합되지 않은 활성 성분과 가능하게는 조합된 당해 접합체에 의해 제조된 것이다. 상기 비히클 및 조건들이 상기 a 내지 e에서 정의된 바와 같은 활성 성분의 활성도에 불리한 영향을 미치지 않는 것이 절대적으로 필요하다.
통상적으로, 본 발명에서 사용될 슈퍼항원(SAG)은 판매될 것이며 각각, 본원에서 제시된 결과를 기준으로 하여 1pg 내지 50mg의 범위 내일 것으로 여겨지는 SAG의 유효량을 함유하는 예비조제된 투여량으로 투여될 것이다. 정확한 투여량은 환자의 체중, 연령 및 사용된 SAG에 특이적인 항체의 예비역가, 투여 경로, 질환 유형, 표적-추적 잔기, 슈퍼항원, 연결부(-B-), 면역 조절인자 등에 따라서 각 경우마다 다를 것이다.
본 발명에 따르는 방법에 사용된 조합물에 대한 용량을 결정하는데 있어서 고려해야 할 중요한 요인은 슈퍼항원과 면역 조절인자가 최적의 용량 범위를 발휘하는 것이다. 너무 낮은 용량은 최적의 효과를 못 내거나 수준 이하의 효과를 나타낼 것이며 너무 높은 용량은 치명적일 수 있는 독성과 같은 허용되지 못하는 부작용을 가져올 것이다. 따라서, 상기 제시된 광범위한 범위는 본 발명에 따르는 방법의 모든 변형법에 가능한 모든 범위를 포괄하고자 한 것이란 사실을 강조하고 싶다. 따라서, 본 발명의 방법에 따르는 각각의 구체적인 조합물은 0.1pg 내지 50mg 범위 내에서 용량 아범위를 지닌다. 이러한 용량은 추가의 진행 및 결과가 이러한 범위를 벗어난 용량 수준을 야기할 수 있다는 것을 배제하지 않는다.
투여 경로는 당해 분야에서 통상적으로 고려되는 것이며, 즉 표적 사멸 유효량 또는 치료학적 활성 양의 본 발명에 따르는 슈퍼항원-면역 조절인자 조합물을 표적 세포와 접촉시킨다. 상기 구체화된 조치에 대해서, 이는 대개 사람과 같은 포유동물에게 비경구 투여, 예를 들면, 주사 또는 주입 투여(피하, 정맥내, 관절내, 근육내, 복강내)하는 것을 의미한다. 본 발명의 접합체 조합물은 국소적으로 또는 전신 투여할 수 있다.
"표적 사멸 유효량"이란 용어는 표적 세포를 분쇄하기 위해 T 세포를 활성화시키고 지시하는데 유효한 양을 지칭한다.
우선일에 바람직한 투여 경로는 문헌[Dohlsten et al WO 9201470; Abrahmsen et al WO 9601650 and Antonsson et al PCT/97/00537]에 따르는 슈퍼항원 접합체에 대해 고려된 것과 동일하다. 이는 해열제(파라세타몰)와 함께 1일 1 내지 5시간 정맥내 주사(바람직하게는 4시간)하는 것을 의미한다. 이러한 투여는 몇일, 예를 들면, 5 내지 8일 동안 반복해야 하는데, 당해 접합체에 대해 지시된 항체의 부스터 위험에 주의해야 한다. 최적으로는, 1일 이상 동안 치료한 다음 1일 이상 동안 휴식기를 갖는 치료 주기, 예를 들면, 5일 동안 치료하고 2일 동안 휴식기를 갖는 치료 주기를 수회 반복한다.
본 발명의 조성물은 주 치료법으로서 투여하거나, 또는 수술과 연계하거나 약물 치료와 연계하여 보조 치료법으로서 바람직한 모드로 투여할 수 있다.
본 발명은 작용성 슈퍼항원(superantigen)에 의해 활성화된 T 세포에 의해 유발된 표적 세포의 불활성화/세포용해에 관한 것이다. 세포용해는 치료 요법과 시험관내 검정에 적용될 수 있다.
정의
슈퍼항원: 맨처음에 제기된 정의에 따르면(약 1988-1993), 슈퍼항원은 세포내 프로세싱이 선행되지 않고서도 MHC 부류 II 항원에 결합될 수 있고 T 세포 수용체(TCR)의 Vβ-쇄 가변 영역(Vβ)에 대한 결합에 의해 T 세포를 활성화시키는 세균성 또는 바이러스성 단백질이다. 이러한 결합으로 인해, 비교적 상당 부분/아셋트의 T 세포가 Vβ 계열 제한된 활성화를 나타내고 MHC 부류 II 발현 세포가 용해된다(슈퍼항원 의존성 세포-매개된 세포용해=SDCC). 정상적으로, 이와 같이 슈퍼항원 활성화된 T 세포의 아셋트는 개개인의 T 세포 총 량의 약 1 내지 30%를 차지하고 있다.
상기 정의에 따라 널리 공지된 야생형 슈퍼항원은 스타필로코쿠스성 장독소(SEA, SEB, SEC1, SEC2, SED, SEE 및 SEH)이다. 추가의 예는 독성 쇽 증후군 독소 1(TSST-1; 이 또한 스타필로코쿠스 기원의 것이다), 엑스폴리아팅 독소(Exfoliating Toxins; EXft), 스트렙토코쿠스성(Streptococcal) 발열성 엑소톡신 A, B 및 C(SPE A, B 및 C), 마우스 유방 종양 바이러스 단백질(MMTV), 스트렙토코쿠스성 M 단백질, 클로스트리듐속 퍼프린겐스 장독소(Clostridial Perfringens Enterotoxin; CPET), 미코플라즈마 관절염 슈퍼항원 등이다. 슈퍼항원 및 이들의 성질에 관한 고찰은 문헌[Kotzin et al 1993]을 참조할 수 있다.
야생형 및 키메라형 슈퍼항원은 또한, MHC 부류 II 결합 및/또는 TCRVβ결합 저하 양상을 나타내거나 이러한 결합이 전혀 나타내지 않도록 돌연변이되었다[참조; Kappler et al WO 9314264; Kappler et al 1993; Blanco et al.; Abrahmsen et al., WO9601650; Antonsson et al., WO 9736932; Antonsson et al 1997]. 이러한 유형의 슈퍼항원은 독성이 덜하다. 이들에게 MHC 부류 II 또는 TCRVβ와의 결합 능력이 완전히 결여된 경우에는, 이들이 자신의 T 세포 활성화 능력을 상실하기 때문에 더 이상 작용성 슈퍼항원이 아니게 된다.
구조적으로 유사한 야생형 슈퍼항원을 돌연변이시킴으로써, 키메라형 작용적으로 활성인 슈퍼항원(하이브리드 슈퍼항원)을 작제할 수 있었다[참조: Lamphaer et al., 1996 and Antonsson et al WO 9736932].
야생형 슈퍼항원을 세포 표면 구조와 결합될 수 있는 표적-추적 잔기와 접합시키는 경우에는, MHC 부류 II와 독립적인 방식으로 활성화 및 후속 세포 용해가 일어날 수 있는 것으로 밝혀졌다[참조: Dohlsten et al WO 9201470]. 이러한 신규의 이펙터(effector) 기전은 슈퍼항원 항체 의존성 세포-매개된 세포 용해(=SADCC)로 명명되었다. 이에는 항체 이외의 표적화 잔기에 대한 유사한 기전이 포함된다[참조: Abrahmsen et al., WO 9601650; Antonsson et al WO 9736932].
따라서, 오늘날 슈퍼항원에 대한 개념은 세포내 프로세싱이 선행되지 않고도 세포 표면 구조물(표적 구조물) 및 하나 이상의 다형성 TCR 쇄, 특히 Vβ쇄에 결합될 수 있음으로써, 이러한 결합과 관련된 특이적 TCR 쇄를 발현하는 T 세포의 아셋트를 활성화시키는 화합물(아마도, 폴리펩티드 구조의 화합물) 모두를 포괄하고 있다. 이때, 상기 T 세포는 세포독성이 되어 표면 구조물(표적 구조물, 표적 세포)을 수반하는 세포에 대해 이들의 세포 독성을 지시한다. 본원에서 사용된 바와 같은 슈퍼항원(SAG)의 정의는 달리 언급되지 않는다면, 표적화 잔기와 SADCC에 대해 위에 논의된 바와 같은 자유 슈퍼항원 간의 접합체를 포괄할 것이다.
달리 언급되지 않는 한, 슈퍼항원이란 용어는 작용성 슈퍼항원만을 고려한 것이다.
자유 슈퍼항원(Sag)은 표적화 잔기나 면역 조절인자에 접합되지 않은 야생형, 가능하게는 돌연변이되었거나 달리 변형된 슈퍼항원이다. 자유 슈퍼항원의 MHC 부류 II 결합 능력은 본래부터 지니고 있는 표적화 성질이다. 자유 슈퍼항원에게는 표적화 잔기가 접합되어 있지 않기 때문에, 이들은 단지 SDCC만을 발휘할 것이다.
접합된 슈퍼항원은 자유 슈퍼항원과 표적화 잔기 또는 면역 조절인자 간의 접합체이다. 접합된 슈퍼항원은 SDCC와 SADCC 중의 어느 하나 또는 둘 다를 발휘한다.
면역 조절인자(IM)는 면역 시스템을 조절할 수 있는 화합물이다. 본 발명의 맥락에서, 면역 조절인자란 용어가 사용되는 경우에는 슈퍼항원이 별개로 처리되며 포함되지 않는다. 면역 조절인자는 종종 상응하는 임파구 수용체에 대해서와 같이 고유의 표적화 능력을 지니고 있다. 달리 언급되지 않는 한, 면역 조절인자는 접합되지 않은 형태이다.
표적화 잔기(T)는 세포 표면 구조물 및/또는 조직 구조물에 결합될 수 있는 잔기이다.
접합체는 서로 공유적으로 연결되는 둘 이상의 잔기 Sag, IM, T 등으로 구성된다.
활성 성분의 가용성 형태란 혈청 및 혈장과 같은 체액에 가용성인 형태를 의미한다.
도 1은 CD80-C215Fab, CD80-C215Fab-SEAm57 또는 C215Fab-SEA로 염색시킨 다음, PE로 표지된 항-마우스 카파 쇄 mAb와 함께 배양된 CHO-CD28 세포의 FACS 분석을 나타낸다. 이러한 염색은 어떠한 세척없이 4℃에서 수행한다. 세로 좌표: 평균 채널.
도 2는 CD80-C215Fab, CD80-C215Fab-SEAm57 또는 C215Fab-SEA로 염색시킨 다음, PE로 표지된 항-마우스 카파 쇄 mAb와 함께 배양된 Colo205 세포의 FACS 분석을 나타낸다. 이러한 염색은 각 염색 단계 사이에 3회 세척하면서 4℃에서 수행한다. 세로 좌표: 평균 채널. 가로 좌표: 이펙터(E) 대 표적 세포(T) 비.
도 3은 증식을 나타낸다. 4일 동안 CD80-C215Fab의 양을 다양하게 하면서 T 세포를 Colo205 세포 및 4μM C242Fab-SEA와 함께 배양한 후, 혼입된3H-티미딘을 계수한다. CD80-C215Fab를 사용하지 않고 수득된 활성도는 20039cpm +/- 1750이다.
도 4는 IL-2 생성을 나타낸다. 4일 동안 CD80-C215Fab의 양을 다양하게 하면서 T 세포를 Colo205 세포 및 4μM C242Fab-SEA와 함께 배양한 후, 슈퍼항원을 수거하고 IL-2의 양을 결정한다. CD80-C215Fab를 사용하지 않고 수득된 IL-2의 양은 2849pg/ml이다.
도 5는 증식을 나타낸다. 4일 동안 CD80-C215Fab-SEAm57 또는 C215Fab-SEAm23의 양을 다양하게 하면서 T 세포를 Colo205 세포와 함께 배양한 후, 혼입된3H-티미딘을 계수한다.
도 6은 IL-2 생성을 나타낸다. 4일 동안 CD80-C215Fab-SEAm57 또는 C215Fab-SEAm23의 양을 다양하게 하면서 T 세포를 Colo205 세포와 함께 배양한 후, 상등액을 수거하고 IL-2의 양을 결정한다.
도 7은 표시된 단백질 및 방사선 조사되고 형질감염된 CHO 세포[SEA의 표시(presentation)를 위함]와 함께 7일 동안 배양된 사람 혈액 T 세포의 증식력을 나타낸다. 세로 좌표:3H-티미딘 혼입량(cpm).
도 8은 표적화된 SEA와 IL-2를 동시에 투여하게 되면 생체내에서 T 세포 활성화가 증진됨을 나타낸다. C215FabSEA(FS), C215Fab-Q-hIL2(FI), 상기 둘(FS+FI) 또는 C215FabSEA-Q-hIL2(FSI)의 조합물 1회 또는 3회 주사로 치료된 마우스로부터의 비장 세포의 SEA-피복된 MHC 부류 II+라지(Raji) 세포에 대한 세포독성(%로서 표시됨). 이펙터:표적 세포비는 30:1이고, 세포독성은 표준 4시간51Cr 방출 검정으로 측정한다.
도 9는 C215FabSEA(FS), C215Fab-Q-hIL2(FI), C215FabSEA + C215Fab-Q-hIL2(FS+FI) 또는 C215Fab-Q-hIL2(FSI)을 3회 주사(종양 접종 후 5일, 6일 및 7일째 주사)하여 C57B1/6 마우스에서의 B16-C215 종양의 5일의 치료를 나타낸다. 등몰량의 FabSEA와 Fab-Q-hIL2를 사용한다. 가로 좌표: 주사된 단백질의 양. 세로 좌표: 종양 감소율(%).
도 10은 C215Fab-SEA(FS), C215Fab-Q-IL2(FI) 또는 C215FabSEA-Q-IL2 치료를 수반한 후의 CD25+T 세포의 증가된 종양 침윤을 나타낸다. 확립된 B16-GA733 폐 종양을 수반하는 마우스의 폐를 침윤시키는 CD25-양성 세포를 면역조직화학법으로 평가한다. 세로 좌표: 염색 면적율(%). 가로 좌표: 1=PBS; 2=첫 번째 주사; 3=두 번째 주사; 4=세 번째 주사; 5=네 번째 주사.
도 11은 C215FabSEA-Q-hIL2(FSI)(37mg)을 1일 1회(1회 주사당 37mg) 4회까지 주사한 후의 인터페론의 유지 수준을 나타낸다. 마지막 주사한 지 4시간 후에 혈액을 수집하고, 표준물로서 재조합 쥐의 인터페론(Pharmingen)을 사용하여 ELISA 측정법에 의해 인터페론함량(세로 좌표)을 결정한다. 등몰량(30mg/주사)의 C215FabSEA(FS)를 사용하여 유사한 실험을 수행한다.
도 12는 PBS로 처리되거나 또는 C215FabSEAD227A-Q-hIL2(=FSm9-IL2)를 1회, 4회 또는 6회 주사로 처리된, 마우스로부터의 비장 세포의 SEA-피복된 MHC 부류 II+라지 세포에 대한 세포독성(세로 좌표에 %로서 표시됨)을 나타낸다. 세포독성은 표준 4시간51Cr 방출 검정으로 측정한다. PBS가 음성 대조군으로서 사용된다.
도 13은 C215FabSEAD227A(=FSm9) 또는 C215FabSEAD227A-Q-hIL2(=FSm9-IL2)를 8회 주사하는 치료를 수행한, C57 B1/6 마우스에서의 B16-C214 종양의 3일의 치료를 나타낸다. 치료는 8일간 연속해서 매일 수행된다. 21일째, 동물을 희생시키고, 폐 전이를 계수한다. 세로 좌표: 종양 감소율(%).
도 14는 C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A(=FSm9-IL2(F42A)), C215FabSEAD227A-Q-hIL2(=FSm9-IL2) 또는 C215FabSEAD227A(=FSm9-IL2)를 8회 주사하는 치료를 수행한, Vb3 TCR 형질전환된 마우스에서의 B16-C214 종양의 3일의 치료를 나타낸다. 치료는 8일간 연속해서 매일 수행된다. 21일째, 동물을 희생시키고, 폐 전이를 계수한다. 세로 좌표: 종양 감소율(%).
도 15는 C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A(F42A), C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42K(F42K) 또는 C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A/D20S(F42A/D20S)를 8회 주사하는 치료를 수행한, Vb3 TCR 형질전환된 마우스에서의 B16-C214 종양의 3일의 치료를 나타낸다. 치료는 8일간 연속해서 매일 수행된다. 21일째, 동물을 희생시키고, 폐 전이를 계수한다. 세로 좌표: 종양 감소율(%).
실시예 1
SAG 표적화된 FAB를 이용한 종양 치료법의 공자극에 사용하기 위한 CD80-C215FAB 융합 단백질의 생물학적 활성
요약: 사람 CD80의 세포외 영역을 함유하도록 CD80-C215Fab 및 CD80-C215Fab-SEAm57 융합 단백질을 작제하였다. 이러한 융합 단백질은 포유동물 세포에서 생성된 것이며, 이를 대상으로 하여 CHO 세포 형질감염체를 이용하여 CD28에 대한 결합과 Colo205 세포를 사용하여 C215 항원에 대한 결합을 시험한다. 양 융합 단백질은 CD28 및 C215 항원에 결합되며, 후자 결합은 C215Fab-SEA와 비교해서 100배 저하된 것이다. CD80이 L쇄의 N-말단부에 연결되기 때문에, CD80 잔기가 C215Fab 결합을 방해하는 것이 가능하다. 양 융합 단백질은 SAG 활성화된 사람 T 세포를 공동으로 자극하는데, 이는 가용성 CD80이 이의 생물학적 기능을 보유하고 있다는 것을 나타낸다.
물질 및 방법
재조합 DNA 기술 및 효소: 본질적으로 문헌[Sambrook et al. 1989]에 따라서, 플라스미드 DNA 제조 및 기타 작동을 수행한다. 이. 콜라이 HB101[참조: Boyer et al 1969]이 숙주 균주로서 사용된다. 제한 엔도뉴클레아제 및 DNA 폴리
플라스미드 작제
쥐의 항체 C215의 가변 영역을 함유하는 Fab 단편을 암호화하는 유전자를 선행 분야에서 기재된 바와 같이 어셈블리한다[참조: Dohlsten et al 1994]. 대체물 F47A 및 D227A를 생성시키는 스타필로코쿠스성 장독소 A(SEA) 유전자의 클로닝 및 돌연변이는 앞서 기재된 바와 같다[참조: Abrahmsen et al 1995]. 프라이머 LAKQ88-93(사용된 모든 올리고뉴클레오티드는 표 Ⅰ에서와 같다)를 사용하여 3가지 다른 돌연변이를 상기 SEA 유전자에 도입하여 SEA 돌연변이체 57을 수득한다. LAKQ5 및 LAKQ7을 RT-PCR에 사용하여 코작 박스 상단을 도입하고, 시그날 펩티드를 암호화하는 유전자 및 사람 비장 총 RNA로부터의 사람 CD80의 세포외 부분을 클로닝한다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 CD80의 유전자 뱅크 서열(기탁 번호 M27533)에 상응하는 것으로 밝혀졌다. 3'-말단에 상이한 클로닝 부위를 갖는 CD80의 두 변이체를 제조하는데: 별개의 PCR에서는 프라이머 LAKQ30 및 LAKQ108을 사용하여 BssHII 또는 MroI 부위를 각각 수득한다. Q-링커에 의해 카파 쇄 전에 융합된 CD80을 암호화하는 유전자 융합물을, 카파 유전자 바로 앞에 있는 DsaI 부위와 관련 CD80 유전자 사이에 DNA 링커 LAKQ37/38 BssHII-Esp3I를 삽입함으로써 작제한다. CD80 시그날 펩티드가 앞에 붙어 있는, CD80-(Q-링커)-카파를 암호화하는 유전자 융합물을, CMV 프로모터 및 폴리 A 테일 이외에도 형질전환체 선별을 위해 사용될 네오마이신 유전자를 함유하는 벡터에 삽입시킴으로써 플라스미드 pKGE987을 수득한다. CD80 유전자의 최종 버젼을 사용하여 Fd-SEA 돌연변이체 57 유전자 융합물에 선행된 유전자 융합물을 작제하는데: Q-링커를 암호화하는 DNA 단편(LAKQ117/118)을 CD80 유전자 중의 MroI 부위와 C215 VH 유전자 중의 코돈 4 및 5의 PstI 부위 사이에 삽입시킨다. 이러한 유전자 융합물을 제2의 CMV 프로모터 벡터에 삽입시켜, CD80 시그날 펩티드 및 세포외 부분에 이어서, 3개의 잔기 스페이서 GGP에 의해 연결된 Fd 및 SEA 돌연변이체 57을 암호화하는 플라스미드 pMB189를 생성시킨다. 플라스미드 pKGE961에서는, Fd 유전자를 시그날 서열(또 다른 쥐의 VH 유전자로부터 유도됨) 다음에 삽입시킨다. 플라스미드 pMB156은 이의 본래의 시그날 펩티드가 앞에 붙어 있는 본래의 카파 쇄를 암호화하고, 네오마이신 유전자를 함유한다.
생성
햄스터 배아 신장 293 세포를 pKGE961 및 pKGE987이나 pMB156 및 pMB189로 형질감염시켜 CD80-C215Fab 및 CD80-C215Fab-SEAm57을 각각 생산하는 세포주를 수득한다. 안정한 세포주를 수득하기 위한 선별 배지는 L-글루타민(GIBCO BRL 번호 25030-24), 10% 소의 태내 혈청 및 제네티신 1mg/ml을 보충시킨, 페놀 레드를 함유하지 않은 DMEM이다(Pharmacia no MS 0127). 생성 배지는 L-글루타민과 0.1% HSA를 보충시킨, 페놀 레드를 함유하지 않은 DMEM이다(Pharmacia & Upjohn AB, Sweden)이다. 융합 단백질을, 단백질 G 세파로즈 FF(Pharmacia Biotech AB) 상에서 친화 크로마토그래피한 다음 항-CD80 친화성 정제(고정화 항-사람 CD80 항체; Camfolio L307.4) 또는 SP 세파로즈 FF(Pharamcia Biotech) 상에서 이온-교환 크로마토그래피함으로써, 여과된(사르토브란 0.65 내지 0.4㎛) 배양 배지로부터 정제한다.
시약: 2mM L-글루타민(Gibco, Middlesex, UK), 0.01M HEPES(Biological Industries, Israel), 1mM NaHCO3(Biochrom KG, Berlin, Germany), 0.1mg/ml 젠타마이신 설페이트(Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel), 1mM 나트륨 피루베이트(JRH Biosciences Industries, USA) 및 10% 열 불활성화 태내 소 혈청(Gibco Middlesex, UK)을 보충시킨 RPMII 1640 배지(Gibco, Middlesex, UK)를 모든 세포 배양에 대한 완전 배지로서 사용한다.
항체: 사람 CD57(HNK1) 및 CD56(HB55)에 대해 지시된 mAbs를 mAb 생성 하이브리도마 세포(American Type Culture Collection, Rockville, MD)로부터 수득한다. PE로 표지된 항-마우스 카파 쇄 mAb를 벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson; San Jose, CA)로부터 수득한다.
세포: 중국산 햄스터 난소(CHO) K1 세포를, CD28 유전자를 암호화하는 사람 cDNA로 형질감염시킨다(Pharmacia and Upjohn, Stockholm, Sweden). 이러한 형질전환체를 대상으로 하여 통상적으로 CD28 발현에 대해 분석하고 유사한 항원 발현 수준에서 FACS 분류에 의해 유지시킨다. 사람 결장암 세포주 Colo205를 ATCC로부터 수득한다. 모든 세포주에는 미코플라즈마가 없다.
T 임파구 증식 검정: CD57, HLA-DR4, CD14 및 CD56 mAbs로 음성 선별 패닝시킴으로써 앞서 기재된 바와 같이[참조: Lando et al 1996] 사람 말초혈 단핵 세포(PBM)로부터 T 세포를 수득한다. 평편한 바닥의 96웰 플레이트(Nunc, Roskilde, Denmark)를 사용하여 200㎕ 용적으로 0.1 x 106세포/웰을 이용하여 T 세-포에 대한 모든 시험을 수행한다. 앞서 기재된 바와 같이(10) 배양물을 [3H]-티미딘 [3H]TdR(0.5mCi/웰)에 노출시킨 후에 DNA-합성을 연구한다.
유동 혈구계산(flow cytometry)에 의한 분석: FACStarPlus유동 혈구계측기(Becton Dickinson, Mountain View, CA) 상에서의 표준 셋팅에 따라서 유동 혈구계산 분석 및 분류를 수행한다. CD28에 대한 CD80의 낮은 친화도로 인해, CD80-C215Fab 융합 단백질을 이용한 CHO-CD28 세포의 염색은 상기 세포의 세척을 생략한다.
사이토킨 검정. IL-2 ELISA 키트(huIL-2 Duoset, Genzyme)를 사용하여 IL-2의 생성을 분석한다.
결과
C80-Fab 융합 단백질에 관한 기재: Fab 잔기는 이것이 IgG2A/k 모노클로날 항체 C215의 가변 영역을 함유하고 있긴 하지만 쥐의 IgG1/k 이소타입의 것이다[참조: Dohlsten et al 1995]. 트리펩티드 서열 GGP가 CH1 영역에서 쇄간 디설파이드 형성 시스테인 다음에 온다. CD80-C215Fab-SEAm57 삼중 융합 단백질에서는, 이것이 5개의 치환체를 갖는, 스타필로코쿠스성 장독소 A(SEA; Betley et al 1988)의 돌연변이체와 Fd 간의 스페이서로서 작용한다. 대체물 F47A 및 D227A를 도입하여 MHC 부류 II에 대한 친화도를 감소시키고[참조: Abrahmsen et al 1995], 대체물 N102Q, N149D 및 T218V를 도입하여 진핵 세포 내에서 생성될 때 예기치 않은 글리코실화를 피한다. 이들 후자의 대체물은 X-선 구조의 도움으로 선별한다[참조: Sundstrom et al 1996]. 최종 펜타 돌연변이체를 SEA 돌연변이체 57로 명명한다. 양 융합 단백질은 사람 CD80의 세포외 영역을 함유한다(말단 FPDN으로 한정됨). 본래의 CD80 시그날 펩티드를 사용하고, 정제된 CD80-C215Fab의 아미노산 서열화로 결정된 바와 같이, 성숙한 단백질이 VIHV를 개시하는 것으로 밝혀졌다. 18개 아미노산의 스페이서는 CD80을 CD80-C215Fab 중의 카파 쇄와 연결시키거나 CD80-C215Fab-SEAm57 삼중 융합 단백질 중의 Fab 단편의 Fd 부분과 연결시킨다. 이러한 스페이서는 Q-링커[참조: Wooton et al 1996]와 유사하며 서열 SARQANELPGAPSQEERA(서열 번호 15) 및 SARQANELPGAPSQEERP(서열 번호 16)을 각각 갖는다.
Facs 분석: CD28 양성 세포 및 C215 양성 세포에 대한 CD80-C215Fab 융합 단백질의 결합.
CD28 양성 세포: CHO-CD28 세포를 CD80-C215Fab, CD80-C215Fab-SEAm57 또는 C215Fab-SEA로 염색시킨 다음, PE로 표지시킨 항-마우스 카파 쇄 mAb와 함께 배양한다. 상기 염색은 어떠한 세척없이 4℃에서 수행한다. CD80-C215Fab와 삼중 융합 단백질 모두는 용량 의존적 방식으로 CHO 세포 상에서 발현된 CD28에 결합되었다. 대조군 융합 단백질 C215Fab-SEA를 사용한 경우에는 예상대로 어떠한 염색도 관찰되지 않았다.
CD215 양성 세포: C215 항원에 대한 융합 단백질의 결합을 Colo205 세포에 대하여 평가한다. 이러한 Colo205 세포를 CD80-C215Fab, CD80-C215Fab-SEAm57 또는 C215Fab-SEA로 염색시킨 다음, PE로 표지시킨 항-마우스 카파 쇄 mAb와 함께 배양한다. 상기 염색은 각 염색 단계 사이에 3회 세척하면서 4℃에서 수행한다.
결과(도 1 내지 2): CD80-C215Fab와 CD80-C215Fab-SEAm57는 모두 용량 의존적 방식으로 C215 항원 양성 Colo205 세포에 결합되었다. 이러한 결합은 C215Fab-SEA에 대한 것 보다 50 내지 100배 정도 더 낮다. 이는 융합 단백질의 N-말단부에 CD80을 도입하는 것이 C215 항원에 대한 C215Fab 부분의 결합을 방해할지도 모른 다는 것을 나타낸다.
이중 융합: 슈퍼항원 활성화된 T 세포의 공자극
융합 단백질의 생물학적 활성을 결정하기 위하여, 상기 융합 단백질을 대상으로 하여 슈퍼항원 활성화된 T 세포의 공자극에 대해 시험한다.
증식: 4일 동안 CD80-C215Fab의 양을 다양하게 하면서 T 세포를 Colo205 세포 및 4μM C242Fab-SEA와 함께 배양한 후, 혼입된3H-티미딘으로서 측정된 증식을 계수한다. 어떠한 CD80-C215Fab를 사용하지 않고도 수득된 활성은 20039cpm +/- 1750이다.
IL-2 생성: 4일 동안 CD80-C215Fab의 양을 다양하게 하면서 T 세포를 Colo205 세포 및 4μM C242Fab-SEA와 함께 배양한 후, 상등액을 수거하고 IL-2의 양을 결정한다. 어떠한 CD80Fab-C215Fab를 사용하지 않고도 수득된 IL-2의 양은 2849pg/ml이다.
결과(도 3 내지 4): CD80-C215Fab는 용량 의존적 방식으로 T 세포의 C242Fab-SEA 유도된 활성화를 공자극하였으며, 둘다 증식 및 IL-2 생성으로 관찰되었다.
삼중융합: 슈퍼항원 활성화된 T 세포의 공자극
삼중 융합 단백질의 생물학적 활성을 시험하기 위하여, 정제된 T 세포를 Colo205 세포 상에 표지된 C215Fab-SEAm23(m23은 상기 삼중 융합 단백질에 사용되는, MHC 부류 II 결합에 영향을 미치는 동일한 SEA 돌연변이체, 즉 Phe47Ala/Asp227Ala이다) 또는 CD80-C215Fab-SEAm57과 함께 배양한다.
증식: 4일 후에 혼입된3H-티미딘을 계수한다.
IL-2 생성: 4일 후에 상등액을 수거하고 IL-2 함량을 결정한다.
결과(도 5 내지 6): 삼중 융합 단백질은 Colo205 세포 상에서 표시되는 경우에 T 세포 활성화 및 IL-2 생성을 유도하였다. C215Fab-SEAm23을 사용하는 경우에는 이러한 활성이 전혀 관찰되지 않았는데, 이는 CD80에 의한 공자극이 활성화에 중요하다는 것을 나타내준다. 삼중 융합 단백질의 낮은 결합 친화도(C215Fab-SEA 보다 50 내지 100배 낮음; FACS 데이터 참조)로 인해, 세포에 결합된 C215Fab-SEAm23의 실제량은 삼중 융합 단백질의 양보다 실질적으로 더 높은 것으로 추정된다.
실시예 2
표적화된 IL-2는 T 세포 활성화에 대한 FabSEA의 효과 및 종양 치료를 증진시키고 연장시킨다.
방법 및 물질:
IL-2 발현 플라스미드의 작제: 슈퍼항원 SEA로 24시간 동안 자극시킨 사람 말초혈 단핵 세포(PBM)로부터 분리된 mRNA를 사용한 RT-PCR에 의해 IL2 cDNA를 클로닝한다. 제조업자의 지시에 따라서 다이날(Dynal, Oslo)로부터의 mRNA 디렉트 키트를 사용하여 5 x 106세포로부터 mRNA를 분리한다. 올리고(dT)26-피복된 자기 비이드에 어닐링시킨 mRNA를 95℃로 가열함으로써 용출시킨다. RT 및 Taq 폴리머라제의 DNA 폴리머라제 활성의 이점을 취한 RT-PCR에 의해 PCR 생성물을 연속적으로 수득한다. 상기와 같이 용출된 mRNA의 1/10을 PCR 프라이머 IL2-1 및 IL2-2와 혼합하고 표준 PCR 반응을 수행한다(30회). 이러한 PCR 생성물을 아가로즈 겔 전기영동시키고, 밴드를 상기 겔로부터 절단하며 프렙-아-진 키트(Bio-Rad)를 사용하여 정제한다. EcoRI 및 BamHI로 분해한 후, 상기 단편을 EcoRI/BamHI-분해된 pBluescript KS II에 클로닝시킨다. 상기 삽입체를 서열화한 결과, 앞서 보고된 IL2 cDNA와 동일하다는 사실을 확인하였다[TANIGUCHI et al 1983]. 그러나, PCR 반응 결과, Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Asn-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg(서열 번호 23)을 암호화하는 DNA 절편 "Gly-Pro-Q-링커"가 성숙한 사람 IL-2를 암호화하는 절편에 5'로 가해졌다. Q-hIL2를 RsrII-NheI 단편으로서 하우스 컬렉션(RsrII-XbaI로 절단됨)으로부터의 플라스미드 내로 클로닝시킨다. 이로써 생성된 플라스미드 pMS306은 이. 콜라이의 외질로의 C215FabSEA-Q-hIL2의 분비를 지시한다. 잔기들 간의 링커는 다음과 같이 추가로 최적화시킨다. Pro-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro(서열 번호 19)(본래의 Gly-Gly-Pro를 대체함)를 암호화하는 링커-암호화 영역을 부위-지시된 돌연변이를 이용하여 슈퍼항원과 Fab 잔기-암호화 영역 사이에 도입한다. 유사하게, 링커 Gly-Pro-Arg-Gln-Ser-Asn-Glu-Thr-Pro-Gly-Ser-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg(서열 번호 20), Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Thr-Thr-Arg(서열 번호 21) 또는 Gly-Pro-Thr-Glu-Ala-Asp-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Glu-Glu-Glu-Thr(서열 번호 22)가 IL-2와 Fab 잔기 간의 본래의 Q-링커를 대체한다. 이중 융합 단백질의 조합물의 경우, 또한 중쇄 또는 경쇄에 각각 융합된 IL-2와의 작제물을 비교한다.
프라이머:
발효기에서 융합 단백질의 발현: 카나마이신 내성 유전자와 lacUV5-프로모터를 갖는 플라스미드를 사용하여 이. 콜라이 K-12 균주 UL 635(xyl-7, ara-14, T4R, deltaompT)에서 융합 단백질을 발현시킨다. 동결된 스톡으로부터의 세균을, (g/ℓ) (NH4)2SO4, 2.5; KH2PO4, 4.45; K2HPO4, 11.85; 나트륨 시트레이트, 0.5; MgSO4·7.H2O, 1; 글루코즈 모노하이드레이트, 11, 0.11mM 카나마이신 및 1㎖/ℓ 미량 원소 용액을 함유하긴 하지만[참조: Forsberg et al 1989], Na2MoO4·2H2O는 함유하지 않는 쉐이커 플라스크에서 대략 21시간 동안 25℃ 하에 배양한다. 상기 세포를 OD6001 내지 2가 되도록 성장시키고 450ml 배양 배지를 사용하여 발효기에 접종하여 이의 최종 용적이 5ℓ가 되도록 한다. 이러한 발효기 배지는 (g/ℓ) (NH4)2SO4, 2.5; KH2PO4, 9; K2HPO4, 6; 나트륨 시트레이트, 0.5; 글루코즈 모노하이드레이트, 22; MgSO4·7.H2O, 1; 0.11mM 카나마이신; 1㎖ 아데카놀(Asahi Denka Kogyo K.K, Japan) 및 1㎖/ℓ 미량 원소 용액을 함유한다. 25% 암모니아로 적정하여 pH를 7.0으로 유지시키고, 온도는 25℃이며 대기성 공기 5ℓ/분으로 통기시킨다. 배치 상 동안 진탕을 300에서 1000rpm으로 증가시키고 공급 배치 상 동안 60%(w/v) 글루코즈의 공급량을 조절함으로써, 용해된 O3의 부분압을 30%로 조절한다. 0.1mM 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노사이드, IPTG를 가함으로써 OD60050에서 생성물 형성을 유도시킨다. 발효 후, 상기 세포를 4℃에서 40분 동안 8000xg로 원심분리시킴으로써 제거한다. 이와 같이 정화된 배지는 직접적으로 분석 및 정제시키거나 -20℃에서 저장한다.
융합 단백질의 정제: 30분 동안 0.19% 폴리에틸렌이민 및 0.2M NaCl으로 침전시켜, 상기와 같이 정화된 배지에 존재하는 DNA를 제거한다[참조: Atkinson and Jack, 1973]. 상기와 같이 원심분리시킨 후, 상등액을 수집하고 NaCl 농도를 0.5M로 조정한다. 이 배지를 0.05% 트윈 80, PBST를 함유하는 10mM 인산나트륨, 150mM NaCl, pH 7.4로 평형시킨 단백질 G 세파로즈 칼럼(Pharmacia Biotech AB, Uppsale, Sweden)에 적용한다. 이어서, 상기 칼럼을 5 칼럼 용적 PBST로 세척하고 결합된 단백질을 0.1M 아세트산, 0.02% 트윈 80 pH 3.2로 용출시킨다. 1M 트리스-HCl, pH 8.0을 사용하여 샘플의 pH를 5.0으로 조정하고, 50mM 암모늄 아세테이트, 0.02% 트윈 80으로 평형시킨 SP 세파로즈 HP 칼럼(Pharmacia Biotech)에 적용한다. 이어서, 상기 칼럼을 2 칼럼 용적 평형 완충액으로 세척하고 10 칼럼 용적에 걸쳐 50 내지 500mM 암모늄 아세테이트의 선형 구배를 이용하여 상기 융합 단백질을 용출시킨다. C215Fab-IL2 융합 단백질의 경우에는, pH 6.0을 활용하는 반면, C215Fab-SEA-IL2 삼중 융합 단백질의 경우에는, 분리 동안 pH가 5.7이다. 상기 융합 단백질을 0.22㎛ 필터를 통하여 여과시키고 -70℃에서 저장한다. 보다 묽을 경우에는, 제조업자의 지시에 따라서 센트리콘 30(Amicon)을 사용하여 최종 농도 0.5 내지 1mg/㎖가 되도록 상기 용출물을 농축시킨다.
세포독성 검정: MHC 부류 II 의존적 및 독립적 세포독성 검정을 앞서 기재된 바와 같이[참조: Dohlsten et al., 1990] 수행한다. MHC 부류 II 의존적 검정에 대해 간략하게 언급하면,51Cr-표지된 라지 세포(200㎕의 최종 용적에서 웰당 2500개 세포수)를, 사람 PBM을 낮은 수준의 재조합 hIL-2의 존재하에서 배양함으로써 생성된 SEA-의존적 이펙터 세포주와 혼합한다. 이펙터:표적 세포비는 30:1이다. MHC 부류 II-독립적 검정의 경우에는,51Cr-표지된 C215+colo205 세포(2500)를 45:1의 E:T비에서 SEA-독립적 이펙터 세포와 함께 배양한다. 배양한지 4시간 후에, 배지 내로 방출된51Cr을 신틸레이션 계수하여 결정한다.
정제된 사람 T 세포에 대한 시험관내 공자극 검정: 본질적으로 문헌[참조: Lando et al 1993]에 기재된 바와 같이 천연의 사람 T 세포를 정제한다. 간략하게 언급하면, 천연의 사람 T 세포를, 피콜 구배 원심분리시킨 다음 젤라틴 칼럼 상에서 분리시키고 마지막으로 HNK1 및 HLA-DR mAbs를 함유하는 페트리 디쉬에서 패닝시킴으로써 음성 선별함으로써, 사람 혈액 PBM으로부터 정제한다. 본질적으로 문헌[참조: Lando et al 1996]에 기재된 바와 같이, 천연의 사람 T 세포를 사용하여 증식 실험을 수행한다. 간략하게 언급하면, 천연의 T 세포(1개의 웰당 100,000개 세포)를, 보충물을 함유하는 RPMI-1640 총 200㎕ 용적에서 방사선 조사된 CHO 형질감염체(1개의 웰당 10,000개 세포)와 합한다. 융합 단백질을 함유하는 IL-2를 이용한 실험의 경우, 세포를 지시된 물질 1nM의 존재하에서 7일 동안 배양한다. 실험 마지막 날, 세포를3H-티미딘으로 펄싱하여 분할된 세포 DNA로의 혼입을 측정한다.
B16-C215 종양의 치료: 본질적으로 문헌[참조: Dohlsten et al 1994; Hansson et al 1997]에 기재된 바와 같이 치료를 수행한다. 0일째, 75000 내지 150000 선천성 B16-F10 흑색종 세포를 C57B1/6 마우스의 꼬리 정맥에 정맥내 주사한다. 이들 B16 세포는 C215 mAb에 의해 인식된 사람 GA-733 항원을 발현한다. 1, 3 또는 5일째, C215Fab 단백질을 이용한 치료를 시작한다. 21일째, 실험을 종결하고, 이때 폐를 꺼내고 전이된 폐 종양을 계수한다.
본질적으로 문헌[참조: Dohlsten et al 1995]에 기재된 바와 같이 18일째 B16-C215 종양을 수반하는 동물의 폐에 대해 면역조직화학을 수행한다. 최종 주사한지 4시간 후에 샘플을 취한다. 염색된 면적을 수동으로 결정한다.
본질적으로 문헌[참조: Rosendahl et al 1996]에 기재된 바와 같이 면역약리학을 수행한다. 1일 1회씩 1 또는 3회 주사 투여된 C57 B1/6 마우스로부터의 비장을 최종 주사한지 48시간 후에 꺼내고, 상기 기재된 바와 같은 표준51Cr 방출 검정에서 표적물로서 라지 세포를 사용하여 SEA-의존적 세포독성을 결정한다. E:T비는 100:1이다.
결과 및 토론:
IL2-함유 융합 단백질의 생성 및 정제: C215FabSEA-Q-hIL2 삼중 융합 단백질을 암호화하는 이. 콜라이 발현 벡터를 작제한다. 이 벡터는 LacUV5 프로모터로부터 전사된 바이시스트론성 mRNA 상의 두 아단위의 삼중 융합 단백질을 암호화한다. 이러한 두 아단위 각각에는 이. 콜라이의 외질성 공간으로의 수송을 지시하는 시그날 펩티드가 붙어있다. 제1 아단위는 C215Fab의 VH 및 이와 이어져 있는 Gly-Gly-Pro 링커이다(VH-CH1-Gly-Gly-Pro-SEA). 다른 아단위는 C215Fab의 VK 및 이와 이어져 있는 C242Fab의 CK이며, 이는 Gly-Pro-Q-링커에 의해 사람 hIL2에 연결되어 있다(VK-CK-Gly-Pro-Q-hIL2). 이러한 Gly-Pro-Q-링커 서열(서열 번호 23)은 OmpR 이. 콜라이 단백질에서 발견된 천연 링커의 약간 변형된 버젼이다[참조: Wootton et al 1989]. 보다 완전한 정보에 대해서는 물질 및 방법을 참조하길 바람. 또한, C215Fab-Q-hIL2 융합 단백질을 생성시킨다. 이는 이러한 단백질의 Gly-Gly-Pro-SEA 잔기가 제거된 것을 제외하고는 C215FabSEA-Q-hIL2와 동일하다. 따라서, 발현 벡터 중의 상응하는 DNA 서열이 결실된다. 표준 방법에 의해 PCR 매개된 부위-지시된 돌연변이에 의해 C215FabSEA-Q-hIL2의 변이된 유도체를 생성시켜 C215FabSEAD227A-Q-hIL2 및 C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A와 같은 수 많은 단백질을 생성시킨다. 이러한 삼중 융합 단백질의 후자 변이체에서는, 아단위간 시스테인을 2개의 세린 잔기로 대체시킨다. 이러한 변형은 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는다.
IL2-함유 단백질을 암호화하는 플라스미드를 이. 콜라이 생산 균주 UL635 내로 형질전환시키고 연속적으로 발효를 수행한다. 단백질 G 친화 크로마토그래피를 사용하여 배양 배지로부터 융합 단백질을 정제한다. 이러한 융합 단백질의 분해된 변이체를 이온 교환 크로마토그래피하여 제거한다. 수득된 생성물은 SDS-PAGE로 측정한 결과 90% 이상 완전한 길이의 융합 단백질인 것으로 밝혀졌다(물질 및 방법). 융합 단백질을 최적으로 고안하여, 130mg/ℓ 이하의 융합 단백질을 성장 배지에서 수득하고, 전형적으로 70mg 삼중 융합 단백질을 1리터 배지로부터 수득한다.
IL2-함유 Fab 융합 단백질의 작용적 특징: C215FabSEA-Q-hIL2 및 C215Fab-Q-hIL2 융합 단백질과 같은 IL2-함유 융합 단백질이 IL-2 의존적 쥐의 세포주 CTLL-2의 증식을 유도하는 능력은 몰 기준으로 하여 재조합 사람 IL2의 것과 거의 유사하다(데이타는 제시되지 않음). 더욱이, C215FabSEA-Q-hIL2 및 C215FabSEA의 항원 결합과 SEA 활성은 수 많은 검정에서 구별이 불가능한 것으로 밝혀졌는데, 이는 IL2를 상기 분자 내로 도입하는 것이 어떠한 불리한 효과도 나타내지 않는다는 사실을 제시해준다. 이들 검정에는 4시간51Cr-방출 검정에서 SEA-반응성 T 세포 이펙터 세포주에 의한 C215+사람 결장암 세포주 colo205의 MHC 부류 II-독립적 사멸을 유도하는 능력이 포함된다. 또한, SEA-반응성 이펙터 T 세포에 의한 MHC 부류 II+라지(랫트 임파종) 세포의 MHC 부류 II-의존적 사멸도 유사한 효능을 나타낸다(데이타는 제시되지 않음). 강력한 C215 항원 및 MHC 부류 II 결합에 대한 보다 직접적인 증거는 FACS 분석으로 수득된다. 라지 세포에 대한 C215FabSEA 및 C215FabSEA-Q-hIL2 결합의 용량 의존성은 몰 기준으로 하여 유사한 것으로 밝혀졌다(데이타는 제시되지 않음). 또한, colo205 세포에 대한 C215FabSEA-Q-hIL2 및 C215Fab-Q-hIL2의 용량-의존적 결합은 C215FabSEA에 대해 관찰된 것과 유사한 것으로 밝혀졌는데(데이터는 제시되지 않음), 이는 항원 결합이 IL2-함유 융합 단백질에서 강력하다는 것을 지시해준다.
FabSEA에 의해 유도된 IL2-의존적 증식: 휴지기 사람 T 세포는 최적의 T 세포 증식 및 활성화를 촉발시키기 위해 시그날 1 및 시그날 2를 필요로 한다[참조: Schwartz, 1990]. 슈퍼항원은 시그날 1이 세포 상에 존재하는 경우에 이를 운반할 수 있다. B7/CD28 시그날링의 주요 하부 이펙터인 IL-2는 시그날 2를 제공하는 것으로 예상된다.
본 실험에서는, 사람 혈액으로부터 정제된 휴지기 T 세포를 사용하여, C215FabSEA-Q-hIL2 삼중 융합 단백질 또는 C215FabSEA이 C215Fab-Q-hIL2 또는 재조합 사람 IL-2와 조합하여 실제로 시험관내에서 T 세포 증식을 유도한다는 것을 보여준다(도 7).
휴지기 사람 T 세포를 IL2(C215Fab-Q-hIL2, C215FabSEA-Q-hIL2 또는 재조합 사람 IL-2의 형태)의 존재하에서 표적화된 SEA(C215FabSEA 또는 C215FabSEA-Q-hIL2)와 함께 배양한다. SEA는 C215 항원(Fab부를 통함)으로 형질감염된 조사된 CHO 세포, 즉 SEA를 연결하는 MHC 부류 II/Dr 상에 존재한다. 형질감염되지 않은 CHO 세포는 대조군으로 제공된다. T 세포를 CHO 형질감염체 및 문제의 물질과 배양한지 7일 후에,3H-티미딘을 DNA 내로 혼입시킴으로써 증식을 측정한다.
C215FabSEA-Q-hIL2는 Fab가 지시하는 사람 C215 항원으로 형질감염된 CHO 세포(CHO-C215) 상에 존재하는 경우에 사람 T 세포의 증식을 유도하였다(도 7). 마찬가지로, 상기 단백질이 CHO-Dr(사람 MHC 부류 II) 상에 존재하는 경우에도 증식이 유도된 반면, 형질감염되지 않은 CHO 세포(CHO)의 존재하에서 또는 CHO 세포의 부재하에서는 증식이 전혀 관찰되지 않았다(R10). C215FabSEA 또는 C215Fab-Q-hIL2가 CHO 세포 상에 존재하는 경우에 이들 스스로는 어떠한 실질적인 증식을 유도하지 않았는데, SEA와 IL-2 모두가 실제로 증식 유도에 필요하다는 것을 지시해준다. 이러한 사실은 C215FabSEA와 C215Fab-Q-hIL2의 조합물 또는 C215FabSEA와 재조합 사람 IL2의 조합물이 C215FabSEA-Q-hIL2에 의해 유도된 것과 정성적으로 유사한 효과를 유도하였기 때문에 확인되었다. 이는 또한, 본 검정에서는 IL-2가 필요하지만, SEA와는 달리, 세포 결합되지 않아야 할 필요는 없다는 것을 나타낸다.
C215FabSEA-Q-hIL2 뿐만 아니라 C215FabSEA와 C215Fab-Q-hIL2의 조합물은 생체내에서 증진되고 지속적인 T 세포 활성화와 개선된 종양 침윤을 야기시킨다. C215Fab-Q-hIL2 + C215FabSEA 및 C215FabSEA-Q-hIL2 모두는 표적 세포의 SEA-의존적 사멸을 유도하는 능력으로 측정한 결과, C215FabSEA 보다 훨씬 더 강력한 T 세포 활성화 유도인자이다(도 8). 간략하게 언급하면, 마우스에게 표시된 단백질을 1일 1 또는 3회 주사 투여한다. 마지막 주사 투여한지 2일 후에, 처리된 마우스로부터 비장을 취하고, SEA-피복된 라지 세포에 대한 세포독성 활성을 표준 4시간51Cr 방출 검정으로 결정한다.
C215FabSEA-Q-hIL2 및 C215FabSEA/C215Fab-Q-hIL2 모두는 증진될 뿐만 아니라 지속적인 T 세포 활성화를 유도하였다. C215FabSEA를 4번째 주사한 후에 현격하게 떨어지는, IFN-등의 혈청 사이토킨의 수준은 심지어 C215FabSEA-Q-hIL2를 4번째 주사한 후에도 매우 높은 수준으로 유지된다(데이터는 제시되지 않음). 일반적으로, IFN-및 IFN-α 수준은 C215FabSEA의 경우에서 보다 훨씬 더 높다(10배 이하).
C215FabSEA와 C215Fab-Q-hIL2 조합물 치료를 이용한, 확립된 B16-C215 종양의 개선된 치료법: FabSag 종양 치료법의 IL2-증진 효과를 쥐의 B16 흑색종 모델에서 연구하였다(도 9). 제시된 실시예에서는, 8 내지 12주생 C57 B1/6 암컷 마우스를 대상으로 하여, 0일째, C215 mAb가 지시하는 사람 종양 항원 GA-733(다음에서는 B16-C215)으로 형질감염된 150,000 B16 세포를 상기 마우스에 접종한다. 표시된 물질을 5, 6 및 7일째 주사한다. 각 데이타점은 7마리 동물에 상응한다. 21일째, 상기 동물을 희생시키고, 폐에 전이 증식하는 멜라닌-착색된 B16 종양의 수를 계수한다. 몇몇 실험에서는 C215FabSEA와 C215Fab-Q-hIL2의 조합물이 처리되지 않은 대조군과 비교해서 C215FabSEA 보다 우수한 치료법을 유도하는 것으로 나타났다(도 9). 표시된 실험에서는, C215FabSEA/C215Fab-Q-hIL2 조합물 치료가 C215FabSEA-Q-hIL2 삼중 융합 단백질 보다 우수한 치료 효과를 제공한다.
연속적인 면역조직화학 연구 결과는 C215FabSEA 단독이나 C215FabSEA와 C215Fab-Q-hIL2의 조합물이 유사한 수의 B6-C215 종양-침윤성 CD4 및 CD8 T 세포를 야기시키는 것으로 나타났다. 그러나, 흥미롭게도, CD25(IL2Ra) 양성 세포(T 세포 활성화에 대한 우수한 마커)는 C215FabSEA/C215Fab-Q-hIL2의 3번째 주사와 4번째 주사 사이에 현격하게 증가되었다(도 10). 이와는 달리, C215FabSEA의 경우에는 감소되었는데, 이는 아네르기의 개시를 나타낸다. 따라서, 침윤성 T 세포의 질은 C215FabSEA 단독 치료 보다 조합물 치료의 경우에 더 높은 것으로 여겨지는데, 이는 "개선된 치료 효과"를 설명하는데 도움을 줄 수 있다. 마찬가지로, T 세포 활성화에 부차적으로 생성된 인터페론와 같은 혈청 사이토킨은 FabSEA를 4번째 주사한 후에 현격하게 감소된다(도 11). 그러나, FabSEA-Q-hIL2 삼중 융합 단백질을 사용하게 되면, 상기 인터페론 수준이 4번째 주사후에도 높은 수준을 유지한다. 이러한 관찰은 해당 작제물에 IL-2를 포함하는 것이 Fab-SEA 유도된 T 세포 아네르기를 길항시킬 수 있다는 것을 부가적으로 나타내준다.
C215FabSEAD227A-Q-hIL2를 이용한 B16-C215 종양의 개선된 치료법: 슈퍼항원은 마우스에서 보다 사람에게서 훨씬 더 독성을 지니는데, 이는 부분적으로는 사람에서의 MHC 부류 II에 대한 친화도가 상당히 더 높기 때문이다[참조: Hansson et al 1997]. 따라서 FabSEA 단백질의 체내 독성이 사람에 있어서의 치료에 주요 걸림돌이 되는 것으로 예상된다. 전신 면역-활성화(SEA-MHC 부류 II 의존적)에 대한 종양에서의 국부적 활성화(Fab-의존적)를 증가시키는 한 가지 방법은 MHC 부류 II에 대한 SEA의 친화도를 감소시키는 것이다. SEA의 결정성 구조에 근거하여, 본 발명자들은 MHC 부류 II에 대한 친화도가 100배 저하된, C215FabSEA의 돌연변이체, 즉 C215FabSEAD227A를 제조하였다. C215FabSEA는 달리, 이는 SEA-매개된 체내 독성에 대한 주 원인인 것으로 여겨지는 MHC 부류 II 분자와 가교결합하는 능력을 지니고 있지 않다[참조: Hansson et al 1997].
Vb3 TCR 형질전환 마우스에서 1일 B16-C215 종양 치료시 효과적인 치료와 독성 간의 영역(윈도우)은 C215FabSEA와 비교해서 상기 C215FabSEAD227A돌연변이체에 대해서 50배 이상 더 넓다[참조: Hansson et al 1997]. 이러한 관찰에 따르면, 면역조직화학 결과는 유사한 치료를 가져오는 두 단백질의 용량에서는, 상기 종양에서 필적하는 면역 활성화가 관찰되는 반면, C215FabSEAD227A를 이용한 비장에서는 훨씬 덜한 전신 면역 활성화가 관찰된 것으로 나타났다[참조: Hansson et al 1997]. 더욱이, 래빗트에서의 약리역학적 연구는 비장 및 기타 임파양 기관에 대한 C215FabSEAD227A의 표적화가 현격히 저하된 것으로 나타났는데, 여기서는 C215FabSEA와 비교해서 대부분의 MHC 부류II+세포가 국재되었다(데이터는 제시되지 않음).
임상용으로 사용하기 위해서는, Fab-SEA-IL2 삼중 융합 단백질이 돌연변이된 슈퍼항원을 함유하는 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명자들은 C215FabSEAD227A-Q-hIL2 삼중 융합 단백질을 제조하였다. 이와 같이 생성된 단백질은 휴지기 사람 T 세포의 증식을 유도할 수 있고(데이터는 제시되지 않음) 6회 주사까지는 마우스에서 지속적인 SEA-의존적 CTL 활성을 유도하였다. 이와는 달리, 배경 CTL 활성이 C215FabSEAD227A(<10% - 데이터는 제시되지 않음) 및 C215Fab-Q-hIL2(<15% - 데이터는 제시되지 않음)를 사용하여 관찰되었다. 상기 단백질을 매일 8차례 주사 투여한, 정상의 C57 B1/6 마우스 중의 확립된(3일) B16-GA733 종양 치료는 최적 용량의 C215FabSEA 만큼이나 우수한 치료를 제공한다(도 13). 이러한 시스템에서는, 마우스가 아닌 사람에게서 최적의 활성을 나타내도록 고안된 C215FabSEAD227A가 보다 적은 효과만을 나타낸다(도 13). 그러나, 가장 높은 용량에서는, C215FabSEAD227A-Q-hIL2의 약간의 독성에 직면하게 된다. 이와는 달리, 몇몇 치료 실험에서는, C215FabSEAD227A와 C215Fab-Q-hIL2의 조합물(8회 주사)이 C215FabSEAD227A단독과 비교해서, Vb3 TCR 형질전환성 마우스에서의 3일 B16-GA733 종양 치료를 상당히 개선시킨다는 것을 나타내준다(데이터는 제시되지 않음). Vb3 TCR 형질전환성 마우스에서는, T 세포의 >90%가 SEA와 반응하는 반면, 정상적인 마우스에서는 10 내지 20%가 반응한다. 흥미롭게도, 래빗트에서는, C215FabSEAD227A-Q-hIL2(0/4 래빗트가 20㎍/kg으로 반복 주사한 후에 사망하였다)를 반복해서 주사(8회 이하)하는 것이 IL-2를 사용하지 않은 C215FabSEAD227A(0/4 래빗트가 20㎍/kg으로 반복 주사한 후에 사망하였고; 4/4가 20㎍/kg에서 사망하였다) 보다 더욱 독성인 것으로 나타나지 않으며 C215FabSEA(1/4 래빗트가 1㎍/kg으로 반복 주사한 후에 사망하였다) 보다 독성이 훨씬 덜한 것으로 나타나지 않는다. 이와 동시에, C215FabSEAD227A이나 C215FabSEA으로 치료한 것이 아니라 C215FabSEAD227A-Q-hIL2로 치료한 후에만 지속적인 면역 활성화(임파구 리바운드 효과)가 관찰되는데, 이는 IL-2를 실질적으로 혼입시키는 것이 FabSEA-유도된 T 세포 아네르기를 길항시키는데 도움을 준다는 것을 나타내준다(데이터는 제시되지 않음).
IL-2 돌연변이된 C215FabSEAD227A-Q-hIL2 단백질을 이용한 B16-C215 종양 치료: IL2-함유 삼중 융합 단백질의 보다 큰 독성, 및 C215FabSEA-Q-hIL2의 경우에는 보다 낮은 치료 효능은 부분적으로는, 임파양 조직에 대한 SEA 활성의 "재표적화"에 기인된 것일 수 있다. 이러한 재표적화 효과는 비장 및 기타 임파양 조직 중의 T 세포 상에서 주로 발견되는, IL2의 이의 수용체에 대한 높은 친화도(Kd=10pM)에 기인된 것이다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 IL2R+세포에 대한 친화도를 저하시킴으로써 전신 활성화시키기 위하여 IL-2 잔기를 돌연변이시킨, C215FabSEAD227A-Q-hIL2의 유도체를 제조하였다. 원칙적으로, 이는 C215FabSEAD227A단백질에 대한 치료 영역을 개선시키기 위해 사용된 것과 동일한 접근법이다.
IL-2와 이의 고 친화성 수용체 간의 상호작용은 매우 잘 연구되어 있다. 이러한 수용체는 3개의 아단위 a, b 및 g로 구성된다. b와 g를 가교결합시키는 것이 생물학적 활성에 필요한 반면, a 아단위는 최적의 결합에 필요하다. 본 발명자들의 전략은 a-아단위 결합을 제거함으로써 IL-2의 이의 높은 친화성 수용체(abg)에 대한 친화도를 저하시키고, 연속적으로 필요에 따라 b 및 g-아단위 결합을 저하(제거하는 것이 아님)시키는 것이다.
IL2Ra-결합을 제거하고(F42A, F42K) 또한 IL2Rb 결합을 감하도록(F42A/D20S) 3가지의 C215FabSEAD227A-Q-hIL2의 돌연변이체를 고안한다. 이들 단백질은 IL-2 의존적 쥐의 세포주 CTLL-2의 증식을 유도하는데 있어서, 각각 100배(F42A), 1000배(F42K) 및 3000배(F42A/D20S) 감소된 활성을 지닌다. 이들 단백질의 특성들, 특히 활성화된 사람 T 세포 및 IL2 수용체에 대한 친화도 및 결합율에 관하여 보다 상세히 결정하기 위한 실험을 진행한다. 초기 치료 실험은 이러한 전략이 유망하다는 것을 나타내준다(도 14; 도 15). 제시된 예에서는, 3일 B16-GA733 종양을 수반하는 Vb3 TCR 형질전환성 마우스(여기서, T 세포의 >90%이 SEA에 의해 활성화된다)에게 8회 주사 투여한다. 가장 높은 용량에서 여전히 일부 독성이 관찰되긴 하였지만, 이는 C215FabSEAD227A-Q-hIL2(6번째 주사) 보다는 오히려 C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A또는 C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42K(8번째 주사)를 사용하는 경우에 나중에 일어나며, 가장 높은 용량 치료는 PBS-처리된 대조군과 비교해서 일관되게 90% 초과의 종양 감소율을 가져온다(도 14). 본 발명자들은 현재, 독성 영역에 대한 치료법을 추가로 개선시키기 위해 부가의 돌연변이를 SEA 및 IL2부에 도입함으로써 상기와 같은 고도의 유망한 접근법을 조사하고 있다.
더욱이, IL-2부 내에 Thr51Pro 돌연변이를 포함하는 C215FabSEA-Q-hIL2 삼중 융합 단백질을 만들기 위한 작업이 진행중이다[참조: Chang et al 1996]. 이러한 돌연변이는 IL-2 생활성을 저하시키지 않으면서도 상기 융합 단백질의 IL2R-매개된 내부이행을 차단시키는 작용을 할 수 있다. 이는 상기 경로에 의한 융합 단백질의 제거를 저하시키고, 이로써 약물의 국소 농도와 효능을 증가시킬 것이기 때문에 중요한 것으로 여겨진다. Thr51Pro 돌연변이된 단백질은 SEA 및 IL-2부에, MHC 부류 II 및 IL2 수용체 각각에 대한 친화도를 감소시키기 위한 추가의 돌연변이를 함유할 수 있다.
실시예 3
(Sag,IM)-접합체의 효과를 입증하기 위한 실험. 표적 세포 IM-수용체 양성 또는 MHC 부류 II 양성 세포.
Sag-IM 분자를 MHC 부류 II 발현 세포에 결합시킴으로써 SDCC를 촉진시킬 수있다. 또 다르게는, IM에 대한 수용체를 발현하는 세포를 표적화할 수 있다. 따라서, Sag-IM 분자가 IM에 대한 수용체를 발현하는 바람직하지 못한 세포의 사멸을 유도하는데 유용할 수 있다.
어떠한 이펙터나 표적 세포도 C215Fab에 의해 인식된 항원을 발현하지 않는 경우에는, C215FabSEA-hIL2 삼중 융합 단백질이 Sag-IM 분자로 간주될 수 있다. 이펙터 세포는 우측 Vβ아유형의 T 세포일 것이다. 표적 세포는, 예를 들면, 특정 백혈병이나 임파종에서 존재하는 것과 같은 IL2 수용체를 발현하는 이상한 조혈 세포일 것이다.
실험 A: 시험관내에서의 개념-입증: 이펙터 T 세포(SEA로 반복해서 자극된 사람 T 세포)와 표적 세포(f.ex. 사람 "라지" B 세포 임파종 세포)를, MHC 부류 I에 대한 결합을 저하시키도록 돌연변이시킨 C215FabSEA-hIL2 삼중 융합 단백질과 함께 배양할 것이다. 이는 SDCC 검정에 대한 표준물 설정이다(이펙터 T 세포, 라지 세포, 실험상 물질). 본 발명자들은 MHC 부류 II에 대한 친화도를 상당히 감소시킨 C215FabSEAD227A-hIL2 단백질이 라지 세포를 사멸시키는데 있어서 C215FabSEAD227A보다 약 10배 이상의 효능을 지니고 있다는 사실을 밝혀내었다. 이와 같이 증가된 효능에 대한 명백한 설명은 상기 삼중 융합 단백질이 라지 세포 상에 발현된 IL2 수용체 상에 주어진다는 것이다.
실험 B: 시험관내에서의 개념-입증: 쥐의 임파종 모델(예를 들면, C57 B1/6 마우스에서 RBL-5 임파종)은 널리 확립된 것이다[참조: Hoglund et al., J. Exp. Med. 168, 1469-1474]. 이러한 모델에서 Sag-IM 단백질을 이용하여 IL-2 수용체 또는 또 다른 IM-R을 표적화하는 것은 생체내에서 IM-수용체 양성 세포를 표적화하기 위한 개념-입증을 제공할 수 있다.
IM-R 양성 세포의 Sag-IM 표적화는 이펙터와 표적 세포 모두가 종종 IM에 대한 수용체를 발현한다는 사실에 의해 복잡해지기도 한다. 그럼에도 불구하고, 특정 상황하에서는, 이러한 치료 양상이 효과적일 수 있다. 표적 세포 상에서의 IM-R 발현 밀도, 표적 세포의 수 및 국재화 등의 요인이 역할을 하는 것으로 여겨진다. 예를 들면, IL2R 알파가 T 세포 활성화시에만 상향-조절된다는 것이 강조되어야 하며, 따라서 IM-R이 이펙터 세포 상에서가 아니라 수 많은 표적 세포에서 발현되는 동안에 일시적인 영역이 존재할지도 모른다.
Sag가 MHC 부류 II에 대한 친화도를 감소시키도록 돌연변이시킨 야생형 슈퍼항원을 나타내는 Sag-IM 융합 단백질이 유사하게 사용될 수 있다.
참조문헌
*-표지된 문헌에는 다른 문헌보다 면역 조절인자에 관해 보다 상세히 기재되어 있다.

Claims (34)

  1. 슈퍼항원(superantigen; SAG)과 면역 조절인자 중의 하나 이상이 "자유" 슈퍼항원(Sag)과 접합체를 표적 세포에 표적화시키는 잔기 간의 접합체의 형태로 존재함을 특징으로 하는, 두 가지 유형의 세포를 면역 조절인자의 존재하에서 상기 슈퍼항원과 접촉시킴으로써 T 세포의 존재하에서 표적 세포를 불활성화시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    a. 슈퍼항원(SAG) 및 면역 조절인자가 슈퍼항원(Sag), 표적 세포에 대한 표적화 잔기(T) 및 면역 조절인자(IM)를 포함하는 삼중 접합체(T,IM,Sag-접합체)의 형태로 사용되고;
    b. 슈퍼항원(SAG)이 면역 조절인자(IM)와 표적 세포에 대한 표적화 잔기(T') 간의 이중 접합체와 조합하여 슈퍼항원(Sag)과 표적 세포에 대한 표적화 잔기(T) 간의 이중 접합체의 형태(T,Sag-접합체 + T',IM-접합체)로 사용되며;
    c. 슈퍼항원(SAG)이 슈퍼항원(Sag)과 표적 세포에 대한 표적화 잔기(T) 간의 이중 접합체의 형태로 사용되고, 면역 조절인자(IM)가 자유 형태, 즉 표적 세포에 대한 표적화 잔기와 접합되지 않은 형태(T,Sag-접합체 + IM)로 사용되며;
    d. 슈퍼항원(SAG)이 자유 형태(Sag)로 사용되고, 면역 조절인자가 접합체 형태, 즉 면역 조절인자와 표적화 잔기 간의 이중 접합체의 형태(Sag + T,IM-접합체)로 사용되고;
    e. 슈퍼항원(SAG) 및 면역 조절인자가 슈퍼항원(Sag)과 면역 조절인자(IM) 간의 이중 접합체의 형태(Sag,IM-접합체)로 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, a가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 면역 조절인자 접합체 중의 표적화 잔기가 슈퍼항원 접합체 중의 표적화 잔기와 상이할 수 있는, b가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, c가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제2항에 있어서, e가 사용되고, IM 및 T가 수용체를 수반하는 접합체 세포를 표적화하기 위한 공통의, 예를 들면, 사이토킨(예: IL-2) 수용체임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 표적 세포와 연관된 질환, 예를 들면, 암에 걸린 개개인의 생체내에서 세포를 불활성화시키는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 표적화 잔기가 항체, 바람직하게는 이의 항원 결합 단편(예: Fab 또는 Fab2-단편) 또는 단일쇄 항체임을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 슈퍼항원(Sag)이, 예를 들면,
    a. 상응하는 야생형 슈퍼항원과 비교해서 MHC 부류 II 항원과 결합하는 능력이 감소되도록 하는 돌연변이;
    b. 상응하는 야생형 슈퍼항원과 비교해서 사람 혈청에서의 혈청 반응성이 감소되도록 하는 돌연변이;
    c. 상응하는 야생형 슈퍼항원과 비교해서 사람에게서의 면역원성이 감소되도록 하는 돌연변이;
    d. 둘 이상의 자유 슈퍼항원 간의 키메라가 되도록 하는 돌연변이에 의해 변형됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 슈퍼항원이, 예를 들면, MHC 부류 II 친화도에 중요한 아미노산 잔기를 암호화하는 코돈에서의 돌연변이에 의해 MHC 부류 II 친화도가 감소되도록 변형됨을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 면역 조절인자가
    a. IL-2 등의 사이토킨;
    b. 케모카인; 또는
    c. 임파구 표면 결합된 수용체 및 리간드의 세포외 부분, 예를 들면, CD80 및 CD86 등의 B7 분자의 세포외 부분 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 면역 조절인자가, 예를 들면, 슈퍼항원 활성화된 T 세포가 아네르기(anergy)로 빠져나가는 것을 길항시킴으로써 생체내에서 슈퍼항원의 효과를 증진시킬 수 있는 면역 조절인자 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 면역 조절인자가, CD80 또는 CD86 등의 B7 리간드의 세포외 부분, 또는 IL-2 등의 CD28/B7 시그날링의 하부 이펙터임을 특징으로 하는 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 면역 조절인자가, 예를 들면, 상응하는 천연 형태와 비교해서 임파구 수용체에 대한 친화도 저하를 나타내도록 돌연변이됨으로써 변형됨을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 면역 조절인자가 IL-2 또는 CD80의 세포외 부분 또는 이의 제14항에 따라서 변형된 형태임을 특징으로 하는 방법.
  16. 다음 화학식 Ⅰ에 해당하는 슈퍼항원 접합체.
    화학식 Ⅰ
    (T)x(Sag)y(IM)z
    상기식에서,
    a. T는 표적화 잔기이고, Sag는 자유 슈퍼항원에 상응하며, IM은 슈퍼항원이 아닌 면역 조절인자이고, T, Sag 및 IM은 하나 및 동일한 접합체 분자 내에서 상이하거나 동일할 수 있는 유기 링커 B를 통하여 함께 연결되어 있으며;
    b. x, y 및 z는 전형적으로 0 내지 10, 예를 들면, 0 내지 5 중에서 선택되는 정수이고, 제시된 접합체 분자 내에서 각각 잔기 T, Sag 및 IM의 수를 나타내는데, 단 y>0이고 또한 x 및 z 중의 하나 또는 둘 모두가 >0이어야 한다.
  17. 제16항에 있어서, 모든 x, y 및 z가 1 내지 3의 정수, 바람직하게는 1 내지 2의 정수이고, x, y 및 z 간의 전형적인 관계가 x=y=z; x=y=0.5z; x=0.5y=0.5z; 및 x=0.5y=z 중에서 선택되는 융합 단백질임을 특징으로 하는 슈퍼항원 접합체.
  18. 제16항에 있어서, 2쇄 생성물로서 발현되는 융합 단백질임을 특징으로 하는 슈퍼항원 접합체.
  19. 제18항에 있어서, 슈퍼항원 잔기 SAG가 표적화 잔기 T'에 C-말단적으로 융합되고 면역 조절인자 IM이 표적화 잔기 T"에 C-말단적으로 융합되는 융합 단백질.
  20. 제19항에 있어서, T' 및 T"가 제8항에서 정의된 바와 같고/같거나 SAG가 제9항 또는 제10항에서 정의된 바와 같으며/같거나 IM이 제11항 내지 제15항 중의 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 융합 단백질.
  21. 제20항에 있어서, SAG가 스타필로코쿠스성 장독소(Staphylococcal enterotoxin) A(SEA)이고, T'가 C215 Fab 단편의 CH1-영역이며, T"가 C215 항체의 경쇄이고, IM이 인터루킨-2인 융합 단백질.
  22. 제19항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, SAG가 가요성이고 친수성인 3 내지 11개 아미노산 잔기의 아미노산 링커 B'를 통하여 T'에 융합되고, IM이 친수성이고 중성이거나 양성적으로 하전된 10 내지 20개 아미노산 잔기의 아미노산 링커 Q를 통하여 T"에 융합되는 융합 단백질.
  23. 제22항에 있어서, B'가 Gly-Gly-Pro 및 Pro-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro(서열 번호 19)로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, Q가 Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Asn-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg(서열 번호 23), Gly-Pro-Arg-Gln-Ser-Asn-Glu-Thr-Pro-Gly-Ser-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg(서열번호 20), Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Thr-Thr-Arg(서열 번호 21) 및 Gly-Pro-Thr-Glu-Ala-Asp-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Glu-Glu-Glu-Thr(서열 번호 22)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 융합 단백질.
  24. 제16항에 있어서, 슈퍼항원 접합체가 융합 단백질이고, 표적화 잔기가 존재하지 않으며(x=0), y 및 z가 정수 1 내지 3, 바람직하게는 1 내지 2이고, x와 y의 바람직한 관계가 x=y; x=0.5y, 0.5x=y; x=1/3y 및 1/3x=y 중에서 선택됨을 특징으로 하는 슈퍼항원 접합체.
  25. 제16항에 있어서, 다음 화학식 Ⅱ를 가짐을 특징으로 하는 슈퍼항원 접합체.
    화학식 Ⅱ
    (Sag)y(IM)z
    상기식에서, y=z=1이다.
  26. 제16항, 제17항, 제24항 또는 제25항에 있어서, 표적화 잔기가 제8항에서 정의된 바와 같고/같거나, 슈퍼항원 잔기가 제9항 또는 제10항에서 정의된 바와 같으며/같거나, 또는 면역 조절인자 잔기가 제11항 내지 제15항 중의 어느 한 항에서 정의된 바와 같음을 특징으로 하는 슈퍼항원 접합체.
  27. 상응하는 천연 형태와 비교해서 임파구 수용체에 대한 친화도가 감소되거나 또는 임파구 수용체에 결합되는 경우에 내부이행 속도가 감소되도록, 예를 들면, 돌연변이에 의해 변형시킨 비-슈퍼항원 면역 조절인자(IM'")와 표적화 잔기(T'") 간의 접합체이며, 이러한 접합체가 다음 화학식 Ⅴ에 해당함을 특징으로 하는, 표적화된 면역 조절인자.
    화학식 Ⅴ
    (T'")x(Sag'")y(IM'")z
    상기식에서,
    a. T'"는 표적화 잔기이고, Sag'"는 자유 슈퍼항원에 상응하며, IM'"은 상기와 같이 변형시킨 면역 조절인자이고, Sag 및 IM은 하나 및 동일한 접합체 분자 내에서 상이하거나 동일할 수 있는 유기 링커 B'"를 통하여 함께 연결되며;
    b. x, y 및 z는 전형적으로 0 내지 10, 예를 들면, 0 내지 5 중에서 선택되는 정수이고, 제시된 접합체 분자 내에서 각각 잔기 T'", Sag'" 및 IM'"의 수를 나타내는데, 단 z>0이고 또한 x 및 y 중의 하나 또는 둘 모두가 >0이어야 한다.
  28. 제27항에 있어서, 모든 x, y 및 z가 1 내지 3의 정수, 바람직하게는 1 내지 2의 정수이고, x, y 및 z 간의 전형적인 관계가 x=y=z; x=y=0.5z; x=0.5y=0.5z; 및 x=0.5y=z 중에서 선택되는 융합 단백질임을 특징으로 하는 표적화된 면역 조절인자.
  29. 제27항에 있어서, 표적화된 면역 조절인자가 융합 단백질이고, 슈퍼항원 잔기가 존재하지 않으며(y=0), x 및 z가 정수 1 내지 3, 바람직하게는 1 내지 2이고, x와 y의 바람직한 관계가 x=y; x=0.5y, 0.5x=y; x=1/3y 및 1/3x=y 중에서 선택됨을 특징으로 하는 표적화된 면역 조절인자.
  30. 제29항에 있어서, 다음 화학식에 해당함을 특징으로 하는 표적화된 면역 조절인자.
    (T'")y(IM'")z
    상기식에서, y=z=1이다.
  31. 슈퍼항원, 및 슈퍼항원이 아닌 면역 조절인자(예: IL-2)를 암호화하는 DNA 분자.
  32. 제31항에 있어서,
    a. 제1 시스트론이 가능하게는 제9항 또는 제10항에서 정의된 바와 같이 변형된, 접합되지 않은 슈퍼항원(Sag)을 포함하는 폴리펩티드 I을 암호화하는 서열 I를 함유하고;
    b. 다른 시스트론이 가능하게는 제11항 내지 제15항 중의 어느 한 항에서 정의된 바와 같이 변형된 면역 조절인자를 포함하는 폴리펩티드 II를 암호화하는 서열 II를 함유하는 비스시스트론성 작제물의 형태임을 특징으로 하는 DNA 분자.
  33. 제32항에 있어서, 서열 I 및 II 중의 어느 하나 또는 둘 모두가, 폴리펩티드 I 및 II가 결합하여 자유 슈퍼항원, 면역 조절인자 및 항체를 포함하는 삼중 융합물을 형성할 수 있도록, 적어도 항체의 일부분을 암호화하는 각각의 서열에 융합됨을 특징으로 하는 DNA 분자.
  34. 제31항에 있어서, 슈퍼항원이 접합되지 않은 슈퍼항원이고, 이러한 슈퍼항원을 암호화하는 서열이, 가능하게는 올리고펩티드 링커를 암호화하는 서열을 통하여 면역 조절인자를 암호화하는 서열에 융합됨을 특징으로 하는 DNA 분자.
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