KR20010021566A - 식물생산량 증가방법 - Google Patents

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리이스마이어죄르그
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크리스타 헤르조크
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Abstract

본 발명은 식물생산량을 증가시키는 방법, 상기 방법에 사용되는 재조합 핵산분자, 그들의 용도 뿐만 아니라 생산량이 증가된 식물에 관한 것으로서,
반세포 특이 프로모터의 조절하에서 뉴클레오티드 서열이 발현되는 식물의 생산량을 증가시키는 방법이 기재되어 있으며,
상기 뉴클레오티드 서열은 발현하여 체관부에 광합성산물을 축적시키는 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 한다.

Description

식물생산량 증가방법{PROCESSES FOR INCREASING THE YIELD IN PLANTS}
본 발명은 식물생산량을 증가시키는 방법, 상기 방법에 사용되는 재조합 핵산분자, 그들의 용도 뿐만 아니라 생산량이 증가된 식물에 관한 것이다.
농업 및 임업분야에서, 생산량이 증가된 식물을 제조하기 위해, 특히 증가하는 세계인구에 지속적으로 식량을 공급하기 위해, 그리고 재생원료를 공급하기 위해 꾸준히 노력을 해왔다. 종래에는, 육종에 의해 생산량을 증가시킨 식물을 얻으려고 노력했지만, 이는 시간낭비와 노동집약적이다. 더구나 적당한 육종계획은 각 관련 식물종에 대해 실시되어야 한다.
식물의 유전자조작, 즉 식물내로 재조합 핵산분자를 도입하고, 식물내에서 발현함으로써 부분적으로 진보되어왔다. 상기 접근방식은 한 식물종에 국한되는 것이 아니라 다른 식물종으로 전가될 수 있다는 장점을 가진다. 유럽특허 EP-A 0 511 979에는 식물세포내에서 원핵세포 아스파라긴 합성효소를 발현시키는 것, 특히 생체중량을 증가시키는 것이 기술되어 있다.
WO 96/21737에는 광합성 속도를 증가시키는, 규제되거나 또는 무질서한 프룩토스-1,6-비스포스파타아제의 발현에 의해 생산량이 증가된 식물을 제조하는 것이 기술되어 있다.
그럼에도 불구하고, 농업 또는 임업에서 식물 생산량을 증가시키기 위해 일반적으로 적용되는 방법이 여전히 필요하다.
따라서, 본 발명의 기본적인 문제는 식물 생산량을 증가시키기 위한 방법을 추가로 제공하는 것이다.
상기 문제는 본 발명의 청구의 범위내에 특징화된 구체예를 제공함으로써 본 발명에 따라 해결된다.
그러므로, 본 발명은 식물 생산량을 증가시키기 위한 방법에 관한 것으로서,
(a)반세포내에서 특이적으로 전사하는 영역; 및 그에 조작가능하게 결합되는
(b)(ⅰ)수크로스를 제거하는 효소활성을 갖는 단백질;
(ⅱ)수크로스 운반체;
(ⅲ)식물세포의 원형질막에 존재하는 양성자구배를 자극하는 활성을 갖는 단백질; 및
(ⅳ)시트르산염 신타아제(E.C.4.1.3.7)로 구성된 군에서 선택되는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성되고, 식물의 게놈에 안정하게 통합되는 재조합 DNA 분자가 발현되는 것을 특징으로 한다.
식물의 체관부에서 특이적으로 상기 단백질을 발현시키면 생산량이 극적으로 증가된다는 것을 알았다.
"생산량 증가"라는 용어는 식물의 생체중으로 측정된 경우, 생물량 생성을 증가시키는 것을 의미한다. 상기 생산량 증가는 식물의 소위 "수용부위(sink)" 기관을 의미하는 것이 바람직하며, 이는 광합성동안 생성된 광합성 산물을 흡수하는 기관이다. 특히 바람직한 것은 종자, 과실, 저장뿌리, 뿌리, 괴경, 꽃, 눈, 새 가지, 줄기 또는 목재와 같이 수확될 수 있는 식물의 일부이다. 본 발명에 따른 생산량 증가율은 같은 조건하에서 재배될 경우, 같은 유전자형의 비형질전환 식물에 비해 생물량에 대해 적어도 3%, 바람직하게 적어도 10% 및 특히 바람직하게 적어도 20%이다.
상기 단백질은 보통 체관부에서 발현되는 경우 그들의 생물학적 활성이 광합성 산물의 체관부로의 축적율을 증가시킨다.
본 발명의 명세서에서, 광합성 산물은 당 및/또는 아미노산으로 이해된다.
본 발명에 따라, (b)에 언급된 뉴클레오티드 서열은 보통 진균류 또는 동물 유기체로부터 기원하는 단백질 또는 세균성 단백질 또는 식물 단백질을 코딩할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 특히 솔라늄 튜베로숨(Solanum tuberosum), 바람직하게 솔라늄 튜베로숨의 괴경에서 발현된 수크로스 신타아제(E.C. 2.4.1.13), 바람직하게 식물 수크로스 신타아제를 코딩한다. 상기 서열은 예를 들어, 살라노우배트 및 벨리아드(Salanoubat and Belliard)의 (Gene 60(1987), 47-56)에 기술되어 있으며, 접수번호 X67125로 EMBL 유전자은행에서 사용할 수 있다.
추가의 바람직하게 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 수크로스 포스포릴라아제(E.C.2.4.1.7)를 코딩한다.
수크로스 포스포릴라아제를 코딩하는 서열은 예를 들어, WO 96/24679에 공지되어 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 인버타아제(E.C.3.2.1.26), 바람직하게 미생물의 인버타아제, 특히 속 사카로마이세스(Saccharomyces) 진균류, 바람직하게 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)의 인버타아제를 코딩한다. 특히, 바람직한 것은 세포질 인버타아제를 코딩하는 서열이다(손네발트(Sonnewald) 외 다수, Plant J. 1(1991), 95-106).
본 발명에 따라, 수크로스 운반체는 식물계내 수크로스를 막을 통과해 운반하는 운반체로 이해된다. 상기 운반체는 식물에서 유래한 것이 바람직하다(예를 들어, EMBL 유전자은행 접수번호 G21319). 특히 바람직한 (b)의 서열은 특히, 리이스마이어 외 다수의 (EMBO J. 11(1992), 4705-4713)에 기술된 바와 같이 클론 SoSUT1의 서열을 갖는 시금치(스피나시아 올레라세아(Spinacia oleracea))에서 수크로스 운반체를 코딩한다.
다른 바람직한 구체예에서, 원형질막에 존재하는 양성자 구배를 자극하는 단백질은 양성자 ATP아제(ATPase)이다.
상기 경우, (b)에 기술된 서열은 미생물, 특히 속 사카로마이세스의 진균류, 바람직하게 사카로마이세스 세레비지애의 단백질을 코딩한다.
특히 바람직한 구체예에서, 상기 서열은 사카로마이세스 세레비지애로부터 양성자 ATP아제 PMA1(세라노(Serrano)외 다수, Nature 319 (1986), 689-693; EMBL 유전자은행), 또는 3'말단에서 절단된 사카로마이세스 세레비지애로부터 상기 양성자 ATP아제의 변형물, 특히 본 발명의 실시예 3에 기술된 바와 같은 ATP아제 ΔPAM1을 코딩한다.
선택적으로, 뉴클레오티드 서열은 또한 식물로부터 양성자 ATP아제, 바람직하게 솔라늄 튜버로섬으로부터 양성자 ATP아제를 코딩할 수 있다.
특히 바람직한 것은 감자로부터 양성자 ATP아제 PHA2(함스(Harms)외 다수, Plant Mol.Biol. 26(1994), 979-988; EMBL 유전자은행 X76535), 또는 3'말단에서 절단된 감자로부터 상기 양성자 ATP아제의 변형물, 특히 본 발명의 실시예 4에 기술된 바와 같은 ATP아제 ΔPHA2를 코딩하는 서열이다.
본 발명에 따라, 시트르산염 신타아제는 특정 시트르산염 신타아제, 예를 들어, 세균, 진균류, 동물 또는 식물로부터의 시트르산염 신타아제일 수 있다. 시트르산염 신타아제를 코딩하는 DNA 서열은 공지되어 있으며, 그 예로는 바실루스 수브틸리스(Bacillus subtilis)(U05256 및 U05257), 대장균(E. coli)(V01501), 알. 프로바제키(R. prowazekii)(M17149), 피. 아에루기노사(P. aeruginosa)(M29728), 에이. 아니트라튬(A. anitratum)(M33037)(쉔델(Schendel)외 다수, Appl. Environ. Microbiol. 58 (1992), 335-345 및 그의 인용문헌), 할로페락스 볼카니(Haloferax volcanii)(제임스(James)외 다수, Biochem. Soc. Trans. 20 (1992), 12), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)(Z17455)(운거(Unger)외 다수, Plant Mol. Biol. 13 (1989), 411-418), 비. 코아굴란스(B. coagulans)(M74818), 시. 부르네티(C. burnetti)(M36338)(하인첸(Heinzen)외 다수, Gene 109 (1990), 63-69), 엠. 스메그마티스(M. Smegmatis)(X60513), 티. 아시도필룸(T. acidophilum)(X55282), 티. 터모필라(T. thermophila)(D90117), 피그(pig)(M21197)(블록삼(Bloxham)외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 5381-5385), 엔. 크랏사(N. crassa)(M84187)(페레아(Ferea)외 다수, Mol. Gen. Genet. 242 (1994), 105-110), 에스. 세레비지애(S. cerevisiae)(Z11113, Z23259, M14686, M54982, X00782)(수잇사(Suissa)외 다수, EMBO J. 3(1984), 1773-1781) 및 감자(EP 95 91 3066.7)가 있다.
괄호 안의 숫자는 GenEMBL 데이터 베이스내 해당 접수번호이다.
본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열은 미생물, 특히 식물, 진균류, 세균 또는 동물로부터 적당한 단백질을 코딩할 수 있다. 상기 서열은 바람직하게 식물 또는 진균류로부터 단백질을 코딩한다. 식물은 고급식물, 특히 전분 또는 오일저장에 유용한 식물, 예를 들어 감자 또는 곡류, 가령 벼, 옥수수, 밀, 보리, 호밀, 라이밀, 귀리, 수수 등 뿐만 아니라 시금치, 담배, 사탕무, 콩, 무명 등이 바람직하다.
진균류로는 속 사카로마이세스 (Saccharomyces), 쉬조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 아스퍼질러스(Aspergillus) 또는 뉴로스포라(Neurospora), 특히 사카로마이세스 세레비지애, 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 또는 뉴로스포라 크랏사(Neurospora crassa)가 바람직하다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예에서, 반세포 특이전사를 보장하는 (a)에서 언급된 영역은 아그로박테리움 리조진(Agrobacterium rhizogenes)로부터의 rolC 유전자의 프로모터이다.
상기 프로모터는 예를 들어, 쉬뮐링(Schmuelling)외 다수의 (Plant Cell (1989), 665-671) 및 퀸(Kuen)의 (솔라나세아(Solanaceae)내 수크로스 운반체 SUT1의 특징화 및 정좌, Doctoral Thesis (1991), Freie Universitaet Berlin, biology department)에 기술되어 있다. 서열번호 1에 기술된 뉴클레오티드 서열을 가지는 프로모터 영역이 사용되는 것이 바람직하다.
상기 언급된 rolC 프로모터와 달리, 당업자는 반세포 특이발현을 위한 다른 프로모터를 쉽게 사용할 수 있다. 아라비돕시스 탈리아나로부터의 수크로스 운반체의 프로모터와 같은 다른 반세포 특이 프로모터는 문헌에 기재되어 있다(Truernit and Sauer, Planta 196 (1995), 564-570).
그리고, 다른 RNA 및 단백질에 대해 반세포내 그들의 특정 발생도는 문헌(예를 들어, 폴레이(Foley)외 다수, Plant Mol. Biol. 30(1996), 687-695; DeWitt, Plant J. 1(1991), 121-128; 스테들러(Stadler)외 다수, Plant Cell 7 (1995), 1545-1554 참조)에 기술되어 있다. 공지된 단백질로부터 출발하여, 당업자들은 항체에 의해, 또는 아미노산 서열로부터 유도된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 cDNA를 쉽게 분리할 수 있다(예를 들어, 삼부룩크(Sambrook)외 다수, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Cold Spring Harbor, NY 참조). 상기 방법에서 얻은 cDNA로부터 출발하여, 해당 유기체로부터 형성된 게놈 라이브러리를 분별하고, 게놈 단편을 식별할 수 있다. cDNA의 뉴클레오티드 서열과 게놈 클론의 뉴클레오티드 서열을 비교함으로써 프로모터의 위치를 대략 결정할 수 있다. 프로모터의 특이성은 프로모터 및 지시유전자, 가령 β-글루쿠로니다아제로 구성된 키메라 유전자를 사용하여 유전자도입 위치내에서 다양할 수 있다(예를 들어, 커트분디트(Kertbundit)외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 5212-5216 참조).
본 발명에 따른 방법은 본래 어느 식물에나 적용될 수 있다. 그러므로, 단자엽식물종 뿐만 아니라 쌍자엽식물종이 특히 적합하다. 상기 방법은 농업, 원예학 및/또는 임업에 흥미있는 식물과 함께 사용하는 것이 바람직하다.
그의 예로는 채소용 식물 가령, 오이, 메론, 호박, 에그 식물, 주키니, 토마토, 시금치, 양배추 종류, 완두콩, 콩 등 뿐만 아니라 과일, 가령 배, 사과 등이 있다.
그리고, 오일저장식물은 가령, 예를 들어 평지, 해바라기, 콩이 적합하다. 특히 바람직한 구체예에서, 전분저장식물은 특히 곡류(벼, 옥수수, 밀, 호밀, 귀리, 라이밀, 수수, 보리), 감자, 카사바, 고구마 등이 적합하다.
상기 방법은 또한 수크로스 저장식물, 가령 예를 들어 사탕무 및 사탕수수 뿐만 아니라 기타 유용한 식물, 가령 예를 들어 무명, 담배, 목재류, 와인, 호프 등에 적용될 수 있다.
본 발명은 또한,
(a)식물 반세포내에서 특이적으로 전사하는 영역; 및 그에 조작가능하게 결합되는
(b)(ⅰ)수크로스 신타아제;
(ⅱ)수크로스 포스포릴라아제;
(ⅲ)수크로스 운반체;
(ⅳ)식물세포의 원형질막에 존재하는 양성자 구배를 자극하는 활성을 갖는 단백질; 및
(ⅴ)시트르산염 신타아제로 구성된 군에서 선택되는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산분자에 관한 것이다.
상기 분자의 바람직한 구체예에 관해, 본 발명의 방법과 연관되어 상기 이미 언급된 (a)에서 언급된 영역 및 (b)에서 언급된 뉴클레오티드 서열에 같이 적용한다.
본 발명은 또한, 식물세포의 형질전환 뿐만 아니라 외부 DNA를 식물 게놈으로 통합하는데 적합한, 본 발명의 핵산분자를 함유하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 핵산분자로 형질전환되고, 게놈내에 안정하게 통합된 상기 분자를 함유하는 식물세포에 관한 것이다. 상기 세포들은 자연발생되지 않는 위치에서 본 발명의 핵산분자가 세포의 세놈내에 통합된다는 점에서 자연발생되는 식물세포와 다르다.
본 발명은 또한, 같은 조건하에서 재배된 대응하는 비-형질전환 식물과 비교했을때 증가된 생산량을 나타내는, 식물 반세포내 게놈으로 통합된 재조합 핵산분자의 발현을 야기하고, 본 발명의 식물세포를 함유하는 유전자도입 식물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 상기 식물세포를 함유하는 본 발명의 식물의 번식물질에 관한 것이다. "번식물질"이라는 용어는 특히 종자, 과실, 괴경, 지하경, 농작물, 칼리, 세포 배양물 등을 포함한다.
마지막으로, 본 발명은 식물 반세포내에 특이적으로 전사하는 영역; 및 그에 조작가능하게 결합되는, (ⅰ)수크로스를 제거하는 효소활성을 갖는 단백질; (ⅱ)수크로스 운반체; (ⅲ)원형질막에 존재하는 양성자구배를 자극하는 활성을 갖는 단백질; 및 (ⅳ)시트르산염 신타아제로 구성된 군에서 선택되는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 생산량을 증가시키기 위한 유전자도입 식물내 발현을 위해 재조합 핵산분자를 사용하는 것에 관한 것이다.
코딩된 단백질은 상기 부연설명된 단백질인 것이 바람직하다.
단자엽식물 및 쌍자엽식물의 형질전환방법은 당 분야에 보통의 기술을 가진 사람들에게 공지되어 있다.
식물 숙주세포에 DNA를 도입하기 위해, 여러가지 기술이 사용될 수 있다. 상기 기술들은 형질전환 수단으로서 아그로박테리움 튬파시엔스 또는 아그로박테리움 리조진을 사용하여 식물세포를 T-DNA로 형질전환하는 기술, 원형질체를 융합시키는 기술, 주입기술, DNA를 전기천공하는 기술, 생분해방법 뿐만 아니라 다른 가능한 방법에 의한 DNA의 도입기술을 포함한다.
식물세포내에 DNA를 주입 및 전기천공하기 위해, 플라스미드는 특정 요건을 만족시킬 필요가 없다. pUC와 같은 간단한 플라스미드가 사용될 수 있다. 식물세포를 형질전환하기 위해 아그로박테리아를 사용하는 것은 유럽특허 EP-A 120 516, 호케마(Hoekema)의 (In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V), 프랄레이(Fraley)외 다수의 (Crit. Rev. Plant. Sci. 4, 1-46) 및 안(An)외 다수의 (EMBO J. 4(1985), 277-287)에서 시험되고 충분히 개시되어 있다.
식물세포에 DNA를 전달하기 위해, 식물이식편은 아그로박테리움 튬파시엔스 또는 아그로박테리움 리조진과 공동배양될 수 있다. 감염식물체(예를 들어, 잎 이식편, 줄기 단편, 뿌리 뿐만 아니라 원형질체 또는 식물세포가 배양된 현탁액)로부터, 전체 식물은 형질전환된 세포를 선별하기 위한 항생물질 또는 바이오지드를 함유하는 적당한 배지내에서 재생될 수 있다. 상기 방법에서 얻은 식물은 도입된 DNA의 존재하에서 시험될 수 있다. 생분해방법 또는 원형질체 형질전환법을 사용하여 외부 DNA를 도입하는 다른 가능한 방법들은 공지되어 있다(예를 들어, Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In:Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Puehler, P. Stadler, eds), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge 참조).
아그로박테리움 튬파시엔스에 의해 Ti-플라스미드-벡터 시스템을 통해 쌍자엽식물을 형질전환하는 기술은 잘 정립되어 있다. 최근의 연구에서는 또한 단자엽식물들이 아그로박테리움계 벡터에 의해 형질전환될 수 있다는 사실을 알았다(찬(Chan) 외 다수, Plant Mol. Biol. 22(1993), 491-506; 히에이(Hiei) 외 다수, Plant J. 6 (1994), 271-282; 뎅(Deng) 외 다수, Science in China 33(1990), 28-34; 윌밍크(Wilmink) 외 다수, Plant Cell Reports 11 (1992), 76-80; 메이(May) 외 다수, Bio/Technology 13 (1995), 486-492; Conner and Domisse; Int. J. Plant Sci. 153 (1992), 550-555; 릿치(Ritchie) 외 다수, Transgenic Res. 2 (1993), 252-265).
단자엽식물을 형질전환하기 위한 선택적인 시스템은 생분해방법에 의한 형질전환(Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104 (1994), 37-48; 바실(Vasil) 외 다수, Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; 리탈라(Ritala) 외 다수, Plant Mol. Biol. 24 (1994), 317-325; 스펜서(Spencer) 외 다수, Theor. Appl. Genet. 79 (1990), 625-631), 원형질체 형질전환, 일부 유동화처리된 세포의 전기천공법 뿐만 아니라 유리섬유에 의한 DNA의 도입이다.
특히, 옥수수의 형질전환은 문헌에 수차례 기재되어 있다(예를 들어, WO95/06128, EP 0 513 849; EP 0 465 875; 프롬(Fromm)외 다수, Biotechnology 8 (1990), 833-844; 고돈-캄(Gordon-Kamm)외 다수, Plant Cell 2 (1990), 603-618; 코지엘(Koziel)외 다수, Biotechnology 11 (1993), 194-200 참조). 유럽특허 EP 292 435 및 쉴리토(Shillito)외 다수의 (Bio/Technology 7 (1989), 581)에 기재된 방법에 의해 점액-자유 연질의 (부서지기 쉬운) 옥수수 칼러스로부터 출발하여, 임성식물이 얻어질 수 있다. 프리올리(Prioli) 및 쇤달(Soendahl)의 (Bio/Technology 7 (1989), 589)에는 카테토(Cateto) 옥수수 근친교계 캐트(Cat) 100-1의 옥수수 원형질체로부터 임성식물을 재생하고, 얻는 것이 기술되어 있다.
다른 곡류 종의 성공적인 형질전환은 또한 예를 들어, 보리(Wan and Lemaux, 상기 참조; Ritala외 다수, 상기 참조) 및 밀(Nehra외 다수, Plant J. 5(1994), 285-297)에 대해서 개시되어 있다.
도입된 DNA가 식물세포 게놈내에 일단 통합되면, 보통 그것은 안정하며, 원래 형질전환된 세포의 후손에도 또한 포함되어 있다. 보통, 상기는 카나마이신, G 418, 블레오마이신, 히그로마이신 또는 포스피노트리신 등과 같은 항생물질 또는 바이오지드에 내성인 형질전환 식물세포를 형성하는 선별마커를 함유한다. 그러므로 각각 선택된 마커는 DNA가 도입되지 않은 세포로부터 형질전환 세포를 선별하여야 한다.
형질전환세포는 통상의 방법으로 식물내에서 성장한다(또한, McCormick외 다수, Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84 참조). 얻어진 식물은 정상적으로 재배될 수 있다. 종자들은 식물로부터 얻어질 수 있다.
둘 또는 그이상의 세대는 표현형질이 안정하게 유지되고, 전수되는지를 확인시키기 위해 재배되어야 한다. 종자들은 해당 표현형질 또는 기타 특성들이 유지되는지를 확인시키기 위해 수확되어야 한다.
도 1은 플라스미드 pBinRolC-SS의 구조물을 도시한 것이다.
도 2a는 RolC-SS 구조물로 형질전환된 유전자도입 감자식물의 잎내 수크로스 신타아제(SS) 활성을 분석한 것을 나타내며, 효소활성은 츠레너(Zrenner)외 다수의 (Plant J. 7 (1995), 97-107)에 따라 측정되었으며, 활성은 헥소스 당량(μmol)/(분×생체중(g))으로 나타낸다. 컬럼은 유전자형마다 세개의 샘플의 평균값을 나타낸다. 표준편차도 또한 나타낸다.
도 2b는 RolC-SS 구조물로 형질전환된 유전자도입 감자식물의 괴경 생산량을 분석한 것을 나타내며, 컬럼은 유전자형마다 10 내지 15개의 식물의 평균값을 나타내며, 표준편차도 또한 나타내고, 괴경 생산량은 생체중(g)으로 표현한다.
도 2c는 RolC-SS 구조물로 형질전환된 유전자도입 감자식물의 괴경 전분을 분석한 것을 나타내며, 상기 목적을 위해 유전자형마다 10 내지 15개의 식물에서 수확된 괴경을 수집하고, 괴경의 전분함량을 폰 쉴레(Von Scheele)외 다수의 (Landw. Vers. Sta. 127 (1937), 67-96)에 따라 측정하였다.
도 3은 플라스미드 pBinRolC-Suc2의 구조물을 도시한 것이다.
도 4는 플라스미드 pBinRolC-ΔPMA1의 구조물을 도시한 것이다.
도 5는 ΔPMA1의 클로닝 계획을 도시한 것이며,
단계 A-B:
기질로서 PMA1 cDNA와, 상보적인 내부 프라이머(A)와 함께 PCR을 통해 3' 말단에서 절단된 H+-ATP아제 ΔPMA1을 증폭하였다. 대응하게 합성되는 프라이머를 통해 PCR 생성물(B)의 플랭킹(flanking) 제거위치를 도입하였다.
단계 B-C:
Pstl/Notl 소화시키고, Pstl/Notl 제거위치(C)를 통해 대장균 벡터 SK-로 PCR 단편을 클로닝함.
단계 C-D:
플라스미드 SK-ΔPMA1을 Bcll/Spel 소화시키고, 단편을 pBinRolC(D)의 적합한 BamHl/Xbal 제거위치로 클로닝함.
도 6은 rolC-ΔPMA2 구조물로 형질전환하여 얻은 유전자도입 식물의 게놈내에 ΔPMA1이 안정하게 통합하는 것을 보여주는 특정 올리고뉴클레오티드와의 중합화효소 연쇄반응의 결과를 나타낸다. PCR 생성물의 크기=730bp; WT=야생형; M=마커.
도 7은 플라스미드 pBinRolC-ΔPHA2의 구조물을 도시한 것이다.
도 8은 ΔPHA2의 클로닝 계획을 도시한 것이다.
단계 A-B:
기질로서 PHA2 cDNA와, 상보적인 내부 프라이머(A)와 함께 PCR을 통해 3' 말단에서 절단된 H+-ATP아제 ΔPHA2를 증폭하였다. 대응하게 합성되는 프라이머를 통해 PCR 생성물(B)의 플랭킹 제거위치를 도입하였다.
단계 B-C:
Pstl/EcoRl 소화시키고, Pstl/EcoRl 제거위치(C)를 통해 대장균 벡터 SK-로 PCR 단편을 클로닝함.
단계 C-D:
플라스미드 SK-ΔPHA2를 Bglll/Spel 소화시키고, 단편을 pBinRolC(D)의 적합한 BamHl/Xbal 제거위치로 클로닝함.
도 9는 rolC-ΔPHA2 구조물로 형질전환하여 얻어진 유전자도입 식물의 게놈내에 ΔPHA2가 안정하게 통합하는 것을 보여주는 특정 올리고뉴클레오티드와의 중합화효소 연쇄반응 결과를 나타낸다. PCR 생성물의 크기=758bp; WT=야생형; M=마커.
도 10은 플라스미드 pBinRolC-SoSUT1의 구조물을 도시한 것이다.
도 11은 플라스미드 pBinRolC-CiSy의 구조물을 도시한 것이다.
도 12는 유관속조직이 풍부한 접목된 감자식물의 괴경의 유조직 샘플내 수크로스 함량을 측정한 결과를 나타낸다. 접목하는데 사용되는 유전자형은 계통 RolC-Suc2-#25(세포질 인버타아제) 및 야생형 솔라늄 튜베로숨 var. Desiree이다. 수크로서 함량은 스팃트(Stitt)외 다수의 (Methods Enzymol. 174 (1989), 518-522)에 따라 측정하였다. 컬럼은 접목형마다 12개의 샘플의 평균값을 나타낸다. 표준편차도 나타나 있다. 수크로스 함량은 헥소스 당량(μmol)/생체중(g)으로 나타낸다.
도 13은 14CO2대기에서 6시간동안 빛의 존재하에 둔 ΔPMA1 잎의 체관부 삼출물을 분석한 것을 나타낸다. 수크로스 함량은 스팃트외 다수의 상기 인용문에 따라 측정하였다. 컬럼은 유전자형마다 4개 내지 5개의 샘플의 평균값을 나타낸다. 표준편차도 나타나 있다.
도 14는 ΔPMA1 식물의 괴경 생산량(생체중(g))을 나타낸다. 컬럼은 유전자형마다 6개의 식물의 평균값을 나타낸다. 표준편차도 나타나 있다. 괴경 생산량은 생체중(g)으로 나타낸다.
도 15는 ΔPHA2 식물의 괴경 생산량(생체중(g))을 나타낸다. 컬럼은 유전자형마다 4개 내지 5개의 식물의 평균값을 나타낸다. 표준편차도 나타나 있다. 괴경 생산량은 생체중(g)으로 표현한다.
하기 실시예는 본 발명을 상술한다.
실시예 1
플라스미드 pBinRolC-SS의 제조 및 유전자도입 감자식물의 제조
플라스미드 pBinRolC-SS는 이진벡터 pBin19내에 3개의 단편 A, B 및 C를 함유한다(Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711)(도 1 참조).
단편 A는 아그로박테리움 리조진의 rolC 프로모터로 구성되어 있다. 상기 rolC 프로모터는 1138bp의 EcoRI/Asp718 DNA 단편(Lerchl외 다수, Plant Cell 7 (1995), 259-270)으로서 아그로박테리움 리조진으로부터의 Ri-아그로핀-형 플라스미드의 TL-DNA(Slightom외 다수, J. Biol. Chem. 261 (1986), 108-121)중 DNA 영역(위치: 11306 내지 위치 12432)을 포함한다. 상기 단편A는 pBin19의 폴리링커의 EcoRI 및 Asp718 제거위치에 삽입된다.
단편 B는 솔라늄 투베로숨으로부터의 수크로스 신타아제(SS)의 cDNA중 코딩영역(위치: 76 내지 위치 2493)을 포함한다(Salanoubat 및 Belliard, Gene 60 (1987), 47-56). 단편 B는 벡터 pBluescript SK-로부터 2427bp의 BamHI 단편으로서 얻어졌으며, 여기서 이는 폴리링커의 BamHI 제거위치에 삽입된다. 단편 B는 벡터 pBin19내 센스배향으로 BamHI 제거위치에, 즉 해독가능한 RNA를 전사하는 배향으로 rolC 프로모터의 하류에 삽입되었다.
단편 C는 Ti 플라스미드 pTiACH 5의 T-DNA중 Gene 3의 폴리아데닐화 시그널(기엘렌(Gielen)외 다수, EMBO J. 3 (1984), 835-846), 특히 뉴클레오티드 11749-11939를 포함하며, 이는 플라스미드 pAGV 40으로부터 PvuII/HindIII 단편으로 분리되었으며(헤레라-에스트렐라(Herrera-Estrella)외 다수, Nature 303 (1983), 209-213), SphI를 첨가할때 pBin19의 폴리링커중 SphI와 HindIII 제거위치 사이의 PvuII 제거위치로 링커가 클론되었다.
결과 플라스미드 pBinRolC-SS는 아그로박테리움 튬파시엔스에 의해 매개된 유전자 전달을 통해 감자 식물세포로 도입되었다. 상기 목적을 위해, 선별재배된 아그로박테리움 튬파시엔스 하루 배양물 50㎕을 함유하는 2% 수크로스를 갖는 10㎖ MS 배지(Murashige and Skoog, Physiol. Plant. 15 (1962), 473)에 스칼펠로 손상입힌 감자 멸균배양물의 10개의 작은 잎(솔라늄 튜베로숨 L. cv. Desiree)을 넣었다. 3 내지 5분 조심스럽게 진탕한후, 암실에서 2일동안 추가로 배양하였다. 그후, 1.6% 글루코스, 나프틸 아세트산 5㎎/ℓ, 벤질아미노퓨린 0.2㎎/ℓ, 클라포란 250㎎/ℓ, 카나마이신 50㎎/ℓ 및 칼러스 유도용 0.8% 박토-아가가 함유된 MS 배지상에 상기 잎을 넣었다. 25℃ 및 3000룩스에서 1주일동안 배양한후, 1.6% 글루코스, 제아틴 리보스 1.4㎎/ℓ, 나프틸 아세트산 20㎍/ℓ, 지베렐산 20㎍/ℓ, 클라포란 250㎎/ℓ, 카나마이신 50㎎/ℓ 및 0.8% 박토-아가가 함유된 MS 배지상에 상기 잎을 넣었다.
상기 벡터 시스템으로 형질전환된 여러 식물의 잎을 분석한 결과는 수크로스 신타아제 활성이 증가됨을 분명하게 입증하였다. 이는 pBinRolC-SS내에 함유된 감자로부터의 수크로스 신타아제 유전자를 발현한 결과이다(도 2a 참조).
상기 벡터시스템으로 형질전환된 식물의 괴경 생산량(괴경 생체중(g))을 분석한 결과는 괴경 생산량이 증가되었음을 분명하게 보여주는 증가된 수크로스 신타아제 활성을 나타낸다. 이는 또한 pBinRolC-SS내에 함유된 감자로부터의 수크로스 신타아제 유전자를 발현한 결과이다(도 2b 참조).
감자 괴경의 전분함량은 괴경의 밀도에 선형비례한다(Von Scheele외 다수, Landw. Vers. Sta. 127 (1937), 67-96). 증가된 수크로스 신타아제 활성을 갖는 벡터시스템 pBinRolC-SS로 형질전환된 식물의 유전자도입 괴경의 밀도분석은 전분함량이 증가되었음을 보여준다. 이는 pBinRolC-SS내에 함유된 감자로부터의 수크로스 신타아제 유전자를 발현한 결과이다(도 2c 참조).
실시예 2
플라스미드 pBinRolC-Suc2의 제조 및 유전자도입 감자식물의 제조
플라스미드 pBinRolC-Suc2는 이진벡터 pBin19내에 3개의 단편 A, B 및 C를 함유하며(Bevan, 인용문헌), 도 3에 도시되어 있다.
단편 A 및 C는 실시예 1에 기술되어 있는 단편 A 및 C에 대응한다.
단편 B는 효모(사카로마이세스 세레비지애)로부터 세포질 인버타아제의 유전자중 코딩영역(위치: 845 내지 위치:2384)을 포함한다. 단편 B는 폴리링커중 BamHI 제거위치내에 삽입되는 벡터 pBluescript SK-로부터 1548bp의 길이를 갖는 BamHI 단편으로서 얻어진다. 단편 B는 BamHI 제거위치에서 pBin19내로 센스 배향으로 삽입된다.
플라스미드 pBinRolC-Suc2는 아그로박테리움에 의해 매개된 유전자 전달을 통해 감자식물세포로 도입되었다. 전체 식물은 형질전환세포로부터 재생되었다. 상기 식물은 형질전환되지 않은 식물에 비해 증가된 생산량(증가된 생물량)을 나타낸다.
실시예 3
플라스미드 pBinRolC-ΔPMA1의 제조 및 유전자도입 감자식물의 제조
플라스미드 pBinRolC-ΔPMA1은 이진벡터 pBin19내에 3개의 단편 A, B 및 C를 함유하며(Bevan, 인용문헌), 도 4에 도시되어 있다.
단편 A 및 C는 실시예 1에 기술된 단편 A 및 C에 대응한다.
단편 B는 효모 사카로마이세스 세레비지애로부터 양성자 ATP아제 PMA1의 유전자중 코딩영역(위치: 937 내지 위치: 3666)을 포함한다(세라노(Serrano)외 다수, Nature 319 (1986), 689-693). 단편 B는 중합화효소 연쇄반응(PCR)에 의해 얻어졌다. 상기를 위해, 유전자 PMA1중 코딩영역의 3' 말단이 27bp까지 절단되었으며, 동시에 필요한 새 정지코돈이 도입되었다. 상기 방법으로 변형된 DNA 단편은 ΔPMA1으로 불리운다. 단편 B는 2739bp의 길이를 갖는 BclI/SpeI 단편과 같이, 벡터 pBin19의 BamHI(BclI 제한위치에 대해 양립가능한 삽입위치) 및 XbaI(SpeI 제한위치에 대해 양립가능한 삽입위치) 제거위치에 센스배향으로 삽입되었다.
단편 B는 폴리링커중 제거위치 NotI 및 PstI을 통해 삽입되는 벡터 pBluescript SK-로부터 BclI/SpeI 단편으로 얻어졌다(도 5 참조).
플라스미드 pBinRolC-ΔPMA1은 아그로박테리움에 의해 매개된 유전자 전달을 통해 감자식물세포로 도입되었다. 전체식물은 형질전환세포로부터 재생되었다.
벡터시스템 pBinRolC-ΔPMA1을 사용하여 얻은 유전자도입 식물의 게놈내에 ΔPMA1을 안정하게 통합하는 것은 중합화효소 연쇄반응(PCR)에 의해 검출되었다(도 6 참조).
상기 형질전환된 식물은 형질전환되지 않은 식물에 비해 증가된 생산량(증가된 생물량)을 나타낸다(도 13 및 14 참조).
실시예 4
플라스미드 pBinRolC-ΔPHA2의 제조 및 유전자도입 감자식물의 제조
플라스미드 pBinRolC-ΔPHA2는 이진벡터 pBin19내에 3개의 단편 A, B 및 C를 함유하며(Bevan, 인용문헌), 도 7에 도시되어 있다.
단편 A 및 C는 실시예 1에 기술된 단편 A 및 C에 대응한다.
단편 B는 양성자-ATP아제 PHA2의 cDNA중 코딩영역(위치: 64 내지 위치: 2672)을 포함한다(함스(Harms)외 다수, Plant Mol. Biol. 26 (1994), 979-988). 단편 B는 중합화효소 연쇄반응(PCR)에 의해 얻어졌다. 상기를 위해, 유전자 PHA2중 코딩영역의 3' 말단은 249bp까지 절단되었으며, 동시에 2개의 새 정지코돈이 도입되었다. 상기 방법으로 변형된 DNA 단편은 ΔPHA2로 불리운다. 단편 B는 2631bp의 길이를 갖는 BglII/SpeI 단편으로서, 벡터 pBin19의 BamHI(BglII 제한위치에 대해 양립가능한 삽입위치) 및 XbaI(SpeI 제한위치에 대해 양립가능한 삽입위치) 제거위치에 센스배향으로 삽입되었다.
단편 B는 폴리링커 서열중 EcoRI 및 PstI 제거위치로 삽입되는 벡터 pBluescript SK-로부터 BglII/SpeI 단편으로서 얻어졌다(도 8 참조:ΔPHA2 클로닝계획).
플라스미드 pBinRolC-ΔPHA2는 아그로박테리움에 의해 매개된 유전자 전달을 통해 감자식물세포로 도입되었다. 전체식물은 형질전환세포로부터 재생되었다.
벡터시스템 pBinRolC-ΔPHA2를 사용하여 얻은 유전자도입 식물의 게놈내에 ΔPHA2를 안정하게 통합하는 것은 중합화효소 연쇄반응(PCR)에 의해 검출되었다(도 9 참조).
상기 형질전환된 식물은 형질전환되지 않은 식물에 비해 증가된 생산량(증가된 생물량)을 나타낸다(도 15 참조).
실시예 5
플라스미드 pBinRolC-SoSUT1의 제조 및 유전자도입 감자식물의 제조
플라스미드 pBinRolC-SoSUT1은 이진벡터 pBin19내에 3개의 단편 A, B 및 C를 함유하며(Bevan, 인용문헌), 도 10에 도시되어 있다.
단편 A 및 C는 실시예 1에 기술된 단편 A 및 C에 대응한다.
단편 B는 시금치(스피나시아 올레라세아)로부터 수크로스 운반체를 코딩하는 cDNA(위치 : 1 내지 위치 : 1969)를 포함한다(리이스마이어(Riesmeier)외 다수, EMBO J. 11 (1992), 4705-4713; 접수번호 X67125 및 S51273). 단편 B는 벡터 pBluescript SK-로부터 Notl 단편으로서 얻어졌으며, 이는 NotI 링커 서열을 통해 삽입된다. 벡터 pBin19중 SmaI 제거위치로 클로닝하기 위해, NotI 소화로부터 얻은 단편의 점착성 말단은 둔단(blunt end)으로 전환되며, pBin19에 센스배향으로 삽입된다. 결과 플라스미드는 pBinRolC-SoSUT1로 불리운다.
이는 아그로박테리움에 의해 매개된 유전자 전달을 통해 감자식물세포로 도입되었다. 전체식물은 형질전환세포로부터 재생되었다.
상기 방법으로 형질전환된 식물은 형질전환되지 않은 식물에 비해 증가된 생산량(증가된 생물량)을 나타낸다.
실시예 6
플라스미드 pBinRolC-CiSy의 제조 및 유전자도입 감자식물의 제조
플라스미드 pBinRolC-CiSy는 베커(Becker)의 (Nucl. Acids Res. 18 (1990), 203)에 따라 변형된 이진벡터 pBin19(Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711)내에 3개의 단편 A, B 및 C를 함유한다(도 11 참조).
단편 A는 아그로박테리움 리조진으로부터의 rolC 프로모터로 구성되어 있다. rolC 프로모터는 아그로박테리움 리조진으로부터 Ri-아그로핀형 플라스미드의 TL-DNA중 DNA 영역(위치 : 11306 내지 위치 : 12432)을 1143bp의 길이를 갖는 EcoRI/Asp718 DNA 단편(레르클(Lerchl)외 다수, The Plant Cell 7 (1995), 259-270)으로서 함유한다(슬라이톰(Slightom) 외 다수, J. Biol. Chem. 261 (1986), 108-121). 단편 A는 pBin19의 폴리링커중 EcoRI 및 Asp718 제거위치내에 삽입된다.
단편 B는 분열효모 사카로마이세스 세레비지애로부터 시트르산염 신타아제(CiSy)의 cDNA중 코딩영역을 포함한다. 단편 B는 벡터 pBluescript SK-로부터 1400bp의 길이를 갖는 BamHI 단편으로서 얻어졌으며, 이는 폴리링커의 BamHI 제거위치에 삽입된다(Landschutze, Studies on the influence of the acetyl-CoA synthesis and use in transgenic plants, Doctoral Thesis, Freie Universitat Berlin, (1985) D83/FB15 No.028).
단편 C는 Ti 플라스미드 pTiACH 5의 T-DNA중 유전자 3의 폴리아데닐화 시그널(기엘렌(Gielen)외 다수, EMBO J. 3 (1984), 835-846), 플라스미드 pAGV40으로부터 PvuII/HindIII 단편으로서 분리된 뉴클레오티드 11749-11939(헤레라-에스트렐라(Herrera-Estrella)외 다수, Nature 303 (1983), 209-213)를 포함하며, PvuII 제거위치에 SphI 링커를 첨가한후 pBin19의 폴리링커중 SphI 및 HindIII 제거위치 사이에서 클론되었다.
플라스미드 pBinRolC-CiSy는 약 13kb의 길이를 가진다.
플라스미드 pBinRolC-CiSy는 아그로박테리움 튬파시엔스에 의해 매개된 유전자 전달을 통해 감자식물에 삽입되었다. 전체 식물은 형질전환된 세포로부터 재생되었다.
상기 벡터시스템으로 형질전환된 여러 식물의 분석결과는 생물량이 증가되었음을 분명하게 보여주며, 이는 pBinRolC-CiSy내에 함유된 효모로부터 CiSy cDNA를 발현한 결과이다.
실시예 7
접목 실험
접목을 위해, 수용체 식물의 가지를 공여체 식물의 가지로 대체한다.
상기 실험에서, 유전자도입 식물의 가지(RolC-Suc2 #25)를 야생형 식물의 대목(솔라늄 튜베로숨, var. Desiree)상에 접목한다. 대조군 실험에서, 실험에 있어서의 배양차이를 알기 위해, 야생형 가지를 야생형 대목상에 접목한다(자동접목). 상기 실험의 목적은 유전자도입 가지의 광합성 산물 분포와 광합성 활성이 야생형 대목의 기관(이경우, 괴경)상에 미치는 영향을 조사하는 것이다. 감자식물은 조직배양액으로부터 토양으로 전달되며, 온실에 넣었다. 약 5주(이 단계에서 식물은 괴경형성을 유도하지 않음)후, 식물을 접목한다. 이를 위해, 필요없는 수용체 식물의 가지를 잘라버리고, 쐐기는 수용체 식물의 줄기로 자른다. 접목된 공여체 가지는 적당한 방법으로 줄기 끝에서 절단하고, 수용체 식물의 쐐기로 삽입한다. 접목자리는 접착테이프로 고정한다.
그후, 접목된 감자식물을 증가된 대기습도하에서 약 1주일동안 그늘에 둔다. 7일 내지 10일내에, 이들을 정상적인 온실조건에 점차적으로 적응시킨다. 상기 단계에서, 상기 식물을 7주간 둔다.
공여체 가지의 광합성 활성과 광합성 산물 분포가 접목된 식물의 대목에 영양분을 준다는 사실을 증명하기 위해, 수용체 식물의 모든 잎을 제거하고, 알루미늄 시트로 줄기를 덮어 빛으로부터 차단시켰다.
접목후 약 2개월후 및 토양에 심은후 약 3개월 후 감자 괴경이 수확될때까지 상기 식물을 온실에 두었다. 상기 접목실험의 결과는 도 12에 도시되어 있다.

Claims (15)

  1. 식물 생산량을 증가시키기 위한 방법에 있어서,
    재조합 DNA 분자는;
    (a)반세포내에서 특이적으로 전사하는 영역; 및 그에 조작가능하게 결합되는
    (b)(ⅰ)수크로스를 제거하는 효소활성을 갖는 단백질;
    (ⅱ)수크로스 운반체;
    (ⅲ)식물세포의 원형질막에 존재하는 양성자구배를 자극하는 활성을 갖는 단백질; 및
    (ⅳ)시트르산염 신타아제로 구성된 군에서 선택되는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 식물의 게놈에 안정하게 통합되는 재조합 DNA 분자가 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    뉴클레오티드 서열은 식물 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    뉴클레오티드 서열은 세균 또는 진균류로부터 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    뉴클레오티드 서열은 수크로스 신타아제, 수크로스 포스포릴라아제 및 인버타아제로 구성된 군에서 선택되는, 수크로스를 제거하는 효소활성을 갖는 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    뉴클레오티드 서열은 스피나시아 올레라세아로부터 수크로스 운반체를 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    뉴클레오티드 서열은 양성자 ATP아제를 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    뉴클레오티드 서열은 솔라늄 튜베로숨 또는 사카로마이세스 세레비지애로부터 양성자 ATP아제를 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a)에 언급된 영역은 아그로박테리움 리조진의 rolC 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. (a)식물 반세포내에서 특이적으로 전사하는 영역; 및 그에 조작가능하게 결합되는
    (b)(ⅰ)수크로스 신타아제;
    (ⅱ)수크로스 포스포릴라아제;
    (ⅲ)수크로스 운반체;
    (ⅳ)식물세포의 원형질막에 존재하는 양성자 구배를 자극하는 활성을 갖는 단백질; 및
    (ⅴ)시트르산염 신타아제로 구성된 군에서 선택되는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산분자.
  10. 제 9 항의 재조합 핵산분자를 포함하는 벡터.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 벡터는 식물세포의 형질전환 및 외부 DNA를 식물세놈에 통합시키는데 적합한 것을 특징으로 하는 벡터.
  12. 제 9 항의 재조합 핵산분자로 형질전환되고, 이를 함유하는 식물세포.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 식물은 식물 반세포내 재조합 핵산분자의 발현으로 인해 대응하는 비-형질전환 식물에 비해 증가된 생산량을 나타내는 것을 특징으로 하는 식물세포.
  14. 제 12 항의 식물세포를 함유하는 제 13 항의 식물의 번식물질.
  15. 식물 반세포내에서 특이적으로 전사하는 영역; 및 그에 조작가능하게 결합되는, (ⅰ)수크로스를 제거하는 효소활성을 갖는 단백질; (ⅱ)수크로스 운반체; (ⅲ)원형질막에 존재하는 양성자구배를 자극하는 활성을 갖는 단백질; 및 (ⅳ)시트르산염 신타아제로 구성된 군에서 선택되는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 핵산분자가 생산량을 증가시키기 위한 유전자도입 식물내 발현을 위해 사용되는 재조합 핵산분자의 용도.
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