KR20000036077A - 셀룰로스 분해 효소를 발현하는 트랜스젠 식물 - Google Patents

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한스 루돌프 하우스, 헨리테 브룬너, 베아트리체 귄터
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Abstract

본 발명은 유도성 트랜스액티베이터-매개된 시스템을 사용하여 색소체에서 유전자 발현을 조절하는 신규 방법 및 당해 신규 발현 시스템을 포함하는 식물을 제공한다. 또한, 본 발명은 유전자 조작 기술의 적용을 통한 식물에서의 셀룰로스-분해 효소의 생산을 기술하고 있다. 셀룰라제 암호화 서열을 식물에서 활성인 프로모터에 융합시키고, 핵의 게놈 및 엽록체 게놈으로 형질전환시킨다. 셀룰라제는 식물에 독성일 수 있기 때문에, 바람직한 프로모터는 화학적-유도성인 것들이다. 이러한 방식으로, 식물로 형질전환된 셀룰라제 유전자의 발현은 적절한 시점에 화학적으로 유도될 수 있다. 또한, 발현된 셀룰라제는 독성 문제를 완화시키기 위해 액포 또는 기타 세포 소기관으로 표적될 수 있다. 본 발명은 많은 공급량의 셀룰라제를 요하는 임의의 공업 공정에서 유용성을 발견할 수 있지만, 특히 셀룰로스 바이오매스 에탄올로의 변환에서 유용성을 발견할 수 있다.

Description

셀룰로스 분해 효소를 발현하는 트랜스젠 식물{transgenic plants expressing cellulolytic enzymes}
셀룰로스-분해 효소에 대한 산업적 용도
1. 바이오매스의 에탄올로의 변환
에탄올의 생산은 옥탄 촉진제(booster), 연료 증량제, 또는 순수 액체 연료로서 수년간 상당히 주목되어 왔다. 예를 들면, 브라질에서는, 새로운 자동차들의 90％까지 순수한 에탄올로 주행하는 반면, 나머지 차들은 에탄올/가솔린 혼합물로 주행한다. 미국에서는, 현재 시판되는 모든 가솔린의 약 7%가 에탄올을 함유하고, 통상적으로 90% 가솔린:10% 에탄올의 혼합물을 포함한다. 연료 에탄올은 현재 브라질에서 사탕수수로부터 주로 생산되고 있지만; 미국에서 당류 가격은 일반적으로 너무 비싸서 사탕수수를 에탄올 생산을 위한 공급 원료로서 매력적이지 않다. 미국에서, 연료 에탄올은 현재 옥수수 및 기타 전분이 풍부한 곡류로부터 주로 생산되고 있다. 그러나, 연간 10억 갤런의 에탄올의 생산은 연간 4억 부셀(bushel)의 옥수수에 상응하므로, 이는 현존하는 옥수수 에탄올 공업이 현재 연료 시장에 공급되기에 불충분함을 의미한다. 또한, 옥수수 에탄올은 현재 가솔린과 가격 경쟁을 하기에는 너무 고가이다. 수송 연료 시장에 현저한 영향력을 미치기 위해, 에탄올은 현재 이의 폐기시에 갖는 것보다 광범위하고 저렴한 자원 베이스를 필요로 한다. 셀룰로스 바이오매스는 저렴하고 풍부하기 때문에, 각종 상업적 공정으로부터 공급 원료로서 셀룰로스 바이오매스, 예를 들면 목재, 목초 및 폐기물 바이오매스를 이용하는 기술은 미국에서 대부분의 연료 시장 수요를 충족시키도록 자원 베이스를 확장시킬 수 있다.
육생 식물의 주성분은 2부류의 당 중합체, 셀룰로스 및 헤미셀룰로스이다. 셀룰로스 섬유는 줄기, 뿌리 및 잎의 전체 건조 중량의 4% 내지 50%를 포함한다. 이들 섬유는 헤미셀룰로스 및 페놀계 중합체의 매트릭스에 내포된다. 셀룰로스는 β-1,4-결합에 의해 결합된 6탄당, 주로 글루코스로 구성된 중합체이다. 헤미셀룰로스는 당의 중합체이지만, 당의 유형은 바이오매스의 기원에 따라 다양하다. 침엽수를 제외하고는, 5탄당 크실로스는 헤미셀룰로스의 주요 성분이다.
모든 에탄올 생산은 궁극적으로 당의 발효 공정을 포함하지만, 셀룰로스 바이오매스으로부터 에탄올을 생산하는 기술은 전분 식품 회사가 에탄올을 생산하는 것과는 근본적으로 상이하다. 두 기술 모두 공급 원료(전분 또는 셀룰로스)의 발효가능한 당으로의 가수분해를 요하지만, 전분이 가수분해되기 더 쉽고, 전분을 분해시키는 효소인 아밀라제가 비교적 저렴하다. 대조적으로, 셀룰로스 분해 효소 또는 "셀룰라제"는 현재 효과가 적고, 보다 고가이다. 셀룰로스 바이오매스 발효가능한 당으로의 가수분해는 산 가수분해 공정을 통해 발생할 수 있고, 이는 상세히 논의되지 않을 것이다. 셀룰라제는 산 가수분해에 비해 훨씬 더 완만한 조건 하에 셀룰로스를 이의 단순한 당 성분으로 분해시키는데 함께 작용하는 효소 부류이다. 또한, 이들 효소는 고도로 특이적인 반응을 촉매하고, 산 가수분해 반응에 비해 훨씬 더 적은 양을 요한다.
셀룰로스 및 전분의 가수분해는 하기 화학식에 따라 글루코스를 생산한다:
nC6H10O5+ nH2O → nC6H12O6
글루코스가 형성된 후, 에탄올로의 발효는 하기 반응식에 의해 처리된다:
C6H12O6→ 2CO2+ 2C2H5OH
침엽수 등의 리그노셀룰로스 바이오매스의 경우, 헤미셀룰로스 분획 역시 고려되어야 한다. 헤미셀룰로스 중에 5탄당 크실로스를 주로 함유하는 바이오매스의 경우, 가수분해 반응은 다음과 같이 진행된다:
nC5H8O4+ nH2O → nC5H10O5
반면, 생산된 크실로스는 하기 화학양론에 따라 에탄올로 발효된다:
C5H10O5→ 5CO2+ 5C2H5OH
2. 셀룰로스-분해 효소를 위한 기타 잠재적 용도
바이오매스를 에탄올로 변환시키는 데 사용하는 것 외에, 셀룰라제는 발효가능한 당의 공급에 의존하는 임의의 공업 공정 등의 기타 공업 공정에서 잠재적 용도를 갖는다. 셀룰라제는 수질 오염의 주요 원인인 산 가수분해에 대한 현재의 의존도를 감소시키기 위해 펄프 및 종이 공업 및 직물 공업에서 잠재적 용도를 역시 갖는다.
동물 사료 공업에서, 셀룰라제는 셀룰로스 물질의 분해를 돕는 사료 첨가제로서의 용도를 갖는다. 예를 들면, 목초는 셀룰라제 또는 셀룰라제를 발현시키는 식물을 첨가함으로써 잘 분해될 수 있다.
셀룰로스-분해 효소의 특성
상기한 바와 같이, 셀룰로스 및 헤미셀룰로스는 리그노셀룰로스 공급 원료에서 발효가능한 당의 주요 제공원이지만; 자연적으로 미생물 침입에 대한 효과적인 내성을 위한 목질 조직을 갖도록 설계되었다. 세균 및 진균을 포함하는 갖가지 광범위한 유기체는 셀룰로스 분해 활성을 갖는다. 효과적이기 위해, 셀룰로스-분해 미생물은, 상승적으로 작용하여 셀룰로스를 셀로비오스로 환원시키고, 이어서 글루코스로 환원시키는 다중 효소 활성을 특징으로 하는 셀룰라제 효소 시스템을 전형적으로 생산한다. 적어도 3개의 상이한 효소 활성이 이러한 작업을 수행하는데 요구된다. β-1,4-엔도뉴클레아제(EC 3.2.1.4, 엔도셀룰라제라고도 칭함)는 셀룰로스 쇄를 따라 무작위로 β-1,4-글리코시드 결합을 절단시키고, β-1,4-엑소글루카나제(EC 3.2.1.91, 셀로비오히드롤라제(CBH)라고도 칭함)는 셀룰로스 쇄의 환원 말단 또는 비환원 말단으로부터 셀로비오스를 절단시키고, 1,4-β-D-글루코시다제(EC 3.2.1.21, 셀로비오제라고도 칭함)는 아릴- 및 알킬-β-D-글루코시드를 가수분해시킨다.
선상 진균은 공업적 셀룰라제의 공급원으로서 공지되어 있다. 그러나, 이러한 공급원은 대규모의 공업적 에탄올 생산에는 너무 비싼 것으로서 일반적으로 간주된다. 세포외 셀룰라제의 가장 다량 생산자의 일부는 트리코모나스 리세이(Trichoderma reesei)의 각종 균주이다. 이와는 대조적으로, 셀룰라제는 선상 진균에 의해 훨씬 더 낮은 수준으로 터모모노스포라 푸스카(Thermomonospora fusca) 등의 셀룰로스 분해 세균에 의해 전형적으로 생산된다. 그러나, 터모모노스포라 푸스카(T. fusca) 및 다른 세균으로부터의 셀룰라제는 광범위한 pH 범위에 걸쳐 매우 고도의 특이적 활성을 갖고, 또한 바람직한 열 안정성을 갖는 것으로 나타났다. 셀룰로스-분해 효소를 암호화하는 터모모노스포라 푸스카(티. 푸스카) 유전자가 클로닝되었으며 광범위하게 특성화되었다[Collmer 등(1983) Bio/Technology 1:594-601; Ghangas 등(1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:2521-2526; 및 Wilson(1992) Crit, Rev. Biotechnol. 12:45-63 참조: 본 명세서에 참고 문헌으로서 인용함]. 또한, 터모모노스포라 푸스카(T. fusca)로부터 셀로비오히드롤라제 유전자 및 엔도글루카나제 유전자의 DNA 서열이 결정되었고[Jung 등(1993) Appl. Environ. Microbiol. 59:3032-3043 참조: 본 명세서에 참고 문헌으로서 인용함]; 터모모노스포라 푸스카(티. 푸스카)로부터 3개의 엔도글루카나제 유전자의 DNA 서열 역시 결정되었다[Lao 등(1991) J. Bacteriol, 173:3397-3407 참조: 본 명세서에 참고 문헌으로서 인용함].
현재, 바이오매스에서-에탄올로의 공정에 사용하기 위한 각종 셀룰라제를 생산하기 위해 재조합 셀룰라제-생산 세균 숙주 또는 진균 숙주를 이용하기 위한 노력이 경주되고 있다. 이러한 재조합 시스템에 사용될 후보 셀룰라제는 역학, 온도 및 pH 내성, 최종 생성물 억제에 대한 내성 및 이들의 상승 효과 등의 인자를 기초로 하여 선택된다[예를 들면, Thomas 등, "Initial Approaches to Artificial Cellulase Systems for Conversion of Biomass to Ethanol", Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates, J.N. Saddler 및 M.H. Penner, eds, ACS Symposium Series 618:208-36, 1995, American Chemical Society Washington, D.C., 본 명세서에 참고 문헌으로서 인용함]. 이. 콜리(E. coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus Subtilis), 스트렙토마이세스 리비단(Steptomyces lividans)에서 엔도글루카나제, 엑소글루카나제 및 β-D-글루코시다제의 이종성 발현의 예가 보고되고 있다[Lejeune 등, Biosynthesis and Biodgradation of Cellulose; Haigler, C.H.; Weiner, P.J., Eds., Marcel Dekker; New York, NY, 1990; 623-671페이지 참조: 본 명세서에 참고 문헌으로서 인용함]. 또한, 바실루스 서브틸리스(B. Subtilis) 엔도글루카나제 및 이. 콜리(E. coli)에서 C. fimi β-D-글루코시다제의 발현이 나타났다[Yoo 등, (1992) Biotechnol. Lett. 14:77-82 참조].
셀룰로스 바이오매스 분해를 위한 최적 비율로 고 수준의 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, 및 β-D-글루코시다제 활성을 생산하는 적절한 숙주에서 다중-유전자 발현 시스템을 개발하려는 연구가 진행되고 있지만, 이러한 연구의 최종 결과는 단순히, 종래의 바이오매스에서-에탄올로의 공정 뿐만 아니라 기타 공업적 분야에 사용하기 위해 높은 활성의 셀룰라제를 대량 생산하기 위한 개선된 생물 반응기일 수 있다. 따라서, 이러한 연구는 바이오매스이 외부 효소의 침입에 대해 천연적으로 내성이라는 사실을 포함하여, 상기와 같은 모든 발효 공정이 본래 갖는 종래의 문제점들로 제한된다.
이러한 문제점에 대한 현재 시도는 셀룰로스-분해 효소의 유전공학적으로 조작되는 생산에 의해 그 자신이 손상되지 않을 재조합 숙주를 사용하는 것으로 제한된다. 예를 들면, 그 자신이 셀룰로스를 자체 포함하지 않는 숙주들만이 이러한 생물 반응기에 사용하기에 적절한 것으로 기대된다. 따라서, 식물들은 재조합 셀룰라제 유전자에 적절한 숙주인 것으로 기대할 수 없다. 고 수준의 셀룰라제를 생산하기 위해 식물을 형질전환시키는 것은 직관에 반하는 것으로 특별한 기술적 난점을 나타낸다. 이러한 난점을 극복하기 위해, 매우 고 수준의 발현을 허용하는 새로운 발현 시스템을, 바람직하게는 이의 개발 중에 식물에 대한 손상을 방지하는 엄격한 조절 하에 개발할 필요가 있다. 이들 신규 발현 시스템은 셀룰라제 생산을 넘어서는 용도를 가질 수도 있다.
발명의 요약
제1 태양에서, 본 발명은 연료 에탄올 생산 공업, 가축 사료 공업, 종이 및 직물 공업과 같은 산업을 위한 셀룰로스-분해 효소의 풍부하고 저렴한 공급원에 대한 필요성을 제기한다. 따라서, 본 발명은 유전자 조작 기술의 적용을 통해 식물에서 셀룰로스-분해 효소의 생산을 제공한다. 고등 식물이 셀룰라제 생산을 위한 생체내 생물 반응기로서 사용하기 위한 유력한 후보이다. 이들 식물은 높은 바이오매스 수율을 가지며, 생산은 용이하게 증대되고, 무균 조건을 요하지 않으며, 식물-합성 단백질의 복잡한 해독후 변형이 흔하다. 더욱이, 식물에서 전이유전자(transgene)-암호화된 단백질은 전체 단백질 함량의 1%를 초과할 수 있다. 그러나, 식물이 구조적 통합을 위해 셀룰로스에 의존함에 따라, 셀룰로스-분해 효소가 식물에 독성인 것으로 기대된다. 따라서, 셀룰라제 유전자는 유전자 발현의 화학적 유도 및 유전자 생성물의 세포 저장 구조물로의 표적화에 관한 기술을 위한 이상적인 표적을 나타낸다.
본 발명에서, 셀룰라제 암호화 서열은 식물에서 활성인 프로모터에 융합되고, 핵의 게놈 또는 색소체 게놈으로 형질전환된다. 본 발명에 따라 식물에서 발현될 수 있는 셀룰라제로는 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, 및 β-D-글루코시다제, 바람직하게는 미생물(예: 세균 또는 진균) 등의 비식물 공급원으로부터 유래된 것들을 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다. 바람직한 프로모터는 화학적으로 유도될 수 있는 담배 PR-1a 프로모터이지만, 특정 상황에서, CaMV 35S 프로모터 와 같은 구성적(constitutive) 프로모터가 마찬가지로 사용될 수 있다. 화학적으로 유도될 수 있는 프로모터에 의해, 식물로 형질전환되는 셀룰라제 유전자의 발현은 화학적 유도 인자를 잎에 적용함으로써 적절한 시점에서 활성화될 수 있다.
색소체 형질전환이 사용되는 경우, 벡터는 파지 T7 유전자 10 프로모터 등의 파지 프로모터를 사용하여 적절히 작제되고, 이의 전사 활성화는 T7 RNA 폴리머라제 등의 RNA 폴리머라제에 의존한다. 어느 한 경우, 셀룰라제 유전자에 융합된 파지 프로모터를 함유하는 색소체 형질전환 벡터는 엽록체 게놈으로 형질전환된다. 생성된 계열은 엽록체-표적 서열로 보충되고 CaMV 35S 등의 구성적 프로모터에 작동 가능하게 결합된 파지 RNA 폴리머라제를 위한 핵의 암호화 영역을 함유하는 트랜스젠 계열에 교잡하면, 이러한 교잡에 의해 생성된 식물의 엽록체에서 구성적 셀룰라제 발현이 이루어진다. 엽록체 발현은 셀룰라제가 셀룰로스를 거의 또는 전혀 함유하지 않는 색소체를 덜 손상시킨다는 장점을 갖는다.
화학적으로 유도될 수 있는 프로모터를 사용하는 것 외에, 발현된 셀룰라제는 독성 문제점들을 완화시키기 위해 액포 등의 특정 세포 소기관으로 표적화될 수 있다. 셀룰라제의 액포-표적된 발현을 위해, 식물들을 담배 키티나제 유전자로부터와 같은 액포 표적화 서열을 포함하는 벡터들에 의해 형질전환시킨다. 이러한 경우에, 발현된 셀룰라제는 셀룰로스를 분해시킬 수 없고, 식물을 손상시킬 수 없 액포에 저장될 것이다.
따라서, 본 발명은 셀룰로스-분해 효소, 예를 들면 식물, 예를 들면, 핵의 DNA 또는 색소체 DNA로 안정하게 통합된 셀룰로스 분해 효소를 암호화하는 이종성 DNA 서열을 포함하는 식물에서 자연적으로 발현되지 않는 셀룰로스-분해 효소를 바람직하게는 유도성 프로모터, 예를 들면 유도성 프로모터에 작동 가능하게 결합된 손상-유도성 또는 화학적으로-유도될 수 있는 프로모터의 조절하에 또는 대응하는 트랜스액티베이터가 유도성 프로모터의 조절 하에 있는 트랜스액티베이터(transactivator)-조절된 프로모터의 조절 하에 발현시키는 식물을 제공하고;
또한, 상기와 같은 식물의, 임의로 처리(예: 애벌칠 또는 코팅됨)되고/되거나 패키지되는, 예를 들면 사용 설명서에 따라 백에 놓여지는 종자를 제공한다.
본 발명은 또한 셀룰라제-발현 식물을 재배하는 단계를 포함하는 셀룰로스-분해 효소의 생산 방법;
셀룰라제-발현 식물을 발효시키는 단계를 포함하는 에탄올의 생산 방법; 및
셀룰라제-발현 식물을 사료 혼합물에 첨가하는 단계를 포함하는, 동뮬 사료, 예를 들면 목초의 분해성을 증진시키는 방법을 제공한다.
이들 방법은 2개 이상의 상이한 셀룰로스 분해 효소, 예를 들면 상승적으로 활성인 조합으로 셀룰로스 생분해 경로의 상이한 단계에서 작용하는 효소들을 조합하고, 단일 식물에 상기 효소들을 발현시킴으로써 또는 상이한 셀룰로스 분해 효소를 각각 발현시키는 2개 이상의 식물을 조합함으로써 셀룰로스 분해를 증진시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 바람직하게는 유도성 프로모터, 예를 들면 손상 유도 또는 화학적 유도성 프로모터의 조절하에 셀룰로스-분해 효소를 위한 암호화 영역을 포함하는 식물 발현성 발현 카세트; 예를 들면 프로모터, 예를 들면 핵의 트랜스액티베이터(트랜스액티베이터가 T7 RNA 폴리머라제일 때 이의 발현이 유도성 프로모터의 임의적인 조절하의 T7 프로모터)에 의해 조절되고, 셀룰로스-분해 효소를 위한 암호화 영역에 작동 가능하게 결합된 트랜스액티베이터-매개된 프로모터를 포함하는 색소체 발현성 발현 카세트;
이러한 식물 발현성 발현 카세트를 포함하는 벡터; 및
이러한 벡터에 의해 형질전환된 식물, 또는 이의 게놈, 예를 들면 이의 색소체 게놈내에 상기와 같은 식물 발현성 발현 카세트를 포함하는 트랜스젠 식물을 제공한다.
추가의 태양에서, 본 발명은 신규한 색소체 발현 시스템을 내포하고, 여기서 색소체에 발현된 유전자는 트랜스액티베이터-조절된 프로모터의 조절하에 있고, 트랜스액티베이터를 위한 유전자는 유도성 프로모터의 조절하에 핵의 DNA에 있다. 예를 들면, 색소체 형질전환 벡터는 전형적으로 파지 T7 유전자 10 프로모터 등의 파지 프로모터를 사용하여 작제되고, 이의 전사 활성화는 파지 T7 RNA 폴리머라제 등의 RNA 폴리머라제에 의존한다. 생성된 계열을 엽록체-표적 서열로 보충되고 담배 PR-1a 프로모터 등의 화학적 유도성 프로모터에 작동 가능하게 결합된 파지 RNA 폴리머라제를 위한 핵의 암호화 영역을 함유하는 트랜스젠 계열에 교잡시킨다. 이러한 교잡에 의해 생성된 식물의 엽록체에서 목적하는 유전자의 발현은 화학적 유도 인자를 잎에 적용함으로써 활성화된다. 본 명세서에 기재된 신규한 유도성 트랜스액티베이터-매개된 색소체 발현 시스템은 엄격하게 조절되는 것으로 보이고, 단, 유도 전에 발현이 검출되지 않고, 예외적으로 유도 후 높은 발현 및 단백질의 축적이 검출되었다.
따라서, 본 발명은 추가로 유도성 프로모터, 예를 들면 트랜스액티베이터(바람직하게는 식물에서 자연적으로 발생되지 않는 트랜스액티베이터, 바람직하게는 RNA 폴리머라제 또는 DNA 결합 단백질, 예를 들면 T7 RNA 폴리머라제)를 위한 DNA 서열에 작동가능하게 결합된 담배 PR-1a 프로모터 등의 손상-유도 또는 화학적-유도성 프로모터를 포함하고, 상기 트랜스액티베이터는 색소체 표적 서열, 예를 들면 엽록소 표적 서열에 융합된 식물 발현성 발현 카세트;
이러한 식물 발현성 발현 카세트를 포함하는 벡터; 및
이러한 벡터에 의해 형질전환된 식물, 또는 이의 게놈이 식물 발현성 발현 카세트를 포함하는 트랜스젠 식물을 제공한다.
본 발명은 또한 유도성 프로모터, 예를 들면 트랜스액티베이터(바람직하게는 식물에서 자연적으로 발생되지 않는 트랜스액티베이터, 바람직하게는 RNA 폴리머라제 또는 DNA 결합 단백질, 예를 들면 T7 RNA 폴리머라제)를 암호화하는 DNA 서열에 작동가능하게 결합된 담배 PR-1a 프로모터 등의 손상-유도 또는 화학적-유도성 프로모터등의 유도성 프로모터등을 포함하고, 상기 트랜스액티베이터는 색소체 표적 서열, 예를 들면 엽록소 표적 서열(예: 상기한 바의 식물 발현성 발현 카세트)에 융합된, 이종성 핵 발현 카세트; 및
트랜스액티베이터(예: 트랜스액티베이터가 T7 RNA 폴리머라제일 때 T7 프로모터)에 의해 조절되고 목적하는 단백질(예: 효소, 탄화수소 분해 효소, 예를 들면 GUS 또는 셀룰로스-분해 효소) 또는 목적하는 기능성 RNA(예: 안티센스 RNA)에 대한 암호화 등의 목적하는 DNA 서열에 작동가능하게 결합된 트랜스액티베이터-매개된 프로모터를 포함하는 이종성 색소체 발현 카세트를 제공하고;
또한, 상기와 같은 식물의, 임의로 처리(예: 애벌칠 또는 코팅됨)되고/되거나 패키지되는, 예를 들면 사용 설명서에 따라 백 또는 기타 용기에 놓여지는 종자가 제공된다.
본 발명은 또한 조절되고 목적하는 단백질에 대해 암호화한 DNA 서열에 작동 가능하게 결합된 트랜스액티베이터-매개된 프로모터를 포함하는 이종성 색소체 발현 카세트를 포함하는 식물을, 상기 트랜스액티베이터-매개된 프로모터를 조절할 수 있는 트랜스액티베이터에 대해 암호화한 DNA 서열에 작동 가능하게 결합된 유도성 프로모터를 포함하는 이종성 핵의 발현 카세트를 포함하는 식물로부터의 화분으로 수분시키는 단계;
이와 같이 수분된 식물로부터 종자를 회수하는 단계; 및
상기 종자로부터 상기한 바의 식물을 재배하는 단계를 포함하는 상기 식물 생산 방법을 포함한다.
정의
본 명세서에 기재된 "셀룰로스-분해 효소"로는 셀룰라제, 셀로비오히드롤라제, 셀로비오제, 및 셀룰로스 및 헤미셀룰로스를 글루코스 및 크실로스와 같은 간단한 당으로 분해시키는데 연관된 기타 효소를 들 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 사용된 셀룰로스-분해 효소는 비식물 기원, 예를 들면 미생물 기원이고, 바람직하게는, 예를 들면 터모모노스포라속(Thermomonospora) 세균으로부터, 예를 들면 터모모노스포라 푸스카(T. fusca)로부터의 세균 기관이다.
본 명세서에 사용된 "발현 카세트"는 말단 영역에 작동 가능하게 결합된 목적하는 암호화 영역에 작동 가능하게 결합된 프로모터를 포함하는 식물 세포에서 유전자의 발현을 지시할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 암호화 영역은 목적하는 단백질에 대해 통상적으로 암호화하지만, 목적하는 기능성 RNA, 예를 들면 센스 또는 안티센스 방향으로 특정 유전자, 예를 들면 안티센스 RNA의 발현을 억제하는 비해독된 RNA 또는 안티센스 RNA에 대해 암호화할 수 있다. 유전자는 키메라성일 수 있고, 유전자의 하나 이상의 성분이 유전자의 하나 이상의 다른 성분에 대해 이종성임을 의미한다. 유전자는 자연적으로 발생하지만 식물의 유전자 형질전환에 유용한 재조합 형태로 얻어진 것일 수도 있다. 그러나, 전형적으로, 발현 카세트는 숙주에 대해 이종성이고, 즉, 발현 카세트의 특정 DNA 서열은 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않고, 형질전환에 의해 숙주 세포 또는 숙주 세포의 조상에 도입되어야 한다. "핵의 발현 카세트"는 숙주의 핵의 DNA에 통합된 발현 카세트이다. "색소체 발현 카세트"는 숙주의 색소체 DNA에 통합된 발현 카세트이다. 본 명세서에 기재된 바의 색소체 발현 카세트는 단일 프로모터, 예를 들면 트랜스액티베이터-매개된 프로모터의 조절하에 목적하는 2개 이상의 시스트론 암호화 서열을 함유하는 폴리시스트론 오페론을 임의로 포함할 수 있고, 여기서, 목적하는 암호화 서열들중의 하나는 clpP 또는 기타 색소체 프로테아제의 발현을 억제하는 안티센스 mRNA를 암호화함으로써 목적하는 기타 암호화 서열 또는 서열들을 발현시킨 단백질의 축적을 증진시킨다.
본 명세서에 사용된 "이종성"이라는 용어는 "천연 기원과는 상이함"을 의미한다. 예를 들면, 식물이 다른 유기체로부터, 특히 다른 종으로부터 유도된 유전자에 따라 형질전환된 경우, 그 유전자는 그 식물에 대해서 및 이러한 유전자를 지니는 식물의 자손에 대해서 역시 이종성이다.
"호모색소체"는 모든 색소체가 유전학적으로 동일한 식물, 식물 조직 또는 식물 세포를 의미한다. 이는 색소체가 형질전환되지 않거나, 돌연변이되지 않거나 또는 그렇지 않으면 유전학적으로 변경되지 않은, 식물의 정상 상태이다. 상이한 조직 또는 개발 단계에서, 색소체는 상이한 형태, 예를 들면, 엽록체, 프로플라스티드(proplastid), 에티오플라스트(etioplast), 전분체(amyloplast), 잡색체(chromoplast) 등을 가질 수 있다.
"유도성 프로모터"는 식물이 구성적 프로모터 또는 특정 조직 또는 기관 또는 발생 단계에 특이적인 프로모터와 구별되는 일부 특정 외부 자극에 노출될 때만 전사를 억제하는 프로모터이다. 본 발명에 특히 바람직한 것은 화학적-유도성 프로모터 또는 손상-유도성 프로모터이다. 화학적 유도성 프로모터로는 전신적 획득 내성 경로의 프로모터 등의 식물-유래된 프로모터, 예를 들면 PR-1. PR-2, PR-3, PR-4 또는 PR-5 프로모터와 같은 PR 프로모터, 특히 식물이 BTH 및 관련 화학 약품에 노출될 때 전사를 개시하는 담배 PR-1a 프로모터 및 아라비돕시스(Arabidopsis) PR-1 프로모터를 들 수 있다[미국 특허 제5,614,395호 및 미국 임시 출원 제60/027,228호 참조: 이들 문헌을 참고 문헌으로서 인용한다]. 또한, 화학적-유도성 프로모터로는 수용체-매개된 시스템, 예를 들면 스테로이드-의존형 유전자 발현, 구리-의존형 유전자 발현, 테트라사이클린-의존형 유전자 발현 및 특히 본 명세서에 참고 문헌으로서 인용한 PCT/EP96/04224호에 기재된 청소년 성장 호르몬 및 이의 효능제(agonist)에 의해 매개된 초파리(Drosophila)로부터 USP 수용체를 이용하는 발현 시스템 뿐만 아니라 본 명세서에 참고 문헌으로서 인용한 PCT/EP96/00686호에 기재된 바의 수용체들의 조합을 이용하는 시스템 등의 다른 유기체로부터 유도된 것들을 들 수 있다. 상처 유도성 프로모터로는 프로테이나제 억제제를 위한 프로모터, 예를 들면 감자로부터 프로테이나제 억제제 II 프로모터 및 폴리페닐 옥시다제, LAP 및 TD를 위한 프로모터와 같이 상처 반응 경로에 연관된 다른 식물-유도된 프로모터를 들 수 있다[일반적으로 그 내용이 참고 문헌으로서 본 명세서에 인용된 C. Gatz, "Chemical Control of Gene Expression", Annu, Rev. Plant Physiol, Plant Mol. Biol.(1997) 48:89-108 참조].
"식물"은 임의의 식물 또는 임의의 발생 단계에서의 식물의 일부를 의미한다. 본 발명의 일부 태양에서, 식물들은 발현을 유도하기 위해 치명적으로 손상될 수 있거나 또는 목적 단백질의 치명적인 수준으로 발현시키도록 유도될 수 있고, 따라서, 본 명세서에 사용된 바의 "식물"이라는 용어는 구체적으로 식물 및 심각하게 손상되거나 또는 죽은 식물 물질 뿐만 아니라 채소, 벌채, 세포 또는 조직 배양물 및 종자를 포함한다.
"트랜스액티베이터"는 단독으로 또는 1개 이상의 추가의 단백질과 함께, 대응하는 트랜스액티베이터-매개된 프로모터의 조절하에 암호화 영역의 전사를 유발할 수 있는 단백질이다. 트랜스액티베이터 시스템의 예로는 파지 T7 유전자 10 프로모터를 들 수 있고, 이의 전사 활성은 파지 T7 RNA 폴리머라제 등의 특정 RNA 폴리머라제에 의존한다. 트랜스액티베이터는 전형적으로 프로모터를 직접적으로 활성화시키거나 또는 수용체 유전자를 불활성화시킴으로써, 예를 들면 억제제 단백질의 발현 또는 축적을 억제함으로써 전사를 개시하는 특정 프로모터와 상호 작용할 수 있는 RNA 폴리머라제 또는 DNA 결합 단백질이다. DNA 결합 단백질은 적당한 전사 활성인자 도메인에 결합된 결합 영역(예: G4L4 결합 영역)을 포함하는 키메라 단백질일 수 있다. 일부 트랜스액티베이터 시스템은 다중 트랜스액티베이터, 예를 들면 폴리머라제 뿐만 아니라 프로모터 인식, DNA 결합 또는 전사 활성화를 위한 특정 서브단위(시그마 인자)를 요하는 프로모터들을 가질 수 있다. 트랜스액티베이터는 식물에 대해 이종성인 것이 바람직하다.
본 발명은 트랜스젠(transgenic) 색소체에서의 유전자 발현의 조절 및 셀룰로스-분해 효소를 발현할 수 있는 트랜스젠 식물에 관한 것이다.
도 1은 식물에서의 셀룰라제 발현을 위한 실시예에 기재된 키메라 유전자 작제물의 개략도이다. 선영의 박스는 E5 유전자 신호 서열을 나타내고, 폐쇄된 박스는 담배 키티나제 유전자로부터 액포 표적화 서열을 나타낸다. Tn은 nos 말단 서열을 암호화하고, Ttml은 tml 말단 서열을 암호화한다.
도 2는 실시예의 섹션 C에 기재된 색소체 형질전환 벡터를 나타내는 도면이다.
본 발명은 진균에 의해 생산된 종래의 공업적 셀룰라제를 식물에서 생산된 셀룰라제로 대체함으로써 연료 에탄올 생산 공업, 가축 사료 공업, 종이 및 직물 공업과 같은 공업을 위한 셀룰로스-분해 효소의 풍부하고 저렴한 자원에 대한 필요성을 제기한다. 식물을 그 자신의 셀룰라제를 생산하기 위해 유전자 조작함으로써, 셀룰로스 분해를 위한 셀룰라제의 외부 적용은 필요치 않다. 예를 들면, 리그노셀룰로스 바이오매스은 본 발명을 이용함으로써 셀룰라제의 자신의 공급원으로서 작용할 수 있는 에탄올로 될 것이다. 사실상, 본 발명에 따른 트랜스젠 식물은 생물 반응기에 모든 공급 원료를 포함시킬 필요가 없고; 오히려, 이들 식물은 비-형질전환된 셀룰로스 공급 원료와 관련하여 사용됨으로써 트랜스젠 식물에 의해 생산된 셀룰라제는 비-트랜스젠 공급 원료를 포함하는 모든 공급 원료의 셀룰로스를 분해시킬 수 있다. 본 발명에 따라 생산된 트랜스잰 바이오매스를 사용하는 셀룰로스 분해는 종래 방법보다 저렴하고, 용이하고, 보다 환경에 안정하게 수행될 수 있다.
공급 원료는 농작물의 줄기 및 잎 등의 다른 목적을 위해 주로 성장된 식물의 폐기되는 부분 또는 바이오매스 공급원으로서 사용하도록 특별히 성장한 고등 바이오매스 식물 등의 임의의 유형의 리그노셀룰로스 물질일 수 있다. 셀룰라제 유전자에 의해 형질전환된 식물은 특정 식물이 셀룰라제의 자체 생산을 위해 보존되는 경우의 셀룰라제의 구성적 발현을 제공하는 작제물에 의해 형질전환될 수 있다. 특정 유형의 식물이 셀룰라제의 구성적 발현으로부터 과도한 독성 문제를 경험하는 경우, 이 식물은 필요할 때만 셀룰라제 생산을 허용하는 작제물에 의해 형질전환시키는 것이 바람직하다. 예를 들면, 화학적-유도 셀룰라제 작제물에 따라, 하나는 식물들이 셀룰라제의 자체 생산에 의해 고사되는 것과 같이, 이들이 임의의 경로로 수확되도록 식물들을 수확하기 직전에 셀룰라제 발현을 화학적으로 유도한다. 식물 조직은 셀룰라제를 방출하도록 분쇄, 연마 또는 잘게 썰어서, 생물 반응기에 첨가하며, 리그노셀룰로스 바이오매스은 트랜스젠 식물에서 발현된 셀룰라제의 작용에 의해 단순한 당으로 분해될 수 있다.
본 발명에 따라 작제된 키메라 유전자는 임의의 적절한 식물 조직으로 형질전환될 수 있다. 본 발명과 연관되어 사용되는 바와 같이, "식물 조직"으로는 전체 식물, 식물 세포, 식물 기관, 식물 종자, 원형질, 유합 조직, 세포 배양물, 및 구조적 및(또는) 기능적 단위로 조직되는 임의의 군의 식물 세포를 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다. 본 발명에 따라 형질전환된 식물은 단자엽 또는 쌍자엽일 수 있으며, 그 예로는 옥수수, 밀, 보리, 호밀, 고구마, 콩, 완두콩, 치커리, 상치, 양배추, 콜리플라워, 브로콜리, 순무, 무, 시금치, 아스파라거스, 양파, 마늘, 후추, 셀러리, 스쿼시, 호박, 대마, 서양 호박, 사과, 배, 모과, 멜론, 서양 자두, 버찌, 복숭아, 승도 복숭아, 살구, 딸기, 포도, 나무 딸기, 검은 딸기, 파인애플, 아보카도, 파파야, 망고, 바나나, 대두, 토마토, 사탕수수 시럽, 사탕수수, 사탕무, 해바라기, 평지씨, 클로버, 담배, 당근, 면화, 자주개자리, 벼, 감자, 가지, 오이, 아라비돕시스, 및 침엽수 및 낙엽수 등의 목재 식물을 들 수 있지만 이들로만 제한되지 않는다.
일단 목적하는 유전자가 특정 식물종으로 형질전환되는 경우, 그 유전자는 전통적인 증식 기술을 사용하여 그 종에서 전파될 수 있거나 또는 특히 시판중인 변종을 포함하는 동일한 종의 다른 변종으로 이동될 수 있다. 대안으로, 목적하는 단백질, 예를 들면 셀룰로스-분해 효소에 대한 암호화 서열은 최적의 발현을 위해 유전자 조작에 의해 단리될 수 있고, 이어서 목적하는 변종으로 형질전환될 수 있다.
본 발명에 따라 식물로 형질전환될 바람직한 셀룰라제 유전자로는 터모모노스포라 푸스카(티. 푸스카) E1 유전자(GenBank 수탁 번호 L20094)(Jung 등(1993) Appl. Environ. 59:3032-3043); 터모모노스포라 푸스카(티. 푸스카) E2 유전자(GenBank 수탁 번호 M73321)(Ghangas 등(1988) Appl. Environ. Microbiol. 54, 2521-2526; Lao 등(1991) J. Bacteriol. 173, 3397-3407); 터모모노스포라 푸스카(티. 푸스카) E5 유전자(GenBank 수탁 번호 L01577)(Collmer 및 Wilson(1983) Biotechnology 1, 594-601; Lao 등(1991) J. Bacteriol. 173, 3397-3407)를 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다. 그러나, 기타 셀룰라제 유전자들이 하기 참고 문헌에 개시된 모든 셀룰라제 유전자를 포함하여, 마찬가지로 본 발명에 따라 식물로 형질전환될 수 있다[Collmer 등(1983) Bio/Technology 1:594-601; Ghangas 등(1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:2521-2526; Wilson(1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12:45-63; Jung 등(1993) Appl. Environ. Microbiol. 59:3032-3043; Lao 등(1991) J. Bacteriol. 173:3397-3407; 및 Thomas 등, "Initial Approaches to Artificial Cellulase Systems for Conversion of Biomass to Ethanol"; Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates, J.N. Saddler M.H. Penner, eds., ACS Sumposium Series 618:208-36, 1995, American Chemical Society, Washington, D.C.]. 이들은 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, 및 세균 및 진균 등의 미생물로부터 유도된 β-D-글루코시다제를 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다.
식물에서 핵의 발현을 최적화시키기 위한 미생물 유전자의 변형
필요할 경우, 본 출원에 기재된 클로닝된 셀룰라제 유전자는 트랜스젠 식물 숙주에서 발현을 위해 변이될 수 있다. 예를 들면, 미생물 공급원으로부터 유래된 유전자의 식물에서 트랜스젠 발현은 식물에서 이들의 발현을 달성하고 최적화시키기 위해 유전자의 변형을 요할 수 있다. 특히, 별개의 효소를 암호화하지만, 천연 미생물에서 동일한 전사에 의해 암호화된 세균의 ORF는 별개의 전사에 따라 식물에서 최상으로 발현된다. 이를 달성하기 위해, 각각의 미생물의 ORF는 개별적으로 단리되고 ORF의 5' 말단에서 식물 프로모터 서열 및 ORF의 3' 말단에서 식물 전사 터미네이터를 제공하는 카세트 내에서 클로닝된다. 단리된 ORF 서열은 개시 ATG 코돈 및 종료 STOP 코돈을 포함하는 것이 바람직하지만, 개시 ATG 코돈 및 종료 STOP 코돈 이외에 추가의 서열을 포함할 수 있다. 또한, ORF가 절단될 수 있지만, 여전히 필수적인 활성을 보유하고; 특히 긴 ORF에 대해, 활성을 보유하는 절단된 버전이 트랜스젠 유기체에서의 발현에 바람직할 수 있다. "식물 프로모터" 및 "식물 전사 터미네이터"는, 식물 세포에서 작동하는 프로모터 및 전사 터미네이터를 의미한다. 이는 바이러스(예를 들면 콜리플라워 모자이크 바이러스) 등의 비식물 공급원으로부터 유래될 수 있는 프로모터 및 전사 터미네이터를 포함한다.
경우에 따라, ORF 암호화 서열 및 인접한 서열로의 변형은 필요치 않을 것이고, 그 경우에 목적하는 ORF를 함유하는 단편을 단리시키고 이를 식물 프로모터 하류에 삽입하는 것이 충분하다. 그러나, 바람직하게는 조금 인접한 미생물 서열이 ATG 코돈의 상류 및 STOP 코돈의 하류에 부착되어야 한다. 실제로, 이러한 작제는 제한 부위의 이용 가능성에 의존할 수 있다.
다른 경우, 미생물 공급원으로부터 유래된 유전자의 발현은 발현시에 문제점들을 제공할 수 있다. 이들 문제점은 당업계에서 잘 특성화되어 있고, 바실루스 서브틸리스(Bacillus) 등의 특정 공급원으로부터 유래된 유전자와 특히 공통적이다. 이러한 유전자의 변형은 당업계에 현재 잘 알려진 기술을 사용하여 시도될 수 있다. 하기 문제점들이 직면하게될 전형적인 것들이다:
1. 코돈 용법
식물에서 바람직한 코돈 용법은 특정 미생물에서 바람직한 코돈 용법과 상이하다. 클로닝된 ORF 내의 코돈들의 용법을 식물 유전자(특히 표적 식물로부터 유전자)의 용법과 비교하면 바람직하게는 변화될 수 있는 ORT 내의 코돈을 식별할 수 있게 한다. 전형적으로 식물 진화는 단자옆 식물의 제3의 염기 위치에 뉴클레오티드 C 및 G를 강력히 선호하는 경향이 있는 반면, 쌍자엽 식물은 이 위치에서 뉴클레오티드 A 또는 T를 종종 사용한다. 특정 표적 트랜스젠 종을 위해 바람직한 코돈 용법을 삽입하도록 유전자를 변형시킴으로써, GC/AC 함량에 대한 많은 하기 문제점들 및 부적절한 스플라이싱이 극복될 것이다.
2. GC/AT 함량
식물 유전자는 전형적으로 35% 이상의 GC 함량을 갖는다. A 및 T 뉴클레오티드가 풍부한 ORF 서열은 식물에서 여러 가지 문제점들을 유발할 수 있다. 먼저, ATTTA의 모티브는 메시지의 불안정성을 유발하는 것으로 믿어지고, 많은 단명하는 mRNA의 3' 말단에서 발견되었다. 2차로, 메시지 내의 부적절한 위치에서 AATAAA 등의 폴리아데닐화 신호의 존재는 전사의 미성숙한 절단을 유발하는 것으로 믿어진다. 또한, 단자엽 식물은 스플라이싱 부위(아래 참조)와 같이 AT가 풍부한 서열을 인식할 수 있다.
3. 개시 메티오닌에 인접한 서열
식물들은 이들의 메시지가 한정된 리보솜 결합 부위를 갖지 않는 점에서 미생물들과 상이하다. 오히려, 리보솜은 메시지의 5' 말단에 부착되고, 해독을 시작하는 제1의 이용가능한 ATG를 스캐닝하는 것으로 믿어진다. 뿐만 아니라, ATG에 인접한 특정 뉴클레오티드가 바람직하고, 미생물 유전자의 발현이 ATG에서 진핵세포의 공통(consensus) 해독 개시제를 포함시킴으로써 증진될 수 있는 것으로 믿어진다. Clontech(1993/1994 카탈로그, 210페이지)는 식물에서 이. 콜리(E. coli) uidA 유전자의 발현을 위한 공통 해독 개시제로서 서열 GTCGACCATGGTC를 제안하고 있다. 더욱이, Joshi(NAR 15:6643-6653(1987))는 ATG에 인접한 많은 식물 서열들을 비교하고 공통적인 TAAACAATGGCT를 제안하고 있다. 식물에서 미생물의 ORF의 발현시에 곤경을 직면하는 상황에서, 개시 ATG에 이들 서열들 중의 하나를 포함시킴으로써 해독을 개선시킬 수 있다. 이러한 경우에 공통적인 최종 3개의 뉴클레오티드는 제2 AA 잔기의 변형으로 인해 변형된 서열에 포함되기에 적절치 못할 수 있다. 개시 메티오닌에 인접한 바람직한 서열은 상이한 식물 종들에서 상이할 수 있다. GenBank 데이터베이스에 위치하는 14 옥수수 유전자의 조사는 하기 결과를 제공하였다:
이러한 분석은 셀룰라제 유전자가 삽입되는 바람직한 식물종에 대해서 및 바람직한 뉴클레오티드를 삽입하기 위해 변형된 TAG에 인접한 서열에 대해 행해질 수 있다.
4. 부적절한 스플라이싱 부위의 제거
비-식물 공급원으로부터 클로닝되고, 식물에서의 발현을 위해 최적화되지 않는 유전자는 5' 또는 3' 스플라이싱 부위로서 식물에서 인식될 수 있고, 분해될 수 있는 모티브를 함유할 수도 있고, 따라서, 절단된 또는 결실된 메시지를 발생시킨다. 이들 부위는 참고 문헌으로 인용한 출원 제07/961,944호에 개시된 기술을 사용하여 제거할 수 있다.
암호화 서열 및 인접한 서열의 변형을 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다. 미생물 ORF의 초기 발현이 적고, 상기한 바의 서열에 대한 변경이 이루어지는 것이 적절한 것으로 간주되는 경우, 합성 유전자의 작제는 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 특허 공고 EP 0 385 962호(Monsanto), EP 0 359 472호(Lubrizol) 및 WO 93/07278호(Ciba-Geigy)에 개시되어 있다. 대부분의 경우에 트랜스젠 식물로 이들을 전이시키기에 앞서 일시적인 분석 프로토콜(당업계에 익히 공지됨)을 사용하는 유전자 작제물의 발현을 평가하는 것이 바람직하다.
색소체 형질전환의 주요 장점은 색소체가 일반적으로 실질적인 변형 없이 세균 유전자를 발현시킬 수 있다는 것이다. 상기한 바의 코돈 적용은 필요치 않으며, 색소체는 단일 프로모터의 조절하에 다중 개방 판독 프레임을 발현시킬 수 있다.
식물 형질전환 벡터의 작제
수많은 형질전환 벡터들이 식물 형질전환을 위해 이용될 수 있으며, 본 발명의 유전자는 임의의 이러한 벡터들과 연관되어 사용될 수 있다. 사용하기 위한 벡터의 선택은 바람직한 형질전환 기술 및 형질전환을 위한 표적 종에 의존할 것이다. 특정 표적 종에 대해, 상이한 항생 물질 또는 제초제 선택 마커가 바람직할 수 있다. 형질전환에 일상적으로 사용된 선택 마커는 카나마이신 및 관련 항생제에 대한 내성을 부여하는 nptII 유전자(Messing & Vierra, Gene 19: 259-268(1982; Bevan 등, Nature 304: 184-187(1983)), 제초제 phoSphlnothricin에 대한 내성을 부여하는 bar 유전자(White 등, Nucl Acids Res 18: 1062(1990), Spencer 등, Theor Appl Genet 79: 625-631(1990)), 항생제 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hpt 유전자(Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4: 2929-2931), 및 메타트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr 유전자(Bourouis 등, EMBO J. 2(7): 1099-1104(1983))를 들 수 있다.
1. 아그로박테륨(Agrobacterium) 형질전환에 적절한 벡터의 작제
많은 벡터들이 아그로박테륨(Agrobacterium tumefaciens)을 사용하는 형질전환에 이용될 수 있다. 이들은 전형적으로 하나 이상의 T-DNA 경계 서열을 갖고, pBIN19[Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)] 및 pXYZ 등의 벡터를 포함한다. 아래에 2가지 전형적인 벡터의 작제를 기재한다.
pCIB200 및 pCIB2001의 작제: 2성분 벡터 pCIB200 및 pCIB2001은 아그로박테륨(Agrobacterium)과 사용하기 위한 재조합 벡터의 작제에 사용되고, 하기 방식으로 작제되었다. pTJS75kan은 테트라사이클린-내성 유전자를 절개하는 pTJS75[Schmidhauser & Helinski, J Bacteriol, 164: 446-455(1985)]의 Narl 분해에 이어, NPTII[Messing & Vierra, Gene, 19: 259-268(1982); Bevan 등, Nature 304: 184-187(1983); McBride 등, Plant Molecular Biology 14: 266-276(1990)]를 갖는 pUC4K로부터의 Accl 단편을 삽입함으로써 생성되었다. Xhol 링커는 좌측 및 우측 T-DNA 경계, 식물 선택성 nos/nptll 키메라 유전자 및 pUC 폴리링커를 함유하는 pCIB7의 EcoRV 단편에 결찰(ligation)시키고[Rothstein 등, Gene 53: 153-161(1987)], Xhol-분해된 단편은 pCIB200을 생성하기 위해 Sall-분해된 pTJS75kan으로 클로닝되었다[EP 0 332 104, 실시예 19 참조]. pCIB200는 하기 독특한 폴리링커 제한 부위: 즉, EcoR1, Sstl, Kpnl, BglII, Xbal 및 Sall을 포함한다. pCIB2001은 추가의 제한 부위를 폴리링커에 삽입함으로써 생성된 pCIB200의 유도체이다. pCIB2001의 독특한 제한 부위는 EcoR1, Sstl, Kpnl, BglII, Xbal, Sall, MluI, Bcll, AvrII, Apal, Hpal 및 Stul을 포함한다. pCIB2001은 이들 독특한 제한 부위를 함유하는 것 외에, 식물 및 세균 카나마이신 선별, 아그로박테륨(Agrobacterium)-매개된 형질전환을 위한 좌측 및 우측 T-DNA 경계, 이. 콜리(E. Coli)과 다른 숙주 사이에서의 이동을 위한 RK2-유래된 trfA 기능 및 RK2로부터의 OriT 및 OriV 기능을 갖기도 한다. pCIB2001 폴리링커가 이들 자신의 조절 신호를 함유하는 식물 발현 카세트를 클로닝하기에 적절하다.
pCIB10 및 이의 히그로마이신 선별 유도체의 작제: 2성분 벡터 pCIB10은 식물에서 선별을 위한 카나마이신 내성을 암호화하는 유전자, T-DNA 우측 및 좌측 경계 서열을 함유하고, 이. 콜리(E. Coli)과 아그로박테륨(Agrobacterium) 모두에서 복제되도록 광범위한 숙주 범위의 플라스미드 pRK252로부터의 서열을 삽입한다. 이의 작제는 Rothstein 등에 의해 기재되어 있다[Gene 53: 153-161(1987)]. Gritz 등이 개시한 히그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제에 대한 유전자를 삽입한 pCIB10의 여러 가지 유도체가 작제되어 왔다[Gene 25: 179-188(1983)]. 이들 유도체는 유일하게 히그로마이신(pCIB743) 상에서 또는 히그로마이신 및 카나마이신(pCIB715, pCIB717) 상에서 트랜스젠 식물 세포들을 선별할 수 있게 한다.
2. 비-아그로박테륨(non-Agrobacterium) 형질전환에 적절한 벡터의 작제
아그로박테륨(Agrobacterium tumefaciens)을 사용하지 않는 형질전환은 선택된 형질전환 벡터에서 T-DNA 서열에 대한 요건을 우회하고, 결과적으로 T-DNA 서열을 함유하는 상기한 벡터들 외에 이들 서열이 결여된 벡터가 이용될 수 있다. 아그로박테륨(Agrobacterium)에 의존하지 않는 형질전환 기술은 입자 피복(bombardment), 원형질체 흡수(예: PEG 및 전기천공) 및 미세주사를 통한 형질전환을 들 수 있다. 벡터의 선택은 형질전환된 종에 대한 바람직한 선택에 크게 의존한다. 아래, 일부 전형적인 벡터의 작제가 기재된다.
pCIB3064의 작제: pCIB3064는 제초제 basta(또는 포스피노트리신)에 의한 선택과 조합된 직접적인 유전자 전이 가술에 적합한 pUC-유도된 벡터이다. 플라스미드 pCIB246는 이. 콜리(E. Coli) GUS 유전자 및 CaMV 35S 전사 터미네이터에 대한 작동 융합 시에 CaMV 35S 프로모터를 포함하고, PCT 공개 출원 제WO93/07278호에 개시되어 있다. 이 벡터의 35S 프로모터는 시작 부위의 5'에 2개의 ATG 서열을 포함한다. 이들 부위는 ATG를 제거하고 제한 부위 SspU 및 PvuII는 방식으로 표준 PCR 기술을 사용하여 돌연변이되었다. 새로운 제한 부위는 독특한 SalI 부위로부터 96 및 37 bp 떨어져 있고, 실제 출발 부위로부터 101 및 42 bp 떨어져 있다. 생성된 pCIB246의 유도체는 pCIB3025라 칭하였다. 이어서, GUS 유전자는 SalI 및 SacI를 분해시킴으로써 pCIB3025로부터 절개하고, 말단을 평활하게 하고, 플라스미드 pCIB3060을 발생시키기 위해 다시 결찰시켰다. 이 플라스미드 pUT82는 John Innes Centre, Norwich로부터 입수하고, 스트렙토마이세스 비리도크로모젠(Streptomyces viridochromogenes)으로부터 bar 유전자를 함유하는 400 bp SmaI 단편이 절개되고, pCIB3060의 HpaI 부위에 삽입되었다[Thompson 등, EMBO J 6: 2519-2523(1987)]. 이는 CaMV 35S 프로모터 및 제초제 선택을 위한 터미네이터의 조절하에 bar 유전자, fro 암피실린 내성을 갖는 유전자(이. 콜리(E. Coli에서 선택) 및 독특한 부위 SphI, PstI, HindIII 및 BamHI를 갖는 폴리링커를 포함하는 pCIB3064를 발생시켰다. 이러한 벡터는 이들 자신의 조절 신호를 포함하는 식물 발현 카세트의 클로닝에 적절하다.
pSOG19 및 pSOG35의 작제: pSOG35는 메토트렉세이트에 내성을 부여하는 선택 가능한 마커로서 이. 콜리(E. Coli) 유전자 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR)을 이용하는 형질전환 벡터이다. PCR은 35S 프로모터(∼800 bp), 옥수수 Adhl 유전자(∼550 bp)로부터 인트론 6 및 pSOG10으로부터 GUS 미해독된 리더 서열 18 bp를 증폭시키도록 사용되었다. 이. 콜리(E. Coli) 디히드로폴레이트 리덕타제 유형 II 유전자를 암호화한 250 bp 단편이 PCR에 의해 증폭되고, 이들 2개의 PCR 단편이 pUC19 벡터 골격 및 노팔린 합성 효소 터미네이터를 포함하는 pBI221(Clontech)로부터의 SacI-PstI 단편과 조합된다. 이들 단편의 조합은 인트론 6 서열, GUS 리더, DHFR 유전자 및 노팔린 합성 효소 터미네이터와 융합된 35S 프로모터를 포함하는 pSOG19를 발생시켰다. pSOG19 중의 GUS 리더를 옥수수 클로로틱 모틀 바이러스(MCMV)로부터의 리더 서열로 대체함으로써 벡터 pSOG35를 발생시켰다. pSOG19 및 pSOG35는 암피실린 내성에 대한 pUC 유전자를 갖고, 외래 서열의 클로닝을 위해 이용될 수 있는 HindIII, SphI, PstI 및 EcoRI 부위를 갖는다.
식물 발현 카세트의 작제를 위한 요건
트랜스젠 식물에서 발현하도록 의도된 유전자 서열은 먼저 적절한 프로모터의 뒤 및 적절한 전사 터미네이터 상류의 발현 카세트에서 조합된다. 이들 발현 카세트는 상기 식물 형질전환 벡터에 용이하게 전송될 수 있다.
1. 프로모터 선택
발현 카세트에 사용된 프로모터의 선택은 트랜스젠 식물에서 트랜스젠의 공간적 패턴 및 시간적 발현 패턴을 결정할 것이다. 선택된 프로모터는 특정 세포 유형(예를 들면 상피 잎 세포, 메오스필 세포, 뿌리 피층 세포) 또는 특정 조직 또는 기간(뿌리, 잎 또는 꽃)에서 트랜스젠을 발현시키고, 이러한 선택은 셀룰라제의 생합성의 바람직한 위치를 반영할 것이다. 대안으로, 선택된 프로모터는 광-유도된 또는 기타 시간적으로 조절된 프로모터하에 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 또 다른 (바람직한) 대안은 선택된 프로모터가 외부 자극, 예를 들면, 특정 화학적 유도 인자 또는 상처의 적용에 의해 유도될 수 있다는 것이다. 이러한 상처는 필요할 때만 셀룰라제 전사를 유도할 가능성을 제공한다.
2. 전사 터미네이터
전사 터미네이터의 변종은 발현 카세트에 사용될 수 있다. 이들은 전이유전자(transgene) 후의 전사의 종료 및 이의 정확한 폴리아데닐화를 초래한다. 적절한 전사 터미네이터 및 식물에서의 기능에 공지된 것들로는 CaMV 35S 터미네이터, tml 터미네이터, 노팔린 합성 효소 터미네이터, 완두 rbcS E9 터미네이터를 들 수 있다. 이들은 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물 모두에 사용될 수 있다.
3. 발현의 증진 또는 조절을 위한 서열
수많은 서열이 전사 단위 내에서 유전자 발현을 증진시키는 것으로 밝혀졌으며, 이들 서열은 트랜스젠 식물에서 이들의 발현을 증가시키기 위해 본 발명의 유전자와 연관되어 사용될 수 있다.
여러 가지 인트론 서열은 발현, 특히 단자엽 식물 세포에서 발현을 증진시키는 것으로 나타났다. 예를 들면, 옥수수 AdhI 유전자의 인트론은 옥수수 세포에 도입될 때 이의 동족 프로모터하에 야생형 유전자의 발현을 현저히 증진시키는 것으로 밝혀졌다. 인트론 I은 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자와의 융합 작제물에서 특히 효과적인 발현을 증진시키는 것으로 밝혀졌다[Callis 등, Genes Develop 1: 1183-1200(1987)]. 동일한 실험 시스템에서, 옥수수 bronzel 유전자로부터의 인트론은 발현을 증진시키는 데 있어어 유사한 효과를 가졌다. 인트론 서열은 일상적으로 식물 형질전환 벡터에, 전형적으로 미해독된 리더 내에 삽입된다.
바이러스로부터 유래된 많은 미해독된 리더 서열 역시 발현을 증진시키는 것으로 공지되어 있고, 이들은 쌍자엽 식물 세포에 효과적이다. 구체적으로, 담배 모자이크 바이러스(TMV, "Ω-서열"), 옥수수 클로로틱 모틀 바이러스(MCMV) 및 자주개자리 모자이크 바이러스(AMV)로부터의 리더 서열은 발현을 증진시키는 데 효과적인 것으로 보였다[예: Gallie 등, Nucl. Acids Res. 15:8693-8711(1987); Skuzeski 등, Plant Molec. Biol. 15:65-79(1990)].
4. 세포 내의 유전자 생성물의 표적화
유전자 생성물을 표적화시키는 여러 가지 메카니즘이 식물에 존재하는 것으로 밝혀졌으며, 이들 메카니즘의 기능을 조절하는 서열을 일부 상세히 특성화시킨다. 예를 들면, 유전자 생성물의 엽록체로의 표적화는 여러 가지 단백질의 아미노 말단에서 발견된 신호 서열에 의해 조절되고, 이는 성숙한 단백질을 생성하는 엽록체 도입시에 분해된다[예: Comai 등, J. Biol. Chem. 263: 15104-15109(1988)]. 이들 신호 서열은 이종성 생성물의 엽록체로의 도입을 수행하는 이종성 유전자 생성물에 융합될 수 있다[van den Broeck 등, Nature 313: 358-363(1985)]. 적절한 신호 서열을 암호화하는 DNA는 RUBISCO 단백질, CAB 단백질, EPSP 합성 효소, GS2 단백질 및 엽록체에 편재할 것으로 알려진 기타 많은 단백질을 암호화하는 cDNA의 5' 말단으부터 단리될 수 있다.
기타 유전자 생성물은 미토콘드리아 및 퍼옥시좀(peroxisome) 등의 기타 소기관에 편재한다[예: Unger 등, Plant Molec. Biol. 13: 411-418(1989)]. 이들 생성물을 암호화하는 cDNA는 이들 소기관에 대한 이종성 유전자 생성물의 표적화를 수행하도록 조작될 수 있다. 이러한 서열의 예는 핵의-암호화된 ATPase 및 미토콘드리아에 대한 특정 아스파르테이트 아미노 트랜스퍼라제 이소형태(isoform)이다. 세포 단백질체로의 표적화는 Rogers 등이 개시하였다[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6512-6516(1985)].
또한, 기타 세포 구획에 대한 유전자 생성물의 표적화를 유발하는 서열이 특성화되었다. 아미노말단 서열은 ER, 아포플라스트로의 표적화, 및 호분(aleurone) 세포로부터의 세포외 분비를 담당한다[Koehler & Ho, Plant Cell 2: 769-783(1990)]. 또한, 카르복시말단 서열과 연관된 아미노말단 서열은 유전자 생성물의 액포 표적화를 담당한다[Shinshi 등, Plant Molec. Biol. 14: 357-368(1990)].
목적하는 전이유전자 서열에 상기 적절한 표적화 서열을 융합시킴으로써, 전이유전자 생성물을 임의의 기관 또는 세포 구획에 적용시킬 수 있다. 예를 들면, 엽록체 표적화를 위해, RUBISCO 유전자, CAB 유전자, EPSP 합성 효소 유전자 또는 GS2 유전자로부터의 엽록체 신호 서열은 전이유전자의 아미노말단 ATG에 동일 프레임으로 융합된다. 선택된 신호 서열은 공지된 절단 부위를 포함할 수 있고, 작제된 융합부는 분해를 위해 필요한 절단 부위 후에 임의의 아미노산을 고려해야 한다. 경우에 따라 이러한 요건은 절단 부위와 전이유전자 ATG 사이의 소수의 아미노산을 첨가함으로써 또는 대안으로 전이유전자 서열 내의 일부 아미노산을 대체함으로써 충족될 수 있다. 엽록체 도입을 위해 작제된 융합은 시험관내 전사된 작제물의 시험관내 해독에 이어 문헌[Bartlett 등, In:Edelmann 등(Eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier, 1081-1091(1982); Wasmann 등, Mol. Gen. Genet. 205: 446-453(1986)]에 개시된 기술을 사용하는 시험관내 엽록체 흡수에 의해 엽록체 흡수 효율에 대해 시험될 수 있다. 이들 작제 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 미토콘드리아 및 퍼옥시좀에 동일하게 적용될 수 있다. 셀룰라제 유전자에 대해 요구될 수 있는 표적화의 선택은 주어진 경로에 대한 출발점으로서 요구되는 전구체의 세포 편재화에 의존할 것이다. 이는 경우에 따라 미토콘드리아 또는 퍼옥시좀일 수 있지만, 통상적으로 시토졸 또는 엽록체일 것이다.
세포 표적화를 위한 상기 메카니즘은 이들의 동족 프로모터와 연관되어서 뿐만 아니라, 이종성 프로모터와 연관되어 이용됨으로써 표적화 신호가 유래되는 프로모터와는 상이한 발현 패턴을 갖는 프로모터의 전사 조절하에 특정 세포 표적화를 달성할 수 있다.
발현 카세트 작제의 예
본 발명은 프로모터의 기원과 무관하게 식물에서 발현될 수 있는 임의의 프로모터의 조절하의 셀룰라제 유전자의 발현을 포함한다.
더욱이, 본 발명은 셀룰라제 유전자의 발현을 위해 요구되거나 또는 선택된 임의의 추가 서열과 연관된 임의의 식물-발현성 프로모터의 사용을 포함한다. 이러한 서열로는 전사 터미네이터, 발현을 증진시키기 위한 외부 서열(예: 인트론[예, Adh 인트론 1], 바이러스의 서열[예: TMV-Ω]), 및 특정 소기관 및 세포 구획에 대한 유전자 생성물의 표적화를 위해 의도된 서열을 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다.
1. 구성적 발현: CaMV 35S 프로모터
플라스미드 pCGN1761는 공개된 특허 출원 제EP 0 392 225호(실시예 23)에 개시되어 있다. pCGN1761는 "이중(double)" 35S 프로모터 및 tml 전사 터미네이터를 이 프로모터와 터미네이터 간의 독특한 EcoRI 부위와 함께 포함하고, pUC-형 골격을 갖는다. 존재하는 EcoRI 부위 외에 Notl 및 Xhol 부위를 포함하는 변이된 폴리링커를 갖는 pCGN1761의 유도체가 작제되었다. 이 유도체는 pCGN1761ENX라 칭한다. pCGN1761ENX는 트랜스젠 식물에서 35S 프로모터의 조절하에 이들의 발현 목적을 위해 이의 폴리링크 내에 cDNA 서열 또는 유전자 서열(미생물의 ORF 서열을 포함함)의 암호화를 위해 유용하다. 이러한 작제의 전체 35S 프로모터-유전자 서열-tml 터미네이터 카세트는 상기한 바의 형질전환 벡터로 전송하기 위해 프로모터에 대해 5'말단의 HindIII, SphI, SalI 및 Xbal 부위 및 터미네이터에 대해 3' 말단의 Xbal, BamHI 및 BglI에 의해 절개될 수 있다. 더욱이 이중 35S 프로모터 단편은 HindIII, SphI, SalI, Xbal 또는 PstI을 갖는 5' 절개부 및 다른 프로모터와의 대체를 위해 임의의 폴리링커 제한 부위(EcoRI, Notl 또는 XhoI)를 갖는 3' 절개부에 의해 제거될 수 있다.
2. 해독 개시 부위의 최적화에 의한 pCGN1761ENX의 변형
본 섹션에 기재된 임의의 작제를 위해, 클로닝 부위 주변의 변형은 해독을 증진시킬 수 있는 서열을 도입함으로써 이루어질 수 있다. 이는 미생물로부터 유래된 유전자가 식물 발현 카세트로 도입될 때 이들 유전자가 식물에서 해독의 개시에 적절할 수 있는 이들의 개시 메티오닌에 인접한 서열을 함유할 수 없으므로 특히 유용하다. 미생물로부터 유래된 유전자가 이들의 ATG에서 식물 발현 카세트로 클로닝되는 경우, 이들의 발현을 최적화하기 위해 이들의 삽입 부위를 변형시키는 것이 유용할 수 있다. pCGN1761ENX의 변형은 예를 들면 식물 발현을 위한 여러 가지 최적화된 서열들 중의 하나를 삽입시키는 것이 기재되어 있다[예: Joshi, supra].
pCGN1761ENX는 T4 DNA 폴리머라제로 처리된 SphI에 의해 절단되고, 재결찰되어, 이중 35S 프로모터에 대해 5' 말단에 위치하는 SphI 부위를 파괴한다. 이는 벡터 pCGN1761ENX/Sph-를 발생시킨다. pCGN1761ENX/Sph-는 EcoRI에 의해 절단되고, 서열 5'-AATTCTAAAGCATGCCGATCGG-3'/5'-AATTCCGATCGGCATGCTTTA-3'의 어닐링된 분자 연결기에 결찰된다. 이는 자신이 개시 메티오닌에 이종성 유전자를 클로닝하는데 적절한 SphI 부위의 일부인 ATG에 인접한 의사(quasi)-최적화된 식물 해독 개시 서열 TAAA-C를 삽입한 벡터 pCGNSENX를 발생시킨다. SphI 부위, EcoRI, Notl 또는 XhoI 부위의 하류가 보유된다.
개시 ATG에서 NcoI 부위를 이용하는 대안의 벡터가 작제된다. pCGN1761ENX라 칭하는 이러한 벡터는 pCGN1761NENX EcoRI 부위에 5'-AATTCTAAACCATGGCGATCGG-3'/5'-AATTCCGATCGCCATGGTTTA-3'의 서열의 어닐링된 분자 연결기를 삽입함으로써 이루어진다. 따라서, 이 벡터는 NcoI 부위 내에 있는 개시 ATG에 인접한 의사-최적 서열 TAAACC를 포함한다. 하류 부위는 EcoRI, Notl 또는 XhoI이다. 그러나, 이러한 조작 전에, pCGN1761ENX 벡터 내의 2개의 NcoI 부위(35S 프로모터 단위의 5'의 상류 위치에서)는 SphI에 대해 상기한 것과 유사한 기술을 사용하거나 또는 대안으로 "내부-외부" PCR을 사용하여 파괴된다[Innes 등, PCR 프로토콜: A guide to methods and applications, Academic Press, New York(1990)]. 이러한 조작은 클로닝 부위에 임의의 식물 cDNA 또는 리포터 유전자 서열을 삽입하고, 이어서 식물에서 일상적인 발현 분석에 의해 발현에 대한 임의의 가능한 유해 효과에 대해 분석될 수 있다.
3. 화학적으로 조절할 수 있는 프로모터하의 발현
이 섹션은 pCGN1761ENX 중의 이중 35S 프로모터를 선택된 임의의 프로모터로 대체하는 것을 기재하고 있으며; 예를 들면, 화학적으로 조절가능한 PR-1a 프로모터는 미국 특허 제5,614,395호에 개시되어 있으며. 그 전부를 참고 문헌으로서 인용하고, 화학적으로 조절 가능한 아라비돕시스 PR-1 프로모터는 미국 임시 출원 제60/027,228호에 개시되어 있으며, 이를 참고 문헌으로서 인용한다. 선택된 프로모터는 제한 효소에 의해 그 공급원으로부터 절개되는 것이 바람직하지만, 대안으로 적절한 말단 제한 부위를 갖는 프라이머를 사용하여 PCR-증폭될 수 있다. PCR-증폭이 이루어지는 경우, 프로모터는 표적 벡터에서 증폭된 프로모터의 클로닝 후 증폭 실수에 대해 점검하도록 재서열화되어야 한다. 화학적으로 조절 가능한 담배 PR-1a 프로모터는 플라스미드 pCIB1004로부터 절단되고(작제를 위한 EP 0 332 104, 실시예 21 참조), 플라스미드 pCGN1761ENX로 전송된다. pCIB1004는 NcoI에 의해 절단되고, 선형 단편의 생성된 3' 돌출부는 T4 DNA 폴리머라제로 처리함으로써 평활해진다. 이어서, 이 단편은 HindIII에 의해 분열되고 생성된 PR-1a 프로모터 함유 단편은 겔 정화되고, 이중 35S 프로모터가 제거됨으로써 pCGN1761ENX로 클로닝된다. 이는 XhoI에 의한 절단 및 T4 폴리머라제에 의한 평활화에 이어, HindIII에 의한 절단 및 pCIB1004 프로모터 단편이 클로닝되는 보다 큰 벡터-터미네이터 함유 단편의 단리에 의해 행해진다. 이는 PR-1a 프로모터 및 tml 터미네이터 및 독특한 EcoRI 부위와 Notl부위에 개재하는 폴리링커에 의해 pCGN1761ENX 유도체를 발생시킨다. 선택된 셀룰라제 유전자는 이러한 벡터로 삽입될 수 있고, 융합 생성물(즉, 프로모터-유전자-터미네이터)은 본 출원에 기재된 것들을 포함하여 임의의 선택된 형질전환 벡터로 순차로 전송될 수 있다.
여러가지 화학적 조절인자는 본 발명에 따라 형질전환된 식물에서 셀룰라제 암호화 서열의 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서의 내용에서, "화학적 조절인자"는 식물에서 PR-1a 프로모터를 위한 유도 인자, 또는 이의 유사한 유도체인 것으로 공지된 화학 물질을 포함한다. 본 발명의 화학적으로 유도 가능한 셀룰라제 유전자에 대한 조절인자의 바람직한 군은 벤조-1,2,3-티아디아졸(BTH) 구조에 기초하고, 그 예로는 하기 유형의 화합물: 즉, 벤조-1,2-3-티아디아졸카르복실산, 벤조-1,2-3-티아디아졸티오카르복실산, 시아노벤조-1,2-3-티아디아졸, 벤조-1,2-3-티아디아졸카르복실산 아미드, 벤조-1,2-3-티아디아졸카르복실산 히드라지드, 벤조-1,2-3-티아디아졸-7-카르복실산, 벤조-1,2-3-티아디아졸-7-티오카르복실산, 7-시아노벤조-1,2-3-티아디아졸, 벤조-1,2-3-티아디아졸-7-카르복실산 아미드, 벤조-1,2-3-티아디아졸-7-카르복실산 히드라지드, 알킬벤조-1,2-3-티아디아졸카르복실산염(여기서, 알킬기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유함), 메틸벤조-1,2-3-티아디아졸-7-카르복실산염, n-프로필벤조-1,2-3-티아디아졸-7-카르복실산염, 벤질벤조-1,2-3-티아디아졸-7-카르복실산염, 벤조-1,2-3-티아디아졸-7-카르복실산 2급-부틸히드라지드 및 이들의 적절한 유도체를 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다. 기타 화학적 유도 인자로는 예를 들면 벤조산, 살리실산(SA), 폴리아크릴산 및 이의 치환된 유도체; 저급 알킬, 저급 알콕시, 저급 알킬 티오 및 할로겐을 포함하는 적절한 치환체를 들 수 있다. 본 발명의 화학적으로 유도 가능한 DNA 서열의 조절인자의 또다른 군은 이소니코틴산 구조물 및 바람직하게는 할로이소니코틴산 구조물 등의 피리딘 카르복실산 구조물에 기초한다. 디클로로이소니코틴산 및 이의 유도체, 예를 들면 저급 알킬 에스테르가 바람직하다. 이러한 군의 화합물의 적절한 조절인자는 예를 들면 2,6-디클로로이소니코틴산(INA), 및 이의 저급 알킬 에스테르, 특히 메틸 에스테르이다.
4. 구성적 발현: 액틴 프로모터
액틴의 여러 가지 이소형태는 대부분의 세포 유형에 발현될 것으로 공지되어 있으며, 결과적으로 액틴 프로모터는 구성적 프로모터에 대한 양호한 선택이다. 특히, 벼의 Actl 유전자로부터의 프로모터가 클로닝되었으며, 특성화되었다[McElroy 등, Plant Cell 2: 163-171(1990)]. 이 프로모터의 1.3kb 단편은 벼의 원형질에서 발현에 요구되는 모든 조절 요소를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, Actl 프로모터에 기초한 수많은 발현 벡터는 단자엽 식물에서 사용하도록 특별히 작제되었다[McElroy 등, Mol. Gen. Genet. 231: 150-160(1991)]. 이들은 Actl-인트론 1, Adhl 5' 플랭킹 서열 및 Actl-인트론 1(옥수수 알콜 데히드로게나제 유전자로부터) 및 CaMV 35S 프로모터로부터의 서열을 삽입한다. 가장 높은 발현을 나타내는 벡터는 35S 및 Actl-인트론 또는 Actl 5' 플랭킹 서열 및 Actl-인트론의 융합체이다. 개시 ATG 주변의 서열의 최적화(GUS 리포터 유전자)는 역시 발현을 증진시켰다. McElroy 등이 개시한 프로모터 발현 카세트[Mol. Gen. Genet. 231: 150-160(1991)]는 셀룰라제 유전자의 발현을 위해 용이하게 변형될 수 있고, 단자엽 식물 숙주에서 사용하기에 특히 적합하다. 예를 들면, 프로모터 함유 단편들은 McElroy 작제물로부터 제거될 수 있고, pCGN1761ENX에서 이중 35S 프로모터를 대체하기 위해 사용되고, 이어서 특정 유전자 서열의 삽입을 위해 이용될 수 있다. 이와 같이 작제된 융합 유전자는 적절한 형질전환 벡터에 전송될 수 있다. 별개의 보고서에서, 이의 제1 인트론을 갖는 벼의 Actl 프로모터는 배양된 보리 세포에서 높은 발현을 나타내는 것으로 밝혀졌다[Chibbar 등, Plant Cell Rep. 12:506-509(1993)].
5. 구성적 발현: 유비퀴틴 프로모터
유비퀴틴은 많은 세포 유형에 축적되는 것으로 알려진 다른 유전자 생성물이고, 이의 프로모터는 이의 트랜스젠 식물[예: 해바라기-Bine 등, Plant Science 79:87-94(1991), 옥수수-Christensen 등, Plant Molec. Biol. 12:619-632(1989)]에서 사용하기 위한 여러 가지 종들로부터 클로닝되어 왔다. 옥수수 유비퀴틴 프로모터는 트랜스젠 단자엽 시스템에서 개발되었고, 이의 서열 및 단자엽 형질전환을 위해 작제된 벡터는 특허 공고 제EP 0342 926호(Lubrizol)에 개시되어 있다. 더욱이, Taylor 등[Plant Cell Rep. 12:491-495(1993)]은 옥수수 유비퀴틴 프로모터 및 제1 인트론 및 미세주입 피복을 통해 도입될 때 수 많은 단자엽 식물의 세포 현탁액에서 이의 고도 활성을 포함하는 벡터(pAHC25)를 개시하고 있다. 유비퀴틴 프로모터는 트랜스젠 식물, 특히 단자엽 식물에서 셀룰라제 유전자의 발현에 적합하다. 적절한 벡터는 적절한 유비퀴틴 프로모터 및(또는) 인트론 서열의 도입에 의해 변이된 pAHC25 또는 본 출원에 기재된 임의의 형질전환 벡터의 유도체이다.
6. 뿌리 특이적 발현
본 발명의 셀룰라제를 위한 발현의 또 다른 패턴은 뿌리 발현이다. 적절한 뿌리 프로모터는 de Framound[FEBS 290:103-106(1991)]가 개시한 것으로 공개된 특허 출원 제EP 0 452 269호[Ciba-Geigy]에 개시되어 있다. 이러한 프로모터는 셀룰라제 유전자의 삽입 및 전체 프로모터-유전자-터미네이터 카세트의 목적하는 형질전환 벡터로의 후속 전송을 위해 pCGN1761ENX 등의 적절한 벡터로 전송된다.
7. 손상-유도 가능한 프로모터
손상-유도성 프로모터가 셀룰라제 유전자의 발현에 적절할 수도 있다. 수 많은 이러한 프로모터는 문헌[예, Xu 등, Plant Molec. Biol. 22:573-588(1993), Logemann 등, Plant Cell 1:151-158(1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22: 783-792(1993), Firek 등, Plant Molec. Biol. 22: 129-142(1993), Warner 등, Plant J. 3:191-201(1993)]에 개시되어 있으며, 모두 본 발명에 사용하기에 적절하다.
Logemann 등은 쌍자엽 감자의 wunl 유전자의 5' 상류 서열을 개시하고, 있다. Xu 등은 쌍자엽 감자(pin2)로부터 손상-유도성 프로모터가 단자엽 벼에서 활성화됨을 보여준다. 더욱이, Rohrmeier & Lehle는 손상 유도되고, 표준 기술을 사용하여 동족 프로모터를 단리시키기 위해 사용될 수 있는 옥수수의 Wipl cDNA의 클로닝을 개시하고 있다. 마찬가지로, Firek 등 및 Warner 등은 국소적 손상 부위 및 병원체 침입 부위에 발현된 단자엽 아스파라거스(Asparagus officinalis)로부터 손상 유도된 유전자를 개시하고 있다. 당업계에 공지된 클로닝 기술을 사용함으로써, 이들 프로모터는 본 발명의 셀룰라제 유전자에 융합되고, 식물 손상 부위에 이들 유전자를 발현시키기 위해 사용되는 적절한 벡터로 전송될 수 있다.
8. 속(Pith)의-바람직한 발현
특허 출원 제WO/93/07278호(Ciba-Geigy)는 속 세포에 선택적으로 발현된 옥수수의 trpA 유전자의 단리를 개시하고 있다. 유전자 서열 및 프로모터는 전사의 개시부위로 부터 -1726까지 이른다. 표준 분자 생물학적 기술을 사용하면, 이러한 프로모터 또는 이의 일부는 35S 프로모터를 대체할 수 있는 경우의 pCDN1761 등의 벡터에 전송될 수 있고, 속-바람직한 방식으로 외래 유전자의 발현을 유도하도록 사용될 수 있다. 사실상, 속-바람직한 프로모터 또는 이의 일부를 함유하는 단편들은 임의의 벡터로 전송될 수 있고, 트랜스젠 식물에 사용하도록 변형될 수 있다.
9. 잎-특이적 발현
포스포엔올 카르복실라제를 암호화하는 옥수수 유전자(PEPC)는 Hudspeth & Grula[Plant Molec. Biol 12:579-589(1989)]가 개시하고 있다. 표준 분자 생물학적 기술을 사용하면, 이러한 유전자를 위한 프로모터는 트랜스젠 식물에서 잎-특이적 방식으로 임의의 유전자의 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있다.
10. 엽록체 표적화에 의한 발현
Chen & Jagendorf[J. Biol. Chem. 268:2363-2367(1993)]는 이종성 전이유전자의 도입을 위한 엽록체 운반 펩티드의 성공적인 사용을 개시하고 있다. 이와 같이 사용된 펩티드는 니코티아나 플럼배기나폴리아(Nicotiana Plumbaginifolia)의 rbcS 유전자로부터의 운반 펩티드이다[Poulsen 등, Mol. Gen. Genet. 205:193-200 (1986)]. 제한 효소 Dral 및 SphI, 또는 Tsp5091 및 SphI를 사용함으로써, 이러한 운반 펩티드를 암호화하는 DNA 서열은 플라스미드 prbcS-8B로부터 절개될 수 있고, 상기한 바의 임의의 작제에 의해 사용하도록 조작될 수 있다. Dral-SphI 단편은 개시 rbcS ATG에 대해 -58에 까지 이르고, 도입된 절단 부위 직후 성숙한 펩티드의 제1 아미노산(또한 메티오닌)을 포함하는 한편, Tsp5091-SphI 단편은 개시 rbcS ATG에 대해 -8까지 이르고, 성숙한 펩티드의 제1 아미노산을 포함한다. 따라서, 이들 단편은 선택된 프로모터(예: 355, PR-1a, 액틴, 유비퀴틴 등)의 미해독된 리더에 대한 전사 융합을 발생시키는 임의의 선택된 발현 카세트의 폴리링커에 적절히 삽입될 수 있는 한편, 운반 펩티드 하류의 정확한 융합에서 셀룰라제 유전자의 삽입을 가능하게 한다. 이러한 종류의 작제는 당업계에서 일상적이다. 예를 들면, Dral 말단은 이미 평활해진 반면, 5' Tsp5091 부위는 T4 폴리머라제 처리에 의해 평활해질 수 있거나, 또는 대안으로 선택된 프로모터에 대한 이의 융합을 촉진시키기 위해 링커 또는 연결기 서열에 결찰될 수 있다. 3' SphI 부위는 이와 같이 유지될 수 있거나, 또는 대안으로 선택된 셀룰라제 유전자의 후속 삽입을 위해 적절한 제한 부위를 이용할 수 있는 방식으로 선택된 벡터로의 이의 삽입을 촉진시키는 링커 서열의 연결기에 결찰될 수 있다. 이상적으로 SphI 부위의 ATG는 유지되고, 선택된 셀룰라제 유전자의 제1 ATG를 포함한다. Chen & Jagendorf는 엽록체 도입을 위한 이상적인 절단을 위한 공통 서열을 제공하고, 각각의 경우에 성숙한 단백질의 제1 위치에는 메티오닌이 바람직하다. 후속 위치에는 보다 많은 변화가 있을 수 있고, 아미노산은 그렇게 중요치 않을 수 있다. 임의의 경우에, 융합 작제는 Bartlett 등이 개시한 방법을 사용하는 시험관내 도입 효율에 대해 평가될 수 있다[In: Edelmann 등(Eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier, 1081-1091페이지(1982) 및 Wasmann 등, (Mol. Gen. Genet. 205: 446-453(1986)]. 전형적으로, 최상의 시도는 아미노 말단에 변형체가 없는 선택된 셀룰라제 유전자를 사용하는 융합을 발생시킬 수 있는 것이고, 이러한 융합이 고 효율로 도입된 엽록체가 아님이 분명할 때 변형을 유일하게 도입하고, 이 경우, 변형은 출판된 문헌에 따라 이루어질 수 있다(Chen & Jagendorf; Wasman 등, Ko & Ko, J. Biol. Chem. 267:13910-13916(1992)).
바람직한 벡터는 prbcS-8B로부터의 단편을 암호화하는 Dral-SphI 운반 펩티드를 클로닝 벡터 pCGN1761ENX/Sph-로 전이시킴으로써 작제된다. 이러한 플라스미드는 EcoRI에 의해 절단되고, 말단은 T4 DNA 폴리머라제로 처리함으로써 평활해진다. 플라스미드 prbcS-8B는 SphI에 의해 절단되고, 서열 5'-CCAGCTGGAATTCCG-3'/5'- CGGAATTCCAGCTGGCATG-3'의 어닐링된 분자 연결기에 결찰된다. 이 결과의 생성물은 T4 키나제로 처리함으로써 5'-말단 포스포릴화된다. Dral에 의한 후속 절단은 상기 변형된 벡터의 평활-말단-EcoRI외 부위에 결찰된 운반 펩티드 암호화 단편을 방출한다. 35S 프로모터의 3'말단에 인접한 삽입물의 5' 말단로 배향된 클론은 서열화에 의해 식별된다. 이들 클론은 rbcS ATG에 대해 -58로부터 성숙한 단백질의 ATG에까지 이르는 rbcS-8A 프로모터-운반 펩티드 서열에 35S 리더 서열의 DNA 융합을 수반하고, 이 위치에서 독특한 SphI 및 새롭게 생성된 EcoRI 뿐만 아니라 pCGN1761ENX의 현재하는 Notl 또는 XhoI 부위를 포함한다. 이와 같이 새로운 벡터는 pCGN1761/CT라 칭한다. DNA 서열은 PCR 기술을 사용하여 증폭하고, 증폭된 ATG에서 SphI, NSphI 또는 NlaIII를 삽입함으로써 동일 프레임의 pCGN1761/CT로 전송되고, 제한 효소 절단 후, 적절한 효소는 SphI-절단된 pCGN1761/CT로 결찰된다. 작제를 용이하게 하기 위해, 클로닝된 유전자의 제2 아미노산을 변화시키는 것이 필요할 수 있지만, 거의 모든 경우에 표준 부위 검출 뮤타겐시스와 함께 PCR을 사용하는 것은 절단 부위 및 성숙한 단백질의 제1 메티오닌 주변의 임의의 목적하는 서열의 작제를 가능하게 할 것이다.
보다 바람직한 벡터는 -1038(전사 시작 부위에 상대적임)로부터 성숙한 단백질의 제1 메티오닌에 이르기까지 완전한 길이의 약간 조절된 rbcS-8A 프로모터를 함유하는 prbcS-8A의 BamHI-SphI 단편으로 이중 pCGN1761ENX의 35S 프로모터를 대체함으로써 작제된다. 파괴된 SphI에 의해 변형된 pCGN1761는 PstI 및 EcoRI에 의해 절단되고, 말단을 평활하게 하기 위해 T4 DNA 폴리머라제로 처리한다. prbcS-8A는 SphI에 의해 절단되고, 상기 서열의 어닐링된 분자 연결기에 결찰된다. 생성물은 T4 키나제로 처리함으로써 5'-말단 포스포릴화된다. BamHI에 의한 후속 절단은 BamHI 말단을 평활하게 하기 위해 T4 DNA 폴리머라제로 처리한 단편을 함유하는 프로모터-운반 펩티드를 방출한다. 이와 같이 발생된 프로모터-운반 펩티드 단편은 제조된 pCGN1761ENX 벡터로 클로닝되고, 이종성 유전자의 삽입을 위해 절단 부위에 위치하는 SphI 부위에 의해 rbcS-8A 프로모터 및 운반 펩티드를 포함하는 작제물을 발생시킨다. 더욱이, SphI 하류에는 EcoRI (재창조됨), Notl 또는 XhoI 클로닝 부위가 존재한다. 이러한 작제는 pCGN1761rbcS/CT라 칭한다.
유사한 조작이 다른 공급원(단자엽 식물 및 쌍자엽 식물)으로부터 및 기타 유전자로부터의 다른 GS2 엽록체 운반 펩티드 암호화 서열을 이용하도록 행해질 수 있다. 또한, 유사한 방법이 미토콘드리아 등의 다른 아세포 구획으로의 표적화가 달성되도록 이어질 수 있다.
쌍자엽 식물의 형질전환
쌍자엽 식물에 대한 형질전환 기술은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 그 예로는 아그로박테륨(Agrobacterium)-기재 기술 및 아그로박테륨(Agrobacterium)을 요하지 않는 기술을 들 수 있다. 비-아그로박테륨(non-Agrobacterium) 기술은 원형질 또는 세포에 의해 직접적으로 외인성 유전자 물질을 흡수하는 것과 연관된다. 이는 PEG 또는 전기천공 매개된 흡입, 입자 피복-매개된 전달 또는 미세주사에 의해 달성될 수 있다. 이들 기술의 예는 문헌[Paszkowski 등, EMBO J 3:2717-2722(1984); Potrykus 등, Mol. Gen. Genet. 199:169-177(1985), Reich 등, Biotechnology 4:1001-1004(1986) 및 Klein 등, Nature 327:70-73(1987)]에 기재되어 있다. 각각의 경우에, 형질전환된 세포들은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 전체 식물에 재생성된다.
아그로박테륨(Agrobacterium)-매개된 형질전환은 이의 큰 형질전환이 고효율 및 많은 상이한 종과의 이의 광범위한 유용성 때문에 쌍자엽 식물의 형질전환에 바람직한 기술이다. 아그로박테륨(Agrobacterium)에 의해 일상적으로 형질전환될 수 있는 많은 작물 종으로는 담배, 토마토, 해바라기, 면화, 평지씨, 감자, 대두, 자주개자리 및 포플러(EP 0 317 511(면화[1313]), EP 0 249 432(토마토, Calgene), WO 87/07299(Brassica, Calgene), US 4,795,855(포플라))를 들 수 있다. 아그로박테륨(Agrobacterium) 형질전환은 동시 잔존하는 Ti 플라스미드 상에 또는 염색체(예: pCIB200 또는 pCIB2001에 대한 균주 CIB542(Uknes 둥, Plant Cell 5: 159-169(1993)) 상의 숙주 아그로박테륨(Agrobacterium) 균주가 갖는 vir 유전자의 보충에 의존할 수 있는 적절한 아그로박테륨(Agrobacterium) 균주로의 목적하는 외래 DNA를 갖는 2성분 벡터(예: pCIB200 또는 pCIB2001)의 전송을 포함한다. 재조합 벡터의 아그로박테륨(Agrobacterium)으로의 전송은 재조합 2성분 벡터를 갖는 이. 콜리(E. Coli), pRK2013 등의 플라스미드를 갖는 헬퍼 이. 콜리(E. Coli) 균주에 의해 수행되고, 표적 아그로박테륨(Agrobacterium) 균주로 재조합 2성분 벡터를 이동시킬 수 있다. 대안으로, 재조합 2성분 벡터는 DNA 형질전환에 의해 아그로박테륨(Agrobacterium)에 전송될 수 있다.[Hofgen & Willmitzer, Nucl. Acids. Res 16:9877(1988)].
재조합 아그로박테륨(Agrobacterium)에 의한 표적 식물 종의 형질전환은 통상적으로 식물로부터 이식편(explant)과 아그로박테륨(Agrobacterium)을 동시 배양시키는 것과 연루되고, 당업계에 잘 알려진 프로토콜에 따른다. 형질전환된 조직은 2성분 플라스미드 T-DNA 경계 사이에 존제하는 항생제 또는 제조제 내성 마커를 갖는 선택할 수 있는 배지 상에서 재발생된다.
단자엽 식물의 형질전환
대부분의 단자엽 식물의 형질전환은 역시 일상적이다. 바람직한 기술로는 PEG 또는 전기천공을 사용하는 유전자의 원형질로의 직접적인 전송, 유합 조직으로 입자 피폭을 들 수 있다. 형질전환은 단일 DNA종 또는 다중 DNA 종(즉, 동시-형질전환)으로 행해지거나, 이들 기술 모두는 본 발명과 사용하기에 적절하다. 동시-형질전환은 복잡한 벡터 작제를 피하고, 목적하는 유전자에 대한 링크되지 않은 장소 및 선택가능한 마커에 따라 트랜스젠 식물을 발생시키고, 후속 세대에서 선택가능한 마커를 제거할 수 있는 장점을 갖으므로 이는 바람직한것으로 고려되어야 한다. 그러나, 동시 형질전환 사용의 단점은 별개의 DNA 종이 게놈에 통합됨에 따라 100% 미만의 빈도를 갖는다[Schocher 등, Biotechnology 4: 1093-1096(1986)].
특허 출원 제EP 0 292 435호([1280/1281], Ciba-Geigy), 제EP 0 392 225호(Ciba-Geigy) 및 제WO 93/07278호(Ciba-Geigy)는 옥수수의 정선된 순계로부터 유합 조직 및 원형질의 제조, PEG 또는 전기천공을 사용하는 원형질의 형질전환, 및 형질전환된 원형질로부터 옥수수 식물의 재발생을 위한 기술이 기재되어 있다. Gordon-Kamm 등[Plant Cell 2: 603-618(1990)] 및 Fromm 등[Biotechnology 8:833-839(1990)]는 입자 피폭을 사용하는 A188-유도된 옥수수 계열의 형질전환 기술을 공개하였다. 더욱이 출원 제WO93/07278호(Ciba-Geigy) 및 Koziel 등 (Biotechnology 11:194-200(1993))는 입자 피폭에 의해 옥수수의 정선된 순계의 형질전환 기술을 개시한다. 이러한 기술은 수분 작용 후 14 내지 15일 후 옥수수 알맹이들로부터 절개된 1.5 내지 2.5 mm 길이의 미성숙한 옥수수 배 및 피폭을 위한 PDS-1000He 바이오리스틱스(Biolistics) 장치를 이용한다.
벼의 형질전환은 원형질 또는 입자 피폭을 이용하는 직접적인 유전자 전송 기술에 의해 수행될 수 있다. 원형질-매개된 형질전환은 Japonica-형 및 Indica-형에 대해 기재하고 있다(Zhang 등, Plant Cell Rep 7: 379-384(1988); Shimamoto 등, Nature 338: 274-277(1989); Datta 등, Biotechnology 8:736-740(1990)). 모두 입자 피폭을 사용하여 일상적으로 형질전환될 수 있다[Christou 등, Biotechnology 9:957-962(1991)].
특허 출원 제EP 0 332 581호(Ciba-Geigy)는 Pooedease 원형질의 발생, 형질전환 및 재발생을 개시한다. 이들 기술은 닥틸리스(Dactylis) 및 밀의 형질전환을 허용한다. 더욱이 밀의 형질전환은 Vasil 등에 의해[Biotechnology 10:667-674(1992)] C 긴-말단 재생성 유합 조직의 세포로 입자 피폭을 사용하는 것이 기재되어 있고, 또한 Vasil 등[Biotechnology 11:1553-1558(1993)] 및 Weeks 등[Plant Physiol. 102: 1077-1084(1993)]에 의해 미성숙한 배 및 미성숙한 배-유도된 유합 조직의 입자 피폭을 사용하는 것이 기재되어 있다. 그러나, 밀의 형질전환을 위한 바람직한 기술은 미성숙한 배의 입자 피폭에 의한 밀의 형질전환과 연관되며, 유전자 전달 전에 큰 자당 또는 큰 맥아당 단계를 포함한다. 피폭 전에, 임의의 수의 배(0.75 mm 길이)가 3% 자당[Murashiga & Skoog, Physiologia Plantarum 15:473-497(1962)]을 갖는 MS 배지 상에 평판 배양되고, 체강 배의 유도를 위해 3 mg/1,2,4-D가 암실에서 처리된다. 피폭일이 선택됨에 따라, 배는 유도 배지로부터 제거되어 오스모티쿰(osmoticum)(즉, 자당 또는 맥아당을 갖는 유도 배지가 목적하는 농도, 전형적으로 15%로 첨가됨) 상에 놓인다. 배들은 2-3시간 동안 원형질 분리된 후 피폭된다. 중요한 것은 아니지만, 표적 플레이트당 20개의 배가 전형적이다. 적절한 유전자를 갖는 플라스미드(pCIB3064 또는 pSG35)가 표준 방법을 사용하는 마이크로미터 크기의 금 입자들 상에 침전된다. 배의 각각의 플레이트는 표준 80 메시 스크린을 사용하고 ∼1000psi의 파열압을 사용하는 DuPont BiolisticsR헬륨 장치로 장탄하였다. 피폭 후, 배는 약 24 시간 동안 회수하기 위해 다시 암실에 놓았다(여전히 오시모티쿰 상에서). 24시간 후, 배를 오스미티쿰으로부터 제거하여 이들이 재발생 전 약 한달 동안 머물 유도 배지 상에 다시 두었다. 약 한달 후, 발생되는 배발생성 유합조직을 갖는 배 이식편이 추가로 적절한 선택제(pCIB3064의 경우에 10 mg/l 베스타 및 pSOG35의 경우에 2mg/l의 메토트렉세이트)를 함유하는 형질전환 배지(MS + 1mg/l NAA, 5mg/l GA)에 전송되었다. 약 한달 후, 발생된 쇼트(shoot)를 1/2-농도의 MS, 2% 자당 및 동일한 농도의 선택제를 함유하는 "GA7"로서 공지된 큰 멸균 용기로 옮겼다. 특허 출원 제08/147,161호는 밀의 형질전환을 위한 방법을 개시하고 있으며, 참고 문헌으로서 이를 인용한다.
엽록체 형질전환
색소체 형질전환 기술이 미국 특허 제5,451,513호, 동 제5,545,817호 및 동 제5,545,818호; PCT 출원 제 WO95/16783호; 및 McBride 등(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305에 기재되어 있으며, 모두 참고 문헌으로서 인용한다. 엽록체 발현을 위한 기본 기술은 목적하는 유전자와 함께 선택가능한 마커를 플랭킹하는 클로닝된 색소체 DNA의 영역을 적절한 표적 조직에 도입하고, 예를 들면 바이오리스틱스 또는 원형질체 형질전환(예: 염화칼슘 또는 PEG 매개된 형질전환)과 연관된다. 표적화 서열이라 칭하는 1 내지 1.5 kb 플랭킹 영역은 색소체 게놈과의 상동 재조합을 용이하게하고, 플라스톰(plastome)의 특정 영역의 치환 또는 변형을 허용한다. 초기에 엽록체 16S rRNA에서 점 돌연변이 및 스펙티노마이신 및(또는) 스트렙토마이신에 대한 내성을 부여하는 rps12 유전자가 형질전환을 위한 선택성 마커로서 이용되었다[Svab, Z., Hajdukiewica, P., 및 Maliga, P.(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA87,8526-8530; Staub, J. M., 및 Maliga, P.(1992) Plant Cell 4:39-25, 이들을 참고 문헌으로서 인용함]. 이는 100피폭의 표적 수준 당 약 1의 빈도로 안정한 동종플라즘 형질전환을 초래하였다. 이들 마커들 간의 클로닝 부위의 존재는 외래 유전자의 도입을 위한 색소체 표적화 벡터의 창출을 허용한다[Staub, J. M. 및 Maliga, Pl(1993) EMBO J. 12, 601-606, 이를 참고 문헌으로 인용함]. 형질전환 빈도의 실질적인 증가는 퇴행성 rRNA 또는 r-단백질 항체 내성 유전자를 우세한 선택성 마커인 스펙티노마이신-해독 효소 아미노글리코시드-3'-아데닐트랜스퍼라제를 암호화하는 세균 aadA 유전자로 대체함으로써 얻어졌다[Svab, Zl, 및 Maliga, P.(1993) Proc.Natl. Acad. Sci. USA90, 913-917, 참고 문헌으로 인용함]. 이미, 이러한 마커는 녹조류 클라미도모나스 계열하르티(Chlamydomonas reinhardtii)의 색소체 게놈의 고-빈도 형질전환을 위해 성공적으로 사용되었다[Goldschmidt-Clermont, M.(1991) Nucl. Acids Res. 19, 4083-4089, 참고 문헌으로 인용함]. 색소체 형질전환에 유용한 다른 선택성 마커는 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 범위에 포함된다. 전형적으로, 형질전환 후, 약 15-20 세포 절단 사이클이 동종색소체 상태에 도달하도록 요구된다.
각각의 식물 세포 내에 존재하는 원형 색소체 게놈의 수천개의 사본 모두에 유전자가 상동 재조합에 의해 삽입되는 경우의 색소체 발현은 전체 가용성 식물 단백질의 10%를 용이하게 초과할 수 있는 발현 수준을 허용하도록 핵-발현된 유전자에 비해 유리한 수많은 사본 수의 장점을 갖는다. 그러나, 이와 같이 높은 발현 수준은 특히 초기 식물 성장 및 발생 시에 생존 능력 문제점을 가질 가능성이 있다. 유사한 문제점들이 트랜스젠 식물의 생존에 고도로 유해할 수 있는 생물 활성 효소 또는 단백질의 발현에 의해 제기되고, 따라서, 구성적으로 발현된 경우는 식물 게놈에 성공적으로 도입될 수 없다. 따라서, 일면에서, 본 발명은 담배의 화학적-유도성 PR-1a 프로모터[US 특허 제5,614,395호, 참고 문헌으로 인용함]의 조절하에 엽록체-표적의 파지 T7 RNA 폴리머라제의 핵의 게놈에서 발현을 T7 유전자 10 프로모터/터미네이터 서열로 조절된 엽록체 리포터 전이유전자 커플링시킨다. 예를 들면, β-글루쿠로니다제(GUS) 리포터를 암호화한 모체에 의한 유전된 uidA 유전자에 대해 동종플라즘의 색소체 형질전환체가 핵에서 T7 폴리머라제를 발현시키는 계열에 의해 수분될 때, 두 전이유전자 작제물을 갖지만 GUS 단백질은 발현시키지 않는 F1 식물이 얻어진다. 효소적 활성 GUS의 대량 합성은 PR-1a 유도 인자 화합물 벤조(1,2,3)티아디아졸-7-카르보티오산 S-메틸 에스테르(BTH)의 잎의 적용 후에만 이들 식물의 색소체에서 시발된다. 아래 실시예의 섹션 C에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 이러한 엽록체-표적된 T7 RNA 폴리머라제 발현 시스템을 사용하는 셀룰로스-분해 효소의 대량 합성을 제공한다.
본 발명을 하기 실시예를 참조하여 추가로 기재할 것이다. 이들 실시예는 달리 지적하지 않는 한 예시의 목적으로만 제공된 것으로 제한하려는 것이 아니다.
본 명세서에 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 문헌[J. Sambrook, E.F. Fritsch 및 T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor lavoratory, Cold Spring Harbor, NY(1989) 및 T.J. Silhavy, M.L. Berman, 및 L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor lavoratory, Cold Spring Harbor, NY(1984) 및 Ausubel, F.M. 등, Current Protocols in Molecular Biology, pub. Greene Publishing Assoc. 및 Wiley-Interscience(1987)]에 개시되어 있다.
A. 식물 시토졸에서 셀룰라제의 발현
실시예 A1: 담배 PR-1a 프로모터에 융합된 서열을 암호화하는 티. 푸스카(T. fusca) E1 셀룰라제를 함유하는 키메라 유전자의 제조
엔도글루카나제 활성을 갖는 단백질에 대해 암호화한, 티. 푸스카 E1 유전자(GenBank 기탁 번호 L20094)를 함유하는 플라스미드 pGFE1[Jung 등(1993) Appl. Environ. Microbiol. 59, 3032-3043]가 성숙한 E1 단백질의 최초의 코돈 앞에 ATG, 성숙한 단백질의 제1의 21 염기쌍 및 새롭게 생성된 ATG에서 NcoI 제한 부위를 포함하는 좌측에서 우측으로 "상단 쇄" 프라이머(프라이머 E11: GCG CCC ATG GAC GAA GTC AAC CAG ATT CGC) 및 E1 유전자의 새롭게 생성된 ATG로부터 322 내지 346 위치에 일치하는 우측에서 좌측으로 "하단 쇄" 프라이머(프라이머 E12: CCA GTC GAC GTT GGA GGT GAA GAC)를 갖는 PCR에 대한 주형으로서 사용되었다. 이러한 PCR 반응은 제조업자의 추천(Perkin Elmer/Roche, Branchburg, NJ)에 따라 94℃(30s), 40℃(60s) 및 72℃(30s)에서 5 주기 동안, 이어서, 94℃(30s), 55℃(60s) 및 72℃(30s)에서 25 주기 동안 AmpliTaq DNA 폴리머라제에 의해 수행하였다. 이는 이의 좌측 말단에 NcoI 부위 및 이의 우측 말단에 EcoRI 부위를 함유하는 352bp의 생성물을 발생시키고, 신호 서열 없이 E1 유전자의 5'말단을 포함시켰다. 단편을 표준 방법을 사용하여 겔 정제하고, NcoI 및 EcoRI(모든 제한 효소는 Promega, Madison, WI 또는 New England Biolabs, Beverly, MA)로 절단시키고, pE1을 얻기 위해 pTC191[De La Fuente 등(1994) Gene 139, 83-86]의 NcoI 및 EcoRI 부위에 결찰시켰다.
이어서, 플라스미드 pGFE1을 EcoRI 및 ScaI로 분해시켰다. E1 유전자의 3'말단을 함유하는 3.0kb 길이의 EcoRI 단편을 겔 정제시키고, 이미 EcoRI로 분해된 pE1로 결찰시켜 신호 서열 없는 전체 E1 유전자를 함유하는 pCTE1을 얻었다. 플라스미드 pCTE1는 NcoI 및 SacI로 분해시켰다. E1 유전자를 함유하는 3.3 kb 길이의 단편을 겔 정제시키고, 903 bp 길이의 담배 PR-1a 프로모터와 nos 유전자 말단 신호 사이의 pJG203의 NcoI 및 SacI 부위에 결찰[Uknes 등(1993), The Plant Cell 5, 159-169, 추가의 SacI 부위의 제거에 의해 변이됨 Joern Goerlach, notebook no. 2941, 4-9 및 13-15페이지] 시켜, 담배 PR-1a 프로모터에 융합된 E1 유전자를 함유하는 pTPR1E1을 얻었다(도 1).
플라스미드 pTPR1E1을 Xhol 및 Xbal로 분해시키고, 키메라 E1 유전자 작제물을 함유하는 4.5kb 길이의 단편을 겔 정제시키고, 2성분 벡터 pEGL101을 얻기 위해 pBHYGM의 Xhol 및 Xbal 부위에 결찰시켰다. pBHYGM은 BfrI/ ApaIl / ClaI/ SamI/ BfrI/ XbaI/ SalI/ Pstl/ Sphl/ HindIII 제한 부위를 함유하는 폴리링커를 pGPV-Hyg의 EcoRI 및 Xbal 부위에 삽입함으로써 생산된 변형된 pGPV-Hyg이다.
실시예 A2: 담배 PR-1a 프로모터에 융합된 서열을 암호화한 티. 푸스카 E2 셀룰라제를 함유하는 키메라 유전자의 제조
셀로비오히드롤라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는, 티. 푸스카 E2 유전자(GenBank 기탁 번호 L73321)를 함유하는 플라스미드 pJT17[Ghangas 등(1988) Appl. Environ. Microbiol. 54, 2521-2526; Lao 등(1991) J. Bacteriol. 173, 3397-3407]가 E2 신호 서열의 최종 코돈 앞에 ATG, 성숙한 단백질의 제1의 18 염기쌍 및 새롭게 생성된 ATG에서 NcoI 제한 부위를 포함하는 좌측에서 우측으로 "상단 쇄" 프라이머(프라이머 E21: GCG CGC CAT GGC CAA TGA TTC TCC GTT CTA C) 및 E2 유전자의 새롭게 생성된 ATG로부터 310 내지 334 위치에 일치하는 우측에서 좌측으로 "하단 쇄" 프라이머(프라이머 E22: GGG ACG GTT CTT CAG TCC GGC AGC)를 갖는 PCR에 대한 주형으로서 사용되었다. 이러한 PCR 반응은 제조업자의 추천에 따라 94℃(30s), 40℃(60s) 및 72℃(30s)에서 5 주기 동안, 이어서, 94℃(30s), 55℃(60s) 및 72℃(30s)에서 25 주기 동안 AmpliTaq DNA 폴리머라제에 의해 수행하였다. 이는 이의 좌측 말단에 NcoI 부위 및 이의 우측 말단에 EcoRI 부위를 함유하는 341bp의 생성물을 발생시키고, 신호 서열 없이 E2 유전자의 5'말단을 포함시켰다. 단편을 표준 방법을 사용하여 겔 정제하고, NcoI 및 EcoRI로 절단시키고, pE2을 얻기 위해 pTC191의 NcoI 및 EcoRI 부위에 결찰시켰다.
이어서, 플라스미드 pJT17을 EcoRI 및 SacI로 분해시켰다. E2 유전자의 3'말단을 함유하는 1.7kb 길이의 단편을 겔 정제시키고, 이미 EcoRI 및 SacI로 분해된 pE2로 결찰시켜 신호 서열 없는 전체 E2 유전자를 함유하는 pCTE2를 얻었다. 플라스미드 pCTE2는 NcoI 및 SacI로 분해시켜 E2 유전자를 함유하는 2.0 kb 길이의 단편을 겔 정제시키고, pJG203의 NcoI 및 SacI 부위에 결찰시켜, 903 bp 길이의 담배 PR-1a 프로모터 단편에 융합된 E2 유전자를 함유하는 pTPR1E2를 얻었다(도 1).
플라스미드 pTPR1E2를 Xhol 및 Xbal로 분해시키고, 키메라 E2 유전자 작제물을 함유하는 2.9kb 길이의 단편을 겔 정제시키고, pBHYGM의 Xhol 및 Xbal 부위에 결찰시켜 pEGL102를 작제하였다.
실시예 A3: 담배 PR-1a 프로모터에 융합된 서열을 암호화하는 티. 푸스카 E5 셀룰라제를 함유하는 키메라 유전자의 제조
엔도글루카나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는, 티. 푸스카 E5 유전자(GenBank 기탁 번호 L01577)를 함유하는 pD370의 변형된 버전인 플라스미드 pD374[Collmer 및 Wilson(1983) Biotechnology 1:594-601; Lao 등(1991) J. Bacteriol. 173, 3397-3407]가 성숙한 E5 단백질의 최초의 코돈 전에 ATG, 성숙한 단백질의 제1의 21 염기쌍 및 새롭게 생성된 ATG에서 NcoI 제한 부위를 포함하는 좌측에서 우측으로 "상단 쇄" 프라이머(프라이머 E51: CGC CCA TGG CCG GTC TCA CCG CCA CAG TC) 및 E5 유전자의 새롭게 생성된 ATG로부터 89 내지 114 위치에 일치하는 우측에서 좌측으로 "하단 쇄" 프라이머(프라이머 E52: GAC GAC CTC CCA CTG GGA GAC GGT G)를 갖는 PCR에 대한 주형으로서 사용되었다. 이러한 PCR 반응은 제조업자의 추천에 따라 94℃(30s), 40℃(60s) 및 72℃(30s)에서 5 주기 동안, 이어서, 94℃(30s), 55℃(60s) 및 72℃(30s)에서 25 주기 동안 AmpliTaq DNA 폴리머라제에 의해 수행하였다. 이는 이의 좌측 말단에 NcoI 부위 및 이의 우측 말단에 Xhol 부위를 함유하는 119bp의 생성물을 발생시키고, 신호 서열 없이 E5 유전자의 5'말단을 포함시켰다. 단편을 표준 방법을 사용하여 겔 정제하고, NcoI 및 Xhol로 절단시키고, pCIB4247의 NcoI 및 Xhol 부위에 결찰시켜 pCE5를 얻었다. pCIB4247는 NcoI, Xhol 및 EcoRI 제한 부위를 갖는 폴리링커를 함유하는 pUC19 유도체이다[Yanisch-Perron 등, (1985) Gene 33, 103-119].
전체 E5 유전자를 재작제하기 위해, E5 유전자 3'말단을 함유하는 pD374의 1.4kb 길이 Xhol/PvuII 단편을 Xhol, EcoRV 및 EcoRI 제한 부위를 갖는 폴리링커를 함유하는 pICEM19R+pUC19 유도체의 Xhol 및 EcoRV 부위로 서브클로닝되었고, Xhol/EcoRI 단편으로서 절개되고, 전체 E5 유전자를 함유하는 pCTE5로부터 pCE5의 Xhol 및 EcoRI 부위에 결찰되었다. pCTE5는 EcoRI로 분해되고, EcoRI 부위의 돌출 말단은 DNA 폴리머라제 I Klenow 단편(Promega, Madison, WI)으로 충전시키고, 플라스미드 DNA는 Ncol로 추가로 분해시켰다. E5 유전자를 함유하는 1.5kb 길이의 단편을 겔 정제시키고, pJG203의 NcoI 및 EcoICRI 부위에 결찰시켜 903 bp 길이의 담배 PR-1a 프로모터에 융합된 E5 유전자를 함유하는 pTPR1E5를 얻었다(도 1).
플라스미드 pTPR1E5를 Apal, Xbal 및 Sacl로 분해시키고, 키메라 E5 유전자 작제물을 함유하는 2.7kb 길이의 Apal/Xbal 단편을 겔 정제시키고, pBHYGM의 Apal 및 Xbal 부위에 결찰시켜 pEGL105를 작제하였다.
실시예 A4: CaMV 35S 프로모터에 융합된 서열을 암호화하는 티. 푸스카 E5 셀룰라제를 함유하는 키메라 유전자의 제조
E5 유전자를 함유하고 이의 돌출 말단가 Klenow DNA 폴리머라제로 이미 충전된 pCTE5의 1.5 kb 길이 NcoI/EcoRI 단편을 겔 정제시키고, 복제된 CaMV 35S 프로모터[Kay 등(1987) Science 236, 1299-1302]와 tml 유전자 말단 신호[Ream 등(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1660-1664] 간의 pCGN1761의 충전된 EcoRI 부위에 결찰되어 p35SE5를 초래한다(도 1). 키메라 유전자를 함유하는 p35SE5의 4.6kb 길이 단편이 pBHYGM의 Xbal 부위에 삽입되어 pEGL355를 얻었다.
실시예 A5: CaMV 35S 프로모터에 융합된 서열을 암호화하는 티. 푸스카 E1 셀룰라제를 함유하는 키메라 유전자의 제조
E1 유전자를 함유하는 pCTE1의 3.3 kb 길이 NcoI(충전됨)/SacI 단편을 겔 정제시키고, pCGN1761의 충전된 EcoRI 부위에 결찰시켰다. CaMV 35S 프로모터에 융합된 서열을 암호화한 E1을 함유하는 키메라 유전자가 pBHYGM의 Xbal 부위에 삽입된다.
실시예 A6: CaMV 35S 프로모터에 융합된 서열을 암호화하는 티. 푸스카 E2 셀룰라제를 함유하는 키메라 유전자의 제조
E2 유전자를 함유하는 pCTE2의 2.0 kb 길이 NcoI(충전됨)/SacI 단편을 겔 정제시키고, pCGN1761의 충전된 EcoRI 부위에 결찰시켰다. CaMV 35S 프로모터에 융합된 서열을 암호화한 E2를 함유하는 키메라 유전자가 pBHYGM의 Xbal 부위에 삽입된다.
실시예 A7: 아. 투메파시엔(A. tumefaciens)에 의한 담배 잎 디스크의 형질전환
2성분 벡터 작제물 pEGL101, pEGL102, pEGL105, 및 pEGL355를 전기천공[Dower, W.J.(1987), Plant Mol. Biol. Reporter 1:5]에 의해 아. 투메파시엔 균주 GV3101[Bechtold, N. 등(1993), CR Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie, 316:1194-1199]로 형질전환시켰다. 동일한 방법이 키메라 셀룰라제 유전자를 함유하는 다른 작제물에 의해 담배로 형질전환시키기 위해 사용되었다.
살리실산 히드록실라제 유전자[Gaffney 등(1993) Science 261: 754-756]를 중복 발현시키는 트랜스젠 계열 "NahG" 및 니코티아나 타바쿰 cv 'Xanthi nc'의 잎 디스크는 상기 작제물을 함유하는 아그로박테륨 클론으로 동시 배양시키고[Horsch 등(1985), Science 227: 1229-1231], 형질전환체를 50μg/ml 히그로마이신 B에 대한 내성으로 선택하였다. 각각의 작제물에 대해 약 50개의 독립적인 히그로마이신 계열(TO 계열)이 선택되고, 호르몬이 없는 매질 상에 뿌리내렸다.
실시예 A8: 옥수수의 형질전환
성숙한 배의 입자 피폭에 의한 옥수수 형질전환은 Koziel 등이 개시한 바와 같이 수행되었다[Biotechnology 11:194-200, 1993]
실시예 A9: 밀의 형질전환
입자 피폭을 사용하는 성숙한 밀의 배 및 성숙한 배-유래된 유합 조직의 형질전환은 Vasil 등[Biotechnology 11:1553-1558(1993] 및 Weeks 등[Plant Physiology 102: 1077-1084, 1993]이 개시한 바와 같이 수행되었다.
실시예 A10: 유도성 셀룰라제 유전자 발현에 따른 트랜스젠 계열의 선택
각각의 트랜스젠 계열에 대해, 약 2-3 cm2의 이중 잎 펀치가 약 300μmol/m2/s의 방사선하에 벤조(1,2,3)티아디아졸-7-카르보티오산 S-메틸 에스테르(BTH, 5.6 mg/10 ml) 또는 멸균 증류수 3 ml 중에서 2일 동안 배양시켰다. 잎 물질을 수확하고, 신속히 동결시키고 액체 질소 중에서 분쇄하였다. 전체 RNA를 추출하고[Verwoerd 등(1989) NAR 17, 2362], 각각의 셀룰라제 유전자에 대해 특이적인 방사선 표지된 프로브를 사용하여 문헌[Ward 등(1991) The Plant Cell 3, 1085-1094]에 기재된 바와 같이 노던 블롯 분석을 수행하였다.
높은 수준의 유도성 트랜스젠 발현을 갖는 트랜스젠 계열이 꽃에 허용되어 자가 수분되어 T1 종자를 생산한다. 각각의 트랜스젠 계열에 대해 10개의 T1 종자를 토양에 발아시키고, 생성된 식물은 자가 수분되었다. 이들 식물로부터 T2 종자를 50μg/ml 히그로마이신 B를 함유하는 T 한천 배지(Nitsch 및 Nitsch(1969 Science 163, 85-87) 상에서 발아시켜 선택가능한 마커 및 연결된 트랜스젠에 동형접합성 계열을 식별하였다.
실시예 A11: 트랜스젠 식물에서 셀룰라제 발현의 유도
동형스플라이싱성 핵의 형질전환체 계열의 종자를 T 한천 배지 상에서 무균 발아시키고, 약 4-6주 동안 300μmol/m2/s에서 배양시켰다. 대안으로, 종자를 토양에서 발아시키고 온실에서 약 2달 동안 성장시켰다. 구성적 발현(CaMV 35S 프로모터) 하에 셀룰라제 유전자를 발현시키는 계열의 물질을 수확하고, 액체 질소 중에서 직접적으로 신속히 동결시키는 한편, 화학적-유도성 PR-1a 프로모터에 융합된 셀룰라제 유전자를 함유하는 계열들은 먼저 1mg/ml BTH 또는 물로 분무하고, 1 내지 7일 동안 배양시키고, 물질들을 수확하고, 신속히 동결시켰다.
실시예 A12: 트랜스젠 식물에서 셀룰라제 함량의 결정
트랜스젠 식물의 조직 내에 존재하는 셀룰라제의 양을 측정하기 위해, 화학 발광(Amersham) 웨스턴 블롯 분석을 제조자의 설명서 및 문헌[Harlow 및 Lane(1988) Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Hargor]에 따라 E1, E2 및 E5 단백질에 대하여 생성된 항혈청을 사용하여 수행하고, E1, E2 및 E5 단백질 표준[D. W ilson, Cornell University, Ithaca, N.Y.]을 사용하여 정제하였다.
실시예 A13: 트랜스젠 식물에서 셀룰라제 활성의 결정
잎 물질을 상기한 바와 같이 수확하고, PC 완충액(50mM 인산염, 12mM 시트르산염, pH6.5) 중에서 균질화시켰다. 표준 곡선(10 nmol 내지 10 μmol)이 PC 완충액 중에 4-메틸륨벨리페론(MU, Sigma Cat. No. M1381)의 적절한 양을 희석함으로써 제조한다. 각각의 표준물의 복제물 100μl 분액 및 각각의 시료의 복제물 50μl 분액이 96-웰 플레이트의 별개의 웰에 분배된다. 이어서, PC 완충액에서 제조된 2mM 4-메틸륨벨리페릴-b-D-셀로비오피라노시드(MUC, Sigma Cat. No. M6018) 50μl를 각각의 시료에 첨가하고, 증발을 방지하기 위해 플레이트를 밀봉하고, 55℃ 또는 37℃ 내지 65℃ 범위의 기타 온도에서 30분 동안 배양시켰다. 반응은 0.15M 글리신/NaOH(pH 10.3) 100μl를 첨가함으로써 종료되었으며, 셀룰라제 활성에서 기인하여 460nm에서 MU 형광 발광이 마이크로플레이트 형광계(여기 파장=355 nm)로 측정하였다.
B. 셀룰라제의 액포-표적된 발현
실시예 B1: 담배 PR-1a 프로모터에 융합된 서열을 암호화하는 티. 푸스카 E5 셀룰라제를 함유하는 키메라 유전자의 제조
티. 푸스카 E5 유전자(실시예 A3 참조)를 함유하는 플라스미드 pD374가 내인성 ATG에 대해 E5 유전자에서 1,135 내지 1,156 위치에 이르고, 이의 좌측 말단에 추가의 NcoI 부위를 포함하는 좌측에서 우측으로 "상단 쇄" 프라이머(프라이머 VAC1: CAT GCC ATG GGT GAG GCC TCC GAG CTG TTC C) 및 이의 서열이 E5 유전자의 21 최종 bp과 상동성이고, 담배 키나제 유전자[Shinshi 등,(1990) Plant Mol. Biol. 14, 357-368, Neuhaus 등(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10362-10366]로부터 유도된 서열을 표적화한 액포의 21 bp, 동일한 담배 키나제 유전자의 종료 코돈 및 SacI 제한 부위를 포함하는 우측에서 좌측으로 "하단 쇄" 프라이머(프라이머 VAC2: TGC GAG CTC TTA CAT AGT ATC GAC TAA AAG TCC GGA CTG CTT GCT CCG CAC)를 갖는 PCR에 대한 주형으로서 사용되었다. AmpliTaq DNA 폴리머라제는 제조업자의 추천에 따라 PCR에 대해 94℃(30s), 40℃(60s) 및 72℃(30s)에서 5 주기 동안, 이어서, 94℃(30s), 55℃(60s) 및 72℃(30s)에서 25 주기 동안 사용되었다. 이는 액포 표적화 서열에 융합된 E5 유전자의 3'말단을 포함하는 283-bp의 생성물을 발생시켰다. 단편을 겔 정제하고, NcoI 및 Sacl로 절단시키고, pJG203의 NcoI 및 Sacl 부위에 결찰되어 pJGDE5를 얻었다.
이어서, 플라스미드 pD374를 NcoI 및 Sacl로 분해시켜, 신호 서열을 포함하는 E5 유전자의 5'말단을 함유하는 1.1kb 길이의 단편을 겔 정제시키고, pJGDE5의 NcoI 및 Sacl 부위에 결찰시켜 신호 서열을 갖는 완전한 E5 유전자 및 903 bp 길이의 담배 PR-1a 프로모터에 융합된 액포 표적화 서열을 함유하는 pVACE5를 얻었다(도 1).
플라스미드 pVACE5를 Apal, Xbal 및 Sacl로 분해시키고, 키메라 E5 유전자 작제물을 함유하는 2.8kb 길이의 단편을 겔 정제시키고, pBHYGM의 Apal 및 Xbal 부위에 결찰시켜 pEGL115를 작제하였다.
실시예 B2: 담배 PR-1a 프로모터에 융합된 서열을 암호화하는 티. 푸스카 E1 셀룰라제를 함유하는 키메라 유전자의 제조
티. 푸스카 E1 셀룰라제 암호화 서열, 이의 신호 서열 및 담배 PR-1a 프로모터에 융합된 액포 표적화 서열을 함유하는 2성분 아그로박테륨 형질전환 벡터가 티. 푸스카 E5 셀룰라제 암호화 서열에 대해 실시예 B1에 기재된 바와 같이 작제되었다.
실시예 B3: 담배 PR-1a 프로모터에 융합된 서열을 암호화하는 티. 푸스카 E2 셀룰라제를 함유하는 키메라 유전자의 제조
티. 푸스카 E2 셀룰라제 암호화 서열, 이의 신호 서열 및 담배 PR-1a 프로모터에 융합된 액포 표적화 서열을 함유하는 2성분 아그로박테륨 형질전환 벡터가 티. 푸스카 E5 셀룰라제 암호화 서열에 대해 실시예 B1에 기재된 바와 같이 작제되었다.
실시예 B4: CaMV 35S에 융합된 서열을 암호화하는 티. 푸스카 E5 셀룰라제를 함유하는 키메라 유전자의 제조
플라스미드 pVACE5를 NcoI 및 EcoRI로 분해시켰다. 이의 돌출하는 NcoI 말단가 Klenow DNA 폴리머라제로 이미 충전된 1.6 kb 길이 단편을 겔 정제시키고, pCGN1761의 충전된 EcoRI 부위에 결찰되어 신호 서열을 갖는 E5 유전자 및 CaMV 35S 프로모터에 융합된 액포 표적화 서열을 함유하는 p35SVACE5를 얻었다(도 1). 키메라 E5 유전자를 함유하는 p35SE5의 4.7kb 길이 단편이 pBHYGM의 Xbal 부위에 삽입되어 pEGL315를 얻었다.
실시예 B5: CaMV 35S에 융합된 서열을 암호화하는 티. 푸스카 E1 셀룰라제를 함유하는 키메라 유전자의 제조
티. 푸스카 E1 셀룰라제 암호화 서열, 이의 신호 서열 및 CaMV 35S 프로모터에 융합된 액포 표적화 서열을 함유하는 2성분 아그로박테륨 형질전환 벡터가 티. 푸스카 E5 셀룰라제 암호화 서열에 대해 실시예 B4에 기재된 바와 같이 작제되었다.
실시예 B6: CaMV 35S에 융합된 서열을 암호화하는 티. 푸스카 E2 셀룰라제를 함유하는 키메라 유전자의 제조
티. 푸스카 E2 셀룰라제 암호화 서열, 이의 신호 서열 및 CaMV 35S 프로모터에 융합된 액포 표적화 서열을 함유하는 2성분 아그로박테륨 형질전환 벡터가 티. 푸스카 E5 셀룰라제 암호화 서열에 대해 실시예 B4에 기재된 바와 같이 작제되었다.
실시예 B7: 아. 투메파시엔(A. tumefaciens)에 의한 담배 잎 디스크의 형질전환
2성분 벡터 작제물 pEGL115 및 pEGL315를 전기천공[Dower, W.J.(1987), Plant Mol. Biol. Reporter 1:5]에 의해 아. 투메파시엔 균주 GV3101[Bechtold, N. 등(1993), CR Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie, 316:1194-1199]로 형질전환시켰다. 동일한 방법이 키메라 셀룰라제 유전자를 함유하는 다른 작제물에 의해 담배로 형질전환시키기 위해 사용되었다.
살리실산 히드록실라제 유전자[Gaffney 등(1993) Science 261: 754-756]를 중복 발현시키는 트랜스젠 계열의 "NahG" 및 니코티아나 타바쿰 cv 'Xanthinc'의 잎 디스크는 상기 작제물을 함유하는 아그로박테륨 클론으로 동시 배양시키고[Horsch 등(1985), Science 227: 1229-1231], 형질전환체를 50μg/ml 히그로마이신 B에 대한 내성으로 선택하였다. 각각의 작제물에 대해 약 50개의 독립적인 히그로마이신 계열(TO 계열)이 선택되고, 호르몬이 없는 매질 상에 뿌리내렸다.
실시예 B8: 옥수수의 형질전환
성숙한 배의 입자 피폭에 의한 옥수수 형질전환은 Koziel 등이 개시한 바와 같이 수행되었다[Biotechnology 11:194-200, 1993]
실시예 B9: 밀의 형질전환
입자 피폭을 사용하는 성숙한 밀의 배 및 성숙한 배-유도된 유합 조직의 형질전환은 Vasil 등[Biotechnology 11:1553-1558(1993)] 및 Weeks 등[Plant Physiology 102: 1077-1084, 1993)]이 개시한 바와 같이 수행되었다.
실시예 B10: 유도성 셀룰라제 유전자 발현에 따른 트랜스젠 계열의 선택
각각의 트랜스젠 계열에 대해, 약 2-3 cm2의 이중 잎 펀치를 약 300μmol/m2/s의 방사선하에 벤조(1,2,3)티아디아졸-7-카르보티오산 S-메틸 에스테르(BTH, 5.6 mg/10 ml) 또는 멸균 증류수 3 ml 중에서 2일 동안 배양시켰다. 잎 물질을 수확하고, 신속히 동결시키고 액체 질소 중에서 분쇄하였다. 전체 RNA를 추출하고[Verwoerd 등(1989) NAR 17, 2362], 각각의 셀룰라제 유전자에 대해 특이적인 방사선 표지된 프로브를 사용하여 문헌[Ward 등(1991) The Plant Cell 3, 1085-1094]에 기재된 바와 같이 노던 블롯 분석을 수행하였다.
높은 수준의 유도성 트랜스젠 발현을 갖는 트랜스젠 계열이 꽃에 허용되어 자가 수분되어 T1 종자를 생산한다. 각각의 트랜스젠 계열에 대해 10개의 T1 종자를 토양에 발아시키고, 생성된 식물은 자가 수분되었다. 이들 식물로부터 T2 종자를 50μg/ml 히그로마이신 B를 함유하는 T 한천 배지(Nitsch 및 Nitsch(1969 Science 163, 85-87) 상에서 발아시켜 선택가능한 마커 및 연결된 트랜스젠에 동형접합성 계열을 식별하였다.
실시예 B11: 트랜스젠 식물에서 셀룰라제 발현의 유도
동형스플라이싱성 핵의 형질전환체 계열의 종자를 T 한천 배지 상에서 무균 발아시키고, 약 4-6주 동안 300μmol/m2/s에서 배양시켰다. 대안으로, 종자를 토양에서 발아시키고 온실에서 약 2달 동안 성장시켰다. 구성적 발현(CaMV 35S 프로모터) 하에 셀룰라제 유전자를 발현시키는 계열의 물질을 수확하고, 액체 질소 중에서 직접적으로 신속히 동결시키는 한편, 화학적으로 유도 가능한 PR-1a 프로모터에 융합된 셀룰라제 유전자를 함유하는 계열들은 먼저 1mg/ml BTH 또는 물로 분무하고, 1 내지 7일 동안 배양시키고, 물질들을 수확하고, 신속히 동결시켰다.
실시예 B12: 트랜스젠 식물에서 셀룰라제 함량의 결정
트랜스젠 식물의 조직 내에 존재하는 셀룰라제의 양을 측정하기 위해, 화학 발광(Amersham) 웨스턴 블롯 분석을 제조자의 설명서 및 문헌[Harlow 및 Lane(1988) Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Hargor]에 따라 E1, E2 및 E5 단백질에 대하여 생성된 항혈청을 사용하여 수행하고, E1, E2 및 E5 단백질 표준[D. W ilson, Cornell University, Ithaca, N.Y.]을 사용하여 정제하였다.
실시예 B13: 트랜스젠 식물에서 셀룰라제 활성의 결정
1. 형광 측정 분석
잎 물질을 상기한 바와 같이 수확하고, PC 완충액(50mM 인산염, 12mM 시트르산염, pH6.5) 중에서 균질화시켰다. 표준 곡선(10 nmol 내지 10 μmol)이 PC 완충액 중에 4-메틸륨벨리페론(MU, Sigma Cat. No. M1381)의 적절한 양을 희석함으로써 제조한다. 각각의 표준물의 복제물 100μl 분액 및 각각의 시료의 복제물 50μl 분액이 96-웰 플레이트의 별개의 웰에 분배된다. 이어서, PC 완충액에서 제조된 2mM 4-메틸륨벨리페릴-b-D-셀로비오피라노시드(MUC, Sigma Cat. No. M6018) 50μl를 각각의 웰에 첨가하고, 증발을 방지하기 위해 플레이트를 밀봉하고, 바람직한 온도(55℃-60℃가 티. 푸스카 셀룰라제에 대해 최적이다)에서 30분 동안 배양시켰다. 반응은 0.15M 글리신/NaOH(pH 10.3) 100μl를 첨가함으로써 종료되었으며, 460nm에서 MU 형광 발광이 마이크로플레이트 형광계(여기 파장=355 nm)로 측정되었다. 셀룰라제 특이적 활성(pmol MU/mg 단백질/분)을 산출하기 위해, 각각의 추출물 중의 단백질의 양은 제조자의 추천에 따라 BCA 분석(Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 측정한다.
2. CMCase 활성[Wilson(1988) Methods in Enzymology, 160:314-315에 따름]
잎 물질을 0.05M 인산칼륨 완충액(pH6.5) 0.3ml 중에서 균질화시키고, 카르복시메틸셀룰로스(CMC, Sigma, Cat. No. C5678) 0.1 ml로 바람직한 온도(55℃-60℃가 티. 푸스카 셀룰라제에 대해 최적이다)에서 15-60분 동안 배양시켰다. DNS 시료(타르타르산칼륨 나트륨 200 g/l, 디니트로살리실산 10g/l, 페놀 2g/l, 황산 나트륨 0.5g/l, 수산화나트륨 10g/l) 0.75 ml를 첨가한 후, 시료를 15분 동안 비등시켰다. 시료를 냉각시키고, 광학적 밀도가 600 nm에서 측정되었다. CMC로부터 방출된 환원당의 양은 글루코스 표준 곡선을 사용하여 측정하고, 셀룰라제 활성을 분당 글루코스 당량 환원당 mmol로 발현되었다. 특이적 셀룰라제 활성을 산출하기 위해, 각각의 추출물 중의 단백질의 양은 제조자의 추천에 따라 BCA 분석(Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 측정한다.
대안으로, CMC에 대한 셀룰라제 활성은 Durbin 및 Lewis(1988)이 개시한 바의 점성 방법에 따라 측정하였다[Methods in Enzymology, 160:314-315].
3. 필터 페이퍼 분석[Wilson(1988) Methods in Enzymology, 160:314-315에 따름: 참고 문헌으로 인용함]
잎 물질을 0.05M 인산칼륨 완충액(pH6.5) 중에서 균질화시키고, 생성된 추출물을 여과지의 디스크(Whatman No.1)에 첨가하였다. 바람직한 온도(55℃-60℃가 티. 푸스카 셀룰라제에 대해 최적이다)에서 4-24 시간 동안 배양시킨 후, 반응이 종료되고, 환원당 함량이 측정되었다.
대안으로, CMC에 대한 셀룰라제 활성은 Durbin 및 Lewis(1988)가 개시한 바의 점성 방법에 따라 측정하였다(Methods in Enzymology, 160:314-315).
C. 담배 엽록체 내에서 셀룰라제 유전자의 발현
실시예 C1: 변형된 박테리오파지 T7 유전자 10 프로모터 및 담배 색소체 형질전환 벡터 pC8에서 터미네이터에 융합된 서열을 암호화하는 티. 푸스카 E5 셀룰라제를 함유하는 키메라 유전자의 제조
플라스미드 pCTE5는 EcoRI로 분해시키고, Klenow DNA 폴리머라제로 처리하여 비워진 3' 말단을 충전시키고, Ncol로 분해시키고, 생성된 1.5 kb의 DNA 단편을 겔 정제시키고, 색소체 형질 변환 벡터 pC8로부터 7.5 kb Ncol(접착성 말단)/Xbal(충전됨) DNA 단편에 결찰시켜 플라스미드 pC8E5를 창조하였다(도 2). pC8[Dr. Pal Maliga, Rutgers University, unpublished]은 구성적 담배 색소체 psbA 유전자 프로모터 및 psbA 5' 및 3' 미해독된 RNA(UTR) 서열 하에 스펙티노마이신 내성을 부여하는 세균의 아미노글리코시드-3'-아데닐트랜스퍼라제(aadA) 유전자를 갖는 색소체 형질전환 벡터 pPRVIIIA[Zoubenko, O.V., Allison, L. A., Savb, Z., 및 Maliga, P.(1994)]의 유도체이다. pPRVIIIA에서 aadA의 3' 말단은 완전한 trnV 유전자 및 16S rDNA의 5'부분을 함유하는 1.8 kb의 담배 색소체 DNA에 의해 플랭킹되는 한편, 5' 말단은 ORF 70B 유전자 및 rps 7/12 오페론 부분을 함유하는 1.2 kb의 색소체 DNA에 의해 다시 플랭킨된 다중 클로닝 부위(EcoRI, Sacl, Kpnl, Smal, BamHI, Xbal, SalI, PstI, SphI, HindIII)에 바로 인접한다. 이들 플랭킹 상동 영역은 공고된 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 색소체 게놈 서열의 뉴클레오티드 위치 102,309 및 140,219에서 담배 색소체 게놈의 역이된 반복 영역에 이종성 DNA의 개재의 통합을 표적화하도록 작용한다[Shinozaki, K. 등, (1986) EMBO J. 5,2043-2049]. pC8은 박테리오파지 T7 유전자 10 프로모터 및 pET21d 발현 벡터(Novagen, Inc., Madison, WI)로부터 유도된 터미네이터 서열에 의해 조절된 β-갈락투로니다제(GUS)를 암호화하는 키메라 이. 콜리(E. coli) uidA 유전자를 pPRVIIIA 폴리링커의 EcoRI 및 HindIII 부위에 클로닝함으로써 얻어졌다.
실시예 C2: 변형된 박테리오파지 T7 유전자 10 프로모터 및 환원된 판독을 통한 전사를 위해 조작된 터미네이터에 융합된 서열을 암호화하는 티. 푸스카 E5 셀룰라제를 함유하는 변형된 담배 색소체 형질전환 벡터의 제조
플라스미드 pC8은 Spel 및 Ncol로 분해시키고, T7 유전자 10 프로모터 및 발산하는 psbA 유전자 프로모터의 일부 및 5' UTR을 함유하는 235 bp 단편은 겔 정제에 의해 단리시키고, 벡터 pGEM5Zf+(Promega, Madison WI)의 Ncol 및 Spel 제한 부위로 클로닝되어 플라스미드 pPH118을 작제한다. pPH118은 Stul로 분해시키고 3210 bp 벡터 단편을 겔 정제시키고, 재결찰되어, 후속하는 분석에 의해 플라스미드 pC8에 존재하는 것으로 밝혀진 복제된 10 bp 서열 CGAGGCCTCG(밑줄친 부분은 Stul 부위)이 결여된 플라스미드 pPH118를 작제한다. pPH118에서 10bp Stul/Stul 단편의 제거는 일반적인 M13을 정방향으로 하고 프라이머를 역방향으로 하여 서열화 함으로써 검증되었다.
pC8에서 키메라 psbA/aadA 선택성 마커 유전자와 pET21d T7 유전자 10 프로모터 사이의 스페이서로서 사용하기 위한 비색소체 DNA 단편을 얻기 위해, 효모 셔틀 벡터 pRS305[Sikorski, R.S. 및 Hieter, P.(1989) Genetics 122, 19-27; GenBank 기탁 번호 U03437]는 EcoRI 및 HincII로 분해시키고, 사카로마이세스 세레비지아 LEU2 유전자 암호화 서열의 256 bp 단편을 단리시키고 겔 정제시켰다. 플라스미드 pPH118을 EcoRI 및 DraIII로 분해시키고 2645bp 단편을 단리시키고, 겔 정제시켰다. pPH118을 EcoRI로 분해시키고, Klenow DNA 폴리머라제로 처리하여 돌출한 3' 말단을 충전시키고, DraIII로 분해시키고 565 bp 단편을 겔 정제시켰다. 3개의 단편들이 결찰되어 LEU2 유전자 단편이 발산하는 T7 유전자 10과 pPH119의 psbA 프로모터 사이에 삽입된 플라스미드 pPH120을 생성한다.
색소체 형질전환 벡터 pC+E5(도 2)는 플라스미드 pPH120을 Ncol/EcoRI로 분해시키고 386 bp 단편을 겔 정제시키고, 플라스미드 pCBE5를 Ncol/HindIII로 분해시키고 1595 bp 단편을 겔 정제시키고, 플라스미드 pC8을 HindIII/EcoRI로 분해시키고 7287 bp 단편을 겔 정제시키고, 이 단편들을 3-방식 반응으로 결찰시킴으로써 작제되었다.
실시예 C3: 담배 PR-1a 프로모터에 색소체-표적된 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제 유전자의 작제
Ncol 제한 부위 및 ATG 출발 코돈을 포함하는 합성 올리고뉴클리오티드 링커에 이어 rbcS 유전자(리불로스 비스포스페이트 카르복실라제의 작은 아단위를 암호화함)로부터 제1의 7개의 색소체 운반 펩티드 코돈 및 내인성 PstI 제한 부위(상단 쇄: 5'-CAT GGC TTC CTC AGT TCT TTC CTC TGT A-3'; 하단 쇄:5'-GAG GAA AGA ACT GAG GAA GC-3'), rbcS 유전자 운반 펩티드 암호화 서열의 3'부분에 동일 프레임으로 융합된 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제 유전자(T7 Pol)를 함유하는 pCGN4205[McBride, K. E. 등, (1994) PNAS 91, 7301-7305]의 2.8 kb PstI/SacI DNA 단편, 출발 코돈[Uknes 등, (1993), Plant Cell 5, 159-169]에 도입된 Ncol 제한 부위를 갖는 담배 PR-1a 프로모터를 포함하는 pCIB296의 0.9 kb Ncol/Kpnl DNA 단편 및 2성분 아그로박테륨 형질전환된 벡터 pSGCGC1(pGEM4로부터 폴리링커를 함유하는 pGPTV-Hyg의 유도체)의 4.9 Sfil/KpnI 및 6.6 kb SacI/SfiI 단편이 결찰되어 pPH110을 작제한다.
실시예 C4: 담배 색소체 게놈의 바이오리스틱 형질전환
니코티아나 타바쿰 cv 'Xanthinc'의 종자를 T 한천 배지 상에 1" 환상 배열로 1플레이트당 7알씩 발아시키고, 문헌[Svab, Z. 및 Malig, P. (1993) PNAS 90 913-917]에 기재된 바와 같이 플라스미드 pC8E5 및 pC+E5로부터 DNA로 코팅된 1μm 텅스텐 입자들(M10, bBiorad, Hercules, CA)과 충전한 후 12-14일 동안 그대로 피폭을 가하였다. 피폭을 입은 종자들을 2일 동안 T 배지 상에서 배양시키고, 잎들을 절개한 후, 500 μg/ml 스펙티노마이신 디히드로클로라이드(Sigma, St. Louis, MO)를 함유하는 RMOP 배지(Svab, Z. Hajdukiewicz, P. 및 Malig, P. (1990) PNAS 87 8526-8530)의 플레이트 상에서 밝은 광선(350-500μ몰 광자/m2/s)하에 배축에 놓았다. 피폭후 3 내지 8주 후에 표백된 잎들 아래에 나타난 내성 쇼트(shoct)를 동일한 선택적 배지 상으로 서브클로닝하고, 유합 조직을 형성하고, 제2 쇼트를 단리시키고, 서브클로닝하였다. 독립적인 서브클론 중의 동종 색소체 상태로 형질 변환된 색소체 게놈 카피의 완전한 분리는 써던 블로팅의 표준 기술로 평가하였다.[Sambrook 등, (1989) Molecular Cloining: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor]. BamHI/EcoRI-분해된 전체 세포 DNA(Mettler, I.J.(1987), Plant Mol. Biol Reporter 5, 346-349)는 1% 트리스-붕산염(TBE) 한천 겔 상에서 분리되고, 나일론 막(Amersham)에 전송되고, rps7/12 색소체 표적화 서열의 일부를 함유하는 pC8로부터 0.7 kb BamHI/HindIII 단편에 대응하는 P-표지된 랜덤 프라임 DNA 서열로 프로브하였다. 동종 색소체 쇼트를 스펙티노마이신-함유 MS/IBA 배지(McBride, K.E. 등(1994), PNAS 91, 7301-7305) 상에 무균적으로 뿌리내리게 하고, 온실로 옮겼다.
실시예 C5: 아그로박테륨-매개된 잎 디스크 형질전환에 의해 키메라 PR-1a/T7 Pol 유전자의 담배 핵의 게놈으로의 도입
히그로마이신 내성 NT-pPH110 담배 식물을 N. 타바쿰 'Xanthi' 및 "NahG"의 잎 디스크 및 pPH110 2성분 벡터를 갖는 GV3101 아그로박테륨의 동시 배양 후 얻어진 쇼트로부터 기재한 바와 같이 재발생시켰다. 각각의 트랜스젠 계열에 대해, 약 2-3 cm2의 이중 잎 펀치가 약 300μmol/m2/s의 방사선 하에 BTH(5.6 mg/10 ml) 또는 멸균 증류수 3 ml 중에서 2일 동안 배양되었다. 잎 물질을 수확하고, 신속히 동결시키고 액체 질소 중에서 분쇄하였다. 전체 RNA를 추출하고(Verwoerd 등(1989) NAR 17, 2362), 방사선 표지된 T7 RNA 폴리머라제 유전자 프로브를 사용하여 문헌[Ward 등(1991) The Plant Cell 3, 1085-1094]에 기재된 바와 같이 노던 블롯 분석을 수행하였다. T7 Pol 발현 범위를 나타내는 19개의 NT-110X(Xanthi 유전자 골격) 및 7개의 NT-110N(NahG 유전자 골격) T1 계열이 온실에 옮겨지고 자가 수분되었다. 링크된 히그로마이신 내성 마커에 대한 3:1의 자손 분리는 자의적이고, 동형스플라이싱성 T2 계열이 선택되었다.
실시예 C6: 트랜스젠 식물의 색소체에서 셀룰라제 발현의 유도
PR-1a-T7 RNA Pol 작제물을 함유하는 동형스플라이싱성 NT-110X 및 NT-110N은 모에 의해 유전된 pC8E5 및 pC+E5 셀룰라제 작제물을 갖는 동종 색소체 Nt_pC8E5 및 Nt_PC+E5 색소체 형질전환체 계열을 수분시키기 위해 사용되었다. Nt_PC+E5 x NT-110X 또는 NT-110N, 및 Nt_pC8E5 x NT-110X 및 NT-110N F1 자손(이들은 PR-1/T7 폴리머라제 핵의 발현 카세트에 대해 동형스플라이싱성이고, T7/셀룰라제 색소체 발현 카세트에 대해 동종 색소체임)이 토양에서 발아되었다. 20-40cm 높이에 달함에 따라, 식물들에 유도 인자 화합물 BTH을 분무시켜 색소체에 편재된 E5 셀룰라제 유전자의 T7 Pol-조절된 발현을 유도한다. 식물 물질은 상기한 바와 같이 유도 및 신속한 동결 후 1,2,3,7 및 14 또는 28일에 8시에 유도 전에 수확하였다.
실시예 C7: 트랜스젠 식물의 E5 셀룰라제 mRNA 함량의 측정
전체 RNA는 BTH의 동결된 조직, 조절 분무되는 보습성 분말 및 PR-1a-T7 폴리머라제 x 색소체 T7/셀룰라제 식물로부터 추출되고, 5μg RNA 시료 상에서 노던 블롯 분석을 E5 셀룰라제 암호화 서열을 함유하는 방사선 표지된 DNA 단편의 프로브를 사용하여 문헌[Ward 등(1991) The Plant Cell 3, 1085-1094]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 각각의 시점에서 상대적인 E5 셀룰라제 mRNA 축적은 중첩된 mRNA 유도 과정을 측정하기 위해 방사선 표지된 E5 셀룰라제 프로브로 혼성화한 대역의 방사선 활성을 정량함으로써 평가되었다. 실시예 C6의 트랜스젠 식물 물질은 유도 후 이러한 분석에서 현저한 셀룰라제 mRNA 축적을 보였고, 유도 후 14일 째에 피크였다. 유도 전, 셀룰라제 mRNA는 검출되지 않았다.
실시예 C8: 트랜스젠 식물의 셀룰라제 함량의 측정
트랜스젠 식물의 조직에 존재하는 셀룰라제의 양을 측정하기 위해, 화학 발광(Amersham) 웨스턴 블롯 분석을 제조자의 설명서 및 문헌[Harlow 및 Lane(1988) Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Hargor]에 따라 E5 단백질에 대하여 생성된 항혈청을 사용하여 수행하고, E5 단백질 표준(D. W ilson, Cornell University, Ithaca, N.Y.)을 사용하여 정제하였다. 실시예 C6의 트랜스젠 식물 물질은 유도 후 이러한 분석에서 현저한 셀룰라제 mRNA 축적을 보였다(유도 후 14일에 전체 가용성 단백질의 0.3%; 유도 전, 단백질은 검출되지 않았다).
실시예 C9: 트랜스젠 식물의 셀룰라제 함량의 측정
잎 물질을 상기한 바와 같이 수확하고, PC 완충액(50mM 인산염, 12mM 시트르산염, pH6.5) 중에서 균질화시켰다. 표준 곡선(10 nmol 내지 10 μmol)이 PC 완충액 중에 4-메틸륨벨리페론(MU, Sigma Cat. No. M1381)의 적절한 양을 희석함으로써 제조된다. 각각의 표준물의 복제물 100μl 분액 및 각각의 시료의 복제물 50μl 분액이 96-웰 마이크로필터 플레이트의 별개의 웰에 분배된다. 이어서, PC 완충액에서 제조된 2mM 4-메틸륨벨리페릴-b-D-셀로비오피라노시드(MUC, Sigma Cat. No. M6018) 50μl를 각각의 시료 웰에 첨가하고, 증발을 방지하기 위해 플레이트를 밀봉하고, 55℃ 또는 37℃ 내지 65℃ 범위의 기타 온도에서 30분 동안 배양시켰다. 반응은 0.15M 글리신/NaOH(pH 10.3) 100μl를 첨가함으로써 종료되었으며, 460nm에서 MU 형광 발광이 마이크로플레이트 형광계(여기 파장=355 nm)로 측정하였다.
실시예 C10: 트랜스젠 식물의 색소체에서 GUS 발현의 도입
McBride, K.E. 등이((1994), PNAS 91, 7301-7305)개시한 N. 타바쿰 'Xanthi' 색소체 형질전환체 계열 4276P는 PR-1a/T7 RNA 폴리머라제를 함유하는 동형스플라이싱성 NT-110X6b-5에 의해 수분되었다. 4276P는 (a)aadA 선택성 마커를 발현시키기 위해 사용된 프로모터(pC8에 사용된 psbA 유전자 프로모터보다 오히려 16s 리보솜 RNA 유전자 프로모터를 가짐), (b) GUS 유전자와 T7 터미네이터 사이에 psbA 3' 미해독된 영역의 존재 및 (c) lac 오퍼레이터와 T7 프로모터에서 복제된 Stul 제한 부위 서열의 부재에 대해서만 pC8과 상이하다. PR-1a/T7 RNA 폴리머라제 핵의 발현 카세트 및 T7/GUS 색소체 발현 카세트에 대한 이러한 교차 이형스플라이싱성으로부터 F1 식물이 토양에서 발아된다. 20-40cm 높이에 달함에 따라, 식물들에 유도 인자 화합물 BTH와 보습성 분말의 제형 또는 보습성 분말 현탁액을 분무시켰다. 토양에 발아된 형질전환되지 않은 대조용 N. 타바쿰 'Xanthi', NT-110X65b-5 및 4276P 식물에 마찬가지 방식으로 분무하였다. 식물 물질(각각의 유전형의 3개의 독립적 식물 각각으로부터 하나의 잎)을 분무 직전 및 분무 및 신속한 동결 후 1,2,3,7 및 28일에 8시에 수확하였다.
실시예 C11: 트랜스젠 식물의 GUS mRNA 함량의 측정
전체 RNA는 BTH의 동결된 조직, 조절 분무되는 보습성 분말 및 PR-1a-T7 폴리머라제 x 색소체 T7/GUS 식물로부터 추출되고, 5μg RNA 시료 상에서 노던 블롯 분석을 GUS 우전자의 500 bp 방사선 표지된 5' 단편의 프로브를 사용하여 문헌[Ward 등(1991) The Plant Cell 3, 1085-1094]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 각각의 시점에서 GUSmRNA 축적은 방사선 표지된 GUS 프로브와 혼성화된 대역에서 방사선 활성을 정량화함으로써 뿐만 아니라, 분무한지 3일 후에 보이기 시작하고, 노던 블롯 상의 GUS RNA 대역을 혼성화함으로써 동시 이주시키는 것으로 관찰되는 우세한 RNA 대역에 존재하는 브롬화 에티듐 형광물질을 스캐닝함으로써 평가하였다. 색소체에서 화학적으로 유도 가능한 GUS RNA는 BTH로 유도한 후 7일 내지 28일 사이에 전체 에티듐 염색 가능한 RNA(이는, 염색 가능한 식물 RNA의 대부분을 구성하는 리보솜 RNA를 암호화한 비단백질을 포함하여, 식물에 존재하는 모든 RNA를 포함한다)의 14%의 피크 수준에 도달하는 것으로 관찰되었으며(표 1 참조), 핵의 PR-1a/GUS 형질전환체에 대한 화학적으로 유도 가능한 CUS mRNA 축적보다 훨씬 더 컸다(1000배 이상).
실시예 C12: 트랜스젠 식물의 GUS 단백질 함량의 측정
트랜스젠 식물의 조직에 존재하는 GUS의 양을 측정하기 위해, 화학 발광(Amersham) 웨스턴 블롯 분석을 제조자의 설명서 및 문헌[Harlow 및 Lane(1988) Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Hargor]에 따라 Molecular Probes사로부터 구매한 GUS 항혈청을 사용하여 수행하고, GUS 단백질 표준(Sigma)으로 정제시켰다. 상기한 바와 같이 수확된 잎 물질을 동결, 분쇄하여 얻은 단백질을 50mM Tris pH8.0, 1mM EDTA, 1mM PTT, 1mM AEBSF 및 1mM DTT 중에서 추출함으로써 용해시키고, 5 내지 25μg의 단백질을 10% 폴리아크릴아미드 겔의 각각의 계열 상에서 처리한다. 색소체 형질전환된 식물에서 GUS 단백질 축적은 7-28일 이상 및 이하로 유지되었으며, 28일까지 전체 단백질의 20%를 초과하여 매우 높았다(핵의 PR-1a/GUS에 대한 피크 GUS보다 훨씬더 높음). 비교하자면, 핵의 PR-1a/GUS 형질전환체에서 GUS 단백질의 축적은 다소 초기에 피크가 나타났으며(7-28일이기 보다는 도입한지 약 3일), 단백질 축적은 지속적이지 못하고, 28일까지 검출 하한치로 떨어졌다.
실시예 C13: 트랜스젠 식물에서 GUS 활성의 측정
동결된 잎 조직을 막자 사발 내에서 액체 질소의 존재하에 막자로 분쇄시켜 미세한 분말을 얻었다. 잎 추출물을 Jefferson R.A. 등((1986), PNAS USA 83 8447-8451)이 기재한 바와 같이 GUS 추출 완충액(50mM 인산나트륨 pH7.0, 0.1% 트리톤-X 100, 0.1% 사르코실, 10mM β-메르캅토에탄올) 중에서 제조하였다. 반응은 75μl의 전체 부피에서 2 mM의 최종 농도로 4-메틸 움벨리페릴 글루쿠로나이드(MU)를 함유하는 GUS 분석 완충액 (50mM 인산나트륨 pH7.0, 10mM EDTA, 0.1% 트리톤-X, 10mM β-메르캅토에탄올) 65μL와 추출물 10μl를 혼합함으로써 불투명한 마이크로리터 웰 내에서 수행하였다. 플레이트를 37℃에서 30분 동안 배양시키고, 반응을 0.2 M 탄산나트륨을 첨가함으로써 종료시켰다. 방출된 형광물질 지시자의 농도는 Flow Labs Fluoroskan II ELISA 플레이트 리더 상에서 플레이트를 판독함으로써 측정하였다. 각각의 시료에 대해 복제된 형광 물질 값을 평균하고, 배경 형광물질(MUG가 없는 반응)을 빼내어 각각의 시료에 대한 MU의 농도를 얻었다. 각각의 추출물 중의 단백질의 양은 단백질 추출물이 미리 요오드아세트아미드(Sigma)로 처리되어 추출 완충액 중에 존재하는 환원제(β-메르캅토에탄올)에 의해 유발되는 배경 신호를 제거하는 것을 제외하고는 제조자의 설명서에 따라 비신코닌산 기술(BCA, Pierc Biochemicals)을 이용하여 측정하였다. 특이적 활성을 각각의 시료에 대해 측정하고, MU p몰/단백질 mg/분으로 발현되었다. BTH 적용 후 특정 시점으로부터 평가된 각각의 조직 시료에 대해, BTH-유도된 시료의 특이적 활성이 예비 BTH 처리 조절 시료의 특이적 활성에 의해 분할되어 GUS 발현의 유도를 가져온다(표 1 참조).

Claims (10)

  1. (a) 트랜스액티베이터를 암호화하는 DNA 서열에 작동 가능하게 결합된 유도성 프로모터를 포함하는 이종성 핵 발현 카세트, 및
    (b) 상기 트랜스액티베이터에 의해 조절되고 목적하는 하나 이상의 DNA 서열에 작동 가능하게 결합된 트랜스액티베이터-매개된 프로모터를 포함하는 이종성 색소체 발현 카세트를 포함하는 식물.
  2. 제1항에 있어서, 유도성 프로모터가 손상-유도성 또는 화학적-유도성 프로모터인 식물.
  3. 제2항에 있어서, 유도성 프로모터가 담배 PR-1a 프로모터인 식물.
  4. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 트랜스액티베이터가 T7 RNA 폴리머라제이고, 트랜스액티베이터-매기된 프로모터가 T7 프로모터인 식물.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 이종성 색소체 발현 카세트 중의 하나 이상의 목적하는 DNA 서열이 셀룰로스-분해 효소를 암호화하는 식물.
  6. 셀룰로스 분해 효소를 발현하는 식물.
  7. 제6항에 있어서, 유도성 프로모터의 조절하에, 핵 DNA 또는 색소체 DNA로 안정하게 통합된 셀룰로스 분해 효소를 암호화하는 이종성 DNA 서열을 포함하는 식물.
  8. 제7항에 있어서, 유도성 프로모터가 손상-유도성 또는 화학적-유도성 프로모터인 식물.
  9. 제8항에 있어서, 유도성 프로모터가 PR-1인 식물.
  10. 제1항 내지 제9항중 어느 한항에 따른 식물의 종자 패키지.
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