KR19990081421A

KR19990081421A - 동물세포를 이용한 인간 혈소판 생성 촉진인자(tpo)의 제조방법

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Publication number: KR19990081421A
Application number: KR1019980015359A
Authority: KR
Inventors: 이재형; 소홍섭; 양재영; 윤혜성
Original assignee: 성재갑; 주식회사 엘지화학
Priority date: 1998-04-29
Filing date: 1998-04-29
Publication date: 1999-11-15

Abstract

본 발명은 인간 혈소판 생성 촉진인자 (Thrombopoietin ; 이하 "TPO" 라 약칭함) 유전자를 포함하는 동물세포 발현벡터 및 이를 이용한 동물세포에서의 TPO 의 대량 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 신호 서열이 tPA 신호 서열로 치환된 TPO 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 동물세포에 형질전환시킨 후 배양하여 TPO 단백질을 대량으로 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 TPO 의 신호 서열을 인간 조직형 플라스미노겐 활성인자 (tissue Plasminogen Activator ; 이하 "tPA" 라 약칭함)의 신호 서열로 치환하여 세포 내에서 발현된 TPO 가 세포외로 효율적으로 분비되도록 함으로써 천연형 TPO 단백질을 동물세포에서 높은 효율로 발현시킬 수 있는 유용한 방법이다.

Description

동물세포를 이용한 인간 혈소판 생성 촉진인자 (ＴＰＯ)의 제조방법

본 발명은 인간 혈소판 생성 촉진인자 (Thrombopoietin; 이하 "TPO" 라 약칭함)를 동물 세포에서 대량 발현시키는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 TPO 의 신호 서열을 인간 조직형 플라스미노겐 활성인자 (tissue Plasminogen Activator; 이하 "tPA" 라 약칭함)의 신호 서열로 치환시켜 동물세포에서 발현시킴으로써 천연형 TPO 단백질을 높은 효율로 대량 제조하는 방법에 관한 것이다.

TPO 는 353 개의 아미노산으로 구성된 당단백질 (glycoprotein)로서, 인간의 간 또는 신장 등의 조직에서 생성되고 분비되어 골수에 작용하여, 골수 내의 조혈세포인 혈소판의 수를 증가시키고 분화를 촉진시키는 조혈단백질이다.

1961년 오델 등이 쥐의 혈액 내에 혈소판의 수를 조절하는 인자가 존재한다는 사실을 처음으로 보고 (Odell, et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 108, 428, 1961)한 이래, 1994 년에 이르러 TPO 가 존재함이 밝혀져 그의 구조와 작용에 대한 연구가 이루어졌다 (Sauvage, et al., Nature, 369, 533-538, 1994; Bartley, et al., Cell, 77, 1117-1124, 1994). TPO 는 골수세포 내에 존재하는 혈소판 전구세포인 거핵구 콜로니형성 전구세포들에 작용하여 혈소판 전구세포를 증식시켜 궁극적으로 혈소판의 수를 증대시키고 그의 분화를 촉진시키는 당단백질로서, 최근 의학 분야에서 관심이 모아지고 있는 유망한 단백질이다.

골수의 근세포가 거핵아구 (megakaryoblast)를 거쳐 거핵구 (megakaryocyte)로 분화되는 과정에는 여러 조혈 성장인자들이 관여한다. 즉, 근세포는 초기에 거핵구 콜로니 자극인자 (megakaryocyte colony-stimulating factors ; 이하 "MK-CSFs")와 비특이성 분화계열 사이토카인의 일종인 인터루킨-3 (IL-3), 과립구 거식 콜로니 자극인자 (GM-CSF)와 근세포 성장 인자 (SCF)에 의해 거핵아구로 분화되고 이후에 특이성 분화계열에 속하는 사이토카인의 일종인 TPO 에 의해 성숙과정을 거치는 것으로 알려져 왔다 [Gordon, M.S. et al., Blood 80 : 302 (1992)].

1960 년대 이래로 혈소판 감소증 동물의 혈장에서 TPO 를 정제하려는 많은 노력이 있었지만 혈장내에는 수많은 다른 단백질이 존재하고 또한 정제 도중 TPO 의 활성을 측정하기 위한 방법이 확립되어 있지 않아 순수한 TPO 를 얻는데 실패했다. 그런데 혈액암을 일으키는 척수 증식 백혈병 바이러스 (myeloproliferative leukemia virus, 이하 "MPLV" 라 약칭함)의 암유전자 (oncogene)인 v-mpl 로부터 원암유전자 (protooncogene)인 c-mpl 유전자가 클로닝 되었고, 이 유전자는 N-말단 부위에 4 개의 잘 보존된 시스테인 (Cys) 잔기를 포함하고 생체막 인접부위에 트립토판 (Trp)-세린 (Ser)-X-트립토판 (Trp)-세린 (Ser) 모티프를 포함하는 것으로 밝혀져, c-mpl 유전자는 조혈인자 수용체 계열에 속한다는 것이 알려졌다 [Soryri, M. et al., Cell 63 : 1137 (1996); Vignon, I. et al., proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 5640 (1992); Skoda, R.C. et al., EMBO J. 12 : 2645 (1993); Bazan, J.F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 6934 (1990)]. 이후에 메티아 등은 c-mpl 이 거핵구 형성을 조절하는 사이토카인 수용체라는 결과를 보고하였는데 즉, 이들은 c-mpl 의 mRNA 가 거핵구 형성이 일어나는 세포에서만 특이하게 관찰되었고 또한 c-mpl 에 대한 항-올리고뉴클레오티드를 조혈 근세포에 도입하여 이 유전자의 발현을 억제시켰을 때 거핵구 형성 과정이 선택적으로 저지되었음을 보고하였다 [Methia, N. et al., Blood 82 : 1395 (1993)]. 최근 c-mpl 유전자를 쥐에 주입하여 만든 형질전환 쥐의 특성 등을 연구함으로써 c-mpl 의 기능은 더욱 분명해졌다 [Gurney, A. L. et al., Science 265 : 1445 (1994)].

한편, 이러한 보고들과 아울러 c-mpl 의 수용성 부분만 발현시킨 재조합 c-mpl 과 방사선이 조사된 동물의 혈청을 혼합시키면 TPO 의 활성이 없어진다는 보고 [Wendling,F. et al. Nature 371 : 571 (1994)]는 c-mpl 의 리간드 (ligand)가 TPO 일 수 있다는 가능성을 제시하는 것으로, 이를 바탕으로 하여 제넨텍사 (Genentech)와 암젠사 (Amgen)는 c-mpl 유전자의 수용성 부분만을 발현시키고 이를 고정시킨 친화 크로마토그라피 방법을 이용하여 혈소판 감소증 혈장으로부터 리간드를 분리·정제하는데 성공하였다. 분리·정제된 리간드 단백질의 5' 말단 아미노산 서열을 확인한 후 이를 이용하여 만든 올리고뉴클레오티드를 탐침으로 이용하여 사람, 쥐 및 개의 TPO 의 염기서열이 최초로 보고되었다 [Bartley, T. D. et al., Cell 77 : (1994), de Sauvage, F. J. et al., Nature 369 : 533 (1994)].

TPO 는 사람의 경우 353 개의 아미노산, 개와 쥐의 경우는 각 352 및 356 개의 아미노산으로 구성되어 있고 이들간의 아미노산 서열은 매우 유사한 것으로 알려져 있다. TPO 아미노산 서열은 다른 성장인자들과 유사성으로 볼 때 2 개의 영역으로 구분된다. N-말단 영역은 162 혹은 153 개의 아미노산으로 이루어져 있고 EPO 와는 약 25 %의 아미노산 유사성을 가지는 반면, C-말단 영역은 기존에 알려진 어떤 폴리펩타이드와도 유사성이 발견되지 않았고 6개의 N-당화부위가 존재한다. C-말단 영역을 제거 (truncation)한 뒤 얻어지는 절단된 TPO 의 활성도를 천연형 TPO 의 활성도와 비교한 결과 생체외 (in virto)에서 매우 유사한 활성을 나타내는 것으로 보아 C-말단 영역은 TPO 활성에 무관한 것으로 보고되었다 [Bartley, T. D. et al., Cell 77 : 1117 (1994)].

재조합 TPO 를 생쥐에 주사했을 때 골수와 지라에서 거핵구 형성과 혈소판 양이 4 배 정도 증가한다는 사실이 보고되었고 [Kaushansky., Lok S. et al., Nature 369 : 568 (1994)], 이로부터 TPO 가 혈소판 생성을 촉진하는 기능을 갖는 체액성 인자임이 확인되었다.

이처럼 TPO 는 혈소판 생성 조절에 특이하게 관여하는 체액성 인자로서, 혈소판 감소증 환자에게 투여할 경우 혈소판 양의 회복을 촉진시키는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

최근에는 인간의 TPO 를 동물세포에서 발현시키는 방법들이 개발되었는데 [Bartley, T. D. et al., Cell, 77 : 1117 (1994) ; De Sauvage, F. J. et al., Nature, 369 : 533 (1994)], 인간의 TPO 를 동물세포에서 발현시키면 인체내의 천연형 TPO 와 같은 형태로 발현되므로 이를 의약품으로 이용할 수 있으나 그 발현량이 현저히 낮아 실용성이 없었다.

본 발명자들은 TPO 의 발현율이 낮은 이유가 TPO 의 신호 서열이 효과적이지 못하여 세포 내에서 발현된 TPO 가 세포외로 효율적으로 분비되지 못하기 때문임을 알아내고, 또한 천연형 tPA 를 동물세포에서 발현시키면 그 발현량이 천연형 TPO 보다 현저히 높으므로 tPA 신호 서열이 TPO 신호 서열보다 TPO 단백질을 효과적으로 세포외로 분비시킬 수 있음에 착안하여 TPO 의 신호 서열을 tPA 의 신호 서열로 치환시켜 천연형 TPO 단백질을 동물세포에서 높은 효율로 발현시킴으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 인간 혈소판 생성 촉진인자 (TPO)를 동물 세포에서 대량 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.

도 1a는 인간혈소판 생성 촉진인자의 염기서열을 나타낸 것이고,

도 1b는 인간혈소판 생성 촉진인자의 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

도 2는 인간 조직형 플라스미노겐 활성인자의 신호서열에 해당하는 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

도 3은 인간 태아 간세포 유래의 혈소판 생성 촉진인자 유전자를 클로닝하여 인간 혈소판 생성 촉진인자의 신호서열을 인간 조직형 플라스미노겐 신호서열로 치환시키는 과정을 나타낸 것이고,

도 4는 본 발명의 발현벡터를 COS-7 세포에 형질 감염시켜 얻은 세포 파쇄액 및 세포 배양액을 인간 혈소판 생성 촉진인자의 항체로 면역 침전시킨 후 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동하여 오토라디오그라피한 결과를 나타낸 것이다.

제 1열 : 발현벡터를 함유하지 않은 COS-7 세포의 세포 파쇄액

제 2열 : 발현벡터 pLCED4 TPO 를 함유한 COS-7 세포의 세포 파쇄액

제 3열 : 발현벡터 pLCED4 tPAL TPO 를 함유한 COS-7 세포의 세포 파쇄액

제 4열 : 발현벡터를 함유하지 않은 COS-7 세포의 세포 배양액

제 5열 : 발현벡터 pLCED4 TPO 를 함유한 COS-7 세포의 세포 배양액

제 6열 : 발현벡터 pLCED4 tPAL TPO 를 함유한 COS-7 세포의 세포 배양액

제 M열 : 표준 분자량 단백질

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 신호 서열이 tPA 신호 서열로 치환된 TPO 유전자를 포함하는 대장균 발현벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 발현벡터를 얻기 위한 대장균 형질전환체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 발현벡터를 이용하여 TPO 를 대량으로 제조하는 방법을 제공한다. 구체적으로 상기 발현벡터를 동물세포에 형질전환시킨 후 이를 배양하여 세포 내에서 발현된 TPO 가 세포외로 효율적으로 분비되도록 하는, 천연형 TPO 단백질을 동물세포에서 높은 효율로 대량 제조하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 TPO 를 코드하는 유전자를 분리하기 위하여 인간 태아 간 세포를 이용한다.

인간 태아 간 조직으로부터 리보핵산 (RNA)을 추출하여 cDNA 를 합성하고 이를 주형으로 중합효소 연쇄반응 (Polymerase chain reaction, 이하 'PCR' 이라 약칭함)을 수행한다. 한편 TPO 유전자에 대응하는 PCR 용 시발체 (서열 1 및 서열 2 의 염기 서열을 갖는 올리고 뉴클레오타이드)를 합성하여 사용한다. 구체적으로 서열 1의 시발체 TPO 의 아미노 말단에 해당하는 염기 서열과 제한효소 Bam I 인지 부위를 포함하도록 고안되었고, 서열 2의 시발체는 종결 코돈, 제한 효소 Xho I 인지 부위 및 상기 TPO 의 카복시 말단의 염기 서열을 갖고 있다. 그 결과 약 1100 염기쌍의 TPO 유전자를 분리하였다.

상기 과정으로 얻은 TPO 의 유전자를 플라스미드 벡터 pLCED4 gDs 에 삽입하여 TPO 유전자를 함유한 발현벡터 pLCED4 TPO 를 제조한다.

한편 tPA 신호 서열을 클로닝하기 위하여 발현벡터 pLCED4sf tPA 를 주형으로 PCR 을 수행한다. 이 때 tPA 신호 서열에 대응하는 PCR 용 시발체 (서열 5 및 서열 6 의 염기 서열을 갖는 올리고 뉴클레오타이드)를 합성하여 사용한다. 구체적으로 서열 5의 시발체는 tPA 의 아미노 말단에 해당하는 염기 서열과 제한효소 BamH I 인지 부위를 포함하고, 서열 6의 시발체는 제한효소 Nar I 인지 부위 및 상기 tPA 신호서열의 카복시 말단의 염기 서열을 포함한다. 그 결과 약 110 염기쌍의 핵산 절편을 얻었다.

한편 신호서열이 제거된 TPO 유전자를 얻기 위하여 상기 발현 벡터 pLCED4 TPO 를 주형으로 PCR 을 수행한다. 이 때 TPO 신호 서열에 대응하는 PCR 용 시발체 (서열 3 및 서열 4 의 염기 서열을 갖는 올리고 뉴클레오타이드)를 합성하여 사용한다. 구체적으로 서열 3의 시발체는 TPO 의 신호서열 카복시 말단에 해당하는 염기 서열과 제한효소 Nar I 인지 부위를 포함하고, 서열 4의 시발체는 제한효소 Xho I 인지 부위 및 상기 TPO 유전자의 카복시 말단의 염기 서열을 포함한다. 그 결과 약 1000 염기쌍의 핵산 절편을 얻었다.

이렇게 신호 서열이 제거된 TPO 유전자와 tPA 유전자 신호서열을 접합반응시킨 다음 이를 대장균에 형질전환시켜 tPA 신호 서열로 치환된 TPO 유전자를 함유한 본 발명의 발현벡터 pLCED4 tPAL TPO 를 제조한다.

본 발명의 발현벡터 pLCED4 tPAL TPO 를 대장균 HB101 균주 (ATCC 33694)에 형질전환시켜 그 대장균 형질전환체 HB101/pLCED4 tPAL TPO 를 1998년 4월 8일자로 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 0452BP).

또한 본 발명은 TPO 의 제조방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명의 발현벡터 pLCED4 tPAL TPO 를 동물세포에 형질전환시킨 후 이를 배양하여 천연형 TPO 단백질을 동물세포에서 높은 효율로 대량으로 제조한다.

본 발명에서는 우선 상기 발현 벡터를 동물세포에 형질전환시킨 후 이를 35 ∼40 ℃의 온도에서 충분히 배양하여 TPO 유전자의 발현을 유도한다. 본 발명의 발현벡터는 신호 서열이 tPA 신호 서열로 치환된 TPO 유전자를 포함하므로 세포 내에서 발현된 TPO 가 세포외로 효율적으로 분비될 수 있어 천연형 TPO 단백질을 높은 효율로 대량 제조할 수 있다.

본 발명에서는 TPO 의 발현상태를 확인하기 위하여 오토라디오그라피 (autoradiography)를 수행하였는데, 그 결과 천연형 TPO 에 비하여 본 발명의 tPA 신호 서열로 치환된 TPO 의 발현량이 3 배 정도 높음을 알 수 있었다.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> TPO 유전자의 클로닝

(단계 1) 인간 태아 간 세포로부터 cDNA 합성

인간 태아 간 세포로부터 RNA 추출을 콜로진스키 등의 방법 [Cholozynski, P., et al., Anal. Biochem., 162 : 156 (1987)]에 따라 다음과 같이 수행하였다. 5

×

106 세포에 1 ml의 RNA 추출액 [4 M 구아니디움 티오시아네이트 (Guanidinium thiocyanate), 25 mM 소듐 시트레이트 (Sodium Citrate), pH 7.0, 0.5 % 사크로실 (Sarcosyl), 0.1 M 2-머캅토에탄올 (Mercaptoethanol)]을 가하고 진탕시켜 세포막을 파괴시킨 다음 0.8 ml의 2 M 나트륨아세테이트 (pH 4.0), 0.8 ml의 페놀, 1.6 ml의 클로로포름-이소아밀알콜 (49:1, v/v)을 가하여 잘 혼합한 후 12,000 G, 4 ℃에서 15 분 동안 원심분리한 후 상층의 수용액을 동일 부피의 이소프로판올이 있는 새 용기에 옮기고 -20 ℃에서 약 1 시간 방치한 다음 12,000 G, 4 ℃에서 20 분간 원심분리하여 RNA 침전물을 얻었다. 이 침전물을 75 % 에탄올로 세척할 뒤 진공 건조시키고 20 ㎕의 TE 완충액 (10 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA)에 용존시켰다. cDNA단선을 합성하기 위해 위에서 얻은 RNA 용액 10 ㎕를 취하여 2 ㎕의 0.1 M 메틸머큐리 (CH₃HgOH)를 가한 다음 상온에서 10 분간 방치하여 RNA 의 2차 구조를 풀어준 후 2 ㎕의 1 M 2-머캅토에탄올을 가하여 5 분간 반응시켰다. 여기에 5 ㎕의 10 배 농축 역전사 효소반응 용액 [500mM 트리스-HCl, pH 8.3, 750 mM KCl, 30 mM MgC1₂, 10mM 디티오트레이톨 (Dithionthreitol)], 2.5 ㎕의 10 mM dNTP 혼합액(dGTP, dATP, dTTP, dCTP 각각 10 mM), 24 ㎕의 디에틸피로카보네이트 (DEPC, Diethylpyocarbonate)가 처리된 증류수, 1.0 ㎕의 RNase 억제제 (RNasin, 1U/㎕, Promega, U.S.A), 1 ㎕의 올리고(dT)_12-18시발체 (oligo(dT)_12-18primer, GibcoBRL, U.S.A.)를 가한 다음 상온에서 10 분간 방치시켜 RNA 주형과 시발체가 잘 붙게 한 다음 2.5 ㎕의 역전사효소 (18U/㎕, Superscript RNase H-Reverse transcriptase, BRL, U.S.A.)를 가하여 37 ℃에서 1 시간 반응시켜 cDNA 가닥을 합성하였다.

(단계 2) 시발체의 합성

TPO 유전자를 중합효소 연쇄반응을 이용해 단계 1에서 얻은 cDNA로부터 얻기 위해 다음과 같은 시발체들을 핵산합성기 (DNA Synthesizer, Applied Biosystems lnc., U.S.A.)를 이용하여 합성하였다.

즉, TPO 염기서열 정보로부터 TPO 유전자에 대응하는 PCR 용 시발체 (서열 1 및 서열 2의 염기 서열을 갖는 올리고 뉴클레오타이드)를 합성하여 사용하는데, 구체적으로 서열 1의 시발체는 TPO 의 아미노 말단에 해당하는 염기 서열과 제한효소BamH I 인지 부위를 포함하고, 서열 2의 시발체는 종결 코돈, 제한효소 Xho I 인지 부위 및 상기 TPO 의 카복시 말단의 염기 서열을 포함한다.

(단계 3) TPO 유전자의 분리

TP0 유전자를 증폭하기 위해, 서열 1과 서열 2를 갖는 시발체를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 반응튜브에 단계 2에서 얻은 각각의 시발체 2 ㎍을 넣은 다음 상기 단계 1에서 얻은 인간 태아 간 세포 cDNA 1 ng을 주형으로 넣고 10 ㎕의 10배 중합완충용액 (500 mM KCl, 100 mM 트리스-HCl, pH 9.0, 1 % 트리톤 X-100, 2.5 mM MgC1₂), 10 ㎕의 2 mM dNTP (dGTP, dATP, dTTP, dCTP 각각 2 mM), 2.5 단위체 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총 부피를 100 ㎕로 한 후 95 ℃에서 1분 (변성단계), 55 ℃에서 40초 (담금단계), 72 ℃에서 2분 (중합단계)의 조건으로 PCR을 40회 실시하였다. 그 결과, TPO 유전자를 얻었고, 이하 이를 '단편 TPO' 라 칭한다. 상기에서 얻은 '단편 TPO' 2 ㎍을 제한효소 BamH I 과 Xho I 으로 NEB 완충용액 2 (50mM NaCl, 10 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl_2,1mM 디티오트레이톨, pH 7.9)의 조건으로 완전절단한 뒤 7 % 아크릴아마이드 젤로 전기영동 분리하여 약 1100 염기쌍의 핵산 절편을 얻었다. 이하 이 단편을 '단편 TPO-B/X' 라 칭한다.

<실시예 2> TPO 유전자 발현벡터 제조

먼저 플라스미드 pLCED4 gDs (대한민국 특허출원 제 95-22864호) 2 ㎍을 제한 효소 BamH I 과 Xho I 으로 NEB 완충용액 2 (50mM NaCl, 10 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl_2,1mM 디티오트레이톨, pH 7.9)의 조건으로 완전절단한 뒤 1 % 아가로오스 젤로 분리하여 약 5.5 kb 핵산 단편을 분리 정제하였다.

접합반응 튜브에 상기 실시예 1의 단계 3 에서 얻은 100 ng의 단편 TPO-B/X, 100 ng의 단편 pLCED4-B/X 를 넣은 다음, 2 ㎕의 10배 접합반응용액 [50 mM 트리스-HCl (pH 7.8), 10 mM MgCl₂, 1 mM 디티오트레이톨, 1 mM ATP, 25 ㎍/ml 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin)], 10 단위체인 T4 DNA 리가제와 총 부피가 20 ㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16 ℃에서 12 시간 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 대장균 HB101 (ATCC 33694)에 형질전환시켜 TPO 유전자를 함유한 pLCED4 TPO 를 얻었다. 상기에서 얻은 재조합 플라스미드 pLCED4 TPO 에 클로닝된 cDNA 단편의 염기서열 확인은 생거 등 [Sanger, F., et al., PANS U.S.A 74 : 5463 (1997)]의 방법에 따라 다이 싸이클 시퀀싱 시스템 [Dye Cycle Sequencing System (Applied Biosystems, U.S.A)]을 이용하여 수행하였고 동사 (同社)의 ABI 377 DNA 염기서열에 의해 분석되었다.

<실시예 3> tPA 유전자의 신호서열 클로닝

중합효소 연쇄반응을 이용해 tPA 유전자의 신호서열 유전자를 얻기 위해 다음과 같은 시발체들을 핵산합성기 (DNA Synthesizer, Applied Biosystems Inc., U.S.A.)를 이용하여 합성하였다.

tPA 의 염기서열 정보로부터 tPA 유전자에 대응하는 PCR 용 시발체 (서열 5 및 서열 6의 염기 서열을 갖는 올리고 뉴클레오타이드)를 합성하여 사용한다. 구체적으로 서열 5의 시발체는 tPA 의 아미노 말단에 해당하는 염기 서열과 제한효소 BamH I 인지 부위를 포함하고, 서열 6의 시발체는 제한효소 Nar l 인지 부위 및 상기 tPA의 신호서열의 카복시 말단의 염기 서열을 포함한다.

tPA 유전자의 신호서열을 얻기 위하여 1997년 3월 27일에 출원된 대한민국 특허출원 제 97-10763호의 발현 벡터 pLCED4sf tPA를 주형으로 하고 서열 5 및 서열 6 시발체를 사용하여 실시예 1의 단계 3과 같은 방법으로 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 그 결과, tPA 유전자의 신호서열을 얻었고 이하 이 단편을 '단편 tPA'이라 칭한다. 상기에서 얻은 '단편 tPAL' 2 ㎍을 제한효소 BamH I 과 Nar I으로 NEB 완충용액 2 (50 mM NaCl, 10 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl₂, lmM 디티오트레이톨, pH 7.9)의 조건으로 완전절단한 뒤 7 % 아크릴아마이드 젤로 전기영동 분리하여 약 110 염기쌍의 핵산 절편을 얻었다. 이하 이 단편을 '단편 tPAL-B/N' 이라 칭한다.

<실시예 4> TPO 유전자의 신호서열이 유전자의 신호서열로 치환된 발현벡터의 제조

중합효소 연쇄반응을 이용해 신호서열에 제거된 TPO 유전자를 다음과 같은 시발체들을 핵산합성기 (DNA Synthesizer, Applied Biosystems Inc., U.S.A.)를 이용하여 합성하였다.

TPO 의 염기서열 정보로부터 TPO 유전자에 대응하는 PCR용 시발체 (서열 2 및 서열 3의 염기 서열을 갖는 올리고 뉴클레오타이드)를 합성하여 사용한다. 구체적으로 서열 3의 시발체는 TPO 의 신호서열 카복시 말단에 해당하는 염기 서열과 제한효소 Nar I 인지 부위를 포함하고, 서열 2의 시발체는 제한효소 Xho I 인지 부위 및 상기 TPO 유전자의 카복시 말단의 염기 서열을 포함한다.

신호서열이 제거된 TPO 유전자를 얻기 위하여 상기 실시예 2의 발현 벡터 pLCED4 TPO 를 주형으로 하고 서열 3 및 서열 2의 시발체를 사용하여 실시예 1의 단계 3과 같은 방법으로 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 그 결과, 신호서열이 제거된 TPO 유전자를 얻었고 이하 이 단편을 '단편 ΔTPO'이라 칭한다. 상기에서 얻은 '단편 ΔTPO' 2 ㎍을 제한효소 Nar I 과 Xho I 으로 NEB 완충용액 2 (50 mM NaCl, 10 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM 디티오트레이톨, pH 7.9)의 조건으로 완전절단한 뒤 7 % 아크릴아마이드 젤로 전기영동 분리하여 약 1000 염기쌍의 핵산 절편을 얻었다. 이하 이 단편을 '단편 ΔTPO-N/X' 라 칭한다.

접합반응 튜브에 상기 실시예 3에서 얻은 100 ng의 단편 tPAL-B/N, 상기에서 얻은 100 ng의 단편 ΔTPO - N/X, 상기 실시예 1의 단계 3에서 얻은 단편 100 ng의 단편 pLCED4-B/X를 넣은 다음, 2 ㎕의 10배 접합반응용액 [50 mM 트리스-HCl (pH 7.8), 10 mM MgCl₂, 1 mM 디티오트레이톨, 1 mM ATP, 25 ㎍/ml 소 혈청 알부민], 10 단위체의 T4 DNA 리가제와 총 부피가 20 ㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16 ℃에서 12 시간 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 대장균 HB101 (ATCC 33694)에 형질전환시켜 tPA 신호서열로 치환된 TPO 유전자를 함유한 pLED4 tPAL TPO 를 얻었다.

상기에서 얻은 재조합 플라스미드 pLCED4 tPAL TPO 에 클로닝된 tPA 신호서열로 치환된 TPO의 염기서열 확인은 생거 등 [Sanger, F., et al., PNAS U.S.A., 74 : 5463 (1997)]의 방법에 따라 다이 싸이클 시퀀싱 시스템 (Applied Biosystems, U.S.A)을 이용하여 수행하였고 동사의 ABI 377 DNA a 염기 서열기에 의해 분석되었다.

<실시예 5> 포유동물세포에서 COS-7 tPA 유전자의 신호서열로 치환된 TPO의 발 현

포유동물세포에서 COS-7 tPA 유전자의 신호서열로 치환된 TPO 의 발현정도를 관찰하기 위하여 COS-7 세포 (ATCC CRL1651)를 35 mm 플레이트에 15배 정도 희석 분양한 후 37 ℃, CO₂배양기에서 배양하였다. 세포가 플레이트에 70∼80 % 정도 성장한 것을 확인한 후 리포펙타민법 (Gibco BRL Cat. No. 18324-012)으로 플라스미드 pLCED4 TPO, 플라스미드 pLECD4 tPALTPO 를 각각 세포내로 형질감염 (transfection)시켰다. 이 때 사용한 배지는 10 % 송아지 혈청이 함유된 D-MEM 배지 [Dulbecco's Modified Eagle Medium; 1 g/L D-글루코스, L-글루타민, 110 mg/L 소듐 피루바아트 (sodium pyruvate), Gibco BRL Cat. No. 11885-035]를 사용하였다. 형질감염후 48 시간 후에 배양세포 및 배양액을 채취하였다. 배양세포를 파쇄하여 얻은 세포 파쇄액 및 배양액을 TPO 항체액과 혼합시켜 반응시킨 후, 면역침전시켰다. 이를 램리의 방법 [Leammli, Nature, 227, 680 (1970)]에 따라 12 % SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동하여 오토라디오그라피 (Autoradiography)하였다. 도 4 는 천연형 TPO 유전자를 포함하는 발현벡터 pLCED4 TPO 및 tPA 신호 서열로 치환된 TPO 유전자를 포함하는 발현벡터 pLCED4 tPAL TPO를 COS-7 세포에 형질 감염시켜 얻은 세포 파쇄액 및 세포 배양액을 인간 혈소판 생성 촉진인자의 항체로 면역 침전시킨 후 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동하여 오토라디오그라피한 결과이다.

여기에서 제 5, 6 열은 세포 배양액으로 분비된 TPO 의 발현량을 비교해 보면 천연형 TPO 에 비해 본 발명의 tPA 신호서열로 치환된 TPO 의 발현량이 3 배 정도 높음을 확인할 수 있다.

본 발명에서는 TPO 의 신호 서열을 tPA 의 신호 서열로 치환하여 세포 내에서 발현된 TPO 가 세포외로 효율적으로 분비되도록 함으로써, TPO 의 신호 서열이 효과적이지 못하여 세포내에서 발현된 TPO 가 세포외로 분비되지 못하여 발현량이 낮았던 기존의 문제점을 해결하여 천연형 TPO 단백질을 동물세포에서 높은 효율로 발현시킬 수 있다.

〔서열목록〕

서열번호 : 1

서열의 길이 : 28

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)

〔서열목록〕

서열번호 : 2

서열의 길이 : 32

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)

〔서열목록〕

서열번호 : 3

서열의 길이 : 37

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)

〔서열목록〕

서열번호 : 4

서열의 길이 : 28

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)

〔서열목록〕

서열번호 : 5

서열의 길이 : 32

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)

Claims

인간 혈소판 생성 촉진인자 (Thrombopoietin; TPO) 유전자의 신호 서열이 인간 조직형 플라스미노겐 활성인자 (tissue Plasminogen Activator; tPA)의 신호 서열로 치환된 TPO 유전자를 포함하는 포유 동물세포 발현벡터 pLCED4 tPAL TPO
제 1항의 발현벡터로 형질전환시킨 대장균 형질전환체 HB101/pLCED4 tPAL TPO (수탁번호 : KCTC 0452BP)
발현벡터 pLCED4 tPAL TPO 를 동물세포에 형질전환시킨 후 이를 배양하는 것을 특징으로 하는 인간 혈소판 생성 촉진인자 (TPO)의 제조방법