KR19990072468A - 검정콩을이용한청국장및그제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 검정콩을 이용한 청국장과 그 제조방법에 관한 것으로 검정콩을 주재료로 사용하며 프로테아제, 아밀라아제 등의 효소활성이 높고 점질물의 생성능력과 혈전용해능이 우수한 균주를 접종한 후 추가로 과채류를 첨가하여 제조한 청국장은 청국장 고유의 퀴퀴한 냄새가 억제되고 관능검사결과 기호도가 우수한 효과가 있으며 혈전용해능, 과산화물가 억제능, 아질산염 소거능, 식중독 및 부패균에 대한 항균효과를 나타내는 우수한 뛰어난 효과가 있다.

Description

검정콩을 이용한 청국장 및 그 제조방법 {Nato products using black-soybean and process of preparation thereof}
본 발명은 검정콩을 이용한 청국장 및 그 제조방법을 제공한다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 프로테아제, 아밀라아제 등의 효소활성이 높고 점질물의 생성능력과 혈전용해능이 우수한 균주를 검정콩에 접종한 후 과채류를 첨가하여 발효시킨 청국장 및 그 제조방법에 관한 것이다.
청국장은 감칠맛이 뛰어나 예로부터 우리나라 사람들이 즐겨 먹어온 고유의 대표적인 발효식품 중의 하나이다. 이는 간장이나 된장과는 달리 제조시간이 매우 짧고 간단할 뿐만 아니라 가을에서 이른 봄까지 이용하는 계절적 감각을 지닌 특유의 조미식품이라 사람의 기호에 맞는 향수를 느끼게 하는 식품으로서 자리잡고 있다.
청국장은 된장보다 단백질과 지방이 많으나 소화 흡수율은 오히려 높으며, 칼슘과 비타민 A·B의 중요한 공급원, 청국장균의 정장효과, 섬유질의 변비예방 효과, 발암물질과 콜레스테롤의 체외 배출효과, 점질물(mucin)의 알코올 흡수에 의한 해장효과, 사포닌의 혈관강화와 혈액순환 촉진과 젖산분해효과, 레시친의 뇌노화와 치매·고혈압과 동맥경화의 예방 등의 효과가 있다는 것이 밝혀져 있다. 이처럼 청국장이 타장류에 비해 훨씬 우수한 식품임에도 불구하고 국민소득의 증대, 급속한 산업발전, 가정주부의 의식전환과 사회활동 참여 확대, 주거환경의 변화 및 식생활의 서구화 등의 이유로 전통적인 방법으로 직접 청국장을 만들기 보다는 점차 공장에서 대량 생산된 청국장을 구매하여 소비하는 형태로 변화되고 있는 실정이다. 또한 현재의 영세한 생산시설과 자동화되어 있지 않은 수공업 제조로는 시장성을 상실할 수밖에 없으며, 특히, 청국장 특유의 퀴퀴한 냄새가 나기 때문에 어린이, 젊은이와 외국인들은 청국장을 싫어한다. 이 점을 개선하고 아울러 고품질이면서 위생적인 청국장을 생산하지 않으면 국제적 상품으로서 청국자의 위상을 정립하기는 어려울 것이다. 우리나라의 청국장과 비슷한 알본의 납두는 일본에서는 우리나라의 두부 소비량과 비슷할 정도로 선호도가 높으며 인도네이사의 전통 대두 발효식품인 템페도 일본이나 미국에서 그 소비량이 매년 증가되고 있다. 납두는 청국장과 같이 바실러스 서브틸리스를 기본균종으로 사용하지만 그 원료 및 제조법이 약각 다르다. 납두는 소립종 콩을 사용하고 소금은 사용하지 않으며 퀴퀴한 냄새가 거의나지 않는 반면, 템페는 무염 곰팡이 대두발효식풍으로 냄새나 점성이 없기 때문에 청국장이나 납두의 대용품으로 주목받고 있다.
청국장에 대한 연구는 대두를 원료로 한 발효과정 중 청국장 성분의 변화, 사용 미생물과 제한적인 발효조건의 차이에 따른 청국장 품질의 변화, 세균학적 특성, 효소학적 특성 및 향기성분에 관한 보고 등이 있다. 또한 황국을 이용하여 청국장의 불쾌한 냄새를 다소 제거하는 개량 제조법에 관한 연구와 CaCO3를 이용한 청국장균의 대상변동에 의한 단백분해 효소력과 아미노태 질소함량, 비타민의 함량이 증가하였다는 연구보고가 있다. 최근에는 마늘, 쑥, 고추, 고추기름 등의 첨가와 균원 시료를 달리하여 청국장의 품질 및 기호성 증진에 관한 연구보고와 스프래드 형태의 가공식품을 제조하기 위하여 바실러스 서브틸리스와 바실러스 납두로 청국장을 제조하고 점도, 색도 및 퍼짐성을 검토하였고, 동결건조된 즉석 청국장 찌개를 25, 35 및 45℃에 저장하면서 경시적인 품질특성 변화와 청국장의 제조방법과 이용실태에 관한 조사보고가 있다. 청국장의 기능적인 연구는 일본의 납두에 비하여 매우 저조하였으나 최근 우리나라의 청국장 (CK 11-4)에서 분리된 바실러스속 균주가 생산하는 효소가 납두의 납두키나아제보다 높은 혈전용해능을 가진다고 보고되어 있다. 또한 우리나라의 전통적인 장류인 된장이 일본의 된장보다 항암이나 면역증강 등의 효과가 우수하며 청국장은 이들보다 생리활성이 낮은 것으로 일부 보고 되고 있는데 생체조절기능을 갖는 생리활성에 관한 연구는 거의 없는 실정이다.
검정콩은 예부터 민간에서 약콩으로 전래되고 있는데 대두와 마찬가지로 주요 아이소플라본(isoflavone)으로 게니스테인(genistein)과 다이드제인(daidzein)이 있으며 특히, 게네스테인은 유해한 활성산소종을 제거하여 항산화효과를 나타내며 암세포가 면역시스템에 의한 공격을 피해 살아남을 수 있게 도와주는 HSP(heat shook protein), GRPs(glucose-related proten)와 같은 스트레스성 단백질의 생성을 저해하므로써 유방, 직장 및 전립선암 등에 대한 항암작용을 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한 다이제인(daizein)은 위에서 알코올의 배출속도를 지연시키므로써 음주 후 급격한 혈중알코올 농도상승을 억제하는 것으로 보고되어있다. 검정콩의 소이야사포닌은 항산화성, 혈청콜레스테롤 저하, 암세포에 대한 선택적 독성 및 면역효과 등과 밀접한 관련이 있다는 보고가 있는데 특히 검정콩 종피의 검은색 부위로부터 최근에 항산화성 및 항암물질의 이소플라본류가 검출되고 있으며 대두에 비하여 검은 색이 짙은 수록 강한 항산화효과가 나타나고 검정콩 껍질을 흰쥐에게 급이시킬 경우 혈청 콜레스테롤이 낮아진다는 보고도 있다. 이러한 검정콩은 대두에 비하여 종피가 두껍고 조직이 약각 단단하므로 증자할 때 팽윤도와 단백질의 분해율이 낮을 뿐만 아니라, 검정콩의 종피와 육질로부터 항균성 물질이 존재하여 발효도가 낮고, 종피의 수용성 색소 용출로 인한 식품고유의 색깔이나 품질변화를 초래하기 때문에 주로 쌀, 보리, 잡곡과 혼합하여 밥밑콩으로 이용되거나 자반용콩으로 이용되어 왔고 일부는 떡소, 제과용, 약콩으로 이용되고 있지만, 간장, 된장, 청국장 등의 장료제조에는 거의 이용되지 않고 있다.
종래의 청국장의 제조방법은 흰콩이나 누렁콩을 세척증자하여 단백질 원료로 사용하고 증자한 다음 납두균을 접종하여 발효하여 왔다. 이러한 종래의 재래식 청국장은 그 원료가 흰콩이나 누렁콩이므로 그 원료의 특성상 납두균을 투입하므로서 용이한 발효가 가능하였으나 검은콩을 원료물질로하는 경우 납두균의 접종만으로는 우수한 청국장의 제조가 불가능하므로 그 제품을 취식할 수 없었다.
따라서 본 발명자들은 청국장의 고유한 맛을 재현하면서 우수한 기능성을 갖는 고품질의 검정콩을 주재료로 이용하여 발효율의 증진을 위한 콩의 처리조건을 조사하였고 검정콩 발효에 적합한 균주를 분리, 동정하였다. 또한 청국장의 냄새 억압 및 품질증진을 위하여 발효초기에 첨가할 가장 적합한 천연식품소재를 검색하였으며 검정콩으로 제조한 청국장으로부터 영양성분을 분석하였고, 혈전용해능, 항산화성, 아질산염 소거능 및 항균활성 등 기초적인 생물활성을 분석하였다.
본 발명의 목적은 검은콩을 주재료로로 사용하여 항균활성, 항산화활성, 혈전용해능이 우수하고 청국장 특유의 퀴퀴한 냄새가 상당히 억제된 청국장을 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 청국장의 제조방법을 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 청국장 또는 재래 된장으로부터 프로테아제, 아밀라아제 등의 효소활성이 높은 균주를 분리하고 이들중 점질물의 생성능력과 혈전용해능이 우수한 균주를 선별하여 이 균주를 검정콩에 접종한 후 키위 및 무를 첨가하여 발효시키므로써 청국장을 제조하고 제조한 청국장의 이화학적 성질, 물리적 성질, 청국장내 생균수 및 효소활성, 패널리스트를 대상으로 한 관능검사 및 청국장의 생물활성을 조사하므로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.
도 1은 청국장으로부터 분리한 SMY-212 균주가 생산나는 프로테아제와 α-아밀라아제 활성을 나타낸 사진도이다.
도 2는 대립 및 소립 검정콩으로 제조한 청국장의 아미노태 질소함량 변화를 시간경과에 따라 나타낸 그래프이다.
도 3는 대립 및 소립 검정콩으로 제조한 청국장의 암모니아태 질소함량 변화를 시간경과에 따라 나타낸 그래프이다.
도 4은 대립 및 소립 검정콩으로 제조한 청국장의 펩타이드태 질소함량 변화를 시간경과에 따라 나타낸 그래프이다.
도 5는 대립 및 소립 검정콩으로 제조한 청국장의 수용성 단백질 함량 변화를 시간경과에 따라 나타낸 그래프이다.
도 6는 대립 및 소립 검정콩으로 제조한 청국장의 염용해성 단배질 함량 변화를 시간경과에 따라 나타낸 그래프이다.
도 7은 대립 검정콩으로부터 제조한 청국장내 유리아미노산을 검출한 크로마토그라피를 나타낸다.
도 8은 대립 검정콩으로부터 제조한 청국장내 화합물과 관련된 핵산을 검출한 HPLC 크로마토그라피를 나타낸다.
도 9은 대립 및 소립 검정콩을 사용하여 제조한 청국장의 발효시간 경과에 따른 명도변화를 나타낸 그래프이다.
도 10는 대립 및 소립 검정콩을 사용하여 제조한 청국장의 발효시간 경과에 따른 적색도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 11는 대립 및 소립 검정콩을 사용하여 제조한 청국장의 발효시간 경과에 따른 황색도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 12은 대립 및 소립 검정콩을 사용하여 제조한 청국장의 발효시간 경과에 따른 굳기(hardness) 변화를 나타낸 그래프이다.
도 13는 대립 및 소립 검정콩을 사용하여 제조한 청국장의 발효시간 경과에 따른 응집도(Cohesiveness)변화를 나타낸 그래프이다.
도 14은 대립 및 소립 검정콩을 사용하여 제조한 청국장의 발효시간 경과에 따른 생균수의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 15는 다양한 검정콩을 사용하여 제조한 청국장의 혈전용해능을 나타낸 사진도이다.
도 16는 대립 및 소립 검정콩을 사용하여 제조한 청국장의 발효시간 경과에 따른 항산화력의 변화를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 검정콩, 시판 및 가정 청국장, 재래된장으로부터 프로테아제, 아밀라아제 등의 효소활성이 높은 균주를 얻은 후 다시 검정콩에 접종하고 발효시켜 방향성, 점질물의 생성능력 및 혈전용해능이 우수한 균주를 선별하는 단계; 상기 선별한 균주의 형태학적, 배양학적, 생리 및 생화학적 특성을 동정하는 단계; 상기 분리 선별되어 동정된 균주 및 과채류를 이용하여 청국장을 제조하는 단계; 상기 검정콩으로 제조한 청국장의 단백질양, 유리아미노산, 지방산, 핵산 및 무기질 등을 측정하여 이화학적 성질을 조사하는 단계; 상기 검정콩으로 제조한 청국장의 점도, 색도 및 텍스쳐를 측정하여 물리적 성질을 조사하는 단계; 상기 검정콩으로 제조한 청국장의 생균수 및 효소활성을 측정하는 단계; 상기 검정콩으로 제조한 청국장을 패널리스트를 대상으로 관능검사를 실시하는 단계 및; 상기 검정콩으로 제조한 청국장의 혈전용해능, 항산화력, 아질산염 소거능 및 식중독 원인균 및 부패균에 대한 항균활성을 측정하여 생물활성을 조사하는 단계로 구성된다.
본 발명에서 사용한 청국장(Chungkuk-jang) 제조용 콩(Glycine max(L.) Merrill)은 1997년에 전남 나주의 가보농산에서 수확한 대두를 대조구로 하였고, 검정콩은 대립 1종(서리태·속 파란콩)과 소립 1종(쥐눈이콩·다원콩·약콩)을 사용하였다. 또한 이들 검정콩 발효과정 중 냄새억압 및 품질증진을 위한 부재료로는 채소·과실류에서 엽경채류(배추, 양배추, 셀러리, 파, 부추, 알로에), 근채류(무, 당근, 마늘, 양파), 과채류·장과류(오이, 호박, 토마토, 딸기, 키위, 참외, 수박), 인과류(감귤, 배, 사과, 감), 핵과류(매실, 복숭아) 및 열대과실류(바나나, 파인애플)를 사용하였고, 기타 향신료(생강, 겨자, 고추, 계피)와 야생 식용식물(쑥, 솔잎, 녹차)를 사용하였다.
이하, 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시예를 들어 설명하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 제한되지 않는다.
실시예 1: 검정콩으로 청국장 제조
제 1단계: 청국장 균주의 분리
검정콩, 시판 및 가정청국장, 재래된장 등의 분리원 1g을 멸균 생리 식염수 100mL에 첨가하여 잘 현탁시켜 10분 동안 방치한 다음 그 상층액 0.1mL씩을 2% 우유 카제인 첨가 LB 평판배지(CM)와 2% 가용성 전분 첨가 LB 평판배지(SM)에 각각 도말하여 30℃에서 2일간 배양하였다. 두 배지상에 나타난 콜로니 중에서 할로 존의 크기가 크고, 명확하며 성장속도가 빠른 단일 콜로니만을 1차 선별하였다. 1차 선별한 순수분리균을 LB 배지(Yeast extract 0,5%, 트립톤 1%, NaCl 1%)에 각각 접종하여 2일간 진탕배양한 후 각 분리균에 대한 프로테아제, 아밀라아제 활성을 측정한 다음 효소활성이 비교적 높은 균주를 2차 선별하였다. 최종적으로 할로 존의 크기가 작고 각 효소활성이 높은 균으로 2차 선별된 각 균주들을 LB 배지상에서 액체 배양하여 배양액 1mL를 에펜도르프 튜브에 넣고 8,000rpm, 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 약 2/3 정도 버리고 멸균수 1mL를 가하여 균체를 재현탁시킨 다음 100㎕를 피브린 배지상에 접종하여 경시적으로 할로 존의 크기를 관찰하여 혈전용해능을 측정하였다. 또한 남은 배양액은 멸균 생리식염수로 세척·잡균한 다음, 일정한 농도로 희석하여 증자된 검정콩에 접종한 후 42℃에서 72시간 발효시키면서 방향성, 점질물의 생성능력 및 전향의 혈전용해능이 가장 우수한 것을 최종 공시균주로 선정하였다. 실험결과, 균원시료를 멸균 생리식염수에 현탁시켜 100㎕를 CM 배지와 SM 배지상에 도말한 후 각각의 배지에서 클리어 존을 형성하는 437개의 균주를 1차 선별하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이 1차 분리된 각 균주를 CM 및 SM 배지에 투스 픽킹(tooth picking) 하여 2종류의 배지상에서 동시에 할로 존의 크기가 비교적 크고 뚜렷하여 성장속도가 빠른 균주를 2차선별하여 LB 배지상에서 2일간 진탕배양하였다. 그 배양액을 원심분리(8,000rpm, 10min)시켜 얻은 상징액에 대한 프로테아제, α-아밀라아제 및 글루코아밀라아제 효소활성을 표 1에 나타냈다. 할로존의 크기는 분리균에서 뚜렷하고 비교적 크게 나타났으나 효소활성에서는 균주에 따라 많은 차이를 보였다. 프로테아제 활성은 SMY-212, 117, 038 균주가 비교적 높았고, α-아밀라아제는 SMY-311, 096 및 029 균주가 높았으며 글루코아밀라아제 활성은 각 균주간의 큰 차이는 보이지 않았으나 SMY-095, 409, 029 및 212 균주에서 높게 나타났다. 2차 분리된 균주에 대한 혈전용해능은 표 2에 나타낸 바와 같이 SMY-212(180%, 플라스민 1unit에 대한 상대활성), 117(147%), 38(147%) 및 94 균주(134%)가 다른 균주에 비하여 할로 존의 크기가 크게 나타났다. 따라서 최종적으로 SMY-212를 선별하였다.
프로테아제, α-아밀라아제 및 글루코아밀라아제 효소활성
균주 번호 할로 존 효소 활성(U/mL) 소오스
CM* SM** 프로테아제α-아밀라아제 글루코아밀 라아제
SMY-026 +++ ++ 108.6 34.9 11.2 Chungkuk
SMY-029 ++ +++ 77.2 89.2 14.2 Chungkuk
SMY-038 +++ ++ 113.1 76.0 10.4 Chungkuk
SMY-061 ++ ++ 87.2 53.4 9.2 Chungkuk
SMY-066 +++ ++ 98.6 18.2 5.6 Chungkuk
SMY-086 ++ ++ 45.7 45.1 8.7 Chungkuk
SMY-094 ++ ++ 69.2 56.9 7.4 Chungkuk
SMY-095 ++ +++ 54.6 54.2 14.9 Chungkuk
SMY-096 ++ ++ 85.4 97.6 10.2 Chungkuk
SMY-117 +++ ++ 115.7 54.2 7.2 Chungkuk
SMY-164 ++ ++ 76.3 46.2 8.3 Chungkuk
SMY-212 +++ +++ 124.8 78.4 13.9 Chungkuk
SMY-216 ++ ++ 67.0 66.4 12.3 Chungkuk
SMY-283 ++ ++ 87.8 78.2 8.2 Doenjang
SMY-285 ++ ++ 64.2 83.1 7.6 Doenjang
SMY-311 +++ ++ 90.1 99.2 9.7 Blacksoybean
SMY-320 ++ +++ 76.2 45.7 11.4 Blacksoybean
SMY-409 ++ +++ 83.2 72.1 14.5 Chungkuk
[주] 할로 사이즈: + 작다, ++: 보통이다, +++: 크다CM: 카제인 배지, SM: 전분 배지
다양한 소오스로부터 분리된 균주의 혈전용해활성, 점도, 냄새억제
균주 번호 냄새제거 점도 혈전용해 활성 소오스
클리어 존(mm)*%**
SMY-026 ++ +++ 9.9 130 Chungkuk
SMY-029 +++ + 6.2 82 Chungkuk
SMY-038 ++ +++ 11.2 147 Chungkuk
SMY-061 ++ +++ 5.2 68 Chungkuk
SMY-066 ++++ +++ 7.5 99 Chungkuk
SMY-086 ++ ++ 5.6 74 Chungkuk
SMY-094 +++ + 10.2 134 Chungkuk
SMY-095 ++ ++ 6.8 90 Chungkuk
SMY-096 +++ ++ 8.7 115 Chungkuk
SMY-117 ++ ++ 11.2 147 Chungkuk
SMY-164 +++ ++ 7.1 93 Chungkuk
SMY-212 ++ ++++ 13.7 180 Chungkuk
SMY-216 +++ + 6.0 79 Chungkuk
SMY-283 +++ ++ 4.6 61 Doenjang
SMY-285 + ++ 9.4 124 Doenjang
SMY-311 ++++ ++ 8.5 112 Blacksoybean
SMY-320 ++ +++ 6.4 84 Blacksoybean
SMY-409 + ++ 7.1 93 Chungkuk
[주] * 클리어 존은 35℃에서 5시간 동안 측정되었다.** 관계 활성(%)= 균주 클리어 존(mm)/플라민의 클리어 존(1unit)+: 매우 약함, ++: 약함, +++: 강함, ++++: 매우 강함
제 2단계 : 청국장 균주의 동정
상기 1단계에서 선정된 공시균주는 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 준하여 동정하였다. 형태학적 특성은 NB 배지에 1.5 아가를 함유시킨 NA 배지상에서 성장한 콜로니의 모양을 관찰하였고, 내생포자 형성은 균주를 Barthlomew와 Wittwer에 의한 Wirtz변법으로 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다. 표면형태는 균주를 3% 글루타르알데하이드 포스페이트(pH 7.2)에 3시간 전 고정하고 같은 농도의 완충액으로 세척한 후 2% OsO4-포스페이트 버퍼에 2시간후 고정하여 알콜 50, 70, 85, 90, 95, 99, 100%의 상승농도순으로 탈수하고 아세톤으로 재탈수시킨 다음 시료대에 접착하여 Au로 코팅(200Å, 진공증착)하여 주사전자현미경(SEM, Akasi SX-40)으로 관찰하였다. 배양학적 특징은 순수분리된 청국장 발효균주의 배양조건 및 배양상의 특징은 NB 배지에 공시균주를 접종하여 여러범위의 온도(25, 30, 35, 40, 45℃)와 초기 pH(5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5)에서 20시간 진탕배양(220rpm)한 후 660nm에서 흡광도를 측정하여 검토하였다. 생리 및 생화학적 특성은 카제인·젤라틴, 전분의 가수분해, H2S 생성, 질산염 환원 및 효소생성 등에 대하여 조사하였다. 분리균주의 지방산 분석은 TSBA(tryptic soy broth agar, Difco)에 원인균을 접종하여 24시간 배양한 후 대수증식기에 있는 콜로니 40 ~ 50mg으로부터 균체 지방산을 추출하고 메탄올라이시스(MIS, Hewlett-Packard 5890A)에 의해 GC로 분석하고 호기성 세균의 지방산 라이브러와 비교·검토하였다. 또한 분리균주의 탄소원 자화성은 GP 마이크로플레이트(BIOLOG, Inc., U.S.A)를 이용하여 조사하였다. 실험결과, 분리균주는 간균(1.0 ~ 1.2 × 5.2 ~ 6.3㎛)이며 내생포자를 형성하였다. 또한 운동성을 가진 호기성 세균으로서 전분, 카제인, 젤라틴을 가수분해하였고 H2S 가스는 생성하지 않았다. 성장 pH 범위는 5 ~ 8 정도의 중성부근이며 성장온도는 25 ~ 45℃였다. 지방산 조성과 GP 마이크로플레이트 상의 탄소원은 덱스트린, 글리코겐, 셀루비오스, 프럭토스, α-D- 글루코스, 말토스, 만노스, 3-메틸 글루코스, 팔라티노스, 수크로스, 프란노스였으며 유기산으로는 메틸 피루베이트, 피루빅산이였다. 부분적으로 이용하는 당류로서는 겐티오비오스, 말토트리오스, 프시코스였으며 유기산으로는 L-말릭산였으며 그외의 당과 유기산, 아미노산 등은 잘 이용하지 못했다. 결론적으로 공시균주는 바실러스 메카테리움(Bacillus megaterium)가 유사한 균종으로 확인되었다. 상기 공시 균주의 생육은 접종 후 2.5시간의 유도기를 지나 대수증식기에서 균의 증식이 왕성해지면서 α-아밀라아제 및 프로테아제의 효소활성이 급격히 증가함을 알 수 있었다.
제 3단계: 청국장 제조
상기 1 단계에서 분리선별한 바실러스 서브틸리스(KFCC 11314)와 각종 검정콩, 청국장 및 장류 등의 분리원으로부터 분리·동정하여 균체증식과 효소활성이 가장 우수한 바실러스 속 SMY-212 균주를 사용하였다. 종균은 글루코스 0.5%를 첨가한 NB 배지(Difco, nutrient broth : beef bxtract 0.3%, peptone 0.5%) 250mL에 균을 각각 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 배양액을 무균즉으로 원심분리하여 멸균수로 균체를 3회 반복 세척한 다음 균체 농도를 조절(흡광도 580nm=2.0)하여 종균액으로 사용하였다. 정선한 대두와 검정콩 3kg씩을 냉수에 침지한 후 물빼기를 하여 스테인레스 스틸에 담아 고압 멸균기에서 30분동안 증자하고 50℃ 정도로 냉각하였다. 청국장은 증자·냉각된 대립 및 소립의 2종류 검정콩 500g을 각각 그대로 42℃ 항온기에서 3일간 발효시킨 청국장, 단백질 분해율 증진 및 이취 억압을 위해 과채류를 6%(w/w) 정도 첨가하여 동일조건으로 발효시킨 청국장 및 전배양한 종균액을 원료의 1%(v/w) 정도 접종하여 동일조건으로 발효시킨 청국장으로 구분하여 제조하였다. 대조구로는 대두 청국장 콩을 증자한 후 그대로 발효시켰다.
실험예 1: 검정콩으로 제조한 청국장의 이화학적 성질
상기 실시예 1에서 제조한 청국장의 pH는 청국장 10g에 CO2를 제거한 증류수 40mL를 가하여 호모게나이져로 마쇄(8,000rpm, 5분)하고 여과하여 50mL로 만든 후 그 액의 일부를 취하여 pH 미터(Fisher, U. S. A)로 측정하였다. 총산도는 앞의 여과액 20mL를 취하여 pH 8.3 될 때 까지 소요되는 0.1N-NaOH의 양(mL)으로 나타냈다. 질소는 총질소를 micro Kjeldahl법, 수용성 질소는 청국장 5g, 증류수 200mL, 실리콘 소포제 1방울을 넣어 3분간 마쇄하고 250mL로 만들어 원심분리(3,000rpm, 30분간)한 후 상층액 25mL를 취해 마이크로 Kjeldahl법으로 정량하였으며 질소용해율은 SN/TN(%)으로 환산하였다. 아미노태 질소(NH2-N)는 포르몰태 질소 함량에서 암모니아태 질소 함량을 뺀 것으로 나타냈다. 포로몰태 질소의 측정은 청국장 5g을 250mL 비이커에 넣고 증류수 100mL를 가하여 1시간 동안 교반하여 충분히 혼합한 후 0.1mL NaOH 용액으로 8.4 까지 적정하였다. 이때에 중성 포르말린 용액 20mL를 가한 다음 다시 pH가 산성화 되면 0.1N NaOH 용액으로 pH 8.4까지 적정하여 다음 식으로 계산하였다.
A: 0.1N NaOH 용액의 시료 적정량(mL)
B: 0.1N NaOH 용액의 공시험 적정량(mL)
F: 0.1N NaOH의 요소
암모니아태 질소(NH3-N)는 전처리 추출액 20mL에 30% NaOH 2mL와 실리콘 수지 3mL를 넣은 다음 증류장치에서 5분간 증류할 때에 발생되는 가스를 3% 붕산으로 포집한 후 pH 미터를 이용하여 0.02N-HCl로 pH 4.04까지 적정하여 HCl 소모량으로 산출하였으며 펩티드내 질소는 TN-(NH2-N + NH3-N)으로 환산하였다. 단백질 분리는 Wang의 분류법에 따라 실시하였다. 즉, 수용성 단백질과 염용해성 단백질은 청국장 3g에 탈이온수에 1M 농도의 NaCl을 함유한 소듐 포스페이트 버퍼(pH 7.0) 60㎖를 각각 가하여 실온에서 90분간 교반하여 추출하고 3,500rpm에서 30분간 원심분리하여 이의 상층액을 Lowry 법에 의하여 3회 반복하여 정량하였다. 유리 아미노산의 분석은 청국장 5g에 증류수 약 100mL를 가하여 마쇄하여 500mL로 정용한 후 60℃에서 30분간 추출하였다. 이 추출액을 0.2㎛ 막 필터와 Sep-pak C18카트리지로 여과한 후 아미노산 분석기로 분석하였다. 핵산관련물질은 마쇄한 청국장 10g에 10% 냉과염소산 용액 25mL를 첨가하여 15분간 마쇄하여 원심분리(4,000 × g, 10min) 하였다. 상층액을 취한 후 다시 같은 방법으로 추출하여 얻은 상층액을 합하고 5N-KOH 용액을 가하여 pH 6.5로 조절하여 냉과염소산 용액으로 100mL로 만들었다. 이를 30분간 방치한 후 원심분리(10,000 × g, 10min)하여 상층액을 0.45㎛ 막필터로 여과하고 Sep-pak C18카트리지를 통과시킨 후 HPLC로 분석하였으며 이들 물질의 함량은 각 표준물질로 검량선을 작성한 후 환산하였다. 무기질의 분석은 청국장 2g에 분해제(HClO4: H2SO4: H2O2= 9: 2 : 5, v/v) 25mL를 가한 다음 낮은 온도에서 서서히 가열하여 분해액이 완전하게 무색으로 변할 때까지 가수분해하고 여과(Whatman No. 2)하여 100mL로 만든 후 Inductively Coupled Plasma Spectrometer(ICP, Optima 300DV, Pekkin-Elmer, U.S.A)로 분석하였다. 실험결과, 대두, 대립 및 소립 검정콩을 이용한 청국장의 수분, 조단백, 조지방, 조회분을 분석한 결과는 표 3에 나타낸 바와 같다. 검정콩 청국장의 수분함량은 58.03 ~ 69.72% 범위로 대조구인 황색대두 청국장(69.72%)에 비해 상당히 적었다. 조단백질 함량은 17.33 ~ 26.71%의 범위였으며 그 중에서 무첨가의 대립 검정콩 청국장의 함량이 가장 많았고, 바실러스 서브틸리스 균주를 접종한 대립 검정콩 청국장의 함량이 가장 적었다. 조지방 함량은 9.73 ~ 12.47%의 범위로 큰 차이는 없었으나 그 중에서 비첨가 대립 검정콩 청국장에서 함량이 가장 많았고 바실러스 서브틸리스 균주를 접종한 소립 검정콩 청국장에서 함량이 가장 적었다. pH는 발효시간이 경과됨에 따라 대부분의 청국장에서 24시간까지 급격히 증가하다가 그 이후는 조금씩 증가하는 경향이였으나 유의적인 변화는 없었다. 특히 대립 검정통의 경우 발효 72시간이 경과하였을 때 바실러스 서브틸리스균주를 접종한 청국장의 pH가 다른 것에 비하여 pH와 그 변화 폭이 조금 낮았고 다른 시험구들은 최종적으로 7.6 ~ 8.0범위에서 거의 비슷하게 나타났다. 총산의 경우는 pH 변화와는 반대로 발효시간이 경과됨에 따라 대부분의 청국장에서 24시간까지는 급격히 감소하다가 그 이후는 조금씩 감소하는 경향이었으며 발효 72시간이 경과한 후에는 모든 청국장에서 0.1N ~ NaOH의 소비가 1.1 ~ 1.5mL 범위로 큰 차이는 없었다. 수용성 질소 함량의 경우는 발효 48시간이 경과한 후부터 분리균주 SMY-212 및 바실러스 서브틸리스를 첨가한 검정콩 및 소립 검정콩의 함량이 급격하게 증가하였는데 특히 바실러스 서브틸리스 균주보다 분리균주를 첨가한 경우 청국장의 함량이 더 많이 나타났으며 기타 다른 청국장은 거의 변화가 없었다. 질소용해율도 수용성 질소의 경우와 같이 발효시 24시간 경과 후부터 균주를 접종한 청국장이 급격하게 증가하였으며 바실러스 서브틸리스 균주보다 분리균주를 접종한 청국장의 증가폭이 더 크게 나타났으며 기타 다른 청국장은 거의 변화가 없었다. 아미노태질소의 함량은 발효시간이 경과함에 따라 점점 증가하는 경향이었는데 분리균주를 첨가한 청국장의 증가 폭이 가장 컸고 다음 바실러스 서브틸리스 첨가한 청국장순이었으며 발효시간이 경과함에 따라 아무것도 첨가하지 않은 것보다는 무 및 키위를 첨가한 청국장의 아미노태 질소함량이 더 많이 나타났다. 이를 도 2에 나타났다. 암모니아태 질소 함량의 경우도 아미노태 질소의 함량과 같은 경향이었는데 특히 검정콩 청국장에 분리균주를 접종한 시험구가 발효시간이 경과함에 따라 그 함량이 증가폭이 크게 나타났다. 이는 도 3에 나타냈다. 펩티드태 지소의 함량은 발효시간이 경과함에 따라 점진적으로 감소하는 경향이었는데 분리균주를 첨가한 청국장의 감소폭이 가장 컸고 다음 바실러스 서브틸리스를 첨가한 청국장순이었으며 발효시간이 경과함에 따라 아무것도 첨가하지 않은 것보다는 무 및 키위를 첨가한 청국장의 펩티드태 질소 함량이 더 낮게 나타났다. 이는 도 4에 나타냈다. 수용성 단백질은 발효 24시간 이후부터 급격히 증가하여 48시간 때에 가장 높게 나타났는데 이때 대두의 청국장 보다는 대립 검정콩 청국장들의 함량의 대체로 더 높게 나타났으며 또한 소립 검정콩 청국장들 보다도 그 함량이 더욱 높은 경향이었다, 또한 대립 검정콩 청국장에서는 바실러스 서브틸리스를 접종한 것이 소립 검정콩 청국자에서는 무를 첨가한 것이 가장 높게 나타났다. 이는 도 5에 나타냈다. 염용해성 단백질 함량은 발효시간이 경과함에 따라 지속적으로 증가하는 경향이었는데 발효 48 ~ 72 시간 사이의 증가폭이 가장 크게 나타났으며 이때 키위를 첨가한 소립 검정콩, 대두 및 비첨가 대립 검정콩 청국장 등의 순으로 증가되었다. 이는 도 6에 나타낸 바와 같다. 유리아미노산은 대두, 대립 및 소립 검정콩을 이용한 청국장의 유리아미노산은 도 7의 크로마토그라피 결과로 나타냈다. 전체 유리아미노산 함량은 439.6 ~ 776.7 mg%로 나타났으며 그중 분리균주를 접종한 대립종 청국장이 776.7mg%로 가장 높았으며 비첨가 대립종 청국장이 439.6mg%로 가장 낮게 나타났다. 전체 시료에서 글루타민산의 함량이 가장 많았는데 검정콩 청국장류가 대조구인 황색대두 청국장(107.1mg%)에 비해 월등히 많았으며 특히 분리균주를 접종한 대립 검정콩 청국장이 214.6mg%에 비해 월등이 많았으며 특히 분리균주를 접종한 대립 검정콩 청국장이 214.6mg%로서 가장 많았다. 대두, 대립 및 소립 검정콩을 이용한 청국장의 핵산관련물질은 도 8에 나타낸 바와 같으며 이중 우리실 및 UMP의 함량은 다른 핵산관련물질에 비하여 많은 함량을 나타냈는데 분리균주를 첨가한 검정콩 청국장이 각각 12.84 및 10.34mg%로 가장 많게 나타났다. 또한 사이토신, 구아닌, CMP, GMP, IMP, AMP, ADP 및 ATP도 검출하였으며 균주를 접종한 청국장이 다른 청국장들에 비하여 핵산관련물질의 수가 적게 검출되어 맛이 단순화됨을 알 수 있었다.
대립 및 소립 검정콩으로 제조한 청국장의 수분, 조단백, 조지방, 조회분 분석
조사성분 대두 대립 검정콩 소립 검정콩
검정콩(I-BO) 식품재료(I-BF) 균주(I-BS) 검정콩(Ⅱ-BO) 식품재료(Ⅱ-BF) 균주(Ⅱ-BS)
무 키위 B.Subtilis SMY-212
무 키위 B. subtils SMY-212
수분 69.72 58.33 59.74 60.32 59.18 60.86 57.34 58.03 58.34 58.84 59.2
조단백질 22.26 26.31 26.71 20.08 17.33 18.03 25.71 23.37 25.39 17.85 20.30
조지방 12.25 12.47 11.72 10.35 10.42 11.89 12.30 10.52 10.12 9.73 11.67
조회분 3.00 3.44 2.32 2.11 2.05 2.18 2.67 2.79 3.42 2.23 2.69
실험예 2: 검정콩으로 제조한 청국장의 물리적 성질
본 실험예에서는 검정콩으로 제조한 콩의 점도, 색도 및 텍스쳐를 조사하였다. 점도는 마쇄한 청국장 10g을 증류수 100mL에 잘 혼합한 다음, 내경 8cm의 원통 유리용기에 담아 20℃로 유지시킨 항온수조에 담그고 원통형 spindle No 2(반경 0.159cm, 길이 3.175cm)을 회전점도계(Brookfield Synchro-Lectic Viscometer, model LVT)에 부착한 뒤 시료표면과 스핀들 표선을 일치시켰다. 10분간 방치한 후 0.6rpm(factor=5000에서 2분간 회전시키면서 torque값이 평형에 도달할 때 까지 측정하였다. 점도의 계산은 Dial reading × Factor(centripoise)로 하였으며 측정수치의 평균을 구하여 mPa·s로 표시하였다. 색도는 청국장 20g을 색차색차계(Chroma Meter CR-200, MINOLTA)의 측정대에 고르게 담은 후, L(Lightness), a(redness) 및 b(yellowness) 값을 각각 5회 반복 측정하였으며 이때 사용한 표준백색관의 L, a, b 값은 각각 89.2, 0.921 및 0.78이었다.텍스쳐는 청국장을 마쇄한 후 Zig(지름 3.5cm, 높이 1.2cm)를 이용하여 텍스쳐 분석기(TA-XT2i stable micro system Co., U. S. A)로 응집성(cohesiveness) 및 경도(hardness)를 측정하였다. 실험결과, 발효시간이 경과함에 따라 점도는 2종류의 검정콩 청국장 모두 점차 증가하는 경향이었는데 아무것도 첨가하지 않은 대립 및 소립 검정콩 보다는 무, 키위 및 균주를 첨가한 시험구의 점도가 발효시간이 경과함에 따라 더 증가하는 것으로 나타났다. 특히 발효 72시간이 경과하였을 때 분리균주를 첨가한 시험구가 다른 시험구보다 점도가 더 높게 나타났으나 대두 청국장에 비하여 높지 못하였다. 이는 대두는 검정콩보다는 쉽게 발효됨을 알 수 있었다. 색도중 명도 L값(명도)은 도 9에 나타낸 바와 같이 발효시간이 경과함에 따라 약간씩 감소하는 경향을 이었는데 검정콩 청국장의 값이 대조구에 비해 월등히 낮게 나타났다. 반면 a값(적색도)은 도 10에 나타낸 바와 같이 오히려 발효시간이 경과함에 따라 조금씩 증가하는 경향이었으며 또한 검정콩 청국장류의 값이 대조구에 비해 높게 나타났다. b값(황색도)는 도 11에 나타낸 바와 같이 발효시간이 경과함에 따라 유의적인 변화는 없었지만 검정콩 청국장류가 대조구에 비해 그 값이 현저히 낮게 나타났다. 텍스쳐중 굳기(hardness)는 줄어드는 경향이었는데 검정콩은 대두에 비하여 증자직후 경도가 높았으나 발효과정중에 상당히 빠르게 감소되어 72시간에는 큰 차이가 없이 비슷하거나 약간 높은 수준이었다. 또한 대립검정콩의 경우는 처음에 비하여 발효시간이 경과함에 따라 분리균주 SMY-212를 첨가한 것이 굳기가 크게 감소하였고, 소립 검정콩의 경우는 대립 검정콩보다 감소 폭이 크게 나타났다. 이를 도 12에 나타냈다. 응집성은 발효시간이 경과함에 따라 증가하였는데 특히 24시간 이후부터 응집성이 크게 증가하였고 대두보다는 검정콩류가 낮게 나타났다. 또한 대립 검정콩 청국장의 경우 키위를 첨가한 것이 다른 것에 비하여 낮게 나타났으며 소립 검정콩의 경우는 분리균주 SMY-212 및 바실러스 서브틸리스 균주를 첨가한 청국장이 첨가하지 않은 것보다 응집성이 높게 나타났다. 이는 도 13에 나타냈다.
실험예 3: 검정콩으로 제조한 청국장의 생균수 및 효소활성
본 발명의 검정콩으로 제조한 청국장의 호기성세균의 생균수 측정은 무균적으로 마쇄한 청국장 1g을 멸균 생리식염수로 3단계 희석법에 따라 희석한다음 플레이트 카운트 아가 배지(PCA : tryptone 0.5%, 이스트 추출물 0.25%, 글루코스 0.1%, 아가 1.5%)를 이용하여 평판 도말하고 40±1℃에서 2일간 배양한 후 나타난 콜로니 수를 측정하였다. 효소활성중 먼저 프로테아제는 마쇄한 청국장 10g과 증류수 100mL을 혼합하여 실온에서 2시간 동안 진탕추출하고 원심분리하여 조제하였다. 기질액은 우유 카제인 1.8g을 소듐 포스페이트 버퍼(pH 7.2) 300mL에 녹여 0.6% 카제인 용액으로 조제하였다. 효소활성 측정은 기질용액 1mL과 증류수 1mL을 시험관에 넣고 항온수조에서 전처리한 후 조효소액 1mL을 가하여 35℃에서 30분간 반응시킨 다음 0.4m 트리크로로 아세트산(TCA) 3mL을 가하고 35℃에서 30분간 방치하여 반응을 중지시켰다. 반응중지액을 원심분리하여 침전물을 제거한 다음 상층액 2mL에 0.5M Na22CO3 5mL과 1/3 폴린 페놀 시약 1mL을 가하여 35℃ 항온수조에서 30분간 발색시킨 후 실온에서 냉각시킨 다음, UV/Vis 스펙트로포토메터로서 660nm에서 optical density을 측정하여 티로신(㎍/mL)의 양으로 환산하여 프로테아제 활성을 나타냈다. 프로테아제의 1 unit는 조효소액 1mL이 1분간에 1㎍의 티로신을 생성하는 효소의 양으로 하였다. 아밀라아제 활성 측정은 수용성 전분을 기질로 조효소액 1mL에 1% 수용성 전분을 함유한 0.1M 아세테이트 버퍼(pH 48) 10mL을 가하고 30℃에서 반응시킨다. 10분 후에 반응액 1mL를 취하고 여기에 0.1N-HCl 10mL을 가하여 반응을 정시시킨다. 그 액 0.5mL에 0.005% 요딘과 0.05% 포타슘 요딘을 함유한 발색액 10mL를 가한 후 660nm에서 흡광도(OD)를 측정하였다. α-아밀라아제의 1unit는 아밀로오스-요딘 콤플렉스의 블루컬러가 10% 감소되는 효소량으로 하였다. 글루코 아밀라아제 활성은 생전분을 기질로 하여 1% 생전분을 함유한 0.05M 아세테이트 버퍼(pH 4.8) 5mL에 동일의 완충액 2mL을 가하여 30℃에서 수분간 보온하였다. 여기에 조효소액 1mL를 가하고 30분간 반응시킨 후 그 액 1mL을 취하여 DNS법에 따라 반응 전후 액증의 환원당량을 측정하고 양자의 차이로부터 효소반응에서 생산된 환원당을 산출하였다. 글루코아밀라아제의 1unit는 1시간에 1μmole의 글루코스를 생산하는 효소량으로 하였다. 실험결과, 생균수의 변화는 도 14에 나타낸 바와 같이 발효초기부터 균주 배양액을 첨가한 2가지 시험구는 다른 시험구에 비하여 균 증식속도가 완만하였으며 초기균수가 비슷한 비첨가 시험구나 무, 키위를 첨가한 시험구의 경우에는 발효시간이 경과되므로서 증식속도가 매우 빨라져 72시간에는 균주 첨가 시험구와 총 생균수가 거의 비슷한 경향을 나타냈다. 또 발효과정중의 프로테아제 활성은 발효시간이 경과함에 따라 모든 시험구에서 증가하였으며 특히 분리균주를 접종한 청국장의 효소활성은 대립 및 소립종에서 매우 높았고 다음 키위를 첨가한 청국장의 순이었으며 발효시간이 경과함에 따라 아무것도 첨가하지 않은 것보다도 무 및 바실러스 서브틸리스를 첨가한 청국장의 효소 활성의 증가폭은 크게 나타났다. α-아밀라아제 활성은 모든 시험구에서 증가하였으며 발효 48시간까지는 증가하다가 그 이후는 감소하는 경향이였다. 그 다음 순은 바실러스 서브틸리스를 첨가한 청국장의 효소활성이 매우 높았고 대조구인 황색 대두 청국장이었던 것이 아주 특징적이었으며 분리균주를 접종한 청국장의 효소활성은 프로테아제와는 달리 아주 강하게 나타나지는 않았다. 발효시간이 경과함에 따라 대립 검정콩에 아무것도 첨가하지 않은 것은 무 및 키위를 첨가한 청국장 같이 효소활성의 증가폭이 낮게 나타났다.
실험예 4:검정콩으로 제조한 청국장의 생균수 및 효소활성
관능검사는 훈련된 패널원 5명을 통하여 발효된 각 청국장을 그대로 실시하는 것과 청국장 찌개(물 500mL에 청국장 50g, 두부 10g, 소금 3g, 무 10g)을 만들어 실시하는 2가지 방법을 사용하였다. 평가항목은 전자의 경우는 색깔, 고유의 냄새 및 점질물의 형성에 대하여 후자의 경우는 색깔, 구수한 맛, 이취, 전체적인 선호도에 대하여 실시하였다. 평가방법은 4점 기호도 채점법(+ 매우 싫다, ++ 약간 싫다, +++ 약간 좋다, ++++ 매우 좋다)을 이용하였다. 실험결과, 표 4에 나타낸 바와 같이 색깔은 대두 청국장에 비하여 검정콩 청국장들이 약간 좋지 못하였지만 불쾌취의 경우는 무 및 키위를 첨가시킨 청국장이 대두 청국장 및 다른 검정콩 청국장들에 비하여 월등하게 개선되었으며 점질물은 대두 청국장에 비하여 검정콩 청국장이 적게 생성되었지만 분리균주를 접종한 검정콩 청국장들은 대두 청국장과 거의 같은 수준을 나타내었다. 청국장을 끓인 후 조미 관능검사는 표 5에 나타낸 바와 같이 색깔은 대두 청국장에 비하여 대립 및 소립 검정콩의 청국장들이 국물에 검은 빛이 약간 많아 좋지는 못하였지만 그 자체의 색깔이 독특한 점은 있었다. 맛의 경우는 대립 검정콩에 무와 키위를 첨가한 청국장은 단맛이 강하여 오히려 대두 청국장보다 좋게 나타났다. 또한 불패취의 경우도 대립 및 소립 검정콩 청국장이 대두 청국장보다 더 적게 생성되는 것으로 나타났으며 특히 무, 키위 및 분리균주를 첨가한 대립 검정콩 및 소립 검정콩 청국장은 불패취를 더 많이 감소시키는 것으로 나타났다. 전체적인 기호도에 있어서는 대립 검정콩의 청국장인 경우는 무 및 키위 첨가 제품이 대조구인 황색 대두 청국장에 비하여 높았고 나머지는 비슷하였으며 소립 검정콩의 청국장인 경우에는 무 첨가 제품외에는 모두 대조구에 비해 낮은 것으로 나타났다.
소립 및 대립 검정콩으로 제조된 청국장의 관능검사
검사항목 대두 대립 검정콩(Ⅰ) 소립 검정콩(Ⅱ)
검정콩(I-BO) 식품재료(I-BF) 균주(I-BS) 검정콩(Ⅱ-BO) 식품재료(Ⅱ-BF) 균주(Ⅱ-BS)
무 키위 B.subtilis SMY-212 무 키위 B.subtilis SMY-212
색깔 ++++ +++ +++ +++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ +
냄새억제 ++++ ++++ ++ + ++++ ++ ++ + + ++++ ++
점질물 ++++ +++ +++ +++ +++ ++++ ++ +++ +++ +++ ++++
+ 매우 싫다, ++ 약간 싫다, +++ 약간 좋다, ++++ 매우 좋다
소립 및 대립 검정콩으로 제조된 청국장으로 조리한 음식물 관능검사
검사항목 대두 대립 검정콩(Ⅰ) 소립 검정콩(Ⅱ)
검정콩(I-BO) 식품재료(I-BF) 균주(I-BS) 검정콩(Ⅱ-BO) 식품재료(Ⅱ-BF) 균주(Ⅱ-BS)
무 키위 B.subtilis SMY-212 무 키위 B.subtilis SMY-212
색깔 ++++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++
냄새 +++ +++ ++++ ++ +++ ++++ ++ +++ +++ ++ +++
냄새억제 ++++ +++ ++ +++ +++ ++ ++ ++ + +++ ++
전체적인 맛 +++ +++ ++++ ++++ +++ +++ ++ +++ ++ ++ ++
+ 매우 싫다, ++ 약간 싫다, +++ 약간 좋다, ++++ 매우 좋다
실험예 5:검정콩으로 제조한 청국장의 생물활성
청국장의 혈전용해능 측정을 위한 시료용액은 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 7.5)에 0.85% NaCl을 용해한 용액 100mL를 마쇄한 청국장 5g에 첨가하고 5℃에서 24시간 추출한 후 여과하여 제조하였다. 피브린 플레이트는 0.01M의 NaCl이 함유된 0.17M 붕산염을 동일 완충용액(pH 7.5)중에 용해시킨 용액중에 피브리노겐의 농도가 0.15%로 되게 한 다음, 이 용액 10mL를 직경이 90mm인 멸균된 샤레에 분주하고 트롬빈(20unit/mL) 0.5mL를 가하여 잘 혼합한 다음 덮개를 덮어 실온에서 1시간 방치하여 제조하였다. 나토키나아제 활성의 측정은 시료용액과 피브린 플레이트를 37℃에서 30분간 각각 보온한후 피브린 플레이트에 시료용액 10㎕를 적가하고 37℃에서 일정시간 반응시켜 형성된 피브린 용해 투명환의 장축 지름을 측정하여 비교하였다. 표준 플라스민용액을 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0unit/mL로 되도록 tris-NaCl 완충용액으로 조제한 후 피브린 플레이트에 10㎕씩 적가하여 형성된 장축 지름을 측정한 다음 시료용액의 활성과 비교하였다. 검정콩 청국장에 대한 수소공여능은 α,α'-디페닐-β-피크릴하이드레이진(DPPH)의 환원성을 이용하여 516nm에서 UV/Vis-스펙트로포토메터로 측정하였다. 즉, 각 추출물 0.1mL와 대조구로 사용한 0.1% BHT 1mL에 4 × 10-4M DPPH 용액 3ml를 각각 첨가한 후 5초 동안 vortex 혼합기로 혼합하여 증류수에 대한 흡광도를 측정하고 대조구는 시료대신에 에탄올 1mL를 첨가하여 대조구에 대한 흡광도의 감소비율로 나타냈다.
청국장 추출물의 항산화효과를 린놀렌산의 과산화물값(peroxide value, POV)을 측정하여 in vitro로 관찰하였다. 즉, 삼각플라스크에 린놀렌산 1mL, 카보닐을 제거한 에탄올 20mL 및 청국장 추출물 0.1mL를 첨가한 후 0.2M 포스페이트 버퍼 25mL를 가하여 37℃에서 일정기간(1, 3, 5, 7일) 저장한 다음 반응용액을 분액 깔대기에 옮겨 크로로포름 25mL를 가하여 2 ~ 3회 반복 추출하였다. 다음에 크로로포름 추출액에 초산 25mL와 포화 KI 용액 1mL를 가하여 암소에서 5분간 방치한 다음 증류수 50mL를 가하여 용해성 전분을 지시약으로 하여 1/100 N Na2S2O3용액으로 적정하였고 과산화물가는 다음 식에 의하여 계산하였다.
간지질에 대한 과산화억제효과는 청국장 추출물의 지질과산화 억제효과를 흰쥐의 간 호모게네이트(homogenate)를 사용하여 in vitro로 관찰하였다. 즉, 흰쥐의 간장을 적출하여 포스페이트 버퍼(pH 7.4)로 균질화한 다음 균질액에 H2O2(1M)과 FeSO4(50mM) 및 청국장 추출물 0.05mL을 가하여 37℃에서 40분간 배양한 후 생성된 TBARS(thiobarbituric acid reactive substances)를 측정하였다. 청국장 추출물에 대한 아질산염의 소거효과는 Gray 등의 방법에 준하여 1mM NaNO2 1mL에 청국장 추출물 0.2mL를 첨가하고 여기에 0.1N HCl(pH 1.2)을 사용하여 반응용액의 pH를 .2로 조정한 후 반용용액의 부피를 10mL로 하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응액 1mL에 2% 초산용액 5mL을 첨가한 다음 Griess 시약 0.4mL를 가하여 혼합하고 15분 방치후 분광광도계를 사용하여 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시험구는 NaNO2용액 대신에 증류수를 첨가하여 측정하였으며 소거율은 다음 식에 의해 제거된 아질산염의 백분율로 나타냈다.
R: 아질산염 소거율
A: 1시간 반응후의 1mM NaNO2의 흡광도
B: 공시험구의 흡광도
C: 추출시료 첨가구의 흡광도
또 항균활성은 그람 포지티브 균주로서 바실러스 속의 일반 부패균, 포도상식중독균(화농균), 충치균, 고초균 등을 포함한 8종을 사용하였고, 그람 네가티브 균주로는 대장균, 부패균, 녹농균, 살모넬라 식중독균 등을 포함한 5종을 사용하였다. 테스트 플레이트는 0.6% 아가를 함유시킨 LB 소프트 아가가 응고되기 전에 1.5% 아가를 함유시켜 미리 준비해둔 LB 배지에 중층·응고시킨 다음 즉시 랩으로 싸서 냉장고에 보관하면서 2주 이내에 사용하였다. 항균활성 측정방법은 아가 디푸젼 법에 준하여 검토하였다. 검정콩 청국장의 추출액을 용매분획시킨 후 회전증발기를 사용하여 10㎖로 감압농축(60℃)한 농축액을 항균활성 측정의 시료액으로 사용하였다. 멸균된 필터 페이퍼 디스크에 시료액을 스팟한 다음 80℃의 드라이 오븐에서 용매를 완전히 휘발시키고 중층 시험용 플레이트의 표면에 놓아 밀착시켜 냉장고에서 1시간 동안 방치시킨 후 인큐베이션에서 배양(30 ~ 35℃, 24시간)하여 클리어 존의 크기(직경, mm)를 측정하여 항균력을 비교하였다. 실험결과, 도 15에 나타낸 바와 같이 혈전용해능은 천연 식품소재 및 공시균주를 첨가하여 제조한 청국장에서 대체로 우수한 것으로 나타났다. 특히 식품소재 중에서는 무보다 키위의 첨가구가 균주 중에서도 바실러스 서브틸리스보다 SMY-212 균주의 첨가구가 우수하였다. 항산화력 조사결과 중 먼저 수소공여능은 표 6에 나타낸 바와 같이 0.1% BHT 첨가한 것이 93.1% 보다는 그 효과가 낮게 나타났지만 모두 상당한 효과를 나타냈다. 또한 대두 청국장의 67.3%에 비하여 대립 및 소립 검정콩 청국장이 각각 85.8 및 80.5%로서 더 높게 나타났다. 도 16에는 청국장 메탄올 추출물의 린놀렌산에 대한 항산화력을 나타낸 것으로 청국장 메탄올 추출물을 첨가하지 않은 대조구는 저장 1, 3, 5 및 7일 후에 과산화물가가 38, 84, 157 및 204meq/kg이었는데 청국장 메탄올을 첨가한 시험구에는 저장 7일 후에도 모두 30meq/kg이하로서 상당한 항산화효과가 있었다. 시험구 중에서도 대두 청국장의 메탄올 추출물보다도 무첨가 대립 검정콩 청국장을 제외한 대립 및 소립 검정콩 청국장류이 메탄올 추출물의 과산화물가가 낮게 나타났으며 대립종 청국장인 경우는 키위를 첨가한 것이 가장 낮았고 소립콩 청국장에서는 바실러스 서브틸리스를 접종한 것이 가장 낮아 이들의 항산화 효과가 더욱 큰 것으로 나타났다. 흰쥐의 간 지질에 대한 TBA가는 표 7에 나타낸 바와 같이 청국장 메탄올 추출물을 첨가하지 않은 대조구에서 3597μmol MDA/g 간이었고 청국장 메탄올 추출물을첨가한 시험구들의 TBA가는 1443μmol MDA/g 간으로서 모두 대조구에 비하여 낮게 나타나 항산화 효과가 있는 것으로 나타났다. 또한 청국장의 메탄올 추출물을 첨가한 시험구의 TBA가 더 낮게 나타났으며 또한 기능 청국장에서는 무보다는 키위를 첨가한 것이 종균 청국장에 있어서는 분리균주(SMY-212) 보다는 바실러스 서브틸리스를 접종한 것이 더 낮게 나타났다. 아질산염 소거능은 표 8에 나타낸 바와 같이 청국장 메탄올 추출물의 아질산염 소거능은 모두 70% 이상을 나타냈는데 소립 검정콩에 무와 바실러스 서브틸리스 및 분리균주를 첨가한 청국장 메탄올 추출물에서만 각각 85.5, 74.5 및 72.8%를 나타냈고 나머지 청국장 추출물에서는 모두 90%이상의 높은 효과를 나타냈다. 식중독균에 대한 항균활성은 대두의 청국장은 대부분의 시험균에 대하여 거의 항균활성이 없었으며 2가지의 검정콩류는 분리균주를 첨가한 청국장의 메탄올 추출물에서 가장 항균활성이 높게 나타났다. 키위보다는 무를 첨가하여 발효시킨 청국장의 추출물에 대한 항균활성이 높게 나타났다.
대두, 대립, 소립 검정콩으로 제조한 청국장 메탄올 추출물의 수소공여능 활성
대두 대립 검정콩(I) 소립 검정콩(Ⅱ)
검정콩(I-BO) 식품재료(I-BF) 균주(I-BS) 검정콩(Ⅱ-BO) 식품재료(Ⅱ-BF) 균주(Ⅱ-BS)
무 키위 B. subtilis SMY-212 무 키위 B.subtilis SMY-212
67.3 76.4 85.8 87.8 79.2 84.4 75.5 84.8 85.9 78.9 83.4
[주] 단위 unit : %
간의 TBA 가에 대한 청국장의 에탄올 추출물의 효과
대두 대립 검정콩(I) 소립 검정콩(Ⅱ)
검정콩(I-BO) 식품재료(I-BF) 균주(I-BS) 검정콩(Ⅱ-BO) 식품재료(Ⅱ-BF) 균주(Ⅱ-BS)
무 키위 B. subtilis SMY-212 무 키위 B.subtilis SMY-212
3730 1620 1480 1210 1030 920 1820 1490 1010 830 910
[주] 단위 unit : μmol MDA/g liver
대두, 대립, 소립 검정콩으로 제조한 청국장의 메탄올 추출물의 아질산염 제거효과
대두 대립 검정콩(I) 소립 검정콩(Ⅱ)
검정콩(I-BO) 식품재료(I-BF) 균주(I-BS) 검정콩(Ⅱ-BO) 식품재료(Ⅱ-BF) 균주(Ⅱ-BS)
무 키위 B. subtilis SMY-212 무 키위 B.subtilis SMY-212
96.8 97.2 99.6 98.3 93.4 92.6 92.8 85.5 92.6 74.5 72.8
[주] 단위 unit : %
상기 실시예와 실험예를 통하여 설명한 바와 같이 검은콩을 주재료로 사용하고 바실러스 균주로부터 분리하여 바실러스 메카테리움 유사균주로 동정한 공시 균주를 접종한 후 추가로 키위와 무를 첨가하여 제조한 청국장은 청국장 고유의 퀴퀴한 냄새가 억제되고 관능검사결과 기호도가 우수한 효과가 있고 혈전용해능, 과산화물가 억제능, 아질산염 소거능, 식중독 및 부패균에 대한 항균효과를 나타내는 뛰어난 효과가 있으므로 식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (2)

  1. 검정콩을 주재료로 함유하고 과채류를 부재료로 함유하는 청국장.
  2. 정선한 검정콩을 냉수에 침지하였다가 물빼기한 다음 고압 멸균기에 증자 및 냉각한 후 3일간 발효시키고 추가로 과채류와 프로테아제 및 아밀라아제 활성이 우수한 균을 접종하고 다시 발효시킴을 특징으로 하는 상기 1항 기재의 청국장 제조방법.
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