KR19990063649A - 헬리코박터 필로리로부터의 신규한 어드히진 - Google Patents

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라이너 하스
슈테판 오덴브라이트
토마스 에프. 마이어
앙드레 블륌
이렌느 꼬르떼시-뗄라즈
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하인리히 쿤
막스-플란크 게젤샤프트 주르 포르데룬 데르 비센샤프텐 이.브이.
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Abstract

본 발명은 헬리코박터 필로리로부터의 부착 유전자, 그에 의해 코드된 폴리펩티드 및 그 폴리펩티드에 대한 항체에 관한 것이다.

Description

헬리코박터 필로리로부터의 신규한 어드히진
본 발명은 헬리코박터 필로리로부터의 신규한 부착 유전자(adherence gene) alpB 및 이에 의해서 코드되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 상기 유전자, 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드에 대한 항체는 헬리코박터 필로리 감염의 진단, 예방 및 치료에 사용될 수 있다.
인간 위장 점막에서의 나선형 박테리아의 발생은 오랜 기간 동안 알려져 왔다(Bizzozero, 1893). 그렇지만, 이들 박테리아가 병원균이라는 것은 마샬 및 웨렌(Warren and Marshall, 1983; Marshall et al., 1984)이 위궤양 환자의 위장 점막으로부터 이 박테리아를 성공적으로 분리한 이후에 알려졌다. 최초의 분석에서 이들 분리된 미생물들이 그램 음성이고, 나선형 박테리아이고 극도로 높은 운동성을 가지며, 강한 산성 조건(pH 1.5 까지)에서도 생존할 수 있는 비상한 능력이 있음이 나타났다. 최초에는 캄필로박터 필로리로 표시된 상기 병원균은 최종적으로는 생화학적 및 형태학적 특성에 근거하여 새로이 정립된 "헬리코박터(Helicobacter)" 속으로 분류되었다(Goodwin et al., 1989).
헬리코박터 필로리 감염의 중요성 및 이러한 발견이 주는 암시는 수년 내에 명확하게 되었다. 테일러 및 블래저(Taylor and Blaser(1991))에 의한 감염연구는 H.필로리 감염은 전세계적으로 발생하고 세계 인구의 약 50%는 이 박테리아에 감염되어 있으며, 그 감염율은 산업화된 국가보다도 개발도상국에서 더 높다는 것을 보여주었다. 더나아가, 만성 H. 필로리 감염의 가능성은 나이가 들수록 극적으로 증가한다는 것이 발견되었다. 그러므로, H.필로리의 감염은 가장 흔한 인간의 만성 박테리아 감염 중 하나이다.
오늘날, H.필로리 감염은 필연적으로 인체에서 박테리아성 위염(B 타입 위염)을 유도하는 것으로 알려져 있다. 더우기, H.필로리는 위암의 몇몇 형태뿐만 아니라 위궤양 및 십이지장 궤양의 발생의 원인이 되는 것으로 추정된다(Lee et al., 1993; Solnick and Tompkins, 1993). 심지어 더욱 드물게 발생하고 면역계의 B 세포 종양의 전구물질로 여겨지는 위장의 MALT(mucosa associated lymphoid tissue) 임파종도 H.필로리 감염의 결과인 것으로 추정된다. 이러한 환자에 대하여 H.필로리를 성공적으로 박멸(완전제거)하면서 항박테리아 치료를 한 결과 MALT 임파종이 감소할 뿐만 아니라 위궤양이 회복되었다(Sipponen and Hyvarinen, 1993; Isaacson and Spencer, 1993; Stolte and Eidt, 1993).
H.필로리의 장기 감염의 결과는 위축성 위염, 즉 위 상피의 점액, 산 또는 펩신-생산 세포의 퇴화이며, 이는 초기-암 병변으로 여겨진다. 1980년 세계적으로 가장 흔히 발생하는 암의 종류에 대한 통계에 따르면, 위암이 감소추세이긴 하나 두 번째이다(Parkin et al., 1988). 최근의 두 개의 연구에서, H.필로리 감염과 위암(장관형)발생간에 통계적으로 상당한 상관관계가 있음을 보여주었다; 두 연구 모두 발생한 위암의 약 60%가 H.필로리 감염으로 인한 것이라고 결론내렸다.(Parsonnet et al., 1991; Nomura et al., 1991). 더우기, 시포넨(Sipponen,1992)의 연구결과는 많은 산업국가에서 감염자의 20% 이상이 위궤양 또는 십이지장 궤양에 걸리는 반면 이러한 위험도는 정상적인 점막을 가진 사람에게는 무시할 정도로 작다는 것을 보여준다. 이는 이들 빈번한 위-십이지장 질병은 감염성 질병이고 적절히 치료되어야만 한다는 것을 의미한다(Alper, 1993). 현재의 만성 H.필로리 감염을 제거하는 치료는 위염, 위궤양, 십이지장 궤양 또는 MALT 임파종이 수복되는 결과를 유도한다. 그러므로, 이미 존재하는 H.필로리 감염을 제거하는 치료뿐만 아니라 H.필로리 감염을 방지하는 예방적 치료(예를 들면, 면역화)는 이들 빈번한 위-십이지장 질병의 치료에 사용될 수 있다.
몇몇 고등 영장류를 제외하고 인간은 H.필로리에 대한 유일한 자연 숙주 인 것으로 예전에는 알려졌었다. 집고양이 또한 H.필로리에 감염될 수 있다는 비교적 최근의 발견은 인체 외부의 박테리아에 대한 가능성 있는 보유자 및 전달방법에 대한 의문에 새로운 실마리를 주었다. 감염자의 배설물로부터의 H.필로리가 종종 성공적으로 배양되었다는 사실 및 이 박테리아가 물에서 수개월동안 생존하는 능력은 배설물-구강 전염의 가설을 뒷받침한다. 또한 구강-구강간의 직접 전염도 가족 연구에 근거하여 가능한 것으로 여겨진다. 상기 감염은 이러한 감염의 발생빈도와 상관관계가 있는, 좁은 생활 공간 및 비위생적 환경에 있는 가족의 어린이에게 종종 발생한다.
구강 흡수 이후 박테리아는 극도로 산성(pH 1 - 2)인 위장 루멘에 도달한다. 여기서 박테리아는 존재하는 유레아를 분해하여 위의 산성 pH 값을 국소적으로 중화하는 유레아제(urease)효소를 생산함으로써 생존 가능하다. 화학주성 및 편모-의존성 운동성에 의해 이들 미생물들은 이후 위 공동(空洞) 영역의 중탄산염-완충된 점막층으로 이동하고, 이곳이 사실상 이들의 자연 서식처가 된다. 여기서 이들은 산성 장벽으로 인하여, 몇몇 경쟁 박테리아 종들만이 접근가능한 독특한 생태학적 위치에 있다. 이들 미생물들은 추정컨대, 루멘(pH 1-2)과 상피세포 표면(pH 6-7) 사이의 pH 구배에 의해 자신을 적응시켜서 상피에 도달한다. 나선형태, 점성 점막에서의 운동성, 점막-변조 효소의 생산 및 마지막으로 미호기성(微好氣性) 생존 방법으로 인해 이들 세균들은 이러한 서식지에서의 생존환경에 최적으로 적응한다.
이들 미생물들은 보통 생의 대부분을 상기 공동 영역의 심부 소낭(deep crypts)에서 보내는데, 여기서 이들은 산, 펩신 같은 외부영향 및 항생제 같은 살균 의약으로부터 보호된다. 미생물의 일부(20%)는 상피 세포, 특히 점액-형성 세포와 밀접하게 결합한다. 위장관의 화생(化生, metaplasia) 조건, 즉 십이지장내 위장관 상피의 산-유도 형성 조건 하에서, 십이지장내의 화생 영역 또한 군체화(群體化)되어, 십이지장 궤양의 발병을 위한 전제조건이 만들어진다. 분비 점액과 함께 헬리코박터가 완전히 방출되는 것은 이들 미생물의 부착능력에 의해 저지되는 것으로 추정되는데, 이로써 이들 박테리아는 수년, 수십년, 심지어 평생동안(만성 감염) 존속할 수 있다.
궤양성 질병에 대한 H.필로리의 존재 및 중요성이 알려지기 이전까지는, 이들 질병은 소위 제산제 또는 H2-수용제 길항제로써 치료되었다. 이들 물질은 위의 벽세포에서의 산 분비를 방해하는 물질이다. 이들 약제의 작용은 보통 궤양의 수복을 유도하지만, 이들 궤양 원인 중의 하나, 즉, H.필로리가 이들 물질에 의해 제거되지 않기 때문에 대부분의 경우 궤양 재발이 단기간내 발생한다.
궤양 치료에 있어서 더욱 빈번히 사용되는 것은 비스무트 치료이다. 다양한 비스무트 염(CBS, BSS)은 H.필로리에 대한 살균 효과를 가진다. 그렇지만, 이들 세균의 완벽한 제거는 8 - 32% 정도의 사례에서밖에 달성되지 않는다. 이 치료법은 겉보기에는 상기 세균의 일시적 억제를 유도하지만, 치료를 중단하면 대부분의 경우 다시 감염이 격발한다. 고용량의 장기치료는 간, 신장 및 신경계에서의 축적을 유발하고 상당한 신경학적 부작용을 유발한다(Malfertheiner, 1994).
위십이지장 궤양 질병은 전염병인 것이 발견되었기 때문에 치료의 목적 중의 하나는 항생제에 의해서 병원균을 박멸하는 것이다. 그러나, 다양한 항생제(아목시실린, 니트로후란, 후라졸리딘, 에리쓰로마이신 등)를 사용한 단일치료는 만족스럽지 못한 것으로 판명되었는데, 상기 병원균의 박멸이 0 - 15%의 사례에서만 발생하였기 때문이다. 현재까지 가장 성공적인 치료는, 산 블로커(Omeprazol)와 항생제(아목시실린)의 병용으로 달성되었는데, 이로써 80% 이상의 사례에서 박멸을 유발할 수 있다(Malfertheiner, 1994). 그러나, H.필로리의 제거를 위한 항생 요법은 장기적 해결책이 되지는 못하는데, 상기 박테리이가 항생제에 급속히 내성을 형성하기 때문이다.
그러므로, H.필로리 감염을 제어하는 새로운 형태의 치료법, 특히 H.필로리 의 전염성 인자(virulence factor)에 저항하도록 특이적으로 제작된 백신이 필요하다. 전염성 인자는 병원성 박테리아의 특성을 나타내는데, 면역반응 및 숙주의 비특이적 방어기전에도 불구하고, 숙주 체내의 특정한 생태학적 장소의 군체화(colonization)를 가능하게 한다. 알려진 가장 중요한 H.필로리의 전염성 인자는 유레아제, 편모, 어드히진(the adhesins) 및 사이토톡신의 생산이다.
박테리아 표면상의 효소인 유레아제는 총 박테리아 단백질의 5%를 구성하는 2개의 서브유닛(UreA, 25 kDa, UreB, 66 kDa)으로 이루어진다. 유레아제는 위액 중의 낮은 농도에서 유레아를 분해하여 암모니아 및 이산화탄소로 만든다. 현재까지 인지된 바로는, 상기 박테리아는 암모니아 무리를 둘러싸서 위액의 산의 국소적 중화를 유도한다. 상기 박테리아의 극도로 높은 운동성은 극성 편모의 존재에 기인하는데, 극성 편모는 상기 박테리아가 점액질의 위 점막 점액내에서 운동할 수 있게 함으로써 상피세포층에 도달하게 한다. 편모 형성 유전자(flaA, flaB)뿐만 아니라 유레아제 유전자 클러스터(ureA-ureH)는 E.coli내에서 클로닝되어 서열화되고 동유전자형 돌연변이(isogenic mutant)가 제조되었다.
분리된 H.필로리의 대략 50 - 60%는 소위 액포형성 사이토톡신이라는 87 kDa 단백질을 생산하는데, 이 단백질은 시험관내 세포 배양물에서 세포질 액포의 형성을 유도한다. H.필로리의 사이토톡신을 코드하는 vacA 유전자 또한 동시에 클로닝되어 유전학적으로 확인되었다. 더우기, 사이토톡신-생산 균주는 이러한 톡신을 생산하지 않는 균주에 비하여 더 높은 병원체 능력을 보유하는 것으로 추정된다. 게다가, 사이토톡신과 위 궤양 발병간의 양성 상관관계가 알려졌다.
H.필로리의 시험관내 상피세포 라인에 대한 부착에 관한 연구는 전기 박테리아가 서로 다른 조직에서의 많은 세포 라인에 결합할 수 있음을 보여준다. 대조적으로 H.필로리는 숙주 유기체내에서 매우 두드러진 종 및 조직 선택적 부착(굴성)을 보인다. 그러므로, 상기 박테리아는 상피세포의 위장관 타입(gastral type)에만 부착하는 것으로 알려졌다. 이러한 선택성은 박테리아 어드히진(adhesin)과 특정 세포 수용체간의 특이적 상호작용에 의해 설명될 수 있다.
현재까지 몇 종의 H.필로리의 유력한 어드히진이 알려졌으며, 소위 N-아세틸뉴라미닐락토스-결합 헤마글루티닌(N-acetylneuraminyllactose - binding haemagglutinin)을 코드하는 유전자(hpaA)가 클로닝되어 서열화되었다(Evans et al, 1993). 이것은 상피세포의 시알릭산을 함유한 수용체를 인식할 수 있는 단백질이다. 그렇지만, H.필로리 감염에 대한 이 어드히진의 중요성은 논쟁 중이다. 다른 유력한 어드히진은 분자량에 의해서만 확인되거나 특이적 결합 수용체에 의해서만 확인된다. 이들에는 ADP-리보실-트란스퍼라제 활성을 가진 어드히진, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 세포외효소 S에 상동인 것으로 보이는 63 kDa 단백질도 포함된다. 더우기, 위 상피세포의 Lewisb혈액 그룹 항원에 대한 특이적 결합을 매개하는 미확인된 어드히진이 있는 것이 아닌가 생각된다(FalK et al., 1993; Boren et al., 1993).
H.필로리에 의한 감염은 위장 점막의 만성 염증 반응(위염)을 유발한다. 더우기, H.필로리 항원에 대한 특이적 전신 면역 반응이 유도된다; 그렇지만 위장 내에서의 분비 항체(sIgA)는 아직 논쟁이 없을 만큼 규명되지는 않았다. 염증의 결과 다양한 면역세포가 위장 점막 및 점막하조직, 예를들면, 다형핵 백구, 단핵 백혈구, 대식세포, 임파구 및 플라즈마 세포에 존재한다.(Blaser, 1992). 더우기, H.필로리는 단핵 백혈구 및 대식세포 뿐 아니라 호중구도 활성화한다(Mai et al., 1991). 특이적 항체 및 보체에 대한 실험은 실험관내에서 호중구에 의한 H.필로리의 급속한 불활성화를 보여주었다. 그렇지만, 생체내에서는 이러한 매카니즘이 병원성인 상기 박테리아의 불활성화를 유도하지 않는다. 상기에서 언급한 방어 기전에도 불구하고 H.필로리가 장기간에 걸쳐 어떻게 생존하는지는 불분명하다.
숙주는 자연적 조건에서는 H.필로리 감염에 대항할 수 없다. 그러므로, H.필로리의 필수적 감염성 인자인 유레아제가 백신으로서 큰 능력을 가진다는 것은 더욱 놀라운 사실이다(미국 특허출원 일련번호 07/970,996 H.필로리 감염에 대항하는, 유레아제를 주재료로 한 백신).
헬리코박터 펠리스/생쥐 모델(H.felis는 고양이의 위장에서 자연적으로 군체화하고 또한 생쥐를 감염시킬 수 있는 헬리코박터의 종이다)은 H.필로리 유레아제 또는 재조합 유레아제 B 서브유닛(rUreB)의 예방 접종이 생쥐를 H.펠리스 감염으로부터 보호하고(예방적 백신) 또한 이미 존재하는 감염을 제거할 수 있음(치료적 백신)(Michetti et al., 1994; Corthesy-Theulaz et al., Gastroenterol.,인쇄중임)을 보여주었다. 구강 예방접종의 결정적 인자는 콜레라 톡신 같은 보조제의 사용이었는데, 콜레라 톡신은 다른 보조제 중에서도 면역반응을 전신적 항체 생산으로부터 분비 항체 생산으로 전환시키는데 중요한 것으로 보인다.
본 발명의 목적은 백신으로 유력한 후보물질인 헬리코박터 필로리로부터의 분비 유전자가 간편하면서 신속한 방법으로 식별될 수 있는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
독일특허출원 제 195 21 312.2 호에서 헬리코박터 필로리로부터 분비 유전자를 확인하는 방법이 기술되있는데, 상기에서 H. 필로리의 돌연변이 유전자 은행은 트랜스포손의 도움으로 제조되고 이 유전자 집합물은, 예를 들면 인간 상피세포에 대한 부착 거동 결함에 대해 분석된다.
이러한 방법으로 alpA로 표시된 어드히진 유전자 및 이 유전자에 의해 코드되는 폴리펩티드를 확인하는 것이 가능하다.
alpA의 하류쪽으로 측면을 접한 영역을 클로닝하는 도중, 서열 식별 번호 1에서 도시한 누클레오티드 서열을 가지고, alpB로 명명된, H. 필로리로부터의 신규한 어드히진 유전자 및 서열번호 1 및 2에서 도시된 아미노산 서열을 가진, 이러한 유전자에 의해 코드된 폴리펩티드가 확인되었다.
그러므로 본 발명의 목적은 또한
(a) 서열 식별 번호: 1에서 도시된 누클레오티드 서열
(b) 유전 암호의 축퇴(degeneracy)의 범위 내에서 (a)에 따른 서열에 상당하는 누클레오티드의 서열 또는
(c) (a) 및/또는 (b)에 따른 서열과 긴축 조건(stringent condition)하에서 하이브리다이즈하는 누클레오티드 서열
을 포함하는 DNA 서열이다.
서열 식별 번호: 1에서 도시된 누클레오티드 서열 및 유전 암호의 축퇴의 범위 내에서 (a)에 따른 서열에 상당하는 누클레오티드 서열에 더하여, 본 발명은 이들 서열과 긴축조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA 서열도 또한 포함한다. 본 발명에 따른 "하이브리다이제이션"라는 용어는 Sambrook 등(Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), 1.101 - 1.104)에 의해 기술된 바대로 사용되었다. 본 발명에 따르면, 긴축 조건하에서의 하이브리다이즈는 55℃, 바람직하게는 62℃에서, 더욱 바람직하기로는 68℃에서 1×SSC 및 0.1% SDS로 1시간 동안, 특히 55℃, 바람직하게는 62℃에서, 더욱 바람직하기로는 68℃에서 0.2×SSC 및 0.1% SDS로 1시간 동안 세척한 후 여전히 관찰되는 양성 하이브리다이즈 신호를 의미한다. 본 발명은 세척조건하에서 서열 식별 번호: 1 또는 유전 암호의 축퇴의 범위 내에서 (a)에 따른 서열에 상당하는 누클레오티드 서열과 하이브리다이즈하는 누클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 DNA 분자는 바람직하기로는 인간 세포 특히 인간의 위장 상피 세포에 부착할 수 있는 능력을 가진 폴리펩티드를 코드한다. 부가적으로, 본 발명에 따른 DNA 분자는 누클레오티드 수준에서 최소 70%, 특히 바람직하기로는 최소 80%가 서열 식별 번호: 1에 도시된 누클레오티드 서열에 상동인 것이 바람직하다. 더우기, 상기 DNA 분자는 최소 15, 바람직하게는 최소 20개 누클레오티드의 길이를 가지는 것이 바람직하다.
서열 식별 번호 1에서 도시된 어드히진 유전자 alpB의 DNA 서열은 518개 아미노산의 폴리펩티드를 코드한다. AlpB라 명명된 이 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 식별 번호 1 및 2에 도시되어있다. AlpB의 아미노산 서열의 N-말단 영역의 분석은 상기 폴리펩티드가 종래의 원핵 시그날 서열을 가짐을 암시한다. 그 아미노산 서열이 서열 식별 번호 3 및 4에서 도시되고, 독일특허출원 제 195 21 312.2 호에서 기술된 AlpA 및 AlpB의 아미노산 수준의 비교는 전체 아미노산 서열의 46%가 양 폴리펩티드에서 동일함을 보여준다. C-말단 부분(아미노산 341-518)은 심지어 66% 동일성을 보여준다.
alpB상의 서로다른 두 개의 위치에 트랜스포손 TnMax9을 삽입함으로써 생산된, alpB 유전자내의 결함 돌연변이는 위장관 상피 세포의 조직 부분에 결합하지 않는다. AlpA의 안정적인 발현이 이들 alpB 돌연변이내에서 검출되기 때문에, alpB유전자내의 결함은 alpB돌연변이의 부착성의 손실의 직접적인 원인임에 틀림없다.
AlpB 및 AlpA가 아마도 함께 복합체를 형성한다는 점에서, AlpA 및 AlpB 간에는 기능적인 연결이 있다. 이 복합체는 기능적인 어드히진으로서 유효한, 헤테로이량체(heterodimeric) 또는/ 및 다량체(multimeric) 집합물로서 존재할 수 있다. AlpA 또는 AlpB 중의 하나의 서브유닛의 손실은 이미 어드히진 복합체의 기능의 손실을 유도하고 그리하여 박테리아의 부착 결함을 유도한다.
그리므로, 본발명의 추가적인 목적은 alpB 유전자의 영역 및 alpA 유전자의 영역이 서로 융합된 서열 영역을 포함하는 DNA 분자이다. 특히, 이것은 상기 (a), (b) 및 (c)에서 정의된 서열이,
(d) 서열 식별 번호: 3에서 도시된 누클레오티드 서열
(e) 유전 암호의 축퇴(degeneracy)의 범위 내에서 (d)에 따른 서열에 상당하는 누클레오티드의 서열 또는
(f) (d) 및/또는 (e)에 따른 서열과 긴축 조건(stringent condition)하에서 하이브리다이즈하는 누클레오티드 서열
과 융합된 DNA 분자이다.
이러한 융합 DNA 분자의 바람직한 실시예는 어드히진 유전자 alpB(서열 식별번호 1) 및 alpA(서열 식별 번호 3) 각각으로부터의 하나 또는 그이상의 단편을 함유한다. 이들 단편의 길이는 바람직하게는 최소한 18 누클레오티드이고, 더욱 바람직하게는 최소한 30 누클레오티드이고 가장 바람직하게는 최소한 60 누클레오티드이다.
본 발명에 따른 또다른 목적은 본 발명에 따른 DNA 분자의 최소한 하나의 복제본을 함유한 벡터이다. 이러한 벡터로는, 발현 시그날(프로모터, 오퍼레이터, 인헨서 등)의 제어 하에서 본 발명에 따른 DNA 서열이 위치하고 있는 원핵 또는 진핵 벡터일 수 있다. 원핵 벡터의 예로는 박테리오파지(예를 들면, 박테리오파지 λ) 같은 염색체 벡터 및 플라스미드 같은 염색체외 벡터가 있으며, 플라스미드로는 원형 플라스미드 벡터가 특히 바람직하다. 적합한 원핵 백터는 예를 들면 Sambrook 등(Supra, chapters 1 - 4)에 의해 기술되어 있다.
한편, 본 발명에 따른 벡터로는 이스트 벡터 같은 진핵 벡터 또는 더욱 고등한 세포에 적합한 벡터(예를 들면 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 식물 벡터)가 있다. 이러한 벡터는 예를 들면 Sambrook 등( Supra, chapters 16)에 의해 기술되어 있다.
그러나, 본 발명에 따른 또다른 목적은 본 발명에 따른 벡터로써 형질전환된 세포이다. 바람직한 실시예에서 상기 세포는 원핵 세포, 바람직하기로는 그램-음성 원핵 세포, 특히 바람직하기로는 E.coli 세포이다. 그렇지만, 반면 본 발명에 따른 상기 세포는 진균 세포(예를 들면 이스트) 동물세포 또는 식물세포같은 진핵 세포일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 DNA 분자에 의해 코드되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 폴리펩티드는 바람직하게는 인간 세포에 부착할 수 있고 또한 (a) 서열 식별 번호: 2에서 도시된 아미노산 또는 (b) (a)에 따른 서열과 면역학적으로 교차-반응하는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 2에서 도시한 아미노산 서열과 람직하기로는 최소한 80%, 가장 바람직하기로는 최소 90%의 상동성을 가진다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 DNA 분자 또는 본 발명에 따른 벡터로써 세포를 형질전환하고, 형질전환된 세포를 폴리펩티드의 발현이 일어나는 조건하에서 배양하고, 상기 세포 및/또는 배양물 상청액으로부터 폴리펩티드를 분리시킴으로써 바람직하게 생산된다. 이러한 공정에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 비-융합 폴리펩티드 뿐만 아니라 융합 폴리펩티드로서도 얻어질 수 있다.
또한 본발명의 추가적인 목적은 폴리펩티드 AlpB( 서열 식별번호 2) 및 AlpA(서열 식별 번호 4)로부터의 하나 또는 그 이상의 단편을 각각 포함하는 융합 폴리펩티드들이다. 이들 단편의 길이는 최소한 6, 바람직하게는 최소한 10이고 가장 바람직하게는 최소한 20 아미노산이다.
AlpB 단백질은 DE 195 21 312.2 호에서 개시된 AlpA 단백질과 기능적으로 활성인 복합체를 형성할 수 있기 때문에, 본발명은 또한 최소한 2개의 폴리펩티드 성분을 가진 폴리펩티드 복합체에 관한 것이기도 한데, 제 1성분은 alpB 서열 또는 이로부터 유도된 서열에 의해 코드되고 제 2 성분은 alpA 서열 또는 이로부터 유도된 서열, 특히,
(d) 서열 식별 번호: 3에서 도시된 누클레오티드 서열
(e) 유전 암호의 축퇴(degeneracy)의 범위 내에서 (d)에 따른 서열에 상당하는 누클레오티드의 서열 또는
(f) (d) 및/또는 (e)에 따른 서열과 긴축 조건(stringent condition)하에서 하이브리다이즈하는 누클레오티드 서열
을 포함하는 DNA 분자에 의해 코드된다.
제 2 폴리펩티드, 즉 복합체의 AlpA 성분은 바람직하기로는 서열 식별 번호: 4에서 도시된 아미노산 서열, 이 서열과 최소한 80%, 바람직하기로는 최소한 90% 상동인 아미노산 서열, 또는 이들 서열과 면역학적으로 교차-반응하는 아미노산 서열을 포함한다.
본발명에 따른 폴리펩티드 AlpB 또는 그 일부분은 항체를 생산하기 위한 항원으로 사용될 수 있다. 본발명은 그러므로 본발명에 따른 폴리펩티드 또는 본발명에 따른 복합체에 대항하도록 설계된 항체에 관한 것이기도 하다. 상기 항체는 서열 식별 번호 2에서 도시된 아미노산 서열의 N-말단, 예를 들면 첫 번째 340개 및 특히 첫번째 250 개 아미노산에 대항하도록 설계되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 또다른 목적은 본 발명에 따른 DNA 분자, 본 발명에 따른 폴리펩티드, 본발명에 따른 복합체 또는 본 발명에 따른 항체를 활성성분으로 함유하고, 임의적으로 통상적인 보조제, 희석제, 첨가제 및 담체를 함께 함유하는, 약제학적 조성물에 관한 것이기도 하다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 한편으로 H.필로리 감염을 진단하는 목적으로 사용될 수 있다. 핵산 수준에서의 진단은, alpB 유전자에 특이적인 본 발명에 따른 DNA 서열을 함유한 하이브리다이제이션 프로브를 사용함에 의해, 또는 본 발명에 따른DNA 분자를 프라이머로 사용하여 증폭시킴에 의해 바람직하게 수행된다. 단백질 수준에서의 진단은 바람직하기로는 본 발명에 따른 항체의 도움으로 수행된다.
다른 한편으로 상기 약제학적 조성물은 헬리코박터 필로리 감염을 예방하거나 물리치는데에도 사용될 수 있다. 치료적 응용을 위하여, AlpA 폴리펩티드 또는 이들의 일부와 임의적으로 혼합된, 상기 AlpB 폴리펩티드 또는 이들의 일부는 능동적 백신의 생산에 사용되거나, 또는 상기 항체는 수동적 백신을 생산하는데 사용된다.
본 발명은 다음의 실시예 및 도면에 의해 더욱 명확히 설명된다.
도 1는 alpA 유전자(서열 식별 번호 1)의 조절 영역 및 5′ 말단을 함유한 플라스미드 pMu140의 제한 지도를 도시한다. alpA유전자는 트랜스포손 TnMax9의 삽입에 의해 불활성화된다(삼각형으로 라벨된 TnMax9 참조). 상기 플라스미드가 발현할 때 alpA-β-락타마제 융합 단백질이 얻어진다. pMu140은, 부착-결함성 H.필로리 균주 P1-140 이, 재형질전환 및 상동 재조합에 의해서 얻어지는 상기 돌연변이 유전자 은행으로부터의 오리지날 클론이다.
도 2는 alpA 유전자의 일부분 및 alpB 유전자의 전체(서열식별 번호 1)를 함유하는 폴라스미드 pMT5의 제한지도를 도시한다. 트랜스포손 TnMax9으로부터의 복제 기원 orifd및 클로람페니콜 트랜스퍼라제 유전자 catGC는 돌연변이화된 alpA 유전자의 자리 및, 이에 측면을 접한 alpB 유전자 영역의 선택적인 역클로닝(cloning back)을 위해 사용되었다. res는 TnMax9의 분해 부위를 의미하고, IR은 트랜스포손의 역전된 반복부(inverted repeats)을 의미한다. M13-FP 및 M12-RP1은 M12-순방향 및 역방향 서열화 프라이머의 서열을 함유하는 영역을 의미한다. 클로닝 부위 SacI 및 StuI 사이의 폴리링커 영역은 플라스미드 pBluescript II KS에서 유래된다.
도 3은 어드히진 AlpA 및 AlpB의 아미노산 서열 비교를 보여준다. (A) 서열 비교는 GCG 프로그램 BESTFIT(Devereux 등, 1984)를 사용하여 수행되었고 전체 폴리펩티드 AlpA 및 AlpB를 포함한다. 수직선은 동일한 아미노산임을 의미한다; 점은 보존된 아미노산의 치환을 보여준다. 양 서열사이의 동일성 또는 유사성의 정도는 서열의 말단 부분에 기재되있다. (B) 상당히 높은 정도의 동일성이 보여질 수 있는 곳은 양 폴리펩티드의 C-말단 영역(위치 341-518)인데, C-말단은 추정컨대 박테리아 외부막내로의 단백질의 내재성(integration)의 원인이 된다. 페닐알라닌(F)으로 끝나는, 5개의 아미노산의 C-말단 영역은 그램-음성박테리아의 분비된 단백질의 경우에 있어서, 외부막내로의 삽입을 의미하는 전형적인 것이다(Struyve 등, 1991).
서열 식별 번호: 1은 H.필로리 부착 유전자 alpB 및 이에 상당하는 아미노산 서열의 누클레오티드 서열을 도시한다.
서열 식별 번호: 2 는 H.필로리로부터의 상기 AlpB 부착 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 식별 번호: 3은 H.필로리 부착 유전자 alpA 및 이에 상당하는 아미노산 서열의 누클레오티드 서열을 도시한다.
서열 식별 번호: 4 는 H.필로리로부터의 상기 AlpA 부착 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다.
실시예 1
H.필로리 플라스미드 유전자 은행의 제조
H.필로리 야생형 균주 69A의 염색체 DNA 의 플라스미드 유전자 은행이 제조되었다. 이를 위해, 염색체 DNA가 H.필로리로부터 링 등(Leying 등, 1992)의 방법에 의해 분리되었으며, 제한 엔도누클레아제 Sau3AI 및 HpaII 각각으로써 부분적으로 절단되었다. 계속하여 상기 DNA 조각은, 준비된 아가로스 겔 상에서 분리되었으며 3-6 kb의 조각이 겔로부터 용출되었다. 이들 DNA 조각은, 제한효소 BglII 및 ClaI 으로 절단되어, 이러한 목적으로 특별히 제조된 플라스미드 벡터 pMin2 내로 결찰되었으며(T4 리가제), 결찰 혼합물은, 리조겐(lysogen) λ파지 λCH616을 함유하고,이전에 이미 트랜스포손 TnMax9으로 형질전환된, 균주 HB101(Bayer 및 Roulland-Dussoix, 1969)의 유도체인 E.coli 균주 E 181내로 형질전환되었다. 이 과정에서 약 2400 개의 독립적인 형질전환체가 얻어졌다.
최소 벡터 pMin2를 함유하는 E.coli 균주 DH5α는 "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)", Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braungschweig에 파일번호 10007로 기탁되었다. 트랜스포손 유도체 pTnMax9을 함유하는 E.coli 균주 E 181은 DSM에 파일 번호 10008로 기탁되었다.
실시예 2
H.필로리 돌연변이의 분리
트랜스포손 돌연변이화를 수행하기 위하여 각 케이스마다 10개 형질전환체가 푸울로 만들어지고 서로 유도되었고, 이런 방법으로 각각 10 - 20 개 클론을 가진 총 190개 푸울(pool)이 추가로 처리되었다. 독립적으로 돌연변이화된 H.필로리 유전자를 운반하는 191 개 암피실린 저항 E.coli 플라스미드 클론이, 이 돌연변이로부터 분리되었다. 이들 192개 플라스미드는 E.coli로부터 분리되어 H.필로리 균주 69A 의 재형질전환을 위해 사용되었다. 분비 단백질을 코드하는 유전자 내에서 돌연변이화된 것으로 추정되는 135개 H.필로리 돌연변이가 이들 192 형질전환체들로부터 분리되었다. H.필로리 돌연변이 집합물은 이후 KatoIII 상피 세포에 결합하는 능력을 상실한 H.필로리 돌연변이에 대한 스크리닝 분석으로 시험되었다.
이를 위해 상기 돌연변이들은 FITC로 표지되었고 상기 상피세포와 함께 37℃에서 1 시간동안 배양되었다. 부착 시험은 형광 현미경으로 관찰함으로써 직접 수행되었다. 이 실험에서 2개 돌연변이(P1-140 및 P1-179a)가 현저히 감소된 부착을 보이는 것으로 발견되었다.
두 돌연변이 모두 2차 부착 모델인 인간 위장의 조직 단편에서 무부착을 나타내었다. H.필로리 야생형 균주는 다른 돌연변이와 마찬가지로 이 모델에서 강한 부착을 나타내었다.
돌연변이 균주 P1-140의 생산에 사용된 플라스미드 pMu140이 도 1에 도시되어있다. 플라스미드 pMU179a(도시되지 않음)은 돌연변이 균주 P1-179a의 생산에 사용되었다. H.필로리 69A 내의 상기 두 플라스미드 모두의 독립적 형질전환은 확인된 부착 결함을 초래하였는데, 이 결함은 박테리아 염색체내에서 2차적 돌연변이화가 일어난 것이 아니라, 클론된 어드히진 유전자 내의 TnMax9 삽입이 H.필로리 돌연변이의 표현형이 관찰되는 것을 초래한다는 것을 증명한다. 트랜스포손 TnMax9에 의해 불활성화된 플라스미드 클론 pMu140 및 pMu179의 유전자의 서열화 및 지도화는 두 클론이 모두 서로 같은 유전자임을 보여주었다; 트랜스포손이 서로 다른 부위에 삽입될 뿐이었다. 코드된 단백질은 리포단백질, 즉 지방 고정물질(lipid anchor)과 함께 막에 고정되는 단백질이기 때문에, 상당하는 유전자는 AlpA(adherence-associated lipoprotein A)로 표시되었다. 막 단백질 및 C-말단에서의 몇몇의 보존된 단백질 서열(C-말단 페닐알라닌; Struyve 등., 1991)의 컴퓨터 2차 구조 예측으로부터의 데이터는 그램-음성 박테리아의 외막내로 합체된 내재성 막 단백질(integral membrane protein)의 증거가 된다.
실시예 3
alpB 부착 유전자의 확인
AlpB 유전자 자리의 유전적 특성화 도중, 측면을 접한 게놈 서열이 E. coli내에서 클로닝되어 서열화되었다. alpA 하류-측면 영역의 클로닝은 H. 필로리의 염색체로부터 TnMax9-삽입물의 역-클로닝에 의해 달성되었다. 돌연변이 P1-179a의 염색체 DNA(실시예 2 참조)는 제한 엔도누클레아제 SacI 및 StuI로써 절단되었고, 형성된 DNA 조각은 플라스미드 pBluescript II KS의 폴리링커로부터의 SacI-HincII 조각과 함께, T4 리가제를 사용하여 원형화되었고, 클로람페니콜에 의해 선택된 수용능력있는(competent) E.coli E131 세포내로 형질전환되었다.
얻어진 모든 형질전환체는 돌연변이화된 alpA유전자를 함유하여야 하고, 측면(flanking) 서열을 가져야 하는데, 왜냐하면, 복제 및 전개는 TnMax9에 의해 염색체적으로 삽입된 복제기원 orifd을 경유하여, 및, TnMax9상에 위치한 클로람페니콜 내성 유전자를 경유하여서만 일어날 수 있기 때문이다. pMT5에서 얻어진 재조합 플라스미드 중의 하나는 추가로 분석되었다.
pMT5 및 이로부터 제조된 서브클론의 서열화는, alpA 유전자( 중지 코돈이후의 67 개 누클레오티드)에 연이은, 518 아미노산의 폴리펩티드를 코드하고 alpB로 명명된(서열 식별 번호 1 및 2), 추가적인 오픈 해독 프레임의 개시가 있었음을 보여준다. 유전적 유기체화에 기초하여, 오페론을 추정할 수 있고, alpA 및 alpB는 추정컨대, 단일 프로모터(폴리시스트론 mRNA)에 의해 전사된다.
AlpB 유전자 생산물은 AlpA과 동일한 수의 아미노산을 가진다. AlpB 폴리펩티드 서열의 N-말단 영역의 분석 결과, 분비 폴리펩티드를 나타내는 종래의 원핵 시그날 서열의 존재를 나타내었다. AlpA 와 AlpB 사이의 아미노산 수준의 비교는 전체 폴리펩티드에 걸쳐서 46%의 동일성을 보여준다. C-말단 부분(아미노산 341-518)은 66% 동일성을 보여준다(도 3).
실시예 4
부착 유전자 AlpA 및 AlpB 사이의 기능적 연결
AlpA 와 AlpB 사이의 기능적 연결을 조사하기 위해, 2개의 TnMax9 트랜스포손 삽입물이 alpB유전자의 다양한 위치(위치 97 및 위치 1108)에서 도입되었고 자연 형질전환에 의해 H. 피롤리 69a의 게놈내로 전달되었다. 트랜스포손이 H. 필로리 염색체내로 정확하게 삽입되고 그리하여 alpB 유전자가 불활성화되었는지는 서던 블롯 하이브리다이제이션(Southern Blot hybridization)에 의해 확인되었다.
결과적으로 얻어진 alpB결함 돌연변이에 대해 위장관 상피 세포에 대한 결합 능력에 관한 분석이 행해졌다. 양 alpB 돌연변이 모두는 조직 단편으로부터의 위장관 상피세포에 결합하지 않은 것으로 밝혀졌다.
alpB 돌연변이내의 AlpA 의 안정적인 발현은 이뮤노블롯에 의해 증명될 수 있다. 이것은 AlpB가 alpB 돌연변이의 부착 결함에 직접적인 원인임을 보여준다. 구조 예측 및 양 폴리펩티드의 C-말단 영역에서의 높은 상동성의 결과로서, AlpB도 박테리아의 외막내로 삽입되어 존재할 수 있고 AlpA와 복합체를 형성할 수 있음을 추측할 수 있다. 이 복합체는 헤테로이량체(heterodimeric) 또는/ 및 다량체(multimeric) 집합물로서, 기능적인 어드히진으로서 유효할 수 있는 반면, AlpA 또는 AlpB 중의 하나의 서브유닛이 손실되면 이미 어디히진 복합체의 기능의 손실이 유도되고 그리하여 박테리아의 부착 결함이 유도된다.
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[서열 목록]
(1) 일반적인 정보 :
(ⅰ) 출원인 :
(A) 이름 : 막스-플랑크-게젤샤프트 쭈어 푀르데룽 더어 비쎈샤프텐 에. 파우. 베 를린
(B)거리 : 호프가르텐스트리트 2
(C) 도시 : 뭔헨
(E) 국가 : 독일
(F)우편번호: 80539
(ⅱ) 발명의 명칭 : 헬리코박터 필로리로부터의 신규한 어드히진
(ⅲ) 서열 수 : 4
(iⅴ) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체 형태 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환성
(C) 작동 시스템 : PC - DOS/MS - DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0,
Version #1.30(EPA)
(2) 1 번 서열에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 1557 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2 본쇄
(D) 분포 상태 : 선형
(ii) 분자 종류 : DNA (게놈형)
(vi) 최초의 기원 :
(A)유기체 : 헬리코박터 필로리
(vii) 직접적 기원 :
(B) 클론 : alpB
(ix) 특징 :
(A) 명칭 / 키 : CDS
(B) 위 치 : 1..1554
(xi) 서열 기술 : SEQ ID NO:1:
(2) 2 번 서열에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 518 개의 염기쌍
(B) 형태 : 아미노산
(C) 분포 상태 : 선형
(ii) 분자 종류 : 단백질
(xi) 서열 기술 : SEQ ID NO:2:
(2) 3 번 서열에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 1557 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2 본쇄
(D) 분포 상태 : 선형
(ii) 분자 종류 : DNA (게놈형)
(vi) 최초의 기원:
(A)유기체:헬리코박터 필로리
(vii) 직접적 기원:
(B) 클론:alpA
(ix) 특징 :
(A) 명칭 / 키 : CDS
(B) 위 치 : 1..1554
(xi) 서열 기술 : SEQ ID NO:3:
(2) 4 번 서열에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 518 개의 염기쌍
(B) 형태 : 아미노산
(C) 분포 상태 : 선형
(ii) 분자 종류 : 단백질
(xi) 서열 기술 : SEQ ID NO:4:

Claims (19)

  1. (a) 서열 식별 번호: 1에서 도시된 누클레오티드 서열
    (b) 유전 암호의 축퇴(degeneracy)위내에서 (a)에 따른 서열에 상당하는 누클레오티의 서열 또는
    (c) (a) 및/또는 (b)에 따른 서열과 긴축 조건(stringent condition) 하에서 하이브리다이즈하는 누클레오티드 서열
    을 포함하는 DNA 분자.
  2. 제 1항에 있어서, 누클레오티드 수준에서 서열 식별 번호: 1에 도시된 누클레오티드 서열에 대해 최소 80%의 상동성을 가진 DNA 분자.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 최소한 15개 누클레오티드의 길이인 DNA 분자.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 인간 세포에 부착하는 능력을 가진 폴리펩티드를 코드하는 DNA 분자.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서,
    (d) 서열 식별 번호: 3에서 도시된 누클레오티드 서열
    (e) 유전 암호의 축퇴(degeneracy)의 범위 내에서 (d)에 따른 서열에 상당하는 누클레오티드의 서열 또는
    (f) (d) 및/또는 (e)에 따른 서열과 긴축 조건(stringent condition)하에서 하이브리다이즈하는 누클레오티드 서열과 융합된 DNA 분자.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중의 어느 한 항에 따른 DNA 분자의 복제본을 최소한 하나 함유하는 벡터.
  7. 제 6항의 벡터로써 형질전환된 세포.
  8. 제 1항 내지 제 5항의 어느 한 항에 따른 DNA 분자에 의해 코드된 폴리펩티드.
  9. 제 8항에 있어서,
    (a) 서열 식별 번호: 2에서 도시된 아미노산 서열,
    (b)(a) 서열에 대해 최소한 80% 상동인 아미노산 서열 또는
    (c) (a) 또는/ 및 (b)에 따른 서열과 면역학적으로 교차-반응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  10. 제 8항 또는 9항에 있어서, 인간 세포에 부착할 수 있는 폴리펩티드.
  11. 최소한 2개의 폴리펩티드 성분을 가진 폴리펩티드 복합체로서, 복합체의 제 1성분은 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 따른 DNA 분자에 의해 코드되고, 복합체 중 제 2 성분은,
    (d) 서열 식별 번호: 3에서 도시된 누클레오티드 서열
    (e) 유전 암호의 축퇴(degeneracy)의 범위 내에서 (a)에 따른 서열에 상당하는 누클레오티드의 서열 또는
    (f) (d) 및/또는 (e)에 따른 서열과 긴축 조건(stringent condition)하에서 하이브리다이즈하는 누클레오티드 서열
    을 포함하는 DNA 분자에 의해 코드되는, 폴리펩티드 복합체.
  12. 제 11항에 있어서, 제 2 성분은
    (a) 서열 식별 번호: 4에서 도시된 아미노산 서열
    (b) (a) 서열과 최소한 80%의 상동인 아미노산 서열
    (c) (a) 또는/ 및 (b)에 따른 서열과 면역학적으로 교차-반응하는 아미노산 서열을 포함하는 복합체.
  13. 세포를, 제 1항 내지 제 5항 중의 어느 한 항에 따른 DNA 분자 또는 제 6항의 벡터로써 형질전환하고, 형질전환된 세포를 폴리펩티드의 발현이 일어나는 조건하에서 배양하고, 상기 폴리펩티드를 세포 및/또는 배양물 상청액으로부터 분리시키는 것을 포함하는, 제 8항 내지 10항 중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드의 생산방법.
  14. 항체를 생산하는 면역원으로서의 제 8항 내지 제 10항 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 용도.
  15. 제 8항 내지 제 10항 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 제 11항 또는 제 12항에 따른 복합체에 대한 항체.
  16. 제 15항에 있어서, 서열 식별 번호 : 2에서 도시된 아미노산 서열의 N-말단에 대항하여 설계된 항체.
  17. 제 1항 내지 제 5항 중의 어느 한 항에 따른 DNA 분자, 제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제 11항 또는 제 12항에 따른 폴리펩티드 복합체, 또는 제 15항 또는 제 16항의 항체를 활성 물질로서 함유하고, 임의적으로, 통상의 보조제 ,희석제, 첨가제 및 담체를 함께 함유한 약제학적 조성물.
  18. 헬리코박터 필로리 감염의 진단에 대한 제 14항에 따른 약제학적 조성물의용도.
  19. 헬리코박터 필로리 감염의 예방 및 치료를 위한 시약의 생산에 대한 제 17항에 따른 약제학적 조성물의 용도.
KR1019980702101A 1995-09-22 1996-09-20 헬리코박터 필로리로부터의 신규한 어드히진 KR19990063649A (ko)

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