DE19535321A1

DE19535321A1 - Neues Adhäsin aus Helicobacter pylori

Info

Publication number: DE19535321A1
Application number: DE19535321A
Authority: DE
Inventors: Rainer Dr Haas; Stefan Odenbreit; Thomas F Prof Dr Meyer; Andre L Prof Dr Blum; Irene Dr Corthesy-Theulaz
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1995-09-22
Filing date: 1995-09-22
Publication date: 1997-03-27
Also published as: AU712447B2; BR9610558A; NZ319160A; ZA967974B; MX9802213A; CA2232730A1; AU7131496A; US6096521A; JP2000513203A; EP0853670A1; WO1997011182A1; CN1200763A; IL123775A0; KR19990063649A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das neue Adhärenzgen alpB aus Helicobacter pylori und das davon codierte Polypeptid. Das Gen, das Polypeptid und ein gegen das Polypeptid gerichteter Antikörper können zur Diagnose, Prävention und Behandlung einer Helicobacter- Infektion eingesetzt werden.

Das Auftreten von spiralförmigen Bakterien in der menschlichen Magenschleimhaut ist seit langem bekannt (Bizzozero, 1893). Die Tatsache, daß es sich dabei um pathogene Keime handelt, wurde jedoch erst mit der erfolgreichen Isolierung und Kultivierung dieses Bakteriums durch Marshall und Warren (Warren and Marshall, 1983; Marshall et al., 1984) aus der Magenschleimhaut eines Patienten mit einem Magengeschwür (Ulcus ventriculi) realisiert. Wie erste Analysen ergaben, handelte es sich bei den isolierten Mikroorganismen um gramnegative, spiralförmige Bakterien mit extrem hoher Beweglichkeit und der ungewöhnlichen Fähigkeit im stark sauren Milieu (bis ca. pH 1,5) zu überleben. Ursprünglich als Campylobacter pylori be zeichnet, wurden die Keime schließlich aufgrund biochemischer und morphologischer Eigenschaften in die neu gegründete Gattung "Helicobacter" eingruppiert (Goodwin et al., 1989).

Schon innerhalb weniger Jahre wurde die Bedeutung der Helicobacter pylori-Infektion und die Tragweite dieser Entdeckung klar. Epidemiologische Untersuchungen von Taylor und Blaser (1991) zeigten, daß die H. pylori Infektion weltweit auftritt, und daß ca. 50% der Bevölkerung mit diesem Bakterium infiziert sind, wobei die Infektionsrate in den Entwicklungsländern höher ist als in industrialisierten Ländern. Ferner beobachtet man, daß die Wahrscheinlichkeit einer chronischen H. pylori-Infektion mit steigendem Lebensalter drastisch zunimmt. Damit zählt die H. pylori- Infektion zu den häufigsten chronischen bakteriellen Infektionen des Menschen.

Heute weiß man, daß die Infektion zwangsläufig zur Auslösung einer bakteriellen Gastritis (Typ-B Gastritis) beim Menschen führt. Ferner geht man davon aus, daß H. pylori auch eine ursächliche Rolle bei der Entstehung von Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren (Ulcus ventriculi und Ulcus duodeni) sowie bei einigen Formen des Magenkarzinoms (Adenokarzinom) spielt (Lee et al., 1993; Solnick and Tompkins, 1993). Auch die seltener auftretenden MALT (Mucosa Associated Lymphoid Tissue) Lymphome des Magens, die als Vorstufen von B-Zell-Tumoren des Immunsystems angesehen werden, sind vermutlich eine Folge der H. pylori-Infektion. Eine antibakterielle Behandlung entsprechender Patienten mit erfolgreicher Eradikation (totaler Elimination) von H. pylori führt sowohl zu einer Abheilung von Magengeschwüren als auch von "low grade" MALT Lymphomen (Sipponen and Hyvärinen, 1993; Isaacson and Spencer, 1993; Stolte and Eidt, 1993).

Eine Folge der Langzeitinfektion mit H. pylori ist die atrophische Gastritis, eine Degeneration der Schleim-, Säure- oder Pepsinproduzierenden Zellen des Magenepithels, die als eine präkanzeröse Läsion angesehen werden muß. Nach einer Statistik der 1980 weltweit am häufigsten aufgetretenen Krebsarten steht das Magenkarzinom an zweiter Stelle, allerdings mit rückläufiger Tendenz (Parkin et al., 1988). Zwei Studien zeigten kürzlich eine statistisch signifikante Korrelation zwischen der H.pylori-Infektion und dem Auftreten des Magenkarzinoms (intestinaler Typ); beide kamen zu dem Schluß, daß ca. 60% aller auftretenden Magenkarzinome wahrscheinlich auf eine H.pylori-Infektion zurückzuführen sind (Parsonnet et al., 1991; Nomura et al., 1991). Weiterhin zeigen Untersuchungen von Sipponen (1992), daß in vielen industrialisierten Ländern mehr als 20% der Infizierten im Laufe ihres Lebens an einem Ulkus des Magens oder des Duodenums erkranken, während bei Personen mit normaler Magenmukosa dieses Risiko vernachlässigbar gering ist. Dies bedeutet, daß diese häufigen gastroduodenalen Erkrankungen als Infektionskrankheiten betrachtet und entsprechend behandelt werden müssen (Alper, 1993). Eine Behandlung, die eine bereits bestehende chronische H.pylori- Infektion eliminiert, führt zur Abheilung einer Gastritis, eines Magen- bzw. Zwölffingerdarmgeschwürs oder eines MALT-Lymphoms. Damit kann eine prophylaktische Behandlung, die eine H. pylori-Infektion verhindert (z. B. Impfung) sowie eine Behandlung die eine bereits bestehende H.pylori- Infektion eliminiert, zur Behandlung dieser häufigen gastroduodenalen Erkrankungen eingesetzt werden.

Neben einigen höheren Primaten war der Mensch bisher als einziger natürlicher Wirt für H. pylori bekannt. Der relativ neue Befund, daß auch die Hauskatze mit H. pylori infiziert sein kann, wirft ein neues Licht auf die Frage der Übertragung und eines möglichen Reservoirs für diese Bakterien außerhalb des menschlichen Organismus. Die gelegentlich erfolgreiche Anzüchtung von H. pylori aus dem Stuhl infizierter Personen und die Fähigkeit der Bakterien über Monate im Wasser zu überleben, unterstützen die Hypothese einer fäkal-oralen Übertragung. Auch die direkte oral-orale Transmission wird aufgrund von Familienstudien als wahrscheinlich angesehen. Die Infektion erfolgt meist im Kindesalter innerhalb der Familie, wobei enge räumliche Lebensverhältnisse und geringer Hygienestandard positiv mit der Häufigkeit der Infektion korrelieren.

Nach der oralen Aufnahme gelangen die Bakterien zunächst in das extrem saure Magenlumen (pH 1-2). Dort wird durch die Produktion des Enzyms Urease, das zur Spaltung des vorhandenen Harnstoffs und damit zur lokalen Neutralisierung des sauren pH-Wertes im Magen führt, das Überleben der Bakterien ermöglicht. Mittels chemotaktischer Orientierung und flagellenabhängiger Motilität bewegen sich die Keime dann in die Bicarbonat-gepufferte Schleimschicht der Antrumregion des Magens, ihrem eigentlichen natürlichen Habitat. Dort befinden sie sich in einer einzigartigen ökologischen Nische, die aufgrund der Säurebarriere nur für wenige konkurrierende Bakterienarten zugänglich ist. Vermutlich orientieren sich die Keime an dem pH-Gradienten zwischen Lumen (pH 1-2) und Epithelzelloberfläche (pH 6-7), um zum Epithel zu gelangen. Durch ihre spiralige Form, ihre Beweglichkeit im viskosen Schleim, die Produktion von Mukus-modifizierenden Enzymen und schließlich durch eine mikroaerophile Lebensweise sind diese Keime optimal an die Lebensbedingungen in diesem Habitat angepaßt.

Sie halten sich meist in den tiefen Krypten der Antrumregion auf, wo sie vor äußeren Einflüssen wie z. B. Säure, Pepsin, aber auch vor Medikamenten zu ihrer Eradikation wie z. B. Antibiotika geschützt sind. Ein Teil der Population (ca. 20%) ist eng mit Epithelzellen assoziiert, vor allem mit Schleim-produzierenden Zellen. Unter der Voraussetzung einer gastralen Metaplasie, d. h. der Säure-induzierten Ausbildung von gastralem Epithel im Duodenum, kommt es auch zur Kolonisierung metaplastischer Areale im Duodenum, wodurch die Voraussetzungen zur Entstehung des Zwölffingerdarm-Geschwürs (Ulcus duodeni) geschaffen sind. Durch ihre Fähigkeit zur Adhärenz wird vermutlich eine komplette Ausscheidung der Helicobacter mit dem abgestoßenen Schleim verhindert, so daß die Bakterien für Jahre, Jahrzehnte oder gar lebenslang persistieren können (chronische Infektion).

Bevor die Existenz und die Bedeutung des H. pylori für die Ulkuserkrankungen bekannt waren, wurden diese durch sog. Antazida, oder H₂-Rezeptorantagonisten behandelt. Dabei handelt es sich um Substanzen, welche die Säuresekretion der Magenparietalzellen inhibieren. Unter dem Einfluß dieser Arzneimittel kommt es meist zur Abheilung von Geschwüren, da jedoch eine der Ursachen dieser Geschwüre, nämlich die H. pylori-Infektion, damit nicht eliminiert wird, kommt es in den meisten Fällen nach kurzer Zeit zu einem erneuten Auftreten der Ulzeration (Rezidiv).

Eine weitere, häufig angewandte Therapie bei Ulzerationen ist die Wismut-Behandlung. Verschiedene Wismutsalze (CBS, BSS) haben einen bakteriziden Effekt auf H. pylori. Eine totale Eradikation des Keims wird jedoch nur in 8-32% der Fälle erreicht. Die Behandlung führt anscheinend zu einer vorübergehenden Suppression des Keims, aber nach Absetzen der Behandlung kommt es in den meisten Fällen wieder zum Aufflackern der Infektion. Eine längerdauernde Therapie mit hohen Dosen führt zu einer Akkumulation der Substanz in Leber, Niere und im Nervensystem und hat beträchtliche neurologische Nebenwirkungen (Malfertheiner, 1994).

Seit der Erkenntnis, daß es sich bei den gastroduodenalen Ulkuserkrankungen um Infektionskrankheiten handelt, ist ein Ziel der Behandlung die Eradikation der Erreger durch Antibiotika. Die Monotherapie mit verschiedenen Antibiotika (Amoxicillin, Nitrofuran, Furazolidin, Erythromycin u. a.) stellte sich jedoch als nicht zufriedenstellend heraus, da es auch hier nur bei 0-15% der Fälle zur Eradikation der Keime kommt. Die erfolgreichste Behandlung wird zur Zeit durch eine Kombination eines Säureblockers (Ompeprazol) mit einem Antibiotikum (Amoxicillin) erreicht, die zu Eradikationsraten bis zu 80% führen kann (Malfertheiner, 1994). Auf Dauer ist eine Antibiotika-Behandlung zur Eliminierung von H. pylori jedoch nicht erfolgversprechend, da mit einer raschen Resistenzentwicklung der Bakterien gegen Antibiotika gerechnet werden muß.

Daher besteht ein Bedürfnis nach neuen Therapieformen für die Bekämpfung einer H. pylori-Infektion, insbesondere nach Impf stoffen, die spezifisch gegen Virulenzfaktoren von H. pylori gerichtet sind. Als Virulenzfaktoren bezeichnet man die Eigenschaften eines pathogenen Bakteriums, die ihm die Fähigkeit verleihen, eine bestimmte ökologische Nische im Körper des Wirts zu kolonisieren und sich dort trotz der Immunantwort und der unspezifischen Abwehrmechanismen des Wirtsorganismus zu vermehren. Kenntnisse über Virulenzfaktoren helfen somit den Ablauf und die Mechanismen einer Infektionskrankheit besser zu verstehen. Die wichtigsten bisher untersuchten Virulenzfaktoren von H. pylori sind die Urease, die Flagellen, die Adhäsine und die Produktion eines Cytotoxins.

Die Urease, ein Enzym auf der Oberfläche der Bakterien, besteht aus 2 Untereinheiten (UreA, 26 kDa, UreB, 66 kDa) die bis zu 5% des gesamten bakteriellen Proteins ausmachen. Die Urease spaltet den im Magensaft in geringer Konzentration vorkommenden Harnstoff in Ammoniak und Kohlendioxid. Nach der gängigen Modellvorstellung umgibt sich das Bakterium mit einer Wolke von Ammoniak, was zur lokalen Neutralisierung der Säure des Magensaftes führt. Die außerordentlich hohe Beweglichkeit der Bakterien kann auf das Vorhandensein von polaren Flagellen zurückgeführt werden, die es dem Bakterium erlauben, sich im viskosen Mukus der Magenschleimhaut zu bewegen und dadurch die Epithelzellschicht zu erreichen. Sowohl das Urease-Gencluster (ureA - ureH) als auch die Gene zur Ausbildung der Flagellen (flaA, flaB) wurden in E. coli kloniert und sequenziert und es wurden isogene Mutanten hergestellt.

Ungefähr 50-60% aller isolierten H.pylori-Stämme produzieren ein 87 kDa Protein, das sogenannte vakuolisierende Cytotoxin, das bei in vitro Zellkulturen die Ausbildung von cytoplasmatischen Vakuolen bewirkt. Auch das vacA-Gen, das für das Cytotoxin von H. pylori kodiert, wurde inzwischen kloniert und genetisch charakterisiert. Es wird ferner vermutet, daß die Cytotoxin-produzierenden Stämme ein höheres pathogenes Potential besitzen, als Stämme, die dieses Toxin nicht produzieren. Weiterhin wurde eine positive Korrelation zwischen der Produktion des Cytotoxins und der Ausbildung von Magengeschwüren gefunden.

Untersuchungen zur Adhärenz von H. pylori an Epithelzellinien in vitro zeigen, daß die Bakterien an viele Zellinien von unterschiedlichen Geweben binden können. Im Wirtsorganismus dagegen zeigt H. pylori eine sehr ausgeprägte spezies- und gewebeselektive Adhärenz (Tropismus). So findet man die Bakterien nur an Epithelzellen gebunden, die dem gastralen Typ von Epithelzellen angehören. Diese Selektivität wird durch eine spezifische Interaktion zwischen einem bakteriellen Adhäsin und einem spezifischen zellulären Rezeptor erklärt.

Es wurden bisher mehrere potentielle Adhäsine von H. pylori beschrieben und ein Gen (hpaA), das für ein sogenanntes N-Acetyl-Neuraminyllactose-bindendes Hemagglutinin kodiert, wurde kloniert und sequenziert (Evans et al., 1993). Dabei handelt es sich um ein Protein, das einen sialinsäurehaltigen Rezeptor auf den Epithelzellen erkennen soll. Die Bedeutung dieses Adhäsins für die H. pylori-Infektion ist jedoch umstritten. Andere potentielle Adhäsine sind entweder nur durch ihr Molekulargewicht oder ihre Rezeptorbindungsspezifität charakterisiert. Dazu zählt ein 63 kDa Protein, das zum Exoenzym S von Pseudomonas aeruginosa, einem Adhäsin mit ADP-Ribosyltransferase-Aktivität, homolog zu sein scheint. Ferner vermutet man ein noch nicht identifiziertes Adhäsin, welches eine spezifische Bindung an das Lewis^b-Blutgruppenantigen der Magenepithelzellen vermittelt (Falk et al., 1993; Boren et al., 1993).

Die Infektion mit H. pylori führt zu einer chronischen Entzündungsreaktion der Magenmukosa (Gastritis). Ferner wird eine spezifische systemische Immunantwort gegen H. pylori-Antigene induziert, die Bildung von sekretorischen Antikörpern im Magen (sIgA) ist allerdings noch nicht eindeutig geklärt. Durch die Entzündung befinden sich verschiedene Immunzellen in der Magenmukosa und Submukosa, z. B. polymorphkernige Leukozyten, Monozyten, Makrophagen, Lymphozyten und Plasmazellen (Blaser, 1992). Weiterhin aktiviert H. pylori sowohl Neutrophile als auch Monozyten und Makrophagen in vitro (Mai et al., 1991). In vitro zeigen Versuche mit spezifischen Antikörpern und Komplement eine rasche Inaktivierung von H. pylori durch Neutrophile. In der in vivo Situation führen diese Mechanismen jedoch nicht zur Inaktivierung der pathogenen Bakterien. Wie H. pylori über lange Zeit im Wirt überlebt obwohl dieser die obengenannten Abwehrmechanismen aktiviert, ist unklar.

Der Wirt ist nicht in der Lage, unter natürlichen Bedingungen mit der H. pylori-Infektion fertig zu werden. Um so überraschender war es deshalb, daß die Urease, ein essentieller Virulenzfaktor von H. pylori (s. o.), ein hohes Potential als Vakzine besitzt (US-Patentanmeldung USSN 07/970,996 "Urease-based Vaccine against Helicobacter Infection").

Im Helicobacter felis / Maus Modell (H. felis ist eine Heli cobacter Spezies, die natürlicherweise im Magen der Katze kolonisiert und auch die Maus infizieren kann) konnte gezeigt werden, daß die H. pylori Urease, bzw. die rekombinante Urease B Untereinheit (rUreB) bei oraler Vakzinierung, sowohl die Maus vor einer H. felis-Infektion schützen kann (präventive Vakzine), als auch eine bereits bestehende Infektion eliminieren kann (therapeutische Vakzine) (Michetti et al., 1994; Corthesy-Theulaz et al., Gastroenterol., im Druck). Entscheidend bei der oralen Vakzinierung war der Einsatz von Adjuvantien wie z. B. Choleratoxin, das u. a. zur Konversion der Immunreaktion von der Produktion von systemischen Antikörpern zu sekretorischen Antikörpern wichtig zu sein scheint.

Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand darin, neue sekretorische Gene aus Helicobacter pylori und davon codierte Polypeptide, die potentielle Kandidaten für Impfstoffe sind, bereitzustellen.

In der deutschen Patentanmeldung 195 21 312.2 wird ein Verfahren zur Identifizierung sekretorischer Gene aus Helicobacter pylori beschrieben, bei dem man mit Hilfe eines Transposons eine Mutantengenbank von H. pylori anlegt und diese Mutantenkollektion auf Mutanten mit Defekten im Adhärenzverhalten, z. B. gegenüber menschlichen Magenepithelzellen analysiert. Auf diese Weise konnte ein als alpA bezeichnetes Adhäsingen und ein von diesem Gen codiertes Polypeptid identifiziert werden.

Bei Klonierung der stromabwärts gelegenen alpA-flankierenden Region wurde jetzt ein neues, als alpB-bezeichnendes Adhäsingen aus H. pylori mit der in SEQ ID NO.1 gezeigten Nucleotidsequenz und ein von diesem Gen codiertes Polypeptid mit der in SEQ ID NO.1 und 2 gezeigten Aminosäuresequenz identifiziert.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein DNA- Molekül, das

(a) die in SEQ ID NO.1 dargestellte Nucleotidsequenz,
(b) eine der Sequenz gemäß (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nucleotidsequenz oder
(c) eine mit den Sequenzen gemäß (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nucleotidsequenz umfaßt.

Neben der in SEQ ID NO.1 gezeigten Nucleotidsequenz und einer dieser Sequenz im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nucleotidsequenz umfaßt die vorliegende Erfindung auch noch eine DNA-Sequenz, die mit einer dieser Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Der Begriff "Hybridisierung" gemäß vorliegender Erfindung wird wie bei Sambrook et al (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101 bis 1.104) verwendet. Gemäß vorliegender Erfindung spricht man von einer Hybridisierung unter stringenten Bedingungen, wenn nach Waschen für eine Stunde mit 1 × SSC und 0,1% SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 62°C und besonders bevorzugt bei 68°C, insbesondere für eine Stunde in 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 62°C und besonders bevorzugt bei 68°C noch ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Eine unter derartigen Waschbedingungen mit einer der in SEQ ID NO.1 gezeigten Nucleotidsequenz oder einer damit im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nucleotidsequenz hybridisierende Nucleotidsequenz wird von der vorliegenden Erfindung umfaßt.

Vorzugsweise codiert das erfindungsgemäße DNA-Molekül für ein Polypeptid mit der Fähigkeit zur Adhärenz an humane Zellen, insbesondere an humane Magenepithelzellen. Weiterhin ist bevorzugt, daß das erfindungsgemäße DNA-Molekül auf Nucleotidebene eine Homologie von mindestens 70%, besonders bevorzugt von mindestens 80% zu der in SEQ ID N0.1 dargestellten Nucleotidsequenz aufweist. Weiterhin ist bevorzugt, daß das DNA-Molekül eine Länge von mindestens 15, besonders bevorzugt von mindestens 20 Nucleotiden aufweist.

Die in SEQ ID NO.1 gezeigte DNA-Sequenz des Adhäsingens alpB codiert für ein Polypeptid von 518 Aminosäuren. Die Aminosäuresequenz dieses als AlpB bezeichneten Polypeptids ist in SEQ ID NO.1 und 2 gezeigt. Eine Analyse der N- terminalen Region der Aminosäuresequenz von AlpB läßt vermuten, daß das Polypeptid eine klassische prokaryontische Signalsequenz besitzt. Ein Vergleich auf Aminosäureebene zwischen AlpB und dem in der deutschen Patentanmeldung 195 21 312.2 beschriebenen Polypeptid AlpA, dessen Aminosäuresequenz in SEQ ID NO.3 und 4 dargestellt ist, zeigt, daß beide Polypeptide eine Identität über die gesamte Aminosäuresequenz von 46% aufweisen. Der C-terminale Teil (Aminosäuren 341-518) zeigt sogar eine Identität von 66%.

Defektmutanten im alpB-Gen, die durch Insertion des Transposons TnMax9 an zwei verschiedenen Positionen des alpB- Gens hergestellt wurden, zeigen keine Bindung an Gewebeschnitte von Magenepithelzellen. Da eine stabile Expression von AlpA in diesen alpB-Mutanten nachgewiesen werden konnte, muß der Defekt des alpB-Gens direkt für den Adhärenzverlust der alpB-Mutante verantwortlich sein.

Ein funktioneller Zusammenhang zwischen AlpA und AlpB besteht darin, daß AlpB und AlpA zusammen vermutlich einen Komplex bilden können. Dieser Komplex könnte als heterodimeres oder/und multimeres Aggregat vorliegen, das als funktionelles Adhäsin wirksam ist. Der Verlust einer Untereinheit, sei es AlpA oder AlpB, kann bereits zu Funktionsverlusten des Adhäsinkomplexes und damit zu Adhärenzdefekten der Bakterien führen.

Noch ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein DNA-Molekül, das Sequenzbereiche des alpB-Gens und des alpA- Gens fusioniert miteinander umfaßt. Insbesondere ist dies ein DNA-Molekül, bei dem die vorstehend unter (a), (b) und (c) definierte Sequenz fusioniert ist mit

(d) der in SEQ ID NO.3 dargestellten Nucleotidsequenz,
(e) einer der Sequenz gemäß (d) im Rahmen der Degeneration des des genetischen Codes entsprechenden Nucleotidsequenz oder
(f) einer mit den Sequenzen gemäß (d) oder/und (c) unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Nucleotidsequenz.

Ein bevorzugtes Beispiel für ein derartiges fusioniertes DNA- Molekül enthält jeweils einen oder mehrere Abschnitte aus den Adhäsingenen alpB (SEQ ID NO.1) und alpA (SEQ ID NO.3). Die Länge dieser Abschnitte ist vorzugsweise mindestens 18 Nucleotide, besonders bevorzugt mindestens 30 Nucleotide und am meisten bevorzugt mindestens 60 Nucleotide.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor, der mindestens eine Kopie eines erfindungsgemäßen DNA-Moleküls enthält. Dieser Vektor kann ein beliebiger prokaryontischer oder eukaryontischer Vektor sein, auf dem sich die erfindungsgemäße DNA-Sequenz vorzugsweise unter Kontrolle eines Expressionssignals (Promotor, Operator, Enhancer etc.) befindet. Beispiele für prokaryontische Vektoren sind chromosomale Vektoren, wie etwa Bakteriophagen (z. B. Bakteriophage X) und extrachromosomale Vektoren, wie etwa Plasmide, wobei zirkuläre Plasmidvektoren besonders bevorzugt sind. Geeignete prokaryontische Vektoren sind z. B. bei Sambrook et al., Supra, Kapitel 1 bis 4, beschrieben.

Andererseits kann der erfindungsgemäße Vektor auch ein eukaryontischer Vektor sein, z. B. ein Hefevektor oder ein für höhere Zellen geeigneter Vektor (z. B. ein Plasmidvektor, viraler Vektor, Pflanzenvektor). Derartige Vektoren sind beispielsweise bei Sambrook et al, Supra, Kapitel 16, beschrieben.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine prokaryontische Zelle, vorzugsweise eine gram-negative prokaryontische Zelle, besonders bevorzugt eine E.coli- Zelle. Andererseits kann die erfindungsgemäße Zelle jedoch auch eine eukaryontische Zelle sein, wie etwa eine Pilzzelle (z. B. Hefe), eine tierische oder eine pflanzliche Zelle.

Die Erfindung betrifft auch ein Polypeptid, welches von einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül codiert ist. Vorzugsweise besitzt das Polypeptid die Fähigkeit zur Adhärenz an humane Zellen und umfaßt (a) die in SEQ ID NO.2 dargestellte Aminosäuresequenz oder (b) eine mit der Sequenz gemäß (a) immunologisch kreuzreagierende Aminosäuresequenz.

Besonders bevorzugt weist das erfindungsgemäße Polypeptid eine Homologie von mindestens 80% und am meisten bevorzugt von mindestens 90% mit der in SEQ ID NO.2 dargestellten Aminosäuresequenz auf.

Die Herstellung von erfindungsgemäßen Polypeptiden erfolgt vorzugsweise dadurch, daß man eine Zelle mit einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül oder Vektor transformiert, die transformierte Zelle unter Bedingungen kultiviert, bei denen eine Expression des Polypeptids stattfindet und das Polypeptid aus der Zelle oder/und aus dem Kulturüberstand isoliert. Dabei kann das erfindungsgemäße Polypeptid sowohl als Fusionspolypeptid als auch als Nicht-Fusionspolypeptid gewonnen werden.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Fusionspolypeptide, die jeweils einen oder mehrere Abschnitte aus den Polypeptiden AlpB (SEQ ID NO.2) und AlpA (SEQ ID NO.4) enthalten. Die Länge dieser Abschnitte beträgt mindestens 6, vorzugsweise mindestens 10 und besonders bevorzugt mindestens 20 Aminosäuren.

Da das AlpB-Protein einen funktionell aktiven Komplex mit dem in DE 195 21 312.2 offenbarten AlpA-Protein bilden kann, betrifft die vorliegende Erfindung auch einen Polypeptidkomplex, der mindestens zwei Polypeptidkomponenten enthält, wobei die erste Komponente codiert ist von der alpB- Sequenz oder einer davon abgeleiteten Sequenz und wobei die zweite Komponente codiert ist von der alpA-Sequenz oder einer davon abgeleiteten Sequenz, insbesondere von einem DNA- Molekül, das

(d) die in SEQ ID NO.3 dargestellte Nucleotidsequenz,
(e) eine der Sequenz gemäß (d) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nucleotidsequenz oder
(f) eine mit den Sequenzen gemäß (d) oder/und (e) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nucleotidsequenz umfaßt.

Vorzugsweise umfaßt das zweite Polypeptid, d. h. AlpA- Komponente des Komplexes, die in SEQ ID NO.4 dargestellte Aminosäuresequenz, eine mit dieser Sequenz mindestens 80% und vorzugsweise mindestens 90% homologe Aminosäuresequenz oder eine mit diesen Sequenzen immunologisch kreuzreagierende Aminosäuresequenz.

Das erfindungsgemäße Polypeptid AlpB oder Teile davon können als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden. Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch einen Antikörper, der gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder einen erfindungsgemäßen Komplex gerichtet ist. Vorzugsweise ist der Antikörper gegen den N-Terminus, z. B. die ersten 340 und insbesondere die 250 Aminosäuren der in SEQ ID NO.2 dargestellten Aminosäuresequenz gerichtet.

Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül, ein erfindungsgemäßes Polypeptid, einen erfindungsgemäßen Polypeptidkomplex oder einen erfindungsgemäßen Antikörper, gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmazeutischen Hilfs-, Verdünnungs-, Zusatz- und Trägermitteln enthält.

Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann einerseits zur Diagnostik einer Helicobacter pylori-Infektion verwendet werden. Die Diagnostik auf Nucleinsäureebene erfolgt vorzugsweise durch Verwendung von Hybridisierungs sonden, welche eine erfindungsgemäße, für das alpB-Gen spezifische DNA-Sequenz enthalten, oder durch Amplifikation unter Verwendung erfindungsgemäßer DNA-Moleküle als Primer. Auf Proteinebene erfolgt die Diagnostik vorzugsweise mit Hilfe der erfindungsgemäßen Antikörper.

Andererseits kann die pharmazeutische Zusammensetzung auch zur Prävention oder Bekämpfung einer Helicobacter pylori- Infektion verwendet werden. Vorzugsweise werden für therapeutische Anwendungen das AlpB-Polypeptid oder Teile davon gegebenenfalls zusammen mit dem AlpA-Polypeptid oder Teilen davon zur Herstellung eines aktiven Impfstoffs oder der Antikörper zur Herstellung eines passiven Impfstoffs verwendet.

Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Beispiele und Abbildungen erläutert werden.

Abb. 1 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pMu140, welches die regulatorische Region und das 5′-Ende des alpA-Gens (SEQ ID NO.3) enthält. Das alpA-Gen wird durch Insertion des Transposons TnMax9 inaktiviert (siehe Dreieck mit Beschriftung TnMax9). Bei Expression des Plasmids wird ein alpA-β-Lactamase-Fusionsprotein erhalten. pMu140 ist der ursprüngliche Klon aus der Mutanten- Genbank, aus dem durch Retransformation und homologe Rekombination der adhärenzdefekte H. pylori-Stamm P1-140 erhalten wurde.

Abb. 2 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pMT5, welches einen Teil des alpA-Gens und das gesamte alpB-Gen (SEQ ID NO.1) enthält. Der Replikations ursprung ori_fd und das Chloramphenicol-Transferase Gen cat_GC aus dem Transposon TnMax9 wurden zur selektiven Rückklonierung des mutierten alpA- Genlocus und der flankierenden alpB-Genregion benutzt. Res bedeutet die Resolution site von TnMax9 und die IR die invertierten Repeats des Transposons. M13-FP und M13-RP1 bedeuten Bereiche, welche die Sequenzen der M13-FORWARD bzw. -REVERSE Sequenzier-Primer enthalten. Die Polylinker-Region zwischen den Klonierungsstellen SacI und StuI stammt aus dem Plasmid pBluescript II KS.

Abb. 3 zeigt einen Aminosäuresequenzvergleich der Adhäsine AlpA und AlpB. (A) Der Sequenzvergleich wurde mit dem GCG-Programm BESTFIT durchgeführt (Devereux et al., 1984) und umfaßt die gesamten Polypeptide AlpA und AlpB. Senkrechte Striche bedeuten identische Aminosäuren; Punkte zeigen konservative Aminosäureaustausche an. Der Grad der Ähnlichkeit bzw. Identität zwischen beiden Sequenzen ist am Ende der Sequenz angegeben. (B) Ein signifikant höherer Identitätsgrad ist in der C-terminalen Region beider Polypeptide festzustellen (Position 341-518), die vermutlich für die Integration der Proteine in die äußere Bakterienmembran verantwortlich ist. Typisch ist auch die C-terminale Region von fünf Aminosäuren, die mit einem Phenylalanin (F) endet, was bei einem sekretierten Protein eines gramnegativen Bakteriums auf eine Insertion in die äußere Membran hinweist (Struyve et al., 1991).

SEQ ID NO.1 zeigt die Nucleotidsequenz des H. pylori- Adhärenzgens alpB und die entsprechende Aminosäuresequenz.

SEQ ID NO.2 zeigt die Aminosäuresequenz des AlpB- Adhärenzpolypeptids aus H. pylori.

SEQ ID NO.3 zeigt die Nucleotidsequenz des H. pylori- Adhärenzgens alpA und die entsprechende Aminosäuresequenz.

SEQ ID NO.4 zeigt die Aminosäuresequenz des AlpA- Adhärenzpolypeptids aus H. pylori.

Beispiel 1 Herstellung einer H. pylori-Plasmid-Genbank

Es wurde eine Plasmidgenbank von der chromosomalen DNA des H. pylori-Wildtyp Stammes 69A angelegt. Dazu wurde die chromosomale DNA nach der Methode von Leying et al. (1992) aus H. pylori isoliert und mit den Restriktionsendonukleasen Sau3AI und HpaII jeweils partiell gespalten. Anschließend wurden die DNA-Fragmente auf einem präparativen Agarosegel aufgetrennt und Fragmente von 3-6 kb wurden aus dem Gel eluiert. Diese DNA-Fragmente wurden in den speziell dafür konstruierten Plasmidvektor pMin2, der mit den Restriktionsenzymen BgIII und ClaI geschnitten war, ligiert (T4-Ligase) und der Ligationsansatz wurde in den E. coli- Stamm E181, ein den lysogenen λ-Phagen λCH616 enthaltendes Derivat des Stammes HB101 (Bayer und Roulland-Dussoix, 1969) transformiert, der bereits mit dem Transposon TnMax9 transformiert war. Dabei wurden ca. 2400 unabhängige Transformanden erhalten.

Der den Minimalvektor pMin2 enthaltende E.coli Stamm DH5α ist bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, unter dem Aktenzeichen 10007 hinterlegt. Der das Transposon-Derivat pTnMax9 enthaltende E.coli Stamm E 181 ist bei DSM unter dem Aktenzeichen 10008 hinterlegt.

Beispiel 2 Isolierung von H. pylori-Mutanten

Zur Durchführung der Transposon-Mutagenese wurden jeweils 10 Transformanden vereinigt und gemeinsam induziert, wodurch insgesamt 190 Pools ä 10-20 Klonen weiterbehandelt wurden. Aus dieser Mutagenese wurden 191 Ampicillin-resistente E. coli-Plasmidklone isoliert, die unabhängige mutierte H. pylori-Gene trugen. Diese 192 Plasmide wurden aus E. coli isoliert und zur Retransformation des H. pylori-Stammes 69A benutzt. Aus diesen 192 Transformationen wurden 135 H. pylori-Mutanten isoliert, die in Genen mutiert sein sollten die für sekretorische Proteine kodieren. Die H. pylori- Mutantenkollektion wurde dann in einem Screening Assay auf H. pylori-Mutanten getestet, die ihre Fähigkeit an KatoIII Epithelzellen zu binden, verloren hatten.

Hierzu wurden die Mutanten mit FITC markiert und 1 h bei 37°C gemeinsam mit den Epithelzellen kultiviert. Der Test auf Adhärenz erfolgte direkt durch Betrachtung mit einem Fluoreszenzmikroskop. Dabei wurden 2 Mutanten gefunden (Nr. P1-140 und P1-179a), die eine stark verminderte Adhärenz zeigten.

Beide Mutanten zeigten auch in dem zweiten Adhärenz-Modell, den Gewebeschnitten von menschlichen Magen, keine Adhärenz. Der H. pylori-Wildtyp-Stamm sowie alle weiteren Mutanten zeigten auch in diesem Modell eine starke Adhärenz.

Das zur Erzeugung des Mutantenstammes P1-140 verwendete Plasmid pMu140 ist in Abb. 1 dargestellt. Zur Erzeugung des Mutantenstammes P1-179a wurde das Plasmid pMu179a (nicht gezeigt) verwendet. Unabhängige Transformationen beider Plasmide in H. pylori 69A führten zu dem identifizierten Adhärenzdefekt, was belegte, daß keine sekundären Mutationen im bakteriellen Chromosom aufgetreten waren, sondern die TnMax9 Insertion im klonierten Adhäsingen zu dem beobachteten Phänotyp der H. pylori-Mutanten führte. Die Kartierung und Sequenzierung der durch das Transposon TnMax9 inaktivierten Gene der Plasmidklone pMu140 und pMu179 zeigte, daß es sich bei beiden Klonen um dasselbe Gen handelte, das Transposon war nur an verschiedenen Stellen insertiert. Da es sich bei dem kodierten Protein um ein Lipoprotein handelt, also ein Protein, das mit einem Lipidanker in der Membran verankert ist, bezeichneten wir das entsprechende Gen als AlpA, adherence-associated lipoprotein A). Unsere Daten aus Computer-Sekundärstrukturvorhersagen von Membranproteinen und von bestimmten konservierten Proteinsequenzen am C-Terminus des Proteins (C-terminales Phenylalanin) (Struyv´ et al., 1991) sprechen für ein in die äußere Membran der gramnega tiven Bakterien eingelagertes integrales Membranprotein.

Beispiel 3 Identifizierung des alpB-Adhärenzgens

Im Zuge der genetischen Charakterisierung des alpA-Genlocus wurden die flankierenden genomischen Sequenzen in E. coli kloniert und sequenziert. Die Klonierung der stromabwärts gelegenen alpA-flankierenden Region erfolgte über die Rückklonierung der TnMax9-Insertion vom Chromosom aus H. pylori. Chromosomale DNA der Mutante P1-179a (siehe Beispiel 2) wurde mit den Restriktionsendonukleasen SacI und StuI geschnitten, die entstandenen DNA-Fragmente zusammen mit einem SacI-HincII-Fragment aus dem Polylinker des Plasmids pBluescript II KS unter Verwendung von T4-Ligase zirkularisiert und in kompetente E. coli E131 Zellen transformiert, wobei eine Selektion auf Chloramphenicol erfolgte.

Alle erhaltenen Transformanten sollten das mutierte alpA-Gen enthalten und flankierende Sequenzen aufweisen, da die Replikation und Propagierung nur über den chromosomal durch TnMax9 inserierten Replikationsursprung ori_fd und durch das auf TnMax9 lokalisierte Chloramphenicol-Resistenzgen erfolgen konnten. Eines der erhaltenen rekombinanten Plasmide pMT5 (Abb. 2) wurde weiter analysiert.

Eine Sequenzierung von pMT5 und davon hergestellten Subklonen zeigt im Anschluß an das alpA-Gen (67 Nucleotide nach Stopcodon) den Start eines weiteren offenen Leserasters, welcher für ein Polypeptid von 518 Aminosäuren codiert und als alpB bezeichnet wurde (SEQ ID NO.1 und 2). Aufgrund der genetischen Organisation kann man von einem Operon ausgehen und vermutlich werden alpA und alpB von einem einzigen Promotor aus transkribiert (polycystronische mRNA).

Das AlpB-Genprodukt weist exakt die gleiche Anzahl an Aminosäuren auf wie AlpA. Eine Analyse der N-terminalen Region der AlpB-Polypeptidsequenz liefert Hinweise auf das Vorhandensein einer klassischen prokaryontischen Signalsequenz, was auf ein sekretorisches Polypeptid hinweist. Ein Vergleich auf Aminosäureebene zwischen AlpA und AlpB zeigt eine Identität über das gesamte Polypeptid von 46%. Der C-terminale Teil (Aminosäuren 341-518) zeigt eine Identität von 66% (Abb. 3).

Beispiel 4 Funktionieller Zusammenhang der Adhärenzgene AlpA und AlpB

Um einen funktionellen Zusammenhang zwischen AlpA und AlpB zu untersuchen, wurden zwei TnMax9 Transposon-Insertionen an verschiedenen Positionen in das alpB-Gen eingeführt (Pos. 97 und Pos. 1108) und durch natürliche Transformation ins Genom von H. pylori 69a transferiert. Die korrekte Insertion des Transposons in das H. pylori Chromosom und damit die Inaktivierung des alpB-Gens wurde durch Southern-Blot- Hybridisierung verifiziert.

Die resultierenden alpB-Defektmutanten wurden auf ihre Fähigkeit zur Bindung an Magenepithellzellen analysiert. Es wurde gefunden, daß beide alpB-Mutanten keine Bindung an Magenepithellzellen aus Gewebeschnitten zeigten.

Die stabile Expression von AlpA in der alpB-Mutante konnte durch einen Immunoblot nachgewiesen werden. Damit ist gezeigt, daß AlpB direkt für den Adhärenzdefekt der alpB- Mutante verantwortlich ist. Aufgrund der Strukturvorhersage und der hohen Homologie im C-terminalen Bereich beider Polypeptide kann man annehmen, daß auch AlpB in die äußere bakterielle Membran insertiert vorliegt und gegebenenfalls mit AlpA einen Komplex bilden kann. Dieser Komplex kann als heterodimeres oder multimeres Aggregat als funktionelles Adhäsin wirksam sein, während der Verlust einer Untereinheit, sei es AlpA oder AlpB, bereits zum Funktionsverlust des Adhäsin-Komplexes und damit ggf. zum Adhärenzdefekt der Bakterien führt.

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Claims

1. DNA-Molekül, dadurch gekennzeichnet, daß es

2. DNA-Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es auf Nucleotidebene eine Homologie von mindestens 80% zu der in SEQ ID NO.1 dargestellten Nucleotidsequenz aufweist.

3. DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Länge von mindestens 15 Nucleotiden aufweist.

4. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es für ein Polypeptid mit der Fähigkeit zur Adhärenz an humane Zellen codiert.

5. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das fusioniert ist mit

(d) der in SEQ ID NO.3 dargestellten Nucleotidsequenz,
(e) einer der Sequenz gemäß (d) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nucleotidsequenz oder
(f) einer mit den Sequenzen gemäß (d) oder/und (e) unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Nucleotidsequenz.

6. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Kopie eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthält.

7. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem Vektor nach Anspruch 6 transformiert ist.

8. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es von einem DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 codiert ist.

9. Polypeptid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es

(a) die in SEQ ID NO.2 dargestellte Aminosäuresequenz,
(b) eine mit der Sequenz aus (a) mindestens 80% homologe Aminosäuresequenz,
(c) eine mit den Sequenzen gemäß (a) oder/und (b) immunologisch kreuzreagierende Aminosäuresequenz umfaßt.

10. Polypeptid nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß es die Fähigkeit zur Adhärenz an humane Zellen besitzt.

11. Polypeptidkomplex, enthaltend mindestens zwei Polypeptidkomponenten, wobei
die erste Komponente codiert ist von einen DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4
und wobei die zweite Komponente codiert ist von einem DNA-Molekül, das

12. Komplex nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Komponente

(a) die in SEQ ID NO.4 dargestellte Aminosäuresequenz,
(b) eine mit der Sequenz (a) mindestens 80% homologe Aminosäuresequenz,
(c) eine mit den Sequenzen gemäß (a) oder/und (b) immunologisch kreuzreagierende Aminosäuresequenz umfaßt.

13. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Zelle mit einem DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder einem Vektor nach Anspruch 6 transformiert, die transformierte Zelle unter Bedingungen kultiviert, bei denen eine Expression des Polypeptids stattfindet und das Polypeptid aus der Zelle oder/und dem Kulturüberstand isoliert.

14. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 8 bis 10 als Immunogen zur Erzeugung von Antikörpern.

15. Antikörper gegen ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 8 bis 10 oder einen Komplex nach Anspruch 11 oder 12.

16. Antikörper nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen den N-Terminus der in SEQ ID NO.2 dargestellten Aminosäuresequenz gerichtet ist.

17. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 8 bis 10, einen Polypeptidkomplex nach Anspruch 11 oder 12, oder einen Antikörper nach Anspruch 15 oder 16, gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmazeutischen Hilfs-, Verdünnungs-, Zusatz- und Trägermitteln enthält.

18. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 17 zur Diagnostik einer Helicobacter pylori- Infektion.

19. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 17 zur Herstellung eines Mittels für die Prävention oder Bekämpfung einer Helicobacter pylori- Infektion.