KR19990023764A - 디-소르비톨 데하이드로제나제 유전자 - Google Patents

디-소르비톨 데하이드로제나제 유전자 Download PDF

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KR19990023764A
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세쓰코 오지마
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다로 미야자키
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프리돌린 클라우스너, 롤란드 비. 보레르
에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 (a) 서열번호 2로 기술되는 서열의 1번부터 716번까지의 아미노산 서열을 갖는 단백질; 또는 (b) (a)에서 정의된 아미노산 서열내에서 하나 이상의 아미노산을 치환하거나 제거하거나 삽입하거나 첨가함으로써 단백질 (a)로부터 유도된 단백질로 정의되고 소르비톨 데하이드로제나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA, 이러한 DNA를 포함하는 벡터, 이러한 벡터에 의해 형질전환된 숙주, 이러한 단백질의 제조 방법 및 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

디-소르비톨 데하이드로제나제 유전자
본 발명은 글루코노박터(Gluconobacter) 속 및 아세토박터(Acetobacter) 속을 포함하는 아세트산 박테리아에 속하는 미생물의 소르비톨 데하이드로제나제를 암호화하는 신규한 DNA, 이 DNA를 포함하는 발현 벡터 및 이 발현 벡터를 포함하는 재조합 미생물에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 재조합 D-소르비톨 데하이드로제나제의 제조 방법 및 이 발현 벡터를 포함하는 재조합 효소 또는 재조합 생물을 사용함에 의한 L-소르보스의 제조 방법에 관한 것이다.
L-소르보스는 주로 라이쉬스타인법(Reichstein method)에 의해 수행되는 비타민 C 제조의 실제 산업 공정에서 중요한 중간체이다(문헌[Helvetica chimica Acta, 17:311, 1934]참고). 이 공정에서, 유일한 미생물에 의한 전환은 글루코노박터 또는 아세토박터 균주에 의한 D-소르비톨로부터의 L-소르보스의 제조이다. 이 전환은 NAD/NADP-비의존성 D-소르비톨 데하이드로제나제(SLDH)에 의해 수행되는 것으로 생각된다. 또한, L-소르보스는 비타민 C의 제조에 있어서 유용한 중간체인 2-케토-L-글론산의 미생물학적 제조를 위해 당 분야에서 공지된 기질이다.
D-소르비톨의 L-소르보스로의 산화를 촉매작용하는 NAD/NADP-비의존성 D-소르비톨 데하이드로제나제가 있음이 공지되어 있다. 이 D-소르비톨 데하이드로제나제를 글루코노박터 서브옥시단스(Gluconobacter suboxydans) 변이체 알파 IFO 3254로부터 분리하여 특성을 규명하였으며(시나가와(E. Shinagawa) 등의 문헌[Agric. Biol. Chem., 46: 135-141, 1982] 참고), 이는 분자량이 63 kDa, 51 kDa 및 17 kDa인 3종의 기본단위(subunit)로 구성되어 있으며, 그 중 가장 큰 기본단위가 보조 인자로 FAD를 포함하는 데하이드로제나제이고 두번째가 사이토크롬 c이고 가장 작은 기본단위가 비공지된 기능을 갖는 단백질이며, 이들의 최적 pH는 4.5임을 밝혀졌다. 이러한 SLDH를 또한 지. 서브옥시단스(G. suboxydans) ATCC 621(KCTC 2111)로부터 정제하여 특성을 규명하였으며(초이(E-S Choi) 등의 문헌[FEMS Microbiol. Lett. 125:45-50, 1995] 참고), 이는 분자량이 75 kDa, 50 kDa 및 14 kDa인 3종의 기본단위로 구성되고, 그 중 가장 큰 기본단위가 보조 인자로 피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ)를 함유하는 데하이드로제나제이고, 두번째가 사이토크롬 c이고, 가장 작은 기본단위가 비공지된 기능을 갖는 단백질임이 밝혀졌다. 또한, 본 발명의 발명자는 NAD/NADP-비의존성 SLDH를 지. 서브옥시단스 IFO 3255로부터 정제하여 특성을 규명하였으며(호시노(T. Hoshino) 등의 유럽 특허 제 728840 호 참고); SLDH는 분자량이 79.0±0.5 kDa인 한 종류의 기본단위로 구성되고 최적 pH는 6 내지 7이고 D-소르비톨 뿐만 아니라 만니톨 및 글리세롤에서도 데하이드로제나제 활성을 나타낸다.
다수의 SLDH가 정제되었음에도 불구하고, 이들의 유전자는 아직 클로닝되어있지 않다. SLDH 효소의 효율적인 제조 및 L-소르보스의 제조수율을 개선시키는 개선된 SLDH 활성을 갖는 재조합 생물의 조립을 위해 SLDH 유전자를 클로닝하는 것은 유용하다. D-소르비톨로부터 2-케토-L-글론산을 직접적으로 제조하는 재조합 미생물을 조립하기 위해, L-소르보스를 2-케토-L-글론산으로 전환시키는 목적하는 생물체(예: 글루코노박터)에 상기 SLDH 유전자를 삽입하는 것 또한 유용하다.
본 발명은 글루코노박터 속 및 아세토박터 속을 포함하는 아세트산 박테리아에 속하는 미생물을 기원으로 하는 D-소르비톨 데하이드로제나제(SLDH)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(유전자); 이 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자 뿐만 아니라 생체내에서 SLDH를 활성화시키는 작용을 하는 단백질의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 또는 이들 DNA의 조합체; SLDH 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 또는 DNA의 상기 조합체를 포함하는 발현 벡터; 발현 벡터를 갖는 재조합 생물; 재조합 SLDH의 제조 방법 및 재조합 SLDH 또는 재조합 생물을 사용함에 의한 L-소르보스의 제조 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 작용성 유도체를 제공하고자 한다. 이러한 기능적 유도체란, 본 발명의 아미노산 서열을 기본으로 이러한 서열에 1종 이상의 아미노산 잔기가 첨가, 삽입, 제거 및/또는 치환된, 당 분야에 공지된 분석법 또는 본원에서 구체적으로 설명한 분석법에 의해 측정된 SLDH 활성을 갖는 유도체로 정의된다. 이러한 기능적 유도체는 당 분야의 공지된 방법 및 예를 들면 샘브룩(Sambrook) 등에 의해 기술되고 있는 방법(문헌[Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989] 참고)에 의해 당 분야에 공지된 화학적인 펩타이드 합성법 또는 DNA 서열을 기본으로 재조합 방법으로 제조될 수 있다. 분자의 활성을 일반적으로 변화시키지 않으면서, 단백질 및 펩타이드내에서 아미노산을 교환하는 것은 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들면 뉴라트(H. Neurath) 및 힐(R. L. Hill) 등의 문헌[The Proteins, Academic Press, New York, 1979, 특히 14 페이지의 도 6 참고]에 기술되어 있다. 가장 일반적으로 일어나는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 뿐만 아니라 그의 역방향으로의 교환이다.
추가로, 본 발명은 SLDH 활성을 갖는 폴리펩타이드 및 예를 들어 서열번호 2 및 서열번호 3과 같은 서열 목록에서 개시된, 생체내에서 SLDH를 활성화하는 작용을 하는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열 및 그들의 상보 쇄, 또는 이들 서열, 표준 조건하에서 DNA 서열 또는 그의 단편과 하이브리드화하는 DNA 서열 및 유전자 암호의 변질로 인하여 표준 조건하에서는 DNA 서열과 하이브리드화되지 않지만 정확히 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에 관한 것이다.
하이브리드화를 위한 표준 조건이란, 본 발명에서 특정 하이브리드화 신호의 존재를 발견하기 위해 당 분야의 숙련자들이 일반적으로 사용하며, 예를 들어 문헌[Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989]에서 인용되고 있는 조건이나, 바람직하게는 당 분야의 숙련자들에게 익숙하며, 예를 들면 샘브룩 등의 상기 문헌에서 기술한 바와 같은 소위 엄격한 하이브리드화 조건 및 엄격한 세척 조건을 의미한다.
도 1은 D-소르비톨 데하이드로제나제(SLDH)의 폴리펩타이드 및 올리고뉴클레오타이드의 부분 아미노산 서열을 설명한다. 도면내의 두꺼운 글씨체의 아미노산 서열은 PCR(폴리머라제 연쇄 반응)을 위한 두 올리고뉴클레오타이드 서열(s7 및 s6R)의 합성에서 사용된다. 화살표는 DNA 합성 방향을 나타낸다. 모든 프라이머는 글루코노박터 코돈(codon) 사용에 있어서 바이어스(bias)를 갖는 변질된 DNA 혼합물이다.
도 2는 본 발명에서 클로닝된 SLDH 유전자의 제한 지도로서 SLDH 및 ORF2를 암호화하는 DNA 영역의 유전자 구조를 설명한다.
도 3a 내지 3d는 업스트림과 다운스트림 서열을 갖는 SLDH 및 ORF2를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, SLDH 및 ORF2의 추정 아미노산 서열, SLDH 및 ORF2 유전자의 추정 리보좀 결합 부위(SD 서열), 및 가능한 전사 종결인자 서열을 설명한다.
도 4는 lac 프로모터의 조절하에서 이. 콜라이(E. coli)에서 SLDH 및/또는 ORF2 유전자의 발현을 위한 플라스미드 pTNB114, pTNB115 및 pTNB116의 조립 단계를 설명한다.
도 5는 일반 pA 프로모터의 조절하에서 ORF2 및 SLDH를 포함하는 플라스미드 pTNB110(실시예 6에서 기술함)을 조립하는 단계, 및 업스트림의 유전자에 인접하게 위치한 pA의 조절을 받는 ORF2 유전자 및 업스트림의 SLDH 유전자에 인접하게 위치한 또다른 pA 프로모터의 조절을 받는 SLDH 유전자를 포함하는 플라스미드 pTNB 143의 조립 단계를 설명한다.
본 발명자들은 DNA 재조합 기법으로 생체내에서 SLDH 활성을 발생시키는 작용을 하는 유전자와 함께 SLDH 유전자를 분리하여, 뉴클레오타이드 서열을 결정하였다.
본 발명은 글루코노박터 SLDH를 암호화하는 DNA 서열 및 이하에서 ORF2 유전자로 지칭되는, 생체내에서 SLDH 활성을 발생시키는 작용을 하는 유전자, SLDH DNA를 포함하는 발현 벡터 및 이 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
간략하게 말하자면, 본 발명에서 사용되는 SLDH 및/또는 ORF2 유전자, 이 유전자를 함유하는 DNA 분자, 재조합 발현 벡터 및 재조합 생물을 하기 단계 (1) 내지 (4)에 의해 수득할 수 있다:
(1) D-소르비톨을 L-소르보스로 전환시키는 SLDH 활성을 제공할 수 있는 미생물로부터 염색체 DNA를 분리하고 적당한 숙주 세포(예: 이. 콜라이)에서 염색체의 DNA로 유전자 라이브러리(gene library)를 조립하는 단계;
(2) 콜로니-하이브리드화(colony-hybridization), 플라크-하이브리드화(plaque- hybridization), 서던-하이브리드화(Southern-hybridization), PCR 클로닝 또는 웨스턴-블롯 분석(Western-blot analysis) 등으로 염색체 DNA로부터 SLDH 및/또는 ORF2 유전자를 클로닝하는 단계;
(3) 종래의 방법에 따라 수득된 SLDH 및/또는 ORF2 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하여 상기 SLDH 및/또는 ORF2 유전자를 함유하는 DNA 분자를 선택하고, SLDH 및/또는 ORF2 유전자를 효과적으로 발현시킬 수 있는 재조합 발현 벡터를 형성하는 단계; 및
(4) 숙주 세포에 DNA를 도입시키기 위한 적당한 방법(예: 형질전환, 형질도입, 형질접합 및/또는 전기천공)에 의해 SLDH 및/또는 ORF2를 갖는 재조합 생물을 형성하는 단계.
본 발명의 양상에서 사용되는 물질 및 기법은 하기에서 보다 자세하게 예시하였다.
전체 염색체 DNA는 당 분야에 공지된 방법에 따라 정제할 수 있다. 목적하는 유전자는 전형적으로 하기 설명 방법 (i) 내지 (iv)에 의해 전체 염색체 DNA로부터 플라스미드 또는 파아지 벡터내에서 클로닝할 수 있다:
(i) 부분 아미노산 서열은 정제된 단백질 또는 이들의 펩타이드 단편으로부터 결정된다. 이러한 전체 단백질 또는 펩타이드 단편은 전체 단백질을 분리하거나 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 후에 겔로부터 펩티다제-처리함으로써 준비될 수 있다. 이렇게 수득된 단백질 또는 이들의 단편은 단백질 서열순서 분석기(예: 응용 바이오시스템즈 자동 기상 서열 분석기(Applied Biosystems automatic gas-phase sequencer) 470A)에 적용된다. 아미노산 서열은 DNA 합성기(예: 응용 바이오시스템즈 자동 DNA 서열순서 분석기 381A)로 올리고뉴클레오타이드 프로브(probe) 및/또는 프라이머를 디자인하고 제조하는데 사용될 수 있다. 상기 프로브는 서던-하이브리드화, 콜로니-하이브리드화 또는 플라크-하이브리드화로 목적하는 유전자를 포함하는 균주의 유전자 라이브러리로부터 목적하는 유전자를 포함하는 클론을 분리하는데 사용할 수 있다.
(ii) 선택적으로, 유전자 라이브러리로부터 목적하는 단백질을 발현하는 클론을 선택하기 위해서, 목적하는 단백질에 대항하는 제조된 항체를 사용하는 면역법을 적용할 수 있다.
(iii) 목적하는 유전자의 DNA 단편은 일련의 프라이머(즉, 상기에서 결정된 바와 같은 아미노산 서열에 따라 합성된 2개의 올리고뉴클레오타이드)로 PCR 방법에 의해 전체 염색체 DNA로부터 증폭될 수 있다. 그 다음, 목적하는 전체 유전자를 포함하는 클론은, 예를 들어 이. 콜라이에서 조립된 유전자 라이브러리로부터 서던-하이브리드화, 콜로니-하이브리드화 또는 플라크-하이브리드화에 의해 프로브로서 상기에서 수득된 PCR생성물과 함께 분리될 수 있다.
(iv) 클로닝의 추가의 선택적인 방법은, 화학적인 변이유발에 의한 종래의 변이화 또는 예를 들어 목적하는 유전자를 분열시키는 트란스포손(transposon) Tn5와의 재조합 DNA 기법에 의해 조립된 SLDH-결핍 균주를 보완하는 클론을 스크리닝(screening)하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 당 분야에 공지된 방법에 의해 상기 기술한 DNA 서열을 기본으로 디자인된 프라이머를 사용함으로써 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 제조될 수 있는 DNA 서열이다. 본 발명의 DNA 서열은, 예를 들어 유럽 특허 제 747 483 호에서 기술한 바와 같이 합성적으로 제조될 수 있음이 이해될 것이다.
전술한 항체는 문헌[Methods in Enzymology, vol. 73, p 46, 1981]에서 기술한 방법에 따라 항원으로서 정제된 SLDH 단백질 또는 그의 펩타이드 단편으로 제조될 수 있다.
목적하는 유전자를 포함하는 클론이 수득되면, 목적한 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 M13 파아지로 디데옥시 쇄 종결 방법과 같은 공지된 방법으로 결정될 수 있다(생거(Sanger F.) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467, 1977] 참고).
본 발명의 D-소르비톨 데하이드로제나제 활성을 발현시키는 목적하는 유전자는 도 2 및 도 3에서 설명한다. 이러한 특정 유전자는 24개의 아미노산 잔기의 신호 펩타이드와 함께 716개의 아미노산 잔기를 갖는 SLDH 효소를 암호화한다. 본 발명의 발명자는 상기 SLDH 구조 유전자의 업스트림에서 개방 해독 프레임(open reading frame)을 발견하였고, 이것을 ORF2로 명명하였다. 이 ORF2 유전자는, 특히 SLDH가 아세트산 박테리아로부터의 상이한 속의 숙주 세포에서 발현되는 경우, 126개의 아미노산 잔기를 갖는 단백질을 암호화하고 목적하는 효소성 활성을 본 발명의 재조합 SLDH에 제공하는 기능이 있는 것으로 제안되었다.
글루코노박터 속 및 아세토박터 속을 포함하는 아세트산 박테리아로부터 분리된 목적한 유전자/뉴클레오타이드 서열을 효율적으로 발현시키기 위해서, 다양한 프로모터가 사용되며, 예를 들자면 유전자의 본래 프로모터; 항생물질 내성 유전자(예: Tn5인 카나마이신(kanamycin) 내성 유전자, 버그(D.E.Berg 및 C.M.Berg)의 문헌[Bio/Technology 1:417-435, 1983] 참고), pBR322인 암피실린 내성 유전자 및 이. 콜라이(lac)의 β-갈락톡시다제의 프로모터; trp-, tac-, trc-프로모터; 람다 파아지(lambda phage)의 프로모터 및 숙주 생물에서 작용할 수 있는 임의의 프로모터를 들 수 있다. 이러한 목적을 위해서, 숙주 생물은 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 퓨티다(Pseudomonas putida), 아세토박터 크실리늄(Acetobacter xylinum), 아세토박터 파스테리아누스(Acetobacter pasteurianus), 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti), 아세토박터 한세니(Acetobacter hansenii) 및 글루코노박터 알비두스(Gluconobacter albidus), 글루코노박터 캡슐라투스(Gluconobacter capsulatus), 글루코노박터 세리누스(Gluconobacter cerinus), 글루코노박터 디옥시아세토니쿠스(Gluconobacter dioxyacetonicus), 글루코노박터 글루코니쿠스(Gluconobacter gluconicus), 글루코노박터 인더스트리우스(Gluconobacter industrius), 글루코노박터 멜라노지누스(Gluconobacter melanogenus), 글루코노박터 난옥시글루코니쿠스(Gluconobacter nonoxygluconicus), 글루코노박터 옥시단스(예: 글루코노박터 옥시단스DSM4025; 독일 BRD 브라운쉬바이히 소재의 도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 부다페스트 조약의 조건하에서 1987년 3월 17일자로DSM4025로서 기탁됨), 글루코노박터 옥시단스 아종 스파에리쿠스(Gluconobacter oxydans subsp. sphaericus), 글루코노박터 로시우스(Gluconobacter roseus), 글로코노박터 루비지노수스(Gluconobacter rubiginosus), 글루코노박터 서브옥시단스와 같은 박테리아를 포함하는 미생물, 포유동물 세포 및 식물 세포로부터 선택될 수 있다.
발현을 위해, 다른 규칙적인 요소(예: 샤인-달가노(Shine-Dalgarno; SD) 서열, 예를 들면, 숙주 세포내에서 작동가능한 천연 서열 및 합성 서열을 포함하는 AGGAGG 등) 및 암호화 서열이 도입될 수 있는 숙주 세포내에서 작동가능한 전사종결인자(숙주 세포내에서 작용가능한 임의의 천연 및 합성 서열을 포함하는 반전 반복부 구조)가 전술한 프로모터와 함께 사용될 수 있다.
막에 연결된 폴리펩타이드, 즉 본 발명의 SLDH 단백질의 발현을 위해, 일반적으로 15 내지 50개의 아미노산 잔기를 포함하고 바람직하게는 전체적으로 소수성인 신호 펩타이드가 관련된다. 신호 펩타이드를 암호화하는 DNA는 바람직한 숙주 세포내에서 작동가능한 임의의 천연 및 합성 서열로부터 선택될 수 있다.
폭넓은 숙주/클로닝 벡터 조합체가 이중 나선 DNA를 클로닝하는데 사용될 수도 있다. 일반적으로 클로닝 벡터는 복제의 근원, 규칙적인 요소, 다수-클로닝 부위를 포함하는 클로닝 부위 및 암피실린, 테트라사이클린, 카나마이신, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 스페티오마이신 등에 대한 내성 유전자를 포함하는 항체 내성 유전자와 같은 선택 표시물을 포함하는 플라스미드 또는 파아지이다.
이. 콜라이내에서의 본 발명의 유전자의 발현을 위한 바람직한 벡터는 이. 콜라이에서 일반적으로 사용되는 임의의 벡터, 예를 들면 pBR322 또는 pUC18와 p블루스크립트(Bluescript) II를 포함하는 그의 유도체(문헌[Stratagene Cloning Systems, CA, USA] 참고), pACYC177 및 pACTC184(문헌[J. Bacteriol., 134: 1141-1156, 1978] 참고)와 이들의 유도체, 및 광범위한 숙주 영역의 플라스미드로부터 유도된 벡터(예: RK2(토마스(C. M. Thomas)의 문헌[Plasmid 5: 10, 1981] 참고) 및 RSF1010(게리(P. Guerry) 등의 문헌[Bacteriol. 117: 619-630, 1974] 참고))로부터 선택된다. 글루코노박터, 아세토박터 및 피. 퓨티다를 포함하는 박테리아에서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 위한 바람직한 벡터는 글루코노박터, 아세토박터 및/또는 피. 퓨티다 뿐만 아니라 이. 콜라이와 같은 바람직한 클로닝 생물체내에서 복제될 수 있는 임의의 벡터중에서 선택된다. 바람직한 벡터는 pVK100(나프(V.C.Knauf) 등의 문헌[Plasmid 8: 45-54, 1982] 참고)와 그의 유도체 및 RSF1010의 코스미드 벡터와 같은 광범위한 숙주 영역의 벡터를 들 수 있다. 벡터의 복제수 및 안정성은 클로닝된 유전자의 안정하고 효율적인 발현 및 클로닝된 유전자를 포함하는 숙주 세포의 효율적인 배양을 위해 조심스럽게 고려되어야 한다. 전위가능한 요소(예: Tn5)를 함유하는 DNA 분자는 목적하는 유전자를 바람직한 숙주, 특히 염색체 상으로 도입시키기 위한 벡터로서 사용될 수도 있다. 본 발명의 유전자와 함께 바람직한 숙주로부터 분리된 임의의 DNA를 함유하는 DNA 분자는 또한 이러한 유전자를 바람직한 숙주, 특히 염색체에 도입시키는데 유용하다. 이러한 DNA 분자는 숙주 및 DNA 분자의 특성을 고려하여 당 분야의 숙련자들에게 공지된 임의의 종래의 방법(예: 형질전환, 형질도입, 형질접합 및/또는 전기천공)을 적용함으로써 바람직한 숙주로 이동될 수 있다.
유용한 숙주로는 미생물, 포유동물 세포 및 식물 세포 등을 들 수도 있다. 바람직한 미생물로서는, 전술한 바와 같은 이. 콜라이, 피. 퓨티다, 에이. 크실리늄, 에이. 파스테리아누스, 에이. 아세티, 에이. 한세니, 글루코노박터 알비두스, 글루코노박터 캡슐라투스, 글루코노박터 세리누스, 글루코노박터 디옥시아세토니쿠스, 글루코노박터 글루코니쿠스, 글루코노박터 인더스트리우스, 글루코노박터 멜라노지누스, 글루코노박터 난옥시글루코니쿠스, 글루코노박터 옥시단스, 글루코노박터 옥시단스 아종 스파에리쿠스, 글루코노박터 로시우스, 글루코노박터 루비지노수스, 글루코노박터 서브옥시단스와 같은 박테리아 및 재조합 SLDH 및/또는 ORF2 유전자를 발현할 수 있는 임의의 박테리아를 들 수 있다. 상기 미생물의 작용성 동일물, 계대 배양물, 돌연변이체 및 변종 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 바람직한 균주는 이. 콜라이 K12 또는 그의 유도체, 피. 퓨티다, 글루코노박터 또는 아세토박터 균주이다.
본 발명에서 제공하는 SLDH 및/또는 ORF2 유전자/뉴클레오타이드 서열은 프로모터, 리보좀의 결합 부위 및 전술한 숙주 세포에서 작용가능한 전사성 종결인자와 같은 규칙적인 영역을 함유하는 적당한 벡터에 당 분야에 공지된 방법으로 결찰되어 발현 벡터를 제조한다. SLDH 및 ORF2 유전자가 조합체내에서 클로닝되는 경우, 두개의 유전자는 동일한 플라스미드 및 염색체 DNA상에서 일렬이 되도록 또는 분리되도록 클로닝될 수 있다. 도 4 및 도 5는 플라스미드상에서 SLDH 및 ORF2의 조합된 클로닝의 형태를 예시한다. 플라스미드상에서 하나의 유전자를 클로닝하고 다른 유전자는 염색체 DNA상에서 클로닝할 수도 있다.
재조합 발현 벡터를 포함하는 재조합 미생물을 조립하기 위해서, 형질전환, 형질도입, 접합교배(필립(Philipp Gerhardt) 등의 문헌[Methods for general and molecular bacteriology의 14장과 15장, American Society for Microbiology, 1994] 참고) 및 전기천공을 포함하는 다양한 유전자 이동 방법을 사용할 수 있다. 재조합 생물의 조립을 위한 방법은 분자 생물학 분야에 공지되어 있는 방법으로부터 선택될 수도 있다. 유용한 형질전환 시스템은 이. 콜라이, 슈도모나스, 글루코노박터 및 아세토박터에서 사용될 수 있다. 형질도입 시스템 또한 이. 콜라이에서 사용할 수 있다. 접합교배 시스템은 그램-양성 및 그램-음성 박테리아(예: 이. 콜라이, 피. 퓨티다 및 글루코노박터)에서 폭넓게 사용될 수 있다. 바람직한 접합교배는 국제특허 공개공보 제 WO 89/06688 호에 기술되어 있다. 접합은 액체 배지 고체 표면에서 일어날 수 있다. SLDH 및/또는 ORF2 제조를 위한 바람직한 수용체는 이. 콜라이, 피. 퓨티다, 글루코노박터 및 아세토박터에서 선택된다. 접합교배용 수용체에 선택적인 표지물을 일반적으로 첨가하며, 예를 들어 날리딕산 또는 리팜피신에 대한 내성체가 일반적으로 선택된다. 천연 내성체 또한 사용할 수도 있으며, 예를 들면 폴리믹신 B(polymyxin B)에 대한 내성체가 다수의 글루코노박터에서 유용하다.
본 발명은 재조합 SLDH를 제공한다. 본 발명에서 제공하는 SLDH 유전자를 글루코노박터 속 및 아세토박터 속을 포함하는 아세트산 박테리아를 포함하는 생물에 도입시킴으로써 SLDH 효소의 제조 수율이 증가될 수 있다. 본 발명의 ORF2 유전자와 함께 조합하여 본 발명의 SLDH 유전자를 사용하면 글루코노박터 외의 미생물에서 활성 SLDH가 제조될 수 있다. 재조합 SLDH는 고상 효소 반응을 위해 고체 담체상에 고정될 수도 있다. 또한, 본 발명은 재조합 생물을 제공한다. 재조합 생물체에 의해 D-소르비톨로부터 L-소르보스를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 ORF2 유전자와 조합된 SLDH 유전자를 도입시킴으로써 아세트산 박테리아 이외의 숙주 생물에서 D-소르비톨로부터 L-소르보스를 제조할 수 있다.
실시예
실시예 1. SLDH의 아미노산 서열의 결정
(1) 라이실엔도펩티다제-처리된 SLDH 폴리펩타이드의 N-말단 아미노산 서열의 분석
SLDH 단백질로부터 준비된 펩타이드 제 1 호, 제 3 호 및 제 8호의 부분 아미노산 서열을 결정하였다(도 1의 서열번호 4번부터 6번까지). 지. 서브옥시단스 IFO 3255(호시노(T. Hoshino) 등의 유럽 특허 제 728840 호)의 정제된 SLDH는 라이실엔도펩티다제(100 mM의 트리스-HCl 완충액내에 1.2 mM의 라이실엔도펩티다제 및 3nmol의 SLDH 단백질을 함유하는 반응 혼합물(25㎖), pH 9.0)로 소화시키고 반응은 15시간 동안 37℃동안 수행되었다. 생성된 펩타이드 단편은 1.0㎖/분의 유속으로 0.1%의 TFA내 아세토니트릴/이소프로판올의 구배를 주어 HPLC(컬럼: 프로테인(protein) C-4, 미국 캘리포니아주 소재의 VYDAC)로 분리하였다. 펩타이드가 용리되는 것은 214㎚에서 UV 흡광도로 관찰하였고, 피크를 나타내는 분획을 수동적으로 수집한 후, 아미노산 서열 분석기(응융 바이오시스템스 모델 470A, 미국 코넥컷트주 소재의 더 퍼킨엘머 코포레이션(The Perkin Elmer Corp.))로 N-말단 아미노산 서열 분석에 적용시켰다.
실시예 2. PCR에 의한 부분 SLDH 유전자의 클로닝
지. 서브옥시단스 IFO 3255의 염색체 DNA로 PCR 및 도 1에서 제시하고 있는 서열인 변질된 올리고뉴클레오타이드 DNA 프라이머, s7 및 s6R로 PCR를 수행하였다. 열 순환기(지모리엑터(ZYMOREACTOR) II AB-1820, 일본 도쿄 소재의 아토(Atto))를 사용하여 열안정성 폴리머라제 암프리타크(Amplitaque)(퍼킨-엘머(Perkin-Elmer), 미국 뉴저지주 소재의 롯슈 몰레큘러 시스템즈 인코포레이티드(Roche Molecular Systems Inc.))로 PCR 증폭 반응을 수행하였다. 공급자로부터 제공되는 완충액내 200μM의 dNTP, 10 내지 20 pmol의 각각의 프라이머(54∼288 디제너러시(degeneracy)), 6 ng의 지. 서브옥시단스 IFO 3255 염색체 DNA 및 DNA 폴리머라제 0.5 단위를 함유하는 반응 혼합물(50㎕)을 PCR를 위해 사용하였다. 반응은 (1) 1분 동안 94℃에서의 변성 단계; (2) 1분 동안 48℃에서의 어닐링(annealing) 단계; (3) 2분 동안 72℃에서의 합성 단계의 30회 순환으로 구성된다. 결론적으로, 1.6 kb DNA가 증폭되고, 증폭된 DNA 단편의 직접 결찰을 위한 3O-ddT-꼬리가 있는 말단을 갖는 이. 콜라이 벡터, pUC57/T(리투아니아 빌니우스 소재의 MBI 페르멘타스(Fermentas))내에서 클로닝되어 재조합 플라스미드 pMT20을 수득하였다. 클로닝된 DNA는 디데옥시-쇄 종결의 방법에 의해 서열화된 뉴클레오타이드에 적용되었고(상거(F. Sanger) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467, 1977] 참고) 1.6kb 단편은 펩타이드 제 3 호 및 제 8 호를 암호화하였다.
실시예 3. SLDH 유전자의 클로닝의 완료
(1) 지. 서브옥시단스 IFO 3255의 유전자 라이브러리의 조립
지. 서브옥시단스 IFO 3255의 염색체 DNA를 2일 동안 MB 한천 플레이트에서 성장한 세포로부터 준비하였다. 염색체 DNA(160㎍)을 500㎕의 반응 혼합물내EcoRI 20 단위로 부분적으로 소화시켰다. 샘플의 분획을 5, 10, 15, 30 및 60분에 취하여, 소화된 정도를 아가로스(agarose) 겔 전기영동으로 검사하였다. 부분적으로 소화된 DNA 단편을 함유하는 전반 4개의 분획을 모아 예비 겔 전기영동(아가로스: 0.6%)에 적용시켰다. 15 내지 35 kb의 단편을 절단하고 겔로부터 전기용리시켰다. 용리액을 여과하고 아세트산 나트륨 및 에탄올로 -80℃에서 침전시켰다. DNA 단편을 원심분리기로 분리하고, 1mM EDTA를 함유하는 pH 8.0의 10 mM 트리스-HCl 완충액 200㎕에 현탁시켰다.
동시에, 1.8㎍의 코스미드 벡터 pVK100은EcoRI로 완전히 소화시키고 송아지 장 알카리 포스파타제로 처리하였다. 공급자가 제공한 조건하에서 20개의 개별적인 관내 결찰 키트(일본 교토 소재의 다카라 스조(Takara Shuzo))로, 선형화시키고 탈인산화시킨 pVK100을 지. 서브옥시단스 IFO 3255의 염색체 DNA의 15 내지 35 kbEcoRI 단편(5㎍)과 결찰시켜 매우 중합화된 DNA를 수득하였다. 그 다음, 결찰된 DNA를 공급자(일본 소재의 아메르샴(Amersham))에 의해 기술된 방법에 따라 시험관내 팩키지(packaging)를 위해 사용하였다. 유전자 라이브러리를 위한 숙주인 이. 콜라이 ED8767를 감염시키기 위하여 생성된 파아지 입자를 사용하였다. 결과적으로 4,271개의 콜로니가 수득되었고, 시험을 한 모든 콜로니(20개의 콜로니)는 평균 크기가 약 25kb인 삽입 DNA를 포함하였다.
(2) 완전한 SLDH 유전자를 수득하기 위한 콜로니의 하이브리드화
pMT20의32P-표시된 1.6kb DNA로의 콜로니-하이브리드화 방법에 의해 완전한 SLDH 유전자를 포함하는 클론을 분리하기 위해서 전술한 코스미드 라이브러리를 스크리닝하였다. pVK100 벡터내 약 25 kb의 삽입물을 포함하는 하나의 클론을 분리하여, pSLII로 표시하였다. pSLII로부터 6.2 kb의PstI 단편을 분리하고 pUC18에 클로닝시켜 플라스미드 pUSLIIP를 수득하였다. ORF2 및 SLDH 유전자를 함유하는 6.2 kbPstI 단편을 pUSLIIP로부터 분리시키고, pCRII 벡터(미국 캘리포니아주 소재의 인비트로진 코포레이션(Invitrogen Corporation))에 서브클로닝시켜 pCRSLIIP를 생산하였다. 생성된 플라스미드로부터, 6.2 kbPstI 단편을 함유하는 DNA 단편을HindIII-Xhp I 단편으로서 분리시키고 pVK100의HindIII과 Xho I 부위 사이에 클로닝시켜 pVKSLIIP를 수득하였다.
(3) 이. 콜라이내 SLDH 유전자의 발현
6.2 kb의PstI-단편이 목적하는 SLDH를 암호화하는지를 확인하기 위해서, pUSLIIP를 포함하는 이. 콜라이 JM109의 세포를 전술한 바와 같은 항-SLDH 항체와 함께 웨스턴-블롯 분석에 적용시켰다. 분자량이 약 80 kDa인 면역-양성 단백질이 형질전환체에서 관찰되었고,PstI-단편이 본래 SLDH의 분자량(79 kDa±0.5kDa)을 갖는 폴리펩타이드를 암호화함을 알아내었다.
(4) SLDH-활성 보완을 위한 시험 균주로서의 SLDH-결핍 글루코노박터, 균주 26A11의 조립
모체로서 지. 멜라노지누스(G. melanogenus) IFO 3293으로 트랜스포손 Tn5 변이유발을 수행하였다. Tn5인 Kmr을 암호화하는 전위가능한 요소는 그의 숙주 생물체에서 불규칙적으로 효력이 없는 돌연변이를 일으키기 때문에 그램-음성 박테리아에서 변이원으로써 폭넓게 사용된다. IFO 3293은 (i) D-소르비톨로부터 L-소르보스를 생성하고, (ii) 지. 서브옥시단스 IFO 3255로부터 정제된 SLDH에 대해 준비된 항체로 웨스턴 블롯 분석한 결과 약 80kDa의 면역성-양성의 폴리펩타이드를 나타내고, (iii) Tn5 변이체를 발생시키는 빈도수는 지. 서브옥시단스 IFO 3255의 경우보다 보다 높다는 이유로 모체로서 선택되었다.
지. 멜라노지누스 IFO 3293은 25g/ℓ의 만니톨, 5g/ℓ의 효모 추출물(디프코 래버러토리스(Difco Laboratories)) 및 3g/ℓ의 박코펩톤(디프코)를 함유한 MB 배지 5㎖를 포함하는 시험관에서 밤새 30℃동안 배양시켰다. 이. 콜라이 HB101(pRK 2013)(피거스키(D.H.Figurski)의 문헌[Proc, Natl. Acad. Sci. USA 79: 1648-1652, 1979] 참고) 및 이. 콜라이 HB101(pSUP2021)(시몬(R. Simon) 등의 문헌[BIO/TECHNOL. 1:784-791, 1983] 참고)를 카나마이신 50 ㎍/㎖와 함께 LB 배지 5㎖를 포함하는 시험관에서 밤새 37℃에서 배양하였다. 세포를 원심분리기로 개별적으로 분리하여 수집하고 ½ 체적의 MB 배지에 현탁시켰다. 각각의 세포 현탁액을 1:1:1의 비율로 혼합하고 혼합물을 MB 한천 플레이트상에 니트로셀룰로즈 필터상에 놓았다. 플레이트를 27℃에서 밤새 배양시키고 필터상에 생성된 세포를 모아 적당한 체적의 MB 배지에 현탁시키고 선택 플레이트(MPK 플레이트)인, 10㎍/㎖의 폴리믹신 B 및 50㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 MB상에 분포시켰다. MPK 플레이트를 3 내지 4일 동안 27℃에서 배양하였다.
생성된 3,436개의 Tn5 변이원을 항-SLDH 항체와의 면역-도트 블롯 스크리닝(immuno-dot blot screening)에 적용시켰다. 각각의 균주의 세포를 96-웰의 미량역가 플레이트내 62.5 mM의 트리스-HCl(pH 6.5), 10%의 글리세롤, 2%의 SDS 및 5%의 β-머캅토에탄올을 함유하는 라엠리(Laemmli) 완충액 50㎕에 독립적으로 현탁시키고, 2시간 동안 60℃에서 배양하였다. 세포가 없는 추출물(Cell Free Extract, CFE)을 니트로셀룰로즈 필터상에 찍고, AP 공액된 기질 키트(미국 캘리포니아주 리치몬드 소재의 바이오-라드 래버러토리스(Bio-RAD Laboratories))로 스크리닝하였다. 결과적으로, 면역-도트 블롯 스크리닝에서 양성 신호가 없는 유일한 한가지 균주인 26A11을 수득하였다.
균주 26A11의 SLDH 결핍도는 웨스턴-블롯 분석법으로 확인하였으며, 그의 모체 균주에 비해 많아야 1/500 양의 SLDH를 발현시켰다. 26A11는 완전히 SLDH-결핍된 균주가 아니라 Tn5 삽입물에 의해 억제된 SLDH 유전자를 갖는 균주이며, Tn5-삽입 부분 주위에 뉴클레오타이드 서열을 결정한 결과, 삽입 부위가 C-말단에 인접한 것으로 밝혀졌다. 그 다음, 휴지 세포 반응을 수행하여 26A11 및 야생 글루코노박터 균주내 SLDH 전체 활성을 검사하였다. 2%의 D-소르비톨을 함유하는 인산 칼륨 완충액 100mM(pH 7.0)에서, 26A11는 D-소르비톨을 L-소르보스로 겨우 전환시키는 반면, 야생 균주 IFO 3293 및 IFO 3255는 30℃에서 39.5시간 동안 이를 완전히 수행하였다.
(5) 26A11내 SLDH 유전자의 발현
수득된 SLDH 클론의 SLDH 활성을 확인하기 위해서, 보완성 시험을 수행하였다. 플라스미드 pSLII 및 pVKLSIIP를 접합 교배에 의해 26A11에 도입시켰다. pSLII 또는 pVKSLIIP를 포함하는 형질접합체는 미니-휴지 세포 반응에 SLDH 활성을 저장하고 웨스턴-블롯 분석에서 약 80 kDa의 면역-반응성 폴리펩타이드를 나타낸다.
(6) SLDH 유전자의 뉴클레오타이드 서열화
플라스미드 pUSLIIP를 SLDH 및 ORF2 유전자의 뉴클레오타이드 서열화를 위해 사용하였다. 결정된 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 1; 3,481 bp)는 SLDH 유전자의 ORF(서열번호 1중에 572번부터 2794번까지의 뉴클레오타이드, 2,223 bp)가 740개의 아미노산 잔기의 폴리펩타이드(서열번호 2)를 암호화하고, 그안에 정제된 SLDH 폴리펩타이드로부터 결정된 3종의 아미노산 서열(서열번호 4부터 6으로 나타나는 펩타이드 제 1 호, 제 3 호 및 제 8 호임)이 있다는 것을 나타냈다. SLDH ORF에 더불어, 하나 이상의 ORF인 ORF2가 도 2 및 도 3에서 기술하는 바와 같이 SLDH ORF의 업스트림에서 발견하였다. ORF2의 ORF(서열번호 1중의 뉴클레오타이드 192번부터 572번; 381 bp)는 126개의 아미노산 잔기의 폴리펩타이드(서열번호 3)를 암호화한다.
펩타이드 제 1 호의 4번째 아미노산 서열은 아미노산 서열 분석기에 의해 Glu으로 결정되었으나 DNA 서열에 의하면 Ala이었다. 펩타이드 제 3 호의 11번째 아미노산 서열은 아미노산 서열 분석기에 의하면 Gln으로 결정되었으나, DNA 서열에 의하면 Pro이었다. 신호-펩타이드 같은 영역(서열번호 8)은 추정 아미노산 서열에 가능한 포함되었다: 이것은 (i) 많은 소수성 잔기, (ii) N-말단 근처의 양성을 띠는 잔기 및 (iii) 절단 표시로서 Ala-Xaa-Ala 부위를 포함한다. 실재 신호 서열은 실시예 3의 (7)에서 설명하는 바와 같이 결정되었다. SLDH 유전자를 위한 추정 리보좀-결합 부위(샤인-달가노, SD 서열)는 개시 코돈의 8bp 업스트림(서열번호 1의 뉴클레오타이드 558번부터 564번; AGAGGAG)에 위치하였다. ORF2에 대한 추정 SD 서열은 개시 코돈의 10bp 업스트림(서열번호 1의 뉴클레오타이드 117번부터 182번; GGGAGG)에 위치하였다. 도 3에서 기술하는 바와 같이 SLDH 구조 유전자의 다운스트림(뉴클레오타이드 서열 2803번부터 2833번 및 2838번부터 2892번)에서 일부 반전 반복 서열이 있었다. 이들은 SLDH 유전자를 위한 전이 종말 루프로서 작용할 수도 있다. ORF2 유전자에 있어서, 반전 반복 서열은 684번에서 704번에서 발견되었다.
SLDH와 ORF2에 대한 상동성 연구를 엠피플래스트(mpBlast, 미국 메릴랜드주 베테스타 소재의 NCBI)의 프로그램 및 GCG(미국 위스콘신주 유니버서티 리서치 파크(University Research Park), 유전자 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group))내 모티프스(Motifs) 프로그램으로 수행하였다. SLDH 폴리펩타이드는 C-말단부 근처의 영역(서열번호 2의 632번부터 692번의 아미노산 잔기 사이)에서 퀴노단백질내에 서열을 일반적으로 보존하였고 그밖의 서열은 퀴노단백질 모티프스(프로사이트 제 PS00363 호; [DN]W.{3}G[RK].{6}[FY]S.{4}[LIVM]N.{2}NV.{2}L[RK]; 서열번호 2의 아미노산 잔기 79번부터 107번)와 동일하였다.
ORF2는 GDH를 막에 연결시키기 위한 막-걸침 영역으로 공지된, 지. 옥시단스, 이. 콜라이, 아시네토박터 칼코아세티큐스(Acinetobacter calcoaceticus)의 막-결합된 PQQ-의존 D-글루코즈 데하이드로제나제의 N-말단 영역과 상보성을 나타냈다. 지. 옥시단스, 이. 콜라이, 에이. 칼코아세티큐스의 GDH의 N-말단 영역에 대한 ORF2의 동일성은 각각 30%, 32% 및 37%이었다. ORF2 단백질은 SLDH 막-연결된 형태을 형성할 수 있는 고정 단백질로서 작용할 수도 있다.
실시예 4. 성숙한 SLDH 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단 서열의 결정
N-말단부의 직접적인 서열화는 결과를 얻지 못하였고, 이는 N-말단이 블록킹되어 있음을 나타낸다. 그 다음, SLDH 폴리펩타이드를 37℃에서 20 시간 동안 기질 대 효소의 비율을 20:1(w/w)로 하여 0.1M 트리스-HCl내 엔도프로티나제 Lys-C(일본 오사카 소재의 와코(Wako))로 처리하였다. 전체 소화물을 역상 HPLC(RP300, 1㎜×25㎝, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 응용 바이오시스템스)로 분석하고, 분자량의 결정을 위해 각각의 피크를 질량 분석기(미국 캘리포니아주 산 호세 소재의 TSQ700 트리플 쿼드러폴 인스트루먼트(triple quadrupole instrument), 파이니간-메트(Finnigan-MAT))에 적용시켰다. 서열번호 7로 기술되어 있는 소화물중 하나는, 서열번호 1로 나타낸 결정화된 뉴클레오타이드 서열로부터 예측된 아미노산 조성물과 함께 질량 분석기 분석 및 아미노산 조성 분석에 의해 N-말단 서열임으로 확인되었다. 추가로, N-말단 서열과 펩타이드와의 동일성을 확인하기 위해서 충돌 유도 분해(collisional induced dissociation; CID)로의 분석을 수행하였다. N-말단부는 피로글루타밀 잔기임이 결정되었다.
서열번호 7에서 제시하는 바와 같기 SLDH의 N-말단부가 결정되었기 때문에, 신호 서열은 서열번호 8에서 기술하는 바와 같이 Met-Arg-Arg-Pro-Tyr-Leu-Leu-Ala-Thr-Ala- Ala-Gly-Leu-Ala-Leu-Ala-Cys-Ser-Pro-Leu-Ile-Ala-His-Ala의 서열 길이를 갖는 24개의 아미노산 잔기임을 확인하였다. C-말단부 서열은 V8 프로티아제 소화물로부터 회수된 펩타이드를 사용하여 Pro-Asp-Ala-Ile-Lys-Gln(서열번호 9)임을 결정하였다.
실시예 5. 이. 콜라이에서의 SLDH 및/또는 ORF2 유전자의 발현
실시예 3(2)에서 기술한 pCRSLIIP로부터, lac 프로모터 조절하에서는 ORF2이 있거나 없거나 SLDH 유전자를 포함하는 플라스미드가 도 4에서 기술한 바와 같이 조립되었다. 생성된 3종의 플라스미드는 SLDH 및 ORF2 유전자를 포함하는 pTNB114, SLDH 유전자 및 리보좀 결합 부위와 개시 코돈(ATG)를 포함하는 N-말단에서 끝이 잘린 ORF2 유전자를 포함하는 pTNB115 및 대부분이 끝이 잘린 ORF2 유전자 및 원래 SLDH 유전자를 포함하는 pTNB116이다. 이러한 3종의 플라스미드는 종래의 형질전환에 의해 이. 콜라이에 도입되었다. SLDH 폴리펩타이드의 제조는 생성된 형질전환체의 세포 없는 추출물로의 웨스턴-블롯 분석에 의해 검사하였고, SLDH 활성은 휴지 세포로 검사하였다. 휴지 세포 반응은 17시간 동안 실온에서 1㎍/㎖의 PQQ가 있거나 없이 0.3%의 NaCl, 1%의 CaCO3, 4%의 D-소르비톨 및 1mM의 PMS를 함유하는 반응 혼합물에서 수행하였다. L-소르보스를 생성시키는 SLDH의 활성은 n-프로판올:H2O:1% H3PO4:HCOOH(400:100:10:1)으로 구성된 용리 용매 및 나프토레조르시놀의 분사 시약을 사용하여 실리카 겔 60(F254, 0.25㎜, 메르크(Merck))으로 TLC 분석법에 의해 분석하였다. 결과적으로, SLDH 폴리펩타이드는 웨스턴-블롯 분석에서 모든 형질변환체에서 ORF2 유전자의 발현이 없는 경우에 검출되었으나, L-소르보스를 생성하는 SLDH 활성은 PQQ의 존재하에서 휴지 세포 반응 조건하에서 원래 ORF2 유전자를 함유하는 pTNB114를 포함하는 형질전환체에서만 검출되었다.
실시예 6. 이. 콜라이에서의 SLDH 및/또는 ORF2 유전자의 발현
도 5는 pTNB110 및 pTNB 143의 조립 단계를 설명한다. DSM4025(호시노 등의 유럽 특허 제 9611500.8 호)의 효소 A 유전자(pA)의 프로모터의 조절하에서 ORF2 및 SLDH를 포함하는 플라스미드 pTNB110는 pUC18의HindIII와XhoI 단편 사이에 pA를 함유하는HindIII-KpnI 단편 및 pTNB114로부터의 Kpn I-Xho I 단편을 삽입함으로써 조립되었다. 독립적인 발현 단위로서의 ORF2 및 SLDH 유전자(pA를 갖는 ORF2 유전자 및 pA를 갖는 SLDH 유전자)를 포함하는 플라스미드 pTNB143는 도 5에서 제시하는 바와 같이 pTNB141 하이브리드 벡터 0.9 Kb의SalI 단편 및 pTNB135로부터의 3.2kb의HindIII-Xho I 단편을 pUC57/pCRII 하이브리드 벡터(pUC57로부터의 plac가 있는ScaI-HindIII 단편 및 CRII로부터의 Plac가 없는XhoI에서ScaI까지의 단편)에 삽입함으로써 형성되었다. 플라스미드, pTNB110 및 pTNB143을 종래의 형질전환에 의해 이. 콜라이에 도입하였다. 생성된 형질전환체는 실시예 5에서 기술한 바와 같이 웨스턴-블롯 분석법 및 휴지 세포 반응에 적용시켰다. 결과적으로, pTNB110 및 pTNB143을 수행하는 둘다의 형질전환체는 SLDH 단백질을 생성하였고 PQQ의 존재하에서 D-소르비톨로부터 L-소르보스를 생성하는 SLDH 활성을 나타내었다.
실시예 7. 지. 옥시단스 DSM 4025내에서의 SLDH의 발현
L-소르보스를 생성하는 D-소르비톨 데하이드로제나제 활성을 함께 가지면서 강한 L-소르보스 및 L-소르보손 데하이드로제나제 활성을 갖는 지. 옥시단스 DSM 4025내 SLDH 유전자의 발현을 위한 플라스미드 pTNB136는 pTNB135(도 5)로부터의HindIII-XhoI 단편을 pVK100의HindIII 및XhoI 부위에 삽임함으로써 조립되었다. 플라스미드 pTNB136 및 그의 벡터 pVK100를, 접합 교배를 통해, L-소르보스를 생성하는 D-소르비톨 데하이드로제나제를 갖는 효소 B의 유전자(유럽특허 제 832 974 호)가 카나마이신 내성 유전자 카세트(1.28 kB의 pUC4K의EcoRI 단편; 스웨덴 소재의 파마시아 웁살라(Pharmacia Uppsala))를 갖는 효소 B 유전자를 함유하는 두개의EcoRI 단편으로 대체함으로써 제거된 지. 옥시단스 DSM 4025의 돌연변이체인 균주 GOBΔK에 도입시켰다. 유전자 붕괴는 당 분야에 공지된 재조합 DNA 기법에 의해 수행되었다. 4일 동안 30℃에서 수행된 플라스크 발효에 의해, 10%의 D-소르비톨에서 pTNB136를 포함하는 생성된 형질접합체 GOBΔK는 5g/ℓ의 2KGA를 생성하였고, pVK100을 포함하는 생성된 형질접합체 GOBΔK는 2g/ℓ의 2KGA를 형성하였다(배지: 10%의 D-소르비톨, 1.6%의 우레아, 0.05%의 글리세롤, 0.25%의 MgSO4·7H2O, 3%의 옥수수 스티프액(corn steep liquor), 6.25%의 빵 효모 습윤 세포 및 1.5%의 CaCO3). 항-SLDH 항체와의 웨스턴 블롯 분석법은 pTNB136를 포함하는 형질접합체가 면역-반응성 SLDH 폴리펩타이드를 발현시킴을 확인하였다.
본 발명을 통해, 글루코노박터 속 및 아세토박터 속을 포함하는 아세트산 박테리아에 속하는 미생물을 기원으로 하는 SLDH를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 ORF2의 뉴클레오타이드 서열을 클로닝하고, 이 SLDH 및/또는 ORF2 유전자를 함유하는 DNA 분자 또는 DNA 조합체와, SLDH 및/또는 ORF2 유전자를 효과적으로 발현시킬 수 있는 재조합 발현 벡터 및 이 발현 벡터를 갖는 재조합 생물을 형성하고, 이 생물을 사용함으로써 D-소르비톨로부터 L-소르보스를 효과적으로 생성함을 확인하였다.
서열 목록
(1) 서열들에 관한 일반 정보
(i) 출원인:
명칭: 에프 호프만-라 롯슈 아크티엔게젤샤프트
가: 그렌짜헤르스트라세 124
시: 바즐
국가: 스위스
우편 번호: 체하-4002
전화: 061-688 25 11
팩스: 061- 688 13 95
텔렉스: 962292/965542 hlr c
(ii) 발명의 명칭: 디-소르비톨 데하이드로제나제 유전자
(iii) 서열의 갯수: 9
(iv) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: 매킨토시
(C) 운용 시스템:
(D) 소프트 웨어: MS 워드 버전 5.1a
(v) 현출원 정보:
(A) 출원 번호:
(B) 출원 날짜:
(C) 분류
(2) 서열번호 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 3481 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: DNA(게놈)
(iii) 기원:
생물명: 글루코노박터 서브옥시단스
균주명: IFO 3255
(iv) 특징적 부분
특징을 나타내는 기호: CDS
존재위치: 192..572
서열을 결정하는 방법: E
특징을 나타내는 기호: CDS
존재위치: 572..2794
서열을 결정하는 방법: E
(3) 서열번호 2에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 740 잔기
(B) 유형: 아미노산
(C) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: 단백질
(iii) 기원:
생물명: 글루코노박터 서브옥시단스
균주명: IFO 3255
(iv) 특징적 부분
특징을 나타내는 기호: sig 펩타이드
존재위치: -24..-1
서열을 결정하는 방법: E
특징을 나타내는 기호: mat 펩타이드
존재위치: 1..716
서열을 결정하는 방법: E
(4) 서열번호 3에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 126 잔기
(B) 유형: 아미노산
(C) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: 단백질
(iii) 단편형: 중간 단편
(iv) 기원:
생물명: 글루코노박터 서브옥시단스
균주명: IFO 3255
(v) 특징적 부분
특징을 나타내는 기호: mat 펩타이드
존재위치: 1..126
서열을 결정하는 방법: E
(5) 서열번호 4에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 8 잔기
(B) 유형: 아미노산
(C) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: 펩타이드
(iii) 단편형: 중간 단편
(iv) 기원:
생물명: 글루코노박터 서브옥시단스
균주명: IFO 3255
(v) 특징적 부분
서열을 결정하는 방법: E
(6) 서열번호 5에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 잔기
(B) 유형: 아미노산
(C) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: 펩타이드
(iii) 단편형: 중간 단편
(iv) 기원:
생물명: 글루코노박터 서브옥시단스
균주명: IFO 3255
(v) 특징적 부분
서열을 결정하는 방법: E
(7) 서열번호 6에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 16 잔기
(B) 유형: 아미노산
(C) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: 펩타이드
(iii) 단편형: 중간 단편
(iv) 기원:
생물명: 글루코노박터 서브옥시단스
균주명: IFO 3255
(v) 특징적 부분
서열을 결정하는 방법: E
(8) 서열번호 7에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 30 잔기
(B) 유형: 아미노산
(C) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: 펩타이드
(iii) 단편형: N-말단 단편
(iv) 기원:
생물명: 글루코노박터 서브옥시단스
균주명: IFO 3255
(v) 특징적 부분
서열을 결정하는 방법: E
(9) 서열번호 8에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 잔기
(B) 유형: 아미노산
(C) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: 펩타이드
(iii) 기원:
생물명: 글루코노박터 서브옥시단스
균주명: IFO 3255
(iv) 특징적 부분
특징을 나타내는 기호: sig 펩타이드
존재위치: 1..24
서열을 결정하는 방법: E
(10) 서열번호 9에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 6 잔기
(B) 유형: 아미노산
(C) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: 펩타이드
(iii) 단편형: C-말단 단편
(iv) 기원:
생물명: 글루코노박터 서브옥시단스
균주명: IFO 3255
(v) 특징적 부분
서열을 결정하는 방법: E

Claims (14)

  1. (a) 서열번호 2로 기술되는 서열의 1번부터 716번까지의 아미노산 서열을 갖는 단백질; 또는
    (b) (a)에서 정의된 아미노산 서열내에서 하나 이상의 아미노산을 치환하거나 제거하거나 삽입하거나 첨가함으로써 단백질 (a)로부터 유도된 단백질
    로 정의되고 소르비톨 데하이드로제나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA.
  2. (1) 제 1 항에서 정의한 DNA; 및
    (2) 서열번호 1로 표시되는 서열의 192번부터 569번까지의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 ORF2를 암호화하는 DNA 및/또는 서열번호 3으로 정의되는 서열의 하나 이상의 아미노산이 치환, 제거, 삽입 또는 첨가되고 ORF2와 동등한 기능을 갖는 ORF2 유도체를 암호화하는 DNA
    를 포함하는 DNA 조합체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에서 청구한 DNA를 포함하는 발현 벡터.
  4. 제 2 항에 있어서,
    각 DNA가 개별적으로 상이한 발현 벡터 또는 동일한 발현 벡터에 포함되는 DNA 조합체.
  5. 제 2 항에 있어서,
    서열번호 1로 기술되는 바와 같은 일렬 형태의 DNA 조합체.
  6. 제 3 항에 있어서,
    글루코박터(Gluconobacter) 속, 아세토박터(Acetobacter) 속 또는 이. 콜라이(E. coli)에 속하는 미생물중에서 선택된 미생물에서 작용가능한 발현 벡터.
  7. 제 3 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에서 청구한 발현 벡터로 형질전환된 재조합 생물.
  8. 숙주의 염색체 DNA상에 제 1 항에서 청구한 DNA 또는 제 2 항, 제 4 항 및 제 5 항중 어느 한 항에서 정의된 DNA 조합체를 갖는 재조합 생물.
  9. 적당한 배지내에서 제 7 항 또는 제 8 항에서 청구한 재조합 생물을 배양하고, 이 배양물로부터 재조합 D-소르비톨 데하이드로제나제를 회수함을 포함하는, 재조합 D-소르비톨 데하이드로제나제의 제조 방법.
  10. 제 1 항에서 청구한 DNA 또는 제 2 항, 제 4 항 및 제 5 항중 어느 한 항에서 청구한 DNA 조합체를 발현시킴으로써 제조된 재조합 D-소르비톨 데하이드로제나제.
  11. 제 9 항에서 청구한 방법으로 제조된 재조합 D-소르비톨 데하이드로제나제.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
    고상 효소 반응을 위해 고체 담체상에 고정화된 재조합 D-소르비톨 데하이드로제나제.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에서 청구한 재조합 D-소르비톨 데하이드로제나제에 의해 D-소르비톨을 L-소르보스로 전환시킴을 포함하는, L-소르보스의 제조 방법.
  14. 적당한 배지에서 제 7 항 또는 제 8 항에서 청구한 재조합 생물의 발효에 의해 D-소르비톨을 L-소르보스로 전환시킴을 포함하는 L-소르보스의 제조 방법.
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