JPH11113586A

JPH11113586A - Ｄ−ソルビトール・デヒドロゲナーゼ遺伝子

Info

Publication number: JPH11113586A
Application number: JP10236138A
Authority: JP
Inventors: Tatsuo Hoshino; 達雄星野; Taro Miyazaki; 太郎宮崎; Setsuko Oshima; せつ子尾島; Masako Shinjo; 雅子新城; Tetsushi Tomiyama; 哲史富山
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1997-08-21
Filing date: 1998-08-21
Publication date: 1999-04-27
Anticipated expiration: 2018-08-21
Also published as: US6444449B1; DE69839381T2; CN1177054C; JP4394761B2; BR9803960A; KR19990023764A; DE69839381D1; CN1210148A; CA2239802A1; US6653115B1; US6127156A

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、Ｄ−ソルビトール・デヒドロゲ
ナーゼ遺伝子を提供することを課題とする。【解決手段】本発明により、下記の(a)または(b)によ
って規定される、ソルビトールデヒドロゲナーゼ活性を
有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むDN
A、該DNAを含むベクター、該ベクターにより形質転換さ
れた宿主、該蛋白質の調製方法、およびそれらの使用が
提供された： (a)配列番号：2に記載された配列の1位から716位までの
アミノ酸配列を有する蛋白質、または (b)(a)で規定されたアミノ酸配列における1つまたはそ
れ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加によ
って(a)の蛋白質から得られる蛋白質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、グルコノバクター
属およびアセトバクター属を含む酢酸菌に属する微生物
のD-ソルビトールデヒドロゲナーゼをコードする新規の
DNA、該DNAを含む発現ベクター、および該発現ベクター
を含む組換え生物体に関する。さらに、本発明は組換え
D-ソルビトールデヒドロゲナーゼの生産プロセス、なら
びに該組換え酵素または該発現ベクターを含む組換え生
物体を利用したL-ソルボースの生産プロセスに関する。

【０００２】

【従来の技術】L-ソルボースは、主にライヒシュタイン
(Reichstein)法(Helvetica chimica Acta, 17: 311, 19
34)により実施される、工業的なビタミンC生産プロセス
の重要な中間体である。このプロセスにおいては、唯一
の微生物による変換は、グルコノバクターまたはアセト
バクター株による、D-ソルビトールからのL-ソルボース
の生産である。この変換は、NAD/NADP非依存性のD-ソル
ビトールデヒドロゲナーゼ(SLDH)によって実行されると
考えられる。L-ソルボースも、ビタミンCの生産の有用
な中間体である2-ケト-L-グロン酸を、微生物により生
産するための当技術分野で周知の基質である。

【０００３】D-ソルビトールからL-ソルボースへの酸化
を触媒するNAD/NADP非依存性のD-ソルビトールデヒドロ
ゲナーゼがあることが知られている。該D-ソルビトール
デヒドロゲナーゼは、グルコノバクター・サブオキシダ
ンス変種αIFO 3254（Gluconobacter suboxydans var
αIFO 3254）(E. Shinagawaら、Agric Biol. Chem., 4
6: 135-141, 1982)から単離および解析され、分子量が6
3 kDa、51 kDa、および17 kDaの3つのサブユニットから
構成されていることが判明した。最大のサブユニット
は、FADをコファクターとして含むデヒドロゲナーゼで
あり、2番目のサブユニットはチトクロームc、最小のサ
ブユニットは機能が不明のタンパク質である。該D-ソル
ビトールデヒドロゲナーゼは、至適pH 4.5を示す。かか
るSLDHはG.サブオキシダンス（suboxydans）ATCC 621
(KCTC 2111)(E-S Choiら、FEMS Microbiol. Lett. 125:
45-50, 1995)からも精製および解析されており、分子量
が75 kDa、50 kDa、および14 kDaの3つのサブユニット
から構成されることが判明した。最大のサブユニット
は、ピロロキノリンキノン(PQQ)をコファクターとして
含むデヒドロゲナーゼ、2番目のサブユニットはチトク
ロームc、最小のサブユニットは機能が不明のタンパク
質である。本発明者らはまたG.サブオキシダンスIFO 32
55 (T. Hoshinoら、欧州特許第728840号)からもNAD/NAD
P非依存性SLDHを精製し解析した。このSLDHは分子量が7
9.0 +/- 0.5 kDaの1種類のサブユニットからなり、至適
pHは6〜7を示し、D-ソルビトール以外にもマンニトール
およびグリセロールにデヒドロゲナーゼ活性を示す。

【０００４】数種類のSLDHが精製されたにもかかわら
ず、その遺伝子はまだクローニングされていない。SLDH
酵素を効率良く生産し、SLDH活性の上昇した組換え生物
体を作製してL-ソルボースの生産収率を改善するため
に、SLDH遺伝子をクローニングすることは有用である。
また、該SLDH遺伝子を、例えばL-ソルボースを2-ケト-L
-グロン酸に変換するグルコノバクターなどの所望の生
物体に導入して、D-ソルビトールから2-ケト-L-グロン
酸を直接生産する組換え微生物を作製することも有用で
ある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、Ｄ−ソル
ビトール・デヒドロゲナーゼ遺伝子を提供することを課
題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、グルコノバク
ター属およびアセトバクター属などの酢酸菌に属する微
生物由来のD-ソルビトールデヒドロゲナーゼ(SLDH)をコ
ードするヌクレオチド配列（遺伝子）、該ヌクレオチド
配列を含むDNA分子、該DNAと該SLDHをインビボで活性化
する機能を有するタンパク質のヌクレオチド配列を含む
DNAとの組み合わせ、SLDHヌクレオチド配列またはDNAの
該組み合わせを含むDNAを有する発現ベクター、該発現
ベクターを有する組換え生物体、組換えSLDHを生産する
ためのプロセス、および組換えSLDHまたは組換え生物体
を利用してL-ソルボースを生産するためのプロセスを提
供する。

【０００７】本発明は、機能的誘導体にも関する。かか
る機能的誘導体とは、本発明のアミノ酸配列を基とし
て、該配列の1つまたは複数のアミノ酸残基が付加、挿
入、欠失、および/または置換されているものであっ
て、当技術分野で公知のアッセイまたは本明細書に具体
的に記載したアッセイによって測定されるSLDH活性を有
する誘導体と定義される。かかる機能的誘導体は、当技
術分野で公知の化学的ペプチド合成法、または当技術分
野で公知であり例えばサムブルック(Sambrook)ら「分子
クローニング(Molecular Cloning)」,( Cold Spring Ha
rbour Laboratory Press, New York, USA、第2版1989)
に開示されている方法による本明細書に開示されている
DNA配列に基づく組換え法のいずれかにより作製でき
る。タンパク質およびペプチドにおける該分子の活性を
通常変化させないようなアミノ酸の置換は、当技術分野
で公知であり、たとえばH.ネウラス(Neurath)およびR.
L. ヒル(Hill)、「タンパク質（The Proteins）」（Aca
demic Press, New York, 1979、特に14ページ図6を参
照）に記述されている。最も通常に起こる置換は、Ala/
Ser,Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, S
er/Asn, Ala/Val, Ser/Gly,Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Ar
g, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Glyおよ
びその逆である。

【０００８】さらに、本発明は、例えば配列番号：2お
よび配列番号：3として開示されるSLDH活性を有するポ
リペプチドと該SLDHをインビボで活性化する機能を有す
るポリペプチドとをコードするDNA配列、その相補鎖、
またはこれらの配列を含む配列、該配列またはその断片
と標準的条件下でハイブリダイズするDNA配列、および
遺伝コードの縮重のために該配列とは標準的条件下でハ
イブリダイズしないが全く同一のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードするDNA配列にも関する。

【０００９】本明細書におけるハイブリダイゼーション
の「標準的条件」とは、当業者が一般的に特異的なハイ
ブリダイゼーションシグナルを検出するために使用する
条件で、例えば「分子クローニング（Molecular Clonin
g）」(Cold Spring HarbourLaboratory Press, New Yor
k, USA、第2版1989)に記述されている条件、または好ま
しくは、当業者に周知で例えばサムブルック（Sambroo
k）ら(前記)に記述されている、いわゆるストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件およびストリンジェ
ントな洗浄条件である。

【００１０】本発明者らは、DNA組換え技術によってSLD
H遺伝子と共にインビボでSLDH活性を発現させるための
機能を有する遺伝子を単離し、そのヌクレオチド配列を
決定した。

【００１１】本発明は、グルコノバクターSLDHをコード
するDNA配列、インビボでSLDH活性を発現させるための
機能を有する遺伝子（以後ORF2遺伝子と称する）、 SLD
Hの該DNAを含む発現ベクター、および該発現ベクターを
有する宿主細胞を提供する。

【００１２】簡単に述べると、本発明で使用されるSLDH
および/またはORF2遺伝子、該遺伝子を含むDNA分子、組
換え発現ベクター、および組換え生物体は、次のような
段階によって得られる：

【００１３】(1) D-ソルビトールをL-ソルボースに変換
するSLDH活性を提供できる微生物から染色体DNAを単離
し、例えば大腸菌などの適当な宿主細胞中で、該染色体
DNAの遺伝子ライブラリーを作製する段階；

【００１４】(2) コロニーハイブリダイゼーション、プ
ラークハイブリダイゼーション、またはサザンハイブリ
ダイゼーション、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）クロー
ニング、およびウェスタンブロット分析、などの方法
で、染色体DNAからSLDHおよび/またはORF2遺伝子をクロ
ーニングする段階；

【００１５】(3) 上記のようにして得られたSLDHおよび
/またはORF2遺伝子のヌクレオチド配列を常法により決
定し、該SLDHおよび/またはORF2遺伝子を含むDNA分子を
選択し、 SLDHおよび/またはORF2遺伝子が効果的に発現
できる組換え発現ベクターを構築する段階；

【００１６】(4) 例えば、形質転換、形質導入、接合伝
達、および/またはエレクトロポレーションなどの適当
な方法でDNAを宿主細胞に導入することにより、SLDHお
よび/またはORF2遺伝子を有する組換え生物体を作製す
る段階。

【００１７】本発明に係るDNAにおいては、（１）下記の(a)または(b)によって規定される、ソルビ
トールデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードす
るヌクレオチド配列を含むDNAであることを特徴とす
る：

【００１８】(a) 配列番号：2に記載された配列の1位か
ら716位までのアミノ酸配列を有する蛋白質、または

【００１９】(b) (a)で規定されたアミノ酸配列におけ
る1つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入も
しくは付加によって(a)の蛋白質から得られる蛋白質。

【００２０】また、本発明に係るDNAにおいては、（２）酢酸菌に属する微生物のソルビトールデヒドロゲ
ナーゼをコードする、上記（1）記載のDNAであることを
特徴とする。

【００２１】また、本発明に係るDNAにおいては、（３）微生物がグルコノバクター属またはアセトバクタ
ー属に属する、上記（2）記載のDNAであることを特徴と
する。

【００２２】また、本発明に係るDNAにおいては、（４）(c) 配列番号：1に示された配列の664位から2791
位まで、または572位から2791位までのヌクレオチド配
列を含むDNA、および

【００２３】(d) (c)で規定されたDNAとのハイブリダイ
ゼーションが可能であって、上記（1）の(a)で規定され
た蛋白質の機能を有する蛋白質をコードするDNAからな
る群より選択される、上記（1）〜（3）のいずれか一項
に記載のDNAであることを特徴とする。

【００２４】また、本発明に係るDNAにおいては、（５）(A) 上記（1）〜（4）のいずれか一項で規定され
るDNAと、

【００２５】(B) 配列番号：1に示された配列の192位か
ら569位までのヌクレオチド配列を有するORF2をコード
するDNA、および／または配列番号：3で規定された配列
の1つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入ま
たは付加によって得られる、ORF2の機能と同等な機能を
有するORF2の誘導体をコードするDNAとを含む、DNAの組
み合わせであることを特徴とする。

【００２６】また、本発明に係るDNAにおいては、（６）(A) 配列番号：1に示された配列の644位から2791
位まで、もしくは572位から2791位までのヌクレオチド
配列を有するDNA、または上記（1）で規定された蛋白質
の機能を有する蛋白質をコードするこのDNAとのハイブ
リダイゼーションが可能なDNA、および

【００２７】(B) 配列番号：1に示された配列の192位か
ら569位までのヌクレオチド配列を有するORF2をコード
するDNA、または配列番号：3で規定された配列の1つま
たはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加
によって得られる、ORF2の機能と同等な機能を有するOR
F2の誘導体をコードするDNAを含む、上記（5）記載のDN
Aの組み合わせであることを特徴とする。

【００２８】また、本発明に係る発現ベクターにおいて
は、（７）上記（1）〜（6）のいずれか一項に記載のDNAを
含む発現ベクターであることを特徴とする。

【００２９】また、本発明に係るDNAにおいては、（８）それぞれのDNAが異なる発現ベクター上にある
か、または同じ発現ベクター上にある、上記（5）また
は（6）記載のDNAの組み合わせであることを特徴とす
る。

【００３０】また、本発明に係るDNAにおいては、（９）配列番号：1に記載のように直列に位置してい
る、上記（5）または（6）記載のDNAの組み合わせであ
ることを特徴とする。

【００３１】また、本発明に係る発現ベクターにおいて
は、（１０）グルコノバクター属、アセトバクター属または
大腸菌に属するものから選択された微生物において機能
的である、上記（7）記載の発現ベクターであることを
特徴とする。

【００３２】また、本発明に係る組換え生物体において
は、（１１）上記（7）および（10）のいずれか一項に記載
の発現ベクターが導入された組換え生物体であることを
特徴とする。

【００３３】また、本発明に係る組換え生物体において
は、（１２）宿主生物体の染色体DNA上に、上記（1）〜
（4）のいずれか一項に記載のDNA、または上記（5）、
（6）、（8）もしくは（9）のいずれか一項に記載のDNA
の組み合わせを有する組換え生物体であることを特徴と
する。

【００３４】また、本発明に係る組換え生物体において
は、（１３）宿主生物体が、グルコノバクター属、アセトバ
クター属または大腸菌に属するものから選択される微生
物である、上記（11）または（12）記載の組換え生物体
であることを特徴とする。

【００３５】また、本発明に係る組換えD-ソルビトール
デヒドロゲナーゼの製造方法においては、（１４）上記（11）〜（13）のいずれか一項に記載の組
換え生物体を適当な培地中で培養する段階と、培養物か
ら該組換えD-ソルビトールデヒドロゲナーゼを回収する
段階とを含む、組換えD-ソルビトールデヒドロゲナーゼ
を製造する方法であることを特徴とする。

【００３６】また、本発明に係る組換えD-ソルビトール
デヒドロゲナーゼにおいては、（１５）上記（1）〜（4）のいずれか一項に記載のDN
A、または上記（5）、（6）、（8）もしくは（9）のい
ずれか一項に記載のDNAの組み合わせの発現によって産
生される組換えD-ソルビトールデヒドロゲナーゼである
ことを特徴とする。

【００３７】また、本発明に係る組換えD-ソルビトール
デヒドロゲナーゼにおいては、（１６）上記（14）記載の方法によって製造される組換
えD-ソルビトールデヒドロゲナーゼであることを特徴と
する。

【００３８】また、本発明に係る組換えD-ソルビトール
デヒドロゲナーゼにおいては、（１７）固相酵素反応のために固体担体上に固定化され
た、上記（15）または（16）記載の組換えD-ソルビトー
ルデヒドロゲナーゼであることを特徴とする。

【００３９】また、本発明に係るL-ソルボースの製造方
法においては、（１８）上記（16）または（17）記載の組換えD-ソルビ
トールデヒドロゲナーゼを利用してD-ソルビトールをL-
ソルボースに変換する段階を含む、L-ソルボースを製造
するための方法であることを特徴とする。

【００４０】また、本発明に係るL-ソルボースの製造方
法においては、（１９）上記（11）〜（13）のいずれか一項に記載の組
換え生物体の適当な培地中における発酵によってD-ソル
ビトールをL-ソルボースに変換する段階を含む、L-ソル
ボースを製造するための方法であることを特徴とする。

【００４１】

【発明の実施の形態】本発明の上記の局面に使用される
材料および技術は、下記に詳細に例示する。

【００４２】全染色体DNAは、当技術分野で周知の方法
により精製できる。目的の遺伝子は、通常、以下の実施
例にある方法のいずれかにより、全染色体DNAからプラ
スミドまたはファージベクターのいずれかにクローニン
グできる。

【００４３】(i) 部分的アミノ酸配列は、精製タンパク
質またはそのペプチド断片から決定できる。かかるタン
パク質全体またはペプチド断片は、タンパク質全体の単
離によって、またはペプチダーゼ処理後SDSポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動したゲルから単離することによっ
て調製できる。このようにして得られたタンパク質また
はその断片を、アプライド・バイオシステムズ（Applie
d Biosystems）自動気相シークエンサー470Aのようなタ
ンパク質シークエンサーにかける。アミノ酸配列を利用
して、オリゴヌクレオチドプローブおよび/またはプラ
イマーをデザインし、それらをアプライド・バイオシス
テムズ（Applied Biosystems）自動DNAシークエンサー3
81AのようなDNA合成装置によって調製することができ
る。該プローブは、目的の遺伝子を有する株の遺伝子ラ
イブラリーから、サザンハイブリダイゼーション、コロ
ニーハイブリダイゼーション、またはプラークハイブリ
ダイゼーションによって、目的の遺伝子を有するクロー
ンを単離するのに使用できる。

【００４４】(ii) または、遺伝子ライブラリーから目
的のタンパク質を発現するクローンを選択するために、
目的のタンパク質に対して調製された抗体を用いる免疫
学的方法も利用できる。

【００４５】(iii) 目的遺伝子のDNA断片は、全染色体D
NAから、プライマーのセット、すなわち、上記のように
して決定したアミノ酸配列にしたがって合成された2つ
のオリゴヌクレオチドを用いる、PCR法によって増幅で
きる。その後、例えば大腸菌において作製した遺伝子ラ
イブラリーから、上記のように得られたPCR産物をプロ
ーブとして用いるサザンハイブリダイゼーション、コロ
ニーハイブリダイゼーション、またはプラークハイブリ
ダイゼーションによって、目的の遺伝子全体を有するク
ローンを単離できる。

【００４６】(iv) クローニングのさらに別の方法は、
化学的変異誘発による通常の変異誘発によって、または
例えばトランスポゾンTn5を用いて目的遺伝子を破壊す
るような組換えDNA技術によって作製されたSLDH欠損株
に相補的なクローンをスクリーニングする方法である。

【００４７】本明細書に開示されているDNA配列に基づ
いてデザインされたプライマーを使用したポリメラーゼ
連鎖反応によって、当技術分野で公知の方法により作製
できるDNA配列も、本発明の目的である。本発明のDNA配
列は、例えば欧州特許第747483号に記載されているよう
に合成によって作製することもできる。

【００４８】上記の抗体は、精製SLDHタンパク質または
そのペプチド断片を抗原として、「酵素学の方法（Meth
ods in Enzymology)」(vol. 73, p 46, 1981)に記載さ
れるような方法により、調製できる。

【００４９】所望の遺伝子を有するクローンが得られた
ら、M13ファージを用いるジデオキシ・チェーン・ター
ミネーター法(Sanger F.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA,74: 5463-5467, 1977)のような周知の方法により目
的遺伝子のヌクレオチド配列を決定できる。

【００５０】本発明のD-ソルビトールデヒドロゲナーゼ
活性を発現する所望の遺伝子を、図２および図３〜６に
示す。この特異的遺伝子は、716アミノ酸残基を有するS
LDH酵素と、24アミノ酸残基からなるシグナルペプチド
とをコードしている。本発明者らは、上記SLDH構造遺伝
子のすぐ上流にオープンリーディングフレームを見出
し、これをORF2と命名した。このORF2遺伝子は、126ア
ミノ酸残基を有するタンパク質をコードしており、特
に、該SLDHが酢酸菌とは異なる属の宿主細胞において発
現される場合に、本発明の組換えSLDHに所望の酵素活性
を提供する機能を有することが示唆された。

【００５１】グルコノバクター属およびアセトバクター
属を含む酢酸菌から単離された所望の遺伝子/ヌクレオ
チド配列を、効果的に発現させるために、種々のプロモ
ーターを使用することができる。例えば、この遺伝子の
元来のプロモーター、Tn5（D.E. BergおよびC.M. Berg.
1983 Bio/Technology 1: 417-435)のカナマイシン耐性
遺伝子およびpBR322のアンピシリン耐性遺伝子のような
抗生物質耐性遺伝子のプロモーター、大腸菌のβガラク
トシダーゼ(lac)、trp-、tac-、trc-プロモーター、λ
ファージのプロモーター、ならびに宿主生物で機能しう
る任意のプロモーターが使用できる。この目的のため
に、宿主生物は、哺乳類細胞、植物細胞、および以下の
ような細菌を含む微生物から選択することができる：大
腸菌（Escherichia coli）、シュードモナス・プチダ
（Pseudomonas putida）、アセトバクター・キシリナム
（Acetobacter xylinum）、アセトバクター・パスツー
リアヌス（Acetobacter pasteurianus）、アセトバクタ
ー・アセチ（Acetobacter aceti）、アセトバクター・
ハンゼニイ（Acetobacter hansenii）、グルコノバクタ
ー・アルビダス（Gluconobacter albidus）、グルコノ
バクター・カプシュラタス（Gluconobacter capsulatu
s）、グルコノバクター・セリヌス（Gluconobacter cer
inus）、グルコノバクター・ディオキシアセトニカス
（Gluconobacter dioxyacetonicus）、グルコノバクタ
ー・グルコニカス（Gluconobacter gluconicus）、グル
コノバクター・インダストリウス（Gluconobacter indu
strius）、グルコノバクター・メラノジーナス（Glucon
obacter melanogenus）、グルコノバクター・ノンオキ
シグルコニカス（Gluconobacter nonoxygluconicus）、
ブダペスト条約の規定に基づいて1987年3月17日にDSM 4
025として[the Deutsche Sammlung von Mikroorganisme
n und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, BRD]に寄託
されたグルコノバクター・オキシダンスDSM 4025のよう
なグルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter ox
ydans）、グルコノバクター・オキシダンス・スフェリ
カス亜種（Gluconobacter oxydans subsp. sphaericu
s）、グルコノバクター・ロゼウス（Gluconobacter ros
eus）、グルコノバクター・ルビギノーザス（Gluconoba
cter rubiginosus）、グルコノバクター・サブオキシダ
ンス（Gluconobacter suboxydans）。

【００５２】発現のためには、コード配列が導入される
宿主細胞で機能的であるシャイン・ダルガーノ(SD)配列
（例えば、AGGAGGなど、宿主細胞中で機能的な天然およ
び合成配列を含む）、および転写終結因子（宿主細胞中
で機能的な任意の天然および合成配列を含む逆方向反復
構造）のような他の制御因子を、上述のプロモーターと
共に使用することができる。

【００５３】本発明のSLDH蛋白質のような膜結合型ポリ
ペプチドの発現のためには、通常15〜50アミノ酸残基を
含み、かつ完全に疎水性であるシグナルペプチドが結合
していることが好ましい。シグナルペプチドをコードす
るDNAは、所望の宿主細胞中で機能的な任意の天然およ
び合成配列から選択できる。

【００５４】二本鎖DNAのクローニングには、広範囲の
宿主/クローニングベクターの組み合わせが使用でき
る。通常、クローニングベクターは、複製開始点、制御
因子、マルチクローニングサイトを含むクローニング部
位、ならびにアンピシリン、テトラサイクリン、カナマ
イシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、および
スペクチノマイシン等の耐性遺伝子を含む抗生物質耐性
遺伝子のような選択マーカーを有するプラスミドまたは
ファージである。

【００５５】本発明の遺伝子を大腸菌で発現させるのに
好ましいベクターは、pBR322またはpUC18およびpBluesc
ript II (ストレータジェンクローニングシステム
ズ(Stratagene Cloning Systems)社、米国カリフォルニ
ア州）を含めたその誘導体、pACYC177およびpACYC184
(J. Bacteriol., 134: 1141-1156, 1978)およびその誘
導体、ならびにRK2 (C. M. Thomas, Plasmid 5: 10, 19
81)およびRSF1010 (P. Guerryら、J. Bacteriol. 117:
619-630, 1974)などの広宿主域プラスミドに由来するベ
クターのように、通常大腸菌で使用される任意のベクタ
ーから選択できる。本発明のヌクレオチド配列を、グル
コノバクター、アセトバクター、およびP.プチダ(putid
a)を含む細菌で発現させるのに好ましいベクターは、大
腸菌のような好ましいクローニング生物におけると同様
にグルコノバクター、アセトバクター、および/または
P.プチダ（putida）において複製可能な任意のベクター
から選択される。好ましいベクターは、pVK100 (V. C.
Knaufら、Plasmid 8: 45-54, 1982) のようなコスミド
ベクターおよびその誘導体ならびにRSF1010などの広宿
主域ベクターである。クローニングされた遺伝子の安定
かつ効果的な発現のため、およびクローニングされた遺
伝子を有する宿主細胞の効果的な培養のために、ベクタ
ーのコピー数と安定性を注意深く検討する必要がある。
Tn5のような転位因子を含むDNA分子も、所望の遺伝子を
好ましい宿主、特に染色体上に導入するためのベクター
として使用できる。本発明の遺伝子と共に好ましい宿主
から単離される任意のDNAを含むDNA分子も、この遺伝子
を好ましい宿主、特に染色体上に導入するために有用で
ある。かかるDNA分子は、宿主およびDNA分子の性質を考
慮して、例えば、形質転換、形質導入、接合伝達、また
はエレクトロポレーションなどの当技術分野で周知の任
意の常法によって、好ましい宿主に導入することができ
る。

【００５６】有用な宿主には、微生物、哺乳類細胞、お
よび植物細胞などが含まれる。好ましい微生物として
は、大腸菌（Escherichia coli）、シュードモナス・プ
チダ（Pseudomonas putida）、アセトバクター・キシリ
ナム（Acetobacter xylinum）、アセトバクター・パス
ツーリアヌス（Acetobacter pasteurianus）、アセトバ
クター・アセチ（Acetobacter aceti）、アセトバクタ
ー・ハンゼニイ（Acetobacter hansenii）、グルコノバ
クター・アルビダス（Gluconobacter albidus）、グル
コノバクター・カプシュラタス（Gluconobacter capsul
atus）、グルコノバクター・セリヌス（Gluconobacter
cerinus）、グルコノバクター・ジオキシアセトニカス
（Gluconobacter dioxyacetonicus）、グルコノバクタ
ー・グルコニカス（Gluconobacter gluconicus）、グル
コノバクター・インダストリウス（Gluconobacter indu
strius）、グルコノバクター・メラノジーナス（Glucon
obacter melanogenus）、グルコノバクター・ノンオキ
シグルコニカス（Gluconobacternonoxygluconicus）、
グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxyd
ans）、グルコノバクター・オキシダンス・スフェリカ
ス亜種（Gluconobacter oxydans subsp. sphaericu
s）、グルコノバクター・ロゼウス（Gluconobacter ros
eus）、グルコノバクター・ルビギノーザス（Gluconoba
cter rubiginosus）、グルコノバクター・サブオキシダ
ンス（Gluconobacter suboxydans）のような細菌、なら
びに組換えSLDHおよび/またはORF2遺伝子を発現する能
力のある任意の細菌が挙げられる。該微生物の機能的同
等株、継代培養物、変異株、および変種も、本発明で使
用することができる。好ましい株は、大腸菌K12または
その誘導体、P.プチダ（putida）、グルコノバクター、
またはアセトバクターの菌株である。

【００５７】本発明で提供されるSLDHおよび/またはORF
2遺伝子/ヌクレオチド配列を、上述の宿主細胞中で機能
的なプロモーター、リボソーム結合部位、および転写終
結因子のような調節領域を含む適当なベクター中に、当
技術分野で周知の方法により連結することにより、発現
ベクターが作製される。SLDHおよびORF2遺伝子を組み合
わせてクローニングする場合は、この2つの遺伝子を、
同一のプラスミド上に直列にクローニングするか、また
は別々にクローニングすることができ、さらに染色体DN
A上にもクローニングできる。図７および図８に、プラ
スミド上にSLDHおよびORF2遺伝子を組み合わせてクロー
ニングする形式を例示している。また、一方の遺伝子を
プラスミド上にクローニングし、他方の遺伝子を染色体
DNA上にクローニングしてもよい。

【００５８】組換え発現ベクターを有する組換え微生物
を構築するためには、形質転換、形質導入、接合伝達
（「一般的および分子細菌学の方法（Methods for gene
ral and molecular bacteriology）第１４および１５
章」、Philipp Gerhardtら編、American Society for M
icrobiology, 1994）、およびエレクトロポレーション
を含む種々の遺伝子導入方法が使用できる。組換え生物
体の構築方法は、分子生物学の分野で周知の方法から選
択できる。大腸菌、シュードモナス、グルコノバクタ
ー、およびアセトバクターには、通常の形質転換系が使
用できる。大腸菌には形質導入系も使用できる。接合伝
達系は、大腸菌、P.プチダ( putida)およびグルコノバ
クターを含むグラム陽性菌およびグラム陰性菌において
広く使用できる。好ましい接合伝達は、国際公開公報第
89/06688号に開示されている。接合伝達は、液体培地ま
たは固体表面上で実施できる。 SLDHおよび/またはORF2
遺伝子産生の好ましい受容株は、大腸菌、P.プチダ（pu
tida）、グルコノバクター、およびアセトバクターから
選択される。接合伝達の受容株には、通常、選択マーカ
ーが添加される。例えば、ナリジクス酸またはリファン
ピシンへの耐性が通常選択される。天然の耐性も使用で
きる。例えば、ポリミキシンBへの耐性は、多くのグル
コノバクターに有用である。

【００５９】本発明は、組換えSLDHを提供する。本発明
により提供されるSLDH遺伝子を、グルコノバクター属お
よびアセトバクター属などの酢酸菌を含む生物体に導入
することにより、 SLDH酵素の生産収率を増加させるこ
とができる。本発明のSLDH遺伝子を、本発明のORF2遺伝
子と組み合わせて使用することにより、グルコノバクタ
ー以外の微生物でも活性SLDHを生産させることができ
る。組換えSLDHは、固相酵素反応の固相担体上に固定化
することができる。本発明はまた、組換え生物体も提供
する。組換え生物体を用いてD-ソルビトールからL-ソル
ボースを生産することができる。また、SLDH遺伝子を本
発明のORF2遺伝子と組み合わせて導入することにより、
酢酸菌以外の宿主生物でも、D-ソルビトールからL-ソル
ボースを生産することができる。

【００６０】

【実施例】実施例1. SLDHのアミノ酸配列の決定

【００６１】(1) リジルエンドペプチダーゼ処理SLDHポ
リペプチドのN末端アミノ酸配列分析

【００６２】SLDHタンパク質から調製されたペプチド
1、3、および8の部分的アミノ酸配列を決定した（図1：
配列番号：4〜6）。G.サブオキシダンスIFO 3255の精製
SLDH(T. Hoshinoら、欧州特許第728840号）をリジルエ
ンドペプチダーゼで消化した。反応液(25 ml)には、100
mMトリス塩酸緩衝液、pH 9.0中にリジルエンドペプチ
ダーゼ1.2 mM、SLDHタンパク質3 nmolが含まれ、反応は
37℃で15時間行った。得られたペプチド断片をHPLC（カ
ラム：プロテインC-4、VYDAC、米国カリフォルニア州）
により0.1% TFA中、アセトニトリル/イソプロパノール
勾配によって、1.0 ml/minの流速で分離した。ペプチド
の溶出は214 nmのUV吸光度でモニターし、ピーク画分は
手動で採集し、アミノ酸シークエンサー（アプライド・
バイオシステムズ・モデル470A（Applied Biosystems m
odel 470A）、パーキン・エルマー社（Perkin Elmer Co
rp.）、米国コネチカット州）によりN末端アミノ酸配列
分析にかけた。

【００６３】実施例2. PCRによる部分的SLDH遺伝子のク
ローニング

【００６４】G.サブオキシダンスIFO 3255の染色体DN
A、および図1に配列を示す縮重オリゴヌクレオチドDNA
プライマーs7およびs6Rを用いてPCRを実施した。PCR増
幅は熱安定性ポリメラーゼAmplitaq（パーキン・エルマ
ー社（Perkin-Elmer）、ロシュ・モレキュラー・システ
ムズ社（Roche Molecular Systems Inc.）、米国ニュー
ジャージー州）により、サーマルサイクラー（ZYMOREAC
TOR II AB-1820, ATTO、東京）を用いて実行した。PCR
には、供給業者から提供される緩衛液中に以下のものを
含む反応液(50 μl)を使用した：dNTP 200 μM、各プラ
イマー10〜20 pmol（縮重度54〜288）、G.サブオキシダ
ンスIFO 3255の染色体DNA 6 ng、およびDNAポリメラー
ゼ0.5ユニット。反応は、1) 94℃での変性段階1分間；
2) 48℃でのアニーリング段階1分間；3) 72℃での合成
段階2分間を、30サイクル行った。この結果、1.6 kbのD
NAが増幅され、増幅DNA断片を直接連結するための3'-dd
T末端を有する大腸菌ベクターpUC57/T（MBI Fermentas,
リトアニア、ヴィリニュス）にクローニングされ、組
換えプラスミドpMT20が得られた。クローニングされたD
NAはジデオキシ・チェーン・ターミネーション法(F. Sa
ngerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467,
1977)によりヌクレオチド配列を決定した。1.6 kbの断
片は、ペプチド3および8をコードしていた。

【００６５】実施例3. SLDH遺伝子の完全クローニング

【００６６】(1) G.サブオキシダンスIFO 3255の遺伝子
ライブラリーの構築

【００６７】2日間MB寒天培地で培養した細胞から、G.
サブオキシダンスIFO 3255の染色体DNAを調製した。染
色体DNA(160 μg)を500μlの反応液中で20ユニットのEc
oRIにより部分消化した。サンプルの一部を5、10、15、
30、および60分後に採取し、アガロースゲル電気泳動に
より消化の程度を調べた。部分消化されたDNA断片を含
む最初の4回に採取したサンプルを混合し、調製用のゲ
ル電気泳動（アガロース：0.6％）にかけた。15〜35 kb
の断片を切り出し、ゲルから電気的に溶出した。溶出液
を濾過し、-80℃で酢酸ナトリウムおよびエタノールを
用いて沈殿させた。遠心分離によりDNA断片を回収し、1
mM EDTAを含む200μlの10 mMトリス塩酸緩衝液pH 8.0
に懸濁した。

【００６８】並行して、1.8μgのコスミドベクターpVK1
00をEcoRIで完全に消化し、ウシ小腸アルカリ性ホスフ
ァターゼで処理した。線状化し脱リン酸化したpVK100
を、高重合DNAを得るために製造元が推奨する条件下
で、20本のチューブ中、ライゲーションキット（宝酒
造、京都）を用いてG.サブオキシダンスIFO 3255の染色
体DNAの15〜35 kbのEcoRI断片(5μg)と連結させた。そ
の後、製造元(アマーシャム社（Amersham）、日本)の方
法に従って、連結したDNAをインビトロパッケージング
に使用した。得られたファージ粒子を用いてゲノムライ
ブラリーの宿主である大腸菌ED8767を感染させた。この
結果、4,271コロニーが得られ、試験したすべてのコロ
ニー（20コロニー）に、平均約25 kbのサイズの挿入DNA
が含まれていた。

【００６９】(2) 完全なSLDH遺伝子を得るためのコロニ
ーハイブリダイゼーション完全なSLDH遺伝子を有するク
ローンを単離するために、３２P標識した1.6 kbのpMT20
のDNAを用いて、コロニーハイブリダイゼーション法に
より、上述のコスミドライブラリーをスクリーニングし
た。pVK100ベクター中に約25 kbのインサートを有する1
つのクローンが単離され、pSLIIと命名した。pSLIIから
6.2 kbのPstI断片を単離し、pUC18にクローニングして
プラスミドpUSLIIPを得た。pUSLIIPからORF2およびSLDH
遺伝子を含む6.2 kbのPstI断片を単離し、pCRIIベクタ
ー（インビトロゲン社（Invitrogen）、米国カリフォル
ニア州）にサブクローニングしてpCRSLIIPを作製した。
得られたプラスミドから、HindIII-XhoI断片として6.2k
bのPstI断片を含むDNA断片を単離し、pVK100のHindIII
部位とXhoI部位との間にクローニングしてpVKSLIIPを得
た。

【００７０】(3) 大腸菌におけるSLDH遺伝子の発現

【００７１】6.2 kbのPstI断片に目的のSLDHがコードさ
れているかどうか確認するために、pUSLIIPを有する大
腸菌JM109細胞を、上述のように抗SLDH抗体を用いたウ
ェスタンブロット分析にかけた。分子量が約80 kDaの免
疫陽性タンパク質が形質転換細胞で観察され、このこと
からPstI断片が完全なSLDHの分子量 (79 kDa +/- 0.5 k
Da)を有するポリペプチドをコードしていることが示さ
れた。

【００７２】(4) SLDH活性の相補性に関する試験用株と
してのSLDH欠損グルコノバクター26A11株の作製

【００７３】G.メラノジーナス（melanogenus）IFO 329
3を親株として、トランスポゾンTn5による変異誘発を行
った。KmｒをコードするトランスポゾンTn5は、宿主生
物のDNA上で無作為にヌル（欠損）変異を誘発するた
め、グラム陰性細菌における突然変異源として広く使用
されている。IFO 3293を親株として選択したのは、以下
の理由による：(i) この株はD-ソルビトールからL-ソル
ボースを生産した、(ii) G.サブオキシダンス（suboxyd
ans）IFO 3255から精製されたSLDHに対して調製された
抗体を用いたウェスタンブロット分析で、約80 kDaの免
疫陽性ポリペプチドを示した、および(iii) Tn5変異体
を生成する頻度が、G.サブオキシダンス（suboxydans）
IFO 3255よりもはるかに高かった。

【００７４】G.メラノジーナス（melanogenus）IFO 329
3は、25 g/lのマンニトール、5 g/lの酵母抽出物(ディ
フコ・ラボラトリーズ社（Difco Laboratories）)、3 g
/l のバクトペプトン(Difco)を含むMB培地5 mlを入れた
試験管にて30℃で一晩培養した。大腸菌HB101 (pRK201
3) [D.H. Figurski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1
648-1652, 1979]および大腸菌HB101 (pSUP2021) [R. Si
monら、BIO/TECHNOL.1:784-791, 1983]は、50μg/mlの
カナマイシンを含むLB培地5 mlを入れた試験管にて、37
℃で一晩培養した。細胞は遠心分離によりそれぞれ別々
に回収し、半分量のMB培地に懸濁した。各細胞懸濁液を
1:1:1の比で混合し、混合液をMB寒天プレート表面上の
ニトロセルロースフィルター上に置いた。プレートを27
℃で一晩インキュベートし、フィルター上に得られた細
胞をかき取り、適当な容量のMB培地に懸濁し、10μg/ml
のポリミキシンBおよび50μg/mlのカナマイシンを含むM
Bの選択プレート(MPKプレート)上に播種した。MPKプレ
ートを27℃で3〜4日間インキュベートした。

【００７５】得られた3,436のTn5変異体を、抗SLDH抗体
を用いた免疫ドットブロットスクリーニングにかけた。
96穴マイクロタイタープレートで、各株の細胞を、62.5
mMトリス塩酸(pH 6.5)、10％グリセロール、2％SDSお
よび5％βメルカプトエタノールよりなるラムリ（Laemm
li）緩衝液50μl中に別々に懸濁し、60℃で2時間インキ
ュベートした。無細胞抽出液(CFE)をニトロセルロール
フィルター上に押し付け、CFE中の免疫陽性サンプルをA
P結合基質キット(バイオ-ラッド・ラボラトリーズ社（B
io-RAD Laboratories）、米国カリフォルニア州リッチ
モンド）を用いてスクリーニングした。その結果、免疫
ドットブロットスクリーニングで、陽性シグナルのない
唯一の株26A11が得られた。

【００７６】26A11株のSLDH欠損は、ウェスタンブロッ
ト分析で確認された。親株と比較して、発現するSLDHの
量は、せいぜい1/500だった。26A11は完全なSLDH欠損株
ではなく、Tn5の挿入によりSLDH遺伝子が抑制された株
であった。Tn5挿入点付近のヌクレオチド配列を決定す
ることにより、挿入部位がC末端に近いことが判明し
た。次に、26A11と野生型のグルコノバクター株の総SLD
H活性を調べるために、休止菌体反応を実施した。2％D-
ソルビトールを含む100 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.
0)中で、26A11はわずかにD-ソルビトールをL-ソルボー
スに変換したが、野性株IFO 3293およびIFO 3255は30℃
で39.5時間のうちに完全に変換した。

【００７７】(5) 26A11におけるSLDH遺伝子の発現

【００７８】得られたSLDHクローンのSLDH活性を確認す
るため、相補性試験を行った。プラスミドpSLIIおよびp
VKSLIIPを接合伝達により26A11に導入した。pSLIIまた
はpVKSLIIPを有する接合伝達体は、ミニ休止菌体反応で
SLDH活性を回復し、ウェスタンブロット分析で約80 kDa
の免疫反応性ポリペプチドを示した。

【００７９】(6) SLDH遺伝子のヌクレオチド配列決定

【００８０】プラスミドpUSLIIPを用いてSLDHおよびORF
2遺伝子のヌクレオチド配列を決定した。決定したヌク
レオチド配列（配列番号：1、3,481 bp）により、SLDH
遺伝子のORF（2,223 bp、配列番号：1のヌクレオチド57
2〜2794位）に、740アミノ酸残基のポリペプチド（配列
番号：2）がコードされていることが明らかになり、そ
のポリペプチド中には、精製されたSLDHポリペプチド
から決定された3つのアミノ酸配列（配列番号4〜6中に
示されているペプチド1、3、および8）が含まれてい
た。図2および図3〜6に示すように、SLDH ORFの他に
も、もう1つのORFであるORF2がSLDH ORFがすぐ上流に見
つかった。ORF2のORF（381 bp、配列番号：1のヌクレオ
チド192〜572位）には、126アミノ酸残基のポリペプチ
ド（配列番号：3）がコードされていた。

【００８１】ペプチド1の4番目のアミノ酸は、アミノ酸
シークエンサーではGluと決定されたが、DNA配列による
とAlaであった。ペプチド3の11番目のアミノ酸はアミノ
酸シークエンサーではGlnと決定されたが、DNA配列によ
るとProだった。推定アミノ酸配列にはシグナルペプチ
ド様領域（配列番号：8）が含まれている可能性があ
る：これには (i) 多くの疎水性残基、(ii) N末端付近
に正に荷電した残基、および (iii) 切断されるシグナ
ルとしてAla-Xaa-Ala部位が含まれている。実際のシグ
ナル配列は、実施例3(7)に説明されるようにして決定し
た。SLDH遺伝子の推定されるリボソーム結合部位（シャ
イン・ダルガーノ、SD配列）は、開始コドンの8 bp上流
に見つかった（配列番号：1のヌクレオチド558〜564位
のAGAGGAG）。ORF2遺伝子の推定SD配列は、開始コドン
の10 bp上流に見つかった（配列番号：1のヌクレオチド
177〜182位のGGGAGG）。図3〜6に示すように、 SLDH構
造遺伝子のすぐ下流に、いくつかの逆方向反復配列（ヌ
クレオチド配列2803〜2833位および2838〜2892位）があ
った。これはSLDH遺伝子の転写終結ループとして機能し
ている可能性がある。ORF2遺伝子には、逆方向反復配列
が684〜704位に見つかった。

【００８２】mpBlast（NCBI、米国メリーランド州ベセ
スダ）およびGCGのモチーフ（ジェネティクス・コンピ
ュータ・グループ（Genetics Computer Group）、米国
ウィスコンシン州ユニバーシティ・リサーチ・パーク）
のプログラムを用いて、SLDHとORF2の相同性を調査し
た。SLDHポリペプチドには、キノタンパク質に一般的に
保存されているC末端付近の領域の配列（配列番号2のア
ミノ酸残基632〜692位）と、キノタンパク質モチーフと
して同定されているもう1つの配列（Prosite No. PS003
63: [DN]W.{3}G[RK].{6}[FY]S.{4}[LIVM]N.{2}NV.{2}L
[RK]；配列番号：2のアミノ酸残基79〜107位）があっ
た。

【００８３】ORF2は、G.オキシダンス（oxydans）、大
腸菌、アシネトバクター・カルコアセチカス（Acinetob
acter calcoaceticus）の膜結合型PQQ依存性Dグルコー
スデヒドロゲナーゼ(GDH)のN末端領域と相同性を示し
た。この領域は、GDHを膜に結合させる膜貫通領域（mem
brane-spanning region）であることが知られている。
G.オキシダンス、大腸菌、アシネトバクター・カルコア
セチカス（Acinetobacter calcoaceticus）のGDHのN末
端領域とORF2との同一性は、それぞれ30％、32％、およ
び37％であった。ORF2タンパク質は、SLDHを膜結合型に
する接着タンパク質として機能している可能性がある。

【００８４】実施例４. 成熟SLDHポリペプチドのN末端
およびC末端配列の決定

【００８５】N末端を直接的に配列決定しても、結果は
得られず、N末端がブロックされていることが示され
た。そこで、 SLDHポリペプチドを、基質対酵素の比率
を20:1 (w/w)として、0.1 Mトリス塩酸中、エンドプロ
テイナーゼLys-C（和光、大阪）を用いて37℃で20時間
処理した。全消化物を逆相HPLC（RP300、1 mm x 25 c
m、アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosyst
ems）、カリフォルニア州フォスターシティ）で分析
し、各ピークを分子量決定のために質量分析計（TSQ700
3重4極装置、Finnigan-MAT、カリフォルニア州サンホ
ゼ）にかけた。配列番号：7として示した一つの消化物
は、質量分析、ならびにアミノ酸組成分析と配列番号：
1として示されている決定済みヌクレオチド配列から予
測されるアミノ酸組成とを合わせて、N末端配列と決定
された。さらに、衝突誘導解離(CID：collisional indu
ced dissociation)による分析で、N末端配列を有するペ
プチドの同定が確認された。N末端は、ピログルタミン
酸残基であると決定された。

【００８６】SLDHのN末端は、配列番号：7に示されるよ
うに、Gln-Phe-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Glu-Pro-
Ser-Ser-Ser-Val-Pro-Gly-Pro-Gly-Asn-Ala-Ser-Glu-Pr
o-Thr-Glu-Asn-Ser-Pro-Lysであると決定されたため、
シグナル配列は、配列番号：8に示されるように、Met-A
rg-Arg-Pro-Tyr-Leu-Leu-Ala-Thr-Ala-Ala-Gly-Leu-Ala
-Leu-Ala-Cys-Ser-Pro-Leu-Ile-Ala-His-Alaの配列の24
アミノ酸残基であると確認された。V8プロテアーゼ消化
により回収されたペプチドを用いて、C末端配列もPro-A
sp-Ala-Ile-Lys-Gln（配列番号：9）であると決定され
た。

【００８７】実施例5. 大腸菌におけるSLDHおよび/また
はORF2遺伝子の発現

【００８８】実施例3(2)に記述されるpCRSLIIPから、図
７に示されるように、lacプロモーターの制御下でSLDH
遺伝子を持ち、ORF2遺伝子を有するプラスミドと持たな
いプラスミドを作製した。得られた3種類のプラスミド
は、SLDHとORF2遺伝子とを有するpTNB114、SLDHとリボ
ソーム結合部位および開始コドン(ATG)を含むN末端が切
除されているORF2遺伝子とを有するpTNB115、ならびに
大部分が切除されたORF2遺伝子と完全なSLDH遺伝子とを
有するpTNB116である。これらの3つのプラスミドを、通
常の形質転換法により大腸菌に導入した。得られた形
質転換細胞の無細胞抽出物のウェスタンブロット分析に
より、SLDHポリペプチドの生産が検出され、そのSLDH活
性を休止菌体を用いて測定した。休止菌体反応は、0.3%
NaCl、1% CaCO３、4% D-ソルビトール、および1 mM PM
Sからなる反応液中で、1μg/ml PQQの存在下および非存
在下で、室温にて17時間行った。L-ソルボースを生産す
るためのSLDH活性は、展開溶媒としてn-プロパノール-H
２O-1% H３PO４-HCOOH (400:100:10:1)を、スプレー試
薬としてナフトレゾルシノールを用いて、シリカゲル60
F２５４、0.25 mm、メルク社（Merck）によるTLCによ
って分析した。その結果、ウェスタンブロット分析では
ORF2遺伝子を発現しない形質転換細胞も含めてすべての
形質転換細胞でSLDHポリペプチドが検出されたが、L-ソ
ルボースを生産するためのSLDH活性は、PQQの存在下で
の休止菌体反応の条件下で完全なORF2遺伝子を含むpTNB
114を有する形質転換細胞でのみ検出された。

【００８９】実施例6. 大腸菌におけるSLDHおよび/また
はORF2遺伝子の発現

【００９０】図８にpTNB110およびpTNB143の作製段階を
示す。DSM4025（T. Hoshinoら、欧州特許出願第961150
0.8号）の酵素A (pA)遺伝子のプロモーターの制御下にO
RF2およびSLDH遺伝子を有するプラスミドpTNB110は、pA
を含むHindIII-KpnI断片とpTNB114のKpnI-XhoI断片を、
pUC18のHindIII-XhoIの間に挿入して作製した。ORF2とS
LDH遺伝子を独立した発現ユニットとして有する、すな
わち、pAを有するORF2遺伝子とpAを有するSLDH遺伝子と
を有する、プラスミドpTNB143は、図８に示すように、p
TNB141の0.9 kb SalI断片およびpTNB135の3.2 kbのHind
III-XhoI断片を、pUC57/pCRIIハイブリッドベクター（p
UC57由来のplacを有するScaI-HindIII断片およびpCRII
由来のplacを持たないXhoIからScaIの断片）に挿入して
作製した。これらのプラスミドpTNB110およびpTNB143
を、通常の形質転換法により大腸菌に導入した。得られ
た形質転換細胞について、実施例5に説明されるように
ウェスタンブロット分析および休止菌体反応を行った。
その結果、pTNB110およびpTNB143を有する両方の形質転
換細胞とも、SLDHタンパク質を生産し、PQQの存在下でD
-ソルビトールからL-ソルボースを生産するSLDH活性を
示した。

【００９１】実施例7. G.オキシダンスDSM 4025におけ
るSLDH遺伝子の発現

【００９２】強いL-ソルボースおよびLソルボソンデヒ
ドロゲナーゼ活性と、L-ソルボースを生産する弱いD-ソ
ルビトールデヒドロゲナーゼ活性とを有するG.オキシダ
ンスDSM 4025においてSLDH遺伝子を発現させるためのプ
ラスミドpTNB136は、pTNB135（図８）のHindIII-XhoI断
片を、pVK100のHindIII部位とXhoI部位との間に挿入し
て作製した。プラスミドpTNB136およびそのベクターpVK
100は、接合伝達によりG.オキシダンスDSM 4025の変異
体であるGOBΔKに導入した。GOBΔKでは、L-ソルボース
を生産するD-ソルビトールデヒドロゲナーゼ活性を有す
る酵素B（欧州特許第832 974号）の遺伝子の欠失が、酵
素B遺伝子を含む2つのEcoRI遺伝子とカナマイシン耐性
遺伝子カセット（pUC4Kの1.28 kbのEcoRI断片；ファー
マシア社（Pharmacia）、スウェーデン、ウプサラ）と
の置換によって起こっている。この遺伝子の破壊は、当
技術分野で周知の組換えDNA技術によって行った。得ら
れた接合伝達体、PTNB136またはpVK100を有するGOBΔK
は、30℃で4日間フラスコで発酵（培地：10% D-ソルビ
トール、1.6%尿素、0.05%グリセロール、0.25% MgSO４
・7H２O、3%コーンスティープリカー、6.25%パン酵母湿
潤細胞、および1.5% CaCO３）させたところ、10% D-ソ
ルビトール中、それぞれ5 g/Lまたは2 g/l未満の2KGAが
生産された。抗SLDH抗体を用いたウェスタンブロット分
析により、pTNB136を有する接合伝達体が免疫反応性SLD
Hポリペプチドを発現していることが明らかとなった。

【００９３】

【発明の効果】本発明により、下記の(a)または(b)によ
って規定される、ソルビトールデヒドロゲナーゼ活性を
有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むDN
A、該DNAを含むベクター、該ベクターにより形質転換さ
れた宿主、該蛋白質の調製方法、およびそれらの使用が
提供された：

【００９４】(a)配列番号：2に記載された配列の1位か
ら716位までのアミノ酸配列を有する蛋白質、または

【００９５】(b)(a)で規定されたアミノ酸配列における
1つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入もし
くは付加によって(a)の蛋白質から得られる蛋白質。

【００９６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> F.HOFFMANN-LA ROCHE AG <120> D-Sorbitol dehydrogenase gene <130> RC-003 <150> EP 97114432.4 <151> 1997-8-21 <160> 9 <170> MS word ver 5.1a <210> 1 <211> 3481 <212> DNA <213> Gluconobacter suboxydans <220> <221> CDS <222> (192)...(572) <220> <221> CDS <222> (572)...(2794) <223> Strain : IFO 3255 <400> 1 acaaatcata ctggcggcgc tgtagtgaca attccggcgg gttaaagaga atattttttt 60 ggtgacaggc cacaacaaat ttttgttacc tcaaacacag ttttgttaga gcatttgaaa 120 acgaagtccg atggacctga actgaatatg gatttaccgt ccggaggatt cagtttggga 180 ggcattcggt tatgccaaat cttcaaggta ataggactct gacggagtgg ctgacgctgc 240 ttctcggggt catcgtcctt cttgtgggcc tgttcttcgt cattgggggt gctgacctcg 300 cgatgctggg cggctctacc tactatgttc tctgtggcat cctcctggtt gctagcggcg 360 tattcatgct catgggccgc acgcttggtg ccttcctgta tctgggtgcc ctggcctaca 420 cgtgggtctg gtccttctgg gaagtcggtt tcagccccat cgatcttctg ccccgcgctt 480 tcggcccgac catccttggc attctcgttg ccctgaccat tccggtcctg cgccgcatgg 540 aaagccgtcg tactctcaga ggagccgtct gatgcgccgg ccttaccttc tagcaacagc 600 cgcaggactc gcccttgcct gttcgccgct catcgctcat gcacagtttg ctcccgcagg 660 ggctggcggc gaaccttcct cgtcagttcc tgggccagga aatgcgagcg agcccaccga 720 aaactctccg aaaagtcaga gctacttcgc aggaccgtcg ccctatgccc cgcaggctcc 780 tggcgtaaac gcagccaacc tgccggacat tgagtcaatc gatccctcgc aggtcccggc 840 catggctccg cagcagagtg ccaatccggc acgtggagac tgggttgctt acggacgtga 900 cgatcatcag acgcgatact ctccgctttc ggaaatcacg cctgagaacg caagcaagct 960 caaggtcgct ttcgtctacc acacggggag ttatccgcgt ccgggacagg tgaacaaatg 1020 ggccgccgaa accacgccga tcaaggttgg tgacggtctc tacacatgtt ccgccatgaa 1080 cgacatcatc aagctggatc cggctacggg taagcagatc tggcgtcgga acgtggatgt 1140 caaataccac tccattccct ataccgctgc ctgtaagggt gtgacgtatt tcacgtcctc 1200 cgtggtgccg gaaggccagc cctgccacaa tcgccttatc gaaggcacgc tggatatgcg 1260 tctgattgcg gttgacgcgg agacagggga tttctgccct aatttcggtc atggtggtca 1320 ggtcaacctg atgcagggtc tgggtgagtc tgttccgggc ttcgtctcca tgacggcacc 1380 tccaccggtc atcaacggcg tcgtggttgt aaaccacgaa gtgctcgacg gtcagcgccg 1440 ctgggctccg tccggtgtga tccgtggtta cgatgctgaa agtggcaaat tcgtatgggc 1500 ctgggacgtc aacaattccg gacgatcaca gccagcctac cgggtaaccg tcattacagc 1560 cgtggaacgc cgaattcctg ggctacctga caggcgacaa cgaggagggt ctcgtttacg 1620 tcccgacagg aactctgctg ctgactatta cagcgccctg cgtagtgatg ctgaaaacaa 1680 ggtgtcctcc gctgttgtcg ccattgacgt caagacgggt tctccgcgct gggtcttcca 1740 gacggctcat aaggacgtct gggattatga catcggttca caggcgaccc tgatggatat 1800 gcctggcccg gatggccaga cggttcctgc tctcatcatg ccgaccaagc gtggccagac 1860 gttcgtgctt gaccgtcgta ccggcaagcc aattctgccg gttgaagaac gcccagctcc 1920 gtcccctggt gttattccgg gtgacccgcg ttctccgacg cagccatggt ccgtcgggat 1980 gccggccctt cgcgtgccgg atctgaaaga gacagacatg tggggtatgt cccccatcga 2040 tcagctcttc tgccgtatca agttccgccg tgcgaactat gtgggtgagt tcacaccacc 2100 gagcgttgac aagccgtgga ttgaatatcc gggctataac ggtggcagtg actggggctc 2160 catgtcctat gatccgcagt ccggcatcct gattgcgaac tggaacatca caccgatgta 2220 cgaccagctc gtaacccgca agaaggcaga ctccctcggc ctgatgccga tcgatgaccc 2280 caacttcaag ccaggtggcg gtggtgccga aggtaacggc gccatggacg gaacgcctta 2340 cggtatcgtc gtgacaccgt tctgggatca gtacacgggc atgatgtgca accgtccgcc 2400 ctacggtatg atcacagcca tcgacatgaa gcacggccag aaggttctgt ggcagcatcc 2460 gctcggaacg gctcgcgcca acggtccatg gggtctgcca acaggtctgc catgggaaat 2520 cggcactccg aacaatggtg gttcggttgt gaccggtggc ggtctgatct tcatcggtgc 2580 ggcaacggat aaccagatcc gcgcgattga tgaacacact ggcaaggttg tctggagcgc 2640 agtcctcccc ggcggcggtc aggccaatcc gatgacgtat gaagccaatg gtcaccagta 2700 cgttgccatc atggctggcg gtcatcactt catgatgacg ccagtgtctg accagcttgt 2760 ggtttacgca ctgccggatg ccatcaagca gtaattaagt cctgtggcgg atgtgtcatg 2820 catatccgcc acactccatc gtcagaagga gactttcgtg ctagccatgc agggaagtct 2880 ccttttgacg tttttggctc tttccagcga gcgggcagtc tgaaacgggg cttcgtctgg 2940 ctcgtacttt cagaatggct cgtcgcaccc tcatgactgc ccactccccc gttatcttgc 3000 aggttctgcc agccctcagc acgggcggcc tggagcgggg agctattgaa attgcggctg 3060 ccatcacaca ggctggtggc aaggccattg tcgcttcgaa gacgggtcct cttcttgtgc 3120 aactccgcca cgtcggagca gtgcatgtgc cgctggatct caaatcgaaa tcgccgtttt 3180 ctgttcggcg ccgtgcccgt gaactccaga aactgatccg ggagcagcag gttgatctgg 3240 ttcacgcccg gtcccgtatt ccggcatggg ccgcctggct cgcctgccgc cgcgagaaca 3300 ttcctttcgt gacaacgtgg catggcgtcc acgaggctgg ctggtggggc aagaaattct 3360 acaattcggt gctggcccgg ggtgcaaggg tcatcgcaat ttcgcactac atttccgggc 3420 gtctttcagg gcagtacggc gttcaggcag atcgtcttcg aaccattccg cgtggtgccg 3480 a <210> 2 <211> 740 <212> PRT <213> Gluconobacter suboxydans <220> <221> sig peptide <222> (-24)...(-1) <220> <221> mat peptide <222> (1)...(716) <223> Strain : IFO 3255 <400> 2 Met Arg Arg Pro Tyr Leu Leu Ala Thr Ala Ala Gly Leu Ala Leu -24 -20 -15 -10 Ala Cys Ser Pro Leu Ile Ala His Ala Gln Phe Ala Pro Ala Gly -5 1 5 Ala Gly Gly Glu Pro Ser Ser Ser Val Pro Gly Pro Gly Asn Ala 10 15 20 Ser Glu Pro Thr Glu Asn Ser Pro Lys Ser Gln Ser Tyr Phe Ala 25 30 35 Gly Pro Ser Pro Tyr Ala Pro Gln Ala Pro Gly Val Asn Ala Ala 40 45 50 Asn Leu Pro Asp Ile Glu Ser Ile Asp Pro Ser Gln Val Pro Ala 55 60 65 Met Ala Pro Gln Gln Ser Ala Asn Pro Ala Arg Gly Asp Trp Val 70 75 80 Ala Tyr Gly Arg Asp Asp His Gln Thr Arg Tyr Ser Pro Leu Ser 85 90 95 Glu Ile Thr Pro Glu Asn Ala Ser Lys Leu Lys Val Ala Phe Val 100 105 110 Tyr His Thr Gly Ser Tyr Pro Arg Pro Gly Gln Val Asn Lys Trp 115 120 125 Ala Ala Glu Thr Thr Pro Ile Lys Val Gly Asp Gly Leu Tyr Thr 130 135 140 Cys Ser Ala Met Asn Asp Ile Ile Lys Leu Asp Pro Ala Thr Gly 145 150 155 Lys Gln Ile Trp Arg Arg Asn Val Asp Val Lys Tyr His Ser Ile 160 165 170 Pro Tyr Thr Ala Ala Cys Lys Gly Val Thr Tyr Phe Thr Ser Ser 175 180 185 Val Val Pro Glu Gly Gln Pro Cys His Asn Arg Leu Ile Glu Gly 190 195 200 Thr Leu Asp Met Arg Leu Ile Ala Val Asp Ala Glu Thr Gly Asp 205 210 215 Phe Cys Pro Asn Phe Gly His Gly Gly Gln Val Asn Leu Met Gln 220 225 230 Gly Leu Gly Glu Ser Val Pro Gly Phe Val Ser Met Thr Ala Pro 235 240 245 Pro Pro Val Ile Asn Gly Val Val Val Val Asn His Glu Val Leu 250 255 260 Asp Gly Gln Arg Arg Trp Ala Pro Ser Gly Val Ile Arg Gly Tyr 265 270 275 Asp Ala Glu Ser Gly Lys Phe Val Trp Ala Trp Asp Val Asn Asn 280 285 290 Ser Gly Arg Ser Gln Pro Ala Tyr Arg Val Thr Val Ile Thr Ala 295 300 305 Val Glu Arg Arg Ile Pro Gly Leu Pro Asp Arg Arg Gln Arg Gly 310 315 320 Gly Ser Arg Leu Arg Pro Asp Arg Asn Ser Ala Ala Asp Tyr Tyr 325 330 335 Ser Ala Leu Arg Ser Asp Ala Glu Asn Lys Val Ser Ser Ala Val 340 345 350 Val Ala Ile Asp Val Lys Thr Gly Ser Pro Arg Trp Val Phe Gln 355 360 365 Thr Ala His Lys Asp Val Trp Asp Tyr Asp Ile Gly Ser Gln Ala 370 375 380 Thr Leu Met Asp Met Pro Gly Pro Asp Gly Gln Thr Val Pro Ala 385 390 395 Leu Ile Met Pro Thr Lys Arg Gly Gln Thr Phe Val Leu Asp Arg 400 405 410 Arg Thr Gly Lys Pro Ile Leu Pro Val Glu Glu Arg Pro Ala Pro 415 420 425 Ser Pro Gly Val Ile Pro Gly Asp Pro Arg Ser Pro Thr Gln Pro 430 435 440 Trp Ser Val Gly Met Pro Ala Leu Arg Val Pro Asp Leu Lys Glu 445 450 455 Thr Asp Met Trp Gly Met Ser Pro Ile Asp Gln Leu Phe Cys Arg 460 465 470 Ile Lys Phe Arg Arg Ala Asn Tyr Val Gly Glu Phe Thr Pro Pro 475 480 485 Ser Val Asp Lys Pro Trp Ile Glu Tyr Pro Gly Tyr Asn Gly Gly 490 495 500 Ser Asp Trp Gly Ser Met Ser Tyr Asp Pro Gln Ser Gly Ile Leu 505 510 515 Ile Ala Asn Trp Asn Ile Thr Pro Met Tyr Asp Gln Leu Val Thr 520 525 530 Arg Lys Lys Ala Asp Ser Leu Gly Leu Met Pro Ile Asp Asp Pro 535 540 545 Asn Phe Lys Pro Gly Gly Gly Gly Ala Glu Gly Asn Gly Ala Met 550 555 560 Asp Gly Thr Pro Tyr Gly Ile Val Val Thr Pro Phe Trp Asp Gln 565 570 575 Tyr Thr Gly Met Met Cys Asn Arg Pro Pro Tyr Gly Met Ile Thr 580 585 590 Ala Ile Asp Met Lys His Gly Gln Lys Val Leu Trp Gln His Pro 595 600 605 Leu Gly Thr Ala Arg Ala Asn Gly Pro Trp Gly Leu Pro Thr Gly 610 615 620 Leu Pro Trp Glu Ile Gly Thr Pro Asn Asn Gly Gly Ser Val Val 625 630 635 Thr Gly Gly Gly Leu Ile Phe Ile Gly Ala Ala Thr Asp Asn Gln 640 645 650 Ile Arg Ala Ile Asp Glu His Thr Gly Lys Val Val Trp Ser Ala 655 660 665 Val Leu Pro Gly Gly Gly Gln Ala Asn Pro Met Thr Tyr Glu Ala 670 675 680 Asn Gly His Gln Tyr Val Ala Ile Met Ala Gly Gly His His Phe 685 690 695 Met Met Thr Pro Val Ser Asp Gln Leu Val Val Tyr Ala Leu Pro 700 705 710 Asp Ala Ile Lys Gln 715 716 <210> 3 <211> 126 <212> PRT <213> Gluconobacter suboxydans <220> <221> mat peptide <222> (1)...(126) <223> Strain : IFO 3255 Fragment : Internal fragment <400> 3 Met Pro Asn Leu Gln Gly Asn Arg Thr Leu Thr Glu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gly Val Ile Val Leu Leu Val Gly Leu Phe Phe Val 20 25 30 Ile Gly Gly Ala Asp Leu Ala Met Leu Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr 35 40 45 Val Leu Cys Gly Ile Leu Leu Val Ala Ser Gly Val Phe Met Leu 50 55 60 Met Gly Arg Thr Leu Gly Ala Phe Leu Tyr Leu Gly Ala Leu Ala 65 70 75 Tyr Thr Trp Val Trp Ser Phe Trp Glu Val Gly Phe Ser Pro Ile 80 85 90 Asp Leu Leu Pro Arg Ala Phe Gly Pro Thr Ile Leu Gly Ile Leu 95 100 105 Val Ala Leu Thr Ile Pro Val Leu Arg Arg Met Glu Ser Arg Arg 110 115 120 Thr Leu Arg Gly Ala Val 125 126 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Gluconobacter suboxydans <220> <223> Strain : IFO 3255 Fragment : Internal fragment <400> 4 Lys Trp Ala Glu Glu Thr Xaa Pro 1 5 8 <210> 5 <211> 24 <212> PRT <213> Gluconobacter suboxydans <220> <223> Strain : IFO 3255 Fragment : Internal fragment <400> 5 Lys Ser Gln Ser Tyr Phe Ala Gly Pro Ser Gln Tyr Ala Pro Gln 1 5 10 15 Ala Pro Gly Val Asn Ala Xaa Asn Leu 20 24 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Gluconobacter suboxydans <220> <223> Strain : IFO 3255 Fragment : Internal fragment <400> 6 Lys Val Leu Trp Gln His Pro Leu Gly Thr Ala Arg Xaa Asn Gly 1 5 10 15 Pro 16 <210> 7 <211> 30 <212> PRT <213> Gluconobacter suboxydans <220> <223> Strain : IFO 3255 Fragment : N terminal fragment <400> 7 Gln Phe Ala Pro Ala Gly Ala Gly Gly Glu Pro Ser Ser Ser Val 1 5 10 15 Pro Gly Pro Gly Asn Ala Ser Glu Pro Thr Glu Asn Ser Pro Lys 20 25 30 <210> 8 <211> 24 <212> PRT <213> Gluconobacter suboxydans <220> <221> sig peptide <222> (1)...(24) <223> Strain : IFO 3255 <400> 8 Met Arg Arg Pro Tyr Leu Leu Ala Thr Ala Ala Gly Leu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Cys Ser Pro Leu Ile Ala His Ala 20 24 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Gluconobacter suboxydans <220> <223> Strain : IFO 3255 Fragment : C terminal fragment <400> 9 Pro Asp Ala Ile Lys Gln 1 5 6

【図面の簡単な説明】

【図１】 SLDHポリペプチドおよびオリゴヌクレオチド
の部分的アミノ酸配列を示す図である。図中の太字のア
ミノ酸配列は、PCR用の2つのオリゴヌクレオチド配列
（S7およびS6R）の合成に使用した。矢印はDNA合成の方
向を示す。すべてのプライマーはグルコノバクターのコ
ドン使用の偏向を有する縮重DNA混合物である。

【図２】本発明でクローニングされたSLDH遺伝子の制
限酵素地図、ならびにSLDHおよびORF2をコードするDNA
領域の遺伝子構造を示す図である。

【図３】図３〜６は、SLDHおよびORF2をコードするヌ
クレオチド配列をその上流および下流の配列と共に示し
たものであり、図３では、このヌクレオチド配列1位か
ら900位までと共に、対応するSLDHおよびORF2の推定ア
ミノ酸配列を示している。さらに、SLDHおよびORF2遺伝
子で推測されるリボソーム結合部位（SD配列）、転写終
結因子と考えられる配列も示されている。なお、点線部
はペプチド３の配列、図中の矢印で示したIR1は、ORF2
遺伝子の転写終結因子と考えられる逆方向反復配列であ
る。

【図４】 SLDHおよびORF2をコードするヌクレオチド配
列をその上流および下流の配列と共に示したものの一部
（ヌクレオチド配列901位から1800位まで）で、それと
共に対応するSLDHの推定アミノ酸配列を示している。さ
らに、点線部はペプチド１の配列を示している。

【図５】 SLDHおよびORF2をコードするヌクレオチド配
列をその上流および下流の配列と共に示したものの一部
（ヌクレオチド配列1801位から2700位まで）で、それと
共に対応するSLDHの推定アミノ酸配列を示している。さ
らに、点線部はペプチド８の配列を示している。

【図６】 SLDHおよびORF2をコードするヌクレオチド配
列をその上流および下流の配列と共に示したものの一部
（ヌクレオチド配列2701位から3481位まで）で、それと
共に対応するSLDHの推定アミノ酸配列を示している。な
お、図中の矢印で示したIR2（またはIR2'）は、SLDH遺
伝子の転写終結因子と考えられる逆方向反復配列であ
る。

【図７】 lacプロモーターの制御下で大腸菌においてS
LDHおよび/またはORF2遺伝子を発現させるためのプラス
ミドpTNB114、pTNB115およびpTNB116の作製段階を示す
図である。pTNB115の作製段階において、リボソーム結
合部位と開始コドンATGとを含む領域を切除したためORF
2は発現しない。

【図８】共通のpAプロモーターの制御下にORF2および
SLDH遺伝子を有するプラスミドpTNB110（以下実施例6に
説明）、ならびに上流に隣接して位置するpAの制御下の
ORF2遺伝子と上流に隣接して位置する別のpAプロモータ
ーの制御下のSLDH遺伝子とを有するプラスミドpTNB143
の作製段階を示す図である。なお、＊１、＊２、および＊３は以下の注釈を意味す
る。＊１以下のプライマー対を用いたPCRにより、DSM4025
の酵素A遺伝子のプロモーター(pA)を、該遺伝子を有す
るDNA断片、例えば、DSM4025自身の染色体DNAまたはpSS
A202(T. Hoshinoら, 欧州特許出願第9611500.8号)か
ら、pUC18のHindIII-BamHI部位へクローニングし、pUCA
Ｐを作成した。 5'-CCAAGCTTATCGCCGCGTTTGTCAT-3' 5'-CCGGATCCGGTTGGTGCAGCGGTCA-3' ＊２以下のプライマー対を用いたPCRにより、DSM4025
の酵素A遺伝子のプロモーターからシグナル配列まで
を、pSSA202よりサブクローニングした。 5'-CCAAGCTTATCGCCGCGTTTGTCAT-3' 5'-GCTAGCAAAGGCGGGTGCGG-3' ＊３以下のプライマー対を用いて、pTNB110に対してP
CRを行った。 5'-GTCGACATCGCCGCGTTTGTCA-3' 5'-GCCGGCGCACTAGACGGCTCC-3'

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:02） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:02） (Ｃ１２Ｐ 19/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者尾島せつ子神奈川県藤沢市善行団地３−22−304 (72)発明者新城雅子神奈川県鎌倉市台５−５−30 (72)発明者富山哲史神奈川県藤沢市川名１−１−27−305

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の(a)または(b)によって規定され
る、ソルビトールデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質
をコードするヌクレオチド配列を含むDNA： (a) 配列番号：2に記載された配列の1位から716位まで
のアミノ酸配列を有する蛋白質、または (b) (a)で規定されたアミノ酸配列における1つまたはそ
れ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加によ
って(a)の蛋白質から得られる蛋白質。
【請求項２】酢酸菌に属する微生物のソルビトールデ
ヒドロゲナーゼをコードする、請求項1記載のDNA。
【請求項３】微生物がグルコノバクター属またはアセ
トバクター属に属する、請求項2記載のDNA。
【請求項４】 (c) 配列番号：1に示された配列の644位
から2791位まで、または572位から2791位までのヌクレ
オチド配列を含むDNA、および (d) (c)で規定されたDNAとのハイブリダイゼーションが
可能であって、請求項1の(a)で規定された蛋白質の機能
を有する蛋白質をコードするDNAからなる群より選択さ
れる、請求項1〜3のいずれか一項に記載のDNA。
【請求項５】 (1) 請求項1〜4のいずれか一項で規定さ
れるDNAと、 (2) 配列番号：1に示された配列の192位から569位まで
のヌクレオチド配列を有するORF2をコードするDNA、お
よび／または配列番号：3で規定された配列の1つまたは
それ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加によ
って得られる、ORF2の機能と同等な機能を有するORF2の
誘導体をコードするDNAとを含む、DNAの組み合わせ。
【請求項６】 (1) 配列番号：1に示された配列の644位
から2791位まで、もしくは572位から2791位までのヌク
レオチド配列を有するDNA、または請求項1で規定された
蛋白質の機能を有する蛋白質をコードするこのDNAとの
ハイブリダイゼーションが可能なDNA、および (2) 配列番号：1に示された配列の192位から569位まで
のヌクレオチド配列を有するORF2をコードするDNA、ま
たは配列番号：3で規定された配列の1つまたはそれ以上
のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加によって得ら
れる、ORF2の機能と同等な機能を有するORF2の誘導体を
コードするDNAを含む、請求項5記載のDNAの組み合わ
せ。
【請求項７】請求項1〜6のいずれか一項に記載のDNA
を含む発現ベクター。
【請求項８】それぞれのDNAが別々に異なる発現ベク
ター上にあるか、または同じ発現ベクター上にある、請
求項5または6記載のDNAの組み合わせ。
【請求項９】配列番号：1に記載のように直列に位置
している、請求項5または6記載のDNAの組み合わせ。
【請求項１０】グルコノバクター属、アセトバクター
属または大腸菌に属するものから選択された微生物にお
いて機能的である、請求項7記載の発現ベクター。
【請求項１１】請求項7および10のいずれか一項に記
載の発現ベクターが導入された組換え生物体。
【請求項１２】宿主生物体の染色体DNA上に、請求項1
〜4のいずれか一項に記載のDNA、または請求項5、6、8
もしくは9のいずれか一項に記載のDNAの組み合わせを有
する組換え生物体。
【請求項１３】宿主生物体が、グルコノバクター属、
アセトバクター属または大腸菌に属するものから選択さ
れる微生物である、請求項11または12記載の組換え生物
体。
【請求項１４】請求項11〜13のいずれか一項に記載の
組換え生物体を適当な培地中で培養する段階と、培養物
から該組換えD-ソルビトールデヒドロゲナーゼを回収す
る段階とを含む、組換えD-ソルビトールデヒドロゲナー
ゼを製造する方法。
【請求項１５】請求項1〜4のいずれか一項に記載のDN
A、または請求項5、6、8もしくは9のいずれか一項に記
載のDNAの組み合わせの発現によって製造される組換えD
-ソルビトールデヒドロゲナーゼ。
【請求項１６】請求項14記載の方法によって製造され
る組換えD-ソルビトールデヒドロゲナーゼ。
【請求項１７】固相酵素反応のために固体担体上に固
定化された、請求項15または16記載の組換えD-ソルビト
ールデヒドロゲナーゼ。
【請求項１８】請求項16または17記載の組換えD-ソル
ビトールデヒドロゲナーゼを利用してD-ソルビトールを
L-ソルボースに変換する段階を含む、L-ソルボースを製
造するための方法。
【請求項１９】請求項11〜13のいずれか一項に記載の
組換え生物体の適当な培地中における発酵によってD-ソ
ルビトールをL-ソルボースに変換する段階を含む、L-ソ
ルボースを製造するための方法。