KR19980082478A - Selective thrombin inhibitors for oral administration - Google Patents

Abstract

본 발명은 트롬빈 억제제로 유용한 신규 화합물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 트롬빈에 대하여 선택적 억제효과를 나타내며, 또한 경구투여에 의해서도 강력한 혈전생성 억제효과를 나타내는 하기 화학식 1 의 신규한 술포닐 유도체, 그의 제조방법 및 이 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈액응고 예방 또는 각종 혈전증 치료를 위한 의약조성물에 관한 것이다:The present invention relates to novel compounds useful as thrombin inhibitors. More specifically, the present invention exhibits a selective inhibitory effect on thrombin, and also shows a potent thrombogenic inhibitory effect by oral administration, a novel sulfonyl derivative of the following formula (1), a preparation method thereof, and a compound containing the compound as an active ingredient. A pharmaceutical composition for preventing blood clotting or treating various thrombosis:

[화학식 1][Formula 1]

상기식에서,In the above formula,

X 는 CH₂또는 NH 를 나타내고,X represents CH ₂ or NH,

R¹은 수소, 저급알킬, 카복실 또는 저급알콕시카보닐을 나타내며,R ¹ represents hydrogen, lower alkyl, carboxyl or lower alkoxycarbonyl,

R²및 R³는 각각 독립적으로 저급알킬 또는 사이클로알킬을 나타내고,R ² and R ³ each independently represent lower alkyl or cycloalkyl,

R⁴는 수소, 저급알킬 또는 아미노를 나타낸다.R ⁴ represents hydrogen, lower alkyl or amino.

Description

경구투여가 가능한 선택적 트롬빈 억제제Selective thrombin inhibitors for oral administration

본 발명은 트롬빈 억제제로 유용한 신규 화합물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 트롬빈에 대하여 선택적으로 작용하며, 경구투여에 의해서도 유효한 트롬빈 억제효과를 나타내는 하기 화학식 1 의 신규한 술포닐 유도체, 그의 제조방법 및 이 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈액응고 예방 또는 각종 혈전증 치료를 위한 의약조성물에 관한 것이다:The present invention relates to novel compounds useful as thrombin inhibitors. More specifically, the present invention is a novel sulfonyl derivative represented by the following formula (1), which selectively acts on thrombin and exhibits an effective thrombin inhibitory effect even by oral administration, a method for preparing the same, and a blood coagulation prevention containing the compound as an active ingredient. Or a pharmaceutical composition for treating various thrombosis:

[화학식 1][Formula 1]

상기식에서,In the above formula,

X 는 CH₂또는 NH 를 나타내고,X represents CH ₂ or NH,

R¹은 수소, 저급알킬, 카복실 또는 저급알콕시카보닐을 나타내며,R ¹ represents hydrogen, lower alkyl, carboxyl or lower alkoxycarbonyl,

R²및 R³는 각각 독립적으로 저급알킬 또는 사이클로알킬을 나타내고,R ² and R ³ each independently represent lower alkyl or cycloalkyl,

R⁴는 수소, 저급알킬 또는 아미노를 나타낸다.R ⁴ represents hydrogen, lower alkyl or amino.

일반적으로 혈액응고 과정에는 여러가지 복잡한 효소반응이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다. 그리고, 마지막 단계는 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환시키는 반응을 포함하고 있다. 이 과정에서 생성된 트롬빈은 혈소판을 활성화시키고, 섬유소원을 섬유소로 바꾸는 등의 역할을 수행하는데, 이때 생성된 섬유소는 중합반응에 의해 고분자물질로 바뀌고, 활성화된 혈액인자 XIII 에 의해 교차결합되어 불용성 응혈이 된다. 트롬빈은 또한 혈액응고 과정에 참여하는 혈액인자 V 와 VIII 을 활성화시키는 역할도 하여 혈액응고 반응을 더욱 가속화시킨다. 따라서, 트롬빈의 억제제는 효과적인 항응혈제로 작용하는 동시에, 혈소판 활성을 억제하고 섬유소 생성 및 안정화를 막을 수 있으므로 오래 전부터 트롬빈 활성을 억제할 수 있는 신규한 물질을 개발함으로써 혈액응고를 예방하고 각종 혈전증을 치료하기 위한 방법이 모색되어 왔다.In general, it is known that various complex enzyme reactions are involved in the coagulation process. And the last step involves the reaction of converting prothrombin to thrombin. The thrombin produced in this process activates platelets, converts fibrinogen to fibrin, etc., wherein the fibrin is converted into a polymer by a polymerization reaction and crosslinked by activated blood factor XIII to insoluble coagulation. Becomes Thrombin also plays a role in activating the blood factors V and VIII involved in the coagulation process, further accelerating the coagulation reaction. Therefore, the inhibitor of thrombin acts as an effective anticoagulant, and can inhibit platelet activity and prevent fibrin production and stabilization, thus developing a new substance that can inhibit thrombin activity for a long time, thereby preventing blood clotting and preventing various thrombosis. Methods for treatment have been sought.

그러나, 단순히 트롬빈을 억제할 수 있다는 점만으로는 효과적인 항응혈제로 사용하는데 제약이 따른다. 그 이유는 트롬빈이 트립신과 유사한 세린계 단백질 분해효소이므로, 효과적인 트롬빈 억제제는 트립신에 대한 억제효과도 높은 특징이 있기 때문이다. 인체내, 특히 혈액내에는 트립신과 유사한 세린계 단백질 분해효소(대표적인 예: 플라스민)가 다양하게 존재하고 있기 때문에, 트롬빈 억제제를 개발함에 있어서는 이러한 세린계 단백질 분해효소를, 특히 트립신을 상대적으로 덜 억제하는 성질을 갖도록 하는 것이 매우 중요하다.However, simply being able to inhibit thrombin is limited to use as an effective anticoagulant. The reason is that since thrombin is a serine protease similar to trypsin, an effective thrombin inhibitor has a high inhibitory effect on trypsin. Because there are a variety of serine proteases similar to trypsin (typically plasmin) in the human body, especially in the blood, the development of thrombin inhibitors makes these serine proteases, especially trypsin, relatively less. It is very important to have a restraining property.

따라서 트롬빈을 효과적으로 억제하는 동시에 트립신에 대한 억제활성은 낮은 선택적 트롬빈 억제제를 개발하고자 하는 연구가 광범위하게 이루어 졌다.Therefore, extensive research has been conducted to develop selective thrombin inhibitors that effectively inhibit thrombin and at the same time have low inhibitory activity against trypsin.

효과적인 트롬빈 억제제로서 개발된 대표적인 화합물로는 첫째 아릴설포닐알지닌계 화합물인 하기 화학식 4 의 아가트로반(Argatroban, Ki=1.9nM)을 들 수 있다(참조: US 4258192 및 US 4201863).Representative compounds developed as effective thrombin inhibitors include the first arylsulfonyl arginine-based compounds, agatroban of Formula 4 (Argatroban, Ki = 1.9 nM) (see US Pat. No. 4,258,192 and US 4201863).

[화학식 4][Formula 4]

이 화합물은 트립신 대비 트롬빈 억제효과가 250 배로 보고 되었으며, 이미 1990 년에 일본에서 상품화되었다(참조: Biochemistry 1984, 23, 85-90). 그러나 이 화합물은 경구투여용으로는 전혀 활성이 없을 뿐만 아니라 매우 복잡한 합성과정을 거쳐야만 합성할 수 있다는 단점을 가지고 있다.This compound has been reported to have a 250-fold thrombin inhibitory effect compared to trypsin and has already been commercialized in Japan in 1990 (Biochemistry 1984, 23, 85-90). However, this compound is not active at all for oral administration and has the disadvantage of being synthesized only after a very complicated synthetic process.

또한, 트롬빈 억제제로서 벤즈아미딘계 아릴설포닐 화합물인 하기 화학식 5 의 NAPAP 도 개발되었는데, 이 화합물은 합성이 용이할 뿐 아니라 효과적인 트롬빈 억제제임에도 불구하고 (Ki=6.0nM) 트립신 대비 트롬빈 억제효과가 50 배 정도 밖에 안된다는 문제점이 있다[참조: J. Biol. Chem. 1991, 266, 20085-20093].In addition, as a thrombin inhibitor, a benzamidine-based arylsulfonyl compound (NAPAP) of formula (5) has been developed, which is not only easy to synthesize but also an effective thrombin inhibitor (Ki = 6.0 nM). The problem is that it is only twice as high [J. Biol. Chem. 1991, 266, 20085-20093.

[화학식 5][Formula 5]

한편 트립신 대비 선택성이 개선된 하기 화학식 6 의 Ro46-6240 화합물이 강력한 트롬빈 억제제로서 (Ki=0.2nM) 보고되었는데, 이 화합물은 정맥주사용 제제로서의 개발가능성을 보여 주고 있으나, 혈중반감기가 짧아서 경구투여제로서의 개발가능성은 없다(참조: J. Med. Chem. 1994, 37, 3889-3901).Meanwhile, Ro46-6240 compound of formula 6, which has improved selectivity compared to trypsin, has been reported as a powerful thrombin inhibitor (Ki = 0.2 nM), which shows the possibility of development as an intravenous preparation, but has a short blood half-life, resulting in oral administration. There is no potential for development as a zero (see J. Med. Chem. 1994, 37, 3889-3901).

[화학식 6][Formula 6]

경구투여가 가능하면서 효과적인 트롬빈 억제제로서 (Ki=1.4nM) 개발된 화합물로는 코르바스(Corvas)사에서 개발한 하기 화학식 7 의 CVS-1123 이 있다. 이 화합물은 쥐에서 뿐만 아니라 개 및 원숭이에도 경구투여가 가능한 것으로 보고되었으나, 트립신 대비 트롬빈에 대한 선택성이 50 배 이하로 저조한 것이 큰 단점이다(참조: WO 9315756 및 WO 9408941).Compounds developed as an effective thrombin inhibitor capable of oral administration (Ki = 1.4 nM) include CVS-1123 of Chemical Formula 7, developed by Corvas Corporation. The compound has been reported to be orally administered to dogs and monkeys as well as to rats, but the disadvantage is that the selectivity to thrombin relative to trypsin is lower than 50 times (WO 9315756 and WO 9408941).

[화학식 7][Formula 7]

경구투여가 가능하면서 강력한 트롬빈 억제제(Ki=1.1nM)로는 또한 주식회사 LG 화학에서 개발한 하기 구조식 8 의 화합물이 있다. 이 화합물은 개에게 경구투여시에 흡수도가 뛰어나며(약 60%), 트립신 대비 트롬빈에 대한 선택성 또한 약 3000 배로서 뛰어난 트롬빈 억제제로 밝혀졌다(참조 : EP-739886A).An orally administrable and potent thrombin inhibitor (Ki = 1.1 nM) also includes a compound of formula 8 developed by LG Chem. This compound has been shown to be an excellent thrombin inhibitor with good absorption upon oral administration to dogs (about 60%) and about 3000 times the selectivity for thrombin relative to trypsin (EP-739886A).

[화학식 8][Formula 8]

이에 본 발명자들은 트립신 대비 트롬빈에 대한 선택성이 좋고 경구투여가 가능하면서 궁극적으로 트롬빈 억제활성이 더 향상된 화합물을 개발하기 위해 상기 화학식 8 의 화합물의 구조적 변형연구를 오랫동안 집중적으로 수행하여 왔다. 그 결과, 상기 정의된 화학식 1 의 화합물이 이러한 목적을 효과적으로 달성할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.Therefore, the present inventors have been intensively researching structural modification of the compound of Formula 8 for a long time to develop a compound having good selectivity for thrombin compared to trypsin and ultimately improving thrombin inhibitory activity. As a result, it was confirmed that the compound of formula 1 defined above can effectively achieve this object, and have completed the present invention.

따라서, 본 발명의 목적은 경구투여가 가능하며 선택성이 높은 신규한 트롬빈 억제제 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a novel thrombin inhibitor capable of oral administration and high selectivity and a method of preparing the same.

또한 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈액응고 예방 및 각종 혈전증 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to a composition for preventing blood clotting and treating various thrombosis containing the compound as an active ingredient.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 하기 화학식 1 로 표시되는 화합물, 약제학적으로 허용되는 그의 염, 수화물, 용매화물 및 이성체에 관한 것이다.The present invention relates to a compound represented by the following formula (1), a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, solvate and isomer thereof.

[화학식 1][Formula 1]

상기식에서,In the above formula,

X 는 CH₂또는 NH 를 나타내고,X represents CH ₂ or NH,

R¹은 수소, 저급알킬, 카복실 또는 저급알콕시카보닐을 나타내며,R ¹ represents hydrogen, lower alkyl, carboxyl or lower alkoxycarbonyl,

R²및 R³는 각각 독립적으로 저급알킬 또는 사이클로알킬을 나타내고,R ² and R ³ each independently represent lower alkyl or cycloalkyl,

R⁴는 수소, 저급알킬 또는 아미노를 나타낸다.R ⁴ represents hydrogen, lower alkyl or amino.

본 발명에 따른 화학식 1 의 화합물의 치환기에 대한 정의에서 용어 저급알킬은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 이소부틸, t-부틸을 포함하는 탄소수 1 내지 4 의 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 라디칼을 의미하고, 용어 사이클로알킬은 사이클로펜틸을 포함한 탄소수 3 내지 8 의 환상 알킬을 의미하며, 용어 저급알콕시카보닐은 카복실 그룹이 상기 정의한 바와 같은 저급알킬에 의해 치환된 형태의 그룹을 의미한다.The term loweralkyl in the definition of the substituent of the compound of formula 1 according to the present invention means a straight or branched chain hydrocarbon radical having 1 to 4 carbon atoms, including methyl, ethyl, propyl, isopropyl, isobutyl, t-butyl, The term cycloalkyl refers to cyclic alkyl having 3 to 8 carbon atoms including cyclopentyl, and the term lower alkoxycarbonyl refers to a group in which the carboxyl group is substituted by lower alkyl as defined above.

본 발명의 바람직한 화학식 1 의 화합물은 X 가 CH₂또는 NH 를 나타내며, R¹은 수소, 메틸 또는 메톡시카보닐을 나타내고, R²및 R³은 각각 독립적으로 메틸 또는 사이클로펜틸을 나타내며, R⁴는 수소, 메틸 또는 아미노를 나타내는 화합물이다.Preferred compounds of formula (I) of the invention are those wherein X represents CH ₂ or NH, R ¹ represents hydrogen, methyl or methoxycarbonyl, R ² and R ³ each independently represents methyl or cyclopentyl, and R ⁴ Is a compound representing hydrogen, methyl or amino.

본 발명에 따르는 화학식 1 의 대표적인 화합물에는 다음과 같은 화합물이 포함된다:Representative compounds of formula 1 according to the present invention include the following compounds:

1. (S)-3-[4-(아미노-히드라조노-메틸)-페닐]-N-사이클로펜틸-N-메틸-2-(5, 6,7,8-테트라히드로-나프탈렌-2-술포닐아미노)-프로피온아미드1. (S) -3- [4- (Amino-hydrazono-methyl) -phenyl] -N-cyclopentyl-N-methyl-2- (5, 6,7,8-tetrahydro-naphthalene-2- Sulfonylamino) -propionamide

2. (S)-3-[4-(아미노-이미노-메틸)-페닐]-N-사이클로펜틸-N-메틸-2-(5,6,7, 8-테트라히드로-나프탈렌-2-술포닐아미노)-프로피온아미드2. (S) -3- [4- (Amino-imino-methyl) -phenyl] -N-cyclopentyl-N-methyl-2- (5,6,7, 8-tetrahydro-naphthalene-2- Sulfonylamino) -propionamide

3. (S)-3-[4-(아미노-메틸이미노-메틸)-페닐]-N-사이클로펜틸-N-메틸-2-(5, 6,7,8-테트라히드로-나프탈렌-2-술포닐아미노)-프로피온아미드3. (S) -3- [4- (amino-methylimino-methyl) -phenyl] -N-cyclopentyl-N-methyl-2- (5, 6,7,8-tetrahydro-naphthalene-2 -Sulfonylamino) -propionamide

4. (S)-3-[4-(아미노-히드라조노-메틸)-페닐]-N-사이클로펜틸-N-메틸-2-(5, 6,7,8-테트라히드로-나프탈렌-1-술포닐아미노)-프로피온아미드4. (S) -3- [4- (Amino-hydrazono-methyl) -phenyl] -N-cyclopentyl-N-methyl-2- (5, 6,7,8-tetrahydro-naphthalene-1- Sulfonylamino) -propionamide

5.5.

6. (S)-3-[4-(아미노-히드라조노-메틸)-페닐]-N-사이클로펜틸-N-메틸-2-(5, 6,7,8-테트라히드로-나프탈렌-6-히드록시카보닐-2-술포닐아미노)-프로피온아미드6. (S) -3- [4- (Amino-hydrazono-methyl) -phenyl] -N-cyclopentyl-N-methyl-2- (5, 6,7,8-tetrahydro-naphthalene-6- Hydroxycarbonyl-2-sulfonylamino) -propionamide

7.7.

8. (S)-3-[4-(아미노-히드라조노-메틸)-페닐]-N-사이클로펜틸-N-메틸-2-(5, 6,7,8-테트라히드로-나프탈렌-7-히드록시카보닐-2-술포닐아미노)-프로피온아미드8. (S) -3- [4- (Amino-hydrazono-methyl) -phenyl] -N-cyclopentyl-N-methyl-2- (5, 6,7,8-tetrahydro-naphthalene-7- Hydroxycarbonyl-2-sulfonylamino) -propionamide

9.9.

10. (S)-3-[4-(아미노-히드라조노-메틸)-페닐]-N-사이클로펜틸-N-메틸-2-(1, 2,3,4-테트라히드로-퀴놀린-8-술포닐아미노)-프로피온아미드.10. (S) -3- [4- (amino-hydrazono-methyl) -phenyl] -N-cyclopentyl-N-methyl-2- (1, 2,3,4-tetrahydro-quinoline-8- Sulfonylamino) -propionamide.

본 발명에 따른 화학식 1 의 화합물은 또한 약제학적으로 허용되는 염을 형성할 수도 있다. 이러한 약제학적으로 허용되는 염에는 약제학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를들면 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산 또는 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산 등과 같은 유기 카본산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 또는 나프탈렌술폰산 등과 같은 술폰산 등에 의해 형성된 산부가염이 포함된다.The compounds of formula 1 according to the invention may also form pharmaceutically acceptable salts. Such pharmaceutically acceptable salts include acids that form non-toxic acid addition salts containing pharmaceutically acceptable anions such as inorganic acids, such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, tartaric acid, formic acid, Acid addition salts formed by citric acid, acetic acid, trichloroacetic acid or trifluoroacetic acid, gluconic acid, benzoic acid, organic carbonic acid such as lactic acid, fumaric acid, maleic acid, etc., sulfonic acid such as methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid or naphthalenesulfonic acid, etc. This includes.

한편, 본 발명에 따른 화합물은 비대칭 탄소중심을 가질 수 있으므로 라세미 화합물, 부분입체이성체 혼합물 및 개개의 부분입체이성체로서 존재할 수 있으며, 이들 모든 이성체 형태는 본 발명의 범위에 포함된다.On the other hand, the compounds according to the invention may have asymmetric carbon centers and therefore may exist as racemic compounds, diastereomeric mixtures and individual diastereomers, all of these isomeric forms are included within the scope of the invention.

본 발명은 상기 정의된 화학식 1 의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a process for preparing the compound of formula 1 as defined above.

본 발명에 따르면 상기 정의된 화학식 1 의 화합물은 하기 화학식 2 의 메틸머캅토 화합물을 하기 화학식 3 의 아민 유도체와 반응시킴으로써 제조할 수 있다.According to the present invention, the compound of Formula 1 as defined above may be prepared by reacting a methylmercapto compound of Formula 2 with an amine derivative of Formula 3 below.

[화학식 2][Formula 2]

[화학식 3][Formula 3]

상기식에서, X, R¹, R², R³및 R⁴는 상기에서 정의한 바와 같다.Wherein X, R ¹ , R ² , R ³ and R ⁴ are as defined above.

본 발명에 따르는 화학식 1 의 화합물의 제조방법은 다음 반응식 1 로 표시할 수 있다.Method for preparing a compound of formula 1 according to the present invention can be represented by the following scheme 1.

[반응식 1]Scheme 1

상기 반응식 1 에 도시한 바와 같이, 본 발명에 따르는 화학식 1 의 화합물은 화학식 2 의 메틸머캅토 화합물을 친핵체인 화학식 3 의 아민 유도체와 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 이 반응은 바람직하게는 용매의 존재하에서 수행할 수 있다. 이러한 목적으로 바람직하게 사용될 수 있는 용매의 예로는 반응에 악영향을 미치지 않는 유기용매라면 어느 것이나 사용할 수 있으나, 일반적으로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 등의 알콜 용매가 바람직하게 사용된다.As shown in Scheme 1, the compound of Formula 1 according to the present invention may be prepared by reacting a methylmercapto compound of Formula 2 with an amine derivative of Formula 3, which is a nucleophile. This reaction can preferably be carried out in the presence of a solvent. Examples of the solvent that can be preferably used for this purpose may be any organic solvent which does not adversely affect the reaction, but generally alcohol solvents such as methanol, ethanol, propanol and the like are preferably used.

본 반응에서 반응량, 반응온도, 반응시간 등을 포함한 반응조건은 특정의 반응물질에 따라 당업계의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 반응온도는 다양하게 변화시킬 수 있으나, 0℃ 내지 50℃ 에서 반응을 수행하는 것이 특히 바람직하다. 또한 반응시간은 일반적으로 0.5 내지 5 시간이 소요되나, 바람직하게는 1 내지 2 시간 동안 반응을 수행한다.In the present reaction, reaction conditions including reaction amount, reaction temperature, reaction time, and the like can be easily determined by those skilled in the art according to a specific reactant. In general, the reaction temperature may vary, but it is particularly preferable to carry out the reaction at 0 ℃ to 50 ℃. In addition, the reaction time generally takes 0.5 to 5 hours, but preferably performs the reaction for 1 to 2 hours.

본 반응이 완결된 후에 생성물은 통상적인 후처리 방법, 예를들면 크로마토그라피, 재결정화 등의 방법에 의해 분리 및 정제할 수 있다.After completion of the reaction, the product can be separated and purified by conventional post-treatment methods such as chromatography, recrystallization and the like.

상기 반응식 1 에서 화학식 1 의 화합물을 제조하는데 중간체로 사용된 화학식 2 의 메틸머캅토 화합물은 예를들어 화학식 9 의 화합물을 R²및 R³가 치환된 아민과 커플링시켜 화학식 10 의 화합물을 수득하고, 화학식 10 의 화합물로 부터 아미노 보호그룹을 제거하여 생성된 화학식 11 의 화합물을 술포닐클로라이드 유도체와 반응시켜 화학식 12 의 화합물을 수득하고, 수득된 화학식 12 의 화합물을 염기의 존재하에서 황화수소로 포화시켜 화학식 13 의 화합물을 생성시키고 생성된 화학식 13 의 화합물을 메틸화시킴으로써 제조할 수 있다.The methylmercapto compound of Formula 2 used as an intermediate in the preparation of the compound of Formula 1 in Scheme 1, for example, by coupling a compound of Formula 9 with an amine substituted with R ² and R ³ to obtain a compound of Formula 10 And reacting the resulting compound of formula 11 with a sulfonylchloride derivative to remove the amino protecting group from the compound of formula 10 with a sulfonylchloride derivative to obtain the compound of formula 12, which is saturated with hydrogen sulfide in the presence of a base. To form a compound of Formula 13 and methylation of the resulting compound of Formula 13.

[화학식 9][Formula 9]

[화학식 10][Formula 10]

[화학식 11][Formula 11]

[화학식 12][Formula 12]

[화학식 13][Formula 13]

상기식에서 R¹, R²및 R³는 상기에서 정의한 바와 같고, P 는 벤질옥시카보닐, 알릴옥시카보닐, t-부톡시카보닐 또는 트리틸 그룹 등과 같은 통상적인 아미노 보호그룹을 나타낸다.Wherein R ¹ , R ² and R ³ are as defined above and P represents a conventional amino protecting group such as benzyloxycarbonyl, allyloxycarbonyl, t-butoxycarbonyl or trityl group and the like.

상기한 바와 같은 화학식 2 화합물의 제조방법은 다음 반응식 2 로 나타낼 수 있다.Method for preparing a compound of Formula 2 as described above can be represented by the following scheme 2.

[반응식 2]Scheme 2

반응식 2 에서 보는 바와 같이, 화학식 2 의 화합물을 제조하기 위해서는 화학식 9 의 화합물의 C-말단에 먼저 R²및 R³가 치환된 아민 그룹을 커플링시켜 화학식 10 의 화합물을 수득한다.As shown in Scheme 2, in order to prepare the compound of Formula 2, R ² and R ³ substituted amine groups are first coupled to the C-terminus of the compound of Formula 9 to obtain a compound of Formula 10.

화학식 9 화합물의 커플링반응을 위해 사용될 수 있는 공지의 커플링시약에는 디사이클로헥실카보디이미드(DCC), 3-에틸-3'-(디메틸아미노)-프로필카보디이미드(EDC), 비스-(2-옥소-3-옥사졸리디닐)-포스핀산클로라이드(BOP-Cl), 디페닐포스포릴아지드(DPPA) 등이 포함되나, 단 이들로 제한되는 것은 아니다.Known coupling reagents that can be used for coupling reactions of compounds of formula 9 include dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 3-ethyl-3 '-(dimethylamino) -propylcarbodiimide (EDC), bis- (2-oxo-3-oxazolidinyl) -phosphinic acid chloride (BOP-Cl), diphenylphosphoryl azide (DPPA), and the like, but are not limited thereto.

또한 이 커플링반응에서 사용된 화학식 9 의 카복실산 화합물은 그대로 사용할 수도 있으나, 바람직하게는 그의 반응성 유도체, 예를들면 산 할라이드 및 그밖의 다른 활성화 에스테르 유도체로 전환시켜 커플링반응에 사용함으로써 반응을 촉진시킬 수 있다. 카르복실산의 활성화 유도체는 아민과의 커플링반응에 의해 아미드 결합을 형성하거나, 알콜과의 커플링반응에 의해 에스테르 결합을 형성시키기 위해 필요하다. 이러한 반응성 유도체에는 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있는 통상적인 유도체들이 포함되는데, 예를들어 산 할라이드에는 산 클로라이드가 포함되고, 활성화 에스테르에는 메톡시카보닐클로라이드, 이소부틸옥시카보닐클로라이드 등의 알콕시카보닐할라이드와 커플링 시약으로 부터 유도된 카복실산의 무수물, N-하이드록시프탈이미드-유도된 에스테르, N-하이드록시숙신이미드-유도된 에스테르, N-하이드록시-5-노르보넨-2',3'-디카복시이미드-유도된 에스테르, 2,4,5-트리클로로페놀-유도된 에스테르 등이 포함되나, 단 이들로 제한되는 것은 아니다.In addition, the carboxylic acid compound represented by the formula (9) used in this coupling reaction may be used as it is, but is preferably converted into a reactive derivative thereof, such as an acid halide and other activated ester derivatives, and used in the coupling reaction to promote the reaction. You can. Activated derivatives of carboxylic acids are necessary to form amide bonds by coupling reactions with amines or to form ester bonds by coupling reactions with alcohols. Such reactive derivatives include conventional derivatives which may be prepared by conventional methods in the art, for example acid halides include acid chlorides, and activated esters include methoxycarbonyl chloride, isobutyloxycarbonyl Anhydrides of carboxylic acids derived from alkoxycarbonyl halides and coupling reagents such as chlorides, N-hydroxyphthalimide-derived esters, N-hydroxysuccinimide-derived esters, N-hydroxy-5- Norbornene-2 ', 3'-dicarboxyimide-derived esters, 2,4,5-trichlorophenol-derived esters and the like, but are not limited to these.

상기의 커플링반응에서 생성된 화학식 10 의 화합물은 그 다음에 N-말단 아미노 보호그룹을 제거하여 화학식 11 의 화합물을 수득한다. 이 화학식 11 의 화합물의 N-말단 부위에 술포닐 그룹을 도입시켜 화학식 12 의 화합물을 수득한 후, 이 화학식 12 의 니트릴 화합물을 피리딘 및 트리메틸아민과 같은 염기의 존재하에서 황화수소로 포화시켜 화학식 13 의 티오아미드 화합물을 생성시키고, 이 화학식 10 의 티오아미드 화합물을 메틸화시킴으로써 화학식 2 의 목적하는 출발화합물을 제조할 수 있다. 화학식 13 화합물의 메틸화를 위해서는 요오드화메탄, 디메틸술페이트((CH₃)₂SO₂) 또는 메틸트리플레이트(CH₃OTf) 등과 같은 메틸화제를 사용할 수 있다.The compound of formula 10 produced in the coupling reaction is then removed from the N-terminal amino protecting group to obtain a compound of formula (11). Sulfonyl groups were introduced to the N-terminus of the compound of formula 11 to obtain a compound of formula 12, and then the nitrile compound of formula 12 was saturated with hydrogen sulfide in the presence of a base such as pyridine and trimethylamine, The desired starting compound of formula (2) can be prepared by producing a thioamide compound and methylating the thioamide compound of formula (10). For methylation of the compound of Formula 13, methylating agents such as methane iodide, dimethylsulfate ((CH ₃ ) ₂ SO ₂ ) or methyltriplate (CH ₃ OTf) may be used.

본 발명에 따른 화학식 1 의 화합물의 트롬빈 억제효과는 문헌(참조: Methods in Enzymology V. 80, p341-361; Biochemistry 27, p2144-2151, 1988)에 기재된 방법에 따라 하기 식을 이용하여 해리상수 Ki 값을 결정함으로써 측정한다.The thrombin inhibitory effect of the compound of formula 1 according to the present invention is dissociation constant Ki using the following formula according to the method described in Methods in Enzymology V. 80, p341-361; Biochemistry 27, p2144-2151, 1988 Measure by determining the value.

Ki = [E]ㆍ[I]/[EI]Ki = [E] · [I] / [EI]

상기식에서, [E] 는 억제제와 결합하고 있지 않은 효소의 농도이고, [I] 는 효소와 결합하고 있지 않은 억제제의 농도이며, [EI] 는 효소와 억제제 결합물의 농도이다.In the above formula, [E] is the concentration of the enzyme not bound to the inhibitor, [I] is the concentration of the inhibitor not bound to the enzyme, and [EI] is the concentration of the enzyme and inhibitor binding.

해리상수 Ki 는 효소와 트롬빈 억제제 화합물의 해리정도를 나타내는 것이므로 해리상수 값이 작을수록 효소에 대한 억제제의 결합성이 큰 것을 의미하며 따라서 억제활성이 큰 것으로 평가될 수 있다. 이러한 해리상수는 트롬빈의 작용을 받아 가수분해되면 발색성을 나타내는 특정 기질과 반응시키고 그 발색정도를 분광광도법에 따라 시간의 함수로 측정함으로서 구할 수 있다.Since the dissociation constant Ki represents the degree of dissociation between the enzyme and the thrombin inhibitor compound, the smaller the dissociation constant value is, the greater the binding activity of the inhibitor to the enzyme, and thus, the inhibitory activity may be evaluated to be greater. This dissociation constant can be obtained by reacting with a specific substrate that exhibits color development when hydrolyzed by the action of thrombin and measuring the color development as a function of time according to spectrophotometry.

본 발명에서는 트롬빈의 기질로서 트롬빈의 작용을 받아 가수분해되면 발색하는 물질인 크로모자임 TH(Chromozyme TH : 토실-Gly-Pro-Arg-4-니트로아닐리드아세테이트)를 사용한다. 크로모자임 TH 가 트롬빈에 의해 가수분해하면 노란색의 파라-니트로아닐리드가 생성된다. 따라서, 생성되는 파라-니트로아닐리드의 양을 시간에 따른 흡광도의 변화로 측정함으로써 본 발명에 따른 화합물의 트롬빈 억제활성을 측정할 수 있다. 즉, 흡광도의 변화로 부터 효소의 활성을 측정할 수 있으며, 이는 곧바로 트롬빈 억제제의 효소활성 억제능력과 연관될 수 있다.In the present invention, Chromozyme TH (Chromozyme TH: Tosyl-Gly-Pro-Arg-4-Nitroanilide Acetate), which is a substance that develops upon hydrolysis under the action of thrombin, is used as a substrate of thrombin. Hydrolysis of chromozyme TH with thrombin produces yellow para-nitroanilide. Therefore, the thrombin inhibitory activity of the compounds according to the invention can be measured by measuring the amount of para-nitroanilides produced by the change in absorbance over time. That is, the activity of the enzyme can be measured from the change in absorbance, which can be directly related to the ability of the thrombin inhibitor to inhibit the enzyme activity.

한편, 본 발명에 따른 화합물의 트립신 대비 트롬빈 억제에 대한 선택성을 알아보기 위하여 상기 트롬빈 억제활성을 측정하는 방법과 동일하게 실시하여 트립신에 대한 화학식 1 화합물의 억제효과를 Ki 값으로 측정한 다음 트립신/트롬빈의 비율을 구한다.On the other hand, in order to determine the selectivity for thrombin inhibition of the compound according to the present invention in the same manner as the method for measuring the thrombin inhibitory activity by measuring the inhibitory effect of the compound of formula (1) to trypsin Ki value then trypsin / Find the ratio of thrombin.

이때, 트립신에 대한 실험방법은 트롬빈에 대한 실험방법과 동일하게 하되, 단 기질로는 N-벤조일-발린-글리신-알기닌 파라-니트로아닐리드 하이드로클로라이드(N-benzoyl-Val- Gly-Arg-p-nitroanilide hydrochloride)를 사용한다.At this time, the test method for trypsin is the same as the test method for thrombin, except that N-benzoyl-valine-glycine-arginine para-nitroanilide hydrochloride (N-benzoyl-Val- Gly-Arg-p-) nitroanilide hydrochloride).

이와 같이 트롬빈 및 트립신에 대해 본 발명에 따른 화학식 1 의 화합물의 억제활성을 측정한 결과, 본 발명의 화합물은 트롬빈 억제효과가 우수할 뿐 아니라 트립신 대비 트롬빈의 선택성도 뛰어나며, 예를들면 실시예 1, 2 및 5 의 화합물의 트롬빈에 대한 선택성은 각각 37100 배, 24081 배 및 8914 배로서 공지의 트롬빈 억제제인 아가트로반과 NAPAP 가 각각 250 배 또는 50 배에 불과한데 비해 선택성이 현저하게 개선되어졌음을 알 수 있었다.As a result of measuring the inhibitory activity of the compound of Formula 1 according to the present invention with respect to thrombin and trypsin, the compound of the present invention is not only excellent in thrombin inhibitory effect but also excellent in selectivity of thrombin to trypsin, for example, Example 1 The thrombin selectivity of compounds 2, 2 and 5 was 37100 times, 24081 times and 8914 times, respectively, and the selectivity of the known thrombin inhibitors, agatroban and NAPAP, was only 250 or 50 times, respectively. Could know.

상기 언급한 바와 같이 본 발명에 따른 화학식 1 의 화합물은 공지의 화합물들에 비해 트롬빈에 대한 선택성도 뛰어나며 경구투여에 의해서도 가능한 트롬빈 억제제이다. 따라서 본 발명의 화합물은 혈액응고 예방 및 혈전증의 치료에 유용하다.As mentioned above, the compound of formula 1 according to the present invention is a thrombin inhibitor which is excellent in selectivity to thrombin and also available by oral administration compared to known compounds. Accordingly, the compounds of the present invention are useful for preventing blood clotting and for treating thrombosis.

따라서, 본 발명은 또한 화학식 1 의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 혈액응고 예방 및 혈전증 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.Accordingly, another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing blood clotting and treating thrombosis, which contains the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

본 발명의 화합물을 임상적인 목적으로 투여시에 단일용량 또는 분리용량으로 숙주에게 투여될 총 일일용량은 체중 1㎏ 당 0.001㎎ 내지 10㎎ 의 범위가 바람직하나, 특정환자에 대한 특이용량 수준은 사용될 특정화합물, 개개 환자의 체중, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률, 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.The total daily dose to be administered to the host in a single dose or in separate doses when administering a compound of the present invention for clinical purposes is preferably in the range of 0.001 mg to 10 mg per kg of body weight, but the specific dose level for a particular patient may be used. Specific compounds, body weight of each patient, sex, health status, diet, time of administration, method of administration, rate of excretion, drug mixture and the severity of the disease may vary.

본 발명의 화합물은 목적하는 바에 따라 주사용 제제 및 경구용 제제로 투여할 수 있다.The compounds of the present invention can be administered in injectable and oral formulations as desired.

주사용 제제, 예를들면 멸균주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 기술에 따라 적합한 분산제, 습윤제, 또는 현탁제를 사용하여 제조할 수 있다. 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 용매에는 물, 링거액 및 등장성 NaCl 용액이 있으며 멸균 고정오일은 통상적으로 용매 또는 현탁매질로서 사용한다. 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있으며, 또한 올레산과 같은 지방산도 주사용 제제에 사용한다.Injectable preparations, such as sterile injectable aqueous or oleaginous suspensions, can be prepared using suitable dispersing agents, wetting agents, or suspending agents according to known techniques. Pharmaceutically acceptable solvents that can be used include water, Ringer's solution and isotonic NaCl solution and sterile fixed oils are conventionally employed as a solvent or suspending medium. Any non-irritating fixed oil may be used for this purpose, including mono-, diglycerides, and also fatty acids such as oleic acid are used in the preparation of injectables.

경구투여용 고체투여 형태는 캅셀제, 정제, 환제, 산제 및 입제 등의 형태일 수 있으며, 특히 캅셀제와 정제가 유용하다. 정제 및 환제는 장피제로 제조하는 것이 바람직하다. 고체투여 형태는 본 발명에 따른 화학식 1 의 활성화합물을 슈크로즈, 락토즈, 전분 등과 같은 하나 이상의 불활성 희석제 및 마그네슘스테아레이트와 같은 윤활제, 붕해제, 결합제 등과 같은 담체와 혼합시킴으로써 제조할 수 있다.The solid dosage form for oral administration may be in the form of capsules, tablets, pills, powders and granules, and particularly, capsules and tablets are useful. Tablets and pills are preferably prepared with enteric agents. Solid dosage forms can be prepared by mixing the active compounds of formula 1 according to the invention with one or more inert diluents such as sucrose, lactose, starch and the like and carriers such as lubricants such as magnesium stearate, disintegrants, binders and the like.

본 발명에 따른 화학식 1 의 화합물의 커다란 특징중의 하나는 이를 함유하는 약제학적 조성물을 경구용 제제로 제형화하여 경구투여하는 경우에도 약효를 나타낸다는 점으로서, 이러한 사실은 쥐를 실험동물로 하여 약물동력학 실험을 수행한 결과 본 발명의 약제학적 조성물을 경구로 투여한 경우 약물의 농도가 혈중에서 오랫동안 유지되는 특성이 있음을 확인함으로서 입증되었다. 따라서, 기존의 트롬빈 억제제와는 달리 경구용 제제로서 효과적으로 사용될 수 있다는 점에서 더욱 유용하다.One of the great features of the compound of formula 1 according to the present invention is that the pharmaceutical composition containing the same has an effect even when formulated orally by administering oral preparations. Results of pharmacokinetic experiments demonstrated that oral administration of the pharmaceutical composition of the present invention confirms that the concentration of the drug is maintained in the blood for a long time. Therefore, it is more useful in that it can be effectively used as an oral preparation, unlike conventional thrombin inhibitors.

한편, 본 발명의 화합물을 임상적으로 투여하여 목적하는 항응혈 효과 및 혈전용해효과를 얻고자 하는 경우에, 본 발명에 따른 화학식 1 의 활성화합물은 혈전용해제 및 혈소판 활성 억제제중에서 선택된 1 종 이상의 성분과 동시에 투여를 할 수 있다. 이러한 방식으로 본 발명의 화합물과 혼합하여 투여될 수 있는 혈전용해제로는 t-PA, 유로키나제(Urokinase), 스트렙토키나제(Streptokinase) 등이 포함될 수 있으며, 혈소판 활성 억제제로는 아스피린, 티클로피딘(Ticlopidin), 클로피드로겔(Clopidrogel), 7E3 단일항체 등이 포함된다.On the other hand, when clinically administering the compound of the present invention to obtain the desired anticoagulant effect and thrombolytic effect, the active compound of formula 1 according to the present invention is one or more components selected from thrombolytic agents and platelet activity inhibitors It can be administered at the same time. Thrombolytic agents that can be administered in combination with a compound of the present invention in this manner may include t-PA, urokinase, streptokinase, and the like, and platelet activity inhibitors include aspirin, ticlopidin, Clopidrogel, 7E3 monoclonal antibody, and the like.

그러나, 혈전의 치료 및 예방을 목적으로 본 발명에 따른 화합물을 함유하는 제제는 상술된 것으로 제한되는 것은 아니며, 혈전의 치료 및 예방에 유용한 제제라면 어떠한 것도 포함될 수 있다.However, the preparations containing the compounds according to the invention for the purpose of the treatment and prevention of thrombi are not limited to those described above, and any preparations useful for the treatment and prevention of thrombi can be included.

본 발명은 하기 실시예 및 실험예에 의해 더욱 구체적으로 설명되나, 본 발명의 범위가 이들에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.The present invention is explained in more detail by the following examples and experimental examples, but the scope of the present invention is not limited in any way by these.

제조예 1Preparation Example 1

사이클로펜틸-메틸아민 염산염의 합성Synthesis of Cyclopentyl-Methylamine Hydrochloride

사이클로펜타논 10㎖(113 밀리몰)를 메탄올 50㎖ 에 용해시킨 후, 물 50㎖ 를 가하였다. 여기에 메틸아민 염산염 7.6g(113 밀리몰)을 가하고 나트륨보로시아노하이드라이드(NaBH₃CN) 7.1g(113 밀리몰)을 가하였다. 반응혼합물을 pH 6 에서 가열환류시키면서 12 시간 동안 교반하고, 0℃ 로 냉각시킨 후에 6N 수산화나트륨 용액으로 중성이 되게 하였다. 감압하여 메탄올을 제거한 후 0℃ 로 냉각시키고 묽은 염산으로 pH 2 로 조정하였다. 반응용액을 디에틸에테르로 3 회 세척하고 수층을 다시 pH 11 로 조정하였다. 여기에 디옥산 50㎖ 를 가하고 t-부틸옥시카보닐 안하이드라이드 37g(169.5 밀리몰)을 가하여 상온에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후에, 반응용액을 감압증류하여 30㎖ 정도로 농축하였다. 농축액을 에틸아세테이트로 추출하고 산, 염기 수용액으로 세척하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 여과하고 농축하였다. 수득된 흰색 고체를 칼럼크로마토그라피를 이용하여 정제하였다. 수득된 고체를 4N 염산-디옥산 용액 60㎖ 에 용해시켜 30 분간 교반하고, 감압하여 용매를 제거하고 진공하에서 건조시켜 표제화합물 13.7g(수율 90.5%)을 수득하였다.After dissolving 10 ml (113 mmol) of cyclopentanone in 50 ml of methanol, 50 ml of water was added thereto. To this was added 7.6 g (113 mmol) of methylamine hydrochloride and 7.1 g (113 mmol) of sodium borocyanohydride (NaBH ₃ CN). The reaction mixture was stirred for 12 hours while heating to reflux at pH 6, cooled to 0 ° C. and neutralized with 6N sodium hydroxide solution. After removing the methanol under reduced pressure, the mixture was cooled to 0 ° C. and adjusted to pH 2 with dilute hydrochloric acid. The reaction solution was washed three times with diethyl ether and the aqueous layer was adjusted to pH 11 again. 50 ml of dioxane was added thereto, and 37 g (169.5 mmol) of t-butyloxycarbonyl anhydride was added thereto, followed by stirring at room temperature for 3 hours. After the reaction was completed, the reaction solution was distilled under reduced pressure and concentrated to about 30ml. The concentrate was extracted with ethyl acetate and washed with an aqueous solution of acid and base. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated. The white solid obtained was purified using column chromatography. The obtained solid was dissolved in 60 mL of 4N hydrochloric acid-dioxane solution, stirred for 30 minutes, the solvent was removed under reduced pressure, and dried under vacuum to give 13.7 g (yield 90.5%) of the title compound.

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ : 3.50(m, 1H), 2.68(s, 3H), 2.10(m, 2H), 1.86-1.50 (m, 6H) ¹ H NMR (CD ₃ OD, ppm) δ: 3.50 (m, 1H), 2.68 (s, 3H), 2.10 (m, 2H), 1.86-1.50 (m, 6H)

제조예 2Preparation Example 2

합성synthesis

(S)-3-(4-시아노-페닐)-2-(t-부틸옥시카보닐-아미노)-프로피온산 0.7g(2.41 밀리몰)을 디메틸포름아미드(DMF) 6㎖ 에 용해시켰다. 0℃ 로 냉각시킨 후, 1- (3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 염산염(EDC) 0.7g 과 1-하이드록시벤조트리아졸 수화물(HOBT) 0.4g 을 가하고 완전히 용해할 때 까지 교반하였다. 이 용액에 제조예 1 에서 수득된 화합물 0.4g(2.96 밀리몰)과 N-메틸모폴린 1.0㎖ 를 가하여 상온으로 서서히 상승시키고 3.5 시간 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후에 감압증류하여 휘발성 물질을 제거하였다. 수득된 잔류물을 에틸아세테이트로 희석한 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 묽은 염산 및 포화 염수로 차례로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하고 농축하였다. 잔류물을 칼럼크로마토그라피[용출제: 에틸아세테이트/헥산(7/3, 부피비)]시켜 정제된 표제화합물 0.65g(수율 73.0%)을 수득하였다.0.7 g (2.41 mmol) of (S) -3- (4-cyano-phenyl) -2- (t-butyloxycarbonyl-amino) -propionic acid was dissolved in 6 ml of dimethylformamide (DMF). After cooling to 0 ° C., 0.7 g of 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) and 0.4 g of 1-hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) were added until complete dissolution. Stirred. 0.4 g (2.96 mmol) of the compound obtained in Preparation Example 1 and 1.0 ml of N-methylmorpholine were added to the solution, and the mixture was slowly raised to room temperature and stirred for 3.5 hours. After the reaction was completed, the product was distilled under reduced pressure to remove volatiles. The residue obtained was diluted with ethyl acetate and then washed sequentially with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, diluted hydrochloric acid and saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated. The residue was subjected to column chromatography [eluent: ethyl acetate / hexane (7/3, volume ratio)] to yield 0.65 g (yield 73.0%) of the title compound.

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ : 7.61(m, 2H), 7.32(m, 2H), 5.48, 5.01-4.86, 4.12(m, m, m, 3H), 2.75, 2.62(s, s, 3H), 2.90-1.20(m, 17H) ¹ H NMR (CDCl ₃ , ppm) δ: 7.61 (m, 2H), 7.32 (m, 2H), 5.48, 5.01-4.86, 4.12 (m, m, m, 3H), 2.75, 2.62 (s, s, 3H), 2.90-1.20 (m, 17H)

Mass(FAB, m/e) : 372(M⁺+1)Mass (FAB, m / e): 372 (M ⁺ +1)

제조예 3Preparation Example 3

5,6,7,8-테트라히드로-나프탈렌-2-술포닐클로라이드와 5,6,7,8-테트라히드로-나프탈렌-1-술포닐클로라이드의 혼합물의 합성Synthesis of a mixture of 5,6,7,8-tetrahydro-naphthalene-2-sulfonylchloride and 5,6,7,8-tetrahydro-naphthalene-1-sulfonylchloride

클로로술폰산 2.3㎖(34.6 밀리몰)를 반응용기에 가한 후, 0℃ 로 냉각시켰다. 여기에 테트랄린 2.0㎖(14.2 밀리몰)를 천천히 적가하였다. 이때 온도가 5℃ 이상 상승하지 않도록 주의하면서 적가하였다. 모두 적가한 후 반응용액을 상온으로 상승시켜 3 시간 동안 교반하였다. 0℃ 로 다시 냉각시키고 얼음을 넣어 반응을 종결시켰다. 반응용액에 물과 에틸아세테이트 40㎖ 씩을 가하여 3 회 추출한 후, 유기층을 합하여 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 여과하고 농축시켜 잔류물 3.2g 을 수득하였다. 이때 수득된 화합물은 5,6,7,8-테트라히드로-나프탈렌-2-술포닐클로라이드와 5,6,7,8-테트라히드로-나프탈렌-1-술포닐클로라이드의 혼합물로 3.2g(수율 97%)을 수득하였다.2.3 ml (34.6 mmol) of chlorosulfonic acid were added to the reaction vessel, followed by cooling to 0 ° C. 2.0 ml (14.2 mmol) of tetralin were slowly added dropwise thereto. At this time, it was added dropwise while being careful not to rise the temperature 5 ℃ or more. After all were added dropwise, the reaction solution was raised to room temperature and stirred for 3 hours. The reaction was terminated by cooling back to 0 ° C. and adding ice. Water and 40 ml of ethyl acetate were added to the reaction solution, followed by extraction three times. The organic layers were combined, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered, and concentrated to give 3.2 g of a residue. The compound obtained was 3.2 g (yield 97) as a mixture of 5,6,7,8-tetrahydro-naphthalene-2-sulfonylchloride and 5,6,7,8-tetrahydro-naphthalene-1-sulfonylchloride. %) Was obtained.

5,6,7,8-테트라히드로-나프탈렌-2-술포닐클로라이드:5,6,7,8-tetrahydro-naphthalene-2-sulfonylchloride:

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ : 7.74(d, 1H), 7.40(d, 1H), 7.27(d, 1H), 2.89(s, 4H), 1.85(s, 4H) ¹ H NMR (CDCl ₃ , ppm) δ: 7.74 (d, 1H), 7.40 (d, 1H), 7.27 (d, 1H), 2.89 (s, 4H), 1.85 (s, 4H)

5,6,7,8-테트라히드로-나프탈렌-1-술포닐클로라이드:5,6,7,8-tetrahydro-naphthalene-1-sulfonylchloride:

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ : 7.91(d, 1H), 7.30(t, 1H), 7.10(m, 1H), 2.80(m, 4H), 1.83(m, 4H) ¹ H NMR (CDCl ₃ , ppm) δ: 7.91 (d, 1H), 7.30 (t, 1H), 7.10 (m, 1H), 2.80 (m, 4H), 1.83 (m, 4H)

Mass(FAB, m/e) : 231(M⁺+1)Mass (FAB, m / e): 231 (M ⁺ +1)

제조예 4Preparation Example 4

합성synthesis

제조예 2 에서 수득한 화합물 2.0g(6.50 밀리몰)을 메탄올 10㎖ 와 함께 반응용기에 가하였다. 0℃ 로 냉각시킨 후, 여기에 아세틸클로라이드 9.2㎖(129 밀리몰)를 서서히 가하면서 교반하였다. 2 시간 동안 반응시킨 후 감압하여 휘발성 물질을 제거하고 진공 건조시켰다. 수득된 잔류물을 디메틸포름아미드에 용해시킨 후 N-메틸모폴린 2.1㎖(19.1 밀리몰)를 가하고 5 분 동안 교반하였다. 여기에 제조예 3 에서 수득한 혼합물 1.5g(6.52 밀리몰)을 가하고 2 시간 동안 상온에서 교반하였다. 감압하여 휘발성 물질을 제거하고 디클로로메탄으로 희석한 후 물로 세척하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 여과하고 농축시켰다. 수득된 잔류물을 칼럼크로마토그라피[용출제: 에틸아세테이트/헥산(4/6, 부피비)]시켜 정제된 표제화합물 1.08g(수율 36%)을 수득하였다.2.0 g (6.50 mmol) of the compound obtained in Preparation Example 2 were added to the reaction vessel together with 10 ml of methanol. After cooling to 0 ° C., 9.2 mL (129 mmol) of acetyl chloride was slowly added thereto and stirred. After reacting for 2 hours, the mixture was decompressed to remove volatiles and dried in vacuo. The residue obtained was dissolved in dimethylformamide and then 2.1 mL (19.1 mmol) N-methylmorpholine was added and stirred for 5 minutes. 1.5 g (6.52 mmol) of the mixture obtained in Preparation Example 3 was added thereto, followed by stirring at room temperature for 2 hours. The volatiles were removed under reduced pressure, diluted with dichloromethane and washed with water. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated. The obtained residue was subjected to column chromatography [eluent: ethyl acetate / hexane (4/6, volume ratio)] to yield 1.08 g (yield 36%) of the title compound.

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ : 7.55(m, 2H), 7.45(m, 1H), 7.26(m, 3H), 7.10(d, 1H), 5.72(m, 1H), 4.56, 4.49, 4.29, 3.81(m, m, m, m, 2H), 2.97(m, 2H), 2.80 (bs, 4H), 2.60, 2.34(s, s, 3H), 1.80-0.90(m, 12H) ¹ H NMR (CDCl ₃ , ppm) δ: 7.55 (m, 2H), 7.45 (m, 1H), 7.26 (m, 3H), 7.10 (d, 1H), 5.72 (m, 1H), 4.56, 4.49, 4.29, 3.81 (m, m, m, m, 2H), 2.97 (m, 2H), 2.80 (bs, 4H), 2.60, 2.34 (s, s, 3H), 1.80-0.90 (m, 12H)

Mass(FAB, m/e) : 466(M⁺+1)Mass (FAB, m / e): 466 (M ⁺ +1)

실시예 1Example 1

합성synthesis

제조예 4 에서 수득한 화합물 0.32g(0.69 밀리몰)을 피리딘 15㎖ 에 용해시켜 가지달린 플라스크에 가하였다. 여기에 트리에틸아민 0.6㎖ 를 가하였다. 플라스크의 한쪽 가지로 부터는 황화수소(H₂S) 가스를 용액내로 천천히 흘려주고 다른 한쪽 가지로 부터는 가스가 흘러나오도록 장치하였다. 약 10 분 동안 교반하면서 황화수소가스를 포화시켰다. 이때 용액의 색깔은 무색에서 초록빛으로 변하고 점점 진한 갈색으로 변화되었다. 플라스크를 고무마개로 막고 3 일 동안 상온에서 방치하였다. 반응이 완결된 후에 감압증류하여 휘발성 물질을 제거하고 진공펌프로 건조시켰다. 수득된 노란색 고체에 아세토니트릴 15㎖ 및 요오드화메탄(CH₃I) 0.13㎖(2.09 밀리몰)를 함께 가하고 1 시간 동안 가열환류시켰다. 이를 다시 감압증류하여 휘발성 물질을 제거하고 진공펌프로 건조시켰다. 잔류물을 아세토니트릴 5㎖ 에 용해시켜 교반하였다. 여기에 80% 히드라진 수화물(H₂NNH₂ㆍH₂O) 0.06㎖(0.99 밀리몰)를 10 분 간격으로 3 회에 걸쳐 나누어 가하였다. 반응이 완결된 후에 반응용액을 농축하고 HPLC 로 정제하여 표제화합물 0.3g(수율 88%)을 수득하였다.0.32 g (0.69 mmol) of the compound obtained in Preparation Example 4 was dissolved in 15 ml of pyridine and added to a flask equipped with a branch. 0.6 ml of triethylamine was added thereto. Hydrogen sulfide (H ₂ S) gas was slowly introduced into the solution from one branch of the flask, and the gas was flowed from the other branch. The hydrogen sulfide gas was saturated with stirring for about 10 minutes. The color of the solution changed from colorless to green and gradually dark brown. The flask was sealed with a rubber stopper and left at room temperature for 3 days. After the reaction was completed, the mixture was distilled under reduced pressure to remove volatiles and dried with a vacuum pump. 15 ml of acetonitrile and 0.13 ml (2.09 mmol) of methane iodide (CH ₃ I) were added together to the obtained yellow solid and heated to reflux for 1 hour. It was distilled under reduced pressure again to remove volatiles and dried with a vacuum pump. The residue was dissolved in 5 ml of acetonitrile and stirred. To this was added 0.06 mL (0.99 mmol) of 80% hydrazine hydrate (H ₂ NNH ₂ H ₂ O) in three portions at 10 minute intervals. After the reaction was completed, the reaction solution was concentrated and purified by HPLC to give 0.3g (yield 88%) of the title compound.

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ : 7.65(d, 2H), 7.42(m, 4H), 7.15(t, 1H), 4.55, 4.40, 4.00(m, m, m, 2H), 3.05, 2.90(m, m, 2H), 2.81(bs, 4H), 2.60, 2.51(s, s, 3H), 1.90-1.00(m, 12H) ¹ H NMR (CD ₃ OD, ppm) δ: 7.65 (d, 2H), 7.42 (m, 4H), 7.15 (t, 1H), 4.55, 4.40, 4.00 (m, m, m, 2H), 3.05, 2.90 (m, m, 2H), 2.81 (bs, 4H), 2.60, 2.51 (s, s, 3H), 1.90-1.00 (m, 12H)

Mass(FAB, m/e) : 498(M⁺+1)Mass (FAB, m / e): 498 (M ⁺ +1)

실시예 2Example 2

합성synthesis

실시예 1 에서 히드라진 수화물 대신에 암모늄아세테이트를 사용하여 반응혼합물을 가열환류시키고 동일한 방법으로 공정을 수행하여 정제된 표제화합물 0.27g (수율 82%)을 수득하였다.In Example 1, the reaction mixture was heated to reflux using ammonium acetate instead of hydrazine hydrate and the process was carried out in the same manner to obtain 0.27 g (yield 82%) of the purified title compound.

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ : 7.73(d, 2H), 7.44(m, 4H), 7.15(t, 1H), 4.56, 4.42, 4.05(m, m, m, 2H), 3.06, 2.90(m, m, 2H), 2.81(bs, 4H), 2.65, 2.54(s, s, 3H), 1.90-1.00(m, 12H) ¹ H NMR (CD ₃ OD, ppm) δ: 7.73 (d, 2H), 7.44 (m, 4H), 7.15 (t, 1H), 4.56, 4.42, 4.05 (m, m, m, 2H), 3.06, 2.90 (m, m, 2H), 2.81 (bs, 4H), 2.65, 2.54 (s, s, 3H), 1.90-1.00 (m, 12H)

Mass(FAB, m/e) : 483(M⁺+1)Mass (FAB, m / e): 483 (M ⁺ +1)

실시예 3Example 3

합성synthesis

실시예 1 에서 히드라진 수화물 대신에 메틸아민을 사용하여 동일한 방법으로 공정을 수행하여 정제된 표제화합물 0.26g(수율 76%)을 수득하였다.The process was carried out in the same manner using methylamine instead of hydrazine hydrate in Example 1 to yield 0.26 g (76% yield) of the title compound.

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ : 7.66(d, 2H), 7.44(m, 4H), 7.16(t, 1H), 4.56, 4.41, 4.01(m, m, m, 2H), 3.08(s, 3H), 3.06, 2.90(m, m, 2H), 2.81(bs, 4H), 2.63, 2.50(s, s, 3H), 1.90-1.00(m, 12H) ¹ H NMR (CD ₃ OD, ppm) δ: 7.66 (d, 2H), 7.44 (m, 4H), 7.16 (t, 1H), 4.56, 4.41, 4.01 (m, m, m, 2H), 3.08 ( s, 3H), 3.06, 2.90 (m, m, 2H), 2.81 (bs, 4H), 2.63, 2.50 (s, s, 3H), 1.90-1.00 (m, 12H)

Mass(FAB, m/e) : 497(M⁺+1)Mass (FAB, m / e): 497 (M ⁺ +1)

제조예 5Preparation Example 5

합성synthesis

제조예 3 에서 수득한 혼합물을 출발물질로 사용하여 제조예 4 와 동일한 방법으로 공정을 수행하여 정제된 표제화합물 0.44g(수율 15%)을 수득하였다.Using the mixture obtained in Preparation Example 3 as a starting material, the same process as in Preparation Example 4 was carried out to obtain 0.44 g (yield 15%) of the title compound.

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ : 7.71(dd, 1H), 7.52(d, 2H), 7.18(m, 3H), 7.10(m, 1H), 5.78(d, 1H), 4.57, 4.48, 4.28, 3.78(m, m, m, m, 2H), 3.20-2.80(m, 6H), 2.60, 2.26(s, s, 3H), 1.90-0.90(m, 12H) ¹ H NMR (CDCl ₃ , ppm) δ: 7.71 (dd, 1H), 7.52 (d, 2H), 7.18 (m, 3H), 7.10 (m, 1H), 5.78 (d, 1H), 4.57, 4.48, 4.28, 3.78 (m, m, m, m, 2H), 3.20-2.80 (m, 6H), 2.60, 2.26 (s, s, 3H), 1.90-0.90 (m, 12H)

Mass(FAB, m/e) : 466(M⁺+1)Mass (FAB, m / e): 466 (M ⁺ +1)

실시예 4Example 4

합성synthesis

제조예 5 에서 수득한 화합물 0.44g(0.95 밀리몰)을 사용하여 실시예 1 에서와 동일한 방법으로 공정을 수행하여 정제된 표제화합물 0.34g(수율 72%)을 수득하였다.0.44 g (0.95 mmol) of the compound obtained in Preparation Example 5 was used in the same manner as in Example 1 to obtain 0.34 g (yield 72%) of the title compound.

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ : 7.70(dd, 1H), 7.60(d, 2H), 7.36(dd, 2H), 7.25(d, 1H), 7.16(q, 1H), 4.50, 4.38, 4.34, 3.91(m, m, m, m, 2H), 3.10-2.90(m, 4H), 2.78(bs, 2H), 2.45, 2.39(s, s, 3H), 1.85-0.97(m, 12H) ¹ H NMR (CD ₃ OD, ppm) δ: 7.70 (dd, 1H), 7.60 (d, 2H), 7.36 (dd, 2H), 7.25 (d, 1H), 7.16 (q, 1H), 4.50, 4.38 , 4.34, 3.91 (m, m, m, m, 2H), 3.10-2.90 (m, 4H), 2.78 (bs, 2H), 2.45, 2.39 (s, s, 3H), 1.85-0.97 (m, 12H )

Mass(FAB, m/e) : 498(M⁺+1)Mass (FAB, m / e): 498 (M ⁺ +1)

제조예 6Preparation Example 6

6-클로로술포닐-1,2,3,4-테트라히드로-나프탈렌-2-카복실산 메틸에스테르와 7-클로로술포닐-1,2,3,4-테트라히드로-나프탈렌-2-카복실산 메틸에스테르의 합성Of 6-chlorosulfonyl-1,2,3,4-tetrahydro-naphthalene-2-carboxylic acid methylester and 7-chlorosulfonyl-1,2,3,4-tetrahydro-naphthalene-2-carboxylic acid methylester synthesis

제조예 3 에서 1,2,3,4-테트라히드로-나프탈렌 대신에 1,2,3,4-테트라히드로-나프탈렌-2-카복실산 메틸에스테르를 사용하여 동일한 방법으로 반응을 수행하여 생성물을 수득하였다. 이 생성물은 6-클로로술포닐-1,2,3,4-테트라히드로-나프탈렌-2-카복실산 메틸에스테르와 7-클로로술포닐-1,2,3,4-테트라히드로-나프탈렌-2-카복실산 메틸에스테르의 혼합물이었으며, NMR 분석에 의한 비율은 1:1 이었다. 이를 환산하면 표제화합물은 0.84g(수율 30%)으로 수득된 것이다.In Production Example 3, the reaction was carried out in the same manner using 1,2,3,4-tetrahydro-naphthalene-2-carboxylic acid methyl ester instead of 1,2,3,4-tetrahydro-naphthalene to obtain a product. . This product contains 6-chlorosulfonyl-1,2,3,4-tetrahydro-naphthalene-2-carboxylic acid methylester and 7-chlorosulfonyl-1,2,3,4-tetrahydro-naphthalene-2-carboxylic acid It was a mixture of methyl esters and the ratio by NMR analysis was 1: 1. In terms of this, the title compound was obtained in 0.84 g (30% yield).

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ : 7.78(m, 1H), 7.38-7.10(m, 2H), 3.75(s, s, 3H), 3.15-2.70(m, 5H), 2.22(m, 1H), 2.00-1.81(m, 1H) ¹ H NMR (CDCl ₃ , ppm) δ: 7.78 (m, 1H), 7.38-7.10 (m, 2H), 3.75 (s, s, 3H), 3.15-2.70 (m, 5H), 2.22 (m, 1H ), 2.00-1.81 (m, 1 H)

제조예 7Preparation Example 7

합성synthesis

제조예 3 에서 수득한 화합물 대신에 제조예 6 에서 수득한 화합물을 사용하여 제조예 4 와 동일한 방법에 따라 반응을 수행하여 표제화합물(A) 0.38g(수율 17%) 및 (B) 0.37g(수율 16%)을 수득하였다.Instead of the compound obtained in Preparation Example 3, using the compound obtained in Preparation Example 6, the reaction was carried out according to the same method as Preparation Example 4, where 0.38 g (yield 17%) of the title compound (A) and 0.37 g (B) were obtained. Yield 16%) was obtained.

화합물 (A) :Compound (A):

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ : 7.52-7.18(m, 7H), 5.76(m, 1H), 4.65, 4.48, 4.32, 3.89(m, 2H), 3.84, 3.81(s, s, 3H), 3.05-2.75(m, 7H), 2.60, 2.58, 2.38, 2.35 (s, s, s, s, 3H), 2.20(m, 1H), 1.82(m, 1H), 1.65-1.02(m, 8H) ¹ H NMR (CDCl ₃ , ppm) δ: 7.52-7.18 (m, 7H), 5.76 (m, 1H), 4.65, 4.48, 4.32, 3.89 (m, 2H), 3.84, 3.81 (s, s, 3H) , 3.05-2.75 (m, 7H), 2.60, 2.58, 2.38, 2.35 (s, s, s, s, 3H), 2.20 (m, 1H), 1.82 (m, 1H), 1.65-1.02 (m, 8H )

화합물 (B) :Compound (B):

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ : 7.66-7.20(m, 7H), 5.80(m, 1H), 4.64, 4.42, 4.30, 3.89(m, 2H), 3.83, 3.81(s, s, 3H), 3.05-2.75(m, 7H), 2.61, 2.55, 2.37, 2.34 (s, s, s, s, 3H), 2.20(m, 1H), 1.82(m, 1H), 1.70-1.10(m, 8H) ¹ H NMR (CDCl ₃ , ppm) δ: 7.66-7.20 (m, 7H), 5.80 (m, 1H), 4.64, 4.42, 4.30, 3.89 (m, 2H), 3.83, 3.81 (s, s, 3H) , 3.05-2.75 (m, 7H), 2.61, 2.55, 2.37, 2.34 (s, s, s, s, 3H), 2.20 (m, 1H), 1.82 (m, 1H), 1.70-1.10 (m, 8H )

실시예 5Example 5

합성synthesis

제조예 7 에서 수득한 화합물 (A) 를 사용하여 실시예 1 에서와 동일한 방법으로 반응을 수행하여 표제화합물 0.25g(수율 70%)을 수득하였다.Using the compound (A) obtained in Preparation Example 7, the reaction was carried out in the same manner as in Example 1 to obtain 0.25 g (yield 70%) of the title compound.

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ : 7.70-7.32(m, 7H), 4.62, 4.51, 4.12(m, m, m, 2H), 3.80(s, 3H), 3.12-2.91(m, 7H), 2.68, 2.65, 2.57, 2.54(s, s, s, s, 3H), 2.28 (m, 1H), 1.92(m, 1H), 1.72-1.18(m, 8H) ¹ H NMR (CD ₃ OD, ppm) δ: 7.70-7.32 (m, 7H), 4.62, 4.51, 4.12 (m, m, m, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.12-2.91 (m, 7H ), 2.68, 2.65, 2.57, 2.54 (s, s, s, s, 3H), 2.28 (m, 1H), 1.92 (m, 1H), 1.72-1.18 (m, 8H)

Mass(FAB, m/e) : 551(M⁺+1)Mass (FAB, m / e): 551 (M ⁺ +1)

실시예 6Example 6

합성synthesis

실시예 5 에서 수득한 화합물 250㎎(0.308 밀리몰)을 메탄올 10㎖ 에 용해시키고 리튬하이드록사이드 40㎎ 을 가하였다. 반응혼합물을 상온에서 6 시간 동안 교반한 후에 아세트산으로 중화하고 감압하에서 용매를 제거하고 용취용 고압액상크로마토그라피(preparative HPLC)[용출제: 물/메탄올(4/1, 부피비)]에 의해 분리하여 표제화합물 55㎎(수율 20%)을 수득하였다.250 mg (0.308 mmol) of the compound obtained in Example 5 were dissolved in 10 ml of methanol, and 40 mg of lithium hydroxide was added. The reaction mixture was stirred at room temperature for 6 hours, neutralized with acetic acid, the solvent was removed under reduced pressure, and separated by preparative HPLC (eluent: water / methanol (4/1, volume ratio)). 55 mg (20% yield) of the title compound were obtained.

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ : 7.70-7.22(m, 7H), 4.62, 4.51, 4.12(m, m, m, 2H), 3.12-2.91(m, 7H), 2.68, 2.65, 2.57, 2.52(s, s, s, s, 3H), 2.28(m, 1H), 1.92 (m, 1H), 1.72-1.18(m, 8H) ¹ H NMR (CD ₃ OD, ppm) δ: 7.70-7.22 (m, 7H), 4.62, 4.51, 4.12 (m, m, m, 2H), 3.12-2.91 (m, 7H), 2.68, 2.65, 2.57 , 2.52 (s, s, s, s, 3H), 2.28 (m, 1H), 1.92 (m, 1H), 1.72-1.18 (m, 8H)

Mass(FAB, m/e) : 536(M⁺+1)Mass (FAB, m / e): 536 (M ⁺ +1)

실시예 7Example 7

합성synthesis

제조예 7 에서 수득한 화합물 (B) 를 사용하여 실시예 1 과 동일한 방법으로 반응을 수행하여 표제화합물 0.20g(수율 65%)을 수득하였다.Using the compound (B) obtained in Preparation Example 7, the reaction was carried out in the same manner as in Example 1 to obtain 0.20 g (yield 65%) of the title compound.

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ : 7.68-7.30(m, 7H), 4.60, 4.52, 4.13(m, m, m, 2H), 3.81(s, 3H), 3.14-2.90(m, 7H), 2.67, 2.65, 2.56, 2.53(s, s, s, s, 3H), 2.27 (m, 1H), 1.94(m, 1H), 1.80-1.15(m, 8H) ¹ H NMR (CD ₃ OD, ppm) δ: 7.68-7.30 (m, 7H), 4.60, 4.52, 4.13 (m, m, m, 2H), 3.81 (s, 3H), 3.14-2.90 (m, 7H ), 2.67, 2.65, 2.56, 2.53 (s, s, s, s, 3H), 2.27 (m, 1H), 1.94 (m, 1H), 1.80-1.15 (m, 8H)

Mass(FAB, m/e) : 551(M⁺+1)Mass (FAB, m / e): 551 (M ⁺ +1)

실시예 8Example 8

합성synthesis

실시예 7 에서 수득한 화합물을 사용하여 실시예 6 에서와 동일한 방법으로 반응을 수행하여 표제화합물 50㎎(수율 25%)을 수득하였다.The reaction was carried out in the same manner as in Example 6 using the compound obtained in Example 7, to obtain 50 mg (25% yield) of the title compound.

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ : 7.71-7.22(m, 7H), 4.60, 4.51, 4.15(m, m, m, 2H), 3.12-2.90(m, 7H), 2.65, 2.63, 2.56, 2.51(s, s, s, s, 3H), 2.28(m, 1H), 1.91 (m, 1H), 1.71-1.15(m, 8H) ¹ H NMR (CD ₃ OD, ppm) δ: 7.71-7.22 (m, 7H), 4.60, 4.51, 4.15 (m, m, m, 2H), 3.12-2.90 (m, 7H), 2.65, 2.63, 2.56 , 2.51 (s, s, s, s, 3H), 2.28 (m, 1H), 1.91 (m, 1H), 1.71-1.15 (m, 8H)

Mass(FAB, m/e) : 536(M⁺+1)Mass (FAB, m / e): 536 (M ⁺ +1)

제조예 8Preparation Example 8

3-메틸-퀴놀린-8-술포닐클로라이드의 합성Synthesis of 3-methyl-quinoline-8-sulfonylchloride

제조예 3 에서 1,2,3,4-테트라히드로-나프탈렌 대신에 3-메틸퀴놀린 1g(4.14 밀리몰)을 사용하여 동일한 방법으로 반응을 수행하여 표제화합물 1.1g(수율 69%) 을 수득하였다.In Preparation Example 3, the reaction was carried out in the same manner using 1 g (4.14 mmol) of 3-methylquinoline instead of 1,2,3,4-tetrahydro-naphthalene to obtain 1.1 g (yield 69%) of the title compound.

¹H NMR(DMSO, ppm) δ : 9.23(s, 1H), 9.16(s, 1H), 8.36(dd, 2H), 7.96(t, 1H), 2.67(s, 3H) ¹ H NMR (DMSO, ppm) δ: 9.23 (s, 1H), 9.16 (s, 1H), 8.36 (dd, 2H), 7.96 (t, 1H), 2.67 (s, 3H)

Mass(FAB, m/e) : 242(M⁺+1)Mass (FAB, m / e): 242 (M ⁺ +1)

제조예 9Preparation Example 9

합성synthesis

제조예 8 에서 수득한 화합물 1.9g(4.9 밀리몰)을 사용하여 제조예 4 와 동일한 방법으로 반응을 수행하여 정제된 표제화합물 1.1g(수율 56%)을 수득하였다.Using 1.9 g (4.9 mmol) of the compound obtained in Preparation Example 8, the reaction was carried out in the same manner as in Preparation Example 4, to obtain 1.1 g (56% yield) of the title compound.

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ : 8.87(s, 1H), 8.1(m, 1H), 7.9(m, 2H), 7.43(m, 3H), 7.15(m, 2H), 4.72, 4.58(m, m, 1H), 4.0, 3.72(m, m, 1H), 2.95(m, 2H), 2.5(s, 3H), 2.03, 1.97(s, s, 3H), 1.5-0.7(m, 8H) ¹ H NMR (CDCl ₃ , ppm) δ: 8.87 (s, 1H), 8.1 (m, 1H), 7.9 (m, 2H), 7.43 (m, 3H), 7.15 (m, 2H), 4.72, 4.58 ( m, m, 1H), 4.0, 3.72 (m, m, 1H), 2.95 (m, 2H), 2.5 (s, 3H), 2.03, 1.97 (s, s, 3H), 1.5-0.7 (m, 8H )

Mass(FAB, m/e) : 477(M⁺+1)Mass (FAB, m / e): 477 (M ⁺ +1)

제조예 10Preparation Example 10

합성synthesis

제조예 9 에서 수득한 화합물 0.2g(0.42 밀리몰)을 피리딘 3㎖ 와 트리에틸아민 0.1㎖ 에 용해시키고 황화수소(H₂S)로 포화시켰다. 반응혼합물을 상온에서 3 일 동안 방치하여 반응을 완결시킨 다음 1N HCl 로 산성화시키고 에틸아세테이트로 추출하여, 추출물을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 여과한 후에 농축시켜 황색고체로서 잔류물을 수득하였다. 이 잔류물을 무수 아세토니트릴 10㎖ 에 용해시키고 요오드화메탄(CH₃I) 0.5㎖ 를 가한 후에 2 시간 동안 가열환류시켰다. 반응이 완결된 후에 에틸에스테르 30㎖ 를 가하여 생성물을 고체화하였다. 생성된 고체를 여과하여 모아 질소로 건조시켜 표제화합물 192㎎(수율 93%)을 수득하였다.0.2 g (0.42 mmol) of the compound obtained in Preparation Example 9 was dissolved in 3 ml of pyridine and 0.1 ml of triethylamine, and saturated with hydrogen sulfide (H ₂ S). The reaction mixture was left at room temperature for 3 days to complete the reaction, acidified with 1N HCl, extracted with ethyl acetate, the extract was dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated to give a residue as a yellow solid. This residue was dissolved in 10 ml of anhydrous acetonitrile and 0.5 ml of methane iodide (CH ₃ I) was added and then heated to reflux for 2 hours. After the reaction was completed, 30 ml of ethyl ester was added to solidify the product. The resulting solid was collected by filtration and dried over nitrogen to give 192 mg (yield 93%) of the title compound.

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ : 8.9(s, 1H), 8.1(m, 1H), 7.92(m, 2H), 7.83(m, 2H), 7.48(m, 1H), 7.28(m, 2H), 4.75, 4.6(m, m, 1H), 4.02, 3.8(m, m, 1H), 3.03 (s, 3H), 2.96(m, 2H), 2.5(s, 3H), 2.3, 2.1(s, s, 3H), 1.6-0.7(m, 8H) ¹ H NMR (CDCl ₃ , ppm) δ: 8.9 (s, 1H), 8.1 (m, 1H), 7.92 (m, 2H), 7.83 (m, 2H), 7.48 (m, 1H), 7.28 (m, 2H), 4.75, 4.6 (m, m, 1H), 4.02, 3.8 (m, m, 1H), 3.03 (s, 3H), 2.96 (m, 2H), 2.5 (s, 3H), 2.3, 2.1 ( s, s, 3H), 1.6-0.7 (m, 8H)

Mass(FAB, m/e) : 525(M⁺+1)Mass (FAB, m / e): 525 (M ⁺ +1)

제조예 11Preparation Example 11

합성synthesis

제조예 10 에서 수득한 화합물 60㎎(0.12 밀리몰)을 메탄올 1㎖ 에 용해시키고 N-t-부톡시카보닐히드라진(H₂NNHCOO⁺) 20㎎(1.2 몰당량)을 가하였다. 반응혼합물을 상온에서 1 시간 동안 교반한 후 농축하였다. 잔류물을 칼럼크로마토그라피[용출제: 디클로로메탄/메탄올(20/1, 부피비)]시켜 정제하여 표제화합물 43㎎(수율 58%)을 수득하였다.60 mg (0.12 mmol) of the compound obtained in Preparation Example 10 was dissolved in 1 ml of methanol, and 20 mg (1.2 molar equivalents) of Nt-butoxycarbonylhydrazine (H ₂ NNHCOO ⁺ ) was added. The reaction mixture was stirred at room temperature for 1 hour and then concentrated. The residue was purified by column chromatography [eluent: dichloromethane / methanol (20/1, volume ratio)] to give 43 mg (yield 58%) of the title compound.

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ : 8.93(m, 1H), 8.19(m, 1H), 7.99(s, 1H), 7.95(d, 1H), 7.55(d, 2H), 7.51(m, 1H), 7.14(dd, 1H), 4.76, 4.6(m, m, 1H), 4.05, 3.8 (m, m, 1H), 2.95(m, 2H), 2.53(s, 3H), 2.18, 2.06(s, s, 3H), 1.49(s, 9H), 1.45-0.7(m, 8H) ¹ H NMR (CDCl ₃ , ppm) δ: 8.93 (m, 1H), 8.19 (m, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.95 (d, 1H), 7.55 (d, 2H), 7.51 (m, 1H), 7.14 (dd, 1H), 4.76, 4.6 (m, m, 1H), 4.05, 3.8 (m, m, 1H), 2.95 (m, 2H), 2.53 (s, 3H), 2.18, 2.06 ( s, s, 3H), 1.49 (s, 9H), 1.45-0.7 (m, 8H)

Mass(FAB, m/e) : 609(M⁺+1)Mass (FAB, m / e): 609 (M ⁺ +1)

실시예 9Example 9

합성synthesis

제조예 11 에서 수득한 화합물 25㎎(3.7 밀리몰)을 메탄올 10㎖ 에 용해시키고 이산화백금 촉매(PtO₂) 5㎎ 을 가한 다음 30psi 수소기압하에서 3 일 동안 교반하였다. 반응혼합물을 여과한 후 농축하고, 잔류물을 칼럼크로마토그라피시켜 정제하고 트리플루오로아세트산(CF₃COOH)으로 처리하여 표제화합물 15㎎(수율 82%)을 수득하였다.25 mg (3.7 mmol) of the compound obtained in Preparation Example 11 was dissolved in 10 ml of methanol, 5 mg of a platinum dioxide catalyst (PtO ₂ ) was added thereto, followed by stirring for 3 days under 30 psi hydrogen pressure. The reaction mixture was filtered and concentrated, and the residue was purified by column chromatography and treated with trifluoroacetic acid (CF ₃ COOH) to give 15 mg (yield 82%) of the title compound.

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ : 7.66(m, 1H), 7.6(m, 1H), 7.4(m, 3H), 7.05(m, 1H), 6.5(m, 1H), 4.4-3.9(m, 2H), 3.4(m, 1H), 3.2-2.7(m, 5H), 2.52, 2.5(s, s, 3H), 1.9-0.9(m, 9H), 1.05(d, 3H) ¹ H NMR (CD ₃ OD, ppm) δ: 7.66 (m, 1H), 7.6 (m, 1H), 7.4 (m, 3H), 7.05 (m, 1H), 6.5 (m, 1H), 4.4-3.9 (m, 2H), 3.4 (m, 1H), 3.2-2.7 (m, 5H), 2.52, 2.5 (s, s, 3H), 1.9-0.9 (m, 9H), 1.05 (d, 3H)

Mass(FAB, m/e) : 513(M⁺+1)Mass (FAB, m / e): 513 (M ⁺ +1)

제조예 12Preparation Example 12

합성synthesis

제조예 4 와 동일한 방법으로 퀴놀린-8-술포닐클로라이드와 (S)-아미노-3- (4-시아노-페닐)-N-사이클로펜틸-N-메틸-프로피온아미드 트리플루오로아세트산염을 반응시켜 표제화합물을 수득하였다(수율 97%).Reaction of quinoline-8-sulfonylchloride and (S) -amino-3- (4-cyano-phenyl) -N-cyclopentyl-N-methyl-propionamide trifluoroacetic acid salt in the same manner as in Preparation Example 4 To give the title compound (yield 97%).

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ : 9.02(m, 1H), 8.2(m, 2H), 7.96(d, 1H), 7.49(m, 2H), 7.39(d, 2H), 7.18(m, 2H), 4.72, 4.58(m, m, 1H), 4.0, 3.72(m, 1H), 2.95(m, 2H), 2.04, 1.97(m, 3H), 1.4-0.6(m, 8H) ¹ H NMR (CDCl ₃ , ppm) δ: 9.02 (m, 1H), 8.2 (m, 2H), 7.96 (d, 1H), 7.49 (m, 2H), 7.39 (d, 2H), 7.18 (m, 2H), 4.72, 4.58 (m, m, 1H), 4.0, 3.72 (m, 1H), 2.95 (m, 2H), 2.04, 1.97 (m, 3H), 1.4-0.6 (m, 8H)

Mass(FAB, m/e) : 463(M⁺+1)Mass (FAB, m / e): 463 (M ⁺ +1)

제조예 13Preparation Example 13

합성synthesis

제조예 12 에서 수득한 화합물을 사용하여 제조예 10 과 동일한 방법으로 반응을 수행하여 표제화합물을 수득하였다(수율 95%).Using the compound obtained in Preparation Example 12, the reaction was carried out in the same manner as in Preparation Example 10 to obtain the title compound (yield 95%).

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ : 9.26(d, 2H), 2.49(m, 1H), 8.28(m, 2H), 5.8, 4.78 (m, m, 1H), 4.1, 3.85(m, m, 1H), 3.14, 3.13(s, s, 3H), 3.02(m, 2H), 2.30, 2.17(s, s, 3H), 1.6-0.7(m, 8H) ¹ H NMR (CDCl ₃ , ppm) δ: 9.26 (d, 2H), 2.49 (m, 1H), 8.28 (m, 2H), 5.8, 4.78 (m, m, 1H), 4.1, 3.85 (m, m , 1H), 3.14, 3.13 (s, s, 3H), 3.02 (m, 2H), 2.30, 2.17 (s, s, 3H), 1.6-0.7 (m, 8H)

Mass(FAB, m/e) : 511(M⁺+1)Mass (FAB, m / e): 511 (M ⁺ +1)

제조예 14Preparation Example 14

합성synthesis

제조예 13 에서 수득한 화합물을 사용하여 제조예 11 과 동일한 방법으로 반응을 수행하여 표제화합물을 수득하였다(수율 87%).Using the compound obtained in Preparation Example 13, the reaction was carried out in the same manner as in Preparation Example 11 to obtain the title compound (yield 87%).

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ : 9.05(m, 1H), 8.2(m, 2H), 7.95(d, 1H), 7.5(m, 4H), 7.1(m, 2H), 4.72, 4.55(m, m, 1H), 4.76, 4.68(m, m, 1H), 2.9(m, 2H), 2.13, 2.03(s, s, 3H), 1.48(s, 9H), 1.6-0.6(m, 8H) ¹ H NMR (CDCl ₃ , ppm) δ: 9.05 (m, 1H), 8.2 (m, 2H), 7.95 (d, 1H), 7.5 (m, 4H), 7.1 (m, 2H), 4.72, 4.55 ( m, m, 1H), 4.76, 4.68 (m, m, 1H), 2.9 (m, 2H), 2.13, 2.03 (s, s, 3H), 1.48 (s, 9H), 1.6-0.6 (m, 8H )

Mass(FAB, m/e) : 595(M⁺+1)Mass (FAB, m / e): 595 (M ⁺ +1)

실시예 10Example 10

합성synthesis

제조예 14 에서 수득한 화합물을 사용하여 실시예 9 와 동일한 방법으로 반응을 수행하여 표제화합물을 수득하였다(수율 83%).Using the compound obtained in Preparation 14, the reaction was carried out in the same manner as in Example 9 to obtain the title compound (yield 83%).

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ : 7.6(d, 2H), 7.4(m, 3H), 7.06(m, 1H), 6.65(m, 1H), 4.5-4.0(m, 2H), 3.3(m, 2H), 3.0(m, 1H), 2.85(m, 1H), 2.72(m, 2H), 2.52, 2.50(s, s, 3H), 1.90(m, 2H), 1.6(m, 4H), 1.4(m, 3H), 1.02(m, 1H) ¹ H NMR (CD ₃ OD, ppm) δ: 7.6 (d, 2H), 7.4 (m, 3H), 7.06 (m, 1H), 6.65 (m, 1H), 4.5-4.0 (m, 2H), 3.3 (m, 2H), 3.0 (m, 1H), 2.85 (m, 1H), 2.72 (m, 2H), 2.52, 2.50 (s, s, 3H), 1.90 (m, 2H), 1.6 (m, 4H ), 1.4 (m, 3H), 1.02 (m, 1H)

Mass(FAB, m/e) : 499(M⁺+1)Mass (FAB, m / e): 499 (M ⁺ +1)

실험예 1 : 트롬빈 저해제의 억제활성Experimental Example 1 Inhibitory Activity of a Thrombin Inhibitor

본 발명의 화합물인 트롬빈 억제제의 효소억제효과는 효소와 반응하여 색을 생성하는 기질을 사용하여 분광광도법으로 측정된 속도상수 Ki 및 Ks 로 결정하였다. 속도상수 Ki 값은 효소와 기질 및 억제제를 동시에 가하였을 경우에 억제제가 효소활성을 억제하는 정도를 나타낸 것이고, 속도상수 Ks 값은 효소와 저해제를 미리 일정 시간 동안 반응시킨 다음 기질을 가수분해하는 속도를 측정하여 얻은 값이다. 트롬빈이 기질인 크로모자임 TH(토실-Gly-Pro-Arg-4-니트로아닐리드아세테이트)를 가수분해하면 파라-니트로아닐리드가 생성된다. 이렇게 생성되는 노란색의 파라-니트로아닐리드의 양을 시간에 따른 흡광도의 변화로 측정하였다. 이 속도로 부터 효소의 활성을 측정할 수 있으며, 억제제의 효소활성 억제능력을 측정할 수 있다.The enzymatic inhibitory effect of the thrombin inhibitor, a compound of the present invention, was determined by the rate constants Ki and Ks measured spectrophotometrically using a substrate that reacts with an enzyme to produce color. The rate constant Ki value indicates the degree to which the inhibitor inhibits the enzyme activity when the enzyme, the substrate and the inhibitor are added simultaneously. The rate constant Ks value indicates the rate at which the enzyme and the inhibitor are reacted for a predetermined time before the hydrolysis of the substrate. The value obtained by measuring Hydrolysis of thrombin, a substrate, chromozyme TH (tosyl-Gly-Pro-Arg-4-nitroanilide acetate) produces para-nitroanilide. The amount of yellow para-nitroanilide thus produced was measured as a change in absorbance over time. From this rate the activity of the enzyme can be measured and the inhibitory capacity of the inhibitor can be measured.

본 발명에 따른 화합물의 트롬빈에 대한 억제활성을 후술하는 방법에 따라 측정하였다.The inhibitory activity against thrombin of the compound according to the present invention was measured according to the method described below.

1.5㎖ 큐벳에 150mM NaCl, 0.1% PEG8000(폴리에틸렌글리콜, 분자량 약 8000)이 함유되어 있는 0.1M 트리스 완충용액(pH 7.8)을 1160㎕ 씩 가하였다. 기질용액으로는 크로모자임 TH 를 디메틸술폭사이드(DMSO)에 10mM 농도로 용해시킨 후 상기 완충용액으로 희석하여 0.1mM 농도가 되도록 제조한 것을 사용하였다. 이렇게 제조한 0.1mM 기질용액 225㎕ 를 큐벳에 가하였다. 억제제 용액으로는 본 발명에 따른 트롬빈 억제제 화합물을 디메틸술폭사이드에 10㎎/㎖ 의 농도가 되도록 용해시킨 후, 상기 완충용액으로 희석하여 0.1㎎/㎖, 0.01㎎/㎖, 0.001㎎/㎖ 농도로 만든 것을 억제제의 양이 0 내지 10㎍ 사이가 되게 취한 후 트리스 완충용액으로 전체 부피가 100㎕ 가 되도록 하여 큐벳에 가하였다.1160 μl of 0.1M Tris buffer (pH 7.8) containing 150 mM NaCl and 0.1% PEG8000 (polyethylene glycol, molecular weight about 8000) was added to a 1.5 mL cuvette. The substrate solution was prepared by dissolving Chromozyme TH in dimethyl sulfoxide (DMSO) at a concentration of 10 mM and diluting with the buffer solution to a concentration of 0.1 mM. 225 µl of the 0.1 mM substrate solution thus prepared was added to the cuvette. As an inhibitor solution, the thrombin inhibitor compound according to the present invention was dissolved in dimethyl sulfoxide to a concentration of 10 mg / ml, and then diluted with the buffer solution at concentrations of 0.1 mg / ml, 0.01 mg / ml, and 0.001 mg / ml. After the preparation was taken so that the amount of inhibitor was between 0 and 10 μg, the total volume was added to the cuvette with 100 μl of Tris buffer solution.

실온에서 반응용액이 들어 있는 큐벳에 각각 상기 트리스 완충용액에 0.1㎎/㎖ 농도로 용해시킨 트롬빈(human thrombin) 15㎕ 를 가하여 효소 가수분해반응을 시작하였다. 효소를 가한 순간부터 2 분 동안 반응에 의해 생성되는 파라-니트로아닐리드의 양을 381㎚ 에서의 흡광도의 변화로 모니터하여 반응시간 대 흡광도의 연속 스펙트럼을 도시하였다. 여러 종류의 억제제 농도에 대해 위의 실험을 수행하여 연속 스펙트럼을 얻었다.At room temperature, 15 μl of thrombin dissolved in the Tris buffer solution at a concentration of 0.1 mg / ml was added to the cuvette containing the reaction solution. The amount of para-nitroanilide produced by the reaction for 2 minutes from the moment of addition of the enzyme was monitored by the change in absorbance at 381 nm to show a continuous spectrum of reaction time versus absorbance. The above experiments were performed for different inhibitor concentrations to obtain continuous spectra.

각 스펙트럼에서 반응시간 초기 30 초 이내에 기울기로 부터 초기속도 Vi 를 구한 후, 억제제 농도 대비 초기속도의 역수(1/Vi) 그래프를 도시하였다. 그래프 위의 점들을 만족하는 1 차식을 계산해낸 후 그 식의 x 절편으로 부터 이하의 효소반응식(Michaelis-Menten equation)을 사용하여 Ki 를 계산해 낼수 있다. 이 계산에 사용된 Km 값은 5.2μM 로 일정 효소농도에서 기질의 농도를 변화시킴으로서 구한 것이다.After calculating the initial velocity Vi from the slope within 30 seconds of the initial reaction time in each spectrum, an inverse (1 / Vi) graph of the initial velocity versus the inhibitor concentration is shown. After calculating the first equation that satisfies the points on the graph, Ki can be calculated from the x-intercept of the equation using the Michaelis-Menten equation. The Km value used in this calculation was 5.2 μM, determined by varying the substrate concentration at a constant enzyme concentration.

효소반응식(Michaelis-Menten equation)Michaelis-Menten equation

상기 효소반응식에서 [I] 는 억제제의 농도를 나타내고, [S] 는 기질의 농도를 의미하며, Vmax 는 최고 초기속도를 의미하고, Km 은 미카엘리스(Michaelis) 상수로 여기에서는 5.2μM 을 의미한다.In the enzyme scheme, [I] denotes the concentration of the inhibitor, [S] denotes the concentration of the substrate, Vmax denotes the maximum initial velocity, and Km denotes the Michaelis constant, which means 5.2 μM. .

속도상수 Ks 는 상기 Ki 를 구할 때 사용한 것과 동일한 용액을 동일한 농도로 사용하였으나 실험방법은 다음과 같다.The rate constant Ks was used in the same concentration as the same solution used to obtain the Ki, but the experimental method is as follows.

즉, 1.5㎖ 용량 큐벳에 완충용액 1160㎕ 를 가하고, 여기에 0.1㎎/㎖ 트롬빈(human thrombin) 용액 15㎕ 및 억제제 용액 100㎕ 를 가하여 실온에서 15 분 동안 방치한 후 0.1mM 기질용액 225㎕ 를 가하면서 2 분 동안 시간의 변화에 따른 흡광도의 변화를 모니터하였다. 얻어진 연속 스펙트럼에서 직선을 나타내는 부분의 기울기를 측정하여 Vs 로 나타낸다. 이 실험을 여러 억제제 농도에서 실행하여 각 억제제 농도에서 Vs 값을 얻어 억제제 농도에 대한 1/Vs 의 그래프를 도시하였다. 그래프 위의 점들을 만족시키는 1 차식을 얻어낸 후 그의 x 절편으로 부터 효소반응식을 이용하여 Ks 값을 결정하였다.That is, 1160 µl of buffer solution was added to a 1.5 ml volume cuvette, and 15 µl of 0.1 mg / ml human thrombin solution and 100 µl of inhibitor solution were added thereto, and the mixture was left at room temperature for 15 minutes, followed by 225 µl of 0.1 mM substrate solution. The change in absorbance over time was monitored for 2 minutes with addition. The inclination of the part showing a straight line in the obtained continuous spectrum is measured and represented by Vs. This experiment was run at several inhibitor concentrations to obtain Vs values at each inhibitor concentration, showing a graph of 1 / Vs versus inhibitor concentration. After obtaining a linear equation satisfying the points on the graph, the Ks value was determined from the x-section using the enzyme reaction equation.

한편, 트립신에 대한 본 발명에 따른 화합물의 억제활성도 상기 트롬빈의 경우에 대해 설명한 바에 따라 실시하여 측정하였다.On the other hand, the inhibitory activity of the compound according to the present invention against trypsin was also measured as described for the case of thrombin.

기질로는 N-벤조일-발린-글리신-알기닌 파라-니트로아닐리드 하이드로클로라이드의 20μM 용액을 사용하였으며, 억제제는 0 내지 120㎍ 범위내에서 여러가지 농도를 사용하였다. 또한, 트립신은 0.1N HCl 에 용해시킨 것을 실험 직전에 상기 트리스 완충용액으로 45㎍/㎖ 로 만든 후 40㎕ 를 사용하였다. 트롬빈에 대한 실험과 마찬가지로 반응용액의 총부피는 1.5㎖ 로 하고 그밖에도 동일한 방법으로 실험하였으며, Ki 계산에 사용된 Km 값도 동일한 방법으로 결정하였는데 그값은 20.2μM 이었다.As a substrate, a 20 μM solution of N-benzoyl-valine-glycine-arginine para-nitroanilide hydrochloride was used, and inhibitors were used at various concentrations in the range of 0 to 120 μg. In addition, trypsin was dissolved in 0.1N HCl was made to 45 ㎍ / ㎖ with the Tris buffer solution immediately before the experiment and 40 ul was used. As in the experiment for thrombin, the total volume of the reaction solution was set to 1.5 ml and the same method was used. The Km value used for the calculation of Ki was determined by the same method, which was 20.2 μM.

이상 설명한 방법에 따라 트롬빈과 트립신에 대해 측정된 본 발명에 따른 억제제의 효소활성 능력을 Ks 및 Ki 값으로 나타내었으며, 또한 트롬빈에 대한 선택성은 트립신/트롬빈으로 나타내었다. 그 결과는 하기 표 1 에 나타낸 바와 같다.The enzymatic activity of the inhibitor according to the invention measured for thrombin and trypsin according to the method described above is shown in Ks and Ki values, and the selectivity to thrombin is also expressed as trypsin / thrombin. The results are as shown in Table 1 below.

[표 1]TABLE 1

트롬빈과 트립신에 대한 억제제의 억제능력Inhibitor's ability to inhibit thrombin and trypsin

화합물(실시예 번호)Compound (Example Number) 트롬빈에 대한억제능력Inhibition of thrombin 트립신에 대한억제능력Inhibitory ability to trypsin 선택성(트립신/트롬빈)Selectivity (Trypsin / Trombin) 1One Ks = 0.10nMKs = 0.10 nM Ki = 3710nMKi = 3710 nM 3710037100 22 Ks = 1.11nMKs = 1.11 nM Ki = 26730nMKi = 26730 nM 2408124081 33 Ks = 2.10nMKs = 2.10 nM 44 Ks = 3.82nMKs = 3.82 nM 55 Ks = 1.05nMKs = 1.05 nM Ki = 9360nMKi = 9360 nM 89148914 66 Ks = 32.4nMKs = 32.4 nM 77 Ks = 1.40nMKs = 1.40 nM 88 Ks = 1350nMKs = 1350 nM 99 Ks = 14.5nMKs = 14.5 nM Ki = 5750nMKi = 5750 nM 397397 1010 Ks = 7.7nMKs = 7.7 nM Ki = 6770nMKi = 6770 nM 879879

상기의 실험결과로 부터 본 발명의 화합물은 우수한 트롬빈 억제활성을 나타내며, 특히 실시예 1, 2 및 5 의 화합물은 트립신 대비 트롬빈에 대한 선택성 면에서도 공지의 화학식 4 및 5 의 화합물이 각각 250 배 및 50 배인 것에 비해 월등히 우수함을 알 수 있다.From the above experimental results, the compound of the present invention shows excellent thrombin inhibitory activity. In particular, the compounds of Examples 1, 2, and 5 are 250-fold and well-known compounds of formulas 4 and 5, respectively, in terms of selectivity to thrombin relative to trypsin. It can be seen that it is much superior to 50 times.

실험예 2 : 약물동력학Experimental Example 2: Pharmacokinetics

실험방법 :Experiment Method:

웅성 쥐를 20 시간 절식시킨 후 실험하였다. 생리식염수를 사용하여 실시예 1 의 화합물의 1%(10㎎/㎖) 용액을 조제한 후 쥐의 체중 ㎏ 당 화합물 30㎎ 이 투여되도록 하는 양으로 경구투여하였다. 정해진 시간 간격에 따라서 혈액을 채취하여 즉시 메탄올 및 황산아연과 혼합한 후 상등액을 고압액체크로마토그라피(HPLC)를 이용하여 자외부 파장 231㎚ 에서 혈중약물농도를 측정하였다.Male rats were fasted for 20 hours and then tested. Physiological saline was used to prepare a 1% (10 mg / ml) solution of the compound of Example 1 and then orally administered in an amount such that 30 mg of the compound per kg body weight of the rat was administered. Blood was collected at predetermined time intervals and immediately mixed with methanol and zinc sulfate, and then the supernatant was measured by using high pressure liquid chromatography (HPLC).

실험결과:Experiment result:

하기 표 2 에는 쥐에서 실시예 1 의 화합물을 경구투여한 후의 시간경과에 따른 혈중약물농도를 나타내었다. 표 2 에 기재된 결과로 부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 의 화합물은 경구투여하였을 때 약물이 흡수되어 혈중에서 오랫동안 유지되는 약물동력학 특성을 나타내었다.Table 2 below shows blood drug concentrations over time after oral administration of the compound of Example 1 in rats. As can be seen from the results shown in Table 2, the compound of Example 1 of the present invention exhibited pharmacokinetic properties that the drug is absorbed and maintained for a long time in the blood upon oral administration.

[표 2]TABLE 2

쥐에서 실시예 1 의 화합물을 30㎎/㎏ 으로 경구투여시 시간에 대한 혈중약물농도Blood Drug Concentration with respect to the Time of Oral Administration of the Compound of Example 1 at 30 mg / kg in Mice

시간(분)Minutes 혈중농도 (ng/㎖)Blood concentration (ng / ml) 평균농도(+오차)(ng/㎖)Average concentration (+ error) (ng / mL) 쥐-1Rat-1 쥐-2Rat-2 쥐-3Rat-3 55 207.62207.62 122.18122.18 미검출Not detected 164.09(30.21)164.09 (30.21) 1010 537.09537.09 285.42285.42 10.9410.94 277.82(131.58)277.82 (131.58) 2020 465.50465.50 215.15215.15 30.7630.76 237.14(109.10)237.14 (109.10) 4040 298.95298.95 203.29203.29 62.8262.82 188.36(59.39)188.36 (59.39) 6060 234.78234.78 103.40103.40 72.3672.36 136.84(43.11)136.84 (43.11) 9090 126.18126.18 72.8772.87 126.78126.78 108.61(15.48)108.61 (15.48) 120120 191.86191.86 64.2464.24 72.2672.26 109.46(35.74)109.46 (35.74) 180180 102.76102.76 45.0545.05 103.09103.09 83.63(16.71)83.63 (16.71) 240240 64.4464.44 48.0948.09 46.7646.76 53.10(4.92)53.10 (4.92)

Claims (8)

하기 화학식 1 로 표시되는 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염 및 그의 이성체:A compound represented by the following formula (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof, and an isomer thereof: [화학식 1][Formula 1] 상기식에서,In the above formula, X 는 CH₂또는 NH 를 나타내고,X represents CH ₂ or NH, R¹은 수소, 저급알킬, 카복실 또는 저급알콕시카보닐을 나타내며,R ¹ represents hydrogen, lower alkyl, carboxyl or lower alkoxycarbonyl, R²및 R³는 각각 독립적으로 저급알킬 또는 사이클로알킬을 나타내고,R ² and R ³ each independently represent lower alkyl or cycloalkyl, R⁴는 수소, 저급알킬 또는 아미노를 나타낸다.R ⁴ represents hydrogen, lower alkyl or amino. 제 1 항에 있어서, X 가 CH₂또는 NH 를 나타내며, R¹은 수소, 메틸 또는 메톡시카보닐을 나타내고, R²및 R³은 각각 독립적으로 메틸 또는 사이클로펜틸을 나타내며, R⁴는 수소, 메틸 또는 아미노를 나타내는 화합물.The compound of claim 1, wherein X represents CH ₂ or NH, R ¹ represents hydrogen, methyl or methoxycarbonyl, R ² and R ³ each independently represents methyl or cyclopentyl, and R ⁴ represents hydrogen, Compounds that represent methyl or amino. 제 2 항에 있어서, (S)-3- 및 (S)-3-[4-(아미노-히드라조노-메틸)-페닐]-N-사이클로펜틸-N-메틸-2- (1,2,3,4-테트라히드로-퀴놀린-8-술포닐아미노)-프로피온아미드로 구성된 그룹중에서 선택된 화합물.3. A compound according to claim 2, wherein (S) -3- and (S) -3- [4- (amino-hydrazono-methyl) -phenyl] -N-cyclopentyl-N-methyl-2- (1,2, 3,4-tetrahydro-quinoline-8-sulfonylamino) -propionamide. 하기 화학식 2 의 메틸머캅토 화합물을 하기 화학식 3 의 아민 유도체와 반응시킴을 특징으로 하여 화학식 1 의 화합물 및 그의 염을 제조하는 방법:A method of preparing a compound of Formula 1 and salts thereof, characterized by reacting a methylmercapto compound of Formula 2 with an amine derivative of Formula 3: [화학식 1][Formula 1] [화학식 2][Formula 2] [화학식 3][Formula 3] 상기식에서,In the above formula, X 는 CH₂또는 NH 를 나타내고,X represents CH ₂ or NH, R¹은 수소, 저급알킬, 카복실 또는 저급알콕시카보닐을 나타내며,R ¹ represents hydrogen, lower alkyl, carboxyl or lower alkoxycarbonyl, R²및 R³는 각각 독립적으로 저급알킬 또는 사이클로알킬을 나타내고,R ² and R ³ each independently represent lower alkyl or cycloalkyl, R⁴는 수소, 저급알킬 또는 아미노를 나타낸다.R ⁴ represents hydrogen, lower alkyl or amino. 제 4 항에 있어서, 반응을 용매의 존재하에서 수행함을 특징으로 하는 방법.The process according to claim 4, wherein the reaction is carried out in the presence of a solvent. 제 5 항에 있어서, 용매가 알콜 용매임을 특징으로 하는 방법.6. The method of claim 5 wherein the solvent is an alcoholic solvent. 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 활성성분으로서 제 1 항에 따르는 화학식 1 의 화합물을 함유하는 트롬빈 억제제 조성물.A thrombin inhibitor composition comprising a compound of formula 1 according to claim 1 as an active ingredient together with a pharmaceutically acceptable carrier. 제 7 항에 있어서, 경구투여형 제제로 제형화된 조성물.The composition of claim 7 formulated as an oral dosage form.