KR102670349B1 - 펩타이드 핵산 유도체들에 의한 엑손 스키핑 - Google Patents

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Abstract

프리-mRNA의 스플라이스 위치에 서열 특이적으로 매우 강하게 결합하는 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체를 제공한다. 우수한 세포 투과성과 RNA에 대한 강한 결합력으로 인하여, 본 발명의 펩타이드 핵산 유도체 "그 자체"를 펨토몰 이하의 농도로 처리한 세포에서 엑손 스키핑이 일어난다. 본 발명의 화합물은 1 μg/Kg 혹은 그 이하를 대상자에게 전신 투여하였을 때 치료활성을 보이며, 따라서 합당한 치료 비용으로 질병이나 증상을 치료하는 데 유용하다.

Description

펩타이드 핵산 유도체들에 의한 엑손 스키핑
본 발명은 세포 투과성이 우수하고 핵산에 대한 결합력이 강한 펩타이드 핵산 유도체에 의해 유도되는 엑손 스키핑에 관한 것이며, 그 전체가 참조 문헌으로 인용되는 것인 2016년 12월 30일자로 출원된 미국 가특허출원 제 62/440,929 호의 우선권의 이익을 주장한다.
올리고뉴클레오타이드는 유전자 발현의 안티센스 억제, 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, PCR), 그리고 유전자칩에 의한 진단분석 등의 다양한 생물학적 목적에 사용되어 왔다. 올리고뉴클레오타이드는 DNA와 RNA와 같은 핵산에 서열 특이적으로 작용하기 때문에 세포내에서 DNA와 RNA가 연관된 생물학적 과정을 예측 가능하게 조절하는 데에 유용하다. 세포 투과성이 우수한 올리고뉴클레오타이드는 세포내에서 서열에 따른 예측이 가능하게 생물학적 과정을 조절할 수 있다.
약물 표적으로서의 단백질: 단백질은 세포의 다양한 기능을 조절한다. 상용화된 약의 대부분이 단백질의 기능 조절을 통해서 치료 활성을 나타낸다는 것은 놀라운 일이 아니다. 예를 들면, 비스테로이드성 소염제인 아스피린은 사이클로옥시게나제라 불리는 효소를 억제함으로서 항염증 활성을 나타내고, 로사르탄은 안지오텐신 II라 불리는 막을 관통하는 수용체에 결합함으로서 항고혈압 활성을 나타낸다. 로시글리타존은 퍼옥시좀 증식 활성화 수용체라고 (peroxisome proliferator-activated receptors γ, PPARγ) 불리는 세포내의 수용체를 선택적으로 활성화하여 항당뇨 활성을 나타내며, 에타너셉트는 종양괴사인자-α라고 (tumor necrosis factor-α, TNF-α) 불리는 시토카인에 결합하는 융합 단백질로서 TNF-α의 생물학적 활성을 중화시켜서 항류머티즘 활성을 나타낸다. 허셉틴은 특정한 종류의 유방암 세포에서 과발현되는 erbB2에 선택적으로 결합하여 유방암을 치료하는 모노클론 항체이다.
프리-mRNA: DNA (2-deoxyribose nucleic acid) 상의 유전 정보는 전사되어 핵에서 프리-mRNA를 (pre-messenger ribonucleic acid) 생성한다. 포유동물의 프리-mRNA는 보통 엑손과 인트론으로 구성되며, 엑손과 인트론은 서로 연결된다. 엑손과 인트론은 도 1A에 예시된 바와 같이 번호가 붙여진다.
mRNA로의 프리-mRNA 스플라이싱: 도 1B에 요약된 바와 같이, 핵 안에서 "스플라이싱"이라 불리는 복잡한 일련의 반응들을 통해서 인트론을 제거하고 엑손을 연결하여 프리-mRNA는 mRNA로 변환된다 [Ann. Rev. Biochem. vol 72(1), 291-336 (2003); Nature Rev. Mol . Cell Biol. vol 6(5), 386-398 (2005); Nature Rev. Mol. Cell Biol. vol 15(2), 108-121 (2014)].
스플라이싱은 프리-mRNA와 스플라이싱 접속 인자의 초기 복합체인 "스플라이스오솜 E 복합체"의 형성으로 시작된다. 작은 핵단백질 U1은 프리-mRNA의 엑손 N과 인트론 N 연결 부위에 결합하고 U2AF35는 인트론 N과 엑손 (N+1) 연결 부위에 결합하여 스플라이스오솜 E 복합체를 만드는데, 따라서 엑손/인트론과 인트론/엑손 연결 부위는 초기 복합체를 만드는 데 아주 중요하다. "스플라이스오솜 E 복합체"에 U2가 결합해서 "스플라이스오솜 A 복합체"를 형성하고, 이 복합체에서 인트론을 제거하고 바로 옆의 엑손을 연결하는 일련의 복잡한 작업이 진행된다.
선택적 스플라이싱과 스플라이스 변형체: 스플라이싱 중에 프리-mRNA의 모든 엑손이 남아서 완전한 길이의 mRNA가 항상 생기는 것은 아니다. 어떤 엑손들은 제거되거나 잘라져 나가서 변형된 mRNA 즉 "스플라이스 변형체"가 생성된다. 따라서 프리-mRNA는 선택적으로 스플라이스되어 여러가지의 스플라이스 변형제를 생성할 수 있다.
칼시토닌을 암호화하는 유전자로 포유동물 세포의 선택적 스플라이싱이 1981년에 처음으로 보고되었다 [Nature vol 290(5801), 63-65 (1981); Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol 79(6), 1717-1721 (1982)]. 이 유전자는 6개의 엑손으로 이루어져 있는 데, 엑손 5와 엑손 6이 스키핑된 것이 칼시토닌 mRNA를 생성하는 반면에 엑손 4가 스키핑된 것은 칼시토닌 유전자 유관 펩타이드를 (calcitonin gene related peptide, CGRP) 암호화하는 mRNA 변형체를 생성한다.
선택적 스플라이싱 여부는 세포와 세포가 처한 조건에 달려있다. 선택적 스플라이싱으로 인하여 하나의 유전자로부터 여러가지의 단백질들이 만들어진다. 선택적 스플라이싱은 동물들이 유전체의 크기에 비하여 다양한 단백질을 생성하는 것을 가능하게 한다. 인간에게 있어서, 여러 개의 엑손을 가진 유전자들의 95% 이상이 선택적 스플라이싱을 한다고 평가되고 있다 [Nature Genetics vol 40(12), 1413-1415 (2008)].
스플라이스 변형체와 생물학적 기능들: 세포의 종류나 조직에 따라 자연 발생되는 스플라이스 변형체는 그 생물학적인 특성이 전체 길이의 단백질과는 흔히 다른 단백질들을 암호화한다.
안드로젠 수용체는 (androgen receptor, AR) 여러 스플라이스 변형체를 생성하는 좋은 예가 될 것이다 [Int . J. Biol . Sci . vol 7(6), 815-822 (2011)]. AR 프리-mRNA는 8개의 엑손과 4개의 숨은 (crtptic) 엑손으로 구성되어 있으며 (숨은 엑손은 도 2A에서 회색으로 표시되었다), 적어도 7개의 AR mRNA 스플라이스 변형체가 있다.
AR mRNA 변형체 1은 도 2A에 도식화된 바와 같이 엑손 1에서 엑손 8까지 순차적으로 연결되어 있으며 전체 길이의 AR 단백질을 암호화하고 있다. AR mRNA 변형체 3은 엑손 4에서 엑손 8까지가 잘려져 나가서, 전체 길이의 AR 단백질에서 리간드가 결합하는 부분이 (ligand binding domain, LBD) 결여된 잘려진 AR 단백질을 (AR3) 암호화하고 있다.
전체 길이의 AR 단백질은 테스토스테론이나 다이하이드로테스토스테론과 (DHT) 같은 안드로젠과 복합체를 만들어야 기능적으로 활성화되는 반면에, AR3 단백질은 안드로젠이 없어도 기능적으로 활성화되어 있다. 안드로젠 제거 치료술에 저항성인 전립선 종양에서 상향 조절된 AR3 단백질이 흔히 발견되는 데, 이는 전립선 암 세포가 안드로젠 제거 치료술을 피하기 위해서 내부적으로 AR3 변형 단백질을 만드는 것으로 보인다.
저산소증 유도인자 1-알파는 (HIF-1α) 전사인자인 HIF-1의 서브유닛이며, HIF1A 유전자에 암호화되어 있다. HIF-1α는 저산소증에서 (산소가 부족한 상태) 상향 조절되는, 세포의 산소 센서라고 할 수 있다 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol 92, 5510-5514 (1995)]. HIF-1α는 VEGF와 EPO를 포함한 60개 이상의 유전자들의 전사를 유도하며, VEGF를 통해 신생혈관의 형성을 촉진한다 [Exp. Mol. Med. vol 36, 1-12 (2004)]. 고형 종양은 제한된 피의 공급으로 인하여 저산소증을 겪으며, 이를 극복하기 위하여 HIF-1α를 상향 조절한다.
전사 활성체로서의 기능적 활성을 위하여 HIF-1α는 기본적인 헬릭스-루프- 헬릭스 (bHLH)와 두 개의 PAS 영역 [PAS 부분 참고. Curr . Biol . vol 7(11), R674-677 (1997); Eur . J. Biochem . vol 271(6), 1198-1208 (2004)] 등의 다양한 부분으로 구성되어 있다. HIF-1α에는 산소 센서로 작용하는 산소 의존적 분해 (ODD) 영역이 있는 데, HIF-1α 단백질의 안정성에 매우 중요하다는 것은 잘 알려져 있다.
도 2B에 도식화된 바와 같이 여섯 개의 HIF-1α mRNA 스플라이스 변형체들에 암호화된 최소한 여섯 개의 HIF-1α 단백질이 있다 [Exp. Mol. Med. vol 36, 1-12 (2004)]. 선택적 스플라이싱으로 인하여 엑손 1과 엑손 2 사이에 세 개의 염기가 (UAG) 더 있는 것을 제외하고는 전체 길이의 HIF-1α (HIF-1αFL) mRNA는 야생형 HIF-1α (HIF-1αWT) mRNA와 유사하다. HIF-1α736은 엑손 14가 잘려져 나갔으며 C-말단 활성화 구역이 (CAD) 없다. HIF-1αFL와 HIF-1α736은 저산소증에서 VEGF 촉진자를 (promoter) 활성화시키는 것으로 알려져 있다. HIF-1α557 (HIF-1αZ)과 HIF-1α516은 HIF-1α의 비활성 단백질로 작용하며, 유방암의 경우 HIF-1αFL mRNA 스플라이스 변형체의 존재는 암의 진행을 의미하며 나쁜 예후와 관련이 있다 [BMC Medicine vol 8(44), 1-12 (2010)].
AR과 HIF-1α 단백질의 예에서 보듯이, 스플라이스 변형체는 포유동물의 유전자에서 생리적 다양성에 중요한 역할을 한다. 자연은 생리적인 역학 관계에 대응하기 위해서뿐만 아니라 항상성을 유지하기 위하여 스플라이스 변형체를 자발적으로 생성한다.
리보솜 단백질 합성: 프리-mRNA의 인트론은 효소 작용에 의해 제거되고, 생성된 mRNA는 세포질로 이동한다. 세포질에서 리보솜이라 불리는 번역 복합체가 mRNA에 붙어서 mRNA에 암호화되어 있는 유전 정보를 이용하여 단백질을 합성한다 [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Cancer Res. vol 48, 2659-2668 (1988)].
코돈: 리보솜이 단백질을 합성할 때 각각의 아미노산은 mRNA 서열 세 개에 의해서 암호화 된다. 예를 들면, "AUG", "UUA", "CCC", 그리고 "AGA"는 "메티오닌", "류신", "프롤린", 그리고 "알기닌"을 각각 암호화하며 그러한 세 개의 서열을 "코돈"이라고 부른다. mRNA의 단량체가 A, G, U, 그리고 C 4 개이므로 64개의 (4x4x4=64) 코돈이 가능하다. "UGA", "UAA", 그리고 "UAG" 코돈은 리보솜 단백질 합성의 "정지" 신호를 위한 코돈으로 리보솜 번역 복합체가 "정지" 신호를 인식하면 리보솜에 의한 단백질 합성은 종료된다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드 (Antisense Oligonucleotide, ASO): mRNA나 프리-mRNA에 서열특이적으로 (상보적으로) 결합하는 올리고뉴클레오타이드를 안티센스 올리고뉴클레오타이드라고 부른다 (ASO). mRNA에 강하게 결합하는 ASO는 리보솜의 단백질 합성을 저해할 수 있으며, 프리-mRNA에 강하게 결합하는 ASO는 프리-mRNA의 스플라이싱 과정을 저해하여 mRNA의 스플라이스 변형체를 생성한다.
안티센스의 스플라이싱 억제: 프리-mRNA의 스플라이싱은 "스플라이스오솜 E 복합체"가 형성된 후에 시작된다. 도 3에 도식화한 바와 같이, SR 단백질은 (세린과 알기닌이 많은 단백질) 엑손 스플라이싱 증폭자 (exonic splicing enhancer, ESE) 부분과 결합하여 U1과 U2AF35가 "5' 스플라이스 위치"와 "3' 스플라이스 위치"에 각각 결합하는 데에 도움을 준다 [Biochem. Cell Biol. vol 77(4), 277-291 (1999); Curr. Opin. Cell Biol. vol 13(3), 302-309 (2001)].
원칙적으로, 스플라이스오솜 E 복합체를 형성하는 데에 중요한 프리-mRNA의 특정한 부분에 결합하는 ASO는 E-복합체의 형성을 입체적으로 억제할 수 있다. 만약 ASO가 "5' 스플라이스 위치", "3' 스플라이스 위치", 혹은 ESE 부분에 강하게 결합한다면 E-복합체의 형성을 억제하거나 막을 수 있다.
mRNA는 서열에따라 단백질을 암호화하기 때문에 mRNA 스플라이스 변형체는 "원래의" 혹은 "전체 길이의" mRNA를 암호화하는 단백질과는 다른 단백질을 암호화한다. 따라서 안티센스의 스플라이싱 억제는, "원래의" 혹은 "전체 길이의" mRNA를 암호화하는 단백질과는 다른 생물학적 특징을 갖는 변형된 단백질을 암호화하는 것으로서 효과적인 치료 방법의 후보가 된다.
안티센스의 스플라이싱 억제에 의한 구조이동 (Frame Shift): 인간 HIF-1α mRNA의 [NCBI mRNA Code: NM_001530] "코딩 DNA 서열"의 (CDS) 일부가 안티센스의 스플라이싱 억제에 의해 일어난 "구조이동"을 도식화한 예시로서 도 4A에 제공된다. CDS에는 (노란 막대) 코돈과 엑손이 (녹색 화살표) 표시되었다. CDS에 있는 T는 (티민) mRNA나 프리-mRNA에서는 U로 (우라실) 대체되야 한다.
만약 안티센스의 스플라이싱 억제로 엑손 3이 잘라져 나간다면 엑손 2의 3'-말단이 엑손 4의 5'-말단과 직접 연결되어 엑손 2와 엑손 4의 연결 부위는 도 4B의 왼쪽과 같이 "...-GAT-GCT-(G- TTT)-GAA-CTA-..."가 된다. 전체 길이 mRNA의 두 개 이웃하는 코돈 사이에는 네 개의 뉴클레오타이드가 있게 된다. 엑손 3이 잘라져 나가면 엑손 4가 시작되는 코돈이 구조 이탈 되었다. 따라서 엑손 3의 삭제는 코돈의 구조이동을 유발하였다.
만약 안티센스의 스플라이싱 억제로 엑손 3과 엑손 4가 동시에 잘라져 나간다면 엑손 2의 3'-말단이 엑손 5의 5'-말단과 직접 연결되어 엑손 2와 엑손 5의 연결 부위는 도 4B의 오른쪽과 같이 "...-GAT-GCT-( G-GC )-CTT-GTC-..." 가 된다. 전체 길이 mRNA의 두 개 이웃하는 코돈 사이에는 세 개의 뉴클레오타이드가 있게 된다. 엑손 3과 엑손 4가 동시에 잘라져 나가면 엑손 5가 시작되는 코돈은 코돈의 구조이동 없이 구조유지 되었다.
구조이동에 따라 "원래의" 코돈과 다른 코돈이 생성되는 데, HIF-1α mRNA에서 엑손 3이 삭제된 경우인 도 4C에 도시된 바와 같이 미성숙 종결 코돈 (premature termination codon; PTC)이 흔히 생긴다. 리보솜 단백질 합성의 미성숙 종결에 의해 C-말단이 잘려져 나간 단백질 조각은, 구조이동을 유발하는 엑손 스키핑에 의해 생길 수 밖에 없다. 그러한 단백질 조각은 "원래의" 또는 "전체 길이의" 단백질과는 다른 생리적인 특성을 갖는다. 따라서 안티센스의 스플라이싱 억제는 질병 유발 유전자에 대해 효과적인 치료 방법의 후보가 된다.
중첩 RT-PCR에 의한 엑손 스키핑 탐지: ASO에 의해 유발된 mRNA 스플라이스 변형체는 흔히 PCR로 (polymerase chain reaction) 탐지된다. 만약 ASO가 도 5A에 도식화된 바와 같이 150 염기 길이의 엑손 4의 스키핑을 유도한다면, ASO의 표적 프리-mRNA로부터 전체 길이의 mRNA나 엑손 4가 결여된 mRNA 스플라이스 변형체가 생성된다. 만약 ASO가 엑손 4의 스키핑을 완벽하게 유도한다면 (즉 100%), ASO를 처리한 세포는 전체 길이 mRNA의 PCR 산물보다 150 염기가 작은 PCR 산물만을 생성한다. 엑손 스키핑에 대한 PCR 산물 밴드를 취하고 서열화해서 그 PCR 산물 밴드가 실제로 mRNA 스플라이스 변형체에서 온 것인지 확인한다.
PCR 방법에 의한 엑손 스키핑의 수율 평가: 문헌에서는 엑손 스키핑의 수율 혹은 효율은 보통, 전체 길이 mRNA와 mRNA 스플라이스 변형체 각각의 PCR 산물의 젤 밴드 강도를 (intensity) 비교해서 평가해왔다. 전체 길이 mRNA와 스플라이스 변형체 mRNA가 PCR 탐지에 사용된 평가 방법 상이나 세포내에서 비슷한 안정성을 갖고 있다면 그러한 평가는 이론적으로 유효하다. 그러나, mRNA의 안정성은 오랜 세월의 진화를 거쳐서 얻어진 결과라는 것을 고려해볼 때, mRNA 스플라이스 변형체가 전체 길이 mRNA와 유사한 안정성을 보일 것 같지는 않다.
마찬가지로, 전체 길이 mRNA와 mRNA 스플라이스 변형체의 상대적인 양은 PCR 프라이머, PCR 조건, 그리고 PCR 탐지 방법에 따라 달라질 것이다. 최근에, 모폴리노나 2'-OMe PTO (phosphorothioate) 디스트로핀 ASO로 처리한 mdx 쥐에서 디스트로핀 mRNA의 엑손 스키핑 수율을 디지털 qPCR로 평가하였다. 디지털 qPCR로 평가한 엑손 스키핑 수율은 중첩 qPCR 같은 전통적인 방법으로 측정한 것과는 상당히 달랐다 [Lab. Investigation, vol 90, 1396-1402 (2010)]. 인간 DMD 환자의 근아세포와 (myoblast) 섬유아세포에서 (fibroblast) 엑손 스키핑을 디지털 qPCR로 평가한 연구를 보면, 높은 감도로 엑손 스키핑 산물을 신뢰성있게 탐지하기에는 디지털 qPCR이 적당하다 [PLoS One 0162467, September 09 (2016)].
엑손 스키핑 수율이 PCR 평가 방법 및 조건에따라 변한다면, 엑손 스키핑 수율의 PCR 평가는 단백질 발현이나 표적 유전자의 기능성 평가로 검증 및 보완되어야 한다.
EIciRNA에 의한 전사의 피드백 상향조절: 프리-mRNA 스플라이싱의 부산물로 인트론 올가미가 (lariot) 형성된다. 엑손 스키핑은 도 5B에 도식화된 바와 같이 mRNA 스플라이스 변형체뿐만 아니라 EIciRNA도 (exon intron circular RNA) 생성하는 데, 엑손 3와 엑손 4가 잘라져 나가면서 인트론, 엑손 3, 그리고 엑손 4로 이루어진 올가미를 형성한다. 첫번째로 형성된 EIciRNA ①은 스플라이싱을 한 번 더 거치면서 EIciRNA ②가 된다.
그러한 EIciRNA 올가미는 엑손 4의 5' 스플라이스 위치의 서열이 그대로 있기 때문에 "U1 작은 리보핵 단백질"과 (U1 snRNP) 결합할 수 있으며, U1 snRNP는 RNA 폴리머라제 II와 결합하여 프리-mRNA의 전사를 상향조절할 수 있다. 만약 핵 내에서 EIciRNA가 어느 정도 이상 쌓이면 프리-mRNA의 전사가 증가할 수도 있다. 엑손 스키핑이 과도하게 일어날 때 EIciRNA은 전사의 피드백 조절자 역할을 하기도 한다 [Nature Struct. Mol. Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)].
비천연 (unnatural) 올리고뉴클레오타이드: DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오타이드는 생체 내에 존재하는 뉴클리에이즈 (nuclease)에 의해 쉽게 분해되므로, 치료적 용도에 한계가 있다. 지금까지 많은 유형의 비천연 (자연에 존재하지 않는) 올리고뉴클레오타이드가 연구되고 개발되어 왔는데 [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)], 그 중 몇몇은 DNA와 RNA에 비하여 긴 대사 안정성을 나타냈다. 대표적인 인공 올리고뉴클레오타이드 중 몇몇의 화학 구조가 도 6A에 제공된다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA처럼 상보적인 핵산에 예측한대로 결합한다.
포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드 (PTO, Phosphorothioate Oligonucleotide): PTO는 모노머 당 골격의 포스페이트 산소 원자 중 하나가 황 원자로 치환된 DNA 유사체이다. 이러한 작은 구조적 변화는 PTO를 뉴클리에즈에 의한 분해에 비교적 잘 견디도록 만들었다 [Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367-402 (1985)].
PTO와 DNA가 구조적으로 매우 유사함을 반영하듯이, 이들은 대부분의 동물세포에 대한 투과성이 매우 나쁘다. 그러나 DNA를 잘 투과시키는 트랜스포터가 (transporter) 많이 발현된 세포들의 경우, DNA와 PTO 모두 세포투과성이 좋은 편이다. 전신성으로 (systemically) 투약된 PTO는 간이나 신장에 많이 분포되는 것으로 알려져 있다 [Nucleic Acids Res. vol 25, 3290-3296 (1997)].
PTO의 세포 투과성을 높이기 위하여, 리포펙션 (lipofection) 방법이 세포 실험 수준에서 널리 사용되고 있다. 그러나 리포펙션 방법은 세포막을 변형시기고 세포 독성을 유발하므로 장기간의 임상 사용에는 이상적이지 못하다.
지난 30여년간 안티센스 PTO와 PTO의 변형체들이 각종 암, 면역 질환, 대사성 질환 등을 치료하기 위하여 임상적으로 평가되어 왔다 [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)]. 대부분의 이러한 안티센스 의약개발 프로그램들은 부분적으로는 PTO의 세포 투과성 부족으로 인하여 성공하지 못하였다. PTO의 세포 투과성 부족을 극복하기 위해서는, 치료 효과를 보기 위해 고용량의 PTO를 투약해야 한다. 그러나 PTO를 고용량 투약하면, 혈액 응고 시간이 길어지고, 보체 활성화 (complement activation), 신장 독성 (tubular nephropathy), 쿠퍼 (Kupffer) 세포 활성화, 그리고 비장 비대, 비장 림프구 증식증, 단핵세포 침윤과 같은 면역 자극 등의 다양한 독성을 유발한다 [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)].
여러 안티센스 PTO들의 경우, 간이나 신장과 관련된 질환에서 임상적 약효를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 미포메르센 (Mipomersen)은 PTO 유사체로서 LDL 콜레스테롤 운반에 관여하는 apoB-100 단백질의 합성을 저해한다. 미포메르센은 일부 동맥경화 환자 군에서 약효를 나타냈는데, 이는 미포메르센이 간에 주로 분포함에 기인하는 것으로 보인다 [Circulation vol 118 (7), 743-753 (2008)]. ISIS-113715는 PTP1B (Protein Tyrosine Phosphatase 1B)의 합성을 저해하는 안티센스 PTO 유도체로서 제2형 당뇨 환자들에서 약효를 나타낸다고 보고되었다 [Curr. Opin. Mol. Ther. vol 6, 331-336 (2004)].
2'-O-알킬 RNA: 2'-O-알킬-RNA는 리보스 (ribose) 고리에 있는 2' 위치의 하이드록시 그룹이 알킬옥시 그룹으로 치환된 RNA 유사체이다. 2'-O-알킬-RNA는 PTO나 DNA보다 RNA에 대한 결합력이 더 크며, 치료 목적을 위한 대사 안정성도 더 좋다. 그러나, 2'-O-알킬-RNA는 나쁜 세포 투과성으로 인하여 치료제로는 한계가 있다.
잠금핵산 (LNA, Locked Nucleic Acid): LNA는 DNA 혹은 RNA에 대한 핵산 결합력을 증가시키기 위하여 RNA의 리보스 고리 골격을 구조적으로 제한한 핵산이다. 따라서, LNA는 강한 핵산 결합력을 지닌 DNA 혹은 RNA 유도체로 간주될 수 있지만 [Biochemistry vol 45, 7347-7355 (2006)], DNA 혹은 RNA와 마찬가지로 세포 투과성이 나쁘다.
DNA나 RNA 골격의 혼합 올리고뉴클레오타이드: PTO와 2'-O-알킬-RNA는 흔히 하나의 올리고뉴클레오타이드로 만들어진다. 그 혼합 올리고뉴클레오타이드는 2'-O-알킬-RNA 덕분에 같은 서열의 PTO보다 강한 결합력을 갖는다. 유사한 방식으로, LNA와 PTO는 흔히 하나의 올리고뉴클레오타이드로 만들어지는 데, 그 혼합 올리고뉴클레오타이드는 같은 서열의 PTO보다 강한 결합력을 갖는다. 그러나 그러한 혼합 올리고뉴클레오타이드는 나쁜 세포 투과성을 갖는다.
포스포로다이아미데이트 모폴리노 올리고뉴클레오타이드 (PMO, Phosphorodiamidate Morpholino Oligonucleotide): PMO는 DNA 골격의 2-디옥시리보스 (2-deoxyribose)와 포스페이트 (phosphate)가 각각 모폴린과 (morpholine) 포스포로다이아미데이트로 (phosphorodiamidate) 치환된 올리고뉴클레오타이드이다 [Appl. Microbiol . Biotechnol . vol 71, 575-586 (2006)]. DNA 골격이 음전하를 갖는 반면, PMO 골격은 중성이다. 따라서 PMO와 mRNA의 결합은 정전기적 반발이 없어, PMO와 mRNA의 결합은 DNA와 mRNA 사이의 결합 보다 강하다. 아울러 PMO는 DNA와 구조적으로 매우 다르기 때문에, DNA 또는 RNA를 인식하는 간에 있는 트랜스포터 (hepatic transporter)에 의해 인식되지 않지만, PMO 역시 세포막을 잘 통과하지 못한다.
펩타이드 핵산 (PNA, Peptide Nucleic Acid): PNA는 N-(2-아미노에틸) 글리신을 단위 골격으로 갖는 폴리펩티드로서 니엘슨 (Nielsen) 등에 의해 발명되었다 [Science vol 254, 1497-1500 (1991)]. PNA의 화학 구조와 축약된 이름은 도 6B에 도식화되었다.
DNA나 RNA와 마찬가지로, PNA 역시 상보적인 핵산과 선택적으로 결합한다 [Nature (London) vol 365, 566-568 (1992)]. 상보적인 핵산에 결합할 때, PNA의 N-말단은 DNA나 RNA의 5'-말단, 그리고 C-말단은 DNA나 RNA의 3'-말단에 해당한다.
PMO 처럼 PNA 골격은 전하를 띠지 않은 중성이기 때문에, PNA와 RNA의 결합은 DNA와 RNA의 결합 보다 강하다. PNA는 DNA와 구조적으로 매우 다르기 때문에, DNA를 인식하는 간에 있는 트랜스포터에 의해 인식되지 않으며, DNA 혹은 PTO와 매우 다른 조직 분포 특성을 갖고 있으나, PNA 역시 포유동물 세포막을 잘 통과하지 못한다 [Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280, (2003)].
듀센 근이영양증 (Duchenne Muscular Dystrophy, DMD): DMD는 3,500명의 신생 남아 중 한 명이 걸리는 근손실 질병이다 [Lancet Neurol. vol 9, 77-93 (2010)]. DMD 환자는 서서히 근 기능을 잃으며 30세 이전에 심부전이나 호흡 부전으로 사망한다. 많은 DMD 환자들에 있어서 디스트로핀 유전자는 변이되어 미성숙 종결 코돈이 (PTC) 포함된 디스트로핀 mRNA를 생성하고 C-말단이 없는 비기능적 디스트로핀을 발현한다 [Human Mol. Genetics vol 12(8), 907-914 (2003); 그리고 그 안의 참고 문헌들].
DMD를 치료하기 위해 가장 알려진 방법은 ASO를 이용하여 PTC가 포함된 엑손을 스키핑한 디스트로핀 mRNA와 흔히 전체 길이 디스트로핀이라 불리는 C-말단이 포함된 스플라이스 변형체 단백질을 만드는 것이다.
MDX 쥐에서 디스트로핀 mRNA의 엑손 23 스키핑: mdx 쥐는 디스트로핀 프리-mRNA의 엑손 23에 PTC가 있는 돌연변이체로 인간 DMD의 동물 모델로 널리 사용되고 있다 [FEBS J. vol 280(17), 4177-4186 (2013)]. 쥐의 디스트로핀 프리-mRNA를 상보적으로 표적하는 ASO들의 엑손 23 스키핑 능력이 평가되었다 [Artificial DNA: PNA & XNA vol 2(1), 6-15 (2011)]. 이와 관련하여, mdx 쥐는 올리고뉴클레오타이드의 엑손 스키핑을 유도하는 정도를 평가하는 좋은 모델로 널리 사용되고 있다
엑손 23과 인트론 23의 연결 부위에 (엑손 23의 5' 스플라이스 위치) 완전히 상보적인 20-머 2'-OMe PTO ASO를 양친매성 트랜스팩션 물질 F127로 제제하고 mdx 쥐의 근육에 약 10 μg/Kg을 국소 주사하였는 데, 주사한 근육 조직에서 전체 길이 디스트로핀의 발현이 증가하였음을 전체 길이 디스트로핀의 면역조직화학염색과 (IHC) 웨스턴 블럿으로 확인하였고 이는 ASO의 국부 주사에 의해 엑손 23이 스키핑되었음을 의미한다. 이 ASO는 인트론 23의 5'-말단과 18-머 그리고 엑손 23의 3'-말단과 2-머의 상보적 결합을 한다 [Nature Med . vol 9(8), 1009-1014 (2003)].
엑손 23과 인트론 23의 연결 부위에 (엑손 23의 5' 스플라이스 위치) 완전히 상보적인 다른 20-머 2'-OMe PTO ASO가 엑손 23을 스키핑하는 정도를 평가하였다. 이 20-머 ASO는 엑손 23과 인트론 23의 연결 부위를 상보적으로 표적하며, 인트론 23의 5'-말단과 18-머 그리고 엑손 23의 3'-말단과 2-머의 상보적 결합을 한다. 쥐의 근아세포를 2 혹은 4 μM의 ASO와 96시간 배양했을 때, 엑손 23의 스키핑이 중첩 RT(역전사)-PCR로 확인되었다. 2.9 nmole의 ASO를 근육내 2번 주사한 mdx 쥐에서도 엑손 23 스키핑이 RT-PCR로 확인되었으며, 50 mg/Kg의 2'-OMe PTO ASO를 피하 투여한 mdx 쥐의 근육 조직에서 엑손 23 스키핑이 탐지되었다. 2'-OMe PTO ASO와 같은 서열을 갖는 20-머 2'-FPS (2'-fluoro-PTO) ASO도 2'-OMe PTO ASO처럼 쥐의 근아세포에서 엑손 23 스키핑을 유도하였으나, 근육내 주사 혹은 피하 주사로 투여했을 때는 mdx 쥐에서 엑손 23 스키핑을 유도하지 못하였다 [Mol. Ther. Nucl. Acids vol 4, e265 (2015)].
엑손 23과 인트론 23의 연결 부위에 완전히 상보적인 20-머 펩타이드 핵산이 (PNA) 엑손 23을 스키핑하는 정도를 mdx 쥐에서 평가하였다. 20-머 PNA ASO는 인트론 23의 5'-말단과 18-머 그리고 엑손 23의 3'-말단과 2-머의 상보적 결합을 한다. 250 nM의 20-머 PNA ASO는 H2K mdx 세포에서 엑손 23의 제거를 유도함을 중첩 RT-PCR로 확인하였다. 5~20 μg의 (약 0.25~2 mg/Kg) ASO를 근육내 주사한 mdx 쥐의 주사 부위의 근육 조직에서 엑손 23 스키핑이 확인되었는 데, mdx 쥐에서 20-머 PNA의 엑손 스키핑 효율이 2'-OMe PTO ASO보다 좋았다. 세포 투과성을 향상시키기 위해 20-머 PNA와 세포 투과 펩타이드를 (CPP) 공유 결합으로 연결하였는 데, 주사 부위의 근육 조직과 세포에서 PNA-CPP와 변형시키지 않은 PNA는 유사한 정도로 엑손 23을 스키핑하였다 [Mol. Ther. vol 16(1), 38-45 (2008)].
엑손 23과 인트론 23의 연결 부위에 (엑손 23의 5' 스플라이스 위치) 완전히 상보적인 25-머 PMO ASO가 mdx 쥐에서 엑손 23을 스키핑하는 정도를 평가하였다. 이 25-머 ASO는 인트론 23의 18-머 그리고 엑손 23의 7-머와 상보적 결합을 한다. 동물 당 2 mg을 (약 100 mg/Kg) 여러 번 정맥 주사한 mdx 쥐에서 이 25-머 PMO는 엑손 23을 스키핑하였다 [Nat. Med. vol 12(2), 175-177 (2006)]. 세포 투과성을 향상시키기 위해 25-머 PMO와 CPP를 공유 결합으로 연결하였는 데, 그러한 PMO-CPP 3 mg/Kg을 한 번 정맥 주사한 근육에서 엑손 23을 스키핑하였다 [Human Mol. Genet. vol 18(22), 4405-4414 (2009)].
인간 DMD 환자의 근아세포에서 디스트로핀 mRNA의 엑손 46 스키핑: 인간 디스트로핀 프리-mRNA에서 엑손 46내의 엑손 스플라이싱 증폭자 (ESE) 부분을 상보적으로 표적하는 2'-OMe PTO ASO들에 대하여, 디스트로핀 mRNA에서 엑손 45가 결여된 인간 DMD 환자의 근아세포에서 엑손 46의 스키핑 효율이 평가되었다. 리포펙션으로 1 μM ASO를 트랜스펙션시킨 세포를 중첩 RT-PCR의 RNA 추출물에서 엑손 46 스키핑이 탐지될 때까지 24시간 동안 배양하였다. 몇 개의 ASO들이 엑손 46을 스키핑하였다 [Human Mol. Genet. vol 10(15), 1547-1554 (2001)].
DMD 환자에서 디스트로핀 mRNA 의 엑손 51 스키핑: 드리사페르센은 (PRO051 혹은 GSK24022968) 인간 디스트로핀 프리-mRNA에서 엑손 51내의 엑손 스플라이싱 증폭자 (ESE) 부분을 상보적으로 표적하는 20-머 2'-OMe PTO인 데, 인간 DMD 환자에서 치료 활성이 평가되었다. 중첩 PCR로 근육 조직을 생체 검사한 결과, 드리사페르센은 일주일에 2에서 6 mg/Kg을 피하주사로 투여받은 DMD 환자에서 엑손 스키핑 효율이 높지는 않았지만 엑손 51의 스키핑을 유도하였다 [N. Engl. J. Med. vol 364, 1513-1522 (2011)].
에텝리르센은 (AVI-4658) 인간 디스트로핀 프리-mRNA에서 엑손 51내의 ESE 부분을 상보적으로 표적하는 30-머 PMO인 데, 인간 DMD 환자에서 치료 활성이 평가되었다. 전체 길이 디스트로핀의 IHC로 근육 조직을 생체 검사한 결과, 에텝리르센은 일주일에 2에서 20 mg/Kg을 정맥 주사로 투여받은 DMD 환자에서 엑손 51의 스키핑을 유도하였다 [Lancet vol 378(9791), 595-605 (2011)].
HepG2 세포에서 아포B 지단백 mRNA의 엑손 27 스키핑: 아포B 지단백 (Apolipoprotein B, APOB)은 지질단백질 중에서 필수적인 부분이며, APOB mRNA는 29개의 엑손으로 구성된다. 엑손 27의 3' 스플라이스 위치, 엑손 27의 5' 스플라이스 위치, 그리고 3' 스플라이스 위치와 5' 스플라이스 위치 두 군데를 표적하는 2'-OMe RNA APOB ASO들이 고안되었다. 3' 스플라이스 위치 ASO는 (3'-SS ASO) 인트론 26과 15-머 그리고 엑손 27과 5-머의 상보적 결합을 한다 [BMC Mol. Biol. 2007, 8:3. published 17 January 2007]. 5' 스플라이스 위치 ASO는 (5'-SS ASO) 엑손 27과 5-머 그리고 인트론 27과 15-머의 상보적 결합을 한다. 40-머 2'-OMe RNA ASO는 3'-SS ASO와 5'-SS ASO를 공유결합으로 연결하였고, 5' 스플라이스 위치와 3' 스플라이스 위치에 동시에 작용할 수 있다.
리포펙션을 이용하여 ASO들의 엑손 27 스키핑 능력을 HepG2 세포에서 평가하였다. 25에서 250 nM의 3'-SS ASO와 5'-SS ASO 모두 HepG2 세포에서 엑손 27 스키핑을 유도하지 못했지만, 25에서 250 nM의 40-머 ASO는 엑손 27 스키핑을 투여량 의존 방식으로 현저하게 유도하였다. 2'-OMe RNA가 스플라이스 위치의 인트론 부분과 15-머의 상보적 결합을 하는 것만으로는 초기 스플라이스오솜 복합체의 형성을 효과적으로 억제하지 못한다. HepG2 세포에서 초기 스플라이스오솜 복합체의 형성을 효과적으로 억제하여 엑손 스키핑을 유도하기 위해서는 APOB 프리-mRNA의 엑손 27에 걸친 스플라이스 위치에 더 강력하게 결합하는 것이 필요하다.
Bcl-x 프리-mRNA의 선택적 스플라이싱: BCL2L1는 (Bcl-x) 선택적 스플라이싱을 통해 Bcl-xL 또는 Bcl-xS를 암호화하는 인간 유전자이다. 18-머 2'-OMe PTO ASO는 엑손 2의 5' 스플라이스 위치를 표적하며 엑손 2와 16-머 그리고 인트론 2와 2-머의 상보적 결합을 한다. 80 내지 400 nM의 리포펙션에서, 선택적 스플라이싱을 통해 MCF7, PC3, Du145, HeLa, 그리고 MDA MB231과 같은 암세포주에서 Bcl-xS의 세포내 생산을 촉진하였다 [J. Biol. Chem. vol 277(51), 49374-49382 (2002)].
β-글로빈 프리-mRNA에서 무세포 생체외 스플라이싱 교정: 지중해빈혈은 (thalassemia) 헤모글로빈의 비정상적인 합성에 의해 야기되는 유전 혈액질환이다. 지중해빈혈 환자에게 발견되는 IVS2705의 희귀한 돌연변이는 인간 β-글로빈 유전자의 인트론 2에서 705 뉴클레오타이드 위치에 점 돌여변이를 (point mutation) 수반한다 [T→G]. IVS2705 돌연변이로 인해 5' 스플라이스 위치가 새로 생성되고 인트론의 579 위치에 있는 숨어있던 (cryptic) 3' 스플라이스 위치를 활성화한다. IVS2705 돌연변이는 선택적 스플라이싱을 유도해 엑손 2와 엑손 3 사이 인트론의 뉴클레오타이드 579-705 (127개) 삽입한다 [J. Biol. Chem. vol 260, 16332-16337 (1985)].
IVS2705 돌연변이의 숨어있는 5' 스플라이스 위치에 완전히 상보적인 17-머 2'-OMe RNA ASO가 무세포 생체외 스플라이싱 조건에서 변종 스플라이싱을 교정할 수 있는 지를 평가하였다. ASO는 인트론과 8-머 그리고 숨어있는 엑손과 9-머의 결합을 한다. 0.12 내지 2 μM의 ASO는 변종 스플라이싱을 효과적으로 교정하여 인트론 2에서 유래한 숨어있는 엑손이 없는 mRNA를 생성하였다 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol 90, 8673-8677 (1993)]. 생체외 스플라이싱 조건은 무세포이며 따라서 엑손 스키핑을 유도하기 위해 전달 물질이 필요하지 않다. 무세포 스플라이싱 조건에서 120 nM 농도의 ASO는 엑손 스키핑을 유도했는 데, 만약 ASO가 5' 스플라이스 위치에 더 강한 결합력을 갖고 있었다면 엑손 스키핑은 더 강력하게 일어났을 것이다. 엑손 스키핑 효능을 향상시키려면 5' 스플라이스 위치에 더 강한 결합력을 갖고있는 ASO가 필요하다.
헬라 pLuc/705 세포에서 2'-OMe RNA에 의한 루시퍼라제 프리-mRNA의 스플라이싱 교정: pLuc/705는 뉴클레오타이드 1368과 1369 사이에 인간 β-글로빈 IVS2705 돌연변이의 인트론 2가 삽입된 변형된 루시퍼라제 유전자이다. 헬라 pLuc/705 세포는 안정적으로 변형된 pLuc/705 루시퍼라제 유전자를 발현한다. 변형된 헬라 세포는 뉴클레오타이드 1368과 1369 사이에 숨어있는 엑손을 포함한 mRNA를 발현하므로 비기능적인 루시퍼라제 변형 단백질을 암호화한다.
IVS2705 돌연변이의 숨어있는 5' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 17-머 2'-OMe RNA 올리고뉴클레오타이드가 (인트론과 8-머 그리고 숨어있는 엑손과 9-머의 결합을 함) 헬라 pLuc/705 세포에서 변형된 루시퍼라제 프리-mRNA의 변종 스플라이싱을 교정할 수 있는 지를 평가하였다. 20 내지 500 nM의 리포펙션에서, 17-머 ASO는 투여량 의존적으로 세포의 루시퍼라제 활성을 회복시켰다. RT-PCR 분석에 의하면, 숨어있는 엑손은 ASO 처리에 의해 잘려나갔다. 엑손 스키핑 활성은 20 nM이나 더 높은 농도에서 관찰되었다 [Biochemistry vol 37, 6235-6239 (1998)].
헬라 pLuc/705 세포에서 PNA에 의한 루시퍼라제 프리-mRNA의 스플라이싱 교정: IVS2705 돌연변이의 숨어있는 5' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 17-머 PNA 유도체가 (인트론과 8-머 그리고 숨어있는 엑손과 9-머의 결합을 함) 헬라 pLuc/705 세포에서 변형된 루시퍼라제 프리-mRNA의 변종 스플라이싱을 교정할 수 있는 지를 평가하였다. 이 PNA 유도체들은 N-말단에 여러 개의 포스포네이트 기가 공유 결합으로 연결되어 있도록 고안되었다 [Nucl. Acids Res. vol 30(13), 4424-4432 (2008)]. 포스포네이트 기를 공유 결합으로 연결시킨 것은 리포펙션을 할 때 PNA가 세포 안으로 잘 들어가게 하기위함이다.
2.5 내지 60 nM의 리포펙션에서, PNA ASO는 투여량 의존적으로 세포의 루시퍼라제 활성을 회복시켰다. RT-PCR 분석에 의하면, 숨어있는 엑손은 ASO 처리에 의해 잘려나갔다. 포스포네이트 기가 더 많이 결합된 PNA ASO들이 숨어있는 엑손을 잘라내는 데에 더 효율적이었는 데, 12개의 포스포네이트 기가 결합된 PNA ASO는 2.5 nM에서 81%의 엑손 스키핑 효율을 보였다.
나노몰 이하에서의 관찰된 PNA ASO의 엑손 스키핑 활성은 17-머 2'-OMe RNA ASO보다 훨씬 강력하다 [Biochemistry vol 37, 6235-6239 (1998)]. 세포 안으로 전달을 위해 적절히 변형시킨다면 PNA는 엑손 스키핑을 강력히 유도하는 데에 매우 유용할 것이다.
2'-OMe PTO에 의한 FOLH1 프리-mRNA의 엑손 스키핑: 전립선 특이적 막 항원 (PSMA)는 엽산 가수분해효소 (FOLH1) 유전자의 산물인 데, 악성의 전립선 조직에서 많이 발현된다. 리포펙션 조건에서 FOLH1 프리-mRNA를 표적하는 2'-OMe PTO ASO가 LNCap 전립선암 세포에서 엑손 스키핑을 유도하는 정도를 평가하였다 [Oligonucleotides, vol 16, 186-175 (2006)].
엑손 1의 5' 스플라이스 위치를 표적하는 18-머 ASO인 SSO1 엑손 1과 16-머 그리고 인트론 1과 2-머의 결합을 한다. SSO6과 SSO18은 각각 엑손 6과 엑손 18을 상보적으로 표적한다.
SSO1은 IC50가 약 400 nM의 효능으로 선태적 스플라이싱을, SSO6은 IC50가 약 4 nM의 효능으로 엑손 6의 스키핑을, 그리고 SSO18은 IC50가 약 4 nM의 효능으로 엑손 18의 스키핑을 유도한다.
흥미롭게도, 5' 스플라이스 위치를 표적하는 SSO1보다 엑손 내 위치 즉 엑손 스플라이싱 증폭자 위치 (ESE)를 표적하는 SSO6과 SSO18이 엑손 스키핑을 더 강력하게 유도한다. 이 특별한 예에서는 ESE를 표적하는 2'-OMe PTO ASO가 스플라이스 위치를 표적하는 것보다 더 효율적이다.
2'-O-MOE RNA에 의한 IL-5Rα 프리-mRNA의 선택적 스플라이싱: BCL1 세포에서 쥐 IL-5Rα 프리-mRNA를 상보적으로 표적하는 2'-O-MOE RNA (2'-O-methoxyethyl RNA) ASO가 선택적 스플라이싱 즉 엑손 스키핑을 유도하는 정도를 전기천공법 (electroporation) 조건에서 평가하였다 [Mol. Pharmacol. vol 58, 380-387 (2000)].
엑손 9의 다양한 부위와 엑손 9 옆의 스플라이스 위치들에 상보적인가를 고려해 ASO를 고안하였다. 인트론 8과 4-머 겹치고 엑손 9의 3' 스플라이스 위치에 (3' SS) 완전히 상보적인 20-머 ASO는 10 μM에서 선택적 스플라이싱을 현저히 유도하였다. 엑손 9의 엑손 내 부위를 표적하는 ASO들은 10 μM에서 3' SS와 유사한 정도로 선택적 스플라이싱을 유도하였다. 평가한 모든 ASO들이 선택적 스플라이싱을 유도하였는 데, 이는 엑손 9와 그의 스플라이스 위치는 엑손 스키핑이 잘 일어난다는 것을 의미하며, 3' 스플라이스 위치가 5' 스플라이스 위치보다 더 잘 일어난다.
인트론과 4-머 겹치고 엑손 8 옆의 스플라이스 위치에 상보적인 20-머 ASO는 10 μM에서 엑손 스키핑을 유도하였는 데, 3' SS ASO가 5' SS ASO보다 더 효율적이었다.
전기천공법 조건에서 마이크로몰 농도 2'-O-MOE RNA ASO의 엑손 스키핑 효능은 리포펙션 조건에서 FOLH1 프리-mRNA를 표적하는 나노몰 농도 2'-OMe PTO ASO에 비해 매우 떨어진다 [Oligonucleotides, vol 16, 186-175 (2006)]. 음전하를 띈 골격을 가진 올리고뉴클레오타이드를 세포 안으로 전달하는 데에는 (transfection) 리포펙션이 전기천공법보다 효과적으로 보인다.
2'-O-MOE PTO에 의한 타우 프리-mRNA의 엑손 10 스키핑: 타우 (tau) 프리-mRNA 엑손 10의 5' 스플라이스 위치는 스템 루프를 쉽게 형성하는 18-머 서열을 가지고 있어서 스플라이스오솜 E 복합체를 형성하기에 적당하지 않다. 따라서 타우 프리-mRNA 엑손 10은 스키핑되기 쉽다.
타우 엑손 10의 3' 스플라이스 위치 혹은 5' 스플라이스 위치를 표적하는 2'-O-MOE PTO ASO들의 엑손 10의 스키핑을 증폭시키는 정도를 평가하였다 [J. Biol. Chem. vol 276(46), 42986-42993 (2001)]. E10α는 3' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 18-머 ASO인 데, 인트론 9와 10-머 그리고 엑손 10과 8-머의 오버랩이 있다. E10β는 5' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 21-머 ASO인 데, 엑손 10과 8-머 그리고 인트론 10과 13-머의 오버랩이 있다.
COS-1 세포에서 리포펙션 조건하에 E10α와 E10β는 IC50 2-5 nM의 효능으로 엑손 10 스키핑을 유도하였고, PC12 세포에서 전기천공법 조건하에 ASO들은 마이크로몰 IC50의 효능으로 엑손 10 스키핑을 유도하였다.
2'-O-MOE RNA ASO에 의한 MyD88 프리-mRNA의 엑손 2 스키핑: MyD88은 IL-1R과 NF-kB의 TLR에 의한 활성화와 연관된 접속 단백질이다. 인간 MyD88 프리-mRNA 엑손 2의 3' 스플라이스 위치 혹은 5' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 20-머 2'-O-MOE RNA ASO들이 고안되었다. 20-머 ASO는 인트론 1의 5'-말단이나 (엑손 2의 3' 스플라이스 위치) 인트론 2의 3'-말단과 (엑손 2의 5' 스플라이스 위치) 0, 5, 10, 15, 혹은 20-머 오버랩을 하도록 고안되었다. A549 세포에서 리포펙션 조건하에 ASO들이 엑손 2를 스키핑시키는 정도를 평가하였다 [J. Immunol. vol 176, 3652-3661 (2006)].
엑손 2의 3' 스플라이스 위치에서 인트론 1과 20-머 오버랩을 하는 ASO가 가장 강력하고 효과적으로 엑손 2의 스키핑을 유도하였다. 엑손 2 스키핑에 대해 관찰된 IC50는 50에서 100 nM 사이였으며, 5' 스플라이스 위치를 표적한 ASO들은 3' 스플라이스 위치를 표적한 ASO들만큼 효과적이지 않았다. 엑손 2의 3'-말단과 20-머 오버랩을 하는 ASO가 5' 스플라이스 위치를 표적한 ASO들 중에서 가장 강력한 ASO였다.
쥐 MyD88 프리-mRNA에서 엑손 2의 3' 스플라이스 위치 혹은 5' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 것과 유사하게 2'-O-MOE RNA ASO들이 고안되었는 데, 그 중에서 엑손 2의 5'-말단과 20-머 오버랩을 하는 ASO가 RAW 264.7 세포에서 리포펙션 조건하에 엑손 2의 스키핑을 가장 강력하게 유도하였다.
가장 강력한 ASO 50 mg/Kg을 2주일 동안 주당 2회 쥐 세포에 투여하였다. 소장, 지방조직, 그리고 간에서 MyD88 mRNA가 60 내지 85% 상당히 감소하였다. 50 mg/Kg은 포스페이트 리보스 골격을 갖는 올리고뉴클레오타이드 치료제에서 전형적으로 부작용을 일으킬 수 있는 많은 양이다. 만약 2'-O-MOE RNA ASO가 전형적인 부작용 없이 치료 활성을 보여야 한다면, 엑손 스키핑의 효능이 현저히 향상되어야 한다.
SMN2에서 누시네르센에 의한 엑손 7의 복구: 척수성 근위축은 (SMA) SMN1 (survival of motor neuron 1) 유전자의 결실 혹은 비기능화에 의해 야기되는 희귀질환이다. 인간은 11개의 뉴클레오타이드외에는 동일한 암호 서열을 가진 직렬상동 SMN2 유전자를 갖고 있다. SMN2 엑손 7에서 C가 T로 바뀌는 SNP는 (single nucleotide polymorphism, 단일염기 변이) 엑손 7의 스키핑을 유도하는 데, 결과적으로 생성된 mRNA 스플라이스 변형체는 빨리 대사되는 SMN2 단백질 변형체를 암호화한다. 따라서 SMN2 돌연변이체는 SMN1 단백질의 기능 부족 현상을 보완하지 못하며 SMA에 이르게 된다 [Neurology vol 86, 890-897 (2016)].
누시네르센은 (SpinrazaTM) SMN2 인트론 7에서 억제인자 (splicing silencer) 부위를 상보적으로 표적하는 18-머 2'-O-MOE RNA ASO인 데, 억제인자의 결합을 입체적으로 막기 때문에 전체 길이의 SMN2 단백질의 생성 과정이 복구된다. 누시네르센은 SMN2 인트론 7에 위치한 억제인자에 결합함으로서 정상적인 스플라이싱 과정을 회복한다.
누시네르센은 미국 FDA에 의해 SMA 치료제로 2016년에 허가를 받았는 데, 세 달 혹은 여섯 달마다 12 mg씩 척추 강내로 투여된다. 누시네르센은 척수에 머물러 있으며 반감기는 뇌척수액에서 135 내지 177일이다. [Nusinersen US Label, FDA, December 2016].
올리고뉴클레오타이드에 의한 엑손 스키핑 치료법의 효능: 위의 예들에서 서술한 바와 같이 포스페이트 골격을 가진 올리고뉴클레오타이드는, 리포펙션 조건에서는 나노몰의 효능으로 엑손 스키핑을 유도하지만, 올리고뉴클레오타이드 "그 자체"로 처치하면 마이크로몰의 효능을 보인다.
MyD88 프리-mRNA에 대한 마이크로몰의 엑손 스키핑 효능은 쥐에서 올리고뉴클레오타이드 "그 자체"를 전신성으로 투여할 때 투여 용량 10 mg/Kg 혹은 그 이상에 해당하는데 [J. Immunol . vol 176, 3652-3661 (2006)], 포스페이트 골격을 가진 올리고뉴클레오타이드는 그 정도의 고용량에서 면역 부작용을 일으키기 쉽다. 따라서 치료 용량을 현저히 줄이기 위한 방법이나 제제의 개발이 필요하다.
드리사페르센은 인간 디스트로핀 프리-mRNA에서 엑손 51의 스키핑을 유도하도록 고안된 20-머 2'-OMe PTO인 데, 주당 2 내지 6 mg/kg의 올리고뉴클레오타이드 "그 자체"를 피하주사로 투여받은 DMD 환자에서 효율은 높지 않았지만 엑손 51의 스키핑을 유도했다 [N. Engl. J. Med. vol 364, 1513-1522 (2011)]. 용량제한 독성으로 인하여 드리사페르센의 치료 용량을 올리는 데 대한 우려가 있었다.
PNA와 PMO는 중성의 골격을 갖고 있어서 면역 체계가 (특히 톨유사 수용체) 인지하지 못하여, 포스페이트 골격을 가진 올리고뉴클레오타이드에서 흔히 관찰되는 면역 반응에서 자유롭다.
인간 디스트로핀 프리-mRNA에서 엑손 51의 스키핑을 유도하도록 개발된 30-머 PMO인 에텝리르센에 대해 (AVI-4658) DMD 환자들은 주당 2 내지 20 mg/Kg 정맥 투여를 잘 견뎠다 [Lancet vol 378(9791), 595-605 (2011)]. 에텝리르센은 미국 FDA에 의해 DMD 환자 치료용으로 신속 허가를 최근에 받았다.
누시네르센은 엑손 스키핑 대신 엑손 복구 능력으로 허가를 받았지만, 승인된 분기당 12 mg/Kg의 치료 용량은 아주 매력적이다. 척추 강내로 주사하여 신경 세포에 잘 흡입되도록 한 것이 누시네르센 효능의 주 원인으로 생각된다.
포스페이트 골격을 갖는 올리고뉴클레오타이드 치료제의 임상 개발은 톨유사 수용체의 활성화를 통한 면역 독성, 보체 활성, 그리고 간이나 신장에서의 조직특이 독성 등을 포함한 용량제한 독성으로 인하여 많은 제약이 있었다. 생체내 치료 활성을 향상시키면 그러한 용량제한 독성 문제는 극복될 수 있을 것이다.
올리고뉴클레오타이드는 생산비가 매우 비싸다. 현재의 인간 치료 용량 주당 100 mg 내지 2 g은, API 생산 비용이 그람당 $1,000이라고 후하게 가정해도, 주당 API의 비용 $100 내지 $2,000에 해당한다. 올리고뉴클레오타이드 치료제의 API 생산 비용은 사실 그람당 $1,000이 훨씬 넘는다. 만성 환자가 감당할 수 있는 연간 치료 비용으로 올리고뉴클레오타이드 치료제를 공급하기 위해서 치료 활성을 현저히 향상시키는 것을 의료계 이해당사자들이 강력히 요구할 것이다.
올리고뉴클레오타이드의 좋은 세포 투과성: 세포막은 오랜 세월동안 진화된 지질 이중층 벽이다. 실제로, 세포막은 4 kDa 내지 10 kDa 크기의 외가닥 안티센스 올리고뉴클레오타이드에게 큰 장벽으로 작용한다. 세포막을 직접 투과하는 방법에 의한 그러한 ASO의 세포 전달은 실질적으로 불가능하며, 외가닥 올리고뉴클레오타이드의 세포 흡수에는 다른 경로들이 있다. 몇 가지 예를 들면, ApoB100을 표적하는 미포메르센에서 보듯이 간 세포에서 운반체 매개의 내포 작용 (endocytosis), 누시네르센에서 보듯이 신경 흡수 (내포 작용로 추정), 그리고 갈낙을 (N-acetylgalactosamine) 매개한 세포 흡수 등이 있다. 그러나 그러한 세포 흡수 경로는 조직에따라 달라서 모든 종류의 조직들에 일반적으로 적용하기 힘들다 [Nature Biotechnol. vol 35(3), 222-229 (2017)].
포스페이트 골격을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 적절히 제제해서 세포막 투과성을 좋게 하는 것은 가능하며, 그렇게 제제된 올리고뉴클레오타이드는 제제하지 않은 올리고뉴클레오타이드 "그 자체"보다 더 좋은 생체내 치료 효능을 보일 것이 예상된다. 포스페이트 골격을 갖는 올리고뉴클레오타이드가 리포펙션 조건에서 나노몰의 효능으로 엑손 스키핑을 유도하는 것을 고려하면, 좋은 세포 투과성을 갖도록 제제된 올리고뉴클레오타이드의 생체내 치료 효능은 생체외 엑손 스키핑의 나노몰 효능처럼 현저하게 향상될 것이다. 따라서 좋은 세포 투과성은 엑손 스키핑을 유도하는 올리고뉴클레오타이드의 생체내 치료 효능에 매우 중요하다. 그럼에도 불구하고, 조직으로 전달을 잘하게 하는 제제의 개발은 올리고뉴클레오타이드 치료제 분야에서 아직도 큰 기술적 문제이다.
변형된 핵산염기로 세포투과성과 결합력을 높인 PNA: 앞에서 언급한대로, PNA 유도체는 리포펙션으로 세포에 잘 전달하기 위해 여러 개의 포스포네이트 기가 공유 결합으로 연결되도록 고안되었다. 그러한 PNA ASO는 헬라 세포에서 리포펙션 조건하에 엑손 스키핑 효능을 나노몰 이하의 농도에서 보였다 [Nucl. Acids Res. vol 30(13), 4424-4432 (2008)]. 나노몰 이하의 효능은 포스페이트 골격을 갖는 ASO들의 엑손 스키핑 효능보다 훨씬 강력한 것이다. 따라서 적절히 세포에 전달되기만 하면, PNA는 엑손 스키핑을 강력히 유도하는 데 유용할 것이다.
양이온성 지질 (cationic lipid) 혹은 그와 동등한 것이 핵산 염기에 공유 결합으로 연결된 변형된 핵산 염기를 갖는 PNA는 포유류의 세포막 투과성이 매우 좋다. 변형된 핵산 염기의 화학 구조는 도 6C에 제공된다. 이렇게 변형된 핵산 염기를 갖는 시토신, 아데닌, 및 구아닌은 구아닌, 티민 및 아데닌과 각각 예측한대로 결합한다 [PCT Appl. No. PCT/KR2009/001256; EP2268607; US8680253].
이렇게 변형된 핵산 염기를 갖는 PNA는 리포펙션 (lipofection)과 비슷한 환경이 된다. 리포펙션 상황에서는 올리고뉴클레오티드가 리포펙타민과 같은 양이온성 지질에 둘러싸이게 되는데, 그러한 리포펙타민/올리고뉴클레오티드 복합체는 올리고뉴클레오티드 그 자체에 비해 세포막 투과가 용이하다.
이렇게 변형된 핵산 염기를 갖는 PNA는 향상된 세포투과성 외에 상보적인 핵산에 대한 결합력이 매우 강하다. 예를 들면, 상보적인 DNA와 듀플렉스 (duplex)를 형성할 때, 4~5개의 변형된 핵산 염기가 도입된 11~13머의 PNA 유도체는 변형되지 않은 PNA에 비해 20oC 이상 높은 Tm 값을 보인다.
이렇게 변형된 핵산 염기를 갖는 PNA는 한 개의 염기 부정합에도 (mismatch) 매우 민감한 데, 변형된 염기의 종류나 PNA의 서열에 따라 다르지만 약 11~22oC의 낮은 Tm 값을 보인다.
좋은 세포 투과성과 핵산에 대한 강한 결합력을 바탕으로, 변형된 핵산 염기를 갖는 PNA 유도체는 엑손 스키핑을 강하게 유도하는 데 유용할 것이다.
발명의 요약
본 발명은 화학식 I로 대표되는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
[화학식 I]
화학식 I 중에서,
n은 10와 25 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 표적하는 프리-mRNA 중 인트론 7-머와 엑손 7-머로 구성되는 14-머의 표적하는 스플라이스 위치와 최소한 10-머 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 표적하는 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적인 결합을 하거나, 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 중수소 [D], 수소 [H], 치환체가 있거나 없는 알킬 (alkyl), 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 (aryl) 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
X와 Y는 수소, 포밀 [H-C(=O)-], 아미노카보닐 [NH2-C(=O)-], 아미노티오카보닐 [NH2-C(=S)-], 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실 (alkylacyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아실 (arylacyl), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 (alkyloxycarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐 (aryloxycarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐 (alkylaminocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐 (arylaminocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카보닐 (alkylaminothiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카보닐 (arylaminothiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카보닐 (alkyloxythiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카보닐 (aryloxythiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐 (alkylsulfonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 (arylsulfonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐 (alkylphosphonyl), 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐 (arylphosphoonyl) 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 수소, 하이드록시 (hydroxy), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 없는 아미노 [-NH2], 치환체가 있거나 없는 알킬아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌 (adenine), 티민 (thymine), 구아닌 (guanine), 시토신 (cytosine), 그리고 우라실 (uracil)을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 치환체가 있거나 없는 아민이 핵산 염기에 공유결합으로 연결된 비천연 핵산 염기로부터 독립적으로 선택된다.
일 구현예에서는, 화학식 I의 화합물은, 표적하는 프리-mRNA의 인트론 7-머와 엑손 7-머로 구성되는 14-머의 표적하는 스플라이스 위치와 최소한 10-머 이상의 상보적인 결합을 하며, 표적하는 스플라이스 위치 서열 중에서 인간 안드로젠 수용체 프리-mRNA내의 [(5'→3') UUGCCUGGUAAGGA], 인간 SCN9A 프리-mRNA내의 [(5'→3') UUUUUGCGUAAGUA], 인간 HIF-1α 프리-mRNA내의 [(5'→3') UAAGUAGGAUAAGU], 인간 SNAP25 프리-mRNA내의 [(5'→3') AUCCCAGGGUAACA], 인간 SCN9A 프리-mRNA내의 [(5'→3') UGUUUAGGUACACU] 및 인간 티로시나제 프리-mRNA내의 [(5'→3') UGUACAGAUUGUCU]는 포함되지 않는다.
일 구현예에서는, 화학식 I의 화합물은, 표적하는 프리-mRNA의 표적하는 스플라이스 위치와 최소한 10-머 이상의 상보적인 결합을 하며, 표적하는 스플라이스 위치 서열 중에서 인간 안드로젠 수용체 프리-mRNA내의 [(5'→3') UUGCCUGGUAAGGA], 인간 SCN9A 프리-mRNA내의 [(5'→3') UUUUUGCGUAAGUA], 인간 HIF-1α 프리-mRNA내의 [(5'→3') UAAGUAGGAUAAGU], 인간 SNAP25 프리-mRNA내의 [(5'→3') AUCCCAGGGUAACA], 인간 SCN9A 프리-mRNA내의 [(5'→3') UGUUUAGGUACACU] 및 인간 티로시나제 프리-mRNA내의 [(5'→3') UGUACAGAUUGUCU]는 포함되지 않는다.
화학식 I의 화합물은 표적하는 프리-mRNA의 표적하는 엑손의 스키핑을 강력히 유도하여 표적하는 엑손이 결여된 mRNA 스플라이스 변형체(들)을 생성하며, 표적하는 프리-mRNA로 전사되는 유전자의 기능 활성을 조절하는 데 유용하다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 화학식 I로 대표되는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
[화학식 I]
화학식 I 중에서,
n은 10와 25 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 표적하는 프리-mRNA 중 인트론 7-머와 엑손 7-머로 구성되는 14-머의 표적하는 스플라이스 위치와 최소한 10-머 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 표적하는 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적인 결합을 하거나, 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 중수소 [D], 수소 [H], 치환체가 있거나 없는 알킬 (alkyl), 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 (aryl) 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
X와 Y는 수소, 포밀 [H-C(=O)-], 아미노카보닐 [NH2-C(=O)-], 아미노티오카보닐 [NH2-C(=S)-], 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실 (alkylacyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아실 (arylacyl), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 (alkyloxycarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐 (aryloxycarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐 (alkylaminocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐 (arylaminocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카보닐 (alkylaminothiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카보닐 (arylaminothiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카보닐 (alkyloxythiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카보닐 (aryloxythiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐 (alkylsulfonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 (arylsulfonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐 (alkylphosphonyl), 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐 (arylphosphoonyl) 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 수소, 하이드록시 (hydroxy), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 없는 아미노 [-NH2], 치환체가 있거나 없는 알킬아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌 (adenine), 티민 (thymine), 구아닌 (guanine), 시토신 (cytosine), 그리고 우라실 (uracil)을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 치환체가 있거나 없는 아민이 핵산 염기에 공유결합으로 연결된 비천연 핵산 염기로부터 독립적으로 선택된다.
일 구현예에서는, 화학식 I의 화합물은, 표적하는 프리-mRNA의 인트론 7-머와 엑손 7-머로 구성되는 14-머의 표적하는 스플라이스 위치와 최소한 10-머 이상의 상보적인 결합을 하며, 표적하는 스플라이스 위치 서열 중에서 인간 안드로젠 수용체 프리-mRNA내의 [(5'→3') UUGCCUGGUAAGGA], 인간 SCN9A 프리-mRNA내의 [(5'→3') UUUUUGCGUAAGUA], 인간 HIF-1α 프리-mRNA내의 [(5'→3') UAAGUAGGAUAAGU], 인간 SNAP25 프리-mRNA내의 [(5'→3') AUCCCAGGGUAACA], 인간 SCN9A 프리-mRNA내의 [(5'→3') UGUUUAGGUACACU] 및 인간 티로시나제 프리-mRNA내의 [(5'→3') UGUACAGAUUGUCU]는 포함되지 않는다.
일 구현예에서는, 화학식 I의 화합물은, 표적하는 프리-mRNA의 표적하는 스플라이스 위치와 최소한 10-머 이상의 상보적인 결합을 하며, 표적하는 스플라이스 위치 서열 중에서 인간 안드로젠 수용체 프리-mRNA내의 [(5'→3') UUGCCUGGUAAGGA], 인간 SCN9A 프리-mRNA내의 [(5'→3') UUUUUGCGUAAGUA], 인간 HIF-1α 프리-mRNA내의 [(5'→3') UAAGUAGGAUAAGU], 인간 SNAP25 프리-mRNA내의 [(5'→3') AUCCCAGGGUAACA], 인간 SCN9A 프리-mRNA내의 [(5'→3') UGUUUAGGUACACU] 및 인간 티로시나제 프리-mRNA내의 [(5'→3') UGUACAGAUUGUCU]는 포함되지 않는다.
화학식 I의 화합물은 표적하는 프리-mRNA의 표적하는 엑손의 스키핑을 강력히 유도하여 표적하는 엑손이 결여된 mRNA 스플라이스 변형체(들)을 생성하며, 표적하는 프리-mRNA로 전사되는 유전자의 기능 활성을 조절하는 데 유용하다.
화학식 I의 화합물을 서술하는 데 사용된 조건인 “n은 10과 25 사이의 정수이며”의 의미는 문자 그대로 “n은 정수 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 그리고 24 중에서 선택된다"는 것이다.
전체 인간 유전체에는 (genome) 26,564개의 유전자가 있다고 평가되었다 [In Silico Biol. vol 4, 387-393 (2004)]. 유전자당 평균 8.8개의 엑손과 7.8개의 인트론이 있다는 것을 고려하면, 인간 유전체에는 368,122개의 스플라이스 위치가 가능하다 [{(8.2x2)-2}x25,564 = 368,122]. 10-머 프리-mRNA는 410=1,048,576개의 서열이 가능하므로 10-머 PNA 유도체도 표적하는 스플라이스 위치에 대해 충분한 수준의 특이성을 보일 것이다. 그러나 인트론에서 [(5' → 3')┃GU-]로 시작되는 5'-말단과 [(5' → 3') -AG┃]로 끝나는 3'-말단은 매우 보존되어 (conserved) 있는 데 여기서 "┃"는 인트론-엑손 혹은 엑손-인트론 연결 부위를 나타낸다. 따라서 올리고머 길이가 11-머 혹은 더 긴 (즉 n은 10보다 큰 정수) 화학식 I의 화합물은 표적하는 스플라이스 위치에 대해 충분한 수준의 특이성을 보일 것이다.
선행 기술에 예시된 바와 같이 화학식 I의 화합물은 상보적인 핵산에 강하게 결합한다 [PCT/KR2009/001256]. 예를 들면, 4-5개의 변형된 (즉 자연에서 존재하지 않는) 핵산 염기가 포함된 11 내지 13-머 화학식 I의 PNA 유도체들이 상보적인 DNA와 듀플렉스를 형성할 때의 Tm은 20oC 이상 높다. 본 발명의 화합물은 상보적인 DNA에서와 같이 상보적인 RNA에 대해서도 강하게 결합한다. 본 발명의 화합물이 몇 개의 염기 부정합을 갖는 다른 프리-mRNA와 결합함으로서 발생하는 바람직하지 않은 탈표적 (off-target) 효과를 피하기 위해서는 가능한한 짧은 본발명의 화합물이 선호된다. 따라서 본 발명의 화합물의 올리고머 길이는 25-머 미만으로 제한된다.
선행 기술에 예시된 바와 같이 화학식 I의 화합물은 한 개의 염기 부정합에도 아주 민감하다 [PCT/KR2009/001256]. 예를 들면, PNA의 염기 서열과 변형된 염기의 종류에 따라 다르지만 한 개의 염기 부정합이 있으면 Tm이 11 내지 22oC 떨어진다. 그렇지만 RNA에 대한 결합력이 강하기 때문에, 한두 개의 염기 부정합이 있는 본 발명의 화합물도 표적하는 스플라이스 위치와 강하게 결합하여 표적하는 엑손의 스키핑을 강력하게 유발한다.
화학식 I의 화합물은 그 서열에 따라 표적하는 프리-mRNA 내의 3' 스플라이스 위치 혹은 5' 스플라이스 위치와 강하게 결합한다.
화합물이 3' 스플라이스 위치와 결합하는 경우에, 본 발명의 화합물은 표적하는 인트론으로부터 7-머와 표적하는 엑손으로부터 7-머로 구성되는 표적하는 3' 스플라이스 위치 내의 14-머와 최소한 10-머 이상의 상보적인 결합을 한다. 따라서 3' 스플라이스 위치는 표적하는 인트론의 3'-말단과 표적하는 엑손의 5'-말단 사이의 연결 부위로 분명하게 정의된다.
화합물이 5' 스플라이스 위치와 결합하는 경우에, 본 발명의 화합물은 표적하는 엑손으로부터 7-머와 표적하는 인트론으로부터 7-머로 구성되는 표적하는 5' 스플라이스 위치 내의 14-머와 최소한 10-머 이상의 상보적인 결합을 한다. 따라서 5' 스플라이스 위치는 표적하는 엑손의 3'-말단과 표적하는 인트론의 5'-말단 사이의 연결 부위로 분명하게 정의된다.
3' 스플라이스 위치를 표적하는 화학식 I의 화합물 14-머 서열은 인간 HIF1A 유전자에서 [NCBI 참고 서열: NG_029606.1] 유래된 인간 HIF-1α (저산소증 유발 인자 1 알파) 프리-mRNA에서 인트론 1과 엑손 2의 연결 부위에 걸친 3' 스플라이스 위치와 같이 예시된다. [(5' → 3') uucuuguuguuguuaaguag┃ GAUAAGUUCUGAACGUCGAA]는 프리-mRNA 3' 스플라이스 위치의 40-머 서열인 데, 20-머는 "인트론 1"에 그리고 20-머는 "엑손 2"에 각각 속해 있으며, 여기서 소문자는 인트론을 그리고 대문자는 엑손을 각각 나타내며, “┃”는 인트론 1과 엑손 2의 연결 부분을 나타낸다. 따라서 3' 스플라이스 위치의 14머는 7-머는 HIF-1α의 인트론 1에 그리고 7-머는 HIF-1α의 엑손 2에 각각 속해 있으며, [(5' → 3')uaaguag┃GAUAAGU]로 표시된다. 3' 스플라이스 위치에서 표적하는 인트론과 엑손은 각각 HIF-1α의 인트론 1과 엑손 2이다.
엑손의 번호는 mRNA 전사물에 따라 흔히 변하기도 하기 때문에, 위의 40-머의 프리-mRNA 서열은 인간 HIF-1α 프리-mRNA 엑손 2의 3' 스플라이스 위치를 분명하게 확인하기 위하여 제공되었다. 본 발명 전체에서, 본 발명의 PNA 화합물이 표적하는 스플라이스 위치는, 표적하는 스플라이스 위치를 구성하는 표적하는 엑손 번호와 프리-mRNA 서열을 가능한한 동시에 명시함으로서 분명하게 확인된다.
5' 스플라이스 위치를 표적하는 화학식 I의 화합물 14-머 서열은 인간 HIF-1α 프리-mRNA에서 엑손 2와 인트론 2의 연결 부위에 걸친 5' 스플라이스 위치와 같이 예시된다. [(5' → 3') GAGGAAACUUCUGGAUGCUG ┃gugaguuauuuuacaagggu]는 5' 스플라이스 위치의 40-머 서열인 데, 20-머는 엑손 2 에 그리고 20-머는 인트론 2에 각각 속해 있으며, 여기서 소문자는 인트론을 그리고 대문자는 엑손을 각각 나타내며, “┃”는 엑손 2와 인트론 2의 연결 부분을 나타낸다. 따라서 5' 스플라이스 위치의 14머는 7-머는 HIF-1α의 엑손 2에 그리고 7-머는 HIF-1α의 인트론 2에 각각 속해 있으며, [(5' → 3') GAUGCUG ┃gugaguu]로 표시된다. 5' 스플라이스 위치에서 표적하는 인트론과 엑손은 각각 HIF-1α의 엑손 2와 인트론 2이다.
화학식 I의 화합물은 표적 프리-mRNA 내의 표적 스플라이스 위치에 강하게 결합하여, 화합물의 표적 스플라이스 위치를 포함하는 "초기 스플라이스오솜 복합체"의 형성을 방해한다. 화학식 I의 화합물은 화합물의 염기 서열에 따라 표적 프리-mRNA 내의 3' 스플라이스 위치 혹은 5' 스플라이스 위치에 강하게 결합한다. 본 발명의 화합물이 "초기 스플라이스오솜 복합체"의 형성을 입체적으로 방해해서, 표적 엑손이 잘라져 나간 mRNA 스플라이스 변형체가 생성된다. 결과적으로, 본 발명의 화합물은 표적 엑손의 스키핑을 강하게 유도한다.
화학식 I의 PNA 유도체에 포함되는 천연 (자연에 존재하는) 핵산 염기나 비천연 (자연에 존재하지 않는) 핵산 염기의 구조는 도 7에 예시되어 있다. 본 발명의 천연 또는 비천연 핵산 염기는 도 7에서 제공된 핵산 염기들로 구성되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다. 제공되는 천연 혹은 비천연 핵산염 기들은 단지 화학식 I의 화합물에 허용되는 핵산 염기들의 다양성을 보여주기 위한 것이며, 따라서 본 발명의 범위를 도 7에 제공된 핵산 염기로 한정하는 방향으로 해석하지 않아야 한다. 올리고뉴클레오타이드 분야의 숙련된 전문가들은 도 7에 예시된 비천연 핵산 염기들에 상보적인 천연 핵산 염기를 쉽게 생각해 낼 수 있을 것이다. 따라서 이 분야의 숙련된 전문가들은 본 발명의 화학식 I의 PNA 화합물과 표적 프리-mRNA 서열 사이의 상보성을 확신할 것이다.
화학식 I의 PNA 유도체를 설명하기 위한 치환체들이 도 8A에서 도 8E에 예시된다. 치환체가 있거나 없는 알킬은 도 8A에 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬아실과 치환체가 있거나 없는 아릴아실은 도 8B에 예시된다. 도 8C에는 치환된 알킬아미노, 치환된 아릴아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐, 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐이 예시된다. 도 8D에는 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐의 예들이 제공된다. 도 8E에는 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카보닐이 제공된다. 제공되는 치환체들은 단지 치환체들의 화학식 I의 화합물에 허용되는 치환체들의 다양성을 보여주기 위한 것이며, 따라서 본 발명의 범위를 도 8A에서 8E에 예시된 치환체들로 한정하는 방향으로 해석하지 않아야 한다. 이 분야의 숙련된 전문가들은 올리고뉴클레오티드가 표적 프리-mRNA 서열에 서열 특이적 결합을 할 때 N-말단과 C-말단의 치환체들 보다는 올리고뉴클레오티드 서열이 더 중요하다는 것을 쉽게 인지할 것이며, 따라서 본 발명의 화합물을 위하여 도 8A에서 8E에 예시된 치환체들보다 더 다양한, 허용되는 치환체들을 생각해낼 수 있을 것이다.
선행 기술에 예시된 바와 같이 [PCT/KR2009/001256] 화학식 I의 화합물은 세포투과성이 우수해서 올리고뉴클레오티드 "그 자체"를 (세포 전달 증가용 보조제와 제제를 하지 않은) 처치해도 세포 내에 쉽게 전달된다. 따라서 본 발명의 화합물 "그 자체"를 처리한 세포에서, 본 발명의 화합물 은 표적 프리-mRNA에 있는 표적 엑손의 스키핑을 유도하여 표적 엑손이 결여된 mRNA 스플라이스 변형체가 생성한다.
화학식 I의 화합물은 세포에서 표적 엑손의 스키핑을 강력히 유도할 목적으로 세포안으로 전달시키는 데 어떤 수단이나 제제가 따로 필요 없다. 이러한 관점에서 보면, 본 발명의 화합물은 DNA, RNA, PTO, 2'-OMe PTO, 2'-OMe RNA, 2'-O-MOE RNA, LNA, PMO, PNA 등을 포함하는 다른 종류의 올리고뉴클레오타이드들과 확실히 차별화된다.
RNA에 대한 강한 결합력과 우수한 세포투과성을 바탕으로 화학식 I의 화합물은 세포에서 표적 엑손의 스키핑을 유도하여 펨토몰 이하 농도의 안티센스 효능을 나타낸다. 현재까지 DNA, RNA, PTO, 2'-OMe PTO, 2'-OMe RNA, 2'-O-MOE RNA, LNA, PMO, PNA 등을 포함하는 다른 종류의 올리고뉴클레오타이드들에서는 펨토몰 이하 농도의 안티센스 엑손 스키핑 효능이 보고되거나 실현된 바 없다. 다른 종류의 올리고뉴클레오타이드들에서, 심지어는 나노몰 이하 농도의 안티센스 엑손 스키핑 효능에 대한 보고도 아주 드물다. 나노몰 이하 농도의 안티센스 엑손 스키핑 효능은 세포로의 트랜스펙션을 위한 리포펙션을 원활하게 하기 위해 여러 개의 포스페이트 기를 PNA의 N-말단에 공유 결합으로 연결한 PNA ASO에서 보고된 바 있다 [Nucl. Acids Res. vol 30(13), 4424-4432 (2008)]. 상기에서 언급한 바와 같이, 리포펙션이나 전기천공법 등의 강제적인 세포 전달 조건에서도 생체외의 안티센스 엑손 스키핑 효능은 나노몰에서 마이크로몰 농도로 보고되었다. 이러한 관점에서 보면, 본 발명의 화합물은 DNA, RNA, PTO, 2'-OMe PTO, 2'-OMe RNA, 2'-O-MOE RNA, LNA, PMO, PNA 등을 포함하는 다른 종류의 올리고뉴클레오타이드들과 확실히 차별화된다.
올리고뉴클레오타이드 분자가 프리-mRNA 내의 상보적인 서열과 결합을 하려면 그 분자는 풀어져서 펼쳐져야 한다. 올리고뉴클레오타이드 분자들은 핵산 염기 사이에 분자 사이 혹은 분자 내 수소 결합의 경향으로 인하여 뭉쳐있거나 머리핀과 (hair-pin) 같이 접혀있으려고 한다. 따라서 많이 연구되는 DNA, RNA, PTO, 2'-OMe PTO, 2'-OMe RNA, 2'-O-MOE RNA, LNA, PMO, PNA 등을 포함하는 다른 종류의 올리고뉴클레오타이드가 안티센스 엑손 스키핑을 하기 위해서는 풀림이라는 추가적인 에너지 장벽이 있다. 올리고뉴클레오타이드는 90oC 이상의 완충 수용액에서 배양하여 분자를 최대한 풀어준 다음, 일반적으로 자외선 흡수도로 정량한다.
생리학적 pH에서 화학식 I의 화합물은 변형된 핵산 염기에 공유 결합으로 연결된 여러 개의 염기성 아미노 기 때문에 여러 개의 양전하가 전체 올리고뉴클레오타이드 가닥에 퍼져있다. 여러 개의 양전하 때문에 화학식 I의 화합물은 풀어져서 펼쳐져 있는 데, 같은 올리고뉴클레오타이드 가닥에서 옆에 있는 양전하들 사이의 전기적인 반발이 그 원인이다. 화학식 I의 유도체는 화학식 I의 다른 분자(들)과 뭉치려는 경향이 낮아서, 화학식 I의 화합물은 표적 프리-mRNA의 표적 서열과 상보적인 결합을 하기에 구조적으로 준비가 되어 있다 (즉, 펼쳐져 있다). DNA로부터 표적 프리-mRNA가 전사될 때 화학식 I의 화합물이 표적 프리-mRNA 서열과 빨리 가지런하게 배열되기 위해서는 구조적인 준비 또한 중요하다. 강한 결합력에 구조적인 준비가 더해져서 펨토몰 이하 농도의 안티센스 엑손 스키핑 효능이 가능해졌다고 생각된다. 이러한 관점에서 보면, 본 발명의 화합물은 DNA, RNA, PTO, 2'-OMe PTO, 2'-OMe RNA, 2'-O-MOE RNA, LNA, PMO, PNA 등을 포함하는 다른 종류의 올리고뉴클레오타이드들과 확실히 차별화된다.
우수한 세포투과성으로 인하여, 화학식 I의 화합물은 올리고뉴클레오타이드 "그 자체"를 전신성으로 투여해도 표적 조직에서 엑손 스키핑을 강력하게 유도할 것이다. 화학식 I의 화합물은 의도한 치료 활성을 위하여 표적 조직으로의 전달을 증가시키기 위한 제제나 보조제가 따로 필요 없다. 화학식 I의 화합물을 단순히 인산완충식염수나 (PBS) 소금물에 녹인 후 전신성으로 투여하면 표적 조직에서 치료 활성을 쉽게 나타낸다.
본 발명의 PNA 유도체는 올리고뉴클레오타이드 "그 자체"로 처리한 세포에서 펨토몰 이하 농도의 엑손 스키핑 효능을 보이는 동시에, 1 μg/Kg 또는 그 이하를 전신성으로 투여하면 생체내에서 흔히 치료 활성을 보인다. 이러한 강력한 치료 효능은 DNA, RNA, PTO, 2'-OMe PTO, 2'-OMe RNA, 2'-O-MOE RNA, LNA, PMO, PNA 등을 포함하는 다른 종류의 올리고뉴클레오타이드에서는 실현된 바 없다. 올리고뉴클레오타이드는 제조 비용이 매우 높기 때문에, 강력한 효능은 특히 만성 환자에 대한 적절한 치료 비용을 달성하는 데 큰 이점이 된다. 이러한 관점에서 보면, 본 발명의 화합물은 DNA, RNA, PTO, 2'-OMe PTO, 2'-OMe RNA, 2'-O-MOE RNA, LNA, PMO, PNA 등을 포함하는 다른 종류의 올리고뉴클레오타이드들과 확실히 차별화된다.
우수한 세포투과성으로 인하여 본 발명의 PNA 유도체는 국부 혹은 경피로 쉽게 전달되어 투여 부위에서 치료 활성을 나타낸다. 본 발명의 화합물은 의도한 국부 치료 활성을 위하여 강하게 혹은 침습성으로 제제할 필요가 없다. 본 발명의 PNA 유도체는 올리고뉴클레오타이드 "그 자체"가 경피로 쉽게 전달된다. 강력한 엑손 스키핑 효능으로 인하여, 본 발명의 화합물을 피코몰 이하의 용액으로 국부 혹은 경피로 투여하면 치료 활성을 나타낸다. DNA, RNA, PTO, 2'-OMe PTO, 2'-OMe RNA, 2'-O-MOE RNA, LNA, PMO, PNA 등을 포함하는 다른 종류의 올리고뉴클레오타이드 "그 자체"를 국부 혹은 경피로 전달하는 것은 매우 도전적인 과제였다. 이러한 관점에서 보면, 본 발명의 화합물은 DNA, RNA, PTO, 2'-OMe PTO, 2'-OMe RNA, 2'-O-MOE RNA, LNA, PMO, PNA 등을 포함하는 다른 종류의 올리고뉴클레오타이드들과 확실히 차별화된다.
화학식 I의 화합물은 약제학적으로 허용 가능한 산이나 염기와 같이 사용될 수 있는데, 약제학적으로 허용 가능한 산이나 염기는 수산화 나트륨 (sodium hydroxide), 수산화 칼륨 (potassium hydroxide), 염산 (hydrochloric acid), 메탄설폰산 (methanesulfonic acid), 구연산 (citric acid), 그리고 트리플루오로아세트산 (trifluoroacetic acid) 등을 포함하나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다.
화학식 I의 화합물이나 약제학적으로 허용 가능한 염은 약제학적으로 허용 가능한 보조제 (adjuvant)와 함께 투약될 수 있는데, 이러한 보조제는 구연산, 염산, 주석산 (tartaric acid), 스테아린산, 폴리에틸렌글리콜 (polyethyleneglycol), 폴리프로필렌글리콜 (polypropyleneglycol), 에탄올, 이소프로판올 (isopropanol), 중탄산나트륨 (sodium bicarbonate), 증류수, 그리고 방부제 (preservative) 등을 포함하나 이들에 한정되는 것은 아니다.
화학식 I의 화합물은 치료상의 효과적인 농도인 1 펨토몰 (1 fmole/Kg)에서 1 나노몰 (1 nmole/Kg) 이상의 양으로 전신성 투여를 할 수 있는데, 그 양은 투여 일정이나 대상자의 질환 및 증상 등에 따라 변할 수 있다. 화학식 I의 화합물은 치료상의 효과적인 농도인 1 아토몰 (1 aM)에서 1 나노몰 (1 nM) 이상의 농도로 국부 투여를 할 수 있는데, 그 농도는 투여 일정이나 대상자의 질환 및 증상 등에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 바람직한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 10와 25 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 표적하는 프리-mRNA 중 인트론 7-머와 엑손 7-머로 구성되는 14-머의 표적하는 스플라이스 위치와 최소한 10-머 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 표적하는 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적인 결합을 하거나, 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 중수소, 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
X와 Y는 수소, 포밀, 아미노카보닐, 아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐, 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 수소, 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 없는 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택된다.
화학식 Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ 중에서,
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
L1, L2 그리고 L3는 화학식 V로 대표되는 공유결합성 링커이며, 염기성 아민과 핵산 염기를 연결시켜 준다:
[화학식 Ⅴ]
화학식 V 중에서,
Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 (-CH2-)이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, … 그리고 Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌, 산소(-O-), 황(-S-), 그리고 치환체가 있거나 없는 아미노 [-N(H)- 또는 -N(치환체)-] 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 15 사이의 정수이다.
선행 기술에 예시된 바와 같이 [PCT/KR2009/001256] 화학식 Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ의 비천연 핵산 염기는 프리-mRNA와 상보적인 염기 쌍을 이루는 데 있어서 각각 시토신, 아데닌 및 구아닌에 해당된다.
화학식 V를 설명하는 조건인 "m은 1에서 15 사이의 정수"의 의미는 문자 그대로 "m은 정수 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 그리고 14 중에서 선택된다"는 것이다.
본 발명의 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 11와 23 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 표적하는 프리-mRNA 중 인트론 7-머와 엑손 7-머로 구성되는 14-머의 표적하는 스플라이스 위치와 최소한 10-머 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 표적하는 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적인 결합을 하거나, 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소, 아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 치환체가 없는 아미노 및 치환체가 있거나 없는 알킬아미노 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌, 산소, 그리고 아미노 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 11 사이의 정수이다.
본 발명의 특히 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 11와 21 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 표적하는 프리-mRNA 중 인트론 7-머와 엑손 7-머로 구성되는 14-머의 표적하는 스플라이스 위치와 최소한 10-머 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 표적하는 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적인 결합을 하거나, 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 치환체가 없는 아미노 및 치환체가 있거나 없는 알킬아미노 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌, 산소, 그리고 아미노 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 11 사이의 정수이다.
본 발명의 매우 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 11와 19 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 표적하는 프리-mRNA 중 인트론 7-머와 엑손 7-머로 구성되는 14-머의 표적하는 스플라이스 위치와 최소한 10-머 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 표적하는 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 치환체가 없는 아미노 및 치환체가 있거나 없는 알킬아미노 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R3, 그리고 R5는 수소이고, R2, R4, 그리고 R6는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌 및 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 9 사이의 정수이다.
본 발명의 매우 더 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 12와 19 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 표적하는 프리-mRNA 중 인트론 7-머와 엑손 7-머로 구성되는 14-머의 표적하는 스플라이스 위치와 최소한 10-머 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 표적하는 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 치환체가 없는 아미노 및 치환체가 있거나 없는 알킬아미노 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 그리고 시토신을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 다섯 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌 및 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 9 사이의 정수이다.
본 발명의 가장 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 12와 18 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 표적하는 프리-mRNA 중 인트론 7-머와 엑손 7-머로 구성되는 14-머의 표적하는 스플라이스 위치와 최소한 10-머 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 표적하는 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X는 수소이며;
Y는 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 치환체가 없는 아미노 및 치환체가 있거나 없는 알킬아미노 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 그리고 시토신을 포함하는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 다섯 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
L1은 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)3-, -CH2-O-(CH2)4-, CH2-O-(CH2)5-, -CH2-O-(CH2)6-, 또는 -CH2-O-(CH2)7- 이고 우측 단부가 염기성 아민에 직접 연결되며; 그리고,
L2와 L3는 -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, 그리고 -(CH2)2-O-(CH2)3- 중에서 각자 독립적으로 선택되며 우측 단부가 염기성 아민에 직접 연결된다.
화학식 I의 화합물은 선행 기술에 예시된 바와 같이 [PCT/KR2009/001256; EP2268607; US8680253] 약자로 표시될 수 있다. 인간 HIF1A 유전자에서 [NCBI 참고 서열: NG_029606.1] 유래된 인간 HIF-1α 프리-mRNA에서 인트론 1과 엑손 2의 연결 부위에 걸친 3' 스플라이스 위치를 표적하는 화학식 I의 PNA 유도체들을 그러한 약자로 표시한 예들을 아래에 제공한다.
(N → C) Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) Fmoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) H-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O3)-TA(5)-NH2;
(N → C) Ac-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) Piv-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) Benzoyl-CA(5)G(2O3)-AA(5)C-TTA(4)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) n-Propyl-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(2O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) Benzyl-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) p-Toluenesulfonyl-CA(5)G-AA(5)C-TTA(2O2)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) [N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-CA(5)G(3)-AA(5)C-TTA(3)- TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) Fethoc-Lys-Leu-CA(5)G(2O2)-AA(5)C-TTA(8)-TCC(1O2)- TA-Lys-NH2;
(N → C) N-Phenyl-N-Me-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH2;
(N → C) Piv-HEX-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH2;
(N → C) FAM-HEX-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH2;
(N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
(N → C) Fethoc-Arg-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-Gly-NH2;
(N → C) Fethoc-Val-GA(5)A-CTT-A(6)TC-CTA(5)-C(2O2)T-Gly-Lys-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O5)TT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2;
(N → C) Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C-NH2;
그리고
(N → C) Fethoc-TTC(1O5)-AG(5)A-A(4)CT-TA(5)T-CC(2O2)T- A(6)CT-TA(6)-NH2:
상기에서,
A, G, T, 그리고 C는 각각 천연 핵산 염기인 아데닌, 구아니, 티민, 그리고 시토신을 가지는 PNA 모노머이다.
C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 그리고 G(pOq)는 각각 화학식 VI, 화학식 VII, 화학식 VIII, 화학식 IX, 또는 화학식 X으로 대표되는 비천연 핵산염기를 가지는 PNA 모노머이다.
상기에서,
p와 q는 정수이며; 그리고,
N-과 C-말단의 치환체들에 대한 약자들은 하기와 같이 구체적으로 기재된다: "Fmoc-"는 "[(9-플루오레닐)메틸옥시]카보닐]-"에 대한 약어이고; "Fethoc-"는 "[2-(9-플루오레닐)에틸-1-옥시]카보닐"; "Ac-"는 "아세틸-"; " Benzoyl-"은 "벤젠카보닐-"; "Piv-"는 "피발릴-"; "n-Propyl-"은 1-(n-프로필)-"; "H-"는 "하이드리도-" 기; "p-Toluenesulfonyl"은 "(4-메틸벤젠)-1-설포닐-"; "-Lys-"는 아미노산 잔기 "리신"; "-Val-"은 아미노산 잔기 "발린"; "-Leu-"는 아미노산 잔기 "류신"; "-Arg-"는 아미노산 잔기 "아르기닌"; "-Gly-"는 아미노산 잔기 "글리신"; "[N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-"은 "[N-1-(2-페닐에틸)아미노]카보닐-"; "Benzyl-"은 "1-(페닐)메틸-"; "Phenyl-"은 "페닐-"; "Me-"는 "메틸-";"-HEX-"은 "6-아미노-1-헥사노일-", "FAM-"은 "5, 또는 6-플로레신-카보닐- (이성체 혼합물)"; "-NH2"는 비치환된 "-아미노" 기에 대한 약어이다.
A, G, T, C, C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 그리고 G(pOq)로 약기된 PNA 모노머들에 대한 화학 구조를 총괄하여 도 9에 제공한다. 종래 기술 [PCT/KR2009/001256]에서 논의된 바와 같이, C(pOq)는 "구아닌"과 상보결합하기 때문에 "변형된 시토신" PNA 모노머로 인식된다. A(p) 및 A(pOq)는 "티민"에 강한 결합력을 갖기 때문에 "변형된 아데닌" PNA 모노머로 인식된다. 마찬가지로 G(p) 및 G(pOq)는 "시토신"과 생산적인 염기 쌍을 이루므로 "변형된 구아닌" PNA 모노머로 인식된다.
본 발명에서 화학식 I의 PNA 유도체의 N-말단 또는 C-말단의 다양화에 사용된 치환체들에 대한 다양한 약어들의 화학 구조를 도 10에 제공한다. 도 10에 예들로서 제공되는 N-말단 또는 C-말단의 기들은 단지 치환체들의 화학식 I의 화합물에 허용되는 N-말단 또는 C-말단의 치환체들의 다양성을 보여주기 위한 것이며, 따라서 본 발명의 화합물을 위한 N-말단 또는 C-말단의 기들의 범위를 한정하는 방향으로 해석하지 않아야 한다. 이 분야의 숙련된 전문가들은 표적 프리-mRNA 서열에 서열 특이적 결합을 할 때 올리고뉴클레오티드 서열이 더 중요하다는 것을 쉽게 인지할 것이다.
PNA 유도체들의 약자들을 분명히 보여주기 위해, 약자로 씌여진 14-머 PNA 유도체 "(N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2"의 화학 구조가 도 11에 제공된다.
또 다른 예시로서 약자로 씌여진 15-머 PNA 유도체 "(N → C) Fmoc-Val- CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C-NH2" 의 화학 구조가 도 12에 제공된다.
화학식 I의 화합물은 "표적하는 프리-mRNA 중 인트론 7-머와 엑손 7-머로 구성되는 14-머의 표적하는 스플라이스 위치와 최소한 10-머 이상의 상보적인 결합을 하며"의 조건에 부합해야 한다. 예를 들면, 만약 화학식 I의 화합물이 인간 HIF-1α 프리-mRNA에서 인트론 1 및 엑손 2의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치를 표적한다면, 3' 스플라이스 위치는 [(5' → 3') guuguuguuaaguag┃GAUAAGUUCUGAACG]의 30-머 인간 HIF-1α 프리-mRNA 서열로 명확하게 정의된다. 따라서 표적하는 HIF-1α 3' 스플라이스 위치의 14-머는 [(5' → 3') uaaguag┃GAUAAGU]가 된다.
"(N → C) Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)C-NH2"의 15-머 HIF-1α ASO 서열은 인간 HIF-1α 프리-mRNA에의 상보성 결합을 위한 "(5' → 3') CAG-AAC-TTA-TCC-TAC"의 DNA 서열에 상응한다. 상기 15-머 ASO는 인간 HIF-1α 프리-mRNA에서 인트론 1 및 엑손 2의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치와 15-머의 상보적 결합을 하는데 (즉 완전히 상보적인 결합을 하는데), [(5' → 3') guuguuguuaa guag ┃ GAUAAGUUCUG AACG]의 30-머 프리-mRNA 서열에서 "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분이 상보성 오버랩을 하는 부분이다. 이 PNA ASO는 [(5'→ 3') uaaguag┃GAUAAGU]의 14-머 인간 HIF-1α 프리-mRNA와 11-머의 상보적인 오버랩을 (인트론 1과 4-머 그리고 엑손-2와 7-머) 한다. 따라서 이 15-머 HIF-1α PNA ASO는 화학식 I의 화합물에 대한 상보적인 결합 요구 조건에 부합한다.
"(N→C) Fethoc-CTC(1O2)-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2"의 또다른 15-머 HIF-1α ASO의 서열은 프리-mRNA에의 상보성 결합을 위한 "(5' → 3') CTC-ATC-CTA-CTT-AAC"의 DNA 서열에 상응한다. 상기 15-머 PNA ASO는 인간 HIF-1α 프리-mRNA에서 "인트론 1" 및 "엑손 2"의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치와 한 개의 부정합을 갖는 데, [(5' → 3') guuguu guuaaguag ┃ GAU "A" AG UUCUGAACG]의 30-머 HIF-1α 프리-mRNA 서열에서 "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분이 상보성 오버랩을 하는 부분이고 인용 부호 (" ")로 표시한 부분이 부정합 위치이다. 이 15-머 PNA는 화학식 I의 화합물을 서술하는 데 적용되는 [(5'→ 3') uaaguag ┃ GAU "A" AG U]의 14-머 3' 스플라이스 위치 서열과 "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분에서 12-머의 상보적인 오버랩을 하며 인용 부호 (" ")로 표시한 부분이 부정합 위치이다. 하나의 부정합에도 불구하고 이 15-머 HIF-1α ASO는 화학식 I의 화합물에 대한 상보적인 결합 요구 조건에 부합한다.
예를 들면 화학식 I의 화합물이 인간 SCN9A 프리-mRNA에서 엑손 4 및 인트론 4의 연결 부위에 걸쳐 있는 5' 스플라이스 위치를 표적하는 경우에는, 5' 스플라이스 위치는 인간 SCN9A 유전자에서 [정보 위치는 NCBI 참고 서열: NC_000002.12] 유래된 30-머 인간 SCN9A 프리-mRNA 서열 [(5'→3') CGUCAUUGUUUUUGC┃guaaguacuuucagc]로 명확하게 정의된다. 따라서 표적하는 SCN9A 5' 스플라이스 위치의 14-머는 [(5'→3')UUUUUGC┃guaagua]가 된다.
"(N→C) Fethoc-AC(1O2)T-TA(5)C-G(6)CA-A(5)AA(5)-AC(1O2)A- A(5)-NH2"의 16-머 SCN9A ASO 서열은 인간 SCN9A 프리-mRNA에의 상보성 결합을 위한 "(5' → 3') ACT-TAC-GCA-AAA-ACA-A"의 DNA 서열에 상응한다. 상기 16-머 PNA는 인간 SCN9A 프리-mRNA에서 엑손 4 및 인트론 4의 연결 부위에 걸쳐 있는 5' 스플라이스 위치와 16-머의 (완전히 상보적인) 상보적 결합을 하는 데, [(5' → 3') CGUCA UUGUUUUUGC ┃ guaagu acuuucagc]의 30-머 SCN9A 프리-mRNA 서열에서 "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분이 상보성 오버랩을 하는 부분이다. 이 16-머 SCN9A ASO는 [(5'→ 3') UUUUUGC ┃ guaagu a]의 14-머 5' 스플라이스 위치 서열과 "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분에서 13-머의 상보적인 오버랩을 한다. 따라서 이 16-머 SCN9A ASO는 화학식 I의 화합물에 대한 상보적인 결합 요구 조건에 부합한다.
도 1A. 프리-mRNA에서 인트론과 엑손의 번호 붙이기 예시.
도 1B. 스플라이싱 과정의 간략한 도식화.
도 2A. 변형된 AR 단백질을 암호화하는 AR mRNA 스플라이스 변형체.
도 2B. 변형된 HIF-1α 단백질을 암호화하는 HIF-1α mRNA 스플라이스 변형체.
도 3. 스플라이스오솜 초기 복합체의 형성과 관련된 생물학적 과정의 도식화.
도 4A. 인간 HIF-1α mRNA 코딩 DNA 서열의 일부.
도 4B. 엑손 3과 (왼쪽) 엑손 3-4가 (오른쪽) 결여된 HIF-1α 스플라이스 변형체의 엑손-엑손 연결 부위 서열과 각각의 구조이동 및 구조유지 예시.
도 4C. 미성숙 종결 코돈이 생성되는 구조이동의 예.
도 5A. 엑손 스키핑을 발견하기 위한 중첩 RT-PCR의 도식화.
도 5B. 엑손 스키핑 중에 생성되는 EIciRNA의 도식화.
도 6A. 대표적인 올리고뉴클레오타이드의 화학 구조.
도 6B. PNA 원형의 화학 구조와 축약된 명명법.
도 6C. PNA의 세포 투과성을 향상시키기 위해 개발된 변형된 핵산 염기.
도 7. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체를 위하여 선택될 수 있는, 천연 혹은 비천연 (변형된) 핵산 염기의 예.
도 8A. 화학식 I의 화합물에 사용되는 치환체가 있거나 없는 알킬의 예.
도 8B. 화학식 I의 화합물을 위하여 선택될 수 있는, 치환체가 있거나 없는 알킬아실과 치환체가 있거나 없는 아릴아실의 예.
도 8C. 화학식 I의 화합물을 위하여 선택될 수 있는, 치환된 알킬아미노, 치환된 아릴아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐, 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐의 예.
도 8D. 화학식 I의 화합물을 위하여 선택될 수 있는, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐의 예.
도 8E. 화학식 I의 화합물을 위하여 선택될 수 있는, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카보닐의 예.
도 9. 천연 혹은 변형된 핵산 염기를 갖는 PNA 모노머의 화학 구조.
도 10. N-말단 혹은 C-말단 치환체의 약자 및 화학 구조.
도 11. 14-머 PNA 유도체 (N→C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2의 화학 구조.
도 12. 15-머 PNA 유도체 (N→C) Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C-NH2의 화학 구조.
도 13. 본 발명의 PNA 유도체를 합성하는 데 사용된 Fmoc-PNA 모노머의 화학 구조.
도 14. SPPS에서의 전형적인 모노머 신장주기.
도 15A. "HIF-ASO 1"의 정제 전 C18-역상 HPLC 크로마토그램.
도 15B. "HIF-ASO 1"의 정제 후 C18-역상 HPLC 크로마토그램.
도 16. 대용량 C18-역상 HPLC로 정제한 "HIF-ASO 1"의 ESI-TOF 질량 스펙트럼.
도 17A. 헬라 세포에서 "HIF-ASO 2"에 의해 유도된 엑손 스키핑을 발견하기 위한 HIF-1α 중첩 PCR에 사용된 엑손 특이적인 프라이머의 표적 위치.
도 17B. 0 (음성 대조용), 10, 100 혹은 1,000 zM의 "HIF-ASO 2"를 처리한 헬라 세포에서 HIF-1α 중첩 PCR 산물의 전기영동 데이터.
도 17C. HIF-1α 엑손 2의 스키핑으로 판명된 PCR 산물 밴드의 생거 서열분석.
도 18A. 0 zM (음성 대조용), 10 zM, 100 zM, 1 aM 혹은 10 aM의 "HIF-ASO 2"를 24 시간 처리한 헬라 세포에서 HIF-1α 웨스턴 블럿 데이터.
도 18B. 0 zM (음성 대조용), 10 zM, 100 zM, 1 aM 혹은 10 aM의 "HIF-ASO 2"를 24 시간 처리한 헬라 세포에서 β-액틴에 대해 정규화한 상대적인 HIF-1α 단백질 발현량 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 18C. 0 (음성 대조용), 10, 100 혹은 1,000 zM의 "HIF-ASO 2"를 처리한 헬라 세포에서 사이버 그린에 의한 HIF-1α 중첩 qPCR (표준 오차에 의한 에러 바).
도 18D. 0 (음성 대조용), 10, 100 혹은 1,000 zM의 "HIF-ASO 2"를 처리한 헬라 세포에서 택만 탐색에 의한 HIF-1α 중첩 qPCR (표준 오차에 의한 에러 바).
도 19A. 0 (음성 대조용), 10, 100 혹은 1,000 zM의 "HIF-ASO 6"을 처리한 헬라 세포에서 HIF-1α 중첩 PCR 산물의 전기영동 데이터.
도 19B. 0 zM (음성 대조용), 10 zM, 100 zM, 혹은 1 aM의 "HIF-ASO 6"을 24 시간 처리한 헬라 세포에서 HIF-1α 웨스턴 블럿 데이터.
도 19C. 0 zM (음성 대조용), 10 zM, 100 zM, 혹은 1 aM의 "HIF-ASO 6"을 24 시간 처리한 헬라 세포에서 β-액틴에 대해 정규화한 상대적인 HIF-1α 단백질 발현량 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 20A. 0 (음성 대조용), 10, 100 혹은 1,000 zM의 "HIF-ASO 6"을 처리한 헬라 세포에서 사이버 그린에 의한 중첩 qPCR 데이터 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 20B. 0 (음성 대조용), 10, 100 혹은 1,000 zM의 "HIF-ASO 6"을 처리한 헬라 세포에서 택만 탐색에 의한 중첩 qPCR 데이터 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 21A. 0 (음성 대조용), 1, 3, 10, 30 혹은 100 aM의 "HIF-ASO 1"을 처리한 헬라 세포에서 HIF-1α 중첩 PCR 산물의 전기영동 데이터와 (왼쪽) 엑손 2-3의 스키핑으로 판명된 PCR 산물의 생거 서열분석 데이터 (오른쪽).
도 21B. 0 zM (음성 대조용), 100 zM, 300 zM, 1 aM, 3 aM, 10 aM, 30 aM, 100 aM 혹은 300 aM 의 "HIF-ASO 1"을 72시간 처리한 헬라 세포에서 HIF-1α 웨스턴 블럿 데이터.
도 21C. 0 zM (음성 대조용), 100 zM, 300 zM, 1 aM, 3 aM, 10 aM, 30 aM, 100 aM 혹은 300 aM 의 "HIF-ASO 1"을 72시간 처리한 헬라 세포에서 β-액틴에 대해 정규화한 HIF-1α 단백질 발현량.
도 22A. 0 (음성 대조용), 10, 100 혹은 1,000 zM의 "HIF-ASO 12"를 처리한 헬라 세포에서 HIF-1α 중첩 PCR 데이터와 (왼쪽) 엑손 스키핑 밴드의 생거 서열분석 데이터 (오른쪽).
도 22B. 0 (음성 대조용), 0.01, 0.1, 1 혹은 10 aM의 "HIF-ASO 12"를 처리한 헬라 세포에서 HIF-1α 웨스턴 블럿 데이터
도 22C. 0 (음성 대조용), 10, 100 혹은 1,000 zM의 "HIF-ASO 12"를 처리한 헬라 세포에서 얻은 HIF-1α 중첩 qPCR 데이터 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 23A. 0 (음성 대조용), 3, 30, 300 혹은 3,000 aM의 "AR-ASO 1"을 3시간 처리한 MCF7 세포에서 AR 중첩 PCR 산물의 전기영동 분석.
도 23B. 엑손 4-5 스키핑으로 판명된 PCR 산물 밴드의 생거 서열분석 데이터.
도 23C. 0 zM (음성 대조용), 10 zM, 30 zM, 100 zM, 300 zM , 1 aM, 3 aM, 10 aM 혹은 30 aM의 "AR-ASO 1"을 48시간 처리한 MCF7 세포에서 AR 웨스턴 블럿 데이터.
도 24A. 0 (음성 대조용), 1, 10, 100 혹은 1,000 zM의 "AR-ASO 1"을 5시간 처리한 MCF7 세포에서 사이버 그린에 의한 AR 엑손 4-6 양의 qPCR 데이터 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 24B. 0 (음성 대조용), 1, 10, 100 혹은 1,000 zM의 "AR-ASO 5"를 5시간 처리한 MCF7 세포에서 사이버 그린에 의한 AR 엑손 4-6 양의 qPCR 데이터 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 24C. 0 (음성 대조용), 1, 10, 100 혹은 1,000 zM의 "AR-ASO 5"를 24시간 처리한 MCF7 세포에서 태만 분석에 의한 AR mRNA의 qPCR 데이터 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 25A. 주사 부위의 피부에서 얻은 웨스턴 블럿 원자료. NC, 1p, 10p, 100p 및 1,000p는 각각 음성 대조군, 1, 10, 100 및 1,000 pmole/Kg ASO 투여군을 나타낸다.
도 25B. 비주사 부위의 피부에서 얻은 웨스턴 블럿 원자료. NC, 1p, 10p, 100p 및 1,000p는 각각 음성 대조군, 1, 10, 100 및 1,000 pmole/Kg ASO 투여군을 나타낸다.
도 26A. 주사 부위 (왼쪽) 및 비주사 부위에서(오른쪽) 대상별과 군별 AR 단백질발현량 (** p < 0.01 및 * for p < 0.05).
도 26B. 주사 부위 (왼쪽) 및 비주사 부위에서(오른쪽) 군별 AR 평균 단백질 발현량 (** p < 0.01 및 * p < 0.05).
도 27A. 0 (음성 대조용), 30, 100 혹은 1,000 aM의 "AR-ASO 1"을 3시간 처리한 MCF7 세포에서 AR 중첩 PCR 산물의 전기영동 분석.
도 27B. 엑손 5 스키핑으로 판명된 PCR 산물 밴드의 생거 서열분석 데이터.
도 28A. 0 (음성 대조용), 10, 100 혹은 1,000 zM의 "SCN-ASO 7"을 24시간 처리한 PC3 세포에서 SCN9A 중첩 PCR 산물의 전기영동 분석.
도 28B. 엑손 4 (위) 및 4-5 (아래) 스키핑으로 판명된 중첩 PCR 산물 밴드의 생거 서열분석 데이터.
도 29A. 0 (음성 대조용), 10, 100 혹은 1,000 zM의 "SCN-ASO 7"을 24시간 처리한 PC3 세포에서의 SCN9A 중첩 qPCR 데이터 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 29B. 0 (음성 대조용), 10, 100 혹은 1,000 zM의 "SCN-ASO 3"을 24시간 처리한 PC3 세포에서의 SCN9A 중첩 qPCR 데이터 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 29B. 0 (음성 대조용), 10, 혹은 100 zM의 "SCN-ASO 8"을 24시간 처리한 PC3 세포에서의 SCN9A 중첩 qPCR 데이터 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 30A. 0 (음성 대조용), 100 혹은 1,000 zM의 "SCN-ASO 7"을 30시간 처리한 PC3 세포에서의 코로나 분석 결과.
도 30B. 0 (음성 대조용), 100 혹은 1,000 zM의 "SCN-ASO 3"을 30시간 처리한 PC3 세포에서의 코로나 분석 결과.
도 30C. 0 (음성 대조용), 100 혹은 1,000 zM의 "SCN-ASO 8"을 30시간 처리한 PC3 세포에서의 코로나 분석 결과.
도 31A. 0 (음성 대조용), 10, 혹은 100 zM의 "ASO 27"을 24시간 처리한 PC3 세포에서 SCN9A 중첩 RT-PCR 산물의 전기영동 분석 데이터.
도 31B. 엑손 4-5 스키핑으로 판명된 PCR 산물 밴드의 생거 서열분석 데이터.
도 31C. 0 (음성 대조용), 1, 10, 100, 혹은 1,000 aM의 "ASO 27"을 처리한 PC3 세포에서 SCN9A 중첩 RT-PCR 산물의 전기영동 분석 데이터.
도 32A. 0 (음성 대조용), 0.1, 1, 혹은 10 aM의 "SCN-ASO 27"을 24시간 처리한 PC3 세포에서 원스텝 cDNA 합성에 의한 SCN9A qPCR 데이터 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 32B. 0 (음성 대조용), 0.1, 1, 혹은 10 aM의 "SCN-ASO 27"을 24시간 처리한 PC3 세포에서 무작위 헥사머의 cDNA 합성에 의한 SCN9A qPCR 데이터 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 33A. 0 (음성 대조용), 100, 혹은 1,000 zM의 "SCN-ASO 27"을 처리한 쥐 L5 DRG 세포에서 (L5/L6 결찰로 자극된) 세포 형광 강도의 평균치.
도 33B. 0 (음성 대조용), 100, 혹은 1,000 zM의 "SCN-ASO 27"을 처리한 쥐 L5 DRG 세포에서 (L5/L6 결찰 없음) 세포 형광 강도의 평균치.
도 34A. 0 (음성 대조용), 10, 100, 혹은 1,000 zM의 "SCN-ASO 30"을 24시간 처리한 DRG 신경 세포에서 (L5/L6 결찰로 자극된) Nav1.7 단백질 발현에 대한 웨스턴 블럿 데이터.
도 34B. 0 (음성 대조용) 및 100 zM의 "SCN-ASO 30"을 4시간 처리한 DRG 신경 세포에서 (L5/L6 결찰로 자극된) 수동 패치 클램프 분석에 의한 나트륨 전류 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 35A. 0 (음성 대조용), 10, 30, 100, 혹은 300 zM의 "SCN-ASO 30"을 24시간 처리한 쥐 L5 DRG 신경 세포에서 원스텝 cDNA 합성에 의한 SCN9A qPCR 데이터 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 35A. 0 (음성 대조용), 10, 30, 100, 혹은 300 zM의 "SCN-ASO 30"을 24시간 처리한 쥐 L5 DRG 신경 세포에서 무작위 헥사머의 cDNA 합성에 의한 SCN9A qPCR 데이터 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 36. 용매 (PBS, 음성 대조용), "SCN-ASO 7" 100 pmole/Kg, "SCN-ASO 8" 100 pmole/Kg, "SCN-ASO 21" 100 pmole/Kg, "SCN-ASO 35" 100 pmole/Kg, "SCN-ASO 36" 100 pmole/Kg, 그리고 "SCN-ASO 37" 100 pmole/Kg를 피하 투여한 쥐에서 DPNP로 유도된 이질통의 경감 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 37A. 용매 만 (음성 대조용), 1,000 pmole/Kg "DMD-ASO 1", 혹은 1,000 pmole/Kg "DMD-ASO 4"를 3일 동안 하루에 2번 피하 투여한 mdx 쥐의 근육 조직에서 얻은 중첩 PCR (방법 A) 산물의 전기영동 데이터.
도 37B. 엑손 23 스키핑으로 판명된 PCR 산물 밴드의 생거 서열분석 데이터.
도 38A. 용매 만 (음성 대조용), 1,000 pmole/Kg "DMD-ASO 1", 혹은 1,000 pmole/Kg "DMD-ASO 4"를 3일 동안 하루에 2번 피하 투여한 mdx 쥐의 근육 조직에서 얻은 중첩 PCR (방법 B) 산물의 전기영동 데이터.
도 38B. 엑손 21-23 스키핑으로 판명된 PCR 산물 밴드의 생거 서열분석 데이터.
도 38C. 0 (음성 대조용) 혹은 10 pmole/Kg "DMD-ASO 1"을 5일 동안 하루에 2번 피하 투여한 mdx 쥐의 삼두근 샘플에서 얻은 중첩 PCR (방법 A) 산물의 전기영동 데이터.
도 39A. 용매 (음성 대조용), 100 pmole/Kg "DMD-ASO 1" 혹은 1,000 pmole/Kg "DMD-ASO 1"을 투여한 mdx 쥐의 로타로드 측정치 (표준 오차에 의한 에러 바, * p < 0.05).
도 39B. 0 (음성 대조용), 10, 50, 혹은 200 pmole/Kg "DMD-ASO 1"을 만성적으로 투여한 mdx 쥐의 그립 강도 측정치 (표준 오차에 의한 에러 바, * p < 0.05).
도 40. 0 (음성 대조용) 혹은 200 pmole/Kg "DMD-ASO 1"을 30주 동안 주당 2회 투여한 mdx 쥐의 근육 조직에서 DAPI로 염색한 전체 길이 디스트로핀의 IHC 이미지.
도 41. 0 (음성 대조용), 10, 50, 혹은 200 pmole/Kg "DMD-ASO 1"을 만성적으로 투여한 mdx 쥐의 골격근에서 전체 길이 디스트로핀 단백질의 상대적인 발현량. 발현량은 야생형 쥐의 발현량에 대해 정규화하였다 (표준 오차에 의한 에러 바, * p < 0.05 및 ** p < 0.01).
도 42. 7주차에 mdx 쥐의 골격근에서 얻은 중첩 PCR 산물의 전기영동 데이터
도 43. 0 (mdx음성 대조용), 10, 50, 혹은 200 pmole/Kg "DMD-ASO 1"을 만성적으로 투여한 mdx 쥐와 C57BL/6 쥐의 (야생형 음성 대조용) 삼두근 H&E 염색에 의한 조직병리학 변화.
도 44A. 0 (mdx 음성 대조용), 10, 혹은 30 pmole/Kg "DMD-ASO 2"를 만성적으로 투여한 mdx 쥐와 C57BL/6 쥐가 (야생형 음성 대조용) 트레드밀에서 걸은 거리 (표준 오차에 의한 에러 바, * p < 0.05, ** p < 0.01 및 *** for p < 0.001).
도 44B. 0 (mdx 음성 대조용), 10, 혹은 30 pmole/Kg "DMD-ASO 2"를 만성적으로 투여한 mdx 쥐와 C57BL/6 쥐의 (야생형 음성 대조용) CK 혈청 중 수치 (표준 오차에 의한 에러 바, ** p < 0.01 및 **** for p < 0.0001).
도 44C. 0 (mdx 음성 대조용), 10, 혹은 30 pmole/Kg "DMD-ASO 2"를 만성적으로 투여한 mdx 쥐와 C57BL/6 쥐의 (야생형 음성 대조용) 미오글로빈 혈청 중 수치 (표준 오차에 의한 에러 바, *** p < 0.001 및 **** for p < 0.0001).
도 45A. 0 (mdx 음성 대조용), 10, 혹은 30 pmole/Kg "DMD-ASO 2"를 만성적으로 투여한 mdx 쥐와 야생형 쥐의 (야생형 음성 대조용) 골격근에서 전체 길이 디스트뢴에 대한 웨스턴 블럿 데이터.
도 45B. 0 (mdx 음성 대조용), 50 pmole/Kg "DMD-ASO 1", 10 pmole/Kg "DMD-ASO 2", 혹은 10 pmole/Kg "DMD-ASO 6"을 66주 동안 주당 2회 투여한 mdx 쥐와 야생형 쥐의 (야생형 음성 대조용) CK 혈청 중 수치 (표준 오차에 의한 에러 바, ** p < 0.01).
도 45C. 0 (mdx 음성 대조용), 50 pmole/Kg "DMD-ASO 1", 10 pmole/Kg "DMD-ASO 2", 혹은 10 pmole/Kg "DMD-ASO 6"을 66주 동안 주당 2회 투여한 mdx 쥐와 야생형 쥐의 (야생형 음성 대조용) 미오글로빈 혈청 중 수치 (표준 오차에 의한 에러 바, * p < 0.05 및 *** p < 0.001).
도 46A. 0 (음성 대조용), 10, 100 혹은 1,000 zM의 "IDO-ASO 1"을 처리한 SKOV3 세포에서 IDO-1 중첩 PCR 산물의 전기영동 데이터와 (왼쪽 도표) 엑손 스키핑 PCR 밴드의 생거 서열분석 데이터 (오른쪽 도표).
도 46B. 0 zM (음성 대조용) 혹은 10 zM에서 1 fM의 "IDO-ASO 1"을 처리한 SKOV3 세포에서 키누레닌 분비 분석 결과 (표준 오차에 의한 에러 바, * p < 0.05).
도 47A. 0 (음성 대조용), 1, 3, 10, 30 혹은 100 aM의 "IDO-ASO 5"를 처리한 SKOV3 세포에서 IDO-1 중첩 PCR 산물의 전기영동 데이터
도 47B. 엑손 2-4 및 엑손 2-6스키핑으로 판명된 PCR 밴드의 생거 서열분석 데이터.
도 46C. 0 (음성 대조용), 1, 3, 10, 30 혹은 100 aM의 "IDO-ASO 6"을 처리한 SKOV3 세포에서 IDO-1 중첩 PCR 산물의 전기영동 데이터와 (왼쪽 도표) 엑손 2-5의 스키핑으로 판명된 PCR 밴드의 생거 서열분석 데이터 (오른쪽 도표).
도 48A. 0 (음성 대조용), 10, 100 혹은 1,000 zM의 "SNAP-ASO 3"을 처리한 PC12 세포에서 SNAP25 중첩 PCR 산물의 전기영동 분석과 (왼쪽 도표) 엑손 5-7의 스키핑으로 판명된 PCR 밴드의 생거 서열분석 데이터 (오른쪽 도표).
도 48B. 0 (음성 대조용), 10, 100 혹은 1,000 zM의 "SNAP-ASO 3"을 처리한 PC12 세포에서 전체 길이 쥐 SNAP25 mRNA 양의 변화 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 48C. 0 (음성 대조용), 10, 100 혹은 1,000 zM의 "SNAP-ASO 1"을 처리한 PC12 세포에서 전체 길이 쥐 SNAP25 mRNA 양의 변화 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 49A. 0 zM (음성 대조용), 1 zM, 10 zM, 30 zM, 100 zM, 300 zM, 1 aM, 3 aM 혹은 10 aM의 "SNAP-ASO 3"을 48시간 처리한 PC12 세포에서 SNAP25 웨스턴 블럿 데이터와 (위 도표) β-액틴에 대해 정규화된 상대적인 SNAP25 발현량 (아래 도표).
도 49B. 0 (음성 대조용), 0.1 혹은 1 aM의 "SNAP-ASO 1"을 48시간 혹은 72시간 처리한 PC12 세포에서 SNAP25 웨스턴 블럿 데이터.
도 50A. 0 zM (음성 대조용), 1 zM, 10 zM, 100 zM, 1 aM, 10 aM 혹은 100 aM의 "SNAP-ASO 3"을 48시간 처리한 SiMa 세포에서 SNAP25 웨스턴 블럿 데이터와 (위 도표) β-액틴에 대해 정규화된 상대적인 SNAP25 발현량 (아래 도표).
도 50B. 0 zM (음성 대조용), 1 zM, 10 zM, 100 zM, 1 aM, 10 aM, 혹은 100 aM 의 "SNAP-ASO 3"을 처리한 SiMa 세포에서 전체 길이 인간 SNAP25 mRNA 양의 변화 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 51. 0 (음성 대조용), 1, 10 혹은 100 fM의 "SNAP-ASO 1"을 4일 동안 하루에 2번 국소 투여한 쥐의 피부 샘플에 대한 SNAP25 IHC 이미지.
도 52A. 0 (음성 대조용), 1, 10 혹은 1,000 aM의 "TYR-ASO 4"를 처리한 B16F10 쥐 흑색종 세포에서 중첩 PCR 산물의 전기영동 분석
도 52B. 엑손 2-3 스키핑으로 판명된 PCR 밴드의 생거 서열분석.
도 52C. 0 (음성 대조용), 1, 10, 100 혹은 1,000 aM의 "TYR-ASO 4"를 처리한 B16F10 쥐 흑색종 세포에서 qPCR에 의한 전체 길이 TYR mRNA 양의 변화 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 53A. 0 (음성 대조용), 0.01, 0.1, 1 혹은 10 aM의 "TYR-ASO 4"를 24시간 처리한 B16F10 세포에서 qPCR에 의한 전체 길이 TYR 웨스턴 블럿 데이터
도 53B. 0 (음성 대조용), 1, 10, 100, 혹은 1,000 aM의 "TYR-ASO 4" 또는 10 μg/mL 혹은 100 μg/mL의 알부틴으로 처리한 B16F10 쥐 흑색종 세포에서 멜라닌 함량의 변화 (표준 오차에 의한 에러 바, * p < 0.05, ** p < 0.01 및 *** p < 0.001).
도 53C. 0 zM (음성 대조용), 1 zM, 100 zM, 혹은 10 aM의 "TYR-ASO 1"로 처리한 인간 1차 상피 멜라닌 세포에서 qPCR에 의한 전체 길이 TYR mRNA 양의 변화 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 54A. 0 (음성 대조용), 10, 100 혹은 1,000 aM의 "PD-ASO 3"을 처리한 Jurkat 세포에서 중첩 PCR 산물의 전기영동 분석
도 54B. 엑손 2와 (왼쪽) 엑손 3의 (오른쪽) 스키핑으로 판명된 PCR 밴드의 생거 서열분석.
도 55A. 0 (음성 대조용), 10, 100, 혹은 1,000 aM의 "PD-ASO 3"을 처리한 Jurkat 세포에서 중첩 qPCR에 의한 인간 PD-1 mRNA 양의 변화 (표준 오차에 의한 에러 바, ** p < 0.01 및 * p < 0.05).
도 55B. 0 (음성 대조용), 10, 100, 혹은 1,000 aM의 "PD-ASO 3"을 처리한 Jurkat 세포에서 qPCR에 의한 인간 IL-2 mRNA 양의 변화 (표준 오차에 의한 에러 바, ** p < 0.01 및 * p < 0.05).
도 56A. 0 (음성 대조용), 10, 100, 혹은 1,000 aM의 "PD-ASO 1"을 처리한 Jurkat 세포에서 중첩 qPCR에 의한 인간 PD-1 mRNA 양의 변화 (표준 오차에 의한 에러 바, * p < 0.05).
도 56B. 2, 10, 혹은 50 pmole/Kg의 "PD-ASO 2"를 주당 2회 피하 투여한 C57BL/6 쥐에서 B16F10 흑색종 성장의 억제 (표준 오차에 의한 에러 바, * p < 0.05).
PNA 올리고머를 합성하는 일반적인 방법
PNA 올리고머는 선행 기술 [US6,133,444; WO96/40685]에 공개된 방법으로, 혹은 이를 약간 변형하여 Fmoc-화학에 기반한 고체상 펩타이드 합성 (SPPS: solid phase peptide synthesis)에 의해 합성하였다. 상기 연구에 사용된 고체 지지체는 PCAS 바이오매트릭스 인코포레이티드로부터 (PCAS BioMatrix Inc., 캐나다 퀘백 소재) 구입한 H-링크 아미드-켐매트릭스 (H-Rink Amide- ChemMatrix)였다. 변형된 핵염기를 갖는 Fmoc-PNA 모노머는 종래 기술 [PCT/KR 2009/001256]에 기재된 바와 같이 혹은 이를 약간 변형하여 합성하였다.
본 발명에 사용된 변형된 핵염기를 갖는 Fmoc-PNA 모노머의 화학적 구조는 도 13에 제공된다. 도 13에 제공되는 Fmoc-PNA 모노머들은 단지 예들로서 받아들여져야 하며, 따라서 본 발명의 범위를 한정하는 방향으로 해석하지 않아야 한다. 이 분야의 숙련된 전문가들은 화학식 I의 PNA 유도체를 합성하기 위해 사용된 Fmoc-PNA 모노머들에 대해서, 예를 들면, 다양한 종류의 많은 보호기들을 쉽게 생각해 낼 수 있을 것이다.
PNA 올리고머를 C18-역상 HPLC로 (0.1% TFA를 갖는 물/아세토니트릴 또는 물/메탄올) 정제하고 MALDI-TOF/MS나 ESI-TOF/MS와 같은 질량 분광분석법에 의해 특성화하였다.
도 14는 본 발명의 SPPS에서 전형적인 모노머 신장주기 (elongation cycle)를 예시하며, 합성 세부사항을 하기와 같이 제공한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가에게는 자동 펩타이드 합성기 또는 수동 펩타이드 합성기 상에서 상기와 같은 SPPS 반응을 유효하게 실행함에 있어서 명백하게 가능한 작은 변화들이 다수 존재한다. SPPS의 각 반응 단계들이 반응 방법의 예시로서 하기와 같이 제공된다.
[H-링크-캠마트릭스 레진의 활성화] 0.01 mmol (약 20 mg) 켐매트릭스 레진과 1.5 mL 20% 피페리딘/디메틸포름아미드(DMF)가 혼합된 현탁액을 리브라 튜브에서 20분간 보텍싱 (vortexing)후 용액을 여과해서 제거한다. 레진을 1.5 mL 메틸렌클로라이드 (MC), 1.5 mL DMF, 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척하고 나면, 레진의 아민은 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머나 Fmoc으로 보호된 아미노산과 반응할 준비가 완료된다.
[Fmoc 제거 (DeFmoc)] 0.01 mmol (약 20 mg) 레진과 1.5 mL 20% 피페리딘/DMF가 혼합된 현탁액을 리브라 튜브에서 7분간 보텍싱 후 DeFmoc 용액을 여과해서 제거한다. 레진을 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척하고 나서, 레진의 아민은 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머와 즉시 반응을 시킨다.
[Fmoc-PNA 모노머와의 커플링 (Coupling)] 레진의 아민은 다음과 같은 방법으로 Fmoc-PNA 모노머와 커플링된다. 0.04 mmol Fmoc-PNA 모노머, 0.05 mmol HBTU [2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3,-테트라메틸우로늄 헥사플루오로-포스페이트], 그리고 10 mmol DIEA (N,N-diisopropylethylamine) 등을 1 mL 무수 DMF에 녹인 다음, 2분 후에 그 용액을 레진의 아민에 가한다. 레진 현탁액을 1 시간 동안 보텍싱 후 용액은 여과해서 제거하고, 레진은 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척한다.
[캡핑 (Capping)] 커플링 반응 후에 반응하지 않은 아민은 1.5 mL 캡핑 용액 (capping solution, 5% 아세틱안하이드라이드와 6% 2,6-루티딘의 DMF 용액)에서 5분간 반응을 통하여 캡핑(capping)된다. 캡핑 용액을 여과하여 제거한 후 레진은 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척한다.
[N-말단에 "Fethoc"기 도입] 일반적인 염기성의 커플링 조건에서 "Fethoc-OSu"와 반응하여 레진의 N-말단 아민에 "Fethoc"기가 도입되는 데, "Fethoc-OSu"의 [CAS No. 179337-69-0, C20H17NO5, MW 351.36] 화학적 구조는 다음과 같이 제공된다.
[레진으로부터 분리] 레진에 결합되어있는 PNA 올리고머는 1.5 mL 분리 용액 (cleavage solution, 2.5% 트리이소프로필실란과 2.5% 물의 트리플루오로아세틱산 용액)에서 3 시간 동안 반응하여 레진에서 분리된다. 레진을 여과하여 제거하고 여과액을 저압을 이용해서 혹은 용액 위에서 질소 가스를 불어서 농축한다. 잔사를 에테르(diethylether)로 처리하여 얻은 고체를 여과하여 수득한 다음, 역상 HPLC로 정제한다.
[HPLC 분석 및 정제] 레진에서 분리된 PNA 유도체의 조생성물 (crude product)은 0.1% TFA가 포함된 물/아세토니트릴이나 물/메탄올을 용리제로 사용하여 구배 방법의(gradient method) C18-역상 HPLC로 정제한다. 도 15A와 15B는 각각 "HIF-ASO 1"의 정제 전과 후의 C18-역상 HPLC 크로마토그램의 예시이다. "HIF-ASO 1"의 서열은 표 1에 제공된다.
화학식 I의 PNA 유도체에 대한 합성 예
PNA 유도체는 위의 방법을 따라서 혹은 부분적인 수정을 통하여 합성하였다. 본 발명의 PNA 유도체는 인간 혹은 마우스의 HIF-1α 프리-mRNA, 인간 혹은 마우스의 안드로젠 수용체 (AR) 프리-mRNA, 인간 혹은 랫 (rat)의 SCN9A 프리-mRNA, 마우스의 디스트로핀 (dystrophin) 프리-mRNA, 인간 혹은 마우스의 티로시나제 (tyrosinase) 프리-mRNA, 인간 혹은 마우스의 SNAP 25 프리-mRNA, 인간의 IDO1 프리-mRNA, 그리고 인간 혹은 마우스의 PD-1 프리-mRNA를 포함하나 이에 한정되지 않는 프리-mRNA 내의 스플라이스 위치를 표적하도록 고안되었다. 다수의 프리-mRNA들의 스플라이스 위치를 표적하는 그러한 PNA 유도체들을 제공하는 것은 화학식 I의 PNA 유도체들을 예시하기 위함이며 따라서 본 발명의 범위를, 예들로서 인용한 표적 스플라이스 위치들로 한정하는 방향으로 해석하지 않아야 한다.
표 1은 인간 HIF-1α 프리-mRNA에서 인트론 1 및 엑손 2의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 PNA 유도체들을 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터와 함께 제공한다. 표 1에서 HIF-1α ASO들을 제공하는 것은 화학식 I의 PNA 유도체를 예시하기 위함이며 본 발명의 범위를 표 1에 명시된 PNA 유도체들로 한정하기 위함이 아니다.
인간 HIF-1α 프리-mRNA에서 인트론 1 및 엑손 2의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 PNA 유도체들과 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터.
PNA PNA 서열 (N→C) 정확한 질량, m/z
Theor.a Obs.b
HIF-
ASO 1		 Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2 4486.05 4486.04
HIF-ASO 2 Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2 4473.99 4474.02
HIF-ASO 3 Fethoc-G(5)AA(5)-CTT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2 4462.03 4462.07
HIF-ASO 4 Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-CT-NH2 4376.94 4376.99
HIF-ASO 5 Fethoc-G(5)AA(6)-CTT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)T-NH2 4504.07 4504.09
HIF-ASO 6 Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-TA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-
TA(6)-NH2 		5393.47 5393.44
HIF-ASO 7 Fethoc-C(1O5)TT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2 4784.18 4784.14
HIF-ASO 8 Fethoc-CTC(1O2)-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2 4727.13 4727.79
HIF-ASO 9 Piv-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC-NH2 3695.73 3695.74
HIF-ASO 10 Piv-Lys-AA(6)C-TTA(6)-TCC(1O2)-TA(6)C-TTA(5)-
Val-NH2 		4844.33 4844.33
HIF-ASO 11 Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-CA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-
TA(6)-NH2 		5448.54 5448.50
HIF-ASO 12 H-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-T CC(1O3)-TA(5)-NH2 4263.98 4263.99
HIF-ASO 13 Benzoyl-CA(5)G(2O3)-AA(5)C-TTA(4)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2 4441.06 4441.06
HIF-ASO 14 n-Propyl-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(2O2)-TA(5)-NH2 4306.03 4306.05
HIF-ASO 15 p-Toluenesulfonyl-CA(5)G-AA(5)C-TTA(2O2)-TCC(1O2)-
TA(5)-NH2 		4405.95 4405.90
HIF-ASO 16 [N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-CA(5)G(3)-AA(5)C-
TTA(3)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2 		4426.06 4426.08
HIF-ASO 17 Fethoc-Lys-Leu-CA(5)G(2O2)-AA(5)C-TTA(8)-TCC(1O2)-
TA(5)-Lys-NH2 		4984.44 4984.46
HIF-ASO 18 N-Phenyl-N-Me-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-
TA(5)-Lys-NH2 		4468.11 4468.14
a) 이론상 정확한 질량, b) 관측된 정확한 질량
도 15A는 "HIF-ASO 1" 조생성물의 HPLC 크로마토그램이다. 조생성물은 대용량 C18-역상 HPLC로 정제하는 데, 도 15B는 정제한 "HIF-ASO 1"의 HPLC 크로마토그램이다. "HIF-ASO 1"의 순도는 대용량 HPLC 정제에 의해 현저히 향상되는 데, 도 16은 정제한 "HIF-ASO 1"의 ESI-TOF/MS 스펙트럼이다. "HIF-ASO 1"의 분석 데이터를 제공하는 것은 화학식 I의 PNA 유도체의 본 발명에서의 정제 및 동정 방법을 예시하기 위함이며 본 발명의 범위를 한정하기 위함이 아니다.
표 2는 인간 HIF-1α 프리-mRNA에서 인트론 3 및 엑손 4의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 PNA 유도체들을 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터와 함께 제공한다. 표 2에서 HIF-1α ASO들을 제공하는 것은 화학식 I의 PNA 유도체를 예시하기 위함이며 본 발명의 범위를 표 2에 명시된 PNA 유도체들로 한정하기 위함이 아니다.
인간 HIF-1α 프리-mRNA에서 인트론 3 및 엑손 4의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 PNA 유도체들과 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터.
PNA 예 PNA 서열 (N→C) 정확한 질량, m/z
Theor.a Obs.b
HIF-
ASO 19		 Fethoc-TA(5)G-TTC(1O2)-A(5)AA(5)-CTG(6)-TA(5)A-NH2 4915.27 4915.26
HIF-ASO 20 Fethoc-TA(5)G-TTC(1O2)-A(5)AA(5)-CTG(6)-CA(5)A-NH2 4900.27 4900.29
a) 이론상 정확한 질량, b) 관측된 정확한 질량
표 3은 인간 AR 유전자에서 [정보 위치는 NCBI 참고 서열: NC_000023.11] 유래된 인간 안드로젠 수용체 (AR) 프리-mRNA에서 엑손 5 및 인트론 5의 연결 부위에 걸쳐 있는 5' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 PNA 유도체들을 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터와 함께 제공한다. 표 3에서 AR ASO들을 제공하는 것은 화학식 I의 PNA 유도체를 예시하기 위함이며 본 발명의 범위를 표 3에 명시된 AR ASO들로 한정하기 위함이 아니다.
인간 AR 프리-mRNA에서 엑손 5 및 인트론 5의 연결 부위에 걸쳐 있는 5' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 PNA 유도체들과 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터.
PNA 예 PNA 서열 (N→C) 정확한 질량, m/z
Theor.a Obs.b
AR-
ASO 1		 Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2 4257.90 4257.92
AR-ASO 2 Fethoc-TC(1O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GGC(1O2)-AA(6)G-G(6)-NH2 5207.37 5207.42
AR-ASO 3 Fethoc-TC(1O2)C-TTA(5)-CCA(5)-GGC(1O2)-AA(5)G-G(6)-NH2 5165.32 5165.31
AR-ASO 4 Fethoc-TA(5)C-CAG(6)-GC(1O2)A-A(5)GG(6)-C-NH2 4283.97 4283.96
AR-ASO 5 Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2 3968.85 3968.86
AR-ASO 6 Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(6)GG(6)-CA(5)A-NH2 3982.86 3982.88
AR-ASO 7 Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2 3774.77 3774.83
AR-ASO 8 Fethoc-C(1O2)TT-A(6)CC-A(6)GG(6)-CA(6)A-NH2 4010.89 4010.93
AR-ASO 9 H-CTT-A(5)C(1O3)C-A(5)G(3)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2 4092.89 4092.90
AR-ASO 10 Benzoyl-CTT-A(5)C(1O5)C-A(5)G(2O2)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2 4254.96 4254.99
AR-ASO 11 n-Propyl-CTT-A(5)C(2O2)C-A(3)G(2O3)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2 4150.93 4150.93
AR-ASO 12 p-Toluenesulfonyl-CTT-A(5)C(1O2)C-A(8)G(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2 4302.96 4302.90
AR-ASO 13 Fethoc-Lys-Leu-CTT-A(5)C(1O2)C-A(2O2)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2 4629.16 4629.16
AR-ASO 14 Fethoc-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GT-C(1O2)TA(5)-G-NH2 4223.88 4223.93
AR-ASO 15 N-Phenyl-N-Me-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2 4239.96 4240.00
a) 이론상 정확한 질량, b) 관측된 정확한 질량
표 4는 인간 SCN9A 유전자에서 [정보 위치는 NCBI 참고 서열: NC_000002.12] 유래된 인간 SCN9A (나트륨 통로 아류형 9A) 프리-mRNA에서 엑손 4 및 인트론 4의 연결 부위에 걸쳐 있는 5' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 PNA 유도체들을 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터와 함께 제공한다. 표 4에서 SCN9A ASO들을 제공하는 것은 화학식 I의 PNA 유도체를 예시하기 위함이며 본 발명의 범위를 표 4에 명시된 ASO들로 한정하기 위함이 아니다.
인간 SCN9A 프리-mRNA에서 엑손 4 및 인트론 4의 연결 부위에 걸쳐 있는 5' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 PNA 유도체들과 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터.
PNA 예 PNA 서열 (N→C) 정확한 질량, m/z
Theor.a Obs.b
SCN-
ASO 1		 Fmoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH2 4640.19 4640.88
SCN-ASO 2 FAM-HEX-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH2 4887.24 4887.40
SCN-ASO 3 Fethoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH2 4652.20 4652.24
SCN-ASO 4 Fethoc-TG(6)T-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-
A(5)A-NH2 		5574.61 5574.57
SCN-ASO 5 Fethoc-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(5)-ACA(5)-A-NH2 4261.98 4262.00
SCN-ASO 6 Fethoc-TA(6)C-GC(1O2)A-A(6)AA(6)-ACA(6)-A-NH2 4318.05 4318.17
SCN-ASO 7 Fethoc-AC(1O2)T-TA(5)C-G(6)CA-A(5)AA(5)-AC(1O2)A-
A(5)-NH2 		5250.53 5250.46
SCN-ASO 8 Fmoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)AC-
A(5)A-NH2 		5539.61 5539.57
SCN-ASO 9 Piv-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH2 4500.17 4499.80
SCN-ASO 10 FAM-HEX-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH2 3970.82 3974.17
SCN-ASO 11 Fmoc-TA(6)A-A(5)TA(6)-CGC(1O2)-AA(6)A-AA(6)C-
A(6)-NH2 		5334.57 5335.59
SCN-ASO 12 Fethoc-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)AA(5)-AA(5)A-
C(1O2)AA(5)-NH2 		4975.34 4975.34
SCN-ASO 13 H-CTT-A(5)CG(3)- C(1O2)AA(5)-AA(5)A-C(1O3)AA(5)-NH2 4711.22 4711.25
SCN-ASO 14 Benzoyl-CTT-A(5)CG(2O2)-C(1O2)AA(5)-AA(5)A-
C(1O5)AA(5)-NH2 		4873.30 4873.32
SCN-ASO 15 n-Propyl-CTT-A(5)CG(2O3)-C(1O2)AA(3)-AA(5)A-
C(2O2)AA(5)-NH2 		4769.27 4769.30
SCN-ASO 16 p-Toluenesulfonyl-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)AA(8)-
AA(5)A-C(1O2)AA(5)-NH2 		4935.32 4935.29
SCN-ASO 17 [N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-CTT-A(5)CG(6)-
C(1O2)AA(2O2)-AA(5)A-C(1O2)A A(5)-NH2 		4888.31 4888.32
SCN-ASO 18 Fethoc-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)TA(5)-AA(5)T-
C(1O2)AA(5)-NH2 		4957.32 4957.32
SCN-ASO 19 Fethoc-Lys-Leu-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)AA(4)-AA(5)A-
C(1O2)AA(5)-Lys-NH2 		5330.60 5330.60
SCN-ASO 20 N-Phenyl-N-Me-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)AA(5)-AA(5)A-
C(1O2)AA(5)-Lys-NH2 		4957.40 4957.42
a) 이론상 정확한 질량, b) 관측된 정확한 질량
표 5는 인간 SCN9A 프리-mRNA에서 인트론 3 및 엑손 4의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 PNA 유도체들을 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터와 함께 제공한다. 표 5에서 SCN9A ASO들을 제공하는 것은 화학식 I의 PNA 유도체를 예시하기 위함이며 본 발명의 범위를 표 5에 명시된 SCN9A ASO들로 한정하기 위함이 아니다.
인간 SCN9A 프리-mRNA에서 인트론 3 및 엑손 4의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 PNA 유도체들과 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터.
PNA 예 PNA 서열 (N→C) 정확한 질량, m/z
Theor.a Obs.b
SCN-
ASO 21		 Fethoc-TA(5)A-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2 5398.60 5398.58
SCN-ASO 22 Fethoc-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2 4282.97 4283.00
SCN-ASO 23 Fethoc-AA(5)G-TG(6)T-AC(1O2)C-TAA(5)-A-NH2 4182.87 4182.89
SCN-ASO 24 Fethoc-A(5)AG-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA-A(5)-NH2 4282.97 4283.00
SCN-ASO 25 Fethoc-AAG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A-NH2 4281.98 4282.05
SCN-ASO 26 Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2 4369.06 4369.08
SCN-ASO 27 Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2 4620.16 4620.14
SCN-ASO 28 Fethoc-A(5)GT-G(5)TA(5)-CC(1O2)T-A(5)AA(5)-C-NH2 4345.56 4345.08
SCN-ASO 29 Fethoc-AA(6)G-TG(5)T-A(6)CC(1O2)-TA(6)A-A(6)C-NH2 4676.22 4676.25
SCN-ASO 30 Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH2 4660.16 4660.15
SCN-ASO 31 Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)CA-NH2 4895.27 4895.20
SCN-ASO 32 Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)GG-NH2 4951.27 4951.26
SCN-ASO 33 Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-ACC(1O2)-TA(5)A-A(5)CA(5)-C-NH2 5146.37 5146.35
a) 이론상 정확한 질량, b) 관측된 정확한 질량
표 6은 인간 혹은 쥐 (rat) SCN9A 프리-mRNA에서 특정한 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 PNA 유도체들을 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터와 함께 제공한다. 표 6에서 SCN9A ASO들을 제공하는 것은 화학식 I의 PNA 유도체를 예시하기 위함이며 본 발명의 범위를 표 6에 명시된 SCN9A ASO들로 한정하기 위함이 아니다.
인간 SCN9A 프리-mRNA에서 특정한 스플라이스 위치를 (SS) 상보적으로 표적하는 PNA 유도체들과 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터.
PNA 예 종 표적
위치a 		PNA 서열 (N → C) 정확한 질량, m/z
theor.b obs.c
SCN-
ASO 34		 인간 엑손 2의 5' SS Fethoc-GA(5)T-A(5)TG-A(5)GT-G(6)TA(5)-C(1O2)TA(5)-A-NH2 5346.49 5346.46
SCN-
ASO 35		 쥐 엑손 2의 5' SS Fethoc-GA(5)T-A(5)TG-A(5)GT-G(6)CA(5)-C(1O2)TA(5)-A-NH2 5331.49 5331.52
SCN-
ASO 36		 인간
& 쥐		 엑손 7의 5' SS Fethoc-A(5)TA(5)-CC(1O2)C-TG(6)A-A(5)TC-TG(6)T-NH2 4866.26 4866.29
SCN-ASO 37 인간
& 쥐		 엑손 15의 3' SS Fethoc-AA(5)G-A(5)C(12)T-CG(6)G-A(5)GC(1O2)-TA(5)-NH2 4772.23 4772.21
a) SS 스플라이스 위치; b) 이론상 정확한 질량; c) 관측된 정확한 질량
"SCN-ASO 34"는 인간 SCN9A 프리-mRNA에서 엑손 2 및 인트론 2의 연결 부위에 걸쳐 있는 5' 스플라이스 위치에 완전히 상보적인 16-머 ASO이다. "SCN-ASO 34"는 [(5' → 3') GAUU UUAGUACACUC┃auauc cuuuu]의 25-머 인간 SCN9A 프리-mRNA에서 "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분에, 엑손 2에 11-머 그리고 인트론 2에 5-머의 상보적 오버랩을 한다.
"SCN-ASO 35"는 쥐 (rat) SCN9A 프리-mRNA에서 엑손 2 및 인트론 2의 연결 부위에 걸쳐 있는 5' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 16-머 ASO이다. "SCN-ASO 35"는 쥐 게놈의 DNA에서 [정보 위치는 NCBI 참고 서열: NC_005102.3] 유래된 [(5' → 3') GAUC UUAGUGCACUC┃auauc cuuuc]의 25-머 쥐 SCN9A 프리-mRNA에서 "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분에, 엑손 2에 11-머 그리고 인트론 2에 5-머의 상보적 오버랩을 한다. "SCN-ASO 35"는 [(5' → 3') GAUU UUAGU "A" CACUC┃auauc cuuuu]의 25-머 인간 SCN9A 프리-mRNA에서 인용 부호로 ("") 표시한 부분에 한 개의 부정합이 있다.
"SCN-ASO 36"은 인간 SCN9A 프리-mRNA에서 엑손 7 및 인트론 7의 연결 부위에 걸쳐 있는 5' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 15-머 ASO이다. "SCN-ASO 36"은 [(5' → 3') CAGC ACAGAUUCAGG┃guau guaaua]의 25-머 인간 SCN9A 프리-mRNA에서 "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분에, 엑손 7에 11-머 그리고 인트론 7에 4-머의 상보적 오버랩을 한다. "SCN-ASO 43"의 표적 서열은 쥐 SCN9A 프리-mRNA에서 보존되어 있다.
"SCN-ASO 37"은 인간 SCN9A 프리-mRNA에서 인트론 14 및 엑손 15의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 14-머 ASO이다. "SCN-ASO 37"은 [(5' → 3') uugcuuu uag┃CUCCGAGUCUU CAAG]의 25-머 인간 SCN9A 프리-mRNA에서 "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분에, 인트론 14에 3-머 그리고 엑손 15에 11-머의 상보적 오버랩을 한다. ASO의 표적 서열은 쥐 SCN9A 프리-mRNA에서 보존되어 있으며, [(5' → 3') uuauuuc uag┃CUCCGAGUCUU CAAG]의 25-머 쥐 SCN9A 프리-mRNA에서 "진하게" "밑줄그어" 표시된다.
표 7은 쥐 게놈 DNA에서 [정보 위치는 NCBI 참고 서열: NC_000086.7] 유래된 쥐 (mouse) 디스트로핀 (dystrophin) 프리-mRNA에서 엑손 23 의 3' 혹은 5' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 PNA 유도체들을 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터와 함께 제공한다. 표 7에서 디스트로핀 ASO들을 제공하는 것은 화학식 I의 PNA 유도체를 예시하기 위함이며 본 발명의 범위를 표 7에 명시된 디스트로핀 ASO들로 한정하기 위함이 아니다.
쥐 디스트로핀 프리-mRNA에서 엑손 23 의 3' 혹은 5' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 PNA 유도체들과 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터.
PNA 예 표적
위치a 		PNA 서열 (N → C) 정확한 질량, m/z
theor.b obs.c
DMD-
ASO 1		 3' SS Fethoc-A(5)GA-G(6)CC(1O2)-TCA-A(5)AA(5)-T-NH2 4267.97 4267.97
DMD-ASO 2 3' SS Fethoc-TTG(6)-CA(5)G-AG(6)C-C(1O2)TC-
AA(5)A-A(5)T-NH2 		5441.49 5441.54
DMD-ASO 3 3' SS Fethoc-TTG(6)-CA(6)G-AG(6)C-C(12)TC-
AA(6)A-A(6)T-NH2 		5483.54 5483.55
DMD-ASO 4 3' SS Fethoc-A(6)CT-TTG(6)-CA(6)G-A(6)GC(1O2)-CTC(1O2)-AA(6)-NH2 5571.59 5571.59
DMD-ASO 5 3' SS Fethoc-TG(6)C-A(5)GA-G(6)CC(1O2)-TCA(5)-A-NH2 4258.96 4258.98
DMD-ASO 6 5' SS Fethoc-C(12)TC-GG(6)C-TTA(6)-CC(1O2)T-
GA(6)A-A(6)TT-NH2 		5672.52 5672.51
DMD-ASO 7 5' SS Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC(1O2)-TG(6)A-
AA(5)T-TT-NH2 		4488.00 4488.00
a) SS 스플라이스 위치; b) 이론상 정확한 질량; c) 관측된 정확한 질량
표 8은 인간 혹은 쥐 (mouse) 2,3-다이옥시게나제 (IDO1) 프리-mRNA에서 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 PNA 유도체들을 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터와 함께 제공한다. 인간 혹은 쥐 IDO1 프리-mRNA는 각각 인간 게놈 DNA [정보 위치는 NCBI 참고 서열: NC_000008.11] 와 쥐 게놈 DNA [정보 위치는 NCBI 참고 서열: NC_000074]에서 유래되었다. 표 8에서 IDO1 ASO들을 제공하는 것은 화학식 I의 PNA 유도체를 예시하기 위함이며 본 발명의 범위를 표 8에 명시된 IDO1 ASO들로 한정하기 위함이 아니다.
인간 혹은 쥐 IDO1 프리-mRNA에서 특정한 스플라이스 위치를 (SS) 상보적으로 표적하는 PNA 유도체들과 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터.
PNA 예 종 표적
위치a 		PNA 서열 (N → C) 정확한 질량, m/z
theor.b obs.c
IDO-
ASO 1		 인간 엑손 7의 3' SS Fethoc-GG(6)A-A(5)TT-
A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2 		4282.97 4283.00
IDO-ASO 2 인간 엑손 7의 3' SS Fethoc-AA(5)T-TA(5)C-CTA(5)-
AA(5)A-C(1O2)A-NH2 		4503.08 4503.09
IDO-ASO 3 쥐 엑손 7의 3' SS Fethoc-GG(5)G-A(5)TT-
G(5)CC(1O2)-TTT-A(5)AA(5)-NH2 		4918.24 4918.26
IDO-ASO 4 쥐 엑손 7의 3' SS Fethoc-GG(5)G-A(5)TT-
G(5)CC(1O2)-TTT-A(5)-NH2 		4267.91 4267.93
IDO-ASO 5 인간 엑손 3의 5' SS Fethoc-CA(5)A-A(5)CC(1O2)-
TTA(5)-CGG(6)-A-NH2 		4243.96 4243.98
IDO-ASO 6 인간 엑손 4의 3' SS Fethoc-GG(6)C-AA(5)G-
A(5)CC(1O2)-TGA(5)-T-NH2 		4299.96 4299.97
a) SS 스플라이스 위치; b) 이론상 정확한 질량; c) 관측된 정확한 질량
표 9는 인간 SNAP25 게놈 DNA [NCBI 참고 서열: NG_029626.1]에서 유래한 인간 SNAP25 프리-mRNA에서 "엑손 7"의 3' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 PNA 유도체들을 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터와 함께 제공한다. 표 9에서 SNAP25 ASO들을 제공하는 것은 화학식 I의 PNA 유도체를 예시하기 위함이며 본 발명의 범위를 표 9에 명시된 SNAP25 ASO들로 한정하기 위함이 아니다.
인간 SNAP25 프리-mRNA에서 인트론 6 및 엑손 7의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 PNA 유도체들과 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터.
PNA 예 PNA 서열 (N→C) 정확한 질량, m/z
Theor.a Obs.b
SNAP-ASO 1 Fethoc-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH2 5188.36 5188.38
SNAP-ASO 2 Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(5)-NH2 4266.93 4266.95
SNAP-ASO 3 Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(5)T-NH2 4533.03 4533.04
SNAP-ASO 4 Fethoc-TG(5)G-TA(5)C-C(1O2)CT-TG(5)G-A(5)T-NH2 4519.01 4518.95
SNAP-ASO 5 Fethoc-TG(6)T-TA(3)C-CC(1O5)T-GG(6)G-A(3)T-NH2 4533.03 4533.04
SNAP-ASO 6 Fethoc-G(5)TT-A(5)CC(1O2)-CTG-G(5)GA(5)-TC(1O2)-NH2 4601.07 4601.08
SNAP-ASO 7 Fethoc-C(1O2)AT-TTG(6)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(6)-NH2 4478.98 4478.99
SNAP-ASO 8 Fethoc-CA(6)T-TTG(5)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(5)-NH2 4468.02 4468.04
SNAP-ASO 9 Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(5)C-C(1O2)CT-G(5)-NH2 4216.91 4216.93
SNAP-ASO 10 Fethoc-CA(6)T-CA(6)T-TTG(5)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(5)-NH2 5374.45 5374.44
SNAP-ASO 11 Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(5)-NH2 5188.36 5188.35
SNAP-ASO 12 Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-G(5)G-NH2 4522.04 4522.05
a) 이론상 정확한 질량, b) 관측된 정확한 질량
표 10은 인간 TYR 유전자에서 [정보 위치는 NCBI 참고 서열: NG_0008748] 유래한 인간 티로시나제 (TYR) 프리-mRNA 또는 쥐 (mouse) 게놈 DNA에서 [정보 위치는 NCBI 참고 서열: NC_000073] 유래한 쥐 TYR 프리-mRNA 에서, 인트론 1과 엑손 2의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 PNA 유도체들을 제공한다. 표 10에서 TYR ASO들을 제공하는 것은 화학식 I의 PNA 유도체를 예시하기 위함이며 본 발명의 범위를 표 10에 명시된 TYR ASO들로 한정하기 위함이 아니다.
인간 또는 쥐 TYR 프리-mRNA에서 인트론 1 및 엑손 2의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 PNA 유도체들과 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터.
PNA 예 종 PNA 서열 (N → C) 정확한 질량, m/z
theor.a obs.b
TYR-
ASO 1		 인간 Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-
A(5)-NH2 		4258.96 4260.99
TYR-ASO 2 인간 Fethoc-AC(12)A-GA(5)C-AA(5)T-CTG(6)
-TA(5)C(1O2)-AA(5)-NH2 		5532.55 5532.54
TYR-ASO 3 인간 Fethoc-AC(1O2)A(5)-GA(5)C-AA(5)T-
CTG(6)-C(1O2)C-NH2 		4592.11 4592.11
TYR-ASO 4 쥐 Fethoc-CA(5)A-A(5)TG-A(5)TC(1O2)-
TG(6)T-G-NH2 		4289.95 4289.96
a) 이론상 정확한 질량, b) 관측된 정확한 질량
표 11은 인간 PDCD1 유전자에서 [NCBI 참고 서열: NG_012110] 유래한 인간 PD-1 프리-mRNA 또는 쥐 (mouse) 게놈 DNA에서 [정보 위치는 NCBI 참고 서열: NC_000067] 유래한 쥐 PD-1 프리-mRNA 에서, 엑손 2의 3' 또는 5' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 PNA 유도체들을 제공한다. 표 11에서 PD-1 ASO들을 제공하는 것은 화학식 I의 PNA 유도체를 예시하기 위함이며 본 발명의 범위를 표 11에 명시된 PD-1 ASO들로 한정하기 위함이 아니다.
인간 또는 쥐 PD-1 프리-mRNA에서 엑손 2의 3' 또는 5' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 PNA 유도체들과 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터.
PNA 예 종 PNA 서열 (N → C) 정확한 질량, m/z
theor.a obs.b
PD-
ASO 1		 인간 Fethoc-C(1O2)TG(6)-GG(6)G-AG(6)T-CTG-
A(5)G-NH2 		4636.07 4636.08
PD-ASO 2 쥐 Fethoc-CC(1O2)T-CA(5)C-CTG(5)-TTA(5)-
C(1O2)CA(5)-C-NH2 		5022.27 5022.27
PD-ASO 3 인간 Fethoc-CG(6)C-A(5)CC-TG(6)T-CA(5)C-
C(1O2)C-NH2 		4422.03 4422.05
a) SS 스플라이스 위치; b) 이론상 정확한 질량; c) 관측된 정확한 질량
상보적인 RNA나 DNA에 대한 모델 PNA 유도체의 결합력 (Binding Affinity)
화학식 I의 PNA 화합물의 DNA 및 RNA에 대한 강한 결합력을 예시하기 위하여 모델 화합물로 변형된 핵산 염기를 갖는 10-머 PNA 유도체를 합성하였다. 이러한 모델 화합물들은 본 발명에서 제공한 합성 방법 혹은 약간의 변형을 통해 합성하였다. 10-머 PNA 유도체들과 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터를가 표 12에 제공된다.
화학식 I의 PNA 화합물의 DNA 및 RNA에 대한 강한 결합력을 예시하기 위한 모델 화합물인 10-머 PNA 유도체.
PNA 예 PNA 서열 (N → C) 정확한 질량, m/z
theor.a obs.b
PNA 10-1 Fmoc-GTA-GAT-CAC-T-NH2 2948.14 2949.05
PNA 10-2 Fmoc-GTA-GA(5)T-CAC-T-NH2 3048.24 3050.41
PNA 10-3 Fmoc-GTA(5)-GAT-CA(5)C-T-NH2 3148.34 3150.65
PNA 10-4 Fmoc-GTA(5)-GA(5)T-CA(5)C-T-NH2 3248.44 3250.81
PNA 10-5 Fmoc-GTA-G(5)AT-CAC-T-NH2 3032.25 3035.01
PNA 10-6 Fmoc-GTA-GAT-C(1O2)AC-T-NH2 3044.21 3047.02
PNA 10-7 Fmoc-GTA(5)-GA(5)T-C(1O2)AC-T-NH2 3245.39 3248.10
a) 이론상 정확한 질량, b) 관측된 정확한 질량
상보적인 10-머 RNA나 DNA에 대한 표 12에에 명시된 10-머 PNA 올리고머들의 결합력을, 다음과 같이 Tm 값을 측정함으로서 평가하였다.
15 mL 폴리프로필렌 팔콘 튜브 (falcon tube)에서 4 μM 10-머 PNA 올리고머와 4 μM의 상보적인 10-머 DNA 또는 RNA를 4 mL 수성 완충 용액 (pH 7.16, 10mM 소듐 포스페이트, 100mM NaCl)에 섞은 후, 90oC에서 일분간 인큐베이션하고 상온으로 서서히 냉각시켰다. 이 용액을 4 mL 석영 UV 큐벳 (Quartz UV Cuvette)에 옮기고 잘 봉인한 후 UV/가시광선 분광 광도계에 장착하고, 종래 기술 [PCT/KR 2009/001256]에 기재된 바와 같이 혹은 이를 약간 변형하여 260 nm에서 Tm을 측정하였다. Tm 측정에 사용된 10-머 DNA 또는 RNA는 (주)바이오니아 (www.bioneer.com, 대한민국 대전직할시)로부터 구매하여 별도의 정제 없이 사용되었다.
상보적인 10-머 RNA나 DNA와 모델 PNA 올리고머들 사이에 측정된 Tm 값이 (수정되지 않음) 표 13에 제공된다. 변형된 핵산 염기가 없는 참고용 PNA 올리고머 "PNA 10-1"은 상보적인 DNA나 RNA에 대해 각각 51 및 55 oC의 Tm 값을 나타내었다. 변형된 핵산 염기를 갖는 모델 PNA 올리고머는 변형된 핵산 염기가 많을수록 더 높은 Tm 값을 나타내었다. "PNA 10-7"은 상보적인 DNA나 RNA에 대해 같이 69oC의 Tm 값을 나타내었는 데, 이는 모델 PNA 올리고머가 상보적인 DNA나 RNA에 대해 비슷한 결합력을 갖는다는 것을 의미한다.
10-머 PNA와 상보적인 DNA나 RNA 사이의 Tm 값.
PNA 상보적인 DNA 혹은 RNA Tm, oC ΔTm a, oC
PNA 10-1 DNA (5' → 3') AGT-GAT-CTA-C 51 -
PNA 10-2 55 + 4
PNA 10-3 61 + 10
PNA 10-4 66 + 15
PNA 10-5 53 + 2
PNA 10-6 59 + 8
PNA 10-7 69 + 18
PNA 10-1 RNA (5' → 3') AGU-GAU-CUA-C 55 -
PNA 10-4 66 + 11
PNA 10-7 69 + 18
a) Tm 값-"PNA 10-1"의 Tm 값
상보적인 10-머 DNA에 대한 PNA 유도체의 결합력 (Binding Affinity)
화학식 I의 PNA 유도체들의 N-말단이나 C-말단을 상보적으로 표적하는 10-머 DNA들과의 결합력을 평가하였다. 결합력은 PNA와 상보적인 10-머 DNA 이중나선의 (duplex) Tm 값으로 평가하였다. PNA 유도체와 전체 길이에 완전히 상보적인 DNA 이중나선의 Tm 값은 너무 높아서 측정하기 어려운데, 이는 완충용액이 Tm 측정 중에 끓을 수 있기 때문이다.
화학식 I의 PNA 유도체들의 상보적인 10-머 DNA에 대한 관찰된 Tm 값들은 매우 높게 나타났는 데, 그 결과들은 표 14에 제공된다. 예를 들면, "AR-ASO 1"은 [(N → C) Fethoc- C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2) AA(5)- G-NH2]에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 바와 같이 PNA 중의 N-말단 10-머를 표적하는 10-머 상보성 DNA와의 듀플렉스에 대해서 86.1oC의 Tm 값을 나타내었다. 반면에, " AR-ASO 1"은 [(N → C) Fethoc-C(1O2)TT- A(5)CC- A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G -NH2]에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 바와 같이 PNA 중의 C-말단 10-머를 표적하는 10-머 상보성 DNA와의 듀플렉스에 대해서 81.3oC의 Tm 값을 나타내었다.
PNA들과 N-말단이나 C-말단을 표적하는 상보적인 10-머 DNA들과의 Tm 값.
PNA Tm 값, oC
N-말단을 표적하는
10-머 DNA		 C-말단을 표적하는
10-머 DNA
AR-ASO 1 86.1 81.3
AR-ASO 4 84.3 84.5
AR-ASO 5 84.4 78.4
HIF-ASO 1 66.0 60.0
HIF-ASO 4 66.0 53.4
HIF-ASO 5 62.0 58.0
HIF-ASO 7 69.0 61.0
HIF-ASO 8 73.0 61.0
HIF-ASO 9 60.9 59.0
HIF-ASO 10 61.0 60,0
HIF-ASO 11 73.4 61.0
SCN-ASO 4 63.5 71.6
SCN-ASO 7 65.0 64.6
SCN-ASO 8 74.0 68.6
SCN-ASO 12 76.0 77.0
SCN-ASO 22 74.0 65.0
SCN-ASO 24 77.0 66.0
SCN-ASO 25 78.0 66.0
SCN-ASO 26 75.0 72.0
SCN-ASO 27 77.0 69.0
SCN-ASO 28 78.1 70.0
SCN-ASO 30 79.0 74.0
SNAP-ASO 2 76.0 87.6
SNAP-ASO 3 77.3 88.7
SNAP-ASO 8 58.0 68.0
SNAP-ASO 9 62.0 76.0
SNAP-ASO 10 61.0 68.0
SNAP-ASO 12 62.0 74.0
TYR-ASO 1 78.0 73.0
TYR-ASO 4 72.0 72.0
HIF-1α ASO들의 생체외 활성에 대한 예
인간 HIF-1α (저산소증 유도 인자 1α) 프리-mRNA에서 엑손 2나 엑손 4의 3' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 화학식 I의 PNA 유도체의 HIF-1α 안티센스 엑손 스키핑 활성을 헬라 세포에서 평가하였다. 표적 프리-mRNA 중 스플라이스 위치를 표적하는 화학식 I의 화합물이 엑손 스키핑을 강하게 유도한다는 것을 예시하기 위하여 HIF-1α ASO들의 생물학적 예들이 제공되며, 본 발명의 범위를 HIF-1α ASO들로 한정하기 위함이 아니다.
HIF-1α 실시예 1. " HIF-ASO 2"에 의해 유도된 엑손 스키핑.
표 1의 14-머 "HIF-ASO 2"는 인간 HIF-1α 프리-mRNA 중의 "엑손 2"의 3' 스플라이스 위치에 있는 [(5' 3') uguua aguag ┃ GAUAAGUUC U]의 20-머 프리-mRNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 서열과 완전한 상보성 결합을 하는 데, "┃"는 인트론-엑손 연결 부위를 나타낸다. "HIF-ASO 2"는 "인트론 1"과 5-머 결합을 하고 "엑손 2"와 9-머 결합을 한다.
헬라 세포에서 "HIF-ASO 2"가 인간 HIF-1α 프리-mRNA "엑손 2"의 스키핑을 유도하는 정도를 HIF-1α 중첩 (nested) RT-PCR을 이용하여 다음과 같이 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] 헬라 세포는 (Cat. Number CCL-2, ATCC) 60 mm 배양 접시에서 5 mL EMEM 배양액에 10% 소 혈청 (FBS, Fetal Bovine Serum), 1% 스트렙토마이신/페니실린, 1% L-글루타민, 그리고 1% 나트륨 피루베이트를 첨가하여 37oC, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 세포들에 대하여 "HIF-ASO 2"를 0 (음성 대조용), 10, 100, 또는 1,000 zM의 농도로 처리하였다. ASO는 2차 증류수로 (DDW) 적절한 농도로 희석하여 배양 접시에 나누었다.
[RNA 추출] 5 시간 후에, 전체 RNA를 "유니버셜 RNA 익스트랙션 키트 (Universal RNA Extraction Kit)" (Cat. Number 9767, 타카라(Takara))를 사용하여 그 제조사의 설명에 따라 추출하였다.
[원스텝 RT-PCR에 의한 cDNA 합성] 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [HIF-엑손 1_순방향: (5' 3') CTTGCCTTTCCTTCTCTTCT; 및 HIF-엑손 8_역방향: (5' 3') AACCCAGACATATCCACC]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 플래티늄 (platinum®) Taq 폴리머라제 (Cat. No. 10928-042, 인비트로젠 (Invitrogen))를 갖는 슈퍼스크립트(Super Script®) 원스텝(One-Step) RT-PCR 키트를 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50 ℃ 30분 및 94 ℃ 2분에 이어서, 15 주기의 94 ℃ 30초, 55 ℃ 30초 및 72 ℃ 1분.
[중첩 PCR 증폭] 1 μL의 cDNA를, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [HIF-엑손 1n_순방향: (5' 3') TGAAGACATCGCGGGGAC; 및 HIF-엑손 5n_역방향: (5' 3') TTTTTCACAAGGCCATTTCT]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 20μL 중첩 PCR 반응(Cat. No. K2612, 바이오니어)에서 증폭시켰다: 95℃ 5분에 이어서, 39 주기의 95 ℃ 30초, 50 ℃ 40초 및 72 ℃ 50초.
원스텝 RT-PCR 및 중첩 PCR 증폭을 위한 엑손 특이적인 프라이머 세트들은 도 17A에 도식화하여 요약된다.
["엑손 2 스키핑" 생성물의 확인] 크기 표시 혼합물을 (size marker cocktail) 이용하여 2% 아가로스 젤 상에서 상기 PCR 산물에 대해 전기영동 분리를 수행하였다. 타겟 크기의 밴드들을 수집하고 생거 (Sanger) 서열분석에 의해 분석하였다. 관찰된 PCR 밴드들은 도 17B에 표시된 바와 같이 전체 길이의 mRNA (즉, 엑손 스키핑이 없음) 및 "엑손 2"가 스키핑된 스플라이스 변형체와 일치했다. ASO를 처리한 세포에서 엑손 2의 스키핑이라고 해석할 만한 크기의 PCR 밴드가 강하게 나왔다. ASO를 처리하지 않은 음성 대조군에서도 "엑손 2"가 스키핑된 밴드가 나왔는 데, 즉 "엑손 2"는 어느 정도는 저절로 잘라져 나가는 것으로 보인다. 그러나, ASO를 처리한 세포에서 나타난 엑손 스키핑 밴드가 ASO를 처리하지 않은 세포에서 보다 훨씬 강하게 나타난 것을 보면 "HIF-ASO 2"가 헬라 세포에서 엑손 2의 스키핑을 촉진하였다. 액손 스키핑 밴드의 서열은 도 17C에 제공되었으며, 엑손 1과 엑손 3의 연결 부위에서의 mRNA 서열이 잘 나타나 있다.
[한 개의 ASO 분자에 영향을 받는 세포의 수] "HIF-ASO 2"는 심지어 10 zM에서도 엑손 2의 스키핑을 유도한다. 60 mm 배양 접시의 5 mL의 배양액에서 10 zM에는 (즉, 10-21M) 약 30개의 ASO가 있다. 약 30개의 ASO가 60 mm 배양 접시의 약 100,000개의 헬라 세포에서 엑손 스키핑을 유도한다는 것을 고려하면, 각 ASO 분자는 평균 약 3,000개의 헬라 세포에서 엑손 스키핑에 영향을 주거나 조절한다고 평가된다. 따라서 각 ASO 분자는 엑손 스키핑에서 주어진 역할을 하기 위해 많은 수의 세포들 사이를 오가는 것으로 생각된다.
HIF-1α 실시예 2. 헬라 세포에서 "HIF-ASO 2"에 의한 HIF-1α 단백질 발현의 억제.
헬라 세포에서 "HIF-ASO 2"가 HIF-1α 단백질 발현을 억제하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] 60 mm 배양 접시에서 5 mL EMEM 배양액에서 배양된 헬라 세포들에 대하여 "HIF-ASO 2"를 0 zM (음성 대조용), 10 zM, 100 zM, 1 aM, 또는 10 aM의 농도로 처리하였다.
[CoCl2 처리 및 세포 용해] ASO를 처리하고 24시간 후에, 프로필히드록실라제의 (propylhydroxylases, PHDs) 활성을 억제하여 HIF-1α 단백질의 양을 상향조절하기 위하여 음성 대조군 이외의 배양 접시를 200 μM CoCl2로 3시간 동안 처리하였다. 세포를 차가운 1 mL PBS로 2번 씻어준 후 얼음 위에서, 1% SDS와 1X 프로티나제 억제제 혼합제가 (cOmplete Mini, Roche) 첨가된 200 μM RIPA 완충용액으로 (Cat. Number 9806, Cell Signaling Tech) 용해하였다. 용해액을 1.5 mL 이튜브에 (e-tube) 모으고 100 μL 5X 샘플 완충 용액을 섞은 후 100oC에서 5분간 끓였다. 용해액을 8% SDS-PAGE 젤 상에서 전기영동 분리를 하고 0.45 μm PVDF 막으로 (membrane) 옮겼으며 그 막은 항-HIF-1α 항체와 (Cat. Number 610958, BD Biosciences) 항-β-액틴 항체를 (Cat. Number sc4778, Santa Cruz) 이용하여 탐색하였다.
[HIF-1α 단백질 발현의 억제] "HIF-ASO 2"를 처리한 헬라 세포에서 얻은 HIF-1α 웨스턴 블럿 데이터를 도 18A에 제공한다. CoCl2를 처리하지 않은 세포의 용해액에서 HIF-1α 밴드가 나타나지 않은 반면, CoCl2를 처리한 세포의 용해액에서는 HIF-1α 밴드가 강하게 나타났다. 덴시토미트리로 (densitometry) 측정한 각각의 β-액틴 밴드에 대해 정규화한 각각의 HIF-1α 밴드의 강도를 도 18B에 제공한다. "HIF-ASO 2"의 농도가 증가할수록 HIF-1α의 발현은 점차 감소하는 데, "HIF-ASO 2"의 농도를 10 aM까지 올렸을 때 약 75%가 감소하였다.
HIF-1α 실시예 3. "HIF-ASO 2"로 처리한 헬라 세포에서 사이버 그린을 이용한 HIF-1α mRNA의 qPCR 평가.
헬라 세포에서 "HIF-ASO 2"가 전체 길이의 HIF-1α mRNA의 발현을 억제하는 정도를 중첩 qPCR을 이용하여 다음과 같이 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] 60 mm 배양 접시에서 5 mL EMEM 배양액에서 배양된 헬라 세포들에 대하여 "HIF-ASO 2"를 0 zM (음성 대조용), 10 zM, 100 zM, 또는 1,000 zM의 농도로 처리하였다 (각 ASO 농도당 2개의 배양 접시).
[RNA 추출] ASO를 처리한 3 시간 후에, 전체 RNA를 "MiniBEST 유니버셜 RNA 익스트랙션 키트 (Cat. Number 9767, 타카라(Takara))를 사용하여 그 제조사의 설명에 따라 추출하였다.
[원스텝 RT-PCR에 의한 cDNA 합성] 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [HIF-엑손 1_순방향: (5' 3') CTTGCCTTTCCTTCTCTTCT; 및 HIF-엑손 8_역방향: (5' 3') AACCCAGACATATCCACC]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 플래티늄 (platinum®) Taq 폴리머라제 (Cat. No. 10928-042, 인비트로젠 (Invitrogen))를 갖는 슈퍼스크립트(Super Script®) 원스텝(One-Step) RT-PCR 키트를 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50 ℃ 30분 및 94 ℃ 2분에 이어서, 15 주기의 94 ℃ 30초, 55 ℃ 30초 및 72 ℃ 1분.
[중첩 qPCR] 100배 희석한 1 μL의 cDNA를, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [HIF-엑손 2n_순방향: (5' 3') CTTGCTCATCAGTTGCCACTTC; HIF-엑손 2n_역방향: (5' 3') AAGTTTCCTCACACGCAAATAG; HIF-엑손 3n_순방향: (5' 3') GAAAGCACAGATGAATTGC; HIF-엑손 3n_역방향: (5' 3') TCATGTCACC- ATCATCTGT; HIF-엑손 4n_순방향: (5' 3') CTAACTGGACACAGTGTGTTTG; 및 HIF-엑손 4n_역방향: (5' 3') TCTGTGTGTAAGCATTTCTCTC; HIF-엑손 5n_순방향: (5' 3') GCC-TTGTGAAAAAGGGTAAAG; 및 HIF-엑손 5n_역방향: (5' 3') CCATGTTGCAGACTTTATGT]의 엑손 특이성 프라이머 세트에 대해 20 μL 실시간 PCR 반응을 실시하였다. PCR 반응은 사이버 그린으로 (SYBR Green, 타카라, 일본) 탐색하였고 주기 조건은 다음과 같다: 95℃ 3분에 이어서, 40 주기의 95 ℃ 5초, 60 ℃ 30초.
[HIF-1α mRNA 엑손의 양 변화] ASO를 처리한 각 세포들의 엑손의 양은 ASO를 처리하지 않은 각 세포의 엑손의 양에 대해 정규화 하였다. 각 엑손에 대한 상대적인 양이 도 18C에 제공된다. "HIF-ASO 2"를 10 zM과 100 zM을 처리한 세포들에서 모든 엑손의 양이 각각 60~80%와 50~70%만큼 현저하게 감소하였다. 그러나 "HIF-ASO 2"를 1,000 zM (즉 1 aM)을 처리한 세포들에서의 엑손의 양은 ASO를 처리하지 않은 세포들과 비슷했다. ASO의 농도를 1,000 zM로 올렸을 때 엑손의 양이 음성 대조군의 양으로 돌아가는 이유는 앞으로 밝혀져야 한다. 그렇지만, 도 18C의 역전된 용량 반응 패턴은 "HIF-1α 실시예 1" 도 17A의 역전된 용량 반응 패턴과 비슷하다.
HIF -1α 실시예 4. "HIF-ASO 2"로 처리한 헬라 세포에서 택만 탐색을 이용한 HIF-1α mRNA의 qPCR 평가.
별다른 언급이 없으면 "HIF-1α 실시예 3"과 같은 방법으로, 헬라 세포에서 "HIF-ASO 2"가 전체 길이의 HIF-1α mRNA의 발현을 억제하는 정도를 중첩 qPCR을 이용하여 평가하였다.
[원스텝 RT-PCR에 의한 cDNA 합성] 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [HIF-엑손 1_순방향 (2): (5' 3') CGCGAACGACAAGAAAAA; 및 HIF-엑손 8_역방향 (2): (5' 3') CTGTGGTGACTTGTCCTTT]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 플래티늄 Taq 폴리머라제 (Cat. No. 10928-042, 인비트로젠)를 갖는 슈퍼스크립트 원스텝 RT-PCR 키트를 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50 ℃ 30분 및 94 ℃ 2분에 이어서, 20 주기의 94 ℃ 30초, 51 ℃ 40초 및 72 ℃ 50초.
[중첩 qPCR] 100배 희석한 1 μL의 cDNA로 인간 HIF-1α "엑손 1"과 "엑손 2"의 연결 부위를 감지하도록 고안된 택만 탐색을 (TaqMan probe, Hs00936371_m1, Thermo Fisher) 이용한 20 μL 실시간 PCR 반응을 하였고 주기 조건은 다음과 같다: 95℃ 3분에 이어서, 40 주기의 95 ℃ 10초, 60 ℃ 30초.
[전체 길이 HIF-1α mRNA의 양 변화] ASO를 처리한 세포들의 전체 길이 HIF-1α mRNA의 양은 ASO를 처리하지 않은 세포의 mRNA의 양에 대해 정규화 하였다. 관찰된 상대적인 mRNA의 양이 도 18D에 제공된다. "HIF-ASO 2" 100 zM과 1,000 zM을 처리한 세포들에서 전체 길이 HIF-1α mRNA의 양이 유의성 (독립표본 T 검정) 있게 각각 65%와 55%만큼 감소하였다. 그러나 "HIF-ASO 2" 10 zM을 처리한 세포들에서의 전체 길이 HIF-1α mRNA의 양은 변화가 없었다.
HIF-1α 실시예 5. "ASO 6"에 의해 유도된 엑손 스키핑.
표 1의 17-머 " HIF-ASO 6"은 인간 HIF-1α 프리-mRNA 중의 인트론 1 및 "엑손 2"의 3' 스플라이스 위치에 있는 [(5' 3') ugu uaaguag ┃ GAUAAGUUCU ]의 20-머 프리-mRNA에 대해 "진하게" "밑줄그어" 표시한 서열과 완전한 상보성 결합을 한다. " HIF-ASO 6"은 "인트론 1"과 7-머 상보성 결합을 하고 "엑손 2"와 10-머 상보성 결합을 한다.
별도의 언급이 없으면 "HIF-1α 실시예 1"과 같은 방법으로, 헬라 세포에서 “HIF-ASO 6”이 인간 HIF-1α mRNA "엑손 2"의 스키핑을 유도하는 정도를 중첩 PCR을 이용하여 다음과 같이 평가하였다.
2% 아가로스 젤 상에서 PCR 산물에 대해 전기영동 분리를 수행하였고 그 결과는 도 19A에 제공된다. "엑손 2"의 스키핑은 "HIF-ASO 6"의 모든 투여농도에서 확실하며, "HIF-ASO 6"가 "HIF-ASO 2"보다 더 효과적으로 유도한다. 전체 길이 HIF-1α mRNA의 PCR 밴드는 "HIF-ASO 6"의 모든 투여농도에서 거의 완전히 사라진 반면에, "HIF-ASO 2"를 10 내지 1,000 zM 투여한 세포의 RNA 추출물에서는 상당한 양의 전체 길이 HIF-1α mRNA가 남아 있었다 [도 17A].
"HIF-ASO 6"는 엑손 2의 3' 스플라이스 위치에 대해 "HIF-ASO 2"보다 더 많은 상보성 결합을 하기 때문에 "HIF-ASO 6"가 엑손 스키핑 효율이 더 높을 수 있다. 표적 스플라이스 위치에 대한 ASO의 결합이 더 강하면 표적 엑손의 스키핑을 더 효과적으로 유도하는 것으로 보인다.
HIF-1α 실시예 6. " HIF-ASO 6"으로 처리한 헬라 세포에서 HIF-1α 단백질 발현의 억제.
별다른 언급이 없으면 "HIF-1α 실시예 2"와 같은 방법으로, 헬라 세포에서 "HIF-ASO 6"이 HIF-1α 단백질 발현을 억제하는 정도를 평가하였다.
0 zM (음성 대조용), 10, 100, 또는 1,000 zM 농도의 "HIF-ASO 6"을 24시간 처리한 헬라 세포로부터 얻은 웨스턴 블럿 데이터를 도 19B에 제공한다. 덴시토미트리로 측정한 각각의 β-액틴 밴드에 대해 정규화한 각각의 HIF-1α 밴드의 강도를 도 19C에 제공한다. HIF-1α 단백질의 발현은 "HIF-ASO 6"의 투여 농도에 따라 약 45~55%가 감소하였다.
HIF-1α 실시예 7. " HIF-ASO 6"으로 처리한 헬라 세포에서 사이버 그린을 이용한 HIF-1α mRNA의 qPCR 평가.
별다른 언급이 없으면 "HIF-1α 실시예 4"과 같은 방법으로, 헬라 세포에서 "HIF-ASO 6"이 HIF-1α mRNA의 발현을 변화시키는 정도를 중첩 qPCR을 이용하여 다음과 같이 평가하였다.
[원스텝 RT-PCR에 의한 cDNA 합성] 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [HIF-엑손 1_순방향 (2): (5' 3') CGCGAACGACAAGAAAAA; 및 HIF-엑손 8_역방향 (2): (5' 3') CTGTGGTGACTTGTCCTTT]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 플래티늄 Taq 폴리머라제 (Cat. No. 10928-042, 인비트로젠)를 갖는 슈퍼스크립트 원스텝 RT-PCR 키트를 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50oC 30분 및 94oC 2분에 이어서, 15 주기의 94oC 30초, 51oC 40초 및 72oC 50초.
[HIF-1α mRNA 엑손의 양 변화] ASO를 처리하지 않은 각 세포의 엑손의 양에 대해 정규화한 ASO를 처리한 각 세포들의 엑손의 양은 도 20A에 제공된다. "HIF-ASO 6"을 10, 100, 그리고 1,000 zM을 처리한 세포들에서 엑손의 양이 유의성 (독립표본 T 검정) 있게 각각 35%, 약 30%, 그리고 약 45%만큼 감소하였다.
HIF-1α 실시예 8. " HIF-ASO 6"으로 처리한 헬라 세포에서 택만 탐색을 이용한 HIF-1α mRNA의 qPCR 평가.
별다른 언급이 없으면 "HIF-1α 실시예 4"와 같은 방법으로, 헬라 세포에서 "HIF-ASO 6"이 전체 길이의 HIF-1α mRNA의 발현을 억제하는 정도를 중첩 qPCR을 이용하여 평가하였다.
[전체 길이 HIF-1α mRNA의 양 변화] ASO를 처리한 세포들의 전체 길이 HIF-1α mRNA의 양은 ASO를 처리하지 않은 세포의 mRNA의 양에 대해 정규화 하였다. 관찰된 상대적인 mRNA의 양이 도 20B에 제공된다. "HIF-ASO 6" 100 zM과 1,000 zM (1 aM)을 처리한 세포들에서 전체 길이 HIF-1α mRNA의 양이 유의성 (독립표본 T 검정) 있게 각각 약 60%와 80%만큼 감소하였다. 그러나 "(독립표본 T 검정) HIF-ASO 6" 10 zM을 처리한 세포들에서의 전체 길이 HIF-1α mRNA의 양은 변화가 없었다.
HIF-1α 실시예 9. " HIF-ASO 1"에 의해 유도된 엑손 스키핑.
14-머 "HIF-ASO 1"은 인간 HIF-1α 프리-mRNA 중의 인트론 1과 엑손 2의 연결 부위에 걸친 3' 스플라이스 위치에 있는 [(5' 3') uguuaag uag ┃ GAUAAGUUCUG AA]의 23-머 프리-mRNA 서열에 대해 "진하게" "밑줄그어" 표시한 서열과 완전한 상보성 결합을 한다. "HIF-ASO 1"은 "인트론 1"과 3-머 결합을 하고 "엑손 2"와 11-머 결합을 한다.
별다른 언급이 없으면 "HIF-1α 실시예 1"과 같은 방법으로, "HIF-ASO 1"가 HIF-1α mRNA에서 엑손 스키핑을 유도하는 정도를 평가하였다. 헬라 세포에 대하여 "HIF-ASO 1"을 0 (음성 대조용), 1, 3, 10, 30, 또는 100 aM의 농도로 처리하고 24 시간 후에 전체 RNA를 추출하였고, 엑손 스키핑을 탐지하기 위하여 HIF-1α 중첩 PCR을 실시하였다.
[엑손 스키핑 데이터] 중첩 PCR 산물의 전기영동 데이터와 엑손 2-3의 스키핑이라고 할 수 있는 PCR 산물의 생거 서열분석 데이터를 도 21A에 제공한다. ASO의 농도가 1 aM에서 100 aM으로 증가할수록 전체 길이 mRNA의 양이 감소하는 경향이 있다. "HIF-ASO 1"의 농도가 3 aM과 10 aM일 때에는 주로 엑손 2의 스키핑이 일어났지만 ASO의 농도가 100 aM으로 증가함에따라 엑손 2-3의 스키핑이 더 많이 일어났다. 엑손 2-3의 스키핑에 대한 PCR 산물은 생거 서열분석으로 확인되었다 [도 21A 우측 참고].
HIF-1α 실시예 10. "HIF-ASO 1"로 처리한 헬라 세포에서 HIF-1α 단백질 발현의 억제.
별도의 언급이 없으면 "HIF-1α 실시예 2"와 같은 방법으로, 헬라 세포에서 "HIF-ASO 1"이 인간 HIF-1α의 발현을 하향 조절하는 정도를 다음과 같이 평가하였다. 이 실시예에서는 헬라 세포들에 대하여 "HIF-ASO 1"을 0 zM (음성 대조용), 100 zM, 300 zM, 1 aM, 3 aM, 10 aM, 30 aM, 100 aM, 또는 300 aM의 농도로 72시간 동안 처리 한 다음 PHDs의 활성을 억제하기 위하여 200 μM CoCl2로 3시간 동안 처리하였다. 음성 대조용으로는 (0 zM "HIF-ASO 1") 4개의 배양 접시를 사용하였다.
"HIF-ASO 1"을 처리한 헬라 세포 용해물로부터 얻은 HIF-1α 웨스턴 블럿 데이터를 도 21B에 제공한다. 음성 대조군 용해물의 HIF-1α 단백질 양이 "HIF-ASO 1"을 처리한 모든 세포 용해물의 HIF-1α 단백질 양보다 상당히 많다. 덴시토미트리로 측정한 각각의 β-액틴 밴드 강도에 대해 정규화한 각각의 HIF-1α 밴드의 강도를 도 21C에 제공한다. 헬라 세포에서 "HIF-ASO 1"의 농도가 0.1에서 300 aM로 증가할수록 72시간 후에 HIF-1α의 발현은 40 내지 80%가 감소하였다.
HIF-1α 실시예 11. "HIF-ASO 12"에 의해 유도된 엑손 스키핑.
표 2에 명시된 15-머 "HIF-ASO 12"는 인간 HIF-1α 프리-mRNA 중의 인트론 3과 엑손 4의 연결 부위에 걸친 3' 스플라이스 위치에 있는 [(5' 3') ugu uuacag ┃ UUUGAACTA AC]의 20-머 프리-mRNA 서열에 대해 "진하게" "밑줄그어" 표시한 서열과 완전한 상보성 결합을 한다. "HIF-ASO 12"는 "인트론 3"과 6-머 결합을 하고 "엑손 4"와 9-머 결합을 한다.
HIF-1α 중첩 PCR을 이용하여 헬라 세포에서 인간 HIF-1α 프리-mRNA의 엑손 4 스키핑을 유도하는 정도를 평가하였다. 헬라 세포에 대하여 "HIF-ASO 12"를 처리하고 6 시간 배양한 다음, 별다른 언급이 없으면 "HIF-1α 실시예 1"과 같은 방법으로 전체 RNA를 추출하였다.
"HIF-ASO 12"를 처리한 헬라 세포의 HIF-1α 중첩 PCR 데이터를 도 22A에 제공한다. 엑손 2-4의 스키핑이라고 할 수 있는 엑손 스키핑 밴드가 ASO를 처리한 모든 PCR 산물에서 탐지된 반면, ASO를 처리하지 않은 경우에는 탐지되지 않았다 (왼쪽 그림 참고). 100 zM "HIF-ASO 12"를 처리하였을 때 엑손 스키핑 밴드가 가장 진하였고, 전체 길이 mRNA 밴드가 가장 흐리게 나타났다. 엑손 2-4의 스키핑은 오른쪽 그림에서 제공된 바와 같이 생거 서열분석으로 확인되었다.
HIF-1α 실시예 12. " HIF-ASO 12"로 처리한 헬라 세포에서 HIF-1α 단백질 발현의 억제.
별다른 언급이 없으면 "HIF-1α 실시예 2"와 같은 방법으로, 헬라 세포에서 "HIF-ASO 12"가 HIF-1α 단백질 발현을 억제하는 정도를 평가하였다.
[ASO 처리] 헬라 세포를 0 zM (음성 대조용), 10 zM, 100 zM, 또는 1 aM 농도의 "HIF-ASO 12"로 처리하였고 음성 대조군의 배양접시는 3개를 사용하였다. 21시간 후에, 음성 대조군의 한 개 접시를 제외하고 나머지는 200 μM CoCl2를 처리하였다. 3시간 후에 모든 세포는 다음과 같이 얼음 위에서 용해되었다. 세포를 차가운 1 mL PBS로 2번 세척한 후, HIF-1α의 분해를 최소화하기 위하여 200 μL 2X 라멜리 (Lammeli) 샘플 완충용액을 (24 mM Tris-HCl, 20 % 글리세롤, 0.8 % SDS, 0.04 % 브로모페놀블루, 2 % β-머캅토에탄올) 이용하여 용해시킨다. 각각의 용해액을 1.5 mL 이튜브에 모으고 5분간 끓인 다음 8% SDS-PAGE 겔에서 웨스턴 블럿을 수행한다.
"HIF-ASO 12"를 1 및 10 aM 농도로 처리한 세포에서 HIF-1α 밴드의 강도가 확실히 감소함을 보여주는 웨스턴 블럿 데이터를 도 22B에 제공한다.
HIF-1α 실시예 13. "HIF-ASO 12"를 처리한 헬라 세포에서 사이버 그린을 이용한 HIF-1α mRNA의 qPCR 평가.
별다른 언급이 없으면 "HIF-1α 실시예 3"과 같은 방법으로, 헬라 세포에서 "HIF-ASO 12"가 HIF-1α mRNA를 변화시키는 정도를 HIF-1α 중첩 qPCR을 이용하여 평가하였다. 헬라 세포에 “HIF-ASO 12”를 6시간 동안 처리한 후 전체 RNA를 추출하였다.
도 22C는 qPCR 데이터를 제공하는 데, ASO를 처리한 세포들에서 엑손 2와 엑손 3의 mRNA 양은 유의성 (독립표본 T 검정) 있게 70~80% 정도로 감소하였다. qPCR 결과는 "HIF-ASO 12"에 의해 유도된 엑손 2-4의 스키핑과 일치한다 (HIF-1α 실시예 11 참고).
AR ASO들의 생체외와 생채내 활성의 예
인간 AR 프리-mRNA에서 엑손 5와 인트론 5의 연결 부위에 걸쳐 있는 5' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 화학식 I의 PNA 유도체에 대해 세포 그리고 마우스에서의 안티센스 엑손 스키핑 활성을 평가하였다. 표적 프리-mRNA 중 스플라이스 위치를 표적하는 화학식 I의 화합물이 엑손 스키핑을 강하게 유도한다는 것을 예시하기 위하여 AR ASO들의 생물학적 예들이 제공되며, 본 발명의 범위를 AR ASO들로 한정하기 위함이 아니다.
AR 실시예 1. "AR-ASO 1"에 의해 유도된 엑손 스키핑.
표 3에 명시된 13-머 "AR-ASO 1"은 인간 AR 프리-mRNA 중의 엑손 5 및 인트론 5의 연결 부위에 걸쳐 있는 5' 스플라이스 위치에서 [(5' 3') GC CUUGCCUG ┃ guaag gaaaa]의 20-머 프리-mRNA RNA 서열내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 13-머 서열과 완전한 상보성 오버랩을 갖는다. "AR-ASO 1"은 엑손 5와 8-머 오버랩을 그리고 인트론 5와 5-머의 오버랩을 한다.
MCF7 세포에서 "AR-ASO 1"이, 인간 AR 프리-mRNA에서 엑손 5의 스키핑을 유도하는 정도를 AR 중첩 PCR을 이용하여 다음과 같이 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] MCF7 세포는 (Cat. Number: HTB-22, ATCC) EMEM 배양액에 10% 소 혈청 (FBS, Fetal Bovine Serum), 0.01 mg/mL 소 인슐린, 그리고 1% 스트렙토마이신/페니실린을 첨가하여 37oC, 5% CO2 조건에서 세포 배양하였다. 60 mm 배양 접시에서 배양된 세포들에 대해 "AR-ASO 1"을 0 (검정 대조용), 3, 30, 300, 또는 3,000 aM의 (즉, 3 fM) 농도로 3시간 동안 처리하였다.
[RNA 추출] 전체 RNA를 "유니버셜 RNA 익스트랙션 키트 (Universal RNA Extraction Kit)"(Cat. Number 9767, 타카라(Takara))를 사용하여 제조사의 설명에 따라 추출하였다.
[원스텝 RT-PCR에 의한 cDNA합성] 100 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [AR-엑손 3_순방향: (5' 3') TGGGTGTCACTATGGAGC; 및 AR-엑손 9_역방향: (5' 3') GGGTGTGGAAATAGATGGG]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 플래티늄 (platinum®) Taq 폴리머라제 (Cat. No. 10928-042, 인비트로젠 (Invitrogen))를 갖는 슈퍼스크립트(Super Script®) 원스텝(One-Step) RT-PCR 키트를 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50oC 30분 및 94oC 2분에 이어서, 39 주기의 94oC 30초, 55oC 30초 및 72oC 1분.
[네스티드 PCR 증폭] 증폭 과정 전체적으로, 한 가지의 풀림 온도를 사용하는 전통적인 PCR 방법과 달리, 사이클마다 풀림 (annealing) 온도를 올려서 전 온도 범위에서 효과적이고 특이적으로 작동하는 독특한 증폭 기술을 사용했다. 1 μL의 cDNA를, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [AR-엑손 3_순방향: (5' 3') TGGGTGTCACTATGGAGC; 및 AR-엑손 7n_역방향: (5' 3') GGGGTGA- TTTGGAGCCAT]의 프라이머 세트에 대해 20 ㎕ 네스티드 PCR 반응에서 추가로 증폭시켰다: 10 주기 [94 ℃ 30초, 47 ℃ 40초 (매 주기마다 +0.5℃), 72 ℃ 40초], 20 주기 [94oC 30초, 50oC 30초 및 72oC 40초].
[엑손 스키핑 생성물의 확인] 상기 PCR 산물에 대해 2% 아가로스 젤 상에서 전기영동 분리를 수행하였다. 타겟 크기에 따라 밴드들을 수집하고 생거 (Sanger) 서열분석에 의해 분석하였다. 도 23A에서 ASO 처리에 의해 생성된 엑손 5가 없는 세 종류의 AR mRNA 스플라이스 변형체가 관찰되었다. "AR-ASO 1"은 엑손 5, 엑손 4-5, 그리고 엑손 4-6 스키핑을 유도하는 것으로 보이는 데, 그 생성 비율은 ASO의 농도에 따라 다르다. 도 23B는 도 23A에 있는 엑손 4-5가 스키핑된 밴드의 실제 서열분석 데이터를 제공한다.
AR 실시예 2. MCF7 세포에서 "AR-ASO 1"로 처리한 AR 단백질 발현의 억제.
60 mm 배양 접시에서 5 mL 배양액에 배양된 MCF7 세포에 대해 "AR-ASO 1"을 0 zM (음성 대조용), 10 zM ~ 30 aM 농도로 처리하였다. 음성 대조용에 4개의 배양 접시가 사용되었다. 48시간 후에, 세포를 저온 PBS로 2회 세척하고, 1X 프로테아제 억제제 칵테일 (Cat. No. P8340, 시그마(Sigma))이 첨가된 200 μL 1X 세포 용해 완충제로 (Cat. No. 9803, 셀 시그널링 테크 (Cell Signaling Tech)) 용해를 수행하였다. 1.5 mL e-튜브에 있는 200 μL의 각 용해물을 100 μL 3X 샘플 완충제와 혼합하고 100oC에서 5분 동안 끓였다. 총 12개의 용해물 중에서 20 μL의 각각의 용해물을 (4개의 음성 대조용과 8개의 ASO 처리 샘플) 8% SDS-PAGE 젤 상에서 전기영동 분리를 수행하고 PVDF 멤브레인으로 단백질 전달을 수행하였다. 상기 멤브레인은 항-AR 항체 (Cat. No. 5153, 셀 시그널링 테크) 및 항-β-액틴 항체로 (Cat. No. sc4778, Santa Cruz) 탐색하였다. 0 zM에서 (4개의 음성 대조군) 30 aM 사이의 "AR-ASO 1"을 처리한 MCF7 세포에서 얻은 AR 웨스턴 블럿 데이터를 도 23C에 제공한다. ASO를 처리한 용해물의 AR 밴드가 (120K 크기) ASO를 처리하지 않은 용해물의 밴드보다 훨씬 흐리게 나타났다.
AR 실시예 3. "AR-ASO 1"로 처리한 MCF7 세포에서 사이버 그린을 이용한 AR mRNA의 qPCR 평가.
[ASO 처리와 RNA 추출] 5 mL 배양액에 배양된 MCF7 세포에 대해 "AR-ASO 1"을 0 zM (음성 대조용), 1 zM ~ 1 aM 농도로 처리하였다 (각 농도마다 2개의 배양 접시). 5시간 후에, 제조사의 설명에 따라 "미니베스트 유니버설 RNA 익스트랙션 키트"를 (Cat. No. 9767, 타카라) 사용하여 전체 RNA를 추출하였다.
[올리고-디티로 cDNA 합성] 제조사의 설명에 따라, 500 ng의 RNA 주형에 대해 올리고-디티를 (Oligo-dT, Cat. No. 6110A, 타카라) 사용하여 cDNA를 합성하였다.
[첫번째 PCR] cDNA를 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [AR-엑손 3_순방향: (5' 3') TGGGTGTCACTATGGAGC; 및 AR-엑손 9_역방향: (5' 3') GGGTGTGGAAATAGATGGG]의 프라이머 세트에 대해 첫번째로 (1st PCR) 증폭시켰다: 94 ℃ 2분, 15 주기의 94 ℃ 15초, 55 ℃ 30초 및 72 ℃ 2분.
[중첩 PCR] 첫번째 PCR 산물을 2천배로 묽힌 후, 1 μL를 취한 다음 특정한 엑손 프라이머를 이용하여 20 μL 실시간 (Real-Time) PCR 반응을 진행하였다 [AR-엑손 4_순방향 (q): (5' 3') GACCATGTTTTGCCCATTG 및 AR-엑손 4_역방향 (q): (5' 3') GGCTCTTTTGAAGAAGACC; AR-엑손 5_순방향 (q): (5' 3') GAAACAGAAGTACCTGTGC 및 AR-엑손 5_역방향 (q): (5' 3') GTCATCCCT- GCTTCATAAC; AR-엑손 6_순방향 (q): (5' 3') CGGAAGCTGAAGAAACTTG 및 AR-엑손 6_역방향 (q): (5' 3') CACTTGACCACGTGTACAAG]. PCR 반응은 사이버 그린을 (타카라, 일본) 이용하여 탐색하였고, 주기 조건은 다음과 같다: 95oC 3분, 40 주기의 95oC 5초 및 60oC 30초. ASO의 농도가 1 zM에서 100 zM로 증가함에 따라 엑손의 양이 점차적으로 현격하게 감소하였다. "AR-ASO 1" 100 zM을 처리한 세포에서 엑손의 양이 40~50% 감소한 반면 (도 24A 참고), "AR-ASO 1" 1 aM을 처리한 세포에서는 음성 대조군과 비슷하게 회복되었다.
AR 실시예 4. "AR-ASO 5"로 처리한 MCF7 세포에서 사이버 그린을 이용한 AR mRNA의 qPCR 평가.
표 3에 명시된 12-머 "AR-ASO 5"는 인간 AR 프리-mRNA 중의 엑손 5 및 인트론 5의 연결 부위에 걸쳐 있는 5' 스플라이스 위치에서 [(5' 3') GCC UUGCCUG ┃ guaag gaaaa]의 20-머 프리-mRNA RNA 서열내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 12-머 서열과 완전한 상보성 오버랩을 갖는다. "AR-ASO 5"는 엑손 5와 7-머 오버랩을 그리고 인트론 5와 5-머의 오버랩을 한다.
"AR-ASO 5"가 AR mRNA 엑손 양의 변화를 유도하는 정도를 q PCR을 이용하여 "AR 실시예 3"에 따라 평가하였다. 도 24B에 제공한 바와 같이, "AR-ASO 5"를 1 에서 1,000 zM 처리한 세포에서 AR 엑손의 양이 유의성 (독립표본 T 검정) 있게 약 60~80% 감소하였다.
"AR-ASO 1"의 ("AR 실시예 3" 참고) 경우와는 달리, 1,000 zM의 "AR-ASO 5"에서 엑손의 양이 회복되지 않았다.
AR 실시예 5. "AR-ASO 5"로 처리한 MCF7 세포에서 택만 탐색을 이용한 AR mRNA의 qPCR 평가.
MCF7 세포에서 "AR-ASO 5"가 인간 AR mRNA를 하향조절하는 정도를 택만 탐색을 이용하여 qPCR로 평가하였다.
MCF7 세포에 대해 "AR-ASO 5"를 0 zM (음성 대조용) ~ 1 aM 농도로 처리하였다 (각 농도마다 2개의 배양 접시). 24시간 후에, 제조사의 설명에 따라 "미니베스트 유니버설 RNA 익스트랙션 키트"를 (Cat. No. 9767, 타카라) 사용하여 전체 RNA를 추출하였다.
400 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [AR-엑손 3_순방향: (5' 3') TGGGTGTCACTATGGAGC; 및 AR-엑손 9_역방향: (5' 3') GGGTGTGGAAATAGATGGG]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 원스텝(One-Step) RT-PCR 키트를 (Invitrogen) 사용하여, cDNA를 합성하였다: 50oC 30분 및 94oC 2분에 이어서, 15 주기의 94oC 30초, 50oC 30초 및 72oC 1분.
50배로 묽힌 각 cDNA 용액의 1 μL를 취한 다음 특정한 엑손 프라이머를 이용하여 20 μL 실시간 (Real-Time) PCR 반응을 진행하였고 [AR-엑손 4_순방향(q2): (5' 3') TTGTCCATCTTGTCGTCTT 및 AR-엑손 5_역방향(q2): (5' 3') CCTCTCCTTCCTCCTGTA], 주기 조건은 다음과 같다: 95oC 3분, 40 주기의 95oC 15초 및 60oC 30초. qPCR 반응은, 전체 길이 AR mRNA에서 엑손 4와 엑손 5의 연결 부위를 탐지하게 고안된 택만 탐색을 [(5'→3') TTTCTTCAG-ZEN-CTTCCGGGCTC-3IABkFQ] 이용하여 탐색하였다.
도 24C는 택만 탐색에 의한 qPCR 데이터를 제공한다. "AR-ASO 5"를 1 zM ~ 1 aM 농도로 처리한 세포에서 전체 길이 AR mRNA의 상대적인 발현이 유의성 (독립표본 T 검정) 있게 약 50 내지 70% 감소하였다.
AR 실시예 6. "AR-ASO 5"를 국소 투여한 쥐의 피부에서 AR 단백질 발현의 억제.
"AR-ASO 5"에 대한 인간과 쥐의 AR 프리-mRNA의 표적 서열은 같다. "AR-ASO 5"를 한 번 국소 투여한 쥐의 (mouse) 피부에서 AR 단백질 발현이 억제되는 정도를 평가하였다.
[모발 제거 및 군 분리] 실험 시작 전날 (Day 0), 졸라제팜/럼푼 (zoletil/rompun)으로 마취한 7주령 수컷 쥐의 (C57BL/6) 등 뒤의 모발을 면도기와 제모제를 도포하여 제거한다. 5일 후에, 완벽히 제모된 쥐를 선별하고 무작위로 5군으로 분리한다: 0 pmole/Kg (용매만, 음성 대조용), 1 pmole/Kg, 10 pmole/Kg, 100 pmole/Kg, 그리고 1,000 pmole/Kg의 "AR-ASO 5" (군당 6마리).
[ASO 주사 용액과 투여] 진한 "AR-ASO 5" 저장 수용액을 0.1% 트윈 80이 포함된 PBS로 차례차례 희석하여 0 nM (용매만, 음성 대조용), 0.5 nM, 5, nM, 50, nM, 그리고 500 nM의 "AR-ASO 5" 용액을 준비하였다. 5일 후에, 2 mL/Kg의 용액을 각 군 쥐들의 목 뒤쪽에 한 번 국소 투여하였다.
[피부 샘플 채취] 10일 후에, 쥐들을 희생시켜 주사 부위의 피부 샘플과 주사 부위가 아닌 곳의 샘플로서 엉덩이 부위 샘플을 채취하였다. 피부 샘플은 채취 직후에 액체 질소를 이용하여 얼렸고, 각각의 피부 샘플은 액체 질소로 얼린 상태를 유지하며 미분화하였다. 미분화된 샘플은 1% SDS가 첨가된 RIPA 완충제로 용해하였고 용해물은 5X 샘플 완충제와 섞은 후 5분간 끓였다.
[AR 웨스턴 블럿] PVDF 막에서 용해물에 대해 AR 웨스턴 블럿을 실시하였다. 각 10% PAGE 젤에는 각군당 2 용해액 총 10 용해액이 분석되었다. AR 단백질은 (120K 달톤) 다클론성의 AR 항체를 (N-20, sc-816, 산타크루즈) 이용하여 탐색하였다.
[AR 단백질 발현의 정량화] 하나의 PVDF 막 위의 각 AR 밴드는 각각의 β-액틴 밴드에 대해 정규화 되었다. 음성 대조군의 두 개의 샘플의 평균적인 AR 밴드의 강도는 (β-액틴에 대해 정규화된) 같은 PVDF 막에 있는 다른 8개 샘플의 AR 밴드 강도를 정규화하는 데 사용되었다. 그러한 이중 정규화는, 덴시토미트리로 각 샘플들의 AR 단백질 발현을 정량화하기 위해 다른 두 개의 PVDF 막들에도 적용되었다. 독립표본 T 검정으로 ASO를 처리하지 않은 발현량에 대해 통계 분석하기 위해 각 샘플들의 이중 정규화 후의 모든 AR 발현량을 모았다.
[AR 단백질 발현의 억제] 도 25A와 25B는 각각 주사 부위와 주사 부위가 아닌 곳의 피부 샘플에 대한 AR 웨스턴 블럿 데이터이다.
개체 및 군의 AR 발현량을 도 26A에 제공한다. 주사 부위와 주사 부위가 아닌 곳 모두에서 AR 단백질 발현은 개체마다 변산도가 컸지만, ASO의 투여량이 증가할수록 AR 발현은 감소하는 경향이었다.
음성 대조군에 대해 정규화된 군의 평균 AR 발현량을 도 26B에 제공한다. 1,000 pmole/Kg "AR-ASO 5"를 투여한 군의 주사 부위에서는 AR 단백질 발현이 약 35% 현저히 감소했다. 100과 1,000 pmole/Kg "AR-ASO 5"를 투여한 군의 주사 부위가 아닌 곳에서는 AR 단백질 발현이 약 40% 현저히 감소했다.
주사 부위와 먼 곳에서 관찰된 AR 단백질 발현의 억제는, 국소 투여 후의 전신 순환을 통해서 ASO가 투여 부위와 떨어진 조직에도 쉽게 분포된다는 것을 증명한다. 화학식 I의 PNA 유도체의 국소 투여에 의한 전신성 표적화 가능성을 예시하기 위하여 탈체 (ex vivo) 결과가 제공되며, 본 발명의 범위를 AR ASO들로 한정하기 위함이 아니다.
AR 실시예 7. "AR-ASO 1"에 의해 유도된 엑손 스키핑 (2).
세포 분할, 세포의 밀도 그리고 세포의 조건에 따라 MCF7 세포의 형태는 달라진다. 초기 분할 시기의 MCF 세포는 상대적으로 빠르게 자라고 적운 형태의 군집을 보이고, 시기가 좀 지난 MCF7 세포는 천천히 자라고 편평 상피 군집을 형성하는 데, 적운 형태의 군집을 보이는 MCF7 세포를 유지하는 것은 쉽지 않다.
별다른 언급이 없으면 "AR 실시예 1"과 같은 방법으로, 거의 적운 형태를 보이는 MCF7 세포에서 "AR-ASO 1"이 엑손 스키핑을 유도하는 정도를 평가하였다.
[ASO 처리] MCF7 세포에 대해 "AR-ASO 1"을 0 (검정 대조용), 30, 100, 또는 1,000 aM의 (즉, 1 fM) 농도로 3시간 동안 처리하였다. (ASO 농도당 2개의 배양접시)
[RNA 추출] 전체 RNA를 RNeasy 미니 프렙 키트를 (Cat. Number 74104, Qiagen) 사용하여 제조사의 설명에 따라 추출하였고 500 ng의 RNA 주형이 25 μL 역전사 반응에 사용되었다.
[엑손 스키핑 결과] 중첩 RT-PCR 산물들의 전기영동 데이터가 도 27A에 제공된다. "AR 실시예 1"의 경우와는 (도 23A 참고) 대조적으로, ASO를 처리한 세포에서 엑손 5의 스키핑이 (생거 서열분석으로 확인됨: 도 27B 참고) 확실히 지배적이었다.
SCN9A ASO들의 생체외와 생채내 활성의 예
인간 SCN9A (나트륨 통로 아형 9A) 프리-mRNA에서 여러 스플라이스 위치들을 상보적으로 표적하는 화학식 I의 PNA 유도체에 대해 세포 그리고 동물에서의 SCN9A 안티센스 및 엑손 스키핑 활성을 평가하였다. 표적 프리-mRNA 중 스플라이스 위치를 표적하는 화학식 I의 화합물이 엑손 스키핑을 강하게 유도한다는 것을 예시하기 위하여 SCN9A ASO들의 생물학적 예들이 제공되며, 본 발명의 범위를 SCN9A ASO들로 한정하기 위함이 아니다.
SCN9A 실시예 1. "SCN-ASO 7"에 의해 유도된 엑손 스키핑.
표 4에 명시된 "SCN-ASO 7"은 인간 SCN9A 유전자에서 (출처는 NCBI 참고 서열: NC_000002.12) 유래한 인간 SCN9A 프리-mRNA 중의 엑손 4 및 인트론 4의 연결 부위에 걸쳐 있는 5' 스플라이스 위치에 완전히 상보적인 16-머 ASO이다. "SCN-ASO 7"은 [(5' 3') UUGUUUUUGC ┃ guaagu acuu]의 20-머 프리-mRNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 16-머 서열과 상보성 결합을 한다. "SCN-ASO 7"은 엑손 4와 10-머 결합을 하고 인트론 4와 6-머 결합을 한다.
PC3 세포에서 인간 SCN9A 프리-mRNA가 풍부하게 발현된다는 보고를 고려하여 [Br. J. Pharmacol. vol 156, 420-431 (2009)], PC3 세포에서 "SCN-ASO 7"이 SCN9A 엑손 4의 스키핑을 유도하는 정도를 중첩 (nested) PCR을 이용하여 다음과 같이 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] PC3 세포는 (Cat. No. CRL-1435, ATCC) 10% 소 혈청 (FBS, Fetal Bovine Serum), 1% 스트렙토마이신/페니실린, 1% L-글루타민, 그리고 1% 나트륨 피루베이트를 첨가한 Ham's F-12K 배양액에서 37oC, 5% CO2의 조건하에 배양되었다.
60 mm 배양 접시에서 5 mL 배양액에 배양된 PC3 세포들에 대해 "SCN-ASO 7"을 0 (음성 대조용), 10, 100, 또는 1,000 zM의 농도로 처리하였다.
[RNA 추출] 18 시간의 배양 후에, 리보솜에 의한 번역을 막기 위해 100 μg/mL의 시클로헥시미드로 6 시간 동안 PC3 세포를 처리하였다. 전체 RNA를 "유니버셜 RNA 익스트랙션 키트 (Universal RNA Extraction Kit)" (Cat. Number 9767, 타카라(Takara))를 사용하여 그 제조사의 설명에 따라 추출하였다.
[원스텝 RT-PCR에 의한 cDNA합성] 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [SCN-엑손 2_순방향: (5' 3') CTTTCTCCTTTCAGTCCTCT; 및 SCN-엑손 9_역방향: (5' 3') CGTCTGTTGGTAAAGGTTTT]의 유전자-특이성 프라이머 세트에 대해 플래티늄 (platinum®) Taq 폴리머라제 (Cat. No. 10928-042, 인비트로젠 (Invitrogen))를 갖는 슈퍼스크립트 (Super Script®) 원스텝 (One-Step) RT-PCR 키트를 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50 ℃ 30분 및 94 ℃ 2분에 이어서, 40 주기의 94 ℃ 30초, 55 ℃ 30초 및 72 ℃ 2분.
[중첩 PCR 증폭] 100배 희석한 1 μL의 cDNA를, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [SCN-엑손 3n_순방향: (5' 3') GGACCAAAAATGTCGAGTATTT; 및 SCN-엑손 8_역방향: (5' 3') GCTAAGAAGGCCCAGCTGAA]의 엑손 4의 스키핑을 탐색하도록 고안된 프라이머 세트에 대해 20 μL 중첩 PCR 반응 (Cat. No. K2612, 바이오니어)에서 증폭시켰다: 95℃ 5분에 이어서, 35 주기의 95 ℃ 30초, 50 ℃ 30초 및 72 ℃ 1분.
"SCN-엑손 3n_순방향"의 프라이머는 22-머 프라이머가 엑손 3과 엑손 4의 연결 부위와 18-머의 상보적인 오버랩이 있긴 하지만, 엑손 4의 결여를 효과적으로 탐색하기 위하여 엑손 3과 엑손 5의 연결 부위를 표적한다. 즉 "SCN-엑손 3n_순방향"은 전체 길이 SCN9A mRNA에서 "엑손 3과 엑손 4의 연결 부위"보다 "엑손 3과 엑손 5의 연결 부위"를 더 잘 인식한다. 프라이머의 서열은 전체 길이 SCN9A mRNA보다 엑손 4가 결여된 SCN9A의 스플라이스 변형체를 더 민감하게 탐지하도록 고안되었다. 그러한 엑손 스키핑 프라이머는 대사 안정성이 떨어지는 mRNA 스플라이스 변형체를 탐지하는 데 유용할 것이며, 전체 길이 SCN9A mRNA는 오랜 세월동안 진화를 통해 대사 안정성이 있을 것이다.
[엑손 스키핑 생성물의 확인] 2% 아가로스 젤 상에서 중첩 PCR 산물에 대해 전기영동 분리를 수행하였다. 타겟 크기의 밴드들을 수집하고 생거 서열분석으로 분석하였다. 도 28A에서 보는 바와 같이 10 zM 및 100 zM의 "SCN-ASO 7"로 처리한 PC3 세포에서도 엑손 4의 스키핑이 보이기는 했지만, 1 aM로 처리한 것에서 엑손 4 스키핑이 눈에 띄게 강했다. 도 28B에서 보는 바와 같이 엑손 스키핑 밴드들은 생거 서열분석으로 명백하게 확인하였다.
SCN9A 실시예 2. "SCN-ASO 7"로 처리한 PC3 세포에서 사이버 그린을 이용한 SCN9A mRNA의 qPCR 평가.
PC3 세포에서 "SCN-ASO 7"이 인간 SCN9A mRNA의 발현을 억제하는 정도를, 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 pPCR로 다음과 같이 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] 60 mm 배양 접시에서 5 mL 배양액에 "SCN-ASO 7"을 0 (음성 대조용), 10, 100, 또는 1,000 zM의 농도로 처리한 PC3 세포를 24 시간 동안 배양하였다 (각 농도마다 2개의 배양 접시).
[RNA 추출] 전체 RNA를 "미니베스트 유니버셜 RNA 추출 키트 (MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)" (Cat. Number 9767, 타카라(Takara))를 사용하여 그 제조사의 설명에 따라 추출하였다.
[원스텝 RT-PCR에 의한 cDNA합성] 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [SCN-엑손 2_순방향: (5' 3') CTTTCTCCTTTCAGTCCTCT; 및 SCN-엑손 9_역방향: (5' 3') TTGCCTGGTTCTGTTCTT]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 플래티늄 (platinum®) Taq 폴리머라제 (Cat. No. 10928-042, 인비트로젠 (Invitrogen))를 갖는 슈퍼스크립트(Super Script®) 원스텝 RT-PCR 키트를 사용하여, 20 μL 역전사 반응에 사용하였다. 순환조건 (cycle condition): 50 ℃ 30분 및 94 ℃ 2분에 이어서, 15 주기의 94 ℃ 15초, 55 ℃ 30초 및 72 ℃ 2분.
[중첩 PCR 증폭] 50배 희석한 1 μL의 cDNA를, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [SCN-엑손 4_순방향: (5' 3') GTACACTTTTACTGGAATATATAC; SCN-엑손 4_역방향: (5' 3') AATGACGACAAAATCCAGC; SCN-엑손 5_순방향: (5' 3') GTATTTAACAGAATTTGTAAACCT; SCN-엑손 5_역방향: (5' 3') CTGGGATTACAGAAATAGTTTTCA; SCN-엑손 6_순방향: (5' 3') GAAGACAATTGTAGGGGC; 및 SCN-엑손 6_역방향: (5' 3') GTCTTCTTCACTCTCTAGGG]의 엑손 특이성 프라이머 세트에 대해 20 μL 실시간 PCR 반응을 실시하였다. PCR 반응은 사이버 그린으로 (SYBR Green, 타카라, 일본) 탐색하였고 주기 조건: 95℃ 30초에 이어서, 40 주기의 95 ℃ 5초, 60 ℃ 30초.
[qPCR 결과] ASO를 처리한 세포들의 엑손의 양은 ASO를 처리하지 않은 세포의 엑손의 양, 즉 음성 대조군에 대해 정규화 하였다. 도 29A는 qPCR 결과를 요약한 것인 데, 10, 100, 그리고 1,000 zM 농도에서 엑손 4~6의 발현량이 약 70%, 40%, 그리고 20~30% 각각 감소하였다.
SCN9A 실시예 3. "SCN-ASO 3"으로 처리한 PC3 세포에서 사이버 그린을 이용한 SCN9A mRNA의 qPCR 평가.
표 4에 명시된 "SCN-ASO 3"은 인간 SCN9A 프리-mRNA 중의 엑손 4 및 인트론 4의 연결 부위에 걸쳐 있는 5' 스플라이스 위치를 표적하는 14-머 ASO이다. "SCN-ASO 3"은 [(5' 3') UUG UUUUUGC ┃ gua "ag" ua cuu]의 20-머 프리-mRNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 12-머 서열과 상보성 결합을 하며, 두 개의 부정합은 인용표로 (" ") 표시하였다. "SCN-ASO 3"은 엑손 4와 7-머 상보성 결합을 하고 인트론 4와 5-머 상보성 결합을 한다.
별다른 언급이 없으면 "SCN9A 실시예 2"와 같은 방법으로, PC3 세포에서 "SCN-ASO 3"이 전체 길이 SCN9A mRNA의 발현을 억제하는 정도를 평가하였다.
도 29B는 qPCR 결과를 요약한 것인 데, 10, 100, 그리고 1,000 zM 농도에서 엑손 4~6의 발현량이 각각 >90%, 약 70%, 그리고 약 80% 현저하게 감소하였다. "SCN-ASO 7"의 경우와 같이, 10 zM일 때가 전체 길이 SCN9A mRNA의 발현을 가장 강하게 억제하는 것을 분명하게 나타내었다.
SCN9A 실시예 4. "SCN-ASO 8"로 처리한 PC3 세포에서 사이버 그린을 이용한 SCN9A mRNA의 qPCR 평가.
표 4에 명시된 "SCN-ASO 8"은 인간 SCN9A 프리-mRNA 중의 엑손 4 및 인트론 4의 연결 부위에 걸쳐 있는 5' 스플라이스 위치를 표적하는 17-머 ASO이다. "SCN-ASO 8"은 [(5' 3') UUGUUUUUGC┃gua "ag" ua cuu]의 20-머 프리-mRNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 15-머 서열과 상보성 결합을 하며, 두 개의 부정합은 인용표로 (" ") 표시하였다. "SCN-ASO 8"은 인간 SCN9A 프리-mRNA 중의 엑손 4와 10-머 상보성 결합을 하고 인트론 4와 5-머 상보성 결합을 한다.
별다른 언급이 없으면 "SCN9A 실시예 2"와 같은 방법으로, PC3 세포에서 "SCN-ASO 8"이 전체 길이 SCN9A mRNA의 발현을 억제하는 정도를 평가하였다.
도 29C는 qPCR 결과를 요약한 것인 데, 10과 100 zM 농도에서 엑손 4~6의 발현량이 각각 50~70%와 70~80% 현저하게 감소하였다.
SCN9A 실시예 5. "SCN-ASO 7"로 처리한 PC3 세포에서 코로나 분석에 의한 나트륨 전류의 억제 평가.
세포의 나트륨 전류는 패치클램프 (patch clamp)로 측정한다. 나트륨 이온이 세포 안으로 들어가면 세포내의 나트륨 이온의 양이 증가하는 데, 나트륨 이온의 양은 나트륨 이온에 반응하는 염료에 의해 탐색할 수 있다. "코로나 그린"은 (CoroNa Green) 크라운 에테르 형의 나트륨 이온 킬레이트제를 (chelator) 이용한 염료인 데, 나트륨 이온이 킬레이트화하면 "코로나 그린"은 녹색 형광을 발한다. "코로나 그린"은 세포내의 나트륨 이온의 양을 간접적으로 측정하는 데 사용되어 왔는 데, "코로나 그린"으로 측정한 나트륨의 양은 나트륨 이온 패치 클램프로 측정한 나트륨 이온 전류와 연관성이 있다 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol 106(38), 16145-16150 (2009)].
SCN의 다른 아형들이 동시에 발현되기는 하지만, PC3 세포에서는 인간 SCN9A mRNA가 풍부하게 발현된다 [Br. J. Pharmacol. vol 156, 420-431 (2009)]. Nav1.7 나트륨 채널 아형이 PC3 세포의 전체 나트륨 이온 전류 중에서 많은 부분을 차지한다면 SCN9A mRNA의 발현을 억제하면 PC3 세포의 나트륨 전류가 상당히 줄어들 것이다.
PC3 세포에서 "SCN-ASO 7"이 나트륨 이온 전류를 억제하는 정도를 "코로나 그린"을 이용하여 다음과 같이 평가하였다.
[ASO 처리] 35 mm 배양 접시에서 2 mL F-12K 배양액에 있는 PC3 세포에 대해 "SCN-ASO 7"을 0 (음성 대조용), 100 zM, 또는 1 aM의 농도로 처리하였다.
[코로나 분석] 30 시간 후에 세포를 2 mL의 HBSS로 (Hank의 안정된 소금물, Cat. Number 14025-092, Life Technologies) 씻은 다음 2 mL의 새 HBSS를 가하였다. 그리고 세포를 37 oC에서 5 μM “코로나 그린”으로 (Cat. Number C36676, Life Technologies) 처리하고, 30분 후에 세포를 2 mL의 HBSS로 2번 씻은 다음 2 mL의 새 HBSS를 가하였다. 세포의 녹색 형광 영상을 계속 촬영하기 위하여 디지털 비디오 카메라가 구비된 올림푸스 형광 현미경 위에 배양접시를 올려 놓았다. 세포를 100 mM 소금물로 급속히 처리하고, 한 프레임에 4 개의 세포가 들어간 세포의 형광 영상의 변화를 3 분간 촬영하였다. 각각 세포의 형광강도는 초 단위로 기록하였고, 각 시점에서 겹쳐 평균을 내었다. ImageJ 프로그램을 (버전 1.50i, NIH) 사용한 도 30A는 ASO의 농도에 따른 각 세포의 평균값들을 나타낸다. 형광강도 기록의 평균값은 0 (음성 대조용), 100, 그리고 1,000 zM의 "SCN-ASO 7"을 처리한 각 세포 내부의 나트륨 이온 농도로 간주하였다.
[코로나 분석 결과] 관찰된 세포 내의 형광강도 기록을 도 29B에 요약하였다. 1,000 zM의 "SCN-ASO 7"을 처리한 세포의 형광강도는 ASO를 처리하지 않은 세포의 형광강도보다 낮았다. ASO 처리에 의해 유도된 나트륨 전류 변화를 평가하기 위하여 100초 후의 평균 형광강도를 비교하였는 데, ASO를 처리하지 않았을 때는 81.86 (임의적 단위), 그리고 1,000 zM의 "SCN-ASO 7"을 처리하였을 때는 51.47 이었다. 즉, PC3 세포에서 1,000 zM의 "SCN-ASO 7"을 처리하고 30시간 후에 나트륨 채널의 활성이 37% 감소하였다 (p<0.05, 독립표본 T 검정). PC3 세포가 다양한 VGSC 아형들을 발현한다는 것을 고려할 때, 37%의 감소는 "SCN-ASO 7"에 의한 Nav1.7의 발현 억제가 현저하다고 할 수 있다. 100 zM의 "SCN-ASO 7"을 처리한 PC3 세포에서의 나트륨 전류는 별로 감소하지 않았다.
SCN9A 실시예 6. "SCN-ASO 3"으로 처리한 PC3 세포에서 코로나 분석에 의한 나트륨 전류의 억제 평가.
별다른 언급이 없으면 "SCN9A 실시예 5"와 같은 방법으로, PC3 세포에서 "SCN-ASO 3"이 나트륨 전류를 억제하는 정도를 "코로나 그린"을 이용하여 평가하였다.
관찰된 세포 내의 형광강도 기록을 도 30B에 요약하였다. 1,000 zM의 "SCN-ASO 3"을 처리한 세포의 형광강도는 ASO를 처리하지 않은 세포의 형광강도보다 낮았다. ASO 처리에 의해 유도된 나트륨 전류 변화를 평가하기 위하여 100초 후의 평균 형광강도를 비교하였는 데, ASO를 처리하지 않았을 때는 89.32 (임의적 단위), 그리고 1,000 zM의 "SCN-ASO 3"을 처리하였을 때는 61.36 이었다. 즉, PC3 세포에서 1,000 zM의 "SCN-ASO 3"은 나트륨 채널의 활성을 현저하게 31% 감소시켰다 (p<0.01, 독립표본 T 검정). 100 zM의 "SCN-ASO 3"을 처리한 PC3 세포에서의 나트륨 전류는 현저하지는 않지만 18% 감소하였다.
SCN9A 실시예 7. "SCN-ASO 8"로 처리한 PC3 세포에서 나트륨 전류의 억제 평가.
별다른 언급이 없으면 "SCN9A 실시예 3"과 같은 방법으로, PC3 세포에서 "SCN-ASO 8"이 나트륨 전류를 억제하는 정도를 "코로나 그린"을 이용하여 평가하였다.
관찰된 세포 내의 형광강도 기록을 도 30C에 요약하였다. "SCN-ASO 8"을 처리한 세포의 형광강도는 ASO를 처리하지 않은 세포의 형광강도보다 낮았다. ASO 처리에 의해 유도된 나트륨 전류 변화를 평가하기 위하여 100초 후의 평균 형광강도를 비교하였는 데, ASO를 처리하지 않았을 때는 130.32 (임의적 단위), 그리고 1,000 zM의 "SCN-ASO 8"을 처리하였을 때는 89.7 이었다. 즉, PC3 세포에서 1,000 zM의 "SCN-ASO 8"은 나트륨 채널의 활성을 31% 현저히 감소시켰다 (p<0.001, 독립표본 T 검정). 100 zM의 "SCN-ASO 8"을 처리한 PC3 세포에서의 나트륨 전류는 30% 감소하였다 (p<0.001).
SCN9A 실시예 8. PC3 세포에서 "SCN-ASO 27"에 의해 유도된 엑손 스키핑 (A).
표 5에 명시된 "SCN-ASO 27"은 인간 SCN9A 프리-mRNA 중의 "인트론 3" 및 "엑손 4"의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치에 완전히 상보적인 14-머 ASO이다. "SCN-ASO 27"은 [(5' 3') uugu guuuag ┃ GUACACUU UU]의 20-머 SCN9A 프리-mRNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 14-머 서열과 상보성 결합을 한다. "SCN-ASO 27"은 "인트론 3"과 6-머 결합을 하고 "엑손 4"와 8-머 결합을 한다.
별다른 언급이 없으면 "SCN9A 실시예 1"과 같은 방법으로, PC3 세포에서 "SCN-ASO 27"이 "엑손 4"의 스키핑을 유도하는 정도를 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] 60 mm 배양 접시에서 5 mL 배양액에 배양된 PC3 세포들에 대해 "SCN-ASO 27"을 0 (음성 대조용), 1, 10, 또는 100 zM의 농도로 처리하였다.
[중첩 PCR 증폭] 1 μL의 cDNA를, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [SCN-엑손 2n_순방향: (5' 3') CCACCGGACTGGACCAAAAA; 및 SCN-엑손 9n_역방향: (5' 3') GCTAAGAAGGCCCAGCTGAA]의 엑손 특이적인 프라이머 세트에 대해 20 μL 중첩 PCR 반응 (Cat. No. K2612, 바이오니어)에서 추가로 증폭시켰다: 95℃ 2분에 이어서, 34 주기의 95℃ 30초, 55℃ 30초 및 72℃ 1분.
[엑손 스키핑 생성물의 확인] 중첩 PCR 산물에 대한 전기영동 데이터를 도 31A에 제공하는 데, "SCN-ASO 27"로 처리한 세포에서 엑손 4-5의 스키핑이라고 할 수 있는 강한 PCR 밴드가 생성되었다. 그러나, 전체 길이 SCN9A mRNA의 PCR 밴드의 강도는, 음성 대조군 샘플보다 10 zM 및 100 zM의 ASO로 처리한 샘플에서 더 강했다. 중첩 PCR의 이상한 용량 반응 패턴은 "SCN-ASO 27"에 의한 엑손 스키핑 도중에 축적된 "엑손 인트론 원형 RNA (EIciRNA)"에 의한 전사 상향조절 때문일 것이다 [Nature Struc. Mol. Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)]. 엑손 스키핑의 PCR 산물은 생거 서열분석으로 엑손 4-5의 스키핑으로 확인되었다 (도 31B 참고).
SCN9A 실시예 9. PC3 세포에서 "SCN-ASO 27"에 의해 유도된 엑손 스키핑 (B).
별다른 언급이 없으면 "SCN9A 실시예 8"과 같은 방법으로, PC3 세포에서 "SCN-ASO 27"이 "엑손 4"의 스키핑을 유도하는 정도를 평가하였다. 본 실험에서 PC3 세포는 0 (음성 대조군), 1, 10, 100 및 1,000 aM의 "SCN-ASO 27"로 24시간 동안 처리하였다.
[중첩 PCR 증폭] [SCN-엑손 3/6_순방향: (5' 3') GGACCAAAAATGTC- GAGCCT; 및 SCN-엑손 9n_역방향: (5' 3') GCTAAGAAGGCCCAGCTGAA]의 엑손 3과 엑손 6의 연결 부위 서열ㅇ을 갖는 산물을 선택적으로 증폭시키도록 고안된 프라이머 세트에 대해 중첩 PCR 반응을 수행하였다.
"SCN-엑손 3/6_순방향"의 프라이머는 20-머 프라이머가 엑손 3과 엑손 4의 연결 부위와 17-머의 상보적인 오버랩이 있긴 하지만, 엑손 4-5의 스키핑을 탐색하기 위하여 엑손 3과 엑손 6의 연결 부위를 표적한다. 즉 "SCN-엑손 3n_순방향"은 전체 길이 SCN9A mRNA에서 "엑손 3과 엑손 4의 연결 부위"보다 "엑손 3과 엑손 6의 연결 부위"를 더 선택적으로 인식한다. 프라이머의 서열은 전체 길이 SCN9A mRNA보다 엑손 4-5가 결여된 SCN9A의 스플라이스 변형체를 더 민감하게 탐지하도록 고안되었다. 그러한 엑손 스키핑 프라이머는 대사 안정성이 떨어지는 mRNA 스플라이스 변형체를 탐지하는 데 유용할 것이며, 전체 길이 SCN9A mRNA는 오랜 세월동안 진화를 통해 대사 안정성이 있을 것이다.
중첩 PCR 산물에 대한 전기영동 데이터를 도 31C에 제공하는 데, "SCN-ASO 27"로 처리한 세포에서 엑손 4-5의 스키핑이라고 (생거 서열분석으로 확인) 할 수 있는 강한 PCR 밴드가 생성되었다.
SCN9A 실시예 10. "SCN-ASO 27"로 처리한 PC3 세포에서 원스텝 cDNA 합성에 의한 SCN9A mRNA의 qPCR 평가.
별다른 언급이 없으면 "SCN9A 실시예 2"와 같은 방법으로, PC3 세포에서 "SCN-ASO 27"이 인간 SCN9A mRNA 양의 변화를 유도하는 정도를 SCN9A 중첩 qPCR로 평가하였다.
[ASO 처리] "SCN-ASO 27"을 0 (음성 대조용), 0.1, 1, 또는 10 aM의 농도로 처리한 PC3 세포를 24 시간 동안 배양하였다 (각 농도마다 2개의 배양 접시).
[원스텝 RT-PCR에 의한 cDNA합성] 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [SCN-엑손 2_순방향: (5' 3') CTTTCTCCTTTCAGTCCTCT; 및 SCN-엑손 8/9_역방향: (5' 3') CGTCTGTTGGTAAAGGTTTT]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 원스텝 RT-PCR 키트를 (Invitrogen, 미국) 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50 ℃ 30분 및 94 ℃ 2분에 이어서, 15 주기의 94℃ 30초, 55℃ 30초 및 72℃ 2분.
[중첩 PCR 증폭] 100배 희석한 1 μL의 cDNA를, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [SCN-엑손 3_순방향: (5' 3') TGACCATGAATAACCCAC; 및 SCN-엑손 4_역방향 (2): (5' 3') GCAAGGATTTTTACAAGT]의 엑손 특이성 프라이머 세트에 대해 20 μL 실시간 PCR 반응을 실시하였다: 95℃ 30초에 이어서, 40 주기의 95 ℃ 5초, 60 ℃ 30초. qPCR 반응은 전체 길이 SCN9A mRNA에서 엑손 3과 엑손 4의 연결 부위를 표적하는 [(5' → 3') 5,6-FAM-GGACCAAAA-Zen-ATGTCGAGTACAC-3IABkFQ]의 택만 탐색으로 추적 관찰하였다.
도 32A에 제공된 바와 같이, "SCN-ASO 27"을 처리한 세포에서 전체 길이 SCN9A mRNA의 양이 유의성 (독립표본 T 검정) 있게 약 35~45% 감소하였다.
SCN9A 실시예 11. "SCN-ASO 27"로 처리한 PC3 세포에서 무작위 헥사머를 사용한 원스텝 cDNA 합성에 의한 SCN9A mRNA의 qPCR 평가.
별다른 언급이 없으면 "SCN9A 실시예 10"과 같은 방법으로, PC3 세포에서 "SCN-ASO 27"이 인간 SCN9A mRNA 양의 변화를 유도하는 정도를 SCN9A qPCR로 평가하였다. cDNA는 무작위 헥사머를 사용하여 합성하였고 택만 탐색을 이용하여 SCN9A qPCR 반응을 수행하였다.
도 32B에 제공된 바와 같이, "SCN-ASO 27"을 처리한 세포에서 전체 길이 SCN9A mRNA의 양이 유의성 (독립표본 T 검정) 있게 약 50~60% 감소하였다.
SCN9A 실시예 12. "SCN-ASO 27"로 처리한 SNL-활성화된 쥐의 L5 DRG 세포에서 코로나 분석에 의한 나트륨 전류의 억제 평가.
"SCN-ASO 27"은 인간 SCN9A 프리-mRNA와 완전히 상보적인 14-머 SCN9A ASO인 데, 쥐의 유전체 DNA에서 [NCBI 참고 서열: NC_000002.12] 유래한 쥐 SCN9A 프리-mRNA와는 한 개의 부정합이 있다. "SCN-ASO 27"은 [(5' 3') uuuc"c" uuuag ┃GUACACUU UU]의 20-머 쥐 SCN9A 프리-mRNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 13-머 서열과 상보성 결합을 하며 한 개의 부정합이 있는 데 부정합은 인용 부호로 (" ") 표시한다.
쥐의 척수 신경절 (DRG, dorsal root ganglion) 세포에서 "SCN-ASO 27"이 나트륨 이온 전류를 억제하는 정도를 "코로나 그린"을 이용하여 다음과 같이 평가하였다.
[척수신경 결찰] 척수신경 결찰은 (Spinal Nerve Ligation, SNL) 척수 및 척수 신경절에서 신경병증을 유도하는 데, 신경성 통증의 모델로 널리 사용되고 있다 [Pain vol 50(3), 355-363 (1992)]. 척수 신경의 결찰 방법에 따라 다양한 SNL이 가능하며 척수 신경절에서 신경병증의 정도나 지속 기간도 신경의 결찰 방법에 따라 다양하다 [Pain vol 43(2), 205-218 (1990)]. 척수신경에서 L5와 L6을 묶는 "L5/L6 결찰"은 L5만 묶는 "L5 결찰"에 비해 더 심하고 오래 지속되는 신경병증을 유도한다.
[L5/L6 결찰에 의한 SNL 수술] 시험 시작 전날에 (Day 0) 졸레틸/럼푼으로 마취한 6주령 수컷 SD쥐의 L5와 L6 척수 신경을 (왼쪽) 단단히 묶고 무균 조건에서 근육과 피부를 봉합한다. 쥐들은 4주에 걸친 폰프레이 검사로 인해 때때로 민감해진다.
[척수 신경절 신경 세포의 준비] 31일째에 낮은 폰프레이 수치를 보이는 희생시켜 왼쪽과 (묶은 쪽) 오른쪽 (묶지 않은 쪽) DRG 모두를 추출하고 추출 직후에 DRG들을 0.5 mL PBS에 담갔다. DRG 세포는 문헌에 공개된 방법으로 준비하였다 [Methods Mol Biol. vol 846, 179-187 (2012); PLOS One vol 8(4); e60558 (2013)].
①DRG를 0.2 mL 0.125% 콜라게나제 (콜라게나제 IV형, Cat. No. C5138-100MG, 시그마) HBSS 용액이 (Hank의 안정된 소금물, Cat. Number 14025-092, Life Technologies) 들어있는 1.5 mL e-튜브에 담그고, 가위로 잘게 자른 다음 37oC, 5% CO2, 그리고 95% RH (상대 습도) 조건의 CO2 배양기에서 20분간 배양한다; ② 50 μL 0.25% 트립신/EDTA를 e-튜브에 가하고 배양기에 10분간 배양한다; ③ e-튜브에 1 mL DMEM 배지를 넣고 600g에 5분동안 원심침전시킨다; ④ 얻어진 펠릿을 2X B-27 (B-27® 무혈청 보충물, Cat. No. 17504-044, Gibco), 1X 페니실린-스트렙토마이신, 그리고 1X L-글루타민이 보충된 4 mL Neurobasal-A 배양액에 (Neurobasal® 배양액, Cat. No. 21103-049, Gibco) 부유시킨 다음, 1 mL 세포 현탁액을 35 mm 배양 접시에 놓인 라미닌 (Cat. No. GG-25-1.5-laminin, Neuvitro)으로 코팅된 덮개 유리에 조심스럽게 살포하였다; ⑤ 살포 1일 후에 1 mL의 새 Neurobasal-A 배양액을 배양 접시에 가한다; ⑥ 살포 2일 후에, DRG 신경 세포 이외의 세포들의 성장을 선택적으로 억제하기 위하여 1 μM Ara-C가 (Cat. No. C1768-100MG, 시그마) 보충된 2 mL의 새 Neurobasal-A 배양액으로 배양액을 교체한다; ⑦ 살포 4일 후에, 1 μM Ara-C가 보충된 2 mL의 새 Neurobasal-A 배양액으로 배양액을 다시 교체한다; ⑧ 살포 5일 혹은 6일 후에, DRG 신경 세포를 "SCN-ASO27"로 처리한다.
[ASO 처리 및 코로나 분석] L5/L6 결찰을 한 혹은 L5/L6 결찰을 하지 않은 L5 DRG 신경 세포에 대해 0 (음성 대조용), 100 혹은 1,000 zM의 "SCN-ASO 27"을 처리하였다. 30 시간 후에, 세포를 2 mL의 HBSS로 씻은 다음 2 mL의 새 HBSS를 가하였다. 37oC에서 세포를 5 μM "코로나 그린"으로 처리하고 30분 후에 세포를 2 mL의 HBSS로 두 번 씻은 다음 2 mL의 새 HBSS를 가하였다. 세포의 녹색 형광 영상을 계속 촬영하기 위하여 CCD 카메라가 구비된 형광 현미경 위에 배양접시를 올려 놓았다. 세포를 10 mM 소금물로 급속히 처리하고, 한 프레임당 4~5 개의 세포가 들어간 세포의 형광 영상의 변화를 300 초간 촬영하였다. 각각 세포의 형광강도는 초 단위로 기록하였고, ImageJ 프로그램을 (버전 1.50i, NIH) 이용하여 평균을 내었으며, L5/L6 결찰을 한 혹은 L5/L6 결찰을 하지 않은 세포에 대한 평균값은 도 33A와 도 33B에 각각 제공된다. 형광강도 기록의 평균값은 0 (음성 대조용), 100, 그리고 1,000 zM의 "SCN-ASO 27"을 처리한 각 세포 내부의 나트륨 농도로 간주하였다.
[코로나 분석 결과] L5/L6 결찰로 (도 33A 참고) 자극이 가해진 세포에 대해 100 zM 혹은 1 aM의 "SCN-ASO 27"을 30시간 처리했을 때, 150초 후 시점에서 세포의 평균 형광강도가 유의성 (독립표본 T 검정) 있게 80~85% 감소했다.
L5/L6 결찰이 없는 (도 33B 참고) 세포에 대해 1 aM의 "SCN-ASO 27"을 30시간 처리했을 때, 형광강도가 약 50% 감소했다. 자극이 가해지지 않은 세포에 대해 100 zM의 "SCN-ASO 27"을 처리했을 때, 형광강도의 감소는 없었다. L5/L6 결찰이 없는 세포의 형광강도는 L5/L6 결찰로 자극이 가해진 세포에 비해 상당히 작은 데, 이는 L5/L6 결찰이 Nav1.7 나트륨 채널 활성의 현저한 상향조절을 유도한다는 것을 의미한다.
신경병적인 자극이 없는 DRG 신경 세포는 Nav1.7, Nav1.8, Nav1.2 등을 포함한 다양한 아형의 VGSC를 발현한다고 알려져 있다. 자극이 없는 경우의 Nav1.7 아형은 DRG 신경 세포의 전체 나트륨 전류에서 제한된 비중만을 차지한다 [Nature Comm. vol 3, Article Number 791: DOI:10.1038/ncomms1795 (2012)]. L5/L6 결찰이 없는 DRG 신경 세포에서는 Nav1.7 아형 나트륨 전류의 제한된 비중을 나타낸다.
반면에 신경 세포는 지속적인 신경병증이 있을 경우 Nav1.7 발현을 상향조절한다고 알려져 있다 [J Biol Chem. vol 279(28), 29341-29350 (2004); J Neurosci. vol 28(26), 6652-6658 (2008)]. L5/L6 결찰로 자극이 가해진 신경 세포에 대해 100 zM 혹은 1 aM의 "SCN-ASO 27"을 처리했을 때, 나트륨 전류가 80~85% 억제되었다. L5/L6 결찰을 한 DRG 세포에서 "SCN-ASO 27"에 의한 나트륨 전류의 강한 억제는 신경 세포에서 만성 신경병증에 의한 Nav1.7의 상향조절과 잘 상응한다.
SCN9A 실시예 13. L5 DRG 신경 세포에서 "SCN-ASO 30"에 의한 Nav1.7 단백질 발현의 억제 평가.
"SCN-ASO 27"이 인간 SCN9A 프리-mRNA에 완전히 상보적인 14-머 ASO인 반면, "SCN-ASO 30"은 쥐 SCN9A 프리-mRNA에 완전히 상보적인 14-머 ASO이다. "SCN-ASO 30"은 "SCN-ASO 27"와 C-말단 끝 위치에 한 개의 부정합이 있다. "SCN-ASO 27"의 인간 SCN9A 프리-mRNA에 대한 연구를 위해 "SCN-ASO 30"은 쥐 SCN9A 프리-mRNA에 대해 좋은 모델 ASO이다.
쥐의 DRG 신경 세포에서 "SCN-ASO 30"이 Nav1.7 단백질 발현을 억제하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
[DRG 신경 세포의 준비] 7주령 수컷 SD쥐에 대해 강하게 L5/L6 결찰을 하였다. 7일 후에 4마리의 쥐를 졸레틸/럼푼으로 마취하고 묶은 쪽의 L5 DRG를 추출하였다. DRG를 모은 다음 "SCN9A 실시예 12"와 같은 방법으로 DRG 신경 세포를 준비하였다.
[ASO 처리 및 코로나 분석] DRG 신경 세포에 대해 0 (음성 대조용), 10, 100 혹은 1,000 zM의 "SCN-ASO 30"을 24시간 동안 처리한 다음, Nav1.7 단백질의 C-말단을 탐지하는 Nav1.7 항체에 (Cat. No. ab85015, Abcam) 대해 웨스턴 블럿을 하기 위해 용해를 한다. β-액틴은 대조용으로 탐색하였다.
[Nav1.7 발현의 억제] 0 (음성 대조용), 10, 100 혹은 1,000 zM의 "SCN-ASO 30"을 처리한 DRG 신경 세포에서 얻은 웨스턴 블럿 데이터를 도 34A에 제공한다. 모든 용해물들이 170K에서 강한 밴드를 보였는 데 전체 길이 Nav1.7 단백질의 조각이나 대사체로 예상된다. 전체 길이 Nav1.7 단백질 밴드는 음성 대조군과 10 zM "SCN-ASO 30"을 처리한 용해물에서만 220~240K에서 탐지되었다. 즉 100 zM 및 1,000 zM "SCN-ASO 30"을 24시간 처리한 쥐 DRG 신경 세포에서 Nav1.7 발현이 현저하게 억제되었다.
SCN9A 실시예 14. 쥐의 L5 DRG 세포에서 "SCN-ASO 30"에 의한 나트륨 전류의 억제 평가.
L5/L6 결찰로 자극된 쥐의 L5 DRG 신경 세포에서 "SCN-ASO 30"이 나트륨 전류를 억제하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
[DRG 신경 세포의 준비] 6주령 수컷 SD쥐에 대해 강하게 L5/L6 결찰을 하였다. 7일 후에 4마리의 쥐를 졸레틸/럼푼으로 마취하고 묶은 쪽의 L5 DRG를 추출하였다. L5 DRG 신경 세포는 다음과 같이 준비하였다. ① DRG를 0.2 mL 0.125% 콜라게나제 HBSS 용액이 들어있는 1.5 mL e-튜브에 담그고, 가위로 잘게 자른 다음 37oC, 5% CO2, 그리고 95% RH 조건의 CO2 배양기에서 20분간 배양한다; ② 50 μL 0.25% 트립신/EDTA를 e-튜브에 가하고 배양기에 10분간 배양한다; ③ e-튜브에 1 mL DMEM 배지를 넣고 600g에 5분동안 원심침전시킨다; ④ 얻어진 펠릿을 2X B-27 (B-27® 무혈청 보충물, Cat. No. 17504-044, Gibco), 1X 페니실린-스트렙토마이신, 그리고 1X L-글루타민이 보충된 4 mL Neurobasal-A 배양액에 (Neurobasal® 배양액, Cat. No. 21103-049, Gibco) 부유시킨다; ⑤ DRG 세포의 현탁액을 약 15 mL Neurobasal-A 배양액이 담겨있는 15 mL 팔콘 튜브에 옮긴 다음 봉해진 상태로 약 1시간 동안 방치한다; ⑥ 0.5 mL 세포 현탁액을 24-웰플레이트 배양 접시의 한 칸에 놓인 라미닌으로 코팅된 덮개 유리에 조심스럽게 살포하였다; ⑦ 배양 판위에 살포된 세포를 덮개 유리에 달라붙게 하기 위해 37oC의 CO2 배양기에서 2시간 동안 배양하였고, 배양기 안에서 0 (음성 대조용) 혹은 100 zM의 "SCN-ASO 30"를 4시간 동안 처리하였다; ⑧ DRG 신경 세포에 대해 나트륨 패치 클램프 기기에서 (Axopatch 200B Amplifier, Axon Instruments) 수동 패치 클램프 분석을 실시하여 나트륨 전류 측정을 하였다.
[패치 클램프 분석 결과] 세포 크기에 대해 정규화된 나트륨 전류 데이터를 도 34B에 제공한다. 100 zM의 "SCN-ASO 30"를 4시간 동안 처리한 결과, 테트로도톡신에 감응하는 작은 크기의 DRG 신경 세포에서 나트륨 전류는 유의성 (p<0.01 독립표본 T 검정) 있게 약 90% 감소하였다 (군당 4개 세포).
SCN9A 실시예 15. "SCN-ASO 30"으로 처리한 쥐 DRG 세포에서 원스텝 cDNA 합성에 의한 SCN9A mRNA의 qPCR 평가.
쥐 DRG 세포에서 "SCN-ASO 30"이 SCN9A mRNA 발현을 억제하는 정도를 SCN9A 중첩 qPCR로 평가하였다.
[L5 DRG 세포 준비] 4주령 수컷 SD쥐를 졸레틸/럼푼으로 마취하고 L5 DRG를 추출하였다. DRG 샘플을 모아서 "SCN9A 실시예 12"와 같은 방법으로 L5 DRG 세포를 준비하였다.
[ASO 처리] 쥐 DRG 세포를 0 (음성 대조용), 10, 30, 100, 300, 또는 1,000 zM 농도의 "SCN-ASO 30"로 처리하였다 (각 농도마다 1개의 배양 접시).
[RNA 추출 및 원스텝 PCR에 의한 cDNA합성] 24시간 후에 전체 RNA를 "유니버셜 RNA 익스트랙션 키트 (Universal RNA Extraction Kit)" (Cat. Number 9767, 타카라(Takara))를 사용하여 그 제조사의 설명에 따라 추출하였다. 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [SCN-엑손 2(3)_순방향: (5' 3') CAATCTTCCGTTTCAACGCC; 및 SCN-엑손 10_역방향: (5' 3') ACCACA- GCCAGGATCAAGTT]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 원스텝 RT-PCR 키트를 (Invitrogen, 미국) 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50 ℃ 30분 및 94 ℃ 2분에 이어서, 15 주기의 94℃ 30초, 55℃ 30초 및 72℃ 2분.
[중첩 PCR 증폭] 100배 희석한 1 μL의 cDNA를 (농도당 2개), 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 SCN9A 엑손 3과 엑손 4의 연결 부위를 표적하는 택만 탐색을 (Cat. No. Rn01514993_mH, ThermoFisher) 이용하여 20 μL 실시간 PCR 반응을 실시하였다: 95℃ 30초에 이어서, 40 주기의 95 ℃ 5초, 60 ℃ 30초.
도 35A에 제공된 qPCR 데이터와 같이, ASO 농도당 한 개의 배양 접시를 사용하긴 했지만 "SCN-ASO 30"을 처리한 세포에서 전체 길이 SCN9A mRNA의 발현량이 유의성 (독립표본 T 검정) 있게 약 45~60% 감소하였다.
SCN9A 실시예 16. "SCN-ASO 30"으로 처리한 쥐 DRG 세포에서 무작위 헥사머를 사용한 원스텝 cDNA 합성에 의한 SCN9A mRNA의 qPCR 평가.
쥐 L5 DRG 세포에서 "SCN-ASO 30"이 SCN9A mRNA의 발현을 억제하는 정도를 SCN9A 중첩 qPCR로 평가하였다. 전체 RNA는 "SCN9A 실시예 15"와 같은 방법으로 준비하였고 cDNA는 무작위 헥사머를 사용하여 합성하였다. 100배 희석한 1 μL의 cDNA를 (농도당 2개), 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 SCN9A 엑손 3과 엑손 4의 연결 부위를 표적하는 택만 탐색을 이용하여 20 μL 실시간 PCR 반응을 실시하였다: 95℃ 30초에 이어서, 40 주기의 95 ℃ 5초, 60 ℃ 30초.
cDNA 용액은 또한 GAPDH mRNA의 qPCR 증폭에도 사용되었다. SCN9A mRNA의 Ct 값은 GAPDH mRNA의 Ct 값에 대해 정규화되었다.
GAPDH에 대해 정규화된 SCN9A qPCR 데이터가 도 35B에 제공된다. "SCN-ASO 30"을 처리한 세포에서 전체 길이 SCN9A mRNA의 발현량이 유의성 (독립표본 T 검정) 있게 약 45~75% 감소하였다.
SCN9A 실시예 17. 당뇨병 유발 말초 신경병성 통증을 가진 쥐에서 SCN9A ASO에 의한 이질통 치료.
SCN9A 유전자는 VGSC 아형 Nav1.7의 α-서브유닛을 암호화한다. 다른 감각 기능은 정상이지만 심한 통증은 느끼지 못하는 소수의 사람들이 있다. 그 사람들은 기능을 못하는 Nav1.7 아형을 암호화하는 변이된 SCN9A 유전자를 갖고 있는 [Nature vol 444, 894-898 (2006)] 데 이를 "SCN9A 이온통로병증"이라 한다. 인간 SCN9A 이온통로병증의 행동적인 표현형은 SCN9A 유전자 결여 쥐에서 잘 재현되었다 [PLOS One 9(9): e105895 (2014)]. 따라서 화학식 I의 SCN9A ASO는 Nav1.7 상향조절을 수반하는 동물 통증 모델에서 진통 효과를 나타낼 것이다.
당뇨병 유발 말초 신경병성 통증을 (DPNP) 가진 쥐에서 "SCN-ASO 7", "SCN-ASO 8", "SCN-ASO 21", "SCN-ASO 35", "SCN-ASO 36", 그리고 "SCN-ASO 37"가 이질통을 치료하는 정도를 평가하였다. 이 실시예에서는 다섯 개의 스플라이스 위치를 표적하는 여섯 개의 SCN9A ASO가 쥐에서 당뇨병성 신경병증에 의해 유도된 이질통을 치료하는 정도를 평가하였다.
[DPNP 유도와 군 분리] 실험 전날 (Day 0) 60 mg/Kg을 쥐에게 복강 내로 투여하여 당뇨병을 유발하였다. 10일째에 DPNP 쥐를 무작위로 음성 대조군 (PBS만), "SCN-ASO 7" 100 pmole/Kg, "SCN-ASO 8" 100 pmole/Kg, "SCN-ASO 21" 100 pmole/Kg, "SCN-ASO 35" 100 pmole/Kg, "SCN-ASO 36" 100 pmole/Kg, 그리고 "SCN-ASO 37" 100 pmole/Kg의 여섯 군으로 분리하였다. 10일째에 각 동물들의 폰프레이 측정치를 기준으로 군 분리를 하였다 (군당 8 내지 9 마리). 이질통은 미세섬유를 (Touch Test®) 이용하여 "업&다운" 방법으로 평가하였다 [J Neurosci . Methods vol 53(1), 55-63 (1994)].
[ASO 투여와 폰프레이 측정] ASO 주사액은 SCN9A ASO 100nM PBS 용액의 진한 저장 수용액을 차례로 묽혀 준비하였다. 1 mL/Kg의 ASO를 11, 13, 15, 17, 그리고 19일째에 동물에게 피하 투여하였고 폰 프레이 측정은 투여 일 투여 후 2시간 후에 실시하였다. 마지막 투여 후 치료 활성의 지속 기간을 평가하기 위하여 21 및 23일째에 추가로 폰 프레이 측정을 실시하였다. 폰 프레이 측정치는 측정된 날 통계적 유의성을 위하여 음성 대조군에 대해 독립표본 T 검정으로 (PBS만) 평가하였다.
[치료 활성] 관찰된 폰프레이 측정치는 도 36에 요약된다. "SCN-ASO 37"이 치료 활성을 확실히 보여주기는 했지만 (19일째 p-값=0.057), "SCN-ASO 36" 및 "SCN-ASO 37"을 제외한 모든 ASO에 의해서 이질통은 현저하게 경감되었다. 투여가 반복될수록 치료 활성이 점차 증가하는 경향이었다. 폰프레이 측정치에 기초한 19일째 최고의 치료 효과는 "SCN-ASO 7", "SCN-ASO 8", "SCN-ASO 21", "SCN-ASO 35", "SCN-ASO 36", 그리고 "SCN-ASO 37"에 대하여 각각 약 76% (유의함), 61% (유의함), 93% (유의함), 52% (유의함), 0% and 22% (유의하지 않음, p-값 = 0.05X) 이었다.
"SCN-ASO 7", "SCN-ASO 8", "SCN-ASO 21", 그리고 "SCN-ASO 35"는 표적 인트론과 5-머의 상보적인 오버랩이 있는 반면, "SCN-ASO 36"와 "SCN-ASO 37"는 표적 인트론과 각각 4-머 및 3-머의 상보적인 오버랩이 있다. 치료 활성에 영향을 주는 많은 요인들이 있지만, 표적 인트론과의 상보적인 오버랩의 정도가 치료 활성에 영향을 주는 것으로 보인다.
이 실시예에서는, 다섯 개의 스플라이스 위치 중에서 4 군데를 표적하는 SCN9A ASO에서 생체내 안티센스 활성이 관찰되었다. 생체내 치료 활성이 세포 안티센스 활성, 표적 조직에서의 약물의 양, 그리고 약동력학적 반감기 등을 포함한 많은 요인에 달려있다는 것을 고려하면, 80%의 적중 확률은 매우 높은 것으로 생각된다. 즉 화학식 I의 화합물은 표적 유전자의 발현을 예측하는대로 조절한다.
"SCN-ASO 7"의 분자량을 (표 4 참고) 고려하면, 100 pmole/kg은 치료 용량 약 0.53 μg/Kg이다. "SCN-ASO 7"의 아토몰 이하에서의 생체외 액손 스키핑 효능 때문에, 당뇨 신경병증을 가진 쥐에서 약 0.53 μg/Kg의 강력한 생체내 치료 효능이 나타난다고 생각된다. 더욱 놀라운 것은, ASO가 올리고뉴클레오타이드 "그 자체"로 투여?다는 것이다. 이렇게 강력한 생체내 치료 효능은 DNA, RNA, PTO, 2'-OMe PTO, 2'-OMe RNA, 2'-OMOE RNA, LNA, PMO, 그리고 PNA 등을 포함한 다른 종류의 올리고뉴클레오타이드에서는 실현된 적이 없다.
DMD ASO들의 생체내와 탈체 활성의 예
뒤쉔 근육 영양장애는 (DMD, Duchenne muscular dystrophy) 근육 퇴화를 수반하는 치명적인 단성의 희귀 질병이다. DMD 환자는 점 돌연변이 혹은 엑손의 결여에서 생기는 미성숙 종결 코돈으로 (PTC, premature termination codon) 인하여 전체 길이의 디스트로핀 단백질을 암호화하지 않는다.
mdx 쥐는 (C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J, Jackson Lab) 디스트로핀 유전자의 엑손 23에, PTC를 생성하는 점 돌연변이가 있는 돌연변이 쥐이다. mdx 쥐는 C-말단 부분이 없는 잘려진 형태의 디스트로핀을 암호화한다. C-말단 부분은 세포외 기질과 (ECM, extracelluar matrix) 결합하기 때문에, 잘려진 형태는 근섬유를 ECM에 단단히 연결하는 주어진 역할을 못하게 된다. 결과적으로, mdx 쥐는 나이가 들어감에 따라 근육의 온전함과 강도를 잃게 된다.
mdx 쥐는 인간 DMD의 동물 모델로 널리 사용되고 있으며, 엑손 23의 스키핑을 통하여 PTC를 제거하기 위한 쥐 디스트로핀 엑손 23을 표적하는 디스트로핀 ASO가 연구되고 있다.
쥐 디스트로핀 프리-mRNA에서 엑손 23의 3' 혹은 5' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 화학식 I의 PNA 유도체가 mdx 쥐에서 디스트로핀 엑손 23의 스키핑을 유도하는 정도를 평가하였다. 화학식 I의 화합물의 예로서 디스트로핀 ASO들이 엑손 스키핑을 유도한다는 것을 예시하기 위하여 생물학적 예들이 제공되며, 본 발명의 범위를 디스트로핀 ASO들로 한정하기 위함이 아니다.
DMD 실시예 1. mdx 쥐에서 "DMD-ASO 1"과 "DMD-ASO 4"에 의해 유도된 엑손 스키핑 (중첩 PCR 방법 A).
표 7에 명시된 "DMD-ASO 1"은 쥐 디스트로핀 프리-mRNA 중의 인트론 22 및 엑손 23의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치에 완전히 상보적인 13-머 ASO이다. "DMD-ASO 1"은 [(5' 3') ua auuuugag ┃ GCUCU GCAAAGTTCT]의 25-머 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 13-머 서열과 상보성 결합을 한다. "DMD-ASO 1"은 인트론 22와 8-머 결합을 하고 엑손 23과 5-머 결합을 한다.
표 7에 명시된 "DMD-ASO 4"는 쥐 디스트로핀 프리-mRNA 중의 인트론 22 및 엑손 23의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치에 완전히 상보적인 17-머 ASO이다. "DMD-ASO 4"는 [(5' 3') uaauu uugag ┃ GCUCUGCAAAGT TCT]의 25-머 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 17-머 서열과 상보성 결합을 한다. "DMD-ASO 4"는 인트론 22와 5-머 결합을 하고 엑손 23과 12-머 결합을 한다.
mdx 쥐의 근육에서, 피하 투여한 "DMD-ASO 1"과 "DMD-ASO 4"가 엑손 스키핑을 유도하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
[ASO 투여 및 근육 조직 추출] ASO 주사액은 "DMD-ASO 1" 혹은 "DMD-ASO 4" 진한 저장 수용액을 PBS로 묽혀 500nM로 준비하였다. PBS만, "DMD-ASO 1", 혹은 "DMD-ASO 4" 2 mL/Kg을 3일 동안 하루에 2번 (BID) 수컷 mdx 쥐에게 피하 투여하였다. 마지막 투여 다음 날 졸레틸/럼푼으로 마취하고 심장, 횡격막, 비복근, 사두근, 그리고 삼두근을 포함한 근육 조직들을 추출하였다.
[RNA 추출] 근육 샘플은 얼음에 보관된 튜브에서 갈아서 균질화한 다음, 약 100 mg의 근육 조직당 1 mL의 트리졸 시약을 (trizol reagent, Invitrogen) 사용하여 전체 RNA를 추출하였다.
[원스텝 RT-PCR에 의한 cDNA합성] 500 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [DMD-엑손 21_순방향: (5' 3') CAAAGAGAAAGAGCTACAGACA; 및 DMD-엑손 25_역방향: (5' 3') CTGGGCTGAATTGTTTGAAT]의 엑손 특이적 프라이머 세트에 대해 플래티늄 (platinum®) Taq 폴리머라제 (Cat. No. 10928-042, 인비트로젠 (Invitrogen))를 갖는 슈퍼스크립트 (Super Script®) 원스텝 (One-Step) RT-PCR 키트를 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50 ℃ 30분 및 94 ℃ 2분에 이어서, 40 주기의 94℃ 30초, 58℃ 1분 및 72℃ 2분.
[중첩 PCR 증폭] 1 μL의 cDNA를, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [DMD-엑손 22n_순방향: (5' 3') ATCCAGCAGTCAGAAAGCAAA; 및 DMD-엑손 25n_역방향: (5' 3') ACTAAAAGTCTGCATTGT]의 프라이머 세트에 대해 20 μL 중첩 PCR 반응 (Cat. No. K2612, 바이오니어)에서 더 증폭시켰다: 95℃ 5분에 이어서, 39 주기의 95 ℃ 30초, 50 ℃ 40초 및 72 ℃ 50초.
[엑손 스키핑 생성물의 확인] 도 37A에 제공된 바와 같이 2% 아가로스 젤 상에서 PCR 산물에 대해 전기영동 분리를 수행하였다. "DMD-ASO 1" 및 "DMD-ASO 4"를 처리한 동물에서만 엑손 23의 스키핑이 발견되었다. 사두근과 비복근에서만 엑손 23의 스키핑이 발견되었지만, "DMD-ASO 1"이 "DMD-ASO 4"보다 효과적으로 보인다.
음성 대조군 (ASO 처리하지 않은 군)의 사두근에서 엑손 22-23의 스키핑이라고 할당된 PCR 밴드가 생성되었다. 엑손 22-23의 스키핑은 구조 이동을 (frame shift) 야기하며 엑손 22-23이 결여된 디스트로핀 mRNA 스플라이스 변형체는 C-말단 부분이 없는 잘려진 디스트로핀을 암호화하게 된다.
타겟 크기의 밴드는 모아서 생거 서열분석으로 분석하였고 "DMD-ASO 1" 및 "DMD-ASO 4"에 의한 엑손 23의 스키핑을 확인하였다 (도 37B 참고). 엑손 22-23 스키핑에 대한 서열분석 데이터가 제공되지는 않았지만, 전체 길이 (스키핑이 없음) 및 엑손 22-23 스키핑의 PCR 밴드는 서열분석으로 확인되었다.
DMD 실시예 2. mdx 쥐에서 "DMD-ASO 1"과 "DMD-ASO 4"에 의해 유도된 엑손 스키핑 (중첩 PCR 방법 B).
"DMD 실시예 1"에서 얻은 RNA 샘플을 [DMD-엑손 20_순방향: (5' 3') CAGAATTCTGCCAATTGCTGAG; 및 DMD-엑손 26_역방향: (5' 3') TTCTTCAGCTT-GTGTCATCC]의 엑손 특이적 프라이머 세트에 대해 원스텝 cDNA 합성을 하였다. cDNA 샘플은 [DMD-엑손 20n_순방향: (5' 3') CCCAGTCTACCACCCTATCAGAGC; 및 DMD-엑손 26n_역방향: (5' 3') CCTGCCTTTAAGGCTTCCTT]의 엑손 특이적 프라이머 세트에 대해 중첩 PCR 반응으로 더 증폭시켰다.
중첩 RT-PCR의 결과는 도 38A과 도 38B에 요약하여 제공된다. ASO를 처리한 동물들에서 (군당 2마리) 엑손 21-23 및 엑손 22-25의 스키핑이 발견되었다. 엑손 21-23의 스키핑에서는 구조 이동이 일어나지 않지만, 엑손 22-25의 스키핑에서는 구조 이동이 일어난다. 엑손 21-23 스키핑의 PCR 밴드는 생거 서열분석으로 명백하게 확인되었다 (도 38B 참고).
엑손 스키핑의 결과들은 위에서 제공된 PCR 방법에 따라 변했으며, 따라서 엑손 스키핑의 결과들은 신중하게 해석해야 한다.
DMD 실시예 3. mdx 쥐에서 "DMD-ASO 1"에 의해 유도된 엑손 스키핑 (중첩 PCR 방법 A).
0 (음성 대조용) 혹은 10 pmole/Kg의 "DMD-ASO 1"를 5일 동안 하루에 2번 mdx 쥐에 피하 투여하였다 (군당 2마리). 마지막 투여 다음 날 졸레틸/럼푼으로 마취하고 조직들을 추출하였다. "DMD 실시예 1"의 중첩 RT-PCR 방법에 따라, 삼두근 샘플에서 엑손 23의 스키핑을 평가하였다.
중첩 RT-PCR 결과는 도 38C에 요약된다. 음성 대조군의 한 마리 동물에서 엑손 22-23 스키핑의 PCR 밴드가 생성되었지만, 엑손 22-23이 결여된 mRNA 스플라이스 변형체는 구조 이동을 한다. ASO를 처리한 군의 한 마리 동물에서만 엑손 23 스키핑의 PCR 밴드가 발견되었다. 즉 DMD-ASO 1은 고안한 대로 엑손 23의 스키핑을 유도한다.
DMD 실시예 4. "DMD-ASO 1"를 피하 투여한 mdx 쥐에서 로타로드 실험에 의한 근육 기능의 향상 평가.
mdx 쥐에서 엑손 23의 스키핑은 엑손 23의 PTC를 제거해서, 엑손 23이 결여된 mRNA 스플라이스 변형체는 구조 이동을 하지 않게 되고 그에 따라 ECM과 결합하는 C-말단 부분이 존재하는 변형 단백질을 암호화한다. 즉 전체 길이의 변형 디스트로핀 단백질은 전체 길이의 원래 야생형 (wild type) 디스트로핀의 생리적인 기능을 부분적으로 회복한다.
엑손 스키핑의 가능성을 고려하여, mdx 쥐에서 "DMD-ASO 1"이 근육 기능을 향상하는 정도를 로타로드 실험으로 (rotarod test) 평가하였다.
[군 분리] 6주령 수컷 mdx 쥐를 2주 동안 로타로드 실험에 대해 훈련시킨 다음, 실험 시작 전날의 로타로드 실험 수치에 기초하여 0 (음성 대조용), 100, 그리고 1,000 pmole/Kg "DMD-ASO 1"의 세 군으로 무작위 분리하였다 (군당 10마리).
[ASO 투여] ASO를 차례로 희석하여 20 및 200 nM의 PBS 주사 용액을 준비하였다. 0 (PBS, 음성 대조용), 20 nM "DMD-ASO 1" (100 pmole/Kg), 혹은 200 nM "DMD-ASO 1" (1,000 pmole/Kg) 5 mL/Kg를 21일 동안 하루에 3번씩 피하 투여하였다.
[로타로드 실험 및 통계 분석] 로타로드 기기에서 (Model #47650, Ugo Basile) 60초간 4 rpm에서 45 rpm의 가속 조건으로 로타로드 실험을 실시하였다. 각 동물에 대해 떨어지기 전 시간을 (즉 동물이 로타로드에 남아있는 시간) 측정하였다. 음성 대조군에 대한 독립표본 T 검정으로 통계적 유의성을 평가하였다.
[근육 기능의 향상] 도 39A에 각 군의 로타로드 측정치를 요약한다. 음성 대조군의 로타로드 측정치는 (떨어지기 전 시간) 평균 약 70 내지 120초로 부진하였다. 반면에, 1,000 pmole/Kg군의 근육 기능은 12일까지 점진적으로 그리고 현저하게 향상되었고 그 뒤에도 로타로드 측정치 평균 210 내지 230초로 안정적으로 유지되었다. 1,000 pmole/Kg군의 근육 기능은 12, 14, 그리고 19일째에 현저하게 향상되었으며, 100 pmole/Kg군의 근육 기능은 향상에 대한 강한 경향이 있기는 하지만 현저하지는 않았다.
DMD 실시예 5. "DMD-ASO 1"를 만성 투여한 mdx 쥐에서 그립 실험 및 근육 보전도에 의한 근육 기능의 향상 평가.
"DMD-ASO 1"를 만성 투여한 mdx 쥐에서 그립 실험으로 근육 기능이 향상되는 정도를, 면역염색화학으로 (IHC) 엑손 스키핑을 유도되는 정도와 전체 길이 디스트로핀 발현을 상향조절되는 정도를, H&E 염색법에 의한 조직병리학으로 근육이 보전되는 정도를 아래와 같이 평가하였다.
[군 분리 및 ASO 투여] 7주령 수컷 mdx 쥐를 2주 동안 로타로드 실험에 대해 훈련시킨 다음, 그립 실험의 그립 강도 측정치에 기초하여 0 (음성 대조용), 10, 50, 그리고 200 pmole/Kg "DMD-ASO 1"의 네 군으로 무작위 분리하였다 (군당 12마리). 전체 길이 디스트로핀 발현량을 가진 야생형 음성 대조군의 12마리의 7주령 C57BL/6 쥐가 추가 군으로 포함되었다.
43주차에 희생시킬 때까지 1주일에 두 번 "DMD-ASO 1" 50 및 200 pmole/Kg PBS 용액을 피하 투여하였다. 반면에, 10 pmole/Kg군은 8주까지는 주당 2회 그리고 그 후에는 주당 3회로 늘려서 피하 투여하였다.
[그립 실험에 의한 근육 기능 평가] 문헌에 따라 그립 강도 측정기에서 (Cat. Number 47,200, Ugo Basile) 그립 강도를 매주 평가하였다 [J. Appl. Physiol. vol 106(4), 1311-1324 (2009)]. 군별 그립 강도 측정치는 음성 대조군에 대한 독립표본 T 검정으로 통계적 유의성을 평가하였다.
처음부터 30주까지의 관찰된 군별 그립 강도 측정치를 도 39B에 요약한다. 첫 번째 투여 후 11주 동안에는 ASO 투여군과 음성 대조군 사이에 그립 강도에서 큰 변화가 없었다. mdx 음성 대조군의 그립 강도는 3주째에 약 107g으로 최고치를 기록하고, 몇 주간 점차 감소하여 약 75에서 95g으로 상대적으로 안정화되었다. ASO 투여군의 그립 강도는 10주째 근처부터 점차 향상되기 시작하여 mdx 음성 대조군에 비해 30~50% 증가하였다.
군당 2~3마리를 무작위로 선택하여 7, 13, 21, 그리고 30주차에 IHC와 중첩 PCR을 위해 희생시켰다.
[전체 길이 디스트로핀에 대한 골격근의 IHC 평가] 7, 13, 그리고 21주차에 군당 2마리를 무작위로 선택하여 희생시키고 근육 조직을 추출하였다. 30주차에는 군당 3마리를 희생시켰다.
7주차에 취한 근육 조직은 전체 길이 디스트로핀에 대해 동결 절단에 (cryosection) 의한 IHC를 실시하였다. 13, 21 그리고 30주차에 취한 근육 조직은 파라핀 블록으로 면역 염색하였다. 파라핀 블록에 의한 IHC가 동결 절단에 의한 IHC보다 좋은 화질을 생성하였다.
빨간 형광 표지를 위해 100배 묽힌 쥐 디스트로핀의 C-말단을 표적하는 1차 항체 (Cat. Number sc-816, Santa Cruz), 200배 묽힌 2차 안티-IgG 항체 (Cat Number BA-1100, Vector), 그리고 200배 묽힌 Dylight 594-스트렙타비딘을 (Cat Number SA-5594, Vector, CA, USA) 차례로 사용하여 근육 샘플을 면역염색하였다. IHC 이미지는 자이스 슬라이드 스캐너나 (13, 21, 그리고 30주차) 올림푸스 형광 현미경에 (7주차) 포착되었다. DAPI 염색은 추가로 진행되었다.
도 40은 30주차에 추출된 근육 샘플에 대한 군별 전체 길이 디스트로핀의 대표적인 IHC 이미지이다. 야생형 음성 대조군은 근섬유 다발의 자연적인 구조를 반영하여 독특하게 각진 패턴의 디스트로핀 발현을 생성하였다. mdx 쥐의 음성 대조군에서는 전체 길이 디스트로핀의 염색이 많지 않았던 반면에 200 pmole/Kg을 처리한 군의 골격근에서는 강하게 각진 패턴의 디스트로핀 염색이 관찰되었다. 야생형 쥐에 비해 mdx 쥐의 근섬유 다발 구조가 모호하기는 하지만, ASO를 처리한 동물에서는 전체 길이 디스트로핀의 발현이 현저하게 증가하였다.
"ImageJ" 프로그램을 (NIH) 사용하여, 각 IHC 이미지의 빨간 형광 강도를 디지털로 측정하여 전체 길이 디스트로핀의 발현을 정량화하였다. 야생형 음성 대조군에 대한 통계적 평가를 위해 각 형광 측정치는 군별 및 근육 종류별로 합쳐졌다.
표 41은 mdx 쥐에서 전체 길이 디스트로핀 단백질의 상대적인 발현량의 변화를 요약한다. 전체 길이 디스트로핀의 발현은 높은 ASO 투여량 및 긴 투여 기간에서 더 증가하는 경향이 있다. 30주차에, 200 pmole/Kg군에서 전체 길이 디스트로핀의 발현은 야생형 음성 대조군의 >80%에 도달한 반면, mdx 음성 대조군의 발현은 야생형 음성 대조군의 20% 이하였다.
[엑손 스키핑을 위한 중첩 PCR (방법 B)] 근육 샘플은 얼음에 보관된 튜브에서 갈아서 균질화한 다음, 약 100 mg의 근육 조직당 1 mL의 트리졸 시약을 (Invitrogen) 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. "DMD 실시예 2"에 서술된 바와 같이 중첩 PCR을 이용하여 전체 RNA에 대하여 엑손 스키핑 정도를 평가하였다.
7주차에 채취한 골격근에서 얻은 중첩 PCR 산물의 전기영동 데이터를 도 42에 제공한다. ASO를 처리한 군의 근육 샘플에서 Δ엑손 21-23 및 Δ엑손 21-24가 스키핑되고 구조 이동이 일어나지 않은 PCR 산물이 관찰된 반면, mdx 음성 대조군의 근육 샘플에서는 전혀 관찰되지 않았다.
[H&E 염색에 의한 조직병리학] 근육의 염증과 퇴화는 DMD 증상의 전형이다. H&E 염색으로 골격근 샘플의 조직병리학을 평가하였다. 군과 채취 시기에 따른 삼두근의 대표적인 H&E 염색 이미지를 도 43에 제공한다.
야생 음성 대조군에서는 채취 시기와 관계없이 근육 구조의 밀도가 항상 높았으며, 실험 기간 내내 근육 염증의 기미가 없었다.
mdx 음성 대조군에서는 근육의 구조가 나이에 따라 퇴화하는 것이 명확하게 보였다. 특히 30주차에는 근육 다발들이 서로 연결되어 있지 않고 퇴화되어 둥근 모양으로 되는 경향이었다. 또한 파란 염색 점들로 나타나는 염증 세포의 큰 침윤이 13에서 21주차에 현저히 나타났다.
200 pmole/Kg 군에서는 7주차의 느슨한 근육 구조의 밀도가 점점 높아지는 것이 관찰되었다. 7주차의 염증 세포의 현저한 침윤이 나이에 따라 점점 사라졌다. 200 pmole/Kg의 ASO를 만성으로 투여한 mdx 쥐 군에서 근육의 퇴화와 염증이 회복되었는 데, 이는 200 pmole/Kg 군에서 전체 길이 디스트로핀이 상향 조절되는 것과 일치한다.
10 및 50 pmole/Kg 군들에서 관찰된 조직병리학 상의 심각성은 mdx 음성 대조군에서 보다 약했지만 200 pmole/Kg 군에서 보다는 강했다. 따라서 ASO 처리에 의해 유도된 전체 길이 디스트로핀의 상향 조절은 조직병리학 상의 결과와 상당히 일치한다.
[기타 결과들] mdx 음성 대조군에서는 만성 근육 염증에서 유래된 큰 덩어리의 근육 림프종으로 인해 죽은 (26, 39, 및 43 주차) 경우가 3건 있었는 데, ASO 투여 군에서는 림프종이 생긴 경우가 없었다.
[다른 디스트로핀 ASO와의 비교] 에텝리르센은 (엑손디스 51) 인간 디스트로핀 프리-mRNA에서 엑손 51의 스키핑을 유도하도록 고안된 PMO 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 최근에, 미국 FDA는 엑손 51의 스키핑이 필요한 DMD 환자용으로 에텝리르센을 조건부 허가하였다 (accelerated approval). 에텝리르센의 권장 정맥주사 투여량은 주당 30 mg/Kg 이었다.
200 pmole/Kg "DMD-ASO 1"의 피하 투여량은 약 1 μg/Kg이다. 화학식 I의 디스트로핀 ASO는, PMO ASO와는 종 (species)과 엑손에 있어서 차이가 있지만, PMO ASO보다 효능이 약 30,000배 더 강하다. 화학식 I의 PNA 유도체의 실현된 바 없는 아주 강한 엑손 스키핑 효능은 치료하기 어려운 이러한 희귀 질환에 대해 생체내 치료 효능을 나타내었다.
DMD 실시예 6. "DMD-ASO 2"를 만성 투여한 mdx 쥐에서 걸은 거리에 의한 근육 기능의 향상 평가.
표 7에 명시된 "DMD-ASO 2"는 쥐 디스트로핀 프리-mRNA 중의 인트론 22 및 엑손 23의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치에 완전히 상보적인 17-머 ASO이다. "DMD-ASO 2"는 [(5' 3') ua auuuugag ┃ GCUCUGCAA A]의 20-머 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 17-머 서열과 상보성 결합을 한다. "DMD-ASO 2"는 인트론 22와 8-머 결합을 하고 엑손 23과 9-머 결합을 한다.
"DMD-ASO 2"를 만성 투여한 mdx 쥐에서, 트레드밀에서 걷는 거리에 의한 근육 기능의 향상 정도와 크레아틴 키나아제와 (CK) 미오글로빈의 혈청 중 수치에 의한 근육 퇴화를 억제하는 정도를 평가하였다
[동물 및 군분리] 6주령 수컷 mdx 쥐를 mdx 음성 대조군 (ASO 투여하지 않음), "DMD-ASO 2" 10 pmole/Kg, 및 "DMD-ASO 2" 30 mg/Kg의 3군으로 몸무게를 기초로하여 무작위 분리하였다 (군당 16마리). 12마리의 6주령 C57BL/6 쥐가 야생형 (WT) 음성 대조군으로 사용되었다.
[주사액과 ASO 투여] ASO 주사액은 "DMD-ASO 2" 진한 저장 수용액을 PBS 혹은 0.1% 트윈 80이 첨가된 PBS로 묽혀 10 pmole/Kg 및 30 pmole/Kg "DMD-ASO 2"용으로 20 및 60 nM "DMD-ASO 2"을 각각 준비하였다. ASO 분자가 플라스틱 주사액 바이알, 피펫팁, 및 주사기 등에 달라붙는 것을 방지하기 위하여 PBS 주사액에 0.1% 트윈 80을 첨가하는 것이 필요하였다.
[트레드밀에서 걸은 거리] 군 분리후 처음 30주 동안 트윈 80이 없는 주사액 2 mL/Kg을 주당 2회 투여하였다. 7주차부터 주당 1회씩 동물들을 트레드밀에서 (Model #LE8710, PanLab) 걷게 하였다. 그러나, 처음 30주 동안 ASO 투여군이 mdx 음성 대조군에 비해 걸은 거리에서 유의적인 향상을 보이는 데 실패하였다.
ASO 투여량을 효과적으로 늘리기 위하여 5주간의 휴약기 (washout period) 후에 36주차부터는 트윈 80이 첨가된 주사액을 주당 2회 투여하였다.
도 44A는 43에서 48주차에 트레드밀에서 걸은 거리를 군별로 요약한다. mdx 음성 대조군의 평균 걸은 거리는 43주차에 250 미터에서 48주차에 130 미터로 점차 빠르게 감소하였다. ASO 투여군의 평균 걸은 거리는 mdx 음성 대조군에 비해 현저하게 길었다.
46에서 48주차에 10 pmole/Kg 군의 평균 걸은 거리는 240 내지 280 미터로 mdx 음성 대조군에 비해 현저하게 길었다. 반면에 46에서 48주차에 30 pmole/Kg 군의 평균 걸은 거리는 약 180 내지 230 미터였다. 10 pmole/Kg 군의 평균 걸은 거리가 30 pmole/Kg 군의 평균 걸은 거리보다 더 긴 경향이 있었다. 이러한 평균 걸은 거리의 역전된 용량 반응 현상은 "HIF-1α 실시예 9"에서 관찰된 바와 같이 높은 ASO 용량에서는 다른 엑손(들)을 선택한다는 것이다. 흥미롭게도, 야생형 음성 대조군과 30 pmole/Kg 군은 44에서 47주차에 비슷한 걸은 거리를 보였다.
[마지막 희생] 48주차에 혈액 샘플 채취를 위해 동물들을 마지막으로 희생시킨다. 근육 퇴화 정도를 평가하기 위하여 제조사의 지시에 따라 CK와 (Creatine Kinase Activity Assay Kit, Cat. Number ab155901, Abcam) 미오글로빈의 (Myoglobin ELISA Kit, Cat. Number ab210965, Abcam) 혈청 중 수치를 분석하였다.
[CK와 미오글로빈의 혈청 중 수치] 도 44B는 관찰된 군별 CK 혈청 중 수치를 제공한다. mdx 쥐의 근육이 허약함을 반영하듯이, 야생형 음성 대조군에 비해 모든 mdx 쥐 군의 CK 혈청 중 활성이 현저히 높았다. 예를 들면, mdx 음성 대조군의 CK 혈청 중 수치는 야생형 음성 대조군 수치보다 약 54배 높았다. 10 및 30 pmole/Kg 군의 CK 혈청 중 수치는 mdx 음성 대조군에 비해 각각 58% 및 38% 적었다. 10 pmole/Kg 군과 mdx 음성 대조군의 CK 혈청 중 수치의 차이는 현저했다.
도 44C는 관찰된 군별 미오글로빈 혈청 중 수치를 제공한다. mdx 쥐의 근육이 허약함을 반영하듯이, 야생형 음성 대조군에 비해 모든 mdx 쥐 군의 미오글로빈 혈청 중 수치가 현저히 높았다. 예를 들면, mdx 음성 대조군의 미오글로빈 혈청 중 수치는 야생형 음성 대조군 수치보다 약 22배 높았다. 10 및 30 pmole/Kg 군의 미오글로빈 혈청 중 수치는 mdx 음성 대조군에 비해 각각 67% 및 58% 현저하게 적었다.
근육 퇴화에 대한 혈청 생체지표의 (biomarker) 관찰된 데이터는 도 44A에 제공된 걸은 거리의 용량 의존성과 잘 일치한다.
[웨스턴 블럿에 의한 삼두근에서의 전체 길이 디스트로핀 발현] 액체 질소 온도에서 균질화한 다음, 1% SDS가 첨가된 RIPA 완충용액으로 삼두근 샘플을 용해하였다. 각 용해액의 단백질 농도는 BSA 표준에 대해 BCA 분석으로 정량하였다. 각 용해액의 50 mg 단백질은 8% PAGE 젤에서 전기영동으로 분리하였고, PVDF 막은 C-말단을 표적하는 디스트로핀 항체로 (Cat. Number ab154168, Abcam) 탐색하였다.
도 45A는 관찰된 웨스턴 블럿 에이터를 제공한다. 모든 샘플에서 427K 크기의 전체 길이 디스트로핀은 발견되지 않은 대신, 야생형 근육 샘플에서는 170K, 130K 및 117K 크기의 작은 디스트로핀 단백질이 생성되었는 데 130K 크기의 밴드가 가장 진했다.
mdx 군에서는 세 개의 디스트로핀 밴드가 발견되었다. 10 및 30 pmole/Kg 투여군에서는 117K 크기의 밴드가 야생형 대조군이나 mdx 음성 대조군에 비해 현저하게 강했다. 10 pmole/Kg 투여군에서 130K 밴드의 강도 또한 mdx 음성 대조군에 비해 현저하게 강했다.
DMD 실시예 7. "DMD-ASO 1", "DMD-ASO 2", 혹은 "DMD-ASO 6"을 투여한 mdx 쥐의 장기간 평가.
표 7에 명시된 "DMD-ASO 6"은 쥐 디스트로핀 프리-mRNA 중의 엑손 23 및 인트론 23의 연결 부위에 걸쳐 있는 5' 스플라이스 위치에 완전히 상보적인 18-머 ASO이다. "DMD-ASO 6"은 [(5' 3') AA AAUUUCAG ┃ guaagccgag guuug]의 25-머 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 18-머 서열과 상보성 결합을 한다. "DMD-ASO 6"은 엑손 23 와 8-머 결합을 하고 인트론 23과 10-머 결합을 한다.
"DMD-ASO 1", "DMD-ASO 2" 및 "DMD-ASO 6"을 장기간 피하 투여한 수컷 mdx 쥐의 생리학적 영향을 평가하였다. 이 평가에서는 과도한 근육 자극이 디스트로핀 유전자의 전사에 영향을 주지 않게 하기 위하여, 근육의 스트레스가 필요한 육체적인 실험을 하지 않았다.
[동물 및 군분리] 6주령 수컷 mdx 쥐를 mdx 음성 대조군 (ASO 투여하지 않음), "DMD-ASO 1" 50 pmole/Kg, "DMD-ASO 2" 10 pmole/Kg, 및 "DMD-ASO 6" 10 pmole/Kg의 4군으로 몸무게를 기초로하여 무작위 분리하였다 (군당 12~13마리). 12마리의 6주령 C57BL/6 쥐가 야생형 (WT) 음성 대조군으로 사용되었다.
[주사액과 ASO 투여] ASO 주사액은 "DMD-ASO 2" 진한 저장 수용액을 PBS로 묽혀서 "DMD-ASO 1" 50 pmole/Kg용 25 nM "DMD-ASO 1", "DMD-ASO 2" 10 pmole/Kg용 5 nM "DMD-ASO 2" 및 "DMD-ASO 6" 10 pmole/Kg용 5 nM "DMD-ASO 6"을 각각 준비하였다. 동물 몸무게 1 Kg당 2 mL의 주사액을 주당 2회 동물에게 피하로 투여되었다.
[계획에 없던 죽음 혹은 희생] ASO를 투여한 mdx 쥐는 mdx 음성 대조군에 비해 오래 사는 경향이 있었는 데, 이는 ASO의 치료 활성을 의미한다.
mdx 음성 대조군에서 계획에 없던 죽음 혹은 희생이 3건 있었다: 42, 58 및 61주차. "DMD-ASO 1" 투여군에서는 38 및 61주차에 때 이른 죽음이 2건 있었고, "DMD-ASO 2" 투여군에서는 56 및 62주차에 때 이른 죽음이 2건 있었으며, "DMD-ASO 6" 투여군에서는 때 이른 죽음이 3건 있었다: 55, 65 및 66주차.
[마지막 희생] 군분리 후 66주차에 혈액 샘플 채취를 위해 살아있는 모든 동물들을 희생시킨다. "DMD 실시예 6"에 따라 ELISA 분석으로 CK와 미오글로빈의 혈청 중 수치를 분석하였다.
[CK와 미오글로빈의 혈청 중 수치] 도 45B는 관찰된 군별 CK 혈청 중 수치를 제공한다. mdx 쥐의 근육이 허약함을 반영하듯이, 야생형 음성 대조군에 비해 모든 mdx 쥐 군의 CK 혈청 중 활성이 현저히 높았다. 예를 들면, mdx 음성 대조군의 CK 혈청 중 수치는 야생형 음성 대조군 수치보다 약 17배 높았다. ASO를 투여한 군에서의 CK 혈청 중 수치는 mdx 음성 대조군의 CK 혈청 중 수치보다 적었으며 이는 ASO의 치료 활성을 의미하지만 그 차이는 유의하지는 않았다.
도 45C는 관찰된 군별 미오글로빈 혈청 중 수치를 제공한다. mdx 쥐의 근육이 허약함을 반영하듯이, 야생형 음성 대조군에 비해 모든 mdx 쥐 군의 미오글로빈 혈청 중 수치가 현저히 높았다. 예를 들면, mdx 음성 대조군의 미오글로빈 혈청 중 수치는 야생형 음성 대조군 수치보다 약 26배 높았다. "DMD-ASO 1", "DMD-ASO 2" 및 "DMD-ASO 6"군의 미오글로빈 혈청 중 수치는 mdx 음성 대조군에 비해 각각 43%, 49% 및 68% 적었다. mdx 음성 대조군과 "DMD-ASO 6"군의 차이는 유의하게 현저하다. 근육의 온전성에 대한 혈청 중 생체지표는 (biomarker) "DMD-ASO 6"이 mdx 쥐에서 디스트로핀 엑손 23의 스키핑을 유도하여 잘 기능하는 전체 길이 디스트로핀을 생성한다는 것을 간접적으로 의미한다.
IDO1 ASO들의 생체외 활성의 예
표 8에 명시된 화학식 I의 PNA 유도체는 인간 IDO1 프리-mRNA의 다양한 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하도록 고안되었다. IDO1 ASO는 SKOV3 세포에서 엑손 스키핑 활성이 평가되었다. IDO1이 L-트립토판을 N-포밀키누레닌으로 분해하는 것을 촉진시키는 것을 고려하여, IDO1 ASO가 N-포밀키누레닌의 생성을 억제하는 정도를 평가하였다. 화학식 I의 화합물의 예로서 IDO1 ASO들이 엑손 스키핑을 유도한다는 것을 예시하기 위하여 생물학적 예들이 제공되며, 본 발명의 범위를 IDO1 ASO들로 한정하기 위함이 아니다.
IDO1 실시예 1. "IDO-ASO 1"에 의해 유도된 엑손 스키핑.
표 8에 명시된 " IDO-ASO 1"은 인간 IDO1 프리-mRNA 중의 인트론 6 및 엑손 7의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치에 완전히 상보적인 13-머 ASO이다. " IDO-ASO 1"은 [(5' 3') uuugu uuuag ┃ GUAAUUCC UA]의 20-머 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 13-머 서열과 상보성 결합을 한다. "IDO-ASO 1"은 인트론 6과 5-머 결합을 하고 엑손 7과 8-머 결합을 한다.
SKOV3 세포 (Cat. Number HTB-77, ATCC)에서 "IDO-ASO 1"이 엑손 스키핑을 유도하는 정도를 IDO1 중첩 PCR을 이용하여 다음과 같이 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] 60 mm 배양 접시에서 SKOV3 (인간 난소 선암) 세포를 5 mL McCoy's 5A 변형 배양액에 10% 소 혈청 (FBS, Fetal Bovine Serum), 1% 스트렙토마이신/페니실린, 1% L-글루타민 및 1% 피루브산 나트륨을 첨가하여 37oC, 5% CO2 조건에서 세포 배양한 다음 "IDO-ASO 1"을 0 zM (음성 대조용), 10 zM, 100 zM, 또는 1 aM의 농도로 48시간 동안 처리하였다.
[RNA 추출 및 원스텝 RT-PCR에 의한 cDNA합성] 전체 RNA를 "유니버셜 RNA 익스트랙션 키트 (Universal RNA Extraction Kit)"(Cat. Number 9767, 타카라(Takara))를 사용하여 제조사의 설명에 따라 세포에서 추출하였다. 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [IDO-엑손 2_순방향: (5' 3') TTCATTGCTAAACATCTGCC; 및 IDO-엑손 10_역방향: (5' 3') TGAAAGGACAAACTCACGGA]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 플래티늄 (platinum®) Taq 폴리머라제 (Cat. No. 10928-042, 인비트로젠 (Invitrogen))를 갖는 슈퍼스크립트(Super Script®) 원스텝(One-Step) RT-PCR 키트를 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50oC 30분 및 94oC 2분에 이어서, 40 주기의 94oC 30초, 50oC 30초 및 72oC 1분.
[네스티드 PCR 증폭] 1 μL의 cDNA를, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [IDO-엑손 4_순방향: (5' 3') CCTTACTGCCAACTCTCC; 및 IDO-엑손 9_역방향: (5' 3') CTGCTTTGGCCTGCACTG]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 20 ㎕ 네스티드 PCR 반응(Cat. No. K2612, 바이오니어)에서 추가로 증폭시켰다: 95oC 5분에 이어서, 30 주기 95oC 30초, 50oC 30초 및 72oC 1분.
[엑손 스키핑 생성물의 확인] 상기 PCR 산물에 대해 2% 아가로스 젤 상에서 전기영동 분리를 수행하였다. 타겟 크기에 따라 밴드들을 수집하고 생거 서열분석에 의해 분석하였다.
도 46A에서는 중첩 PCR 산물의 전기영동 데이터와 (왼쪽 도표) 엑손 6-7 스키핑으로 판명된 PCR 밴드의 생거 서열분석 데이터를 (오른쪽) 제공한다. 엑손 6-7 스키핑은 100 zM "IDO-ASO 1"을 처리한 세포의 RNA 추출물에서 발견되었다. 10 zM 혹은 1 aM의 "IDO-ASO 1"을 처리한 세포의 RNA 추출물에서는 엑손 6-7 스키핑 밴드가 발견되지 않았는 데, 엑손 6-7이 결여된 IDO1 mRNA 스플라이스 변형체의 안정성이 나쁘기 때문일 것이다. 10 혹은 100 zM의 ASO를 처리한 세포에서 전체 길이 IDO1 mRNA의 강도가 감소하였지만, 1 aM의 ASO를 처리한 세포에서 전체 길이 mRNA PCR의 강도는 증가하였다. 1 aM에서 전체 길이 mRNA의 양이 증가한 원인은 아직 밝혀지지 않았지만, PCR 반응에서의 오류 때문일 수도 있고 "IDO-ASO 1"에 의한 엑손 스키핑 중에 축적된 "엑손 인트론 고리형 RNA (EIciRNA)"에 의한 (일시적인) 전사 상향조절 때문일 수도 있다 [Nature Struct. Mol. Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)]. 생거 서열분석 데이터는 (오른쪽 도표) SKOV3 세포에서 "IDO-ASO 1"에 의해 유도된 엑손 6-7 스키핑을 명백히 증명하였다.
IDO1 실시예 2. "IDO-ASO 1"의 안티센스 기능 활성.
SKOV3 세포에서 키누레닌 분비를 억제하는 "IDO-ASO 1"의 기능 활성을 다음과 같이 평가하였다.
[키누레닌 분비 분석] 60 mm 배양 접시에서 5 mL 배양액에 배양된 SKOV3 세포에 " IDO-ASO 1"을 0 zM (음성 대조용) 또는 10 zM에서 1 fM의 농도로 처리하였다 (농도당 3 배양 접시). 키누레닌 분비를 증가시키기 위하여 10 ng/mL γ-인터페론을 ASO와 같이 처리하였다. 24시간 후에, 각 배양 접시에서 200 μL의 배양액을 취한 다음 100 μL 30% 트리클로로아세틱 산과 섞었다. 혼합물을 보텍싱하고 8,000g에서 5분 동안 원심분리하였다. 75 μL의 상청액을 75 μL의 Ehrlich 시약과 (0.8% p-다이메틸아미노벤즈알데하이드 초산 용액) 섞고 그 혼합물에 대해 ELISA 리더기를 이용하여 490 nm에서 키누레닌 정량을 실시하였다 [PLOS One 5(8): e63301 (2013)].
도 46B에 키누레닌 분석 결과를 제공한다. 1 aM의 "IDO-ASO 1"를 처리한 세포를 제외하고, 10 zM에서 1 fM의 ASO를 처리한 세포에서 키누레닌의 분비가 유의성있게 (독립표본 T 검정) 감소하였다. 1 fM의 "IDO-ASO 1"를 처리한 세포에서 키누레닌의 분비가 약 40% 감소하였다.
IDO1 실시예 3. "IDO-ASO 5"에 의해 유도된 엑손 스키핑.
표 8에 명시된 " IDO-ASO 5"는 인간 IDO1 프리-mRNA 중의 엑손 3 및 인트론 3의 연결 부위에 걸쳐 있는 5' 스플라이스 위치에 완전히 상보적인 13-머 ASO이다. " IDO-ASO 5"는 [(5' 3') UG UCCGUAAG ┃ guuug gagau]의 20-머 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 13-머 서열과 상보성 결합을 한다. "IDO-ASO 5"는 엑손 3과 8-머 결합을 하고 인트론 3과 5-머 결합을 한다.
별다른 언급이 없으면 "IDO1 실시예 1"과 같이, SKOV3 세포에서 "IDO-ASO 5"가 엑손 스키핑을 유도하는 정도를 IDO1 중첩 RT-PCR을 이용하여 평가하였다.
[ASO 처리] 60 mm 배양 접시에서 배양된 SKOV3 세포에 대해 "IDO-ASO 5"를 0 (음성 대조용), 1, 3, 10, 30, 또는 100 aM의 농도로 48시간 동안 처리하였다.
[원스텝 PCR에 의한 cDNA합성] 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [IDO-엑손 1_순방향: (5' 3') AAAACTCCTGGACAATCAGT; 및 IDO-엑손 8_역방향: (5' 3') ACTTGAAGGGCTTTCTCC]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 플래티늄 (platinum®) Taq 폴리머라제 (Cat. No. 10928-042, 인비트로젠 (Invitrogen))를 갖는 슈퍼스크립트(Super Script®) 원스텝 RT-PCR 키트를 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50oC 30분 및 94oC 2분에 이어서, 40 주기의 94oC 30초, 52oC 30초 및 72oC 40초.
[네스티드 PCR 증폭] 1 μL의 cDNA를, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [IDO-엑손 1n_순방향: (5' 3') TATTGATGAAGAAGTGGG; 및 IDO-엑손 8n_역방향: (5' 3') GTTCACATGATCGTGGATTTG]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 20 ㎕ 네스티드 PCR 반응(Cat. No. K2612, 바이오니어)에서 추가로 증폭시켰다: 95oC 5분에 이어서, 30 주기 95oC 30초, 52oC 40초 및 72oC 40초.
[네스티드 PCR 생성물의 데이터] 도 47A에서는 중첩 PCR 산물의 전기영동 데이터를 제공한다. 30 및 100 aM의 "IDO-ASO 5"를 처리한 세포에서는 엑손 2-4 및 엑손 2-6이 결여된 mRNA 스플라이스 변형체가 명백히 생성되었다. 10 aM의 ASO를 처리한 세포에서 강도가 살짝 올라가긴 했지만, ASO를 처리한 세포에서 전체 길이 mRNA의 강도가 감소하였다. 도 47B에서는 엑손 2-4 및 엑손 2-6이 결여된 mRNA 스플라이스 변형체에 대한 생거 서열분석 데이터를 제공한다.
IDO1 실시예 4. "IDO-ASO 6"에 의해 유도된 엑손 스키핑.
표 8에 명시된 " IDO-ASO 6"은 인간 IDO1 프리-mRNA 중의 인트론 3 및 엑손 4의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치에 완전히 상보적인 13-머 ASO이다. " IDO-ASO 6"은 [(5' 3') uuuua aucag ┃ GUCUUGCC AA]의 20-머 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 13-머 서열과 상보성 결합을 한다. "IDO-ASO 6"은 인트론 3과 5-머 결합을 하고 엑손 4과 8-머 결합을 한다.
별다른 언급이 없으면 "IDO1 실시예 3"과 같이, SKOV3 세포에서 "IDO-ASO 6"이 엑손 스키핑을 유도하는 정도를 IDO1 중첩 PCR을 이용하여 평가하였다.
[네스티드 PCR 생성물의 데이터] 도 47C에서는 중첩 PCR 산물의 전기영동 데이터와 (왼쪽 도표) 엑손 스키핑으로 해석할 수 있는 PCR 밴드의 생거 서열분석 데이터를 (오른쪽 도표) 제공한다. 100 aM의 ASO를 처리한 세포에서는 엑손 스키핑 밴드가 발견되지 않았지만, 1에서 30 aM의 "IDO-ASO 6"을 처리한 세포에서는 엑손 2-5가 결여된 하나의 mRNA 스플라이스 변형체가 명백히 생성되었다. ASO를 처리한 세포에서의 전체 길이 mRNA의 강도가 ASO를 처리하지 않은 세포에서의 전체 길이 mRNA의 강도보다 강했는 데, 이는 "IDO-ASO 1"에 의한 엑손 스키핑 중에 축적된 "엑손 인트론 고리형 RNA (EIciRNA)"에 의한 전사 상향조절 때문일 수도 있다 [Nature Struct. Mol. Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)].
SNAP25 ASO들의 생체외와 탈체 활성의 예
25 kDa의 시냅토솜 유관 단백질는 (SNAP25, synaptosome-associated protein of 25 kDa) 운동 신경 세포에서 신경 전달 물질의 세포외 전달에 관련된 SNARE 단백질이다. 보툴리눔 독소 A는 (BotoxTM) SNAP25를 절단하여 유명한 주름 제거 활성을 나타낸다. 표 9에 명시된 화학식 I의 PNA 유도체는 인간 SNAP25 프리-mRNA에서 엑손 7의 3' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하게 고안되었다. SNAP25 ASO가, SiMa (인간 신경모세포종) 세포와 쥐에서 기원하는 PC12 세포에서의 SNAP25 안티센스 활성과 국부 투여한 쥐의 피부에서 SNAP25의 발현을 억제하는 정도를 평가하였다. 화학식 I의 화합물의 예로서 SNAP25 ASO들이 엑손 스키핑을 유도한다는 것을 예시하기 위하여 생물학적 예들이 제공되며, 본 발명의 범위를 SNAP25 ASO들로 한정하기 위함이 아니다.
SNAP25 실시예 1. "SNAP-ASO 3"을 처리한 PC12 세포에서의 엑손 스키핑.
표 9에 명시된 "SNAP-ASO 3"은 인간 SNAP25 프리-mRNA 중의 인트론 6 및 엑손 7의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치에 완전히 상보적인 14-머 ASO이다. "SNAP-ASO 3"은 [(5' 3') cucuuugg aucccag ┃ GGUAACA AAUGAUGC]의 30-머 프리-mRNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 14-머 프리-mRNA 서열과 상보성 결합을 한다. "SNAP-ASO 3"은 인트론 6과 7-머 결합을 하고 엑손 7과 7-머 결합을 한다.
"SNAP-ASO 3"은 쥐 유전체 DNA에서 [접속 NCBI 참고 서열: NC_005012] 유래한 쥐 SNAP25 프리-mRNA에서 엑손 7의 3' 스플라이스 위치에 대해 한 개의 부정합을 가지고 있지만, PC12 세포에서 (Cat. Number CRL-1721, ATCC) 엑손 스키핑을 유도하는 정도를 평가하였다. 14-머 ASO는 [(5' 3') ugg"c" ucccag ┃ GGUAACA AACGAUGC]의 25-머 프리-mRNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 바와 같이 쥐 SNAP25 프리-mRNA와 13-머의 상보성 결합을 하는 데, 한 개의 부정합은 인용 부호로 (" ") 표시하였다.
[세포배양 & ASO 처리] PC12 세포를, 60 mm 배양 접시에서 5 mL의 RPMI 1640 배양액에 5% 소 혈청 (FBS, Fetal Bovine Serum), 10% 말 혈청, 1% 스트렙토마이신/페니실린, 1% L-글루타민, 그리고 1% 나트륨 파이루베이트를 첨가하여 37oC, 5% CO2 조건에서 세포 배양한 다음 "SNAP-ASO 3"을 0 (음성 대조용), 10, 100, 또는 1,000 zM의 농도로 처리하였다.
[RNA 추출 및 원스텝 PCR에 의한 cDNA합성] 42시간의 배양 후에, 리보솜에 의한 번역을 억제하기 위해 세포를 100 μg/mL 사이클로헥시미드로 6시간 동안 처리하였다. 전체 RNA를 "유니버셜 RNA 익스트랙션 키트 (Universal RNA Extraction Kit)"(Cat. Number 9767, 타카라(Takara))를 사용하여 제조사의 설명에 따라 추출하였다. 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [SNAP-엑손 1_순방향: (5' 3') ATGGCCGAGGACGCAGACA; 및 SNAP-엑손 14_역방향: (5' 3') AGCATCTTTGTTGCACGTTG]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 플래티늄 (platinum®) Taq 폴리머라제 (Cat. No. 10928-042, 인비트로젠 (Invitrogen))를 갖는 슈퍼스크립트(Super Script®) 원스텝(One-Step) RT-PCR 키트를 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50oC 30분 및 94oC 2분에 이어서, 40 주기의 94oC 30초, 50oC 30초 및 72oC 1분.
[네스티드 PCR 증폭] 1 μL의 cDNA를, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [SNAP-엑손 1_순방향: (5' 3') ATGGCCGAGGACGCAGACA; 및 SNAP-엑손 14n_역방향: (5' 3') TTGTTGGAGTCAGCGCCT]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 20 ㎕ 네스티드 PCR 반응(Cat. No. K2612, 바이오니어)에서 추가로 증폭시켰다: 95oC 2분에 이어서, 34 주기 95oC 30초, 55oC 30초 및 72oC 1분.
[엑손 스키핑 생성물의 확인] 상기 PCR 산물에 대해 2% 아가로스 젤 상에서 전기영동 분리를 수행하였다. 타겟 크기에 따라 밴드들을 수집하고 생거 서열분석에 의해 분석하였다.
도 48A에서는 PCR 산물의 전기영동 데이터를 제공하는 데, 10 zM ASO 투여군에서 엑손 5-7 스키핑으로 해석할 수 있는 희미한 PCR 밴드가 생성되었다 (왼쪽 도표 참고). 세포를 사이클로헥시미드로 처리하여 전체 길이 mRNA를 불안정화하여 리보솜에 의한 번역을 억제하였지만, 엑손 스키핑 밴드는 희미하게 나타났다. 즉 엑손 5-7 스키핑으로 해석할 수 있는 SNAP25 mRNA 스플라이스 변형체는 전체 길이 mRNA에 비해서 대사 안정성이 나쁜 것으로 보인다. 엑손 스키핑 PCR 산물은 도 48B에 (오른쪽 도표 참고) 나타난 바와 같이 엑손 5-7 스키핑으로 서열분석되었다. 엑손 6 스키핑으로 해석할 수 있는 PCR 산물이 ASO의 농도와 관계없이 관찰된 것을 보면 엑손 6의 스키핑은 자발적으로 일어나는 것으로 생각된다.
전체 길이 SNAP25 mRNA의 강도는 10 zM "SNAP-ASO 3"을 처리한 세포에서 가장 많이 감소하였다. ASO의 농도를 10에서 1,000 zM로 증가시킬수록 전체 길이 mRNA의 강도는 점차 음성 대조군의 (ASO를 처리하지 않음) 수준으로 증가하였다. 중첩 PCR 데이터에서 역전된 용량 반응 패턴은 "SNAP-ASO 3"에 의한 엑손 스키핑 중에 축적된 "엑손 인트론 고리형 RNA (EIciRNA)"에 의한 (일시적인) 전사 상향조절 때문일 수도 있다 [Nature Struct. Mol. Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)].
SNAP25 실시예 2. "SNAP-ASO 3"을 처리한 PC12 세포에서 SNAP25 mRNA의 qPCR 평가.
PC12 세포에서 "SNAP-ASO 3"이 쥐 SNAP25 mRNA 양의 변화를 유도하는 정도를 SNAP25 중첩 qPCR로 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] 60 mm 배양 접시에서 5 mL의 배양액에서 배양된 PC12 세포에 대해 "SNAP-ASO 3"을 0 (음성 대조용), 10, 100, 또는 1,000 zM의 농도로 처리하였다 (ASO 농도당 2 배양 접시).
[RNA 추출 및 원스텝 RT-PCR에 의한 cDNA합성] 42시간의 배양 후에, 리보솜에 의한 번역을 억제하기 위해 세포를 100 μg/mL 사이클로헥시미드로 6시간 동안 처리하였다. 전체 RNA를 "유니버셜 RNA 익스트랙션 키트 (Universal RNA Extraction Kit)"(Cat. Number 9767, 타카라(Takara))를 사용하여 제조사의 설명에 따라 추출하였다. 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [SNAP-엑손 1_순방향: (5' 3') ATGGCCGAGGACGCAGACA; 및 SNAP-엑손 14_역방향: (5' 3') AGCATCTTTGTTGCACGTTG]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 원스텝(One-Step) RT-PCR 키트를 (Invitrogen, USA) 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50oC 30분 및 94oC 2분에 이어서, 20 주기의 94oC 30초, 55oC 30초 및 72oC 1분.
[네스티드 PCR 증폭] 100배 희석한 1 μL의 cDNA 용액을, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [SNAP-엑손 7q_순방향: (5' 3') ATGGATGAAAACCTAGAGC; 및 SNAP-엑손 8q_역방향: (5' 3') CTTCCCAGCATCTTTGTT]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 20 ㎕ 실시간 PCR 반응을 실시하였다: 95oC 3분에 이어서, 40 주기 95oC 10초 및 60oC 30초. 전체 길이 SNAP25 mRNA를 정량하기 위해 엑손 7과 엑손 8의 연결 부위를 표적하는 택만 탐침을 [(5'→3') 5,6-FAM-CAGCCTTCT-ZEN-CCATGATCCT-3IABkFQ] 이용하여 qPCR 반응을 추적하였다.
도 48B에서 qPCR 데이터를 제공하는 데, 10 zM 및 100 zM의 "SNAP-ASO 3"를 처리한 세포에서 전체 길이 mRNA의 양이 유의적으로 (독립표본 T 검정) 각각 약 50% 및 20% 감소하였다. 그러나, 1,000 zM의 "SNAP-ASO 3"를 처리한 세포에서는 전체 길이 mRNA의 양이 ASO를 처리하지 않은 세포에서의 (음성 대조군) 양보다 약간 많았다.
qPCR 데이터의 역전된 용량 반응 패턴은 "SNAP25 실시예 1"에서 서술된, 엑손 스키핑 중에 전체 길이 mRNA 양에 대한 용량 반응 패턴과 잘 일치하는 데, ASO의 용량이 10에서 1,000 zM로 증가함에 따라 전사의 상향 조절이 일어난다는 것을 의미한다. 즉, 쥐 SNAP25 프리-mRNA와 13-머 상보적인 결합은 엑손 스키핑 중에 축적되는 EIciRNA에 의해 유도되는 전사의 상향 조절을 막기에는 충분하지 않다.
SNAP25 실시예 3. "SNAP-ASO 1"을 처리한 PC12 세포에서 SNAP25 mRNA의 qPCR 평가.
표 8에 명시된 "SNAP-ASO 1"은 인간 SNAP25 프리-mRNA 중의 인트론 6 및 엑손 7의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치에 완전히 상보적인 16-머 ASO이다. "SNAP-ASO 1"은 [(5' 3') cucuuugga ucccag ┃ GGUAACAAAU GAUGC]의 30-머 인간 프리-mRNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 16-머 서열과 상보성 결합을 한다. "SNAP-ASO 1"은 인트론 6과 6-머 결합을 하고 엑손 7과 10-머 결합을 한다. 그러나, "SNAP-ASO 1"은 [(5' 3') uggc ucccag ┃ GGUAACAAA "C"GAUGC]의 25-머 프리-mRNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 바와 같이 쥐 SNAP25 프리-mRNA와 15-머의 상보성 결합을 하고 한 개의 부정합이 있는 데, 한 개의 부정합은 인용 부호로 (" ") 표시하였다.
별다른 언급이 없으면 "SNAP25 실시예 2"와 같이, PC12 세포에서 "SNAP-ASO 1"이 쥐 SNAP25 mRNA 양의 변화를 유도하는 정도를 SNAP25 중첩 qPCR로 평가하였다.
도 48C에서 qPCR 데이터를 제공하는 데, 10 zM, 100 zM 및 1,000 zM의 "SNAP-ASO 1"을 처리한 세포에서 전체 길이 mRNA의 양이 유의적으로 (독립표본 T 검정) 각각 약 50%, 40% 및 70% 감소하였다.
"SNAP-ASO 3"의 경우와 같이 "SNAP-ASO 1"의 경우에도 용량이 10에서 100 zM로 증가함에 따라 역전된 용량 반응 패턴이 부분적으로 재현되었다. 그러나, ASO의 농도가 1,000 zM로 증가했을 때 전체 길이 mRNA의 양이 더 감소한 것을 고려하면, "SNAP-ASO 1"이 "SNAP-ASO 3"보다 엑손 스키핑 효능이 더 강한 것으로 보인다. "SNAP-ASO 1"과 쥐 프리-mRNA의 15-머 오버랩이 더 강한 엑손 스키핑 효능의 원인으로 보인다.
SNAP25 실시예 4. PC12 세포에서 "SNAP-ASO 3"에 의한 SNAP25 단백질 발현의 억제.
PC12 세포에서 "SNAP-ASO 3"이 SNAP25 단백질 발현을 억제하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
60 mm 배양 접시에서 5 mL의 배양액에서 배양된 PC12 세포에 대해 "SNAP-ASO 3"을 0 zM (음성 대조용), 1 zM, 10 zM, 30 zM, 100 zM, 300 zM, 1 aM, 3 aM, 또는 10 aM의 농도로 48시간 동안 처리하였다. 웨스턴 블럿 분석 중 생길 수 있는 기술적 오류에 대처하기 위해 음성 대조군에 4 배양 접시를 사용하였다.
[세포 용해] 1% SDS와 1X 단백질 가수 분해 요소 억제제 칵테일이 (cOmplete Mini, Roche) 첨가된 200 μL 1X RIPA 완충 용액으로 (Cat. Number 9806, Cell Signaling Tech) 얼음 위에서 세포를 용해하였다. 용해액을 1.5 mL e-튜브에 모으고 100 μL 5X 샘플 완충 용액과 섞은 후 5분 동안 끓였다.
[웨스턴 블럿] 용해액에 대해 4-15% TGX-PAGE 경사 젤 (Cat. Number 456-1086, Bio-Rad) 상에서 전기영동 분리를 수행한 다음 0.45 μm PVDF 막으로 옮겼다. 막은 항-SNAP25 항체와 (Cat. Number S9684, Sigma) 항-β-액틴 항체로 (Cat. Number A3845, Sigma) 탐색하였다.
도 49A에서는 PC12 세포 용해액의 SNAP25 웨스턴 블럿 데이터와 (위 도표) 덴시토미트리로 측정한 β-액틴에 대해 정규화한 상대적인 SNAP25 단백질 발현량을 (아래 도표) 제공한다. "SNAP-ASO 3"으로 처리한 세포에서 SNAP25 단백질 발현량이 10 내지 60% 감소하였는 데, 음성 대조군의 (즉, 0 zM "SNAP-ASO 3") 발현량은 4 샘플의 평균 값이다.
SNAP25 실시예 5. PC12 세포에서 "SNAP-ASO 1"에 의한 SNAP25 단백질 발현의 억제.
별다른 언급이 없으면 "SNAP25 실시예 4"와 같이, PC12 세포에서 "SNAP-ASO 1"이 SNAP25 단백질 발현을 억제하는 정도를 평가하였다. PC12 세포에 대해 "SNAP-ASO 1"을 0 (음성 대조용), 100 zM, 또는 1,000 zM의 농도로 48시간 혹은 72시간 동안 처리하였다 (각 ASO 농도당 1 배양 접시).
도 49B에서는 ASO를 48시간 (왼쪽) 및 72시간 (오른쪽) 동안 처리한 세포의 웨스턴 블럿 데이터를 제공한다. 두 시간 대 모두, PC12 세포에서 "SNAP-ASO 1"이 SNAP25 단백질 발현을 상당히 억제하였다.
SNAP25 실시예 6. SiMa 세포에서 "SNAP-ASO 3"에 의한 SNAP25 단백질 발현의 억제.
SiMa 인간 신경모세포종 세포에서 "SNAP-ASO 3"이 SNAP25 단백질 발현을 억제하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] SiMa 세포를 (Cat. Number ACC164, DSMZ) RPMI 1640 배양액에 10% 소 혈청 (FBS), 1% 스트렙토마이신/페니실린, 1% L-글루타민, 그리고 1% 나트륨 파이루베이트를 첨가하여 37oC, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 60 mm 배양 접시에서 5 mL의 배양액에서 배양된 SiMa 세포에 대해 "SNAP-ASO 3"을 0 zM (음성 대조용), 1 zM 내지 100 aM의 농도로 48시간 동안 처리하였다. 웨스턴 블럿 분석 중 생길 수 있는 기술적 오류에 대처하기 위해 음성 대조군에 3 배양 접시를 사용하였다.
[세포 용해] 0.1% SDS와 1X 단백질 가수 분해 요소 억제제 칵테일이 (cOmplete Mini, Roche) 첨가된 200 μL 1X RIPA 완충 용액으로 (Cat. Number 9806, Cell Signaling Tech) 얼음 위에서 세포를 용해하였다. 용해액을 1.5 mL e-튜브에 모으고 100 μL 5X 샘플 완충 용액과 섞은 후 5분 동안 끓였다.
[웨스턴 블럿] 용해액에 대해 12% SDS-PAGE 젤 상에서 전기영동 분리를 수행한 다음 0.2 μm 폴리비닐리덴 다이플로라이드 (PVDF) 막으로 옮겼다. 막은 항-SNAP25 항체와 (Cat. Number ab41455, Sigma) 항-β-액틴 항체로 (Cat. Number A3845, Sigma) 탐색하였다.
도 50A에서는 SiMa 세포 용해액의 SNAP25 웨스턴 블럿 데이터와 (위 도표) 덴시토미트리로 측정한 β-액틴에 대해 정규화한 상대적인 SNAP25 단백질 발현량을 (아래 도표) 제공한다. "SNAP-ASO 3"으로 처리한 세포에서 SNAP25 단백질 발현량이 40 내지 50% 감소하였는다.
SNAP25 실시예 7. "SNAP-ASO 3"을 처리한 SiMa 세포에서 SNAP25 mRNA의 qPCR 평가.
SiMa 세포에서 "SNAP-ASO 3"이 인간 SNAP25 mRNA 양의 변화를 유도하는 정도를 SNAP25 중첩 qPCR로 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] 60 mm 배양 접시에서 5 mL의 배양액에서 배양된 SiMa 세포에 대해 "SNAP-ASO 3"을 0 zM (음성 대조용), 1 zM, 10 zM, 100 zM, 1 aM, 10 aM, 또는 100 aM의 농도로 처리하였다 (ASO 농도당 2 배양 접시).
[RNA 추출 및 cDNA합성] 전체 RNA를 "RNeasy 미니 키트" (Cat. Number 74106, Qiagen)를 사용하여 제조사의 설명에 따라 추출하였다. 무작위 헥사머에 대하여 200 ng의 RNA 주형을 PrimeScript 1st 스트랜드 cDNA 합성 키트 (Cat. No. 6110B, Takara)를 이용한 25 μL 역전사 반응에 사용하였다.
[qPCR 증폭] 엑손 6과 엑손 7의 연결 부위를 표적하는 택만 탐침을 [(5'→3') 5,6-FAM-CGGCTTCAT-ZEN-CCGCAGGGTAACAA-3IABkFQ] 이용하여 PCR 반응을 추적하였고, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [SNAP-엑손 6_순방향: (5' 3') GACGAACGGGAGCAGATG; 및 SNAP-엑손 8_역방향 (2): (5' 3') ATCTCATTGCCCATATCCAGG]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 PCR 반응을 실시하였다: 95oC 3분에 이어서, 40 주기 95oC 15초 및 60oC 30초.
도 50B에서 qPCR 데이터를 제공하는 데, 1 zM, 100 zM, 1 aM 및 100 aM의 "SNAP-ASO 3"를 처리한 세포에서 전체 길이 mRNA의 양이 유의적으로 (독립표본 T 검정) 각각 약 20% 내지 40%까지 감소하였다. 100 aM의 "SNAP-ASO 3"를 처리한 세포에서 40%의 가장 강한 억제가 관찰되었다.
SNAP25 실시예 8. "SNAP-ASO 1"을 국소 투여한 쥐의 피부에서 SNAP25 단백질 발현의 억제.
"SNAP-ASO 1"은 쥐 유전체 DNA에서 [접속 NCBI 참고 서열: NC_000068] 유래한 쥐 SNAP25 프리-mRNA에서 인트론 6과 엑손 7의 연결 부위에 걸쳐있는 3' 스플라이스 위치에 대해 완전히 상보적인 16-머 ASO이다. 국소 투여한 쥐의 피부에서 "SNAP-ASO 1"이 SNAP25 단백질 발현을 억제하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
[털 제거 및 군분리] 실험 전날에 (날자 0), 5주령 암컷 C57BL/6 쥐 8마리를 졸레틸/롬펀으로 마취하고 등의 (약 3 cm x 4 cm) 털을 클리퍼로 제거한다. 쥐들은 다음과 같이 4군으로 무작위 분리하였다: ASO를 투여하지 않음 (음성 대조용), 1 fM, 10 fM 및 100 fM의 "SNAP-ASO 1" (군당 2마리).
[국소 투여] 국소용액은 "SNAP-ASO 1" 진한 저장 수용액을 3% (v/v) 글리세린이 첨가된 30% (v/v) 에틸 알콜 수용액으로 묽혀 0, 1, 10 및 100 fM의 "SNAP-ASO 1"을 각각 준비하였다. 날자 0에서 4 사이에 공모양의 솜을 사용하여 털을 제거한 동물의 등에 약 100 ㎕의 국소용액을 하루에 2번 국소 투여하였다.
[피부 샘플링] 4일차 오후에, ASO를 국소 투여한 부분의 피부를 채취하기 위하여 졸레틸/롬펀으로 동물을 마취하였다. 피부 샘플은 SNAP25 단백질에 대해 다음과 같이 IHC를 실시하였다.
[SNAP25 IHC] 피부 샘플을 동결 절단하고 (cryosection) 빨간 형광 표지를 위해 200배 묽힌 1차 안티-SNAP25 항체 (Cat. Number ab41455, Abcam), 200배 묽힌 2차 안티-IgG 항체 (Cat Number BA-1100, Vector), 그리고 200배 묽힌 Dylight 594-스트렙타비딘을 (Cat Number SA-5594, Vector, CA, USA) 차례로 사용하여 면역염색하였다. 안티-SNAP25 항체는 SNAP25 단백질의 C-말단을 탐색한다. IHC 이미지는 SNAP25 단백질 발현을 평가하기 위하여 자이스 슬라이드 스캐너에 포착되었다. DAPI 염색은 피부의 미세조직을 시각화하기 위하여 실시되었다.
도 51에서는 대표적인 군별 SNAP25 IHC 이미지를 제공한다. 음성 대조군에서는 피부 바로 밑의 근육층에서 SNAP25 단백질 발현이 높았다. 근육층의 SNAP25 단백질 발현은 운동뉴런 축색 돌기의 SNAP25 단백질 발현에서 유래한다고 생각된다. 근육층에서의 SNAP25 단백질 발현은 투여량이 증가할수록 감소하였는 데, 100 fM 투여군에서 가장 많이 감소하였다.
IHC에 의해 관찰된 피부에서 전체 길이 SNAP25 단백질 발현의 억제는 웨스턴 블럿에 의해 PC12 세포에서 관찰된 억제보다 ("SNAP25 실시예 5" 참고) 더 강한 것으로 보인다. 1차 세포에서 (primary cells) EIciRNA에 의한 전사의 상향 조절은, 있다고 해도, PC12나 SiMA 세포 등의 암세포와 연관된 상향 조절같이 현저하게 일어나지는 않는 것으로 보인다.
TYR ASO들의 생체외 활성의 예
티로시나제는 (TYR) 멜라닌 생성 및 피부 색소와 연관된 효소이다. 표 10에 명시된 화학식 I의 PNA 유도체는 인간이나 쥐 TYR 프리-mRNA에서 엑손 2의 3' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하도록 고안되었다. TYR ASO는 B16F10 (쥐의 흑색종) 세포 및 인간 멜라닌 세포에서 TYR 안티센스 엑손 스키핑 활성이 평가되었다. 화학식 I의 화합물의 예로서 TYR ASO들이 엑손 스키핑을 유도한다는 것을 예시하기 위하여 생물학적 예들이 제공되며, 본 발명의 범위를 TYR ASO들로 한정하기 위함이 아니다.
TYR 실시예 1. B16F10 세포에서 "TYR-ASO 4"에 의해 유도된 엑손 스키핑.
표 10에 명시된 "TYR-ASO 4"는 쥐 TYR 프리-mRNA 중의 인트론 1 및 엑손 2의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치에 완전히 상보적인 13-머 TYR ASO로, [(5' 3') aauuguuuuu cacag┃AUCAUUUG UAGCAGA]의 30-머 쥐 TYR 프리-mRNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 13-머 서열과 상보성 결합을 한다. 반면에, "TYR-ASO 4"는 인간 TYR 프리-mRNA 중의 인트론 1 및 엑손 2의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치와 4개의 갖는 데, [(5' 3') ggguguuuug"u" acag ┃ AU "UG" U "C" UG UAGCCGA]의 30-머 프리-mRNA 서열 내에 인용 부호로 (" ") 표시되었다.
B16F10 흑색종 세포에서 "TYR-ASO 4"가 쥐 TYR 엑손 2의 스키핑을 유도하는 정도를 다음과 같이 평가하였다. "TYR-ASO 4"는 인간 TYR 프리-mRNA에 대해 완전히 상보적인 "TYR-ASO 1"의 좋은 대용품이다.
[세포배양 & ASO 처리] B16F10 쥐 흑색종 세포는 (Cat. Number CRL-6475, ATCC) DMEM 배양액에 (Dulbecco's modified Eagle's essential minimum medium) 10% 소 혈청 (FBS), 0.01 mg/mL 소 인슐린, 그리고 1% 스트렙토마이신/페니실린을 첨가하여 배양하였다. 60 mm 배양 접시에서 5 mL DMEM에 배양된 B16F10 세포에 대해 "TYR-ASO 4"를 0 (음성 대조용), 1, 10, 100, 또는 1,000 aM의 농도로 5시간 동안 처리하였다.
[RNA 추출 및 원스텝 PCR에 의한 cDNA합성] 전체 RNA를 "유니버셜 RNA 익스트랙션 키트 (Universal RNA Extraction Kit)"(Cat. Number 9767, 타카라(Takara))를 사용하여 제조사의 설명에 따라 세포에서 추출하였다. 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [TYR-엑손 1_순방향: (5' 3') GTAAGTTTGGATTTGGGG; 및 TYR-엑손 4_역방향: (5' 3') AGAGCGGTATGAAAGGAA]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 플래티늄 (platinum®) Taq 폴리머라제 (Cat. No. 10928-042, 인비트로젠 (Invitrogen))를 갖는 슈퍼스크립트(Super Script®) 원스텝(One-Step) RT-PCR 키트를 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50oC 30분 및 94oC 2분에 이어서, 15 주기의 94oC 30초, 52oC 30초 및 72oC 40초.
[네스티드 PCR 증폭] 1 μL의 cDNA를, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [TYR-엑손 1n_순방향: (5' 3') GAGAACTAACTGGGGATGA; 및 TYR-엑손 4n_역방향: (5' 3') CGATAGGTGCATTGGCTT]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 20 ㎕ 네스티드 PCR 반응 (Cat. No. K2612, 바이오니어)에서 추가로 증폭시켰다: 95oC 5분에 이어서, 30 주기 95oC 30초, 52oC 30초 및 72oC 40초.
[엑손 스키핑 생성물의 확인] PCR 산물에 대해 2% 아가로스 젤 상에서 전기영동 분리를 수행하였다. 타겟 크기에 따라 밴드들을 수집하고 생거 서열분석에 의해 분석하였다.
도 52A에서는 PCR 산물의 전기영동 데이터를 제공한다. ASO를 처리하지 않은 세포에서 전체 길이 TYR mRNA 밴드 및 엑손 2와 3을 결여한 TYR mRNA 스플라이스 변형체의 밴드의 2개 PCR 밴드가 관찰되었는 데, 이는 엑손 2-3의 스키핑이 저절로 일어난다는 것을 의미한다. 그러나, 1에서 1,000 aM의 "TYR-ASO 4"를 처리한 세포에서는 엑손 2와 3을 결여한 TYR mRNA 스플라이스 변형체만이 관찰되었는 데, 이는 B16F10 세포에서 "TYR-ASO 4"가 엑손 2-3의 스키핑이 더 잘 일어나게 한다는 것을 의미한다.
엑손 스키핑된 PCR 산물은 도 52B에 나타난 바와 같이 엑손 2-3을 결여한 TYR mRNA 스플라이스 변형체로 서열분석되었다.
TYR 실시예 2. "TYR-ASO 4"를 처리한 B16F10 세포에서 TYR mRNA의 qPCR 평가.
B16F10 세포에서 "TYR-ASO 4"가 쥐 TYR mRNA 양의 변화를 유도하는 정도를 TYR 중첩 qPCR로 다음과 같이 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] 60 mm 배양 접시에서 5 mL의 배양액에서 배양된 B16F10 세포에 대해 "TYR-ASO 4"를 0 (음성 대조용), 1, 10, 100, 또는 1,000 aM의 농도로 처리하였다 (ASO 농도당 2 배양 접시).
[RNA 추출 및 원스텝 PCR에 의한 cDNA합성] "TYR 실시예 1"과 같이, 전체 RNA를 추출하였고 cDNA를 합성하였다.
[네스티드 qPCR 증폭] 100배 희석한 1 μL의 cDNA 용액을, 엑손 2와 엑손 3의 연결 부위를 표적하는 택만 탐침을 (Cat. No. Mm00495818_m1, Thermo Fisher Scientific) 이용하여 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 20 ㎕ 실시간 PCR 반응을 실시하였다: 95oC 3분에 이어서, 30 주기 95oC 10초 및 60oC 30초.
[통계 분석] 중첩 qPCR 실험을 독립적으로 4회 실시하였고, 각 실험에서 얻은 각각의 mRNA 양은 ASO를 처리하지 않은 mRNA의 양에 대해서 정규화하였다. 4회의 독립된 실험에서 얻은 mRNA의 양은 독립표본 T 검정에 의한 통계 분석을 위해 모두 모았는 데, ASO의 농도당 8개의 데이터가 되었다.
도 52C에서 모은 qPCR 데이터를 제공하는 데, 1에서 1,000 aM의 "TYR-ASO 4"를 처리한 세포에서 전체 길이 mRNA 양은 유의하게 (독립표본 T 검정) 약 40% 감소하였다.
TYR 실시예 3. B16F10 세포에서 "TYR-ASO 4"에 의한 TYR 단백질 발현의 억제.
B16F10 세포에서 "TYR-ASO 4"가 TYR 단백질 발현을 억제하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
60 mm 배양 접시에서 5 mL의 배양액에서 배양된 B16F10 세포에 대해 "TYR-ASO 4"를 0 zM (음성 대조용), 10 zM, 100 zM, 1 aM, 또는 10 aM의 농도로 24시간 동안 처리한 다음, 1X 단백질 가수 분해 요소 억제제 칵테일이 (Cat. No. P8340, Sigma) 첨가된 200 μL 1X 세포 용해 완충 용액으로 (Cat. No. 9803, Cell Signaling Tech) 세포를 용해하였다. 200 μL의 각 용해액을 100 μL 5X 샘플 완충 용액과 섞은 후 100oC에서 5분 동안 끓였다. 20 μL의 각 용해액에 대해 4-15% TGX 경사 젤 (Cat. Number 456-1086, Bio-Rad) 상에서 전기영동 분리를 수행한 다음 0.45 μm PVDF 막으로 옮겼다. 막은 항-TYR 항체와 (Cat. No. 9319, Cell Signaling Tech) 항-β-액틴 항체로 (Cat. Number a3845, Sigma) 탐색하였다.
도 53A에서는 B16F10 세포 용해액의 TYR 웨스턴 블럿 데이터를 제공한다. 음성 대조군의 용해액에서의 TYR 단백질 발현량이 "TYR-ASO 4"를 처리한 세포의 용해액에서의 TYR 단백질 발현량보다 상당히 많다.
TYR 실시예 4. B16F10 세포에서 "TYR-ASO 4"에 의한 멜라닌 생성의 억제.
B16F10 세포에서 "TYR-ASO 4"가 멜라닌 생성을 억제하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
60 mm 배양 접시에서 5 mL의 배양액에서 배양된 B16F10 세포에 대해 0 zM (음성 대조용), 1에서 1,000 aM의 "TYR-ASO 4", 또는 양성 대조용으로 10 혹은 100 μg/mL의 알부틴을 처리하였다 (투여량당 2 배양 접시). 24시간 후에, 200 μL 1N NaOH로 세포를 용해하였다. 각 용해액을 1.5 mL e-튜브에 모으고 상온에서 밤새 방치해두었다. 각 용해액의 멜라닌 함량은 ELISA 리더기로 측정한 475 nm에서의 흡광도로 결정하였다. 다른 패시지의 (passage) 세포를 사용하여 네번 반복 실험하였고, 네 세트의 멜라닌 함량 데이터는 음성 대조군의 멜라닌 함량에 대해 독립표본 T 검정에 의한 통계 분석을 위해 모두 모았다.
도 53B는 "TYR ASO 4"나 알부틴을 24시간 동안 처리한 B16F10 세포에서 멜라닌 함량의 변화를 요약한다. 10 μg/mL 및 100 μg/mL의 알부틴을 처리한 세포에서 멜라닌 함량이 각각 약 15% 및 25% 유의하게 감소하였다. "TYR ASO 4"를 처리한 세포에서는 멜라닌 함량이 약 15% 유의하게 감소하였으며 용량 의존성은 크지 않았다. "TYR ASO 4"의 억제 활성은 10 μg/mL 알부틴의 억제 활성과 유사하였다.
TYR 실시예 5. "TYR-ASO 1"을 처리한 인간 멜라닌 세포에서 TYR mRNA의 qPCR 평가.
표 10에 명시된 "TYR-ASO 1"은 인간 TYR 프리-mRNA 중의 인트론 1 및 엑손 2의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치에 완전히 상보적인 13-머 TYR ASO로, [(5' 3') ggguguuuug uacag ┃ AUUGUCUG UAGCCGA]의 30-머 인간 TYR 프리-mRNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 13-머 서열과 상보성 결합을 한다.
1차 상피 멜라닌 세포에서 (primary epidermal melanocytes) "TYR-ASO 1"이 인간 TYR mRNA 양의 변화를 유도하는 정도를 TYR 중첩 qPCR로 다음과 같이 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] 1차 상피 멜라닌 세포는 (Cat. Number PCS-200-013, ATCC) 성인 멜라닌 세포 성장 키트 요소 (Adult Melanocyte Growth Kit Component; Cat. Number PCS-200-042, ATCC)가 첨가된 피부 세포 기저 배양액에서 (Dermal Cell Basal Medium, Cat Number PCS-200-030, ATCC) 배양되었다. 60 mm 배양 접시에서 5 mL의 배양액에서 배양된 멜라닌 세포에 대해 "TYR-ASO 1"을 0 zM (음성 대조용), 1 zM, 100 zM, 또는 10 aM의 농도로 처리하였다 (ASO 농도당 3 배양 접시).
[RNA 추출 및 원스텝 PCR에 의한 cDNA합성] "TYR-ASO 1"를 처리하고 5시간 후에, 전체 RNA를 "RNeasy 미니 키트" (Cat. Number 74106, Qiagen)를 사용하여 제조사의 설명에 따라 추출하였다. 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [TYR-엑손 1_순방향(2): (5' 3') CTCTTTGTCTGGATGCATT; 및 TYR-엑손 5_역방향: (5' 3') CTGTGGTAATCCTCTTTCT]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 플래티늄 (platinum®) Taq 폴리머라제 (Cat. No. 10928-042, 인비트로젠 (Invitrogen))를 갖는 슈퍼스크립트(Super Script®) 원스텝(One-Step) RT-PCR 키트를 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50oC 30분 및 94oC 2분에 이어서, 15 주기의 94oC 30초, 50oC 30초 및 72oC 1분.
[네스티드 PCR 증폭] 1 μL의 cDNA를, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [TYR-엑손 2n_순방향: (5' 3') GATAAAGCTGCCAATTTC; 및 TYR-엑손 3n_역방향: (5' 3') TTGTGCATGCTGCTTTGA]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 20 ㎕ 네스티드 PCR 반응 (Cat. No. K2612, 바이오니어)에서 택만 [(5'→3') 5,6-FAM-CACTGG-ZEN-AAGGATTTGCTAGTCCAC-3IABkFQ] 탐침에 대해 추가로 증폭시켰다: 95oC 3분에 이어서, 40 주기 95oC 10초 및 60oC 30초.
도 53C에서는 qPCR 데이터를 제공하는 데, 1 zM에서 10 aM의 "TYR-ASO 1"을 처리한 인간 멜라닌 세포에서 전체 길이 TYR mRNA 양이 약 30% 감소하였다. 1 zM에서 10 aM의 "TYR-ASO 1"을 처리한 세포에서 관찰된 감소는 통계적으로 유의하였다 (독립표본 T 검정).
PD-1 ASO들의 생물학적 활성의 예
예정된 세포사 단백질 1 (programmed cell death protein 1) 혹은 CD279로도 알려진 PD-1은 면역 세포에서 발현되는 세포 표면 수용체이며, 면역 반응의 하향 조절에 관련된 면역 검문소 (check-point) 단백질이다. 니볼루맙이나 (nivolumab) 펨브로리주맙과 (pembrolizumab) 같은 PD-1 단일클론 항체는 면역 반응을 증가시키는 기전으로 고형 종양을 치료하는 데 사용되고 있다.
표 11에 명시된 화학식 I의 PD-1 ASO는 인간이나 쥐 PD-1 프리-mRNA에서 엑손 2의 3' 스플라이스 위치나 5' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하도록 고안되었다. PD-1 ASO에 대해 Jurkat 세포에서 안티센스 엑손 스키핑 활성과 신제닉 (syngenic) 종양이 주입된 야생형 쥐에서 항종양 효능이 평가되었다. 화학식 I의 화합물의 예로서 PD-1 ASO들이 엑손 스키핑을 유도한다는 것을 예시하기 위하여 생물학적 예들이 제공되며, 본 발명의 범위를 PD-1 ASO들로 한정하기 위함이 아니다.
PD-1 실시예 1. Jurkat 세포에서 "PD-ASO 3"에 의해 유도된 엑손 스키핑.
표 11에 명시된 "PD-ASO 3"은 인간 PD-1 프리-mRNA 중의 엑손 2 및 인트론 2 의 연결 부위에 걸쳐 있는 5' 스플라이스 위치에 완전히 상보적인 14-머 PD-1 ASO로, [(5' 3') AGCUCA GGGUGACAG ┃ gugcg gccucggagg]의 30-머 인간 PD-1 프리-mRNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 14-머 서열과 상보성 결합을 한다. "PD-ASO 3"은 엑손 2와 9-머 오버랩을 그리고 인트론 2와 5-머 오버랩을 한다.
Jurkat 세포에서 "PD-ASO 3"이 인간 PD-1 엑손 2의 스키핑을 유도하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] Jurkat 세포는 (Cat. Number TIB-152, ATCC) RPMI-1640 배양액에 10% 소 혈청 (FBS) 및 1% 스트렙토마이신/페니실린을 첨가하여 배양하였다. 60 mm 배양 접시에서 5 mL 배양액에 배양된 Jurkat 세포에 대해 "PD-ASO 3"을 0 (음성 대조용), 10, 100, 또는 1,000 aM의 농도로 5시간 동안 처리하였다.
[RNA 추출 및 원스텝 RT-PCR에 의한 cDNA합성] 전체 RNA를 RNAeasy 미니 프렙 키트 (RNAeasy mini prep kit, Qiagen, USA)를 사용하여 제조사의 설명에 따라 추출하였다. 500 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [PD-엑손 1_순방향: (5' 3') GTCGTCTGGGCGGTGCTACAAC; 및 PD-엑손 5_역방향: (5' 3') GGGTGTGGAA-ATAGATGGG]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 원스텝(One-Step) RT-PCR 키트를 (Invitrogen, USA) 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50oC 30분 및 94oC 2분에 이어서, 30 주기의 94oC 30초, 53oC 30초 및 72oC 1분.
[중첩 PCR 증폭] 100배 묽힌 1 μL의 cDNA를, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [PD-엑손 1n_순방향: (5' 3') GGCTGGCGGCCAGGATGGTTC; 및 PD-엑손 5n_역방향: (5' 3') GAAAGACAATGGTGGCATACTCC]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 20 ㎕ 네스티드 PCR 반응 (Invitrogen, USA)에서 추가로 증폭시켰다: 40 주기의 95oC 20초, 56oC 30초 및 72oC 40초.
[엑손 스키핑 생성물의 확인] 중첩 PCR 산물에 대해 2% 아가로스 젤 상에서 전기영동 분리를 수행하였다. 타겟 크기에 따라 밴드들을 수집하고 생거 서열분석에 의해 분석하였다.
도 54A에서는 PCR 산물의 전기영동 데이터를 제공한다. ASO를 처리하지 않은 세포에서는 전체 길이 mRNA의 PCR 산물 밴드만이 생성되었다. 반면에, PD-1 ASO를 처리한 세포에서는 세 개의 새로 형성된 PCR 산물 밴드가 관찰되었다. 세 개의 PCR 산물 밴드 중에서 약 470 bp 크기의 밴드는 (도 54A에서 비특이적이라고 표시된 것) 생거 서열분석에 의하면 엑손 스키핑에 의한 PD-1 mRNA 스플라이스 변형체가 아니었다.
10 및 100 aM의 "PD-ASO 3"을 처리한 세포에서는 생거 서열분석에 의하면 엑손 2의 스키핑에 의한 PCR 산물 밴드가 관찰되었다. 그러나, 1,000 aM의 "PD-ASO 3"을 처리한 세포에서는 엑손 2의 스키핑에 의한 PCR 산물 밴드가 사라졌고, 전체 길이 mRNA의 양이 적은 양의 ASO를 처리한 세포에서의 전체 길이 mRNA의 양보다 많은 것으로 관찰되었다. 엑손 2와 엑손 3의 스키핑이라고 지정한 두 개의 PCR 산물은 생거 서열분석으로 확인하였다 (도 54B 참고). 중첩 PCR 데이터에서 역전된 용량 반응 패턴은 "PD-ASO 3"에 의한 엑손 스키핑 중에 축적된 "엑손 인트론 고리형 RNA (EIciRNA)"에 의한 전사 상향조절 때문일 수도 있다 [Nature Struct. Mol. Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)].
PD-1 실시예 2. "PD-ASO 3"을 처리한 Jurkat 세포에서 PD-1 mRNA의 qPCR 평가.
Jurkat 세포에서 "PD-ASO 3"이 인간 PD-1 mRNA 양의 변화를 유도하는 정도를 PD-1 중첩 qPCR로 다음과 같이 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] 60 mm 배양 접시에서 5 mL의 배양액에서 배양된 Jurkat 세포는 1 μg/mL 항-CD3 항체와 (Cat. Number 16-0037, eBioscience) 0.5 μg/mL 항-CD28 항체로 (Cat. No. 16-0289, eBioscience) 48시간 동안 활성화시켰다. 새 배양액으로 갈아준 다음 "PD-ASO 3"을 0 (음성 대조용), 10, 100, 또는 1,000 aM의 농도로 24시간 동안 처리하였다 (ASO 농도당 4 배양 접시).
[RNA 추출 및 원스텝 RT-PCR에 의한 cDNA합성] 전체 RNA를 RNAeasy 미니 프렙 키트 (RNAeasy mini prep kit, Qiagen, USA)를 사용하여 제조사의 설명에 따라 추출하였다. 500 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [PD-엑손 1_순방향: (5' 3') GTCGTCTGGGCGGTGCTACAAC; 및 PD-엑손 5_역방향: (5' 3') GGGTGTGGAAATAGATGGG]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 원스텝(One-Step) RT-PCR 키트를 (Invitrogen, USA) 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50oC 30분 및 94oC 2분에 이어서, 30 주기의 94oC 30초, 53oC 30초 및 72oC 1분.
[SYBR에 의한 중첩 qPCR] 100배 묽힌 1 μL의 cDNA를, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [PD-엑손 2_순방향: (5' 3') ACAACGCCACCTTCACCTGC; 및 PD-엑손 2_역방향: (5' 3') GCCAGCTTGTCCGTCTGGTTG]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 20 ㎕ 중첩 qPCR 증폭을 실시하였다: 40 주기의 95oC 20초, 56oC 30초 및 72oC 40초. qPCR 반응은 SYBR로 (Bio-Rad, USA) 탐색되었다.
도 55A에서는 qPCR 데이터를 제공하는 데, 10 및 100 aM의 "PD-ASO 3"을 처리한 세포에서는 PD-1 mRNA 양이 80% 이상 유의하게 (독립표본 T 검정) 감소하였다. 1,000 aM의 "PD-ASO 3"을 처리한 세포에서는 PD-1 mRNA 양이 음성 대조군의 약 55%로 반등하였다. 1,000 aM에서 PD-1 mRNA 양의 반등은 "PD-1 실시예 1"에서 관찰된 바 있는 역전된 용량 반응 패턴과 일치한다 (도 54A 참고).
PD-1 실시예 3. "PD-ASO 3"을 처리한 Jurkat 세포에서 IL-2 mRNA의 qPCR 평가.
PD-1 활성이 하향 조절되면 인터루킨 2의 (IL-2) 발현이 상향 조절된다고 알려져 있다 [Am. J. Clin. Oncol. Vol 39(1), 98-106 (2016)]. Jurkat 세포에서 "PD-ASO 3"이 인간 IL-2 mRNA 양의 변화를 유도하는 정도를 IL-2 중첩 qPCR로 다음과 같이 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] 60 mm 배양 접시에서 5 mL의 배양액에서 배양된 Jurkat 세포는 1 μg/mL 항-CD3 항체와 (Cat. Number 16-0037, eBioscience) 0.5 μg/mL 항-CD28 항체로 (Cat. No. 16-0289, eBioscience) 48시간 동안 활성화시켰다. 새 배양액으로 갈아준 다음 "PD-ASO 3"을 0 (음성 대조용), 10, 100, 또는 1,000 aM의 농도로 24시간 동안 처리하였다 (ASO 농도당 4 배양 접시).
[RNA 추출 및 cDNA합성] 전체 RNA를 RNAeasy 미니 프렙 키트 (RNAeasy mini prep kit, Qiagen, USA)를 사용하여 제조사의 설명에 따라 추출하였다. 500 ng의 RNA 주형을 PrimeScriptTM 1st 스트랜드 합성 키트를 (PrimeScriptTM 1st strand cDNA synthesis kit, Takara, Japan) 이용하여 제조사의 설명에 따라 25 μL 역전사 반응에 사용하였다.
[SYBR에 의한 qPCR] 1 μL의 cDNA를, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [IL-2_순방향: (5' 3') GTCACAAACAGTGCACCTAC; 및 IL-2_역방향: (5' 3') GGTGAGTTTGGGATT-CTTGTA]의 IL-2 mRNA를 표적하는 프라이머 세트에 대해 20 ㎕ qPCR 증폭을 실시하였다: 40 주기의 95oC 20초, 56oC 30초 및 72oC 40초. qPCR 반응은 SYBR로 (Bio-Rad, USA) 탐색되었다.
도 55B에서는 IL-2 qPCR 데이터를 제공하는 데, 10, 100 및 1,000 aM의 "PD-ASO 3"을 처리한 세포에서 IL-2 mRNA 양이 각각 약 140%, 120% 및 40%로 유의하게 (독립표본 T 검정) 증가하였다. 이러한 역전된 용량 반응 패턴은 "PD-1 실시예 1"과 "PD-1 실시예 2"에서 관찰된 바 있는 역전된 용량 반응 패턴과 일치한다 (도 54A 및 도 55A 참고).
PD-1 실시예 4. "PD-ASO 1"을 처리한 Jurkat 세포에서 PD-1 mRNA의 qPCR 평가.
표 11에 명시된 "PD-ASO 1"은 인간 PD-1 프리-mRNA 중의 인트론 1 및 엑손 2의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치에 완전히 상보적인 14-머 PD-1 ASO로, [(5' 3') cucuccaucu cucag ┃ ACUCCCCAG ACAGGC]의 30-머 인간 PD-1 프리-mRNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 14-머 서열과 상보성 결합을 한다. "PD-ASO 1"은 인트론 1과 5-머 오버랩을 그리고 엑손 2와 9-머 오버랩을 한다.
별다른 언급이 없으면 "PD-1 실시예 2"와 같이, Jurkat 세포에서 "PD-ASO 1"이 인간 PD-1 mRNA 양의 변화를 유도하는 정도를 PD-1 중첩 qPCR로 다음과 같이 평가하였다.
도 56A에서는 qPCR 데이터를 제공하는 데, 100 및 1,000 aM의 "PD-ASO 1"을 처리한 세포에서는 PD-1 mRNA 양이 약 60% 유의하게 (독립표본 T 검정) 감소하였다. "PD-ASO 3"의 경우와는 다르게, "PD-ASO 1"은 역전된 용량 반응 패턴에 대한 명백한 의견을 나타내지 않았다.
PD-1 실시예 5. C57BL/6 쥐에서 B16F10 흑색종에 대한 "PD-ASO 2"의 항종양 활성.
표 11에 명시된 "PD-ASO 2"는 쥐 PD-1 프리-mRNA 중의 엑손 2 및 인트론 2 의 연결 부위에 걸쳐 있는 5' 스플라이스 위치에 완전히 상보적인 16-머 PD-1 ASO로, [(5' 3') AGCUC GUGGUAACAG ┃ gugagg cuaguagaa]의 30-머 쥐 PD-1 프리-mRNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 16-머 서열과 상보성 결합을 한다. "PD-ASO 2"는 엑손 2와 10-머 오버랩을 그리고 인트론 2와 6-머 오버랩을 한다.
반면에, "PD-ASO 2"는 인간 PD-1 프리-mRNA와 네 개의 부정합을 갖는 데, [(5' 3') AGCUC"AG" GGU "G" ACAG ┃ gug "c" gg ccucggagg]의 30-머 인간 PD-1 프리-mRNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 12-머 서열과 상보성 결합을 하며 네 개의 부정합은 인용 부호로 (" ") 표시되었다. "PD-ASO 2"는 인간 PD-1 프리-mRNA에 대해서 상보적인 "PD-ASO 3"의 대용 ASO로 생각된다.
B16F10 흑색종 세포가 주입된 C57BL/6 4주령 수컷 쥐에서 "PD-ASO 2"의 항종양 활성이 아래와 같이 평가되었다.
[B16F10 흑색종 세포의 접종] B16F10 쥐는 흑색종 세포는 (Cat. Number CRL-6475, ATCC) DMEM 배양액에 10% 소 혈청 (FBS), 1% 페니실린/ 스트렙토마이신 및 0.01 mg/ml 소 인슐린을 첨가하여 150 mm 배양 접시에서 배양하였다. 실험 전날 (날자 0), 50 μL PBS에 녹인 약 1x105개의 B16F10 세포를 각 동물의 오른쪽 뒤옆구리에 주입하였다.
[군분리 및 ASO 투여] 3일차에 몸무게를 기준으로 동물을 0 (음성 대조용), 2, 10, 또는 50 pmole/Kg의 "PD-ASO 2" 네 개의 투여군으로 무작위 군 분리하였다 (군당 15마리).
주사액 "PD-ASO 2" 진한 저장 수용액을 PBS로 묽혀 음성 대조용으로 0 nM (PBS만), 0.4 nM, 2 nM 및 12.5 nM "PD-ASO 2", 그리고 2, 10 및 50 pmole/Kg "PD-ASO 2" 군으로 준비하였다.
3일차부터 17일차 사이에 일주일에 2회씩 5 mL/Kg의 주사액을 동물에게 피하 투여하였다.
[항종양 활성] 음성 대조군과 ASO 투여군 사이의 종양 크기 변화로 항종양 활성을 평가하였다.
도 56B는 0일차부터 19일차 사이에 관찰된 종양 크기를 군별로 제공한다. 2 pmole/Kg 투여군의 종양 성장은 10일차부터 19일차 사이에 유의성있게 억제되었으며 19일차에 약 55% 억제된 것으로 관찰되었다 (2 pmole/Kg 투여군과 음성 대조군은 각각 약 375 mm3와 850 mm3). 10일차부터 17일차 사이에 50 pmole/Kg 투여군의 항종양 활성은 2 pmole/Kg 투여군과 유사하다. 그러나, 50 pmole/Kg 투여군의 항종양 활성은 19일차에 사라졌다. 10 pmole/Kg 투여군의 항종양 활성은 전체 기간 동안 유의성 없이 미미하였다.
이러한 이상한 용량 반응 패턴은 "PD-ASO 2"에 의한 엑손 스키핑 중에 축적된 "엑손 인트론 고리형 RNA (EIciRNA)"에 의한 전사 상향조절 때문일 수도 있다 [Nature Struct. Mol. Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)]. 미국 FDA에 의해 승인된 PD-1 단일클론 항체 약인 니볼루맙이 종양 환자에서 종 모양의 용량 반응 패턴을 보인 것을 고려하면 [J. Clin. Oncol. Vol 33(18), 2013-2020 (2015)], "PD-ASO 2"의 이상한 용량 반응 패턴은 PD-1 억제의 고유한 약리학 때문일 수도 있다.
19일차에 종양의 무게를 군별로 측정하기 위하여 동물들을 희생시켰다. 2 pmole/Kg 투여군과 음성 대조군의 평균 종양 무게는 각각 0.35g 및 1.20g 이었다. 즉, 종양 성장을 무게로 평가하는 경우, 2 pmole/Kg 투여군에서 약 70% 유의성있게 억제되었다 (p<0.01, 독립표본 T 검정).

Claims (14)

  1. 화학식 I로 표시되며, 프리-mRNA의 인트론/엑손 혹은 엑손/인트론 연결 부위를 표적하여 엑손 스키핑을 유도하는, 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    [화학식 I]

    화학식 I 중에서,
    n은 10와 25 사이의 정수이며;
    화학식 I의 화합물은, 표적하는 프리-mRNA의 인트론 7-머와 엑손 7-머로 구성되는 14-머의 표적하는 스플라이스 위치와 최소한 12-머 이상의 상보적인 결합을 하며;
    화학식 I의 화합물은 표적하는 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적인 결합을 하거나, 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
    상기 표적 스플라이스 위치 서열이, 인간 안드로젠 수용체 프리-mRNA내의 [(5' → 3') UUGCCUGGUAAGGA], 인간 SCN9A 프리-mRNA내의 [(5' → 3') UUUUUGCGUAAGUA] 및 인간 HIF-1α 프리-mRNA내의 [(5' → 3') UAAGUAGGAUAAGU]를 포함하지 않으며;
    S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소 [H]이며;
    X는 수소이며; Y는 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐이고, 여기에서 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐은 하기에서 선택되며:
    ;
    Z는 아미노 [-NH2] 기이며;
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실에서 선택되는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택된다:

    화학식 Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ 중에서,
    R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며; 그리고,
    L1, L2 그리고 L3는 화학식 V로 대표되는 공유결합성 링커이며, 염기성 아민과 핵산 염기쌍을 형성하는 부분인 핵산 염기를 연결시켜 준다:
    [화학식 Ⅴ]

    화학식 V 중에서,
    Q1과 Qm은 메틸렌 (-CH2-)이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
    Q2, Q3, … 그리고 Qm-1은 메틸렌과 산소(-O-) 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
    m 은 1과 15 사이의 정수이다.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    화학식 I 중에서,
    n은 11과 19 사이의 정수이며;
    화학식 I의 화합물은, 표적하는 프리-mRNA의 인트론 7-머와 엑손 7-머로 구성되는 14-머의 표적하는 스플라이스 위치와 최소한 12-머 이상의 상보적인 결합을 하며;
    화학식 I의 화합물은 표적하는 프리-mRNA 서열과 완전히 상보적인 결합을 하며;
    S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
    X는 수소이며;
    Y는 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐이고, 여기에서 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐은 하기에서 선택되며:
    ;
    Z는 아미노 기이며;
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 그리고 시토신에서 선택되는 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
    B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 다섯 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
    R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
    L1은 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)3-, -CH2-O-(CH2)4-, CH2-O-(CH2)5-, -CH2-O-(CH2)6-, 또는 -CH2-O-(CH2)7- 이고 우측 단부가 염기성 아민에 직접 연결되며; 그리고,
    L2와 L3는 -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, 그리고 -(CH2)2-O-(CH2)3- 중에서 각자 독립적으로 선택되며 우측 단부가 염기성 아민에 직접 연결된다.
  8. 세포의 단백질 발현의 시험관 내 조절을 위해 제 1항의 펩타이드 핵산 유도체 또는 그의 염을 사용하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 1 pM 이하 농도의 펩타이드 핵산 유도체의 수용액을 사용하는 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제 1항 또는 제7항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 화합물:
    상기 화합물은, 표적하는 프리-mRNA의 인트론 7-머와 엑손 7-머로 구성되는 14-머의 표적하는 스플라이스 위치와 최소한 12-머 이상의 상보적인 결합을 하며;
    표적하는 스플라이스 위치 서열 중에서 인간 SNAP25 프리-mRNA내의 [(5' → 3') AUCCCAGGGUAACA], 인간 SCN9A 프리-mRNA내의 [(5' → 3') UGUUUAGGUACACU] 및 인간 티로시나제 프리-mRNA내의 [(5' → 3') UGUACAGAUUGUCU]는 포함되지 않는다.

  14. 삭제
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X701 Decision to grant (after re-examination)