KR102668187B1 - 락토바실러스 플란타럼 ndhs 01 균주 및 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 피부 항노화용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 본 발명은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NDHS 01 균주 및 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 피부 항노화용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NDHS 01 균주(기탁번호 KCTC 15440BP)는 항염증 또는 항산화 효과를 나타내고, 또한 프로콜라겐 발현 증가 효과를 나타내므로, 피부 노화 방지를 위한 조성물로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NDHS 01 균주 및 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 피부 항노화용 조성물에 관한 것이다.
최근 화장품 소재 동향을 살펴보면 생물 전환 기술을 적용한 소재가 주목받고 있는데, 이는 발효기술을 더욱 발전시킨 형태로 유효성분의 약리활성을 증가시키거나 일반적인 천연 추출물과 다르게 완전히 새로운 효능을 보이는 것으로 알려져 각광을 받고 있다.
현재까지 알려진 많은 발효 미생물은 여러 국가와 많은 기업들이 지적재산권으로 등록하여 그 권리를 주장하고 있어 쉽게 사용할 수 없는 실정이기에 발효 종균을 확보하고 개발할 필요성이 있으며, 발효 균주 개발과 그 관련 정보의 데이터베이스 구축에도 노력을 기울이고 있다.
피부노화는 흔히 피부주름, 처짐 및 늘어짐의 증가와 관련된 외적 및 내적인 과정에 의한 것으로서, 외적 노화는 반복되는 자외선(ultraviolet rays, UV) 노출에 의해 주로 발생하기 때문에 이를 일반적으로 '광노화'라고한다. 자연적으로 노화된 피부는 매끄럽고 창백하며 잔주름이 있으나, 광노화된 피부는 굵은 피부주름이 생기고 색소침착 및 모세혈관 확장증을 야기하게 된다.
아디포넥틴은 지방세포에서 특이적으로 분비되는 단백질 호르몬인 아디포카인의 일종으로서, 인슐린의 기능을 증진시키고 인슐린 저항성을 유도함으로써 고혈당, 고인슐린증, 비만, 동맥경화와 같은 심혈관 질환 등을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 또한, 아디포넥틴은 암세포의 전이와 염증반응을 억제하는 기능이 있다. 아디포넥틴은 각질세포의 증식뿐만 아니라 피부에서 필라그린(filaggrin), 히알루론산(hyaluronic acid)과 세포외 기질의 발현을 촉진함으로써 상처치료, 섬유화 억제, 피부주름개선, 보습 등의 기능을 수행한다. 아디포넥틴은 244개의 아미노산으로 구성되어 있으며 신호서열(signal sequence), N-말단(N-terminal)에 위치한 콜라겐-유사 도메인과 C-말단에 위치한 C1q-유사 구형 도메인(globular domain)으로 이루어져 있다. 육합체(hexamer)와 400 kDa의 고분자 복합체(HMW complex)가 주요한 소중합체(oligomer)로서, 상기 고분자 복합체는 저분자 복합체(LMW complex) 보다 더 활성이 높은 것으로 알려져 있다.
본 발명자는 자체 발효 종균을 확보하기 위해 피부 노화가 시작되기 전인 20대 초반 건강한 여성의 피부로부터 유용물질을 생산하는 미생물을 확보하여 발효를 통해 유용물질의 함량을 극대화시키고 독성은 감소시키며, 기능성을 극대화시키고자 다양한 선별 방법을 통해 유산균, 효모 등 유익균주들을 분리, 선별하고자 하였다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NDHS 01 균주(기탁번호 KCTC 15440BP)를 제공한다.
상기 균주 또는 균주 배양액은 서열번호 1의 16S rRNA 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
상기 균주 또는 균주 배양액은 항염증 또는 항산화 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.
상기 균주 또는 균주 배양액은 프로콜라겐 발현 증가 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.
상기 균주 또는 균주 배양액은 L-프롤린과 함께 배양되는 경우 프로콜라겐 발현 효과를 향상시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 균주 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 균주의 사균체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 피부 항노화용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 균주 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 균주의 사균체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 피부 항노화용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NDHS 01 균주(기탁번호 KCTC 15440BP)는 항염증 및 항산화 효과를 나타내고, 나아가 프로콜라겐 발현 증가 효과를 나타내므로, 피부 노화 방지를 위한 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명은 피부 노화 방지 또는 주름 개선 효과를 갖는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NDHS 01 균주(기탁번호 KCTC 15440BP)에 관한 것으로, 상기 균주는 항염증 또는 항산화 효과를 나타내고, 또한 프로콜라겐 발현 증가 또는 콜라게나아제 발현 억제 효과를 나타낸다.
상기 균주는 L-프롤린과 함께 배양되는 경우 프로콜라겐 발현 효과를 향상시키는 것을 특징으로 한다. 본 발명자의 실험에 의하면, 상기 균주 배양시 L-프롤린을 첨가하는 경우 L-프롤린을 첨가하지 않은 경우에 비하여 프로콜라겐 발현 효과를 향상시키는 것을 확인하였으며, 피부 항노화 효과를 향상시키기 위해서는 본 발명의 균주 배양시 L-프롤린을 첨가하는 것이 바람직하며, 상기 L-프롤린은 배지 총 중량 대비 0.1 ~ 5 중량%첨가되는 것이 바람직하다.
상기 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NDHS 01 균주(기탁번호 KCTC 15440BP)는 MRS 배지에서 배양될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 피부 노화 방지 또는 주름 개선 효과를 갖는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NDHS 01 균주(기탁번호 KCTC 15440BP) 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 균주의 사균체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기 유효성분 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물이 크림으로 제조되는 경우 상기 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NDHS 01 균주(기탁번호 KCTC 15440BP) 배양물, 베헤닐알코올, 스테아린산, 폴리솔베이트 60, 솔비탄 세스퀴올레이트, 소르비탄 스테아레이트, 자기유화형 모노스테아린산 글리세린, 스쿠알란, 프로판디올, 글리세린, 카르복시폴리머, 트리에탄올아민, 1,2 헥산다이올 및 정제수를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 피부 노화 방지 또는 주름 개선 효과를 갖는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NDHS 01 균주(기탁번호 KCTC 15440BP) 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 균주의 사균체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 건강기능식품은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강 기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 피부 노화 방지 또는 주름 개선 효과를 증진시키기 위 보조제로 섭취가 가능하다.
이하 본 발명에 대하여 구체적으로 상세히 설명하고자 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 따로 정의하지 않는 경우 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 내용으로 해석되어야 할 것이다.
본 명세서의 도면 및 실시예는 통상의 기술자가 본 발명을 쉽게 이해하고 실시하기 위한 것으로 도면 및 실시예에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 내용은 생략될 수 있으며, 본 발명이 도면 및 실시예로 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 독자 균주 분리
20대 초반 건강한 여성의 뺨 부위에서 샘플을 채취한 미생물중 유산균을 1차적으로 선별할 수 있도록 산도가 높아지면 노란색으로 변색되어 유산균 선별이 가능한 BCP agar 배지를 통해 유산균 분리 수행을 하였으며, MRS broth 배지를 이용해 단일 콜로니 형태를 보이는 3개의 유산균을 분리하였다.
BCP Agar 배지에 상기 제작된 희석액 sample 106, 107 , 108 , 109 을 100uL씩 넣은 후 도말한 뒤, 30℃ 배양 후, 넘버링하였다.
2. 미생물의 동정
상기 분리된 3개의 유산균(하기 표 참고)을 특정하기 위하여 DNA 추출과 16s rRNA sequencing을 수행하였으며, Single Colony의 DNA를 Fast DNA Spin kit(MP Biomedical, France)를 사용하여 추출하였으며 추출된 DNA를 template로 하여 16s rDNA Universal primer를 이용한 증폭을 수행하였다. 16s rRNA sequencing을 수행하여 얻어진 sequence는 NCBI((http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 D/B를 활용하여 동정하였다.
상세하게는 gDNA로부터 universal primer에 해당되는 27F(5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3')와 1492R(5' TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACTT 3')에 의해 PCR을 수행하여 염기서열을 분석하였고, MEGA5 program (Kumar et al, 2011)으로 phylogenetic tree를 작성하여 이들 중 분리 균주와 가까운 유연관계에 있는 species를 조사하였다.
균주의 동정 및 계통학적 위치를 결정하기 위해 16S rRNA 염기서열을 분석을 진행한 결과, 분리한 3종의 유산균은 Leuconostoc mesenteroides, Enterococcus faecalis, Lactobacillus plantarum와 상동성이 높았으며, Lactobacillus plantarum과는 99.22%의 높은 상동성을 나타내었다.
| No. |
균주명
(Hit taxon name) |
Similarity | Diff/Total nt | Completeness (%) | 배지 | 배양온도 |
| 1 | Lactobacillus plantarum | 99.22 | 11/1410 | 96.1 | MRS | 37℃ |
| 2 | Leuconostoc mesenteroides | 98.4 | 23/1438 | 100 | 30℃ | |
| 3 | Enterococcus faecalis | 99.03 | 14/1450 | 100 | 37℃ |
특히. Lactobacillus plantarum의 경우 선행 연구로 주름 개선 및 보습 효과 등이 우수한 것으로 알려진 유산균에 해당되며(Lee et al, 2015), 이에 항노화 소재로써 가능성이 있는 후보 균주로써 선별하고 Lactobacillus plantarum strain NDHS 01라고 명명하였다. 상기 Lactobacillus plantarum strain NDHS 01 균주의 16S rRNA 염기서열은 [서열번호 1]과 같다;
[서열번호 1]
GGAGCAGGCAGCATACTGCAGTCGACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCTCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGAACCTTTAGAACCGCCGCTAATCTCGCTGGTAAA.
3. 락토바실러스 플란타럼 NDHS 01
균주의 최적의 생장 조건 확인
선별된 균주를 이용한 배양의 화장품 소재로써 이용을 위한 공정 표준화를 위해 Lactobacillus plantarum NDHS 01의 최적의 온도별, pH별 생장 조건을 확인고자 하였다.
(1) 온도에 따른 균주의 최적 생장 조건
Lactobacillus plantarum NDHS 01의 생장에 미치는 온도의 영향을 확인하기 위해 먼저 MRS broth(non-animal)에서 O.D 600 값이 1.0이 되게 seed 배양한 후 MRS broth(non-animal)에 1%씩 접종하여 각각 25, 30, 37℃에서 정치 배양하여 O.D 600 값을 측정하여 최적 배양온도를 확인하였다.
| O.D (600nm) |
0H | 4 H | 8 H | 12 H | 24 H | 48 H | 72 H | 96 H |
| 25℃ | 0 | 0.52 | 0.84 | 1.27 | 1.45 | 1.42 | 1.46 | 1.15 |
| 30℃ | 0 | 0.63 | 1.12 | 1.56 | 2.08 | 1.75 | 1.82 | 1.35 |
| 37℃ | 0 | 0.67 | 1.31 | 2.21 | 2.37 | 2.25 | 2.19 | 1.68 |
적합한 미생물을 활용하여 소재의 유효물질을 최대로 전환시키고자, 선별된 Lactobacillus plantarum NDHS 01의 최적 생장 온도 조건을 확인한 결과, 다른 온도에 비하여 37℃에서 배양이 잘 이루어지는 것을 확인하였다.
(2) pH에 따른 균주의 최적 생장 조건
Lactobacillus plantarum NDHS 01의 생장에 미치는 pH의 영향을 확인하기 위해 MRS broth(non-animal)에서 O.D 600 값이 1.0이 되게 seed 배양한 후 pH 3.5, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0으로 조절한 MRS broth(non-animal)에 1% 씩 접종하여 정치 배양한 O.D 600 값을 측정하여 최적의 pH를 확인하였다.
| O.D (600nm) |
0H | 4 H | 8 H | 12 H | 24 H | 48 H | 72 H | 96 H |
| pH3.5 | 0 | 0.32 | 0.35 | 0.34 | 0.36 | 0.35 | 0.35 | 0.34 |
| pH4.0 | 0 | 0.54 | 0.65 | 1.01 | 1.45 | 1.48 | 1.23 | 1.05 |
| pH5.0 | 0 | 0.65 | 1.33 | 2.23 | 2.42 | 2.43 | 2.35 | 2.12 |
| pH6.0 | 0 | 0.72 | 1.38 | 2.32 | 2.45 | 2.41 | 2.36 | 2.25 |
| pH7.0 | 0 | 0.68 | 1.29 | 1.82 | 2.37 | 2.35 | 2.23 | 1.95 |
적합한 미생물을 활용하여 소재의 유효물질을 최대로 전환시키고자, 선별된 Lactobacillus plantarum NDHS 01의 최적의 생장 pH 조건을 확인한 결과, pH 5.0 ~ 7.0, 바람직하게는 pH 5.0 ~ 6.0에서 배양이 잘 이루어지는 것을 확인하였다.
이후 Lactobacillus plantarum NDHS 01 균주를 37℃, pH 5.0 ~ 6.0에서 36시간 배양한 후, 원심분리하여 상등액을 0.22㎛ 필터로 여과하여 후속 실험에 사용하였다.
<실험예>
1.
Lactobacillus plantarum
NDHS 01 균주 배양액의 안전성 평가
살아있는 세포 내의 미토콘드리아에 존재하는 탈수소효소는 Tetrazolium Salt(WST)에서 formazan이라는 발색물질을 생성한다. 따라서 이를 측정하여 살아있는 세포의 수를 측정할 수 있다.
96 well cell culture plate 에 3 x 103 cells/well 농도의 CCD-986sk 세포를 10% fetal bovine serum(FBS), 1% Penicillin/Streptomycin(p/s)이 첨가된 IMDM 배양액으로 24 시간 배양한 뒤, serum free, 1% penicillin/streptomycin 이 첨가된 IMDM 으로 배지를 교체하고 24 시간 배양하였다.
Lactobacillus plantarum NDHS 01 균주 배양액이 농도 별로 포함된 IMDM(serum free, P/S 1%) 배지로 교체하여 48 시간 배양하고, 배양이 끝난 세포에 EZ-CYTOX (EZ-1000, Daeil lab service, Korea)를 10% 함유한 IMDM(serum free, P/S 1%)배지로 교체하고 2 시간 반응후 450nm 에서 흡광도를 측정해 세포생존율을 측정하였다.
* Cell viability (%) = (시료 첨가군의 흡광도/무처리군 흡광도)*100
| 농도 (ug/ml) |
세포 생존율(%) | ||||
| 1차 | 2차 | 3차 | 평균 | 표준편차 | |
| 0 | 99.85 | 101.51 | 100.1 | 100.49 | 0.90 |
| 6.25 | 113.15 | 110.93 | 110.16 | 111.41 | 1.55 |
| 12.5 | 112.29 | 111.73 | 112.24 | 112.09 | 0.31 |
| 25 | 111.09 | 110.33 | 110.04 | 110.49 | 0.54 |
| 50 | 108.29 | 109.66 | 109.32 | 109.09 | 0.71 |
| 100 | 103.13 | 102.79 | 102.53 | 102.82 | 0.30 |
| 200 | 101.92 | 103.08 | 103.21 | 102.62 | 0.71 |
상기 표 4를 참고하면, Lactobacillus plantarum NDHS 01 균주 배양액은 섬유아세포에 200 ug/ml 이하의 농도로 처리 시 100 % 이상의 세포 생존율을 나타내는 것으로 확인하였다. (p-value; <0.05)
2. 항염증 시험 (Nitric oxide assay)
마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 10% fetal bovine serum(FBS) 및 1% penicillin/streptomycin이 함유된 DMEM 배지를 이용하여 100mm cell culture dish를 사용하여 5% CO2 배양기에 배양한다. Confluence에 도달한 세포는 scraper를 사용하여 계대 배양하여 유지하였다.
RAW 264.7 세포를 2 Х 105 cells/dish density로 24well plate에 분주하여 24시간 동안 plate에 부착시킨다. 염증반응을 유발하기 위해 1㎍/㎖ 농도의 LPS (lipopolysaccharide)와 시험물질을 함유한 새로운 배지를 처리하여 24시간 배양함.
RAW 264.7 세포에서 생성되어 배양액에 존재하는 NO 수준을 Griess 반응을 기본으로 하는 NO detection kit (intron)를 사용하여 측정하였으며 NO가 존재한다고 추정되는 배양액을 96 well plate에 100㎕씩 분주한 후 N1 buffer (sulfanilamide) 50㎕를 넣어 10분간 실온에서 반응시킴. 이어서 N2 buffer (naphthylethylenediamine) 50㎕를 넣고 10분간 실온에서 반응시킨후 540nm에서 흡광도 측정하고, 각 NO 생성량은 nitrite standard를 이용하여 얻은 표준검량곡선을 이용하여 산출하였다.
| 농도(%) | NO 억제율 (%) | |||||
| 1차 | 2차 | 3차 | 평균 | 표준편차 | ||
| (-) LPS (1ug/ml) |
0 | 0 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 |
| (+) LPS (1ug/ml) |
0.125 | 14.36 | 15.9 | 13.66 | 14.64 | 1.15 |
| 0.25 | 7.79 | 11.05 | 9.08 | 9.31 | 1.64 | |
| 0.5 | 12.87 | 12.54 | 13.57 | 12.99 | 0.53 | |
| 1.0 | 14.9 | 13.27 | 13.65 | 13.94 | 0.85 | |
| 2.0 | 29.71 | 30.04 | 27.69 | 29.15 | 1.27 | |
| 4.0 | 52.5 | 55.26 | 53.33 | 53.70 | 1.42 | |
Lactobacillus plantarum NDHS 01 균주 배양액이 RAW264.7 세포의 Nitric oxide (NO) 생성에 미치는 영향을 확인한 결과, 4% 농도에서 약 53% 정도의 NO 억제율을 나타내는바, Lactobacillus plantarum NDHS 01 균주 배양액에 항염증 활성이 있는 것을 확인하였다.
3. 항산화 시험 (DPPH assay)
Free Radical에 대한 소거 능력을 측정하여 항산화능을 평가하는 실험 방법으로, 락토바실러스 배양액을 다양한 농도로 희석하여 시료를 준비한 후, 0.1mM DPPH 62.5㎕(1,1-diphenyl -2-picrylhydrazyl)용액을 혼합 후 30분간 4℃에서 반응시켰다.
반응이 끝나면 각 sample을 96well plate에 담아 ELISA reader기를 이용하여 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 그리고 Positive control로 Ascorbic acid를 사용하여 진행하였으며, 시료를 넣지 않은 경우를 대조군으로 하여 시료의 자유라디칼 소거량(Free radical scavenging activity, %)을 확인하였다.
* Free radical 소거 활성 (%) = 100-(b/a)Х100
a : 공시료액의 반응 후의 흡광도
b : 시료액의 반응 후의 흡광도
| 농도 (ug/ml) |
Free radical scavenging (% of control) | 통계분석 (p-value) |
||||
| 1차 | 2차 | 3차 | 평균 | 표준편차 | ||
| 0 | 0.44 | -0.22 | -0.22 | 0 | 0.38 | - |
| 0.3125 | 8.30 | 6.99 | 7.64 | 7.64 | 0.66 | <0.001 |
| 0.625 | 13.54 | 12.88 | 13.54 | 13.32 | 0.38 | <0.001 |
| 1.25 | 24.67 | 25.33 | 24.02 | 24.67 | 0.66 | <0.001 |
| 2.5 | 48.25 | 48.25 | 48.25 | 48.25 | 0.00 | <0.001 |
| 5 | 60.70 | 61.35 | 60.70 | 60.92 | 0.38 | <0.001 |
| 10 | 60.90 | 67.25 | 66.59 | 67.25 | 0.66 | <0.001 |
항산화 활성을 가지는 것으로 알려진 ascorbic acid를 양성 대조군으로 한 DPPH radical 소거 활성 시험 결과를 [표 6]에 나타내었다. 그 결과, ascorbic acid 는 0.3125 내지 10 ug/mL 범위에서 농도의존적이고 통계적으로 유의한(p<0.05) 수준의 DPPH radical 소거활성을 나타내어(IC50 : 2.58 ug/mL), 본 시험 과정에 문제가 없음을 확인하였다.
| 농도 | Free radical scavenging (% of control) | 통계분석 (p-value) |
||||
| 1차 | 2차 | 3차 | 평균 | 표준편차 | ||
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | - |
| 0.25 | 26.45 | 27.36 | 24.22 | 26.01 | 1.62 | <0.001 |
| 0.5 | 33.88 | 32.29 | 33.68 | 33.28 | 0.87 | <0.001 |
| 1.0 | 64.99 | 63.07 | 62.62 | 63.56 | 1.26 | <0.001 |
| 2.0 | 86.25 | 88.32 | 85.64 | 86.74 | 1.40 | <0.001 |
| 4.0 | 93.2 | 89.81 | 90.39 | 91.13 | 1.81 | <0.001 |
| 5.0 | 80.12 | 82.28 | 80.95 | 81.11 | 1.34 | <0.001 |
Lactobacillus plantarum NDHS 01 균주 배양액은 0.25 내지 4 wt% 농도 범위에서 농도 의존적이며, 통계적으로 유의한 (p<0.05) 수준의 DPPH radical 소거 활성을 나타내었다. 특히, 4% 농도에서 가장 높은 91.13% 의 radical 소거 활성을 나타내었다. 상기 균주 배양액이 5 wt%의 농도로 첨가되는 경우에는 오히려 항산화 활성이 감소하는 효과를 나타내었으며, 따라서 Lactobacillus plantarum NDHS 01 균주 배양액의 최적의 항산화 활성을 발휘하기 위해서는 4 wt% 농도 범위로 첨가되는 것이 바람직하다.
4. 항노화(항주름) 시험 - 프로콜라겐 생합성능 시험
Lactobacillus plantarum NDHS 01 균주 배양액을 hFF(human Foreskin Fibroblast) 세포에 각각의 농도로 처리하고 24시간 배양 후 Procollagen Type ⅠC-peptide(PIP) kit인 96well plate에 각각 농도별로 처리한 배양액을 100㎕씩 분주해주고 37℃에 넣고 2시간동안 반응시켜주었다.
이 후 D-PBS로 세척해준 뒤, antibody-POD conjugate solution을 각각 100㎕씩 분주해주고 37℃에 넣고 1시간동안 반응시켜주었다. 다시 D-PBS로 세척해준 뒤, substratesolution (3,3',5,5'- Tetrametyl benzidine)을 각각 100㎕씩 분주해주고 상온에서 15분간 반응시켜주었다. 15분 뒤, multi-reader기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
| 균주 배양액 | ||||||
| 농도 (㎍/㎖) | control | 25 | 50 | 100 | 200 | 400 |
| 발현양 | 1.00 | 1.27 | 1.32 | 1.52 | 2.29 | 1.67 |
프로콜라겐 생합성능 확인 결과, Lactobacillus plantarum NDHS 01 균주 배양액 처리 농도에 비례하여 프로콜라겐 발현량이 증대됨을 확인할 수 있으며, 농도인 200 ㎍/㎖ 처리 시 control과 대비하여 전사량이 2.29 배 증가되었다. 그러나 Lactobacillus plantarum NDHS 01 균주 배양액을 400 ㎍/㎖로 처리하는 경우에는 200 ㎍/㎖ 처리한 경우에 비하여 전사량이 오히려 감소하는 경향을 나타내었으며, 최적의 프로콜라겐 생합성능을 위해서 Lactobacillus plantarum NDHS 01 균주 배양액을 200 ㎍/㎖로 처리하는 것이 바람직하다.
5. 영양인자에 따른 프로콜라겐 생합성능 시험
(1) 영양인자에 따른 균주의 생장 조건
Lactobacillus plantarum NDHS 01의 생장에 미치는 영양인자별 영향을 확인하기 위해 먼저 MRS broth(non-animal)에서 O.D 600 값이 1.0이 되게 seed 배양한 후 영양인자로써 아미노산의 일종인 L-프롤린, 비타민B에 해당하는 비오틴, 미네랄류에 해당되는 염화마그네슘을 각각 1% 씩 접종하여 37℃, pH 5.0 ~ 6.0의 조건에서 배양한 후 O.D 600 값을 측정하였다.
| O.D (600nm) |
0H | 4 H | 8 H | 12 H | 24 H | 48 H | 72 H | 96 H |
| 미첨가 | 0 | 0.62 | 1.28 | 2.14 | 2.33 | 2.38 | 2.12 | 1.85 |
| L-프롤린 | 0 | 0.56 | 1.24 | 1.95 | 2.22 | 2.28 | 2.01 | 1.74 |
| 비오틴 | 0 | 0.57 | 1.22 | 1.94 | 2.24 | 2.30 | 2.07 | 1.75 |
| 염화마그네슘 | 0 | 0.55 | 1.24 | 1.97 | 2.19 | 2.26 | 1.98 | 1.74 |
적합한 미생물을 활용하여 소재의 유효물질을 최대로 전환시키고자, 선별된 Lactobacillus plantarum NDHS 01 균주의 최적 생장 영양인자별 조건을 확인한 결과, L-프롤린, 비오틴 및 염화마그네슘을 첨가한 경우에 첨가하지 않은 경우에 비하여 Lactobacillus plantarum NDHS 01 균주의 성장성이 약간 감소하는 경향을 나타내었으나, 크게 차이가 나는 것은 아니었다. 따라서 L-프롤린, 비오틴 및 염화마그네슘은 Lactobacillus plantarum NDHS 01 균주의 성장을 크게 저해하지 않는 것으로 확인되었다.
(2) 프로콜라겐 생합성능 시험
Lactobacillus plantarum NDHS 01 균주 배양액 및 생장 조건 인자로써 검토했던 아미노산의 일종인 L-프롤린, 비타민B에 해당하는 비오틴, 미네랄류에 해당되는 염화마그네슘을 각각 처리한 Lactobacillus plantarum NDHS 01 균주배양액(24h) 각각에 대해 프로콜라겐 발현양 변화를 확인하였다.
실험은 배양액별로 hFF(human Foreskin Fibroblast) 세포에 각각의 농도로 처리하고 24시간 배양 후 Procollagen TypeⅠC-peptide(PIP)인 96well plate에 각각 농도별로 처리한 배양액을 100㎕씩 분주해주고 37℃에 넣고 2시간동안 반응시켜주었다.
이 후 D-PBS로 세척해준 뒤, antibody-POD conjugate solution을 각각 100㎕씩 분주해주고 37℃에 넣고 1시간동안 반응시켜주었다. 다시 D-PBS로 세척해준 뒤, substratesolution (3,3',5,5'- Tetrametyl benzidine)을 각각 100㎕씩 분주해주고 상온에서 15분간 반응시켜주었다. 15분 뒤, multi-reader기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다
| 발현양 | Control | 25 (㎍/㎖) |
50 (㎍/㎖) |
100 (㎍/㎖) |
200 (㎍/㎖) |
400 (㎍/㎖) |
| 배양액 1 (미첨가) |
1.00 | 1.27 | 1.32 | 1.52 | 2.29 | 1.67 |
| 배양액2 (L-프롤린 1%) |
1.00 | 1.36 | 1.53 | 2.01 | 2.98 | 2.21 |
| 배양액3(비오틴 1%) | 1.00 | 1.22 | 1.28 | 1.45 | 1.75 | 1.33 |
| 배양액4(염화마그네슘 1%) | 1.00 | 1.12 | 1.25 | 1.37 | 1.68 | 1.27 |
프로콜라겐 생합성능 확인 결과, Lactobacillus plantarum NDHS 01 균주 배양액 처리 농도에 비례하여 프로콜라겐 발현량이 증대됨을 확인할 수 있으며, 농도인 200 ㎍/㎖ 처리 시 control과 대비하여 전사량이 2.98 배 증가되었으나 Lactobacillus plantarum NDHS 01 균주 배양액을 400 ㎍/㎖로 처리하는 경우에는 200 ㎍/㎖ 처리한 경우에 비하여 전사량이 오히려 감소하는 경향을 나타내었으며, 최적의 프로콜라겐 생합성능을 위해서 Lactobacillus plantarum NDHS 01 균주 배양액을 200 ㎍/㎖로 처리하는 것이 바람직하다.
추가로 영양인자에 따른 Lactobacillus plantarum NDHS 01 균주 배양액별 프로콜라겐 발현량을 확인한 결과, 농도에 비례하여 L-프롤린을 함유한 균주 배양액이 다른 영양인자인 비오틴이나 염화마그네슘을 함유한 균주 배양액에 비하여 Lactobacillus plantarum NDHS 01 균주의 프로콜라겐 발현 효과를 향상시키는 것을 확인할 수 있었다.
Claims (5)
- 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NDHS 01 균주(기탁번호 KCTC 15440BP)로 상기 균주는 프로콜라겐 발현 증가 효과를 갖고, 상기 균주는 L-프롤린과 함께 배양되는 경우 프로콜라겐 발현 효과를 향상시키는 것을 특징으로 하는 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 항염증 또는 항산화 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
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