KR102644658B1 - 모노클로날 항체 항-fgfr4 - Google Patents

모노클로날 항체 항-fgfr4 Download PDF

Info

Publication number
KR102644658B1
KR102644658B1 KR1020207005364A KR20207005364A KR102644658B1 KR 102644658 B1 KR102644658 B1 KR 102644658B1 KR 1020207005364 A KR1020207005364 A KR 1020207005364A KR 20207005364 A KR20207005364 A KR 20207005364A KR 102644658 B1 KR102644658 B1 KR 102644658B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
antibody
amino acid
acid sequence
fgfr4
Prior art date
Application number
KR1020207005364A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200040772A (ko
Inventor
파올라 갈리나리
찬탈 파올리니
제시카 필로카모
미르코 브루네티
아르민 람
한스-프리드리히 그루네르트
존 톰슨
루씨아 리치-비티아니
마우로 비포니
Original Assignee
엑시리스 에스.알.엘.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 엑시리스 에스.알.엘. filed Critical 엑시리스 에스.알.엘.
Publication of KR20200040772A publication Critical patent/KR20200040772A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102644658B1 publication Critical patent/KR102644658B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 모노클로날 항체 항-FGFR4 및 이들의 약제 및 진단 시약으로서의 용도에 관한 것이다. 특히 이것은 FGFR4의 산박스 도메인 및 이들의 특이적 부분에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 상기 항체를 위한 핵산 코딩, 이들의 발현 및 제조를 위한 벡터 및 숙주 세포, 상기 항체를 포함하는 항체-약물 콘쥬게이트 및 약제학적 조성물이 또한 본 발명의 범위 내이다. 본 발명은 또한 대장암 줄기 세포의 검출, 죽임, 이들의 발달 및/또는 분화에 영향을 미치거나 억제하는데 사용되는 항체 항-FGFR4에 관한 것이다.

Description

모노클로날 항체 항-FGFR4
본 발명은 모노클로날 항체, 특히 모노클로날 항체 항-FGFR4 및 이들의 약제 및 진단 시약으로서의 용도에 관한 것이다.
암은 서방 세계에서 가장 일반적인 질병들 중 하나이며 점차 그 수가 증가하고 있고, 세계적으로 증가하는 사회적 경제 부담을 나타낸다. 암 생물학에 대한 우리의 이해도가 상당히 개선되었지만, 고형 전이성 종양을 갖는 환자들은 근본적으로 치료가 불가능하고 이들의 삶의 질은 때때로 치료 결과로 인해 크게 영향을 받게 된다. 2012년에 전세계적으로 14,100,000 새로운 암 케이스와 8,200,000 명의 사망과, 2035년까지 매년 24,000,000의 새로운 케이스가 나올 것이라는 추정치는 암이 여전히 세계적으로 중요한 공중 건강 문제로 남아있다(Ferlay et al. 2015).
치료적으로 진행 암을 효율적으로 다룰 수 없는 우리의 능력은 최근 새로운 이론적 기반을 얻게 되었다. 유력한 증거들은, 분화된 암 세포 자손을 만들고 원 자리 및 먼 위치로 종양을 효율적으로 퍼트릴 수 있는 높은 종양형성 잠재력을 갖는 미분화된 암 세포들의 독특한 서브세트를 기초로 많은 정상 세포 조직에서뿐만 아니라 다른 혈액학적 종양 및 고형 종양에서 세포의 계층적 조직의 실존을 뒷받침하였다(Bonnet & Dick, 1997; Brittan & Wright, 2004; Barker et al., 2007; Lapidot et al., 1994; Reya et al., 2001; Singh et al., 2003; Al-Hajj et al., 2003). 이들 공통적 용어 암 줄기 세포(CSC)는 특이적 표면 마커의 발현을 기초로 확인되었고 자기 재생 능력 및 비대칭적으로 나누어 2개의 다른 딸 세포를 발생시키는 이들의 능력을 기초로 정의되었으며, 하나는 줄기세포 특징을 유지하고 하나는 일시적으로 조상을 증폭시켜 최종적으로 분화된 암 세포들로 점진적으로 분화한다(Valent et al., 2012). 게다가, 분리된 CSCs는 종래 화학치료 및 방사선치료에 매우 저항적인 것으로 입증되었다(Maugeri-Sacca et al., 2011; Bao et al., 2006; Diehn et al., 2009). 이들은 모든 종양 세포에 대한 주요 근원으로서 정의되고, 지속적인 주요 종양 성장, 재발 및 전이에 필수적이며, 치료 저항성의 주요 메커니즘을 대표한다. 직접적인 임상 결과로서, 줄기 세포 구역에 영향을 미치지 않고 분화된 조상들에 작용하여 벌크한 종양을 제거하는 것은 단지 일지적인 성공일 뿐이고 이어서 재발 및/또는 전이가 뒤따를 것이기 때문이므로, 효과적인 치료법은 또한 CSCs를 표적으로 해야만 한다.
결장 직장암(Colorectal cancer, CRC)은 세계적으로 질병률 및 사망률의 주요 원인이다. 모든 암 발생률의 13% 이상이고 3번째로 가장 일반적으로 진단된 악성 종양이고 암 관련 사망의 선두 4번째 원인이고, 약 1,400,000 새로운 케이스 발병과 세계적으로 매년 700,000 사망의 발생원인이다. 게다가, 세계적인 부담이 60% 증가하여 2,200,000 이상의 새로운 케이스와 2030년까지 1,100,000 암 사망에 이를 것으로 예상된다(Arnold et al., 2017). 초기 단계 CRC는 수술 단독으로만 치료될 수 있거나 또는 수술 및 화학 치료의 조합으로 치료될 수 있는 반면에, 전이성 질병은 거의 항상 치료불가능하고 상당한 의학적 도전을 요구하고 의료보험제도에 부담이 되고 있다. 약 30% 환자들은 초기 친단에서 전이성 질병을 나타내는 반면에, 국소적 질병으로 진단된 환자들의 25%는 몇 년 후에 전이성으로 발달할 것이다(American Cancer Society). 그러므로 종양 제거를 위한 새로운 치료 전략 개발이 매우 중요하다.
본 발명자들 중 일부는 일차적으로 CRC 종양 시료로부터 CSCs를 분리하고(Ricci-Vitiani et al. 2007; Dalerba et al., 2007), 이들의 분리 및 인비트로(in vitro) 배양, 캐릭터리제이션(characterization) 및 이비보(in vovo) 전파를 위하여 표준 프로토콜을 개발하였다. 특히 이들 세포들은 면역결핍성 마우스 내에 이종이식(xenograft)을 형성하는 능력을 나타내며, 상기 면역결핍성 마우스는 역사적으로 그리고 유적학적으로 이들이 원래 분리되었던 종양들을 표현형모사한 것이다(Blaiocchi et al.,2010).
현재 대장 CSCs를 선택적으로 표적할 약물이 없으며, 임상 샘플에서 이들을 검출할 수 있게 하는 활발한 분석법도 없다 (Zeuner et al. 2014).
우리는 대장 CSCs가 티로신 키나아제 섬유아세포성장인자 수용체 4 (FGFR4)를 발현하고 이들 단백질이 대장 CSCs의 몇가지 중요한 기능들을 제어한다는 것을 발견하였다.
연속해서, 본 발명자들은 유전적 면역화를 위한 기존 기술을 사용하여 이 항원에 대한 모노클로랄 항체를 생성하였다 (다음 참조: 예를 들어 다음 참조 문헌들: Bioprocessing - Genetic Immunization for Antibody Production. Tutorial: Genovac's Technological Shortcut From Gene to Antibody. By John Thompson, Ph.D., and Stefan Lang, Ph.D., published in Genetic Engineering News, Vol. 22, No. 17, October 1, 2002; Custom-made antibodies produced by genetic immunisation: Applications in drug development, therapy and diagnosis. By Stefan Lang and John Thompson, published in Global Outsourcing Review, Vol. 5, No. 1, Spring 2003; A shortcut from genomics to drug development. By Jens Lohrmann, Stefan Lang 및 John Thompson, published in Current Drug Discovery, October 2003).
이들 항체는 환자 샘플에서 대장 CSCs를 검출하는데 유용하고 CSC 개체군에서 새로운 CRC 치료의 효과를 측정하는 것을 목표로한 임상 등급 분석법에서의 응용성도 발견하였다.
보다 중요하게는, 항체가 CSC 생존 및 증식에 영향을 미칠 수 있어 치료적 가치를 갖는다는 것을 발견한 것이다.
종양형성에서 중요한 역할자로서 나타난 성장인자 신호전달 경로 내에서, FGF는 최근에 종양 발달, 진행 및 전이에서 큰 주목을 받고 있다(Dienstmann et al. 2014; Hierro et al., 2015). 수용체 티로신 키나아제(RTKs)로 작용하는 22 인간 FGFs 및 4 타입의 FGF 수용체(FGFRs)가 있다(Goetz & Mohammadi, 2013). 일단 활성화되면, FGF/FGFR 신호전달은 다중 하류 경로, 예를 들어 세포 증식을 조절하는 RAS-MAPK, 또는 세포 생존을 조절하는 PI3K-AKT를 통해 진행한다(Beenken & Mohammadi, 2009).
프로토타입 FGFR의 외세포 영역은 유연한 링커로 연결된 3개의 면역글로불린(Ig)-유사 도메인( Ig I, Ig II, 및 IgIII)로 이루어진다. FGFR의 독특한 특성은 Ig I-Ig II 링커 내 위치한 글루타메이트-, 아스파르테이트-, 및 세린-풍부한 시퀀스의 스트레치와 산 박스(Acid Box, AB)의 말단이다. AB/링커의 손실은 FGF에 대한 FGFR의 친화성을 증가시키고 FGFR의 신호전달 능력을 증가시키며, 이는 수용체의 이 부분이 FGFR 자기억제를 제어한다는 것을 나타낸다(Kalinina et al., 2012). 산 박스의 유연한 성질은 "폐쇄된" 낮은 활성 상태로 FGFR을 유지하는 분자내 상호작용을 용이하게 하고, 여기서 이 리간드를 위한 FGFR의 친화도는 줄어든다(Olsen et al., 2004). 이 영역의 손실은 암에 관련되어 있다(Onwuazor et al., 2003).
증가하는 수 많은 최근 공개된 데이터들은 큰 패널의 신생세포에서 FGFR4의 역할을 제시하고 있으며, 이는 서브세트의 간세포암종 (hepatocellular carcinoma, HCC), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma) 암, 및 결장 직장암(colorectal cancer), 전립선암, 유방암, 뇌하수체암, 폐암(NSCLC), 위 및 난소 종양을 포함하는 다른 고형 신생세포 종양에서 이 수용체 및/또는 이의 리간드 FGF19의 과발현을 나타내고 있다(Lin & Desnoyers, 2012; Wu & Li, 2012; Katoh & Nakagama, 2014; Crose et al., 2012; Li et al. 2014; Sahadevan et al., 2007; Andre & Cortes, 2015; Abbass et al., 1997; Huang et al., 2015; Chen H et al., 2015; Zaid et al., 2013). 이들 종양 타입의 일부에서, FGFR4는 이의 유전자 내에서 좋지 못한 전조 생체 지표 및 몇가지 폴리모피즘(polymorphism)으로서 확인되어 왔고, 이중 대부분 연구된 것들인 rs351855 (Gly388Arg)은 종양 진행 및 나쁜 예후와 긍정적으로 관련이 있다(Spinola et al., 2005a, 2005b; Taylor et al., 2009; Cho et al., 2016; Xu et al., 2011; Streit et al., 2004; Yang et al., 2012; Frullanti et al., 2011). 임상 전 연구는 세포 증식(간, 결장직장, 난소 및 전립선 암종)(Ho et al., 2009; Wu et al., 2010; Desnoyers et al., 2008; Pai et al. 2008; Pelaez-Garcia et al., 2013; Zaid et al., 2013; Yu et al., 2011), 세포 생존(횡문근육종암 및 간암, 결장 직장암, 유방암, 위 암종), 및 세포 다중 약물 내성 (결장직장암 및 유방 암종) (Ho et al., 2009; Turkington et al., 2014; Zaid et al., 2013; Ye et al., 2013; Roidl et al. 2009)의 유도에서 FGF19-FGFR4 축에 대한 종양 촉진자 역할을 강조하여왔다. 게다가, 세포 운동성, 침입성 및 상피간엽이행 (epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)을 촉진하는데 있어서 FGFR4에 대한 역할이 또한 CRC에서 강조되어 왔다(Pelαez-Garc
Figure 112020019445964-pct00001
a et al., 2013; Liu et al., 2013).
이를 기초로 FGF19-FGFR4 축의 억제는 다른 종양 타입에 대한 새로운 치료 전략으로서 최근 고려되어 왔고, 특히 간세포암종 (HCC)에 대한 새로운 치료 전략으로 고려되어 왔다.
간 암은 세계에서 5번째로 가장 일반적인 악성종양이나, 높은 치사율 때문에 사망 원인으로서는 2번째로 랭크되어 있다(Ferlay et al. 2015). HCC는 초기 단계에서 통상 무증상이기 때문에 치료가 어려우며, 증상이 나타났을 때 통상 이미 항암 요법 단계로 도달하였다(Fong et al., 2001; Bruix & Sherman 2005). 수술 절제술 및 간 이식이 실행되었어도, 5-년 생존율은 부분적으로는 대부분의 환자들이 늦게 진단된다는 사실로 인하여 크게 개선되지 않았다(Trovato et al., 2015). 추가적으로, 많은 HCC 환자들은 표준 방사선요법 및 화학요법에 낮은 민감도를 나타낸다(Llovet et al., 2015; Worns & Galle, 2014).
그러므로, HCC에서 비상식적으로 활성화된 분자 경로를 표적으로 하는 비세포독성제(non-cytotoxic agent)가 긴급하게 요구된다는 공통 의견이 있다 (Hoofnagle 2004).
HCC 진행의 분자 기초는 매우 다종적이며, 심지어 동일한 종양 내에서도 다종적이다(El-Serag & Rudolph, 2007; Thorgeirsson & Grisham, 2002). 최근 수년 내에, 몇가지 증거 조각들은, 일부 유전자 및 세포 신호전달 경로는 HCC의 발달 및 진행에서 주요 역할을 한다고 규정하였다(Chen & Wang, 2015). 게다가, 상피세포증식인자(EGF), 간세포생장인자(HGF), 인슐린유사성장인자(IGF), 종양증식인자(TGF), 혈소판유래성장인자(PDGF) 및 섬유아세포성장인자(FGF)와 같은 일부 성장 인자 신호전달 경로는 간 발암을 포함하는 종양형성에서 중요한 플레이어로서 나타났다 (Enguita-Germαn & Fortes, 2014; Yoshida et al., 2014; Hopfner et al., 2008). FGF 수용체들 중에서, FGFR4는 인간 간세포에서 우세한 동형단백질이며, 인간 HCC 및 HCC 세포주에서 과발현된다(Lin et al., 2007; Ho et al., 2009). 게다가, FGFR4는 간암발생에 필요한 것으로 나타났으며, 이는 자발적인 HCC를 발달시키는 경향이 있는 FGF19 유전자이식 마우스가, 이들이 FGFR4 넉아웃 마우스과 교차된 후 간 종양을 발달시키는 데 실패했기 때문이다(French et al., 2012). 게다가, 내생 회장(endogenous ileal) FGF15는 임상적으로 관련된 마우스 모델에서 섬유증-관련 간세포 발암에 기여하는 것으로 나타났다 (Uriarte et al., 2015).
정상 간세포에서, FGF19는 담즙산 합성에서 첫번째 속도-제한 단계인, Cyp7a1를 암호화하는 유전자의 억압을 통해 간 담즙산 신진대사를 조절한다(Inagaki et al., 2005; Chiang et al., 2009). 소화관(gut)에 의해 분비된 FGF19(및 이의 쥐과 호모로그 FGF15)는 간세포 상의 FGFR4에 결합하여 내분비 호르몬으로 작용하여, Cyp7a1의 활성화를 방지하고 그로 인하여 담즙산 합성을 억제한다. FGFR4 KO 마우스는 보다 큰 담즙산 풀(pool), 담즙산의 분비 증가 및 담즙산-열화된 쓸개를 갖으며, 이는 콜레스테롤 및 담즙산 합성의 음성적 조절을 나타낸다(Xie et al., 1999; Yu et al., 2000). 예상되는 키나아제 활성이 없는 막 관통 단백질인 Klotho beta (KLB)은 FGF19의 간-특이적 활성(Lin et al., 2007)에 필요한 보조인자로 확인되었고, 담즙산 합성의 손상된 음성적 피드백 억제는 klotho beta-결핍 마우스에 설명되어 있다(Ito et al., 2005).
이전 연구들은 항-FGF19 항체로 처리하면 대장 종양 이종이식(xenograft)의 성장을 줄이고 FGF19 유전자 이식 마우스 내에서 간세포암종을 방지한 것을 보여줬다(Desnoyers et al., 2008). 그러나, 필리핀 원숭이(cynomolgus monkey)에서 반복된 복용량 안전성 연구에서, 항-FGF 19 치료(3~100mg/kg)는 심각한 설사 및 낮은 식량 소비를 동반하는 복용량-관련 간 독성을 나타냈다(Pai et al. 2012).
따라서, 효과적이면서 우수한 치료적 지표, 즉 낮거나 또는 적어도 허용가능한 독성을 갖는, FGFR4와 이의 리간드의 상호작용을 효과적으로 저해할 수 있는 항체 또는 치료제의 필요성이 여전히 존재한다.
FGFR4를 표적으로 하는 치료적 항체 및 소분자의 항-종양 효과를 기초로 한 보다 최근 연구에서는 동물 모델에서 HCC 및 다른 종양 아이소타입에 대한 효능을 입증해왔고 일부는 현재 임상 시험으로 평가되는 중이다.
본 발명의 근본적인 문제는 FGFR4 발현, 과발현 및/또는 과잉행동과 관련된 질병을 지난, 예방 및/또는 치료하는데 사용될 수 있는 항-FGFR4 항체를 제공하는 것이었다.
수 많은 항-FGFR4 모노클로랄 항체는 활성화된 FGFR4 경로를 갖는 HCC 및 다른 종양 타입의 마우스 모델에서 치료적 효능을 나타냈다(French et al., 2012; Bumbaca et al., 2011; Bartz et al., 2016; US 9266955 B2; WO 2014/105849 A1; WO 2016/023894 A1). 게다가 이들 항체들(U3-1784, U3/Daiichi Sankyo, NCT02690350) 중 하나의 상 I 연구는 발전된 고체 종양 및 간 암 환자에서 계속 진행중이다.
게다가, FGFR4에 매우 특이적인 새로운-세대 티로신 키나아제 수용체 억제제는 HCC의 마우스 모델(Hagel et al., 2015; WO 2014/011900 A2; WO 2016/151499 Al; US 2016/0244450 A1)에서 입증되어 왔고, 이들 중 2개는 현재 HCC 및 담관암 환자(BLU-554, Blueprint, NCT02508467), 및 양성 FGFR4 및 KLB 발현에 의해 특징되는 HCC 및 고형 종양(FGF401, Novartis, NCT02325739)에서 이들의 용인성(tolerability) 및 효능에 대해 임상 단계 I/II에서 현재 평가되고 있다.
FGF 수용체의 표적화와 관련된 추가 특허 문헌은 다음과 같다: US20050147612, US20070248605, US8263074, US20140301946, US20110212091, US20160017027, US9284379, US20100143386, US7531304, WO2010004204, WO2015107171.
그러나, 상기 언급된 문헌에 개시된 항체 또는 억제제의 어느 것에서도 대장암 줄기 세포의 활성이 보여지지 않았다.
따라서, 대장암 줄기세포(colon CSC)를 표적으로 하여 이들을 죽이거나 적어도 실질적으로 이들의 성장, 증식 및 분화를 억제할 수 있는 약제의 필요성이 강하게 요구된다.
진단 분석법에서 이들을 밝히기 위하여 대장 CSC를 검출할 수 있는 약제의 필요성이 강하게 요구된다.
현재 인비트로 및 인비보 둘 다에서 FGFR4는 대장암 줄기 세포에 대한 치료적 표적이고, CSC에서 FGFR4의 존재는 보다 높은 증식률 및 클론원성 효율 및 보다 높은 이동성 경향과 관련되어 있다는 것을 밝히고 입증하였다.
그러므로, FGFR4에 관련되고 이의 활성을 억제할 수 있는 약제는 대장암 줄기 세포의 활성을 죽이거나 억제하기 위하여 대장암에서 유리하게 사용될 수 있다. FGFR4가 대장 CSC에 존재한다는 것을 발견했기 때문에, 항원에 관련된 약제는 또한 상기 세포들을 검출하고 인식하는데 유리하게 사용될 수 있다.
리간드와 이들의 상호 작용을 효과적으로 억제하고 효과적인 항종양제로서 작용할 수 있는, FGFR4에 대해 선택적인 모노클로랄 항체의 필요성이 강하다.
대장 CSCs에 효과적인 모노클로날 항체 항-FGFR4가 또한 필요하다.
또 다른 특히 강하게 느껴지는 필요성은, 이에 제한되지는 않지만, 간세포암종(HCC)와 같은 FGFR4-종속 종양의 치료를 위한 모노클로날 항체 항-FGFR4이다.
BMK-386-E4 및 이의 키메라(ch3B6) 및 인간화(hu3B6) 형태라 이름 붙인 모노크로날 항체는, 동일한 세포 내에서 FGFR4 신호전달 성분들을 조절하는데 있어서 높은 효율이라는 점에서 유사한, 배양된 세포 및 인비보에서 높은 항-증식성 활성을 나타낸다는 것을 밝혔다.
이 항체는 인비트로에서 FGFR4에 결합하는 리간드를 억제하는 것으로 나타났다.
본 발명의 상기 항체가, 리간드 결합과 관련되어 있지않다고 알려진 외세포 영역인 FGFR4의 자가-억제 산 박스 도메인 내 에피도프에 결합한다는 것을 놀랍게도 발견하였다(Kalilina et al., 2012). 대조적으로, 상기 도메인은 FGFR4에 대해 자가 억제 활성을 갖는 것으로 알려져 있고, 실로 이 영역의 손실이 리간드에 대한 수용체의 결합을 증가시킨다는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 본 발명의 항체는 리간드 상호작용 및 수용체 활성화에 형태적으로 영향을 미치는 독특한 모드로 FGFR에 결합한다는 것을 밝혀냈다.
FGFR4의 도메인 이름 "산 박스"를 특이적으로 인식하고 이에 합할 수 있는 항체는 리간드와 수용체의 상호작용을 억제하고 항-종양 효과를 갖는다는 것을 밝혀냈다.
이들 예상하지 못한 특징들은 대장 CSCs에 대한 인간화 항체, 글리코엔지니어드 항체 및 항체-약물 콘쥬게이트의 임상 개발에서 그리고 FDFR4 종속 암의 치료를 위해서 가치가 있다.
본 발명의 목적은 대장암 줄기 세포의 검출 및/또는 죽임 및/또는 이들의 발달 및/또는 분화에 영향을 미치고 및/또는 억제하고 및/또는 분화시키는데 사용되는 모노클로랄 항체 항-FGFR4이다.
본 발명의 목적은 인간 FGFR4의 아미노산 119 및 156 사이, 바람직하게는 인간 FGFR4의 아미노산 127 및 154 사이의 에피토프로서, FGFR4에 FGF19가 결합하는 것을 억제하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체이다.
특히, 상기 항체는 FGFR4의 산 박스 도메인에 특이적으로 결합한다.
바람직하게는, 상기 항체는 SEQ ID NO. 27을 갖는 아미노산 시퀀스를 에피토프로 인식한다.
특정 실시예에서, 상기 항체는 SEQ ID NO. 27를 갖는 아미노산 시퀀스 내에 다음 아미노산을 특이적으로 인식한다: D127, P130, K131, P136, S137, R139, H140, S141, Q144, Y148, W149, T150, Q153, R154. 아미노산 번호는 신호 펩티드(NCBI 접속 번호 NP_001341913)를 포함하는 인간 FGFR4 전구체를 의미한다.
본 발명의 특히 바람직한 항체는 인간 FGFR4에 대한 FGF19의 결합을 적어도 60&, 바람직하게는 적어도 70% 및 보다 바람직하게는 적어도 80% 또는 87%로 차단할 수 있다. 특히 바람직한 것은 본 발명의 이들 항체들로서, 인간 FGFR4에 대한 FGF19의 결합을 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85% 또는 적어도 90% 차단하는 항체이다. 인간 FGFR4에 대한 리간드의 결합을 차단한 결과 FGFR4 신호 전달을 억제한다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 항체는 예를 들어 FGF1, FGF8, FGF17, FGF18, FGF21, FGF23 (Zhang et al., 2006)을 포함하는 FGFR4 리간드의 추가 결합을 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70% 및 보다 바람직하게는 적어도 80% 또는 87% 억제할 수 있다.
본 발명의 목적은 여기 개시된 모노글로날 항체가 결합하는 에피토프에 특이적으로 결합하는데 필요한 여기 개시된 항체의 초가변영역의 아미노산을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
이 문맥에서, "초가변영역"에 대한 것은, 아미노산 시퀀스(CDRs)의 비접경 영역의 트리플렛으로부터 유래된 3차 구조체를 의미한다.
본 발명의 목적은 항원 또는 에피토프에 결합하는 항체, 특히 대장암 줄기 세포에 의해 발현되고, 여기 개시된 모노클로날 항체에 의해 인식된 항체이다. 예를 들어, 특정 실시예에서, SEQ ID NO:1-4 의 중사슬 가변영역 (VH) 시퀀스 및 SEQ ID NO:10-13의 경사슬 가변영역(VL) 또는 하나 이상의 이하 개시된 CDRs를 포함하는 항-FGFR4 항체를 포함하는 항-FGFR4 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명의 목적은, FGFR4의 산 박스에 결합하는 항체, 또는 항원-결합 단편, 또는 이들의 일부로서 다음을 포함한다: (i) SEQ ID NO:5-6의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 CDR1, 및/또는 (ii) SEQ ID NO:7-8의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 CDR2, 및/또는 (iii) SEQ ID NO:9의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 CDR3, 및/또는 (iv) SEQ ID NO:14-15의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 CDR1, 및/또는 (v) SEQ ID NO:16의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 CDR2, 및/또는 (vi) SEQ ID NO:17의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 CDR3, 여기서 상기 CDRs의 어느 하나는 상기 언급된 시퀀스들 중 적어도 어느 하나에 비하여 하나 또는 2개 아미노산이 다를 수 있으며, 이는 항체가 그의 결합 특이성을 유지한다는 것을 전제로 한다.
본 발명의 목적은 FGFR4의 산 박스에 결합하는 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편이며, 이의 중사슬의 가변영역은 시퀀스 SEQ ID NO: 18-22 또는 SEQ ID NO: 92-96와 적어도 80% 아이덴티디를 갖는 뉴클레오티드 시퀀스에 의해 코드화되고 경사슬의 가변 영역은 시퀀스 SEQ ID NO:23-26, 또는 SEQ ID NO: 97-99와 적어도 80% 아이덴티티를 갖는 뉴클레오티드에 의해 코드화되고, 이는 항체가 그의 결합 특이성을 유지하는 것을 전제로 한다.
본 출원의 바람직한 실시예에서, 본 발명의 항체는 FGFR4의 "산 박스" 도메인을 인식하거나 이에 결합할 수 있고 동시에 리간드 FGF-19와 수용체의 상호작용을 억제하고, 리간드-종속 FGFR4 신호전달을 손상한다.
본 발명의 항-FGFR4 항체는 FGFR4에 대한 FGF 리간드, 특히 FGF19의 결합을 효율적으로 억제할 수 있고, 특히 HCC 세포주 내에서 FGFR4-종속 신호전달 경로에 간섭할 수 있다는 것을 발견하였다.
이것은 FGFR4에 종속된 종양, 예를 들어 간세포암종의 치료에 특히 유리하게 한다.
특히 본 발명의 항체는 효과적인 종양 세포 억제, 특히 FGFR4을 발현하는 종양에서 효과적인 세포 억제를 나타낸다.
게다가, 본 발명의 항체는 대장 CSCs에 높은 결합 활성을 나타내므로 특히 대장암 치료에 유용하다.
또한, 본 발명의 항체는 FGFR4에 대해 높고 특이적인 결합 친화도를 갖는 반면에, 다른 FGF 수용체에 결합하지 않는다. 이것은 암 병리학에 관련되지 않은 다른 FGF 수용체에서의 활성으로 인하여 부작용 가능성을 줄이기 때문에 유리하다.
본 발명의 특정 실시예서, 상기 항체는 BMK-3B6-E4, 및 이의 키메라(ch3B6) 및 인간화(hu3B6) 형태로서 여기서 지칭된 항체이다. 이 항체는, 특히 간세포암종(HCC)에 높은 FGFR4 발현 준위를 갖는 암 줄기 세포 및 종양 세포주 둘 다에 높은, 복용량-종속된 반응성을 나타낸다.
대조군에 비하여 이 항체로 처리된 마우스에서 종양 부피의 감소가 관찰된다.
게다가, 본 발명의 항체는 MDA-MB453 세포 내에서 발현된 FGFR4 Y367C 돌연변이에 또한 효율적으로 결합한다. 돌연변이 수용체는 기존의 길항성 항체(antagonistic antibody)를 가지고 하는 억제에 무감각적인, 지배적이고, 리간드-종속적이며, 구성적으로 활성화된 변이체로서 설명되어 왔다(Roidl et al., 2010). 이는 본 발명에 따른 항체가 기존 길항적 항체로 치료법에 반응하지 않는 상기 돌연변이를 갖는 대상에서 또한 사용될 수 있다는 장점을 제공한다.
본 발명의 추가적 실시예에서, 항체는 인간화 항체이다.
본 발명의 추가적 실시예에서, 항체는 인간 항체이다.
본 발명의 항체는 FGFR4 산 박스에 대한 결합 특이성을 나타내고 수용체에 대한 리간드의 결합을 억제한다. 이것은 상기 산 박스가 리간드 결합에 관련되지 않다고 알려져 있는 이미 상술된 사실에 의하면 예상하지 못한 것이다. 대조적으로, 상기 산 박스는 수용체의 자가 억제와 관련이 있다고 알려져 있다.
본 발명은 여기 설명된 것처럼 항체를 포함하는 콘쥬게이트를 제공한다. 특히 항체 약물 콘쥬게이트는 본 발명의 바람직한 과제이다.
본 발명의 추가 목적은 항체를 암호화하는 핵산 분자로서, 선택적으로 발현 제어 시퀀스에 대해 작동적으로 연결된다.
상기 분리된 핵산은 전형적으로 중사슬을 암호화하는 시퀀스 및 경사슬을 암호화하는 시퀀스를 포함하고, 둘 다는 가변 영역 및 불변 영역(constant region)을 포함한다. 상기 중사슬을 암호화하는 시퀀스는 바람직하게는 SEQ ID NO. 28-31의 시퀀스 또는 상기 시퀀스와 적어도 80% 아이덴티티를 갖는 시퀀스로 이루어진 군으로부터 선택되고, 및 상기 경사슬을 암호화하는 상기 시퀀스는 SEQ ID NO. 32-34의 시퀀스 또는 상기 시퀀스와 적어도 80% 아이덴티티를 갖는 시퀀스로부터 바람직하게 선택된다.
본 발명의 추가 목적은 여기 개시된 하나 이상의 핵산 시퀀스를 포함하는 벡터이고, 바람직하게는 발현 벡터이다. 예를 들어, 상기 벡터는 항체 또는 이의 경사슬 및/또는 중사슬, 불변 영역 및/또는 가변영역, 또는 이의 CDRs에 대하여 코딩하는 헥산 시퀀스를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 양상은 숙주, 특히 핵산 분자를 포함하는 재조합 세포이다. 상기 세포는 항체의 제조를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 추가 양상은 FGFR4 발현, 과발현 및/또는 과잉행동과 관련된 질병의 진단, 예방 및/또는 치료에 사용을 위한 본 발명의 항체이다.
바람직하게는 상기 질병은 암 질병, 보다 바람직하게는 이것은 대장암 또는간세포암종 (HCC)이다.
보다 더 바람직한 실시예에서, 본 발명의 항체는 대장암 줄기 세포를 죽이거나 이들의 발달 및/또는 분화에 영향을 미치거나 및/또는 억제시키는 사용된다.
본 발명의 목적은 여기 개시된 모노클로날 항체 항-FGFR4를 포함하는 약제학적 조성물이다.
본 발명의 목적은 여기 개시된 모노클로날 항체를 포함하는 항체-약물 콘쥬게이트(ADC), 이를 포함하는 약제학적 조성물 및 약제로서의 이들의 용도, 특히 종양 치료를 위한 약제로서의 이들의 용도이다.
본 발명의 이들 및 다른 목적은 도면 및 실시예를 참조로 하여 이하 상세히 설명될 것이다.
도면의 간단한 설명:
도 1은 유전자 선택 깔대기이다.
도 2(A-B)는 특이적 상업적 1차 항체를 사용하여 웨스턴 블롯(Western Blot)에 의해 분석된 ATCC 종양 세포주 및 정상 대장 조직에 대한 CSCs에서 선택된 단백질 항원의 우선 발현을 나타낸다.
도 3은 5개 다른 CSC 세포주에서 모든 상청액으로 얻어진 FACS 분석 데이터의 요약이다. 배수 변화도(Fold Change, FC)는 음성 대조군(myeloma cell conditioned medium, 골수종 세포 조건화된 배지)에 대하여 각 상청액으로 측정된 평균 형광감도(평균 형광 강도, MFI)의 비이다. 점수는 각 CSC 세포주(3A) 상의 FC 값들을 기초로 할당하고, 최종 랭크는 개별 점수를 합하여 계산되었다(3B). 단순화를 위하여, 항-FGFR4 상청액으로 얻어진 데이터만 보여진다.
도 4는 다른 FGFR4 표면 발현 준위를 갖는 2개 하부 집단을 분리하도록 수행된 유세포분석기(flow cytometry cell) 분류 전 및 후에 CSC 세포주 CTSC85의 FACS 분석이다.
도 5는 CellTiter-BlueTM 분석(n=3)에 의해 평가된 대조군(모의 분류됨, 사각형), FGFR4 높음(삼각형) 및 FGFR4 낮음(뒤집어진 삼각형) CTS85 세포 집단의 성장 곡선이다. 데이터는 0일로 정상화되었다.
도 6은 3개 CTSC85 세포 집단에 대해 계수된 부드러운 한천 내 콜로니의 수이다. 3개 다른 실험의 평균 값 ± StDev이 보여진다. 상기 FGFR4 높음 및 모의 분류(Mock sorted)된 집단 사이의 차이(**p=0.007) 및 모의 분류된 집단(****p=0.00015)뿐만 아니라, FGFR4 높음 및 FGFR4 낮음 세포 하부집단 사이의 콜로니 수의 차이는 통계적으로 중요하다.
도 7은 48 시간 후 트랜스웰 이동 측정(transwell migration assay) 및 Calcein AM 형광 염색으로 평가된 FGFR4 높음, FGFR 낮음 및 모의 분류된 CTSC85 세포 집단(n=3)의 이동 효율이다. 상부 패널은 Imagel 소프트웨어의 도움으로 계수된 3개 집단 각각에 대한 평균 형광 세포 수이다. 하부 패널은 3개 집단 각각에 대하여 이동된 세포와 관련된 평균 형광 강도 값이며, 상대적인 형광 단위로 표현된다. (*) p<0.04; (**) p<0.004; (***) p<0.001.
도 8은 분류 후 수집된 2개 CTSC85 세포 하부집단으로부터 유래된 이종이식의 다른 종양 성장이다. FGFR4 높음(사각형) 및 FGFR4 낮음(삼각형) 종양 성장 곡선이 보여진다. 데이터는 중간 종양 부피 ± StDev로서 표현된다.
도 9는 HCT116 대장 종양 세포의 이종이식에서 BFG-2F7-B9 항체에 의한 항-종양 효과이다. 데이터는 비이클 대조군에 대한 평균 종양 부피 ± StDev; (*) p<0.05; (**) p<0.01로서 표현된다.
도 10은 대장 CTSC85의 이종이식 상의 BFG-2F7-B9 항체에 의한 항-종양 효과이다. 상부 패널에서, 곡선은 치료 기간 동안 평균 종양 부피 ± StDev의 증가를 나타내며; 하부 패널에서, -1일에 대한 평균 종양 부피의 증가는 ± StDev로 보여진다. 비이클 대조군에 대하여 (*) p<0.05; (**) p<0.01로 보여진다.
도 11은 고체 상 FGF19-FGFR4 결합 분석(n=3)으로부터 얻어진 450nm에서 흡광도 값으로부터 유래된, 지정된 상청액 각각의 부피의 함수로서 FGFR4에 대한 FGF19의 잔기 결합의 복용량-반응 곡선이다. 억제 곡선은 상청액 부피를 증가시키면서 450nm에서 잔기 흡강도를 기초로 한 KaleidaGraph 소프트웨어로 실험 데이터를 4P 로지스틱 피팅(logistic fitting)하여 얻어졌다(조건부여한 배지 대조군의 %).
도 12는 다른 항-FGF4 항체로 처리한 HCC HepG2 세포의 qRT-PCR 분석이다. 새로운 항체 일부는 CYP7A1 발현의 진압(상부 패널) 및 CTGF 발현(하부 패널)의 유도를 저해하고, 둘 다는 HepG2 세포에서 FGF-19-매개 FGFR4 활성화에 종속된다. 2개 유전자의 mRNA 준위는 FGF19의 부재(CYP7A1) 또는 FGF19의 존재(CTGF)시 각각의 PBS 대조 값들의 퍼센트로 표현된다. 대쉬 막대는 활성 mAbs를 나타내며; 점 막대는 비활성 mAs를 나타낸다.
도 13은 웨스턴 블롯으로 분석된 다른 항-FGFR4 항체로 처리된 Hep3B 세포에서 FGF19-종속 FRS2 인산화의 억제이다. (*) 활성 항체.
도 14는 HCC Huh7 세포에 의해 콜로니 형성 효율에서 항-FGFR4 항체의 억제 효과이다. 24-웰 플레이트의 300 세포/웰은 37℃에서 5% CO2에서 10일 동안 지정된 항체의 존재 또는 부존재(PBS 또는 DMSO의 음성 대조군)에서 50㎍/mL 및 100㎍/mL의 농도로, 또는 농도를 증가시키면서 화합물 BLU9931과 함께 배양되었다. 배약액에 항체, BLU9931또는 비이클을 포함하는 신선한 배지를 2일마다 공급하였다. 콜로니를 도립 광학현미경(inverted light microscope) 하에서 모니터링하고 실험 말기에 20% 메탄올 중 0.5% Crystal Violet로 염색하였다. 4개 실험 각각의 콜로니 수를 결정하고 복제 수단은 비이클 대조군들의 퍼센트로서 표현되었다(항체에 대해서 PBS 및 BLU9931에 대해서 DMSO).
도 15(A-C)는 인간-쥐 키메라 항체 ch3B6, ch6C9 및 ch5B5의 중사슬 및 경사슬을 암호화하는 발현 벡터이다. 유사한 발현 벡터는 다른 항체에 대해 얻어졌다.
도 16은 항체 ch3B6에 대한 품질 대조군이다. 좌측: SDS-PAGE; 우측: HPLC-SEC. 유사한 결과가 항체 ch6C9 및 ch5B5에 대해 얻어졌다.
도 17은 HCC 세포주 HepG2 및 Huh7 및 유방암 세포주 MDA-MB453에서 키메라 mAbs ch3B6, ch6C9 및 ch5B5의 FAXS 분석으로 얻어진, 항체 농도의 함수로서 FC 값의 그래프이다. 연속선은 실험한 것들이고, 대쉬선은 "1 사이트 결합(one site binding) 공식에 실험 데이터를 대입하여 얻어진 것들이다.
도 18은 항-FGFR4 항체의 농도 함수로서, FGFR-Fc-종속 고체상으로부터 얻어진 450nm에서의 흡광도 값의 그래프이다. 각 항체의 연속적인 1:3의 희석(0.0014 ㎍/mL 내지 9㎍/Ml의 9개 실험 포인트)을 하여 인간 Fc와 융합된 FGFR1α IIIc, FGFR1β IIIc, FGFR2α IIIb, FGFR2α IIIc, FGFR2β IIIb, FGFR2β IIIc, FGFR3 및 FGFR4의 외세포 영역에서 3번 시험하였다. 음성 대조군으로서, 인간 Fc에 융합된 IL17B 수용체의 외세포 영역이 포함되었다. 연속선은 실험한 것들이고, 대쉬선은 "1 사이트 결합" 공식에 실험 데이터를 대입하여 얻어진 것들이다.
도 19는 고체상 FGF19-FGFR4 결합 분석(n=3)로부터 얻어진 450nm에서의 흡광도 값으로부터 유래한, ch3B6 및 ch6C9의 농도의 함수로서 FGFR4에 대한 FGF19의 잔기 결합의 복용량-반응 곡선이다. 억제 곡선은 항체 농도를 증가시키면서(0.014~30㎍/mL의 1:3 연속희석법) 450nm의 잔기 흡광도(PBS 대조군의 %)를 기초로 한 KaleidaGraph 소프트웨어로 실험 데이터를 4P 로지스틱 피팅을 하여 유도한 것이다.
도 20는 HCC HuH7 세포에 의한 콜로니 형성 효율에 대한 항-FGFR4 키메라 항체의 억제 효과이다. 600 세포/웰의 24-웰 플레이트를 30 ㎍/mL 및 100 ㎍/mL의 농도로 지정된 항체가 존재 또는 부존재(PBS 또는 DMSO에서 음성 대조군)시 10일 동안 37℃, 5% CO2에서 배양되거나, 또는 지정한 농도를 증가시키면서 화합물 BLU9931과 함께 배양되었다. 배양액에 항체, BLU9931, 또는 비이클을 포함하는 신선한 배지를 2일마다 공급하였다. 도립 광학현미경 하에서 콜로니를 모니터링하고 실험 말기에 20% 메탄올 중 0.5 Crystal Violet 용액으로 염색하였다. 4개 실험 각각에서 콜로니 수를 결정하고 복제 수단은 비이클 대조군의 것들(항체에 대해 PBS 및 BLU9931에 대해 DMSO)의 퍼센트로 표현되었다.
도 21은 웨스턴 블롯으로 분석된 항-FGFR4 키메라 항체로 처리한 Huh7 세포에서 FGF19-종속 FGFR4 및 FRS2 인산화의 억제이다. 세포들을 100 또는200 ug/mL의 각각의 항체, 0.1 uM 또는1 uM BLU9931와 함께 처리하거나, 또는 실험실 8에 설명된 실험 조건 하에서 FGF19/헤파린의 첨가 전에 PBS와 함께 처리하였다. 웨스턴 블롯 분석은 항-포스포-FRS2항체(Tyr196, Cell Signalling), 항-FRS2 항체(LSBio), 항-포스포-FGFR4 항체(FGFR4[포스포-Tyr642]항체, Biorbyt), 항-FGFR4 항체 BFG-2F7-B9, 및 항-GAPDH 항체(Sigma-Aldrich)를 사용하여 수행되었다.
도 22는 Huh7 간 종양 세포의 이종이식에서 3개 항-FGFR4 키메라 항체에 의한 항-종양 효과이다. 데이터는 일 수에 대비한 평균 종양 부피의 증가로서 표현되며 11 ± StDev; 비이클 대조군에 대하여 (*) p<0.05이다.
도 23은 항-FGFR4 키메라 항체로 Huh7 이종이식의 인비보 처리는, 비이클-처리된 종양에 비하여 CYP7A1 발현(좌측 패널)을 활성화시키고 CTGF 발현(우측 패널)을 억제하였다. 단일 종양에서 mRNA 준위가 2^(-ΔΔc-t)으로 표시된 도트 플롯이 보여진다. 베타 글루쿠로니다아제(GUS)의 인간 유전자는 정규화군(normalizer)으로 사용되고 대조군 마우스 중 하나에 대응하는 ΔΔCt 값은 비교 참조로서 선택되었고 1로 설정되었다. 처리된 마우스와 대조군 마우스의 통계적으로 중요한 차이는 CYP7A1 (* p≤0.05) 및 CTGF (** p=0.003) 데이터 둘 다의 t-시험 분석의 결과로부터 나왔다.
도 24는 항체 ch3B6 또는 PBS로 처리한 Huh7 이종이식에서 FGFR4(상부 패널) 및 ERK1/2 인산화의 억제이다. 종양 단백질 추출물의 웨스턴 블롯 분석은 항-포스포-FGFR4 항체 (FGFR4 [포스포-Tyr642] 항체, Biorbyt), 항-FGFR4 항체 BFG-2F7-B9, 항-포스포-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) 항체(Cell Signalling), 항-p44/42 MAPK (Erk1/2) 항체(Cell Signalling), 및 항-GAPDH 항체 (Sigma-Aldrich)을 사용하여 수행되었다.
도 25는 FACS 분석에 의해 BOSC23 리포터 세포들에서 측정된 FL FGFR4 및 FGFR4 결실 돌연변이 d1, d2 및 d3에 대한 키메라 항체의 반응성이다. 이 분석은 실시예 8에서 설명된 것처럼 수행되었다.
도 26는 다른 항-FGFR4 항체에 대한 에피토프 맵핑이다. 판넬 A에서, 2 독립 ELISA 실험의 대표적인 히스토그램이 보여지며, 여기서 Ig II 도메인 펩타이드 콜렉션에 대한 항체 ch5B5(양성, 채워진 막대) 및 ch6C9(음성, 대쉬 막대)의 결합이 분석되었다. 이 분석으로부터 추론된 ch5B5 결합 시퀀스가 또한 보여진다. 판넬 A에서, 도 26은 출현 순서로 SEQ ID NOS 35-57를 각각 개시한다. 판넬 B에서, 3 독립 ELISA 실험을 대표하는 히스토그램이 보여지며, 여기서 산 박스 펩타이드 콜렉션에 대한 항체 ch3B6(양성, 채워진 막대) 및 ch6C9(음성, 대쉬 막대)의 결합이 분석되었다. 이 분석으로부터 추론된 ch3B6 결합 시퀀스가 또한 보여진다. 결합에 기여하는 잔기는 밑줄로 표시하였고; 가장 높은 피크에 대응하는 잔기는 굵은 글씨체이다. 판넬 B에서 도 26은 각각 출현 순서대로 SEQ ID NOS 58-83 및 27을 개시한다. 판넬 C에서, 산 박스 영역 내에 인간 FGFR4 단백질 시퀀스(SEQ ID NO: 100) (NCBI 접속 번호 NP_001341913) 및 마우스 오솔로그(orthologous) 시퀸스 (SEQ ID NO: 101) (NCBI 접속 번호 NP_032037)의 배열이 보여지며, 인간 수용체에 실험적으로 확인된 ch3B6 결합 영역이 지정된다(SEQ ID NO: 102). 결합에 기여하는 잔기는 밑줄로 표시하며; 인간과 마우스 사이의 보존된 잔기는 굵은 글자이다.
도 27은 항-FGFR4 항체 3B6 인간화이다. (A) 3B6의 인간화의 전략의 도식. (B) 선택된 인간 생식계열(germline) IgG의 3D 모델. 랫트 잔기로 치환된 생식계열 잔기는 좌측 판넬에 지정되며, 실험적으로 결정되는데 필요한 최적 해결책(인간 또는 랫트 아미노산)이 있는 위치는 우측 판넬에 지정된다.
도 28은 3B6 인간화 중사슬 및 경사슬 변이체를 암호화하는 발현 벡터이다.
도 29는 지정된 발현 벡터로 감염된 293F 세포의 상청액을 줄이는 조건(상부) 및 줄이지 않는 조건(하부)하에서의 웨스턴 블롯 분석이다.
도 30은 고체상 FGF19-FGFR4 결합 분석(n=3)으로부터 얻어진 450nm에서의 흡광도 값으로부터 유래된, 6개의 인간화된 3B6 변이체의 농도의 함수로서 FGFR4에 대한 FGF19의 잔기 결합의 복용량-반응 곡선이다. 억제 곡선은 항체 농도를 증가시키면서(0.01 내지 30 ㎍/mL으로 1:3 연속희석) 450nm에서의 잔기 흡광도(PBS 대조군의 %)를 기초로 한, KaleidaGraph 소프트웨어로 실험 데이터를 4P 로지스틱 피팅하여 유도되었다. (A) 대응하는 억제 곡선으로부터, IC50 값 0.13 ug/mL (0.87 nM), 0.4 ug/mL (2.7 nM), 및 0.07 ug/mL (0.47 nM)이 Hu3B6a, Hu3B6b, 및 Hu3B6c로부터 각각 추론되었다. (B) 대응하는 억제 곡선으로부터, IC50 값 0.03 ug/mL (0.2 nM), 0.16 ug/mL (1 nM), 및 0.09 ug/mL (0.6 nM)이 Hu3B6d, Hu3B6e, 및 Hu3B6f로부터 각각 추론되었다. (C) 대응하는 억제 곡선으로부터, IC50 값 0.09 ug/mL (0.6 nM) 및 0.2 ug/mL (1.3 nM)이 ch3B6 및 양성 대조군 항체 hLD1.v22로부터 각각 추론되었다. 아이소타입 대조군으로는 억제 곡선이 얻어지지 않았다.
도 31은 ch3B6 및 상업적으로 이용가능한 항체 ab41948의 비교 분석이다. (A) ab41948의 농도 함수로서, FGFR4-Fc-종속 고체상 결합 분석으로부터 얻어진 450nm에서의 흡광도 그래프. 일련의 1:3 희석액(0.00005 ug/mL 내지 1 ug/mL의 10개 실험 포인트)을 인간 Fc와 융합한 FGFR4의 외세포 영역에서 3번 시험하였다. 연속선은 실험한 것이고, 대쉬선은 "1 사이트 결합" 공식에 실험 데이터를 대입하여 얻어진 것이다. (B)고체상 FGF19-FGFR4 결합 분석(n=3)으로부터 얻어진 450nm에서의 흡광도 값으로부터 유래된, ch3B6 및 ab41948의 농도 함수로서 FGFR4에 대한 FGF19의 잔기 결합의 복용량-반응 곡선이다. 억제 곡선은 항체 농도를 증가시키면서(0.001 내지 10 ug/mL의 1:3 연속희석법) 450nm에서의 잔기 흡광도(PBS 대조군의 %)를 기초로 한, KaleidaGraph 소프트웨어로 실험 데이터를 4P 로지스틱 피팅하여 유도되었다. (C) 웨스턴 블롯으로 분석된 ch3B6 또는 ab41948으로 처리된 Huh7 세포에서 FGF19-종속 FRS2 인산화의 억제. 세포들을 실시예 8에 설명된 실험 조건하에서 FGF19/헤파린 첨가 전에 100 ug/mL의 각 항체 또는 PBS와 함께 처리하였다. 웨스턴 블롯 분석은 항-포스포-FRS2 항체 (Tyr-436, Cell Signalling) 및 항-GAPDH 항체(Sigma-Aldrich)을 사용하여 수행되었다.
도 32는 대장 CTSC85의 이종이식 상에서 ch3B6 항체에 의한 항-종양 효과이다. 상부 판넬에서, 곡선은 치료 동안 평균 종양 부피 ± StDev의 증가를 나타내며; 하부 판넬에서, -1일에 비교된 평균 종양 부피의 증가는 ± StDev로 보여진다. 비이클 대조군과 관련하여 (**) p<0.01; (***) p<0.005; (****) p<0.0005.
도 33은 대장 CTSC85-유래 간 전이에 대한 ch3B6 및 ch6C9 항체에 의한 항-종양 효과이다. 곡선은 처리 동안 평균 광자 계수의 증가를 나타낸다. 비이클 대조군에 대하여 (*) p<0.05.
정의
"항체"에 대하여 본 발명에서의 의미는, 일반적으로 관심있는 특정 항원성 표적에 면역특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 사이트를 포함하는 분자를 의도한 것이다. 그러므로, 용어 "항체"는 이에 제한되지는 않지만, 천연 항체 및 이들의 변이체, 천연 항체의 단편 및 이들의 변이체, 펩티바디(peptibody) 및 이들의 변이체, 및 항체 또는 특정 단편 또는 이들의 일부의 구조 및/또는 기능을 모방하고 단일 사슬 항체 및 이들의 단편을 포함하는 항체 모방체(mimetic)를 포함한다. 그러므로 용어 "항체"는 완전한 길이의 항체 및/또는 이들의 변이체뿐만 아니라, 이들의 단편도 포함한다. 적어도 하나의 표적 항원에 대한 항체의 결합은 다양한 효과, 예를 들어 이에 제한되지는 않지만, 그러한 결합이, 인비틀, 인시튜 및/또는 인비보에서 적어도 하나의 표적 항원 활성, 특히 표적 수용체 활성과 함께 조절, 감소, 증가, 길항(antagonize), 아고나이즈(agonize), 완화(mitigate), 경감(alleviate), 차단(block), 억제(inhibit), 폐지(abrogate) 및/또는 간섭하는 곳에서 다양한 효과를 일으킨다. 본 발명은 그러므로, 이에 제한되지는 않지만 Fab, Fab' 및 F(ab')2, facb, pFc', Fd, Fv 또는 scFv 단편(See, e.g., Colligan et al. eds., John Wiley & Sons, Inc., NY, 1994-2001); 디어바디(diabody); 선형 항체 (Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10): 1057); 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적(multispecific) 항체를 포함하는, 생물학적 분자(예를 들어 항원 또는 수용체) 또는 이들의 일부에 결합할 수 있는 항체 단편을 포함한다. 따라서, 항체는 가장 폭넓은 의미로 사용되고, 예를 들어 구체적으로 단일 항-FGFR4 모노클로날 항체(아고니스트, 길항성 및 중성화 항체를 포함), 폴리에피토픽 특이성을 갖는 항-FGFR4 항체 조성물, 단일 사슬 항-FGFR4 항체, 및 항-FGFR4 항체의 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 항체 유도체를 포함한다. 본 발명의 모노클로날 항체의 유도체는, 예를 들어 항체 단편, 방사능적으로 표지된 모노클로날 항체, 및 효소와, 형광성 마커와, 세포독성 약물과, 또는 이와 유사한 것들과의 콘쥬게이트이다. 용어 "유도체"는 적어도 하나의 아미노산의 첨가, 결실, 및/또는 치환에 의해 항체 구조가 변화하는 임의 돌연변이를 포함한다. 에피토프에 결합하는 항체의 단편 또는 유도체의 능력은, 예를 들어 다음 섹션에서 설명된 것처럼 직접적인 ELISA에 의해 결정될 수 있다.
"모노클로날 항체"에 대한 본 발명의 의미에는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 얻어진 항체를 의미하며, 즉 상기 집단을 포함하는 개별 항체가 소량으로 존재할 수 있는 자연적으로 일어날 수 있는 돌연변이를 제외하고 동일하다. 모노클로날 항체는 "mAb"으로 약칭될 수 있다.
본 발명의 의미로는, 용어 "키메라 항체"는 불변 영역 또는 이들의 일부가 가변 영역이 다른 종들의 불변 영역에 연결되거나, 또는 또 다른 항체류 또는 하부류에 속하도록 변경, 대체 및 교환된 항체를 의미한다. 키메라 항체를 제조하는 방법은 당해 기술 분야의 통상의 기술자들에게 알려져 있다. 예를 들어 Morrison, 1985, Science, 229:1202; Oi and al., 1986, Bio Techniques, 4:214; Gillies and al., 1989, J. Immunol. Methods, 125:191 -202; U.S. Pat. Nos. 5,807,715; 4,816,567; 및 4,816,397를 참조. 항체의 이들 키메라 버전은 인간 기원의 CL (kappa) 및 the CH (lgG1) 불변 도메인에 대한 쥐과 VL 및 VH 가변 영역의 융합을 포함하여, 키메라 모노클로날 항체를 제조할 수 있다.
"인간화 항체"에 대한 본 발명의 의미는, 비인간 종의 항체로서 이들의 단백질 시퀀스가 인간에서 자연적으로 제조된 항체 변이체에 대한 이들의 유사성을 증가시키기 위하여 수정된 비인간 종의 항체를 의미한다. "인간화"의 공정이 통상 인간에 투여하기 위해 개발된 모노클로날 항체에 통상적으로 적용된다.
"인간 항체"를 위한 본 발명의 의미는 인간에서 자연발생적으로 일어날 수 있는 항체를 의미한다. 용어 "인간 항체"는 완전히 인간 또는 인간화 항체를 포함한다.
본 발명의 의미에서, 용어 항체의 "결합" 또는 "결합하는"은 표적 항원과 또는 표적 항원에 적어도 일시적으로 상호작용 또는 관련된 것을 의미한다.
본 발명의 의미에는, "억제하다" 또는 "억제"는 생물학적 약제의 작용 또는 기능을 제한, 방지 및/또는 차단하고자 하는 것이다. "차단하는"은 또한 유사어로서 여기 사용된다.
본 발명의 의미에는 암 줄기 세포(CSC)는 정상 줄기세포와 관련된 특성들, 특히 특정 암 샘플에서 발견되는 모든 세포 타입으로 분화하고 그리고 무한정 자가갱신하는 능력과 관련된 특성을 갖는 암세포이다.
본 발명의 의미에서, "치료", "치료하다"는, 원하는 약물학적, 및/또는 생리학적 효과를 얻고자 하는 것이다. 효과는 질병 및/또는 질병이 원인인 부작용을 부분적 또는 완전하게 치료하는 측면에서 치료적일 것이다. 여기 사용된 것으로서 "치료"는 포유류, 특히 인간에서 질병 또는 상태의 치료를 위하여 본 발명의 화합물의 투여를 포함하고, 다음을 포함한다: (a) 질병을 억제, 즉 이들의 발달을 막고; (b) 완화 치료(palliative care)를 제공, 즉 환자의 고통을 줄이고 예방; 및 (c) 질병을 완화, 즉 질병 또는 질환의 억제 야기 또는 이들의 증상 또는 합병증을 경감시킨다. 용량 복용법은 최적의 원하는 반응을 제공하기 위하여 조절될 수 있다.
"에피토프"에 대한 본 발명의 의미는 항체가 제조되고 항체가 결합할 항원성 분자의 일부를 의미한다. "FGFR4 에피토프"는 항-FGFR4 모노클로날 항체가 특이적으로 결합하는 FGFR4 단백질의 일부를 포함한다. 에피토프는 선형 아미노산 잔기(i.e., 에피토프 내 잔기는 선형 방식으로 또 다른 것 후에 연속적으로 배열된다), 비선형 아미노산 잔기, 또는선형 및 비선형 아미노산 잔기 둘 다를 포함할 수 있다. 전형적으로 선형 에피토프는 일반적으로 짧은 아미노산 시퀸스(e.g. 약 5개 아미노산 길이)이다.
"약제학적 조성물"에 대한 본 발명의 의미는, 효과적인 함량의 본 발명의 항체가 대상에 투여하기에 적당하도록 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 비이클 및/또는 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 함께 혼합된다.
"실질적으로"에 대한 본 발명의 의미는 크고 및/또는 중요한 정도라는 것을 의미한다.
"항체 약물 콘주게이트" 또는 "ADC"에 대한 본 발명의 의미는 모노클로날 항체가 약물, 일반적으로 매우 높은 세포독성 약물에 결합된 화합물을 의미한다.
본 발명은 FGFR4 또는 이들의 기능적 단편 또는 기능적 유도체에 대한 항체, 특히 인간 항체를 의미한다.
용어 "항체"는 특히 적어도 하나의 면역글로불린 중사슬 및 적어도 하나의 면역글로불린 경사슬을 포함하는 분자에 관한 것이다. 각 중사슬 및 경사슬은 가변 및 불변 도메인을 포함할 수 있다. 항원 결합 사이트는 중사슬 및 경사슬의 가변 도메인으로부터 형성될 수 있다. 가변 영역(또는 가변 도메인이라 함)은 상보성 결정 영역(CDRs), e.g. CDR1 , CDR2 및 CDR3 영역 및 CDRs를 측면에 둔 프레임워크 영역(FRs)을 포함한다. 용어 "상보성 결정 영역"은 이미 통상의 기술자들에게 이해되고(예를 들어 다음 참조: Harlow 및 Lane (eds.), 항체: A Laboratory Manual, CSHL press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1988), 일차적으로 항원과 접촉하고 항체 특이성을 결정하는 항체의 가변 도메인 내에서 아미노산의 스트레치(stretch)를 의미한다. 3개의 비접경 CDRs으로부터 유래한 3차원적 구조체는 또한 초가변영역으로 알려져 있다.
본 발명의 목적은 대장암 줄기 세포의 검출 및/또는 죽임 및/또는 이들의 발달 및/또는 분화에 영향을 미치거나 및/또는 억제하기 위하여 사용되는 FGFR4에 대한 항체이다.
모노클로날 항체 항-FGFR4는 당해 기술 분야에 알려져 있고 구입되거나 또는 흔한 방법으로 합성될 수 있다. 예를 들어 다음을 참조한다: 상기 도입부에서 인용된 참조 문헌, 예를 들어 French et al., 2012; Bumbaca et al., 2011; Bartz et al., 2016; US 9266955 B2; WO 2014/105849 A1; WO 2016/023894 A1, U3-1784 (U3/Daiichi Sankyo, NCT02690350). FGFR4에 대한 모노클로날 항체는 유전적 면역법에 대해 기존 기술을 사용하여 얻어질 수 있으며; 유전적 면역법은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있고, 당해 기술 분야의 통상의 기술자들에 의해 흔하게 사용된다. 본 기술에 대한 참조 문헌은 다음에서 발견될 수 있다: DC, DeVit M, Johnston SA. Nature. 1992, 356(6365):152-154.
본 발명에 따라 FGFR4에 대한 항체는 대장암 줄기 세포를 검출 및 인식하기 위하여 사용될 수 있다. 특히, 이들은 임상 샘플에서 대장암 줄기 세포의 검출을 위해 유리하게 사용될 수 있으므로 진단적 분석에서 응용성을 찾을 수 있다. 보다 더 특히, 이들은 CSC 집단에서 새로운 CRC 치료의 효과를 측정할 목적으로 임상 등급 분석에 유리하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따라, FGFR4에 대한 항체는 또한 대장암 줄기 세포를 죽이거나 또는 이들의 발달 또는 이들의 분화에 영향을 미치거나 또는 억제하는데 사용될 수 있다.
특히, FGFR4에 대한 항체는 치료가 필요한 대상에 대장암 줄기 세포를 죽이기 위한 약제학적 조성물의 형태로 투여되어 대장암을 치료할 수 있다. 또한, 치료가 필요한 대상에게 투여되어 상기 세포의 발달 또는 분화를 억제하여 대장암 상태를 예방 또는 개선할 수 있다.
약제학적 조성물 및 투여 모드는 관습적이며 당해 기술 분야의 통상의 기술자, 예를 들어 의사의 능력 및 지식 내에 있다.
치료적 분야와 관련된 추가 상세한 내용은 단락 "약제학적 조성물 및 의학적 치료"에서 이후 발견될 수 있다.
본 출원의 발명자들은 또한 인간 FGFR4의 아미노산 119-156 사이의 에피토프에 대한 항체 또는 이들의 기능적 단편 또는 기능적 유도체들이 치료적 및 진단적 분야에서 특히 유용하다는 것을 밝혔다. FGF4의 에피토프는 또한 "산 박스" 도메인으로 알려져 있다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 항체는 인간 FGFR4의 아미노산 127 및 154 사이의 에피토프에 대한 것이다. 실로 이 특정 에피토프에 대한 결합은 FGFR4 활성을 억제하는데 유리하다는 것이 밝혀졌다.
특히 바람직한 실시예에 따라, 본 발명의 항체는 인간 FGFR4의 아미노산 119 및 156 사이, 바람직하게는 인간 FGFR4의 아미노산 127 및 154 사이에 포함된 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이들로만 이루어지거나 이들로 이루어진 것을 포함하는 에피토프에 대한 것이다. 바람직하게는, 상기 아미노산 시퀸스는 SEQ ID N.27 (DEDPKSHRDPSNRHSYPQQAPYWTHPQR)를 갖는 시퀀스를 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 이 항체는 다음에 개시된 모노클로날 항체에 의해 인식된 항원 또는 에피토프에 결합한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 항체는 다음에 개시된 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프에 특이적으로 결합하는데 필요한 다음에 개시된 항체의 초가변영역의 아미노산을 포함한다.
그러한 항체는 적당한 단세포성 또는 다른 숙주에서 표준 재조합 DNA 절차를 사용하여, 상기 초가변영역을 암호화하는 DNA를 클로닝하고 상기 DNA를 발현하는 것으로 얻어질 수 있다. 게다가, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드를 합성하기 위하여 잘 알려진 기술을 사용하여 화학적 절차에 의해 합성될 수 있다.
본 발명의 목적은 여기 개시된 가변 경사슬 및 중사슬 및 CDRs을 갖는 항체에 제한되지 않는다. 본 발명은 여기 개시된 항체가 결합하는 것과 동일한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 시퀀스를 포함하거나 이들로만 이루어지는 폴리펩타이드를 포함한다. 그러한 폴리펩타이드를 얻는 한 가지 방법은 상기 항체의 초가변영역의 아미노산을 치환하여, 치환되었을 때 항원에 대한 폴리펩타이드의 결합에 영향을 미치거나 미치지 않는 아미노산을 확인하는 것이다.
이들 모든 기술은 당해 기술 분야에서 그리고 통상의 기술자의 기술 범위 내에서 잘 알려져 있다.
예를 들어, 도 26B에 보여진 127 및 154 사이의 아미노산을 포함하는 산 박스 내에서 결합 사이트를 참조로 할 수 있다. 결합 사이트를 기초로, 통상의 기술자는 에피토프에 특이적으로 결합하는데 필요한 다음에 개시된 항체의 초가변영역의 아미노산을 확인할 수 있다.
본 발명의 항체는 다양한 면역글로불린(Ig) 타입, 예를 들어 IgA-, IgD-, IgE-, IgG- 또는 IgM-타입, 바람직하게는 이에 한정되지는 않지만 lgG1-, lgG2-, lgG3-, lgG4-, lgM1 및 lgM2-타입을 포함하는 IgG- 또는 IgM-타입의 것일 수 있다. 하나의 바람직한 실시예에서 상기 항체는IgG1 타입의 것이다.
또한, 경사슬의 불변 부분은 kappa 타입 또는 lambda 타입, 바람직하게는kappa 타입일 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 항체는 모노클로날 항체이다.
일부 실시예에서, 이것은 인간, 인간화된, 또는 키메라 항체이다.
본 발명의 특정 실시예에서, 상기 항체는 이하 설명된 특이적 중사슬 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2 및/또는 CDRH3을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 항체가 SEQ ID NO: 5-6중 임의의 것에 보여지거나 또는 이들과 1 또는 2 아미노산이 다른 아미노산 시퀀스를 갖는 중사슬 상보성 결정 영역 1 (CDRH1)을 포함한다.
추가 실시예에서, 상기 항체는 임의의 SEQ ID NO: 7-8에 보여진 아미노산 시퀀스 또는 이들로부터 1 또는 2 아미노산이 다른 아미노산 시퀀스를 갖는 중사슬 상보성 결정 영역 2 (CDRH2)를 포함한다.
또 다른 추가 실시예에서, 상기 항체는 임의의 SEQ ID NO: 9에 보여진 아미노산 시퀀스 또는 이들로부터 2 또는 2 아미노산이 다른 아미노산 시퀀스를 갖는 중사슬 상보성 결정 영역 3 (CDRH3)를 포함한다.
본 발명에 따른 항체는 또한 특이적 경사슬 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2 및/또는 CDRL3을 포함할 수 있다.
따라서, 일 실시예에서, 상기 항체는 임의의 SEQ ID NO: 14-15에 보여진 아미노산 시퀀스 또는 이들로부터 2 또는 2 아미노산이 다른 아미노산 시퀀스를 갖는 경사슬 상보성 결정 영역 1 (CDRL1)를 포함한다.
추가 실시예에서, 상기 항체는 임의의 SEQ ID NO: 16에 보여진 아미노산 시퀀스 또는 이들로부터 1 또는 2 아미노산이 다른 아미노산 시퀀스를 갖는 경사슬 상보성 결정 영역 2 (CDRL2)를 포함한다.
또 다른 추가 실시예에서, 상기 항체는 임의의 SEQ ID NO: 17에 보여진 아미노산 시퀀스, 또는 이들로부터 1 또는 2 아미노산이 다른 아미노산 시퀀스를 갖는 경사슬 상보성 결정 영역 3 (CDRL3)를 포함한다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 하나의 중사슬 내에서 특이적 조합의 CDRs(i.e. CDRH1, CDRH2 및 CDRH3)을 포함한다.
따라서, 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 항체는 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 중사슬을 포함하며, 여기서 CDRH1은 SEQ ID NOs: 5-6에서 보여진 시퀀스들 또는 이들로부터 2 또는 2 아미노산이 다른 아미노산 시퀀스로부터 선택되고, CDRH2는 SEQ ID NOs: 7-8에 보여진 시퀀스, 또는 이들로부터 1 또는 2 아미노산이 다른 아미노산 시퀀스로부터 선택되며, CDRH3는 SEQ ID NOs: 9, 또는 이들로부터 2 또는 2 아미노산이 다른 아미노산 시퀀스에 보여진다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 항체는 3개의 CDRs를 포함하는 중사슬을 포함하며, 여기서 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 조합은 표 1에 도시된 것들 중에서 선택된다. 이 표의 각 줄은 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 하나의 특이적 조합을 나타낸다고 이해된다.
CDRH1 CDRH2 CDRH3
(NYYMA)SEQ ID N.5 (TINPSGTRTYYPDSVKG)
SEQ ID N.7		 (LYNNYAFDY)
SEQ ID N.9
(NYYMS)SEQ ID N.6 (TINPSGTRTYYPDSVKG)
SEQ ID N.7		 (LYNNYAFDY)
SEQ ID N.9
(NYYMS)SEQ ID N.6 (NINPSGTRTYYPDSVKG)
SEQ ID N.8		 (LYNNYAFDY)
SEQ ID N.9
본 발명에 따라, 상기 항체는 하나의 경사슬 내의 CDRs의 특이적 조합(i.e. CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)을 포함하는 것이 바람직하다. 그러므로, 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 항체는 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 경사슬을 포함하고, 여기서 CDRL1는 임의의 SEQ ID NO: 14-15에 보여진 아미노산 시퀀스, 또는 이들로부터 1 또는 2 아미노산이 다른 아미노산 시퀀스를 가지며, CDRL2는 SEQ ID NO: 16에 보여진 아미노산 시퀀스, 또는 이들로부터 1 또는 2 아미노산이 다른 아미노산 시퀀스를 가지며, CDRL3는 SEQ ID NOs: 17에 보여진 아미노산 시퀀스, 또는 이들로부터 1 또는 2 아미노산이 다른 아미노산 시퀀스를 갖는다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 항체는 CDRs를 포함하는 경사슬을 포함하고, 여기서 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 조합은 표 2에 보여진 것들로부터 선택된다. 이 표의 각 줄은 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 하나의 특이적 조합을 나타낸다.
CDRL1 CDRL2 CDRL3
(RASESVSTLMH)SEQ ID N.14 (GTSNLES)
SEQ ID N.16		 (QQSWNDPPT)
SEQ ID N.17
(RASESISTLLH)SEQ ID N.15 (GTSNLES)
SEQ ID N.16		 (QQSWNDPPT)
SEQ ID N.17
상술한 것처럼, 항체의 상보성 결정 영역(CDRs)은 프레임워크 영역 측면에 위치될 수 있다. 3개의 CDR을 포함하는 항체의 중사슬 또는 경사슬은 예를 들어 4개의 프레임워크 영역을 포함한다.
이들 항체의 기능적 단편 및 기능적 유도체는 또한 본 발명의 범위 내이다.
추가적으로, 본 발명은 또한 상기 중사슬 및/또는 경사슬 CDRs에 의해 특징되는 특이적 항체로서 인간 FGFR4와 동일한 에피토프를 인식하는 이들 항체를 포함한다.
항체에 의해 인식된 FGFR4 위의 에피토프를 결정하기 위하여, 인간 FGFR4의 외세포 도메인의 아미노산 시퀀스로부터 유래된 짧은 펩티드의 화학적으로 제조된 배열을 사용하여 항체 에피토프를 위치시키고 확인할 수 있다(Reinicke W., Methods Mol. Biol. 2004, 248: 443-63). 본 발명의 항체에 의해 결합된 FGFR4 외세포 도메인에서 에피토프를 맵핑하는 추가 방법은 Snaps/SELDI (Wang et al, Int. J. 암, 2001, June 15; 92 (6): 871-6)을 포함하거나, 또는 Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)에 설명된 것과 같은 일상적인 크로스-블로킹(cross-blocking) 어레이가 수행될 수 있다.
특히 바람직한 실시예에 따라, 본 발명의 항체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중사슬을 포함한다:
(a) SEQ ID NO: 5-6에 보여진 CDRH1, 또는 이들로부터 1 또는 2 아미노산이 다른 CDRH1 시퀀스,
(b) SEQ ID NO: 7-8에 보여진 CDRH2, 또는 이들로부터 1 또는 2 아미노산이 다른 CDRH2 시퀀스, 및
(c) SEQ ID NO: 9에 보여진 CDRH3, 또는 이들로부터 1 또는 2 아미노산이 다른 CDRH3 시퀀스,
및/또는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경사슬:
(d) SEQ ID NO: 14-15에 보여진 CDRL1, 또는 이들로부터 1 또는 2 아미노산이 다른 CDRL1 시퀀스,
(e) SEQ ID NO: 16에 보여진 CDRL2, 또는 이들로부터 1 또는 2 아미노산이 다른 CDRL2 시퀀스, 및
(f) SEQ ID NO: 17에 보여진 CDRL3, 또는 이들로부터 1 또는 2 아미노산이 다른 CDRL3 시퀀스.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 항체는 임의의 SEQ ID NO.1-4 또는 SEQ ID NO.84-88에 보여진 중사슬 가변영역(VH) 또는 상기 시퀀스와 적어도 85% 아이덴티티를 갖는 시퀀스에 보여진 중사슬 가변영역(VH)를 포함한다. 게다가, 본 발명의 인간 항체는 임의의 SEQ ID NO.10-13 또는 SEQ ID NO.89-91 또는 상기 시퀀스와 적어도 85% 아이덴티티를 갖는 시퀀스에 보여진 경사슬 가변영역(VL)을 포함한다. 적어도 85% 아이덴티티는 85 및 100% 사이, 바람직하게는 90, 95 또는 99%로 포함된 아미노산 아이덴티티 퍼센트를 의미한다.
SEQ ID NO.1-4를 갖는 상기 언급된 시퀀스는 여기 개시되며; 각 시퀀스에서 가변 사슬 내 CDRs의 위치는 밑줄로 표시한다:
EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSNYYMAWVRQAPKKGLEWVATINPSGTRTYYPDSVKGRFTLSRDSAKSSLYLQMNSLKSEDTATFYCARLYNNYAFDYWGQGVMVTVSS
SEQ ID NO.1 - 가변 중사슬
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVATINPSGTRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLYNNYAFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.2 - 가변 중사슬
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVANINPSGTRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLYNNYAFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.3 - 가변 중사슬
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVATINPSGTRTYYPDSVKGRFTISRDSAKSSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLYNNYAFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.4 - 가변 중사슬
SEQ ID NO.84-88을 갖는 상기 언급된 시퀀스는 여기 개시되며; 각 시퀀스에서 가변 사슬 내 CDRs의 위치는 밑줄로 표시한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVATINPSGTRTYYPDSVKGRFTLSRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLYNNYAFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.84 - 가변 중사슬
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMAWVRQAPGKGLEWVATINPSGTRTYYPDSVKGRFTLSRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTATFYCARLYNNYAFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.85 - 가변 중사슬
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMAWVRQAPGKGLEWVATINPSGTRTYYPDSVKGRFTLSRDSAKSSLYLQMNSLRAEDTATFYCARLYNNYAFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.86 - 가변 중사슬
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVATINPSGTRTYYPDSVKGRFTLSRDSAKSSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLYNNYAFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.87 - 가변 중사슬
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMAWVRQAPGKGLEWVATINPSGTRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTATYYCARLYNNYAFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.88 - 가변 중사슬
SEQ ID NO.10-13를 갖는 상기 언급된 시퀀스는 여기 개시되며; 각 시퀀스에서 가변 사슬 내 CDRs의 위치는 밑줄로 표시한다:
DVQMTQSPALAVSPGERVSISCRASESVSTLMHWYQQKPGQQPKLLIYGTSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIDPVEADDTATYFCQQSWNDPPTFGGGTKLEVK
SEQ ID NO.10 - 가변 경사슬
DVQMTQSPALAVSPGERVSISCRASESVSTLMHWYQQKPGQQPKLLIYGTSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIDPVEADDTATYFCQQSWNDPPTFGGGTKLELK
SEQ ID NO.11 - 가변 경사슬
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESISTLLHWYQQKPGKAPKLLIYGTSNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWNDPPTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO.12 - 가변 경사슬
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSTLMHWYQQKPGKAPKLLIYGTSNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWNDPPTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO.13 - 가변 경사슬
SEQ ID N.89-91을 갖는 상기 언급된 시퀀스는 여기 개시되며; 각 시퀀스에서 가변 사슬 내 CDRs의 위치는 밑줄로 표시한다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESISTLLHWYQQKPGKQPKLLIYGTSNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQSWNDPPTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO.89 - 가변 경사슬
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSTLMHWYQQKPGKQPKLLIYGTSNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQSWNDPPTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO.90 - 가변 경사슬
DVQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESISTLLHWYQQKPGKAPKLLIYGTSNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQSWNDPPTFGGGTKVEIK
SEQ ID N.91 - 가변 경사슬
임의의 SEQ ID NOs. 2-4에 보여진 중사슬 가변영역 및 임의의 SEQ ID NOs. 12-13에 보여진 경사슬 가변영역을 포함하는 인간항체가 특히 바람직하다.
FGFR4의 산 박스에 결합하는 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편으로서 이의 중사슬 가변 영역이 시퀸스 SEQ ID NO: 18-22 또는SEQ ID NO: 92-96과 적어도 80% 아이덴티티를 갖는 뉴클레오티드 시퀀스로 코딩되고 이의 경사슬의 가변 영역이 시퀸스 SEQ ID NO:23-26 또는 SEQ ID NO: 97-99과 적어도 80%의 아이덴티티를 갖는 뉴클레오티드 시퀀스로 코딩되는 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편도, 본 발명의 범위 내이며, 이는 항체가 그의 결합 특이성을 유지한다는 전제하에서이다. 적어도 80% 아이덴티티는 80% 및 100% 사이, 바람직하게는 90%, 95% 또는 99%로 포함된 뉴클레오티드 아이덴티티를 의미한다.
SEQ ID NO: 6에 보여진 CDRH1, SEQ ID NO: 7에 보여진 CDRH2 및 SEQ ID NO: 9에 보여진 CDRH3를 포함하는 중사슬 및 SEQ ID NO: 15에 보여진 CDRL1, SEQ ID NO:16에 보여진 CDRL2 및 SEQ ID NO:17에 보여진 CDRL3을 포함하는 경사슬을 포함하는 인간 항체(hu3B6a 및 hu36Bc)가 특히 바람직하다. 또한, 하나 이상의 CDRs가 1 또는 2 아미노산이 다른 인간 항체 또는 인간 FGFR4에 대해 동일한 에피토프를 인식하는 항체를 포함한다. 특히 바람직한 실시예에서, 상기 인간 항체는 SEQ ID NO: 2에 따른 중사슬 가변영역 및 SEQ ID NO: 12에 따른 경사슬 가변영역을 포함한다(hu3B6a). 또 다른 특히 바람직한 실시예에서, 인간 항체는 SEQ ID NO: 4에 따른 중사슬 가변영역 및 SEQ ID NO: 12에 따른 경사슬 가변영역을 포함한다(hu3B6c). 상기 중사슬 및/또는 경사슬의 가변 영역의 시퀀스는 SEQ ID NOs. 2, 4 및 12에 보여진 시퀀스와 적어도 85 아이덴티티를 갖는 인간항체가 또한 포함된다.
SEQ ID NO: 6에 보여진 CDRH1, SEQ ID NO: 8에서 보여진 CDRH2 및 SEQ ID NO: 9에 보여진 CDRH3을 포함하는 중사슬 및 SEQ ID NO: 15에 보여진 CDRL1, SEQ ID NO: 16에 보여진 CDRL2 및 SEQ ID NO: 17에 보여진 CDRL3을 포함하는 경사슬을 포함하는 인간항체(hu3B6b)가 특히 바람직하다. 하나 이상의 CDRs가 1 또는 아미노산이 다른 인간 항체 또는 인간 FGFR4에 대해 동일한 에피토프를 인식하는 항체가 또한 포함된다. 특히 바람직한 실시예에서, 상기 인간 항체는 SEQ ID NO: 3에 따른 중사슬 가변영역 및 SEQ ID NO: 12에 따른 경사슬 가변영역을 포함한다. 중사슬 및/또는 경사슬의 가변 영역의 시퀀스는 SEQ ID NOs: 3 및 12에 보여진 시퀀스와 적어도 85% 아이덴티티를 갖는 인간 항체가 또한 포함된다.
SEQ ID NO: 6에 보여진 CDRH1, SEQ ID NO: 7에 보여진 CDRH2 및 SEQ ID NO: 9에 보여진 CDRH3을 포함하는 중사슬 및 SEQ ID NO: 14에 보여진 CDRL1, SEQ ID NO: 16에 보여진 CDRL2 및 SEQ ID NO: 17에 보여진 CDRL3을 포함하는 경사슬을 포함하는 인간 항체(hu3B6d 및 hu3B6f)가 특히 바람직하다. 하나 이상의 CDRs가 1 또는 2 아미노산이 다른 인간 항체 또는 인간 FGFR4에 대한 동일한 에피토프를 인식하는 항체가 또한 포함된다. 특히 바람직한 실시예에서, 상기 인간 항체는 SEQ ID NO: 2에 따른 중사슬 가변 영역 및 SEQ ID NO: 13에 따른 경사슬 가변영역을 포함한다(hu3B6d). 또 다른 특히 바람직한 실시예에서, 상기 인간 항체는 SEQ ID NO: 4에 따른 중사슬 가변영역 및 SEQ ID NO: 13에 따른 경사슬 가변영역을 포함한다(hu3B6f). 중사슬 및/또는 경사슬의 가변 영역의 시퀀스가 SEQ ID NOs: 2, 4 및 13에 보여진 시퀀스와 적어도 85%의 아이덴티티를 갖는 인간 항체가 또한 포함된다.
SEQ ID NO: 6에 보여진 CDRH1, SEQ ID NO: 8에 보여진 CDRH2 및 SEQ ID NO: 9에 보여진 CDRH3을 포함하는 중사슬 및 SEQ ID NO: 14에 보여진 CDRL1, SEQ ID NO: 16에 보여진 CDRL2 및 SEQ ID NO: 17에 보여진 CDRL3을 포함하는 경사슬 인간 항체(hu3B6e)가 특히 바람직하다. 하나 이상의 CDRs는 1 또는 2 아미노산이 다른 인간 항체, 또는 인간 FGFR4에 대한 동일한 에피토프를 인식하는 항체가 또한 포함된다. 특히 바람직한 실시예에서, 상기 인간 항체는 SEQ ID NO: 3에 따른 중사슬 가변영역 및 SEQ ID NO: 13에 따른 경사슬 가변영역을 포함한다. 중사슬 및/또는 경사슬의 가변 영역의 시퀀스는 SEQ ID NOs: 3 및 13에 보여진 시퀀스와 적어도 85% 아이덴티티를 갖는 인간 항체가 또한 포함된다.
또 다른 바람직한 항체는 SEQ ID NO: 5에 보여진 CDRH1, SEQ ID NO: 7에 보여진 CDRH2 및 SEQ ID NO: 9에 보여진 CDRH3을 포함하는 중사슬 및 SEQ ID NO: 14에 보여진 CDRL1, SEQ ID NO: 16에 보여진 CDRL2 및 SEQ ID NO: 17에 보여진 CDRL3을 포함하는 경사슬을 포함하는 랫트 모노클로날 항체 (BMK-3B6-E4-C3)이다. 하나 이상의 CDRs이 1 또는 2 아미노산이 다른 항체 또는 인간 FGFR4에 대해 동일한 에피토프를 인식하는 항체가 또한 포함된다. 특히 바람직한 실시예에서, 상기 항체는 SEQ ID NO: 1에 따른 중사슬 가변영역 및 SEQ ID NO: 10에 따른 경사슬 가변영역을 포함한다. 중사슬 및/또는 경사슬의 가변 영역의 시퀀스가 SEQ ID NOs. 1 및 10에 보여진 시퀀스와 적어도 85% 아이덴티티를 갖는 항체가 또한 포함된다.
또 다른 바람직한 항체는 SEQ ID NO: 5에 보여진 CDRH1, SEQ ID NO: 7에 보여진 CDRH2 및 SEQ ID NO: 9에 보여진 CDRH3을 포함하는 중사슬 및 SEQ ID NO: 14에 보여진 CDRL1, SEQ ID NO: 16에 보여진 CDRL2 및 SEQ ID NO: 17에 보여진 CDRL3을 포함하는 경사슬을 포함하는 키메라 항체 (ch3B6)이다. 하나 이상의 CDRs이 1 또는 2 아미노산이 다른 항체 또는 인간 FGFR4에 대해 동일한 에피토프를 인식하는 항체가 또한 포함된다. 특히 바람직한 실시예에서, 상기 항체는 SEQ ID NO: 1에 따른 중사슬 가변영역 및 SEQ ID NO: 11에 따른 경사슬 가변영역을 포함한다. 중사슬 및/또는 경사슬의 가변 영역의 시퀀스가 SEQ ID NOs. 1 및 11에 보여진 시퀀스와 적어도 85% 아이덴티티를 갖는 항체가 또한 포함된다.
본 발명의 실시예에서, 상기 본 발명의 항체는 경사슬 및 중사슬을 포함하며, 여기서 중사슬의 가변 영역이 SEQ ID NO. 1-4, 84-88를 갖는 임의 시퀀스로부터 선택되고 경사슬의 가변 영역이 임의 SEQ ID NO. 10-13, 89-91를 갖는 임의 시퀀스로부터 선택된 시퀀스를 갖는다.
본 발명의 실시예에서, 상기 본 발명의 항체는 중사슬의 가변 영역이 SEQ ID NO. 18-22, 92-96을 갖는 임의의 시퀀스로부터 선택된 뉴클레오티드 시퀀스에 의해 코딩되고, 상기 경사슬의 가변 영역이 SEQ ID NO. 23-26, 97-99를 갖는 임의 시퀀스로부터 선택된 뉴클레오티드 시퀀스에 의해 코딩되는 경사슬 및 중사슬을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명의 항체는 가변 경사슬(VL) 및 가변 중사슬(VH)의 조합이 이하 표 3에 보여진 것들로부터 선택되는 경사슬 및 중사슬을 포함한다. 상기 항체는 다음 표 3에서 보여진 것들로부터 바람직하게 선택된 CDRH 및 CDRL의 조합을 포함한다. 이 표의 각 줄은 CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 하나의 특이적 조합 및 가변 경사슬 및 가변 중사슬의 특이적 조합을 나타낸다는 것으로 이해된다.
표 3. 숫자는 포함된 시퀀스 리스트에 따라 SEQ ID NO를 나타낸다.
항체내부 코드 VH VL CDRH1 CDRH2 CDRH3 CDRL1 CDRL2 CDRL3
Hu3B6a 2 12 6 7 9 15 16 17
Hu3B6b 3 12 6 8 9 15 16 17
Hu3B6c 4 12 6 7 9 15 16 17
Hu3B6d 2 13 6 7 9 14 16 17
Hu3B6e 3 13 6 8 9 14 16 17
Hu3B6f 4 13 6 7 9 14 16 17
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 항체는 이들의 결합 특이성 및 생물학적 활성에 관하여, 특히 FGFR4의 특이적 에피토프를 인식하고 세포 성장 및 세포 이동을 줄이는 이들의 능력에 대하여 유리한 성질을 나타낸다.
특히, 본 발명의 항체 hu3B6, ch3B6 및 BMK-3B6-E4-C3는 항-종양 활성을 갖는다.
또한, 이들은 특이적으로 FGFR4에 결합하고 바람직하게는 다른 FGF 수용체 FGFR1-3에 교차-반응성을 나타내지 않는다.
본 발명의 항체는 FGFR4에 대한 FGF19 결합을 억제시킬 수 있다.
FGFR4에 결합하는 리간드 위의 항체 효과는 고체 상 수용체-결합 분석법을 사용하여 결정될 수 있다. FGFR4 수용체에 대한 리간드의 결합 친화도를 줄이거나 또는 FGFR4에 대한 리간드의 결합을 차단하는 이들 항체가 확인될 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 항체는 추가 FGFR4 리간드, 예를 들어 FGF1, FGF8, FGF17, FGF18, FGF21, FGF23 (Zhang et al., 2006)를 포함하는 FGFR4 리간드의 수용체에 대한 결합을 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70% 및 보다 바람직하게는 적어도 80% 또는 87%를 차단할 수 있다.
인간 FGFR4에 대한 리간드 결합의 차단으로 FGFR4 신호전달이 억제된다. FGFR4 활성화는 Cyp7A1의 억제 및 CTGF 유전자 전사의 유도, 및 수용체 자체 및 FRS2 및 Erk1/2와 같은 하류 이펙터 단백질의 인산화의 자극과 관련이 있다. 차단 항체를 선택하기 위하여, 세포들을 완충액(대조군) 또는 항체로 사전 배양하고, 이후 리간드 또는 대조군 완충액으로 처리될 수 있다. 이후 세포들을 용해시키고 세포 용해물은 Cyp7A1 및 CTGF 특이적 프로브를 사용하는 RT-PCR에 의한 유전자 발현 분석을 위해 가공되거나, 또는 SDS-PAGE 및 항-포스포 FGFR4, 항-포스포 FRS2, 및/또는 항-포스포 Erk1/2 항체로 탐침된 웨스턴 블롯으로 분석될 수 있다. 대조군(처리되지 않은 세포들)에 비하여 Cyp7A1 억제를 완화시키고, CTGF 발현을 활성화하고, 및/또는 FGFR4, FRS2, 및 Erk1/2 인산화를 줄이는 이들 항체가 선택된다.
인비트로 실험을 수행하여 FGFR4-종속 세포 증식을 억제하는 본 발명의 항체 능력을 결정할 수 있다. 클론원성 분석법 및 분석법 및 부드러운 한천 콜로니 형성 분석법(soft agar colony formation assay)이 수행될 수 있다. 적당한 수의 관심있는 단일 세포들을 파종하고 처리하거나 또는 적당한 배지로 희석한 항체로 처리하거나 항체없이 처리한다. 항체는 실험 기간 동안(10-15일) 1주일에 2번 교체하고 이후 생성된 콜로니를 계수한다. FGFR4-매개 세포 이동을 줄이는 이들 항체를 선택하기 위하여, 유입(transmigration) 실험이 수행될 수 있다. 세포를 항체와 함께 배양한다. 적당한 수의 세포들을 8㎛ 기공을 갖는 코팅된 트랜스웰 플레이트 BD Biosciences, San Jose, CA; U.S.A.)의 상부 챔버에 놓을 수 있다. 자극 배지 단독 또는 화학주성제(chemotactic agent)를 포함하는 자극 배지의 경우에 하부 챔버에서 사용된다. 세포를 놓아 이동하게 하고 이어서 염색한다. 염색된 세포를 계수하고 퍼센트 억제는 대조군 항체에 대비한 억제로서 표현된다.
본 발명의 항체는 항-종양 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
치료적 항체의 항-종양 효능은 인간 이종이식 종양 연구로 평가될 수 있다. 이들 연구에서, 인간 종양은 면역시스템이 손상된 마우스에서 이종이식으로 성장하고 치료적 효능은 종양 성장 억제의 정도로 측정된다. 만약 본 발명의 FGFR4 항체가 면역시스템이 손상된 마우스 내에서 인간 암 세포의 종양 성장에 관련이 있는지 결정하기 위하여, 세포들을 마우스에 이식한다. 종양은 동물의 등 또는 옆구리에서 피하로 성장된다. 치료는 즉각 또는 종양이 특정 평균 부피에 도달할 때 시작될 수 있다. 제1 치료 전에, 마우스는 무작위적으로 선별되고 통계적 시험을 수행하여 치료 집단에 걸쳐 시작 종양 부피(평균, 중간 및 표준 편차)에서 균일성을 확보한다. 치료는 복강내 주사에 의해 일주일에 2번 25mg/kg 주사 후 25mg/kg 주사의 복용량으로 시작한다.
특정 실시예에서, 여기 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 U.S. Pat. No. 4,816,567; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))에 설명되어 있다. 일 실시예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역(e.g., 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 또는 비인간 영장류, 예를 들어 몽키로부터 유래한 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가 실시예에서, 키메라 항체는 "류 스위치된" 항체이며, 여기서 류 또는 하부류는 부모 항체의 것으로부터 변화되었다. 키메라 항체는 이들의 항원-결합 단편을 포함한다.
예시적 실시예에서, 키메라 항체는 인간 IgG1 불변 영역에 대한 코딩 시퀀스를 갖는 프레임에서 랫트 가변 중사슬 영역을 암화화하는 cDNA 및 동일한 발현 벡터 내로 인간 kappa 사슬 불변 영역에 대한 코딩 시퀀스를 갖는 프레임 내 랫트 가변 경사슬 영역을 암호화하는 cDNA를 클로닝하여 제조될 수 있다. 하이브리드 중사슬 및 경사슬을 암호화하는 발현 벡터는 이후 적당한 세포주 내로 공-감염되고 원하는 항체가 얻어진다.
특정 실시예에서, 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비인간 항체는 인간화되어 부모 비인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지하면서, 인간에 대한 면역원성을 줄인다. 일반적으로, 인간화된 항체는 하나 이상의 가변 도메인을 포함하며, 여기서 CDRs(또는 이들의 일부)는 비인간 항체로부터 유래하고, FRs(또는 이들의 일부)는 인간 항체 시퀀스로부터 유래한다. 인간화된 항체는 선택적으로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 실시예에서, 인간화된 항체에서 일부 FR 잔기는 비인간 항체(예를 들어 CDR 잔기가 유래된 항체)의 대응하는 잔기로 치환되어, 예를 들어 항체 특이성 및 친화성을 회복시키거나 개선한다.
인간화된 항체는 기존 기술에 따라 모노클로날 항체의 인간화에 의해 제조될 수 있다. 전형적으로 비인간 항체는 인간화되어 인간에 대한 면역원성을 줄이는 한편 부모 비인간 항체의 특이성 및 친화성은 유지한다. 인간화된 항체 및 이들을 제조하는 방법은 예를 들어 Alamagro 및 Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)에 검토되어 있고, 다음에 더 설명되어 있다: 예를 들어, Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); U.S. Pat. Nos. 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, and 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (describing SDR (a-CDR) grafting); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (describing "resurfacing"); Dall' Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (describing "FR shuffling"); and Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) and Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (describing the "guided selection" approach to FR shuffling).
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은, 이에 한정되지는 않지만 다음을 포함한다: "best-fit" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역(see, e.g., Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); 경사슬 또는 중사슬 가변영역의 특정 하부집단의 인간 항체의 컨센서스 시퀀스로부터 유래한 프레임워크 영역(see, e.g., Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); 인간 성숙 (신체적으로 돌연변이됨) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역(see, e.g., Almagro 및 Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); 및 스크리닝 FR 라이브러리로부터 유래된 프레임워크 영역 (see, e.g., Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
본 발명의 예시적 실시예에서, 완전히 인간화된 항는 키메라 발현 벡터로부터 출발하여 제조된 인간화된 발현 벡터를 사용하고, 인간화된 가변 중사슬 코딩 시퀀스로 원래 랫트 가변 중사슬 코딩 시쿼스를 교체하고, 인간화된 가변 경사슬 코딩 시퀀스로 원래 랫트 가변 경사슬 코딩 시퀀스를 교체하여 얻어진다. 얻어진 발현 벡터는 이후 적당한 세포주 내에서 공-감염되어 인간화된 항체를 제조한다.
인간 항체는 유전적으로 가공된 동물, 예를 들어 이종 면역 시스템을 포함하는 유전적으로 가공된 동물 또는 기존 기술에 따라 항체 디스플레이 라이브러리부터 제조될 수 있다. 인간 항체는 다음에 일반적으로 설명된다: van Dijk and van de Winkel (Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)) 및 Lonberg (Curr. Opin. Immunol. 20: 450-459 (2008)). 인간 항체는 항원성 도전에 반응하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 제조하기 위하여 변형된 형질 전환 동물에 면역원을 투여하는 것으로 제조될 수 있다. 그러한 동물들은 전형적으로 내생 면역글로불린 좌위(loci)를 교체하거나, 또는 염색체 외적으로 존재하거나 또는 동물 염색체 내로 무작위적으로 통합되는 인간 면역글로불린 좌위의 모두 또는 일부를 포함한다. 그러한 형질전환 마우스에서, 상기 내생 면역글로불린 좌위는 일반적으로 불활성화되었다. 형질전환 동물로부터 인간 항체를 얻기 위한 방법의 검토는 다음을 참조한다: 예를 들어 Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125 (2005). 그러한 동물에 의해 제조된 온전한 항체의 인간 가변 영역은, 예를 들어 다른 인간 불변 영역과 조합하는 것으로 더 변형될 수 있다.
인간 항체는 혼성세포-기반 방법으로 또한 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 제조를 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 다음에 설명되어 있다: (see e.g. Kozbor J. Immunol. 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63). 인간 B-세포 혼성세포 기술을 통해 제조된 인간 항체는 또한 다음에 설명되어 있다: Li et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 103: 3557-3562 (2006).
인간 항체는 파아지 디스플레이 방법에 의해 제조될 수 있다(see e.g., US 6,248,516, US 5,403,484, US 5,969, 108, US 5,885,793, US 6,696,248, US 5,849,500). 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 기술은 당해 기술 분야에 알려져 있다(see e.g., Carmen, S. et al., Briefings in Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p. 189-203; and Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), p. 427-431). 예를 들어, 파아지 디스플레이 방법이 사용될 수 있느며, 파아지 표면에 단일-사슬 항체 (scFv)로서 발현되는 인간 항체 가변 영역을 일으키고 항원에 결합하는 파아지를 선택하는 것과 관련이 있다(Nature (1991), 352, (6336), p. 624-628, Journal of Molecular Biology (1992), 227, (2), p 381-388, and Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p. 1105-1116). 유사하게, 또 다른 파아지 디스플레이 방법이 또한 사용될 수 있고, 이는 파아지 표면에 인간 항체 Fab (항원-결합 단편)의 발현을 야기하고 항원에 결합하는 파아지를 선택하는 것과 관련이 있다(WO 97/08320 및 WO 01/05950). 항원 결합을 기반으로 선택된 파아지 유전자를 분석하여, 항원에 결합하는 인간 항체 가변 영역을 암화화하는 DNA 시퀀스를 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv 또는Fab의 DNA 시퀀스가 명확해질 때, CDR 시퀀스가 그로부터 추출되고, 상기 시퀀스를 갖는 발현 벡터가 제조되고 적당한 숙주 내로 도입되고, 이어서 유전자 발현을 통해 인간 항체를 얻는다(WO 92/01047, WO 92/20791 , WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p. 433-455, 및 Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p. 1105-1116). 인간 항체는 인간-유래 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 시퀀스를 분리하여 제조될 수 있다. 그러한 가변 도메인 시퀸스는 원하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 기술은 당해 기술 분야에 알려져 있다.
본 발명의 특정 실시예에서, 항체 ch3B6의 인간화는 선택된 인간 면역글로불린 가변 영역 내로 원래의 혼성세포 랫트 CDR 시퀀스를 그래프트하여 얻어졌다. 인간화된 변이체를 최적화하기 위하여, 원래 랫트 항체 3B6의 것과 가장 유사한 인간 생식계열 면역글로불린 가변 시퀸스가 확인되고 선택되었다. 기존 면역글로불린 결정 구조체와의 상동성을 기초로, 선택된 인간 생식계열 가변 영역의 3D 모델은 중사슬 가변영역 (VH), 및 경사슬 가변영역 (VL) 둘 다에 대하여 제조되었다. 3D 모델 내의 각 아미노산 위치는, 항원 결합 또는 VH/VL 방향성에 잠재적으로 영향을 미치는 아미노산을 특히 주목하면서, 대응하는 원래 쥐과 잔기로 치환되는데 필요한 인간 프레임워크 내 추가 아미노산 잔기를 결정하기 위하여 평가되었다. 인간화된 시퀀스는, VH 3개 및 VL 2개에 대해 각각 약간 다른 버전으로 디자인되고, 이들의 조합은 6개의 다른 항체(hu3B6a, hu3B6b, hu3B6c, hu3B6d, hu3B6e, hu3B6f)를 제조한다.
본 발명은 또한 인간 항체의 단편, 예를 들어 적어도 하나의 항원 결합 사이트를 포함하는 상기 언급된 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2단편, Fv 단편, 디어바디 또는 단일 사슬 항체 분자 및 이들이 인간 FGFR4에 대해 원하는 결합 능력을 나타내는 한 다른 단편을 포함한다. 특정 항체 단편의 검토는 다음을 참조로 한다: Hudson et al., Nat. Met. 9: 129-134 (2003).
특정 실시예에서, 여기 제공된 항체의 아미노산 시퀀스 변이체는 이들이 인간 FGFR4에 대해 원하는 결합 능력을 나타내는 한 고려된다. 이는 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선하는데 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 시퀀스 변이체는 항체를 암화화하는 뉴클레오티드 시퀀스 내로 적당한 변형을 도압하거나, 또는 펩타이드 합성을 통해 제조될 수 있다. 그러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 시퀀스 내 잔기의 결손 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의 조합으로 최종 구성에 도달하며, 이는 최종 구성이 원하는 특성, 예를 들어 항원 결합을 갖는다는 것을 전제로 한다.
본 발명에 따른 항체는 당해 기술 분야에서 흔한 일반적인 지식의 일부인 제조 방법의 수단으로 얻어질 수 있다.
예를 들어, 참조 문헌은 최종판 "Current protocols in immunology" Colligan et al. eds., John Wiley & Sons, Inc., NY에 있다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 모노클로날 항체는 실시예 3에 보여진 것처럼 유전적 면역법으로 제조된다. 유전적 면역법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있고, 당해 기술 분야의 통상의 기술자들에 의해 보통 사용된다. 이 기술은 예를 들어 다음 문헌에서 발견될 수 있다: 예를 들어 Tang DC, DeVit M, Johnston SA. Nature. 1992, 356(6365):152-154.
본 발명의 항체는 비상동 기(heterologous group), 예를 들어 이펙터 기(effector group)에 결합될 수 있다. 그러한 항체 콘쥬게이트는 치료적 분야에서 특히 적당하다. 용어 "이펙터 기"는 세포독성기를 말하며, 예를 들어 방사성동위원소 또는 방사성핵종, 독소, 치료적 기 또는 당해 기술 분야에 알려진 또 다른 이펙터기를 의미할 수 있다.
상기 항체가 치료적 기에 결합된 콘쥬게이트, 소위 항체-약물-콘쥬게이트(ADCs)가 특히 바람직하다.
본 발명의 항체는 FGFR4를 선택적으로 표적화하는 성질로 인하여, 항체-약물 콘쥬게이트(ADC)를 제조하는데 특히 유용하다. 바라직한 실시예에서, 상기 ADC에서 항체에 부착된 약물 성분은 독소, 바람직하게는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 독소이다: 아우리스타틴(auristatin), 메이탄시노이드(maytansinoid), 칼리케아마이신(calicheamycin), 투불리신(tubulysin), 듀오카르마이신(duocarmycin), 캄프토테신 아날로그(camptothecin analog), 벤조디아제핀(benzodiazepine), 독소루비신(doxorubicin), α-아마니틴 유도체(a-amanitin derivertive), 안트라시클린(anthracyclin), 리족신(rhizoxin), 타일란스타틴(thailanstatin), 스플리스오스타틴(spliceostatin), 크립토피신(cryptophycin) 및 히스톤 데아세틸라제 저해제(히스톤 데아세틸라제 억제제). 본 주제의 검토를 위하여 다음을 참조할 수 있다: Beck et al., Nat Rev 약물 Discov. 16:315-337 (2017).
본 발명의 일 실시예에 따라, 여기 개시된 모노클로날 항체를 갖는 콘쥬게이트(ADC)는 크립토피신, 특히 다음 식의 크립토피신을 포함한다:
본 발명의 일 실시예에 따라 다음 콘쥬게이트는 화학식(I) 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 갖는다.
여기서 R은 -CO-CH2-X-(A)n-B이고;
여기서 X는 NR*로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R*은 H 및 C1-C10 알킬, 및 O로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A는 존재하거나 부존재할 수 있고, 자가-희생기 링커(self-immolative linker)이고,
n은 0 또는1이고;
B는 본 발명에 개시된 항체이다.
본 발명의 일 실시예에서, 화학식(I)의 콘쥬게이트에서 상기 링커 A는 화학식(II)의 모이어티이다.
여기서 R1은 H, (C1-C10) 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, R2는 선택적으로 R1 와 함께 아미노산 측쇄의 잔기이고, R3 는 H, (C1-C10) 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, R4는 선택적으로 R3와 함께 아미노산 측쇄의 잔기이다.
본 발명의 일 실시예에서, 화학식(I)의 콘쥬게이트에서 상기 링커 A는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
및
(IV)
본 발명의 일 실시예에서, 상기 콘쥬게이트는 화학식 (V)을 가지며,
여기서 R1, R2, R3 및 R4 는 상기 정의된 바와 같으며, X는 NH, N- (C1-C10)- 알킬, O로 이루어진 군으로부터 선택되고; mAb는 본 발명에 개시된 모노클로날 항체를 나타낸다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 콘쥬게이트는 화학식 (VI)을 갖고,
(VI)
여기서 상기 화학식 왼쪽 말단의 기호는 본 발명에 개시된 모노클로날 항체를 나타낸다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 콘쥬게이트는 화학식 (VII)을 갖고,
여기서 R1은 H, (C1-C10) 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, R4은 선택적으로 R1과 함께 아미노산 측쇄의 잔기이고; X 는 NH, N-(C1-C10), 알킬 O로 이루어진 군으로부터 선택되고; mAb은 본 발명에 개시된 바와 같은 모노클로날 항체를 나타낸다.
모든 상술된 실시예들은 대표적인 약제학적으로 허용가능한 염을 또한 포함한다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 항체는 ADC에 포함되고, 여기서 상기 약물 모이어티는 WO2016146638에 개시된 크립토피신이다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명의 항체는 WO2016146638에 개시된 화학식(I)의 화합물 중 B기에 대응한다.
또한, 본 발명의 항체는 표지기(labeling group )에 결합될 수 있다. 그러한 항체 콘쥬게이트는 진단 분야에 특히 적당하다. 여기 사용된 용어 "표지기"는 검출가능한 마커, e.g. 방사선 표지된 아미노산 또는 비오틴 모이어티, 형광성 마커, 효소 또는 당해 기술 분야에 알려진 임의 다른 타입의 마커를 의미한다. 방사성 동위원소에 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 결합시키는 것은 예를 들어 종양 치료에 장점을 제공한다. 화학요법 및 암 치료의 다른 형태와 다르게, 방사면역치료법 또는 방사성동위원소-항체 조합의 투여는 주위 정상 건강한 조직에 최소 손상을 주면서 암 세표를 표적화한다.
일부 실시예에서, 본 발명의 항체는 예를 들어 항원 결합 성질, 이펙터 기능, 약물동태, 약제학적 성질 및 안전성 문제를 개선하기 위하여 가공될 수 있다. 특히, 항체의 가변 영역이 가공될 수 있다. 가공 항체는, 특히 상기 언급된 효과를 얻기 위하여, 면역학 분야에서 보통 활성이다. 참조문헌은 예를 들어 다음과 같다: Igawa T, Tsunoda H, Kuramochi T, Sampei Z, Ishii S, Hattori K. MAbs. 2011 May-Jun;3(3):243-52, "Engineering the variable region of therapeutic IgG antibodies". 특히, 본 발명의 항체의 글리코엔지니어드 버전은 본 발명의 범위 내이며, 이들은 당해 기술분야의 일반적인 지식에 따다 통상의 기술자에 의해 얻어질 수 있다.
본 발명은 또한 항체를 암호화하는 핵산 분자를 의미한다.
용어 "핵산 분자"는 DNA, e.g. 단일- 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA을 포함한다. 상기 DNA는 게놈, cDNA 또는 합성 기원, 또는 이들의 조합의 것일 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는 발현 대조군 시퀀스, 즉 핵산 시퀀스를 코딩하는 발현에 영향을 주는데 필요한 시퀀스에 대한 작동적으로 연결될 수 있다. 그러한 발현 대조군 시퀀스는 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 사이트 및/또는 전사 종결 시퀸스를 포함할 수 있다. 적당한 발현 대조군 시퀀스의 특정 예는 당해 기술 분야에 알려져 있다.
바람직한 실시예에 따라, 본 발명은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 분리된 핵산 분자에 대한 것이다:
(a) 상기 정의된 항체, 이들의 단편 또는 유도체를 암호화하는 핵산 시퀀스,
(b) SEQ ID NOs: 18-22, 92-96 및 SEQ ID NOs. 23-26, 97-99 또는 SEQ ID NO.28-31 및 SEQ ID NOs 32-34 중 어느 하나에 보여진 핵산 시퀀스,
(a) 또는 (b)의 어느 하나의 시퀀스에 상보적인 핵산 시퀀스, 및
엄격한 조건 하에서 (a) 또는 (b)에 하이브리드할 수 있는 핵산 시퀀스.
본 발명의 특히 바람직한 실시예에 따라, 핵산 분자는 항체의 중사슬 가변 영역을 암호화하는 시퀀스 및 항체의 경사슬의 가변 영역을 암호화하는 시퀀스를 포함한다.
대안적 실시예에서, 2개 핵산 분자들의 조합이 제공되고, 여기서 하나의 핵산 분자는 항체의 경사슬을 암호화하고 다른 핵산 분자는 항체의 중사슬을 암호화한다.
중사슬의 가변 영역을 암호화하는 핵산 시퀀스는 SEQ ID NOs. 18-22 중 어느 하나에 보여진 시퀀스들로부터 바람직하게 선택된다. 항체의 경사슬의 가변 영역을 암호화하는 핵산 시퀀스는 SEQ ID NOs. 23-26 중 어느 하나에 보여진 시퀀스들로부터 바람직하게 선택된다.
중사슬의 가변영역을 코딩하는 SEQ ID NO. 18-22를 갖는 상기 언급된 핵산 시퀀스는 여기 보고된다:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTAGTGCAGCCTGGAAGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCACTTTCAGTAATTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAAAGAAGGGTCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAATCCCAGTGGTACCAGAACTTACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCCGATTCACTCTCTCCAGAGATAGTGCAAAGAGCAGCCTATATCTGCAAATGAACAGTCTGAAGTCTGAGGACACGGCCACTTTTTACTGTGCAAGGCTTTATAACAACTACGCTTTTGATTACTGGGGCCAGGGAGTCATGGTCACAGTCTCCTCA
SEQ ID N.18 -가변 중사슬을 코딩하는 핵산
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTAGTGCAGCCTGGAAGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCACTTTCAGTAATTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAAAGAAGGGTCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAATCCCAGTGGTACCAGAACTTACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCCGATTCACTCTCTCCAGAGATAGTGCAAAGAGCAGCCTATATCTGCAAATGAACAGTCTGAAGTCTGAGGACACGGCCACTTTTTACTGTGCAAGGCTTTATAACAACTACGCTTTTGATTACTGGGGCCAAGGAGTCATGGTCACTGTCTCCTCA
SEQ ID N.19 -가변 중사슬을 코딩하는 핵산
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID N.20 -가변 중사슬을 코딩하는 핵산
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID N.21 -가변 중사슬을 코딩하는 핵산
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAGCGCCAAGAGCTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID N.22 -가변 중사슬을 코딩하는 핵산
중사슬의 가변 영역을 코딩하는 SEQ ID NO. 92-96을 갖는 상기 언급된 핵산 시퀀스가 여기 보고된다:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCCTCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID N.92 - 가변 중사슬을 코딩하는 핵산
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCCTCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTACCTTCTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID N.93 - 가변 중사슬을 코딩하는 핵산
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCCTCTCCAGAGACAGCGCCAAGAGCTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTACCTTCTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID N.94 - 가변 중사슬을 코딩하는 핵산
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCCTCTCCAGAGACAGCGCCAAGAGCTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID N.95 - 가변 중사슬을 코딩하는 핵산
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTACCTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID N.96 - 가변 중사슬을 코딩하는 핵산
경사슬의 가변 영역을 코딩하는 SEQ ID NO. 23-26을 갖는 상기 언급된 핵산 시퀀스가 여기 보고된다:
gatgtccagatgacccagtctcctgctttggctgtgtctccaggagagagggtttccatctcctgtagggccagtgaaagtgtcagtacacttatgcactggtaccaacagaaaccaggacagcaacccaaactcctcatctacggtacatccaacctagagtctggagtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatagatcctgtggaggctgatgacactgcaacctatttctgtcagcagagttggaatgatcctccgacgttcggtggaggcaccaagctggaagtgaaa
SEQ ID N.23 - 가변 경사슬을 코딩하는 핵산
GATGTCCAGATGACCCAGTCTCCTGCTTTGGCTGTGTCTCCAGGAGAGAGGGTTTCCATCTCCTGTAGGGCCAGTGAAAGTGTCAGTACACTTATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCAACCCAAACTCCTCATCTACGGTACATCCAACCTAGAGTCTGGAGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATAGATCCTGTGGAGGCTGATGACACTGCAACCTATTTCTGTCAGCAGAGTTGGAATGATCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAATTGAAA
SEQ ID NO.24 - 가변 경사슬을 코딩하는 핵산
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAGCATTAGCACCCTGTTACACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGCACCTCCAACTTGGAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTGGAACGACCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
SEQ ID NO.25 - 가변 경사슬을 코딩하는 핵산
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAGCGTGAGCACCCTGATGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGCACCTCCAACTTGGAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTGGAACGACCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
SEQ ID NO.26 - 가변 경사슬을 코딩하는 핵산
경사슬의 가변 영역을 코딩하는 SEQ ID NO. 97-99를 갖는 상기 언급된 핵산 시퀀스가 여기 보고된다:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAGCATTAGCACCCTGTTACACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAACAGCCTAAGCTCCTGATCTATGGCACCTCCAACTTGGAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTTCTGTCAACAGAGTTGGAACGACCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
SEQ ID N.97 - 가변 경사슬을 코딩하는 핵산
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAGCGTGAGCACCCTGATGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAACAGCCTAAGCTCCTGATCTATGGCACCTCCAACTTGGAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTTCTGTCAACAGAGTTGGAACGACCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
SEQ ID N.98 - 가변 경사슬을 코딩하는 핵산
GACGTGCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAGCATTAGCACCCTGTTACACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGCACCTCCAACTTGGAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTTCTGTCAACAGAGTTGGAACGACCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
SEQ ID NO.99 - 가변 경사슬을 코딩하는 핵산
SEQ ID NOs. 18-22, 92-96에 보여진 적어도 하나의 시퀀스 및 SEQ ID NOs. 23-26, 97-99에 보여진 적어도 하나의 시퀀스는 본 발명의 범위 내이다.
SEQ ID NOs. 18-22 중 적어도 하나의 시퀀스 및 SEQ ID NOs. 23-26에 보여진 적어도 하나의 시퀀스를 포함하는 핵산 시퀀스의 조합이 특히 바람직하다. 상기 핵산 시퀸스는 하나의 분리된 핵산 분자 또는 2개 분리된 핵산 분자들의 조합 내에 존재할 수 있다.
바람직한 실시예에서 (rat 항체 BMK-3B6-E4-C3), 상기 분리된 핵산 분자는 중사슬의 가변 영역을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO 18 (SEQ ID NO 1를 갖는 아미노산 시퀀스를 암호화함)을 포함하고, 경사슬의 가변 영역을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO. 23 (SEQ ID NO 10를 갖는 아미노산 시퀀스를 암호화함)의 시퀀스를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시예에서 (키메라 항체 ch3B6), 상기 분리된 핵산 분자는 중사슬의 가변 영역을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO 19의 시퀀스 (SEQ ID NO 1를 갖는 아미노산 시퀀스를 암호화함) 및 경사슬의 가변 영역을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO. 24의 시퀀스(SEQ ID NO 11를 갖는 아미노산 시퀀스를 암호화함)를 포함한다.
핵산 시퀀스들의 조합이 특히 바람직하며, 여기서 중사슬의 가변 영역을 암호화하는 핵산 시퀀스는 SEQ ID NOs. 20-22 중 어느 하나에 보여진 시퀀스들로부터 선택되고, 항체의 경사슬을 암호화하는 핵산 시퀀스는 SEQ ID NOs. 25-26 중 어느 하나에 보여진 시퀀스들로부터 선택된다. 핵산 시퀀스는 하나의 분리된 핵산 분자 내에 또는 2개의 분리된 핵산 분자들의 조합 내에 존재할 수 있다.
바람직한 실시예에서 (인간 항체 Hu3B6a), 상기 분리된 핵산 분자는 중사슬의 가변 영역을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO 20의 시퀀스 (SEQ ID NO. 2를 갖는 아미노산 시퀀스를 암호화함) 및 경사슬의 가변 영역을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO25의 시퀀스(SEQ ID NO12를 갖는 아미노산 시퀀스를 암호화함)를 포함한다.
바람직한 실시예에서(인간 항체 Hu3B6d), 상기 분리된 핵산 분자는 중사슬의 가변 영역을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO 20의 시퀀스(SEQ ID NO2를 갖는 아미노산 시퀀스를 암호화함) 및 경사슬의 가변 영역을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO26의 시퀀스(SEQ ID NO 13을 갖는 아미노산 시퀀스를 암호화함)을 포함한다.
바람직한 실시예에서 (인간 항체 Hu3B6b), 상기 분리된 핵산 분자는 중사슬의 가변 영역을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO21의 시퀀스(SEQ ID NO.3을 갖는 아미노산 시퀀스를 암호화함) 및 경사슬의 가변 영역을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO.25의 시퀀스(SEQ ID NO. 12을 갖는 아미노산 시퀀스를 암호화함 12)을 포함한다.
바람직한 실시예에서 (인간 항체 Hu3B6e), 상기 분리된 핵산 분자는 중사슬의 가변 영역을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO 21의 시퀀스(SEQ ID NO. 3을 갖는 아미노산 시퀀스를 암호화함) 및 경사슬의 가변 영역을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO. 26의 시퀀스(SEQ ID NO. 13을 갖는 아미노산 시퀀스를 암호화함)을 포함한다.
바람직한 실시예에서(인간 항체 Hu3B6c), 상기 분리된 핵산 분자는 중사슬의 가변 영역을 암호화하는 시퀀스 SEQ ID NO. 22의 시퀀스(SEQ ID NO. 4를 갖는 아미노산 시퀀스를 암호화함) 및 경사슬의 가변 영역을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO. 25의 시퀀스(SEQ ID NO.12를 갖는 아미노산 시퀀스를 암호화함)를 포함한다.
바람직한 실시예에서(인간 항체 Hu3B6f), 상기 분리된 핵산 분자는 중사슬의 가변 영역을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO.22의 시퀀스(SEQ ID NO.4를 갖는 아미노산 시퀀스를 암호화함) 및 경사슬의 가변 영역을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO. 26의 시퀀스 (SEQ ID NO. 13를 갖는 아미노산 시퀀스를 암호화함)를 포함한다.
추가 실시예에서, 상기 분리된 핵산은 중사슬을 암호화하는 시퀀스 및 경사슬을 암호화하는 시퀀스를 포함하고, 둘 다는 가변 및 불변 영역을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 분리된 핵산은 키메라 항체의 제조를 위한 것이고 중사슬을 암호화하는 시퀀스는 SEQ ID NO. 28의 시퀀스이고, 경사슬을 암호화하는 시퀀스는 SEQ ID NO. 32의 시퀀스이며 이하에 보여진다:
ATGAATCTACTTCTGATCCTTACCTTTGTTGCGGCCGCTGTTGCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTAGTGCAGCCTGGAAGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCACTTTCAGTAATTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAAAGAAGGGTCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAATCCCAGTGGTACCAGAACTTACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCCGATTCACTCTCTCCAGAGATAGTGCAAAGAGCAGCCTATATCTGCAAATGAACAGTCTGAAGTCTGAGGACACGGCCACTTTTTACTGTGCAAGGCTTTATAACAACTACGCTTTTGATTACTGGGGCCAAGGAGTCATGGTCACTGTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO.28 - 중사슬을 코딩하는 핵산
ATGAATCTACTTCTGATCCTTACCTTTGTTGCGGCCGCTGTTGCGGATGTCCAGATGACCCAGTCTCCTGCTTTGGCTGTGTCTCCAGGAGAGAGGGTTTCCATCTCCTGTAGGGCCAGTGAAAGTGTCAGTACACTTATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCAACCCAAACTCCTCATCTACGGTACATCCAACCTAGAGTCTGGAGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATAGATCCTGTGGAGGCTGATGACACTGCAACCTATTTCTGTCAGCAGAGTTGGAATGATCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAATTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
SEQ ID NO.32 - 경사슬을 코딩하는 핵산
또 다른 실시예에서, 상기 분리된 핵산은 인간화된 항체의 제조를 위한 것이고 중사슬을 암호화하는 시퀀스는 SEQ ID NO. 29-31 의 시퀀스로부터 선택되고, 경사슬을 암호화하는 시퀀스는 SEQ ID NO. 33-34의 시퀀스로부터 선택되고, 이하 보여진다:
ATGAATCTACTTCTGATCCTTACCTTTGTTGCGGCCGCTGTTGCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID N.29 - 중사슬을 코딩하는 핵산
ATGAATCTACTTCTGATCCTTACCTTTGTTGCGGCCGCTGTTGCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID N.30 - 중사슬을 코딩하는 핵산
ATGAATCTACTTCTGATCCTTACCTTTGTTGCGGCCGCTGTTGCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAGCGCCAAGAGCTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID N.31 - 중사슬을 코딩하는 핵산
ATGAATCTACTTCTGATCCTTACCTTTGTTGCGGCCGCTGTTGCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAGCATTAGCACCCTGTTACACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGCACCTCCAACTTGGAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTGGAACGACCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
SEQ ID N.33 - 경사슬을 코딩하는 핵산
ATGAATCTACTTCTGATCCTTACCTTTGTTGCGGCCGCTGTTGCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAGCGTGAGCACCCTGATGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGCACCTCCAACTTGGAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTGGAACGACCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
SEQ ID N.34 - 경사슬을 코딩하는 핵산
바람직하게는, 상기 분리된 핵산 분자는 중사슬을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO.29의 시퀀스 및 경사슬을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO.33의 시퀀스를 포함한다.
바람직하게는, 상기 분리된 핵산 분자는 중사슬을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO.30의 시퀀스 및 경사슬을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO.33의 시퀀스를 포함한다.
바람직하게는, 상기 분리된 핵산 분자는 중사슬을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO.31의 시퀀스 및 경사슬을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO.33의 시퀀스를 포함한다.
바람직하게는, 상기 분리된 핵산 분자는 중사슬을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO.29의 시퀀스 및 경사슬을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO.34의 시퀀스를 포함한다.
바람직하게는, 상기 분리된 핵산 분자는 중사슬을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO.30의 시퀀스 및 경사슬을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO.34의 시퀀스를 포함한다.
바람직하게는, 상기 분리된 핵산 분자는 중사슬을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO.31의 시퀀스 및 경사슬을 암호화하는 시퀀스로서 SEQ ID NO.34의 시퀀스를 포함한다.
용어 "엄격한 조건하에서 혼성화"는 2개 핵산 단편이 상술한 것처럼(예를 들어: Sambrook et al., "Expression of cloned Genes in E. coli" in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA.)에 설명된 것처럼 표준화된 혼성화 조건하에서 서로 혼성화하는 것을 의미한다. 그러한 조건들은, 예를 들어 약 45℃에서 6.0 x SSC (Saline Sodium Citrate)에서 혼성화하고, 이어서 50℃에서 2.0 x SSC, 바람직하게는 65℃에서 2.0 x SSC 또는 50℃에서 0.2 x SSC, 바람직하게는 65℃에서 0.2 x SSC으로 세척하는 것이다. 엄격한 조건하에서 혼성화의 추가 예는 0.5M NaHPO4, 7% 소듐 도데실 설페이트(SDS), 1 mM EDTA를 65℃에서 필터 결합된 DNA로 혼성화하고, 68℃에서 0.1xSSC/0.1%SDS에서 세척하는 것이다(Ausubel FM et al. eds., 2003, Current Protocol in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., 및 John Wiley & sons, Inc., New York, at p. 2.20.3).
상기 개시된 임의 시퀀스와 적어도 80% 아이덴티티를 갖는 뉴클레오티드 시퀸스는 여전히 본 발명의 범위 내이며, 이는 코드된 항체가 이들의 결합 특이성을 유지한다는 것을 전제로 한다.
특히, 시퀀스 SEQ ID NO: 18-22와 적어도 80% 아이덴티티를 갖는 가변 중사슬을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스 및 SEQ ID NO: 23-26과 적어도 80% 아이덴티티를 갖는 가변 경사슬을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스는 여전히 본 발명의 범이 내이다. 적어도 80% 아이덴티티는 80 및 100% 사이, 바람직하게는 90, 95, 또는 99%의 뉴클레오티드 아이덴티티 퍼센트를 의미한다.
본 발명의 핵산 분자는 추가적으로 복제(replication) 기원 및/또는 선택 마커 유전자를 포함할 수 있는 벡터에 위치될 수 있다. 벡터의 예는, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 파아지, 바이러스 등이다. 그러므로, 본 발명의 추가 실시예는 여기 개시된 핵산 시퀀스를 포함하는 벡터이다. 바람직하게는 상기 벡터는 발현 벡터이다.
상기 벡터는 예를 들어, 파아지, 플라스미드, 바이러스 또는레트로 바이러스 벡터일 수 있다.
레트로 바이러스 벡터는 복제가능 또는 복제결핍일 수 있다. 후자의 경우, 바이러스 번식이 일반적으로 상보적(complementing) 숙주/세포에서만 일어날 것이다.
본 발명의 핵산 분자는 숙주 내에서 전파를 위하여 선택가능한 마커를 포함하는 벡터에 연결될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 침전물, 예를 들어 침전물, 예를 들어 칼슘 포스페이트 침전물 또는 루비듐 클로라이드 침전물 또는 전하된 지질과의 복합체, 또는 탄소-기반 클러스터, 예를 들어 플러렌(fullerene) 내로 도입된다. 벡터가 바이러스라면, 이것은 숙주 세포에 적용하기 전에 적당한 포장 세포주를 사용하여 인비트로 포장될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 벡터는 발현 벡터이며, 여기서 상기 핵산 분자는 하나 이상의 대조군 시퀀스에 작동가능하게 연결되어, 원핵 및/또는 진핵 숙주 세포 내에서 전사 및 선택적으로 발현할 수 있게 한다. 상기 핵산 분자의 발현은 핵산 분자의 전사, 바람직하게는 번역가능한 mRNA 내로 전사를 포함한다. 진핵 세포, 바람직하게는 포유류 세포에서 발현을 확보하는 조절 원소(Regulatory element)는 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 이들은 통상 전사의 개시를 확보하는 조절 시퀀스 및 선택적으로 전사의 종결 및 전사의 안정화를 확보하는 폴리-A를 포함한다. 추가적인 조절 원소는 전사 인핸서뿐만 아니라 번역 인핸서를 포함할 수 있다. 원핵 숙주 세포에서 발현을 허락하는 가능한 조절 원소는, 예를 들어 E. Coli 내 lac, trp 또는 tac 프로모터를 포함하며, 진핵 숙주 세포 내 발현을 허락하는 조절 원소의 예는 이스트 내의 AOXI 또는 GAL-1 프로모터 또는 포유류 및 다른 동물 세포 내 CMV(Cytomegalovirus)-, SV40 (Simian Virus 40)-, RSV-프로모터 (Rous saroma virus), CMV-인핸서, SV40-인핸서 또는 글로빈 인트론(globin intron)이다. 전사 개시를 담당하는 원소들 이외에, 그러한 조절 원소들은 또한 전사 종결 신호, 예를 들어 폴리뉴클레오티드의 하류, SV40-폴리-A 사이트 또는the tk-폴리-A 사이트를 포함할 수 있다. 이러한 맥락에서, 적당한 발현 벡터는 당해 기술 분야에서 알려져 있으며, 예를 들어 Okayama-Berg cDNA 발현 벡터 pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAI , pcDNA3 또는pSPORTI (Thermo Fisher Scientific)이다. 바람직하게는, 상기 벡터는, 발현 벡터 및/또는 유전자 전달 또는 표적 벡터이다. 바이러스로부터 유래된 발현 벡터, 예를 들어 레트로바이러스, 백시나 바이러스(vaccina virus), 아데노- 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 또는소유듀종 바이러스는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 표적화된 세포 집단으로 송달하는데 사용될 수 있다. 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 방법은 재조합 바이러스 벡터를 구성하는데 사용될 수 있다; 다음 참조: 예를 들어 the techniques described in Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001, 3<rd>edition), N. Y. 및 Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates 및 Wiley Interscience, N. Y. (1994). 대안적으로, 본 발명의 핵산 분자는 표적 세포로 송달을 위하여 리포솜 내로 재구성될 수 있다. 게다가 본 발명은 상술된 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주를 말한다. 핵산 분자 또는 벡터는 당해 기술 분야에서 알려진 임의 방법에 따라 변형, 감염 또는 형질도입에 의해 숙주 내로 도입될 수 있다.
상기 숙주는 원핵 또는 진핵 세포 또는 비인간 형질전환 동물일 수 있다. 숙주 내에 존재하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 숙주의 게놈 내로 통합되거나 또는 염색체 외적으로 유지될 수 있다. 이와 관련해서, 본 발명의 핵산 분자는 상동 재조합을 통해 "유전자 표적화" 및/또는 "유전자 교체"를 위해, 돌연변이 유전자 부활을 위해 또는 돌연변이 유전자를 제조하기 위해 사용될 수 있다; 다음 참조 예를 들어 Mouellic, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990), 4712-4716; Joyner, 유전자 표적화, A Practical Approach, Oxford University Press.
상기 숙주는 임의의 원핵 또는 진핵 세포, 예를 들어 세균, 곤충, 균류, 식물, 동물, 포유류 또는 바람직하게는 인간 세포일 수 있다. 바람직한 균류 세포는 예를 들어 사카로미세스 속의 것들(genus Saccharomyces), 특히 S. Cerevisiae 종의 것들이다. 용어 "원핵"은 본 발명의 변이체 폴리펩타이드의 발현을 위하여 폴리뉴클레오티드로 변형 또는 감염될 수 있는 모든 세균을 포함하는 것을 의미한다. 원핵 숙주는 그람 음성뿐만 아니라 그람 양성 세균, 예를 들어 E. coli, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens 및 Bacillus subtilis을 포함할 수 있다. 본 발명의 변이체 폴리펩타이드의 돌연변이 형태를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 당해 기술 분야의 통상의 기술자들에게 보통알려진 임의 기술을 사용하여 숙주를 변형시키거나 감염시키는 데 사용될 수 있다. 세균 또는 동물 세포 내에서 융합되고 작동가능하게 연결된 유전자를 제조하고 이들을 발현시키는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다(Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001, 3<rd>edition). 여기 설명된 유전적 구성 및 방법은 예를 들어 원핵 숙주 내에서 본 발명의 변이체 항체, 이들의 항체 단편 또는 유도체의 발현을 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 프로모터 시퀀스를 포함하는 발현 벡터는 삽입된 핵산 분자의 효율적인 전사를 용이하게 하며 숙주와 관련하여 사용된다. 발현 벡터는 전형적으로 복제, 프로모터 및 종결뿐만 아니라 변형된 세포의 표현형 선택을 제공할 수 있는 특이적 유전자를 포함한다. 변형된 원핵 숙주는 당해 기술 분야에 알려진 기술에 따라 배양기에서 성장되고 배양되어 최적 세포 성장을 얻을 수 있다. 본 발명의 항체, 이들의 항체 단편 또는 유도체는 성장 배지, 세포 용해물 또는 세포 막 분획물로부터 분리될 수 있다. 미생물적으로 또는 그외 발현된 본 발명의 항체, 이들의 항체 단편 또는 유도체의 분리 및 정제는 임의의 종래 수단들, 예를 들어 조제용 크로마토그래피 분리(조제용 크로마토그래피 separation) 및 면역학적 분리, 예를 들어 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 사용과 관련된 것들에 의할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 숙주는 인간, 세균, 동물, 균류, 양서류 또는 식물 세포이다. 바람직한 동물 세포는, 이에 한정되지는 않지만, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 몽키 신장 세포(COS), 마우스 배아 섬유아세포 세포(NIH-3T3) 및 수 많은 인간 세포를 포함하는 다른 세포주을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 동물 세포는 곤충 세포이다. 바람직한 곤충 세포은, SF9 세포주의 세포를 포함한다.
바람직하게는, 세포는 포유류 세포, e.g. a 햄스터, 토끼 또는 인간 세포이다. 가장 바람직하게는, 상기 세포는 인간 세포이다. 상기 인간 세포는, 이에 한정되지 않지만, 인간 배아 신장 세포 (HEK293, 293T, 293 freestyle)를 포함한다. 게다가, 상기 인간 세포주는, 이에 한정되지 않지만, HeLa 세포, 인간 간세포암종 세포(e.g. HEPG2, Huh-7), A549 세포를 포함한다. 또 다른 실시예에 따라, 본 발명의 숙주는 비인간 형질전환 동물이다. 본 발명은 본 발명의 항체를 제조하기 위하여 사용될 수 있는 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 형질전환 비인간 동물을 제공한다. 항체는 염소, 소, 말, 돼지, 랫트, 마우스, 토끼, 햄스터 또는 포유류의 조직 또는 체액, 예를 들어 젖, 혈액 또는 소변으로부터 제조될 수 있고 이로부터 회수될 수 있다; 다음을 참조: US 특허 no. 5,827,690; 5,756,687; 5,750,172; 및 5,741,957. 상술한 것처럼, 인간 면역글로불린 위치를 포함하는 비인간 형질전환 동물은 FGFR4 또는 이들의 일부로 면역력을 갖게 하여 제조될 수 있다. 본 발명의 항체는 하나의 방법으로 제조될 수 있으며, 여기서 상기 항체는 상술한 숙주로부터 얻어진다. 그러므로, 본 발명의 추가 실시예는 상기 항체의 합성을 가능하게 하는 조건하에서 본 발명의 숙주를 배양하고 상기 배양액으로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항체의 제조방법이다.
변형된 숙주는 당해 기술 분야에 알려진 기술에 따라 배양기 내에서 성장되고 배양되어 최적 세포 성장을 얻을 수 있다. 일단 발현되면, 전체 항체, 이들의 다이머, 개별 경사슬 및 중사슬 또는 본 발명의 다른 면역글로불린 형태는, 암모늄 설페이트 침전물, 친화도 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 이와 유사한 것을 포함하는 당해 기술 분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다; 다음 참조: Scopes, "단백질 Purification", Springer-Verlag, N. Y. (1982). 본 발명의 항체 또는 이의 대응하는 면역글로불린 사슬은 성장 배지, 세포 용해물 또는 세포 막 분획물로부터 분리될 수 있다. 본 발명의 예를 들어 미생물적으로 발현된 항체 또는 면역글로불린 사슬의 분리 및 정제는 임의 종래 수단, 예를 들어 조제용 크로마토그래피 분리 및 면역학적 분리, 예를 들어 본 발명의 항체의 불변 영역에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 사용과 관련된 것들에 의해서이다. 본 발명의 항체가, e.g. 약물 표적화 및 이미징 분야에서 다른 모이어티들에게 더 결합될 수 있다는 것은 당해 기술 분야의 통상의 기술자들에게 명백할 것이다. 그러한 결합은 부착의 측면에 항체 또는 항원의 발현 후에 화학적으로 수행되거나 또는 결합 생성물은 DNA 준위로 본 발명의 항체 또는 항원 내로 가공될 수 있다. 상기 DNA는 적당한 숙주 시스템 내에서 이후 발현되고, 상기 발현된 단백질은 수집되고 필요에 따라 재생된다.
일 실시예에 따라, 상술된 재조합 세포는 핵산 분자를 암화화하는 항체의 발현이 가능하게 하는 조건하에서 배양된다. 상기 항체는 배양된 세포 또는 배양 상청액으로부터 수집될 수 있다. 바람직하게는 상기 항체는 포유류, 특히 인간 세포로부터 제조된다.
약제학적 조성물 및 의학적 치료
본 발명의 추가 양상은 상술한 항체, 콘쥬게이트, 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터 또는 숙주, 선택적으로는 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
용어 "담체"는 약제, e.g. 희석제, 안정화제, 아주반트 또는 사용된 복용량 및 농도에서 이에 노출되는 세포 또는 포유류에 비독성인 다른 타입의 부형제를 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 담체의 예는, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있고, 인산염완충식염수 용액, 물, 에멀젼 예를 들어 오일/물 에멀젼, 다양한 타입의 습윤제, 멸균 용액 등을 포함한다. 때때로, 약제학적으로 허용가능한 담체는 약물 송달, 특히 항체 분자의 송달에 유용한 수성 pH-완충 용액이다. 약제학적 조성물은 잘 알려진 종래 방법, 즉 활성제를 담체 및 선택적으로 제형 내로 통상 통합되는 다른 약제와 함께 혼합하는 방법으로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 동결건조된 제형, 수용액, 분산액 또는 고체 제제의 형태로 제형화될 수 있다. 적당한 조성물의 투여는 다른 방법들, 예를 들어 정맥으로, 복강내로, 피하로, 근육내로, 국부로, 피내로, 비강내로 또는 기관지내로 투여에 의해 영향받을 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 표적 사이트에 직접적으로, 예를 들어 뇌와 같은 외부 또는 내부 표적 사이트로 생물학적 송달(biolistic delivery)에 의해 직접적으로 송달될 수 있다. 복용량 요법은 참석 의사 및 임상적 인자들에 의해 결정될 것이다.
본 발명은 또한 약제학적 조성물을 이것이 필요한 대상, 특히 FGFR4 발현, 과발현 및/또는 과잉행동과 관련된 질환으로 고통받는 인간 환자에 투여하는 단계를 포함한다.
의학적 분야에 잘 잘려진 것으로서, 임의 환자의 복용량은 환자의 몸체, 체표면 및 면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강 및 동시 투여되는 다른 약물을 포함하는 많은 인자들에 따라 달라진다. 치료할 상태의 타입 및 심각도에 따라 활성 성분의 약 1 pg/kg 내지 15 mg/kg가 이의 치료가 필요한 환자에게, 예를 들어 한번 이상의 분리된 투여, 또는 연속적으로 주입되어 투여될 수 있다. 전형적으로 매일 복용량은 상기 언급된 인자들에 따라서 약 1 pg/kg 내지 약 100 mg/kg의 범위일 것이다. 치료할 상태에 따라서, 몇 일 또는 그 이상의 기간 동안 반복적 투여를 하여, 질병 또는 증세의 원하는 정도의 억제가 일어날 때까지 치료가 유지된다. 조성물은 임의 적당한 경로, 예를 들어 비경구, 피하로, 비강내로, 혈관내로, 정맥으로, 동맥내로 또는 척추강내로 주사 또는 주입으로 투여될 수 있다. 진행은 주기적인 평가로 모니터링될 수 있다.
본 발명의 조성물은 국소적으로 또는 전신으로 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균 수용액 또는 비수용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비수용성 용매의 예는 프로필렌, 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예를 들어 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸-올리에이트이다. 수성 담체는 염류 및 완충 배지를 포함하는 물, 알코올성/수용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구성 비이클은 소듐 클로라이드 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 소듐 클로라이드, 락테이트 링거 또는 고정유를 포함한다. 정맥 비이클은 유체 및 영양소 첨가액, 전해액 첨가액(예를 들어 링거 덱스트로스를 기반한 것들) 및 이와 유사한 것을 포함한다. 방부제 및 다른 첨가제, 예를 들어 항균제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 기체 등이 또한 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 활성 약제는 다른 활성 약제와 함께 투여될 수 있다. 추가적인 활성 약제는 본 발명의 약제학적 조성물과 별도로 또는 일부로서 투여될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따라, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적 조성물의 의도한 용도에 따라 추가 약제를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 활성 약제, 예를 들어 추가적인 항신생물제(antineoplastic agent), 소분자 억제제, 항-종양제 또는 화학요법 약제를 더 포함한다는 것이 특히 바람직하다. 본 발명은 또한 적어도 하나의 추가 항신생물제와 조합하여 본 발명의 항체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 그러한 조합은 예를 들어 비정상 세포 성장을 억제하는 데 있어 효과적이다.
많은 항신생물제는 당해 기술 분야에 현재 알려져 있다. 일 실시예에서, 상기 항신생물제는 이에 한정되지는 않지만, 항체 또는 면역조절(immunomodulatory) 단백질을 포함하는 치료적 단백질의 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시예에서, 상기 항신생물제는 소분자 억제제, 또는 유사분열 억제제, 키나아제 억제제, 알킬화제, 대사길항제, 삽입성 항체, 성장 인자 억제제, 세포 사이클 억제제, 효소, 토포아이소머라제 억제제, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 항-생존제, 생체반응조절제(biological response modifier), 항-호르몬, e.g. 항-안드로겐 및 항혈관신생제(antiangiogenesis agent)로 이루어진 화학 요법제의 군으로부터 선택된다.
물론 상기 언급된 추가 활성약제는 공동 약제학적 조성물 내에서 본 발명의 항체와 함께 투여될뿐만 아니라 이들은 또한 별도로 투여될 수 있다.
일단 제형화되면, 본 발명의 조성물은 대상에 직접적으로 투여될 수 있다. 치료할 대상은 동물일 수 있으며; 특히 인간 대상이 치료될 수 있다.
본 발명의 약제는 이에 한정되지는 않지만, 경구, 정맥으로, 근육내로, 동맥 내, 척수 내, 척추강내로, 심실 내(intraventricular)로, 경피(transdermal)로 또는경피성(transcutaneous) 분야로, 피하로, 복강내로, 비강내로, 장관, 국부로, 혀 밑으로, 질내로 또는 직장 수단을 포함하는 임의 수의 경로에 의해 투여될 수 있다.
모든 이들 방법 및 제형은 종래 당해 기술 분야에서 종래 및 잘 알려져 있으므로 더 이상 설명할 필요가 없다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 환자 조직 또는 환자 샘플에서 FGFR4의 함량 및/또는 현지화(localization)를 결정하는 단계를 포함하는 진단방법에 관한 것이다. 본 실시예에서, 상술한 바와 같이 표지기(labeling group)를 수송하는 항체를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 참조 데이터에 대비하여 환자 조직 또는 환자 샘플에 대해 얻어진 결과를 비교하여, FGFR4 발현, 과발현 및/또는 과잉 행동과 관련된 질병의 진단이 가능하게 한다. 본 발명의 진단 방법은 다른 세포, 조직 또는 다른 적당한 샘플에서 인간 FGFR4의 원하지 않는 발현, 과발현 또는 과잉행동을 검출하는데 유용하다. 따라서, FGFR4 발현과 관련된 질병의 시작 또는 질병 상태가 평가될 수 있다. 본 발명의 진단 방법은 또한 얻어진 결과들을 기초로 환자에 대한 치료 요법을 성립하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 FGFR4 발현 세포의 존재를 평가하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 항체를 이들의 표면에서 FGFR4를 수송하는 것으로 의심된 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계를 포함한다. 샘플 내에서 FGFR4 발현을 검출하는 적당한 방법은, 효소-결합된 면역흡착제 분석법(ELISA) 또는 면역조직화학 (IHC)일 수 있다. ELISA 분석법은 마이크로티터(microtiter) 플레이트 포맷으로 수행될 수 있으며, 여기서 예를 들어 마이크로티터 플레이트의 웰은 항-FGFR4 항체와 함께 흡수된다. 상기 웰은 세정되고 블록킹제, 예를들어 우유 단백질 또는 알부민으로 처리하여 피분석물(analyte)의 비특이적 흡수를 방지한다. 연속해서, 웰은 시험 샘플로 처리한다. 시험 샘플 또는 표준을 세정하여 제거한 후, 웰을, 예를 들어 비오틴과 콘쥬게이션하여 표지된 제2 항-FGFR4 항체로 처리한다. 과량의 제2 항체를 세척해서 제거한 후, 상기 표지를, 예를 들어 아비딘-콘쥬게이트된 홍당무 과산화효소(HRP) 및 적당한 색소생산성 기질로 검촐된다. 시험 샘플에서 FGFR 항원의 농도는, 표준 샘플로부터 개발된 표준 곡선과 비교하여 결정된다. IHC에 대해, 파라핀-내장된 조직이 사용될 수 있으며, 여기서 상기 조직은 자일렌 내에서 예를 들어 1차적으로 탈파라핀화되고, 이후 예를 들어 에탄올로 탈수되고 증류수로 세정된다. 포말린 고착(formalin fixation) 및 파라핀 고정으로 마스크된 항원성 에피토프는 에피토프 마스크 제거, 효소 소화 또는 사포닌에 의해 노출될 수 있다. 에피토프 마스크 제거를 위하여, 파라핀 섹션을 스팀기, 물 욕조 또는 마이크로웨이브 오븐에서, 에피토프-회수 용액, 예를 들어 2 N HCL 용액 (pH 1.0) 내에서 20~40분 동안 가열될 수 있다. 효소 소화의 경우에, 조직 섹션은 다른 효소 용액, 예를 들어 프로테아제 K, 트립신, 프로나아제, 펩신 등에서 1030 분 동안 37℃에서 배양될 수 있다. 에피토프-회수 용액 또는 과량의 효소를 세정하여 제거한 후, 조직 섹션을 블록킹 완충액으로 처리하여 비특이적 상호작용을 방지한다. 일차적 항-FGFR4 항체는 적당한 농도로 첨가된다. 과량의 1차 항체는 세정하여 제거하고 섹션들을 실온에서 10분 동안 퍼옥시다아제 블록킹 용액 내에서 배양시킨다. 또 다른 세척 단계 후, 조직 섹션을 제2 표지된 항체, 예를 들어 효소에 대한 앵커로서 작용할 수 있는 기로 표지된 항체와 함께 배양된다. 그러므로 예로는 스트렙트아비딘(streptavidin)-결합된 홍당무 과산화효소에 의해 인식된 비오틴-표지된 2차 항체가 있다. 항체/효소 복합체의 검출은 적당한 색소생산성 기질과 함께 배양하는 것으로 얻어진다.
추가적인 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 표면에 FGFR4를 수송하는 것으로 의심된 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계를 포함하는 FGFR4 기능 차단 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 항체는 FGFR4 기능을 차단할 수 있다. 접촉 단계는 인비트로 또는 인비보일 수 있다.
게다가, 본 발명은 FGFR4 발현, 과발현 및/또는 과잉행동과 관련된 질병의 진단 또는 치료에 대한 키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트는 상술된 적어도 하나의 항체, 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함한다. 게다가, 상기 키트는 적어도 하나의 다른 활성 약제 또는 추가 성분을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 암 병행 요법에 유용한 하나 이상의 치료제, 예를 들어 항신생물제, 소분자 억제제, 항-종양제 또는 화학요법제를 더 포함하는 것이 바람직하다. 많은 항신생물제는 당해 기술 분야에서 현재 알려져 있다. 일 실시예에서, 항신생물제는 이에 한정되지는 않지만 항체 또는 면역조절 단백질을 포함하는 치료적 단백질의 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서, 상기 항신생물제는 소분자 억제제 또는 유사분열 억제제, 키나아제 억제제, 예를 들어 티로신-키나아제 억제제, 알킬화제, 대사길항제, 삽입성 항체, 성장 인자 억제제, 세포 사이클 억제제, 효소, 토포아이소머라제 억제제, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 항-생존제, 생체반응조절제, 항-호르몬, e.g. 항-안드로겐 및 항혈관신생제로 이루어진 화학요법제의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 진단 키트는 바람직하게는 상술된 바와 같이 표지된 항체를 포함한다. 게다가, 상기 진단 키트는 동일한 타입의 조직 또는 샘플 내에서 FGFR4의 함량 및/또는 현지화에 관한 참고 데이터를 포함할 수 있다. 상기 참고 데이터는 하나 이상의 건강한 대상 및/또는 기존 질병 상태를 갖는 하나 이상의 대상으로부터 얻어질 수 있다. 상기 참조 데이터에 비교하여 FGFR4 발현, 과발현 및/또는 과잉행동과 관련된 질병의 진단이 가능하다. 얻어진 결과를 기초로, 환자의 치료 요법이 성립될 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 FGFR4 발현, 과발현 및/또는 과잉행동과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료에 사용되는 본 발명의 항체이다.
본 발명에 따라, FGFR4 발현, 과발현 및/또는 과잉행동과 관련된 질병들은 예를 들어 과증식성 질병, 예를 들어 암이다. 본 발명에 따라 진단, 예방 및/또는 치료될 수 있는 암은 간세포암종, 유방 암, 위 암, 대장암, 횡문근육종, 결장직장암, 전립선 암, 유방 암, 뇌하수체 암, 난소 암, 부드러운 조직 육종, 흑색종양, 두부(head) 및 목(neck) 편평상피 암종 및 폐 아데노암종 및 다른 FGFR4-발현 또는-과발현 암 및 종양 전이의 형성으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
통상의 기술자는 만약 질병이 FGFR4 발현, 과발현 또는 과잉행동과 관련이 있다면 당해 기술 분야에서 일반적인 지식에 따라 용이하게 확인할 수 있다.
예를 들어 소개부에서 언급된 참조 문헌들이 참조될 수 있다 (예를 들어, Lin & Desnoyers, 2012; Wu & Li, 2012; Katoh & Nakagama, 2014; Crose et al., 2012; Li et al. 2014; Sahadevan et al., 2007; Andre & Cortes, 2015; Abbass et al., 1997; Huang et al., 2015; Chen H et al., 2015; Zaid et al., 2013).
본 발명의 특정 실시예에 따라, 여기 개시된 항체는 대장암, 특히 대장암 줄기 세포를 죽이거나 이의 성장 및/또는 분화에 실질적으로 영향을 미치는 대장암 치료에 사용되는 것이다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에 따라, 여기 개시된 항체는 간 암의 치료에 사용된다.
특정 실시예에서, 본 발명의 항체는 대장암, 특히 특이적으료 대장암 줄기 세포를 표적화하기 위하여 사용된다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 항체는 대장암 줄기 세포의 검출 및/또는 죽이거나 이들의 발달 및/또는 분화에 영향을 미치거나 및/또는 억제하기 위한 것이다.
또 다른 실시예에 따라, FGFR4 발현, 과발현 및/또는 과잉행동과 관련된 질병은 대사성 질환, 특히 대사증후군 또는 비만이다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따라, FGFR4 발현, 과발현 및/또는 과잉행동과 관련된 질병은 좌심실 비대증(ventricular hypertrophy), 심장 비대증 또는만성 신장 질환이다.
만성신장 질환(CKD)은 요절(premature death)의 위험이 있고, 심혈관계 질환은 CKD의 모든 단계에서 선두 원인이다(Go et al. N. Engl. J. Med., 351(13):1296-1305, 2004). 좌심실 비대증(LVH)은 심장확장성 기능장애, 울혈성심부전(congestive heart failure), 부정맥, 및 급사(sudden death)의 원인인 CKD에서 심혈관계 질환의 중요 메카니즘이다. LVH에서 이들의 역할로 인하여, FGFR4의 억제는 심혈관계 질환을 예방하는데 유리하다는 것이 알려져 있다(참조: 예를 들어 US20160039936 및 여기서 인용된 참조 문헌들).
그러므로, 본 발명의 항체를 사용하여 FGFR4, 특히 심장병 세포(e.g., 근세포, 섬유아세포, 내피 세포, 민무늬근 세포)에서 FGFR4의 활성화를 억제하는 것을 포함하는, 대상에서 심혈관계 질환 (e.g., 일차 심장병, 2차 심장병, 심비대증(cardiac hypertrophy), 심부전, 좌심실 비대증), CKD, 당뇨병, 비만의 치료 또는 예방 또한 본 발명의 범위 내이다. 특이적 실시예에서, 심혈관계 질환은 고혈압, 울혈성심부전, 좌심실 비대증, 요독성 심장근육병증, 당뇨성 심장근육병증, 또는 일차 심장근육병증이다.
다음 예들은 본 발명을 더 설명한다.
실시예
실시예 1
대장암 줄기 세포에서 선택적으로 발현된 막 단백질을 암호화하는유전자의 비오틴 포맷 확인
새로운 대장암 줄기 세포(CSC)를 확인하기 위하여, 등록 상표 CSC-특이적 Affymetrix 마이크로어레이 및 cross-querying 이용가능한 공공 발현 데이터베이스를 채굴하여 컴퓨터 분석을 수행하였다.
이 분석은 게놈-와이드 유전자 발현 데이터 뱅크(Affymetrix microarray, Human Gene 1.0 ST platform)를 이용하였고, 이는 EGF 및 bFGF로 상보된 규정된 무혈청 배지 내에서 스페로이드(spheroid)로서 전파되거나, 또는 10% 혈청(Ricci-Vitiani et al., 2007)의 존재 하에서 인비트로로 분화되는 일차 종양 샘플 및 전이로부터 분리된 8개의 대장 CSC 세포주들로부터 얻어진 데이터를 포함한다. 상기 데이터세트는 26917 다른 인간 유전자에 대하여 별개의 프로브세트들을 포함한다.
잠재적 표적 유전자 리스트를 규정하기 위하여, 다음 전체 워크플로우를 채택하였다. 참조 대장 CSC 데이터세트를 사용하여, 이들의 인비트로 분화된 카운터파트에 대하여 미분화된 대장 CSC에서 다르게 상향 조절된 유전자(1325)의 첫번째 리스트는 Bioconductor RankProd algorithm (Hong et al., 2006 & 2008)을 사용하여 제조되었고; 통계적으로 차등적 발현을 갖는 유전자만(p-value ≤ 0.1)만이 포함되었다. 표적 유전자 리스트는 이후 2개의 다른 자료(http://www.uniprot.org/ 및 Sallman Almen et al., 2009)에 따라, 잠재적 트랜스-막 단백질 또는 글리코실포스파티딜리노시톨(GPI)-앵커된 단백질을 암호화하는 유전자로서 주석이 달린 250 엔트리로 줄였다. 이 유전자 리스트 내에, 미분화된 세포 샘플 내에서 상향 조절은 일반적으로 낮고 때때로 <2이며, 이 값은 생물학적 콘테스트에서 유전자가 상향-조절된 것으로 여겨지는 최소값으로 간주된 값이다. 그러므로, 추가적 우선순위를 매기는 전략으로서, 미분화된 대장 CSC 샘플을, CSC 특이성에 대한 추가 선택 기준으로서 대장 정상 조직 샘플, 대장 종양 조직 샘플 및 상업적 종양 세포주 샘플에 비교하였다.
공공 유전자 발현 데이터 저장소(NCBI GEO 및 EBI ArrayExpress)를 검색하여 인간 대장 조직 샘플(정상 또는 종양)을 포함하는 데이터세트 또는 상업적으로 이용가능한 대장암 세포주의 데이터를 찾았다. 발견된 데이터세트의 초기 조사는 이들 중 매우 일부만 동일한 마이크로어레이 플랫폼(인간 유전자 ST 1.0)을 기초로 하거나 또는 매우 밀접하게 관련된 플랫 폼 인간 Exon ST 1.0을 기초로 하였다는 것을 밝혔다. 특히 정상 또는 종양 대장 샘플을 포함하는 다수의 데이터세트는 Affymetrix platform U133 plus 2.0를 기초로 하였다. 그러므로, 대장 CSC와 비교를 위한 기초로서, U133 더하기 2.0 플랫폼 데이터를 포함할 필요가 있다. 이용가능한 데이터를 제조하기 위하여 사용된 종양 샘플(이용가능한 곳)의 정확한 해부학적 현지화(localization)에 관하여 어떠한 하부-선택도 하지 않았다. 종양 카테고리에 대하여, 단지 암종 샘플만이 받아들여지고, 모든 확인가능한 선종 샘플 또는 다른 명확하게 분리된 샘플, 예를 들어 염증성 창자 질환환자로부터의 샘플은 배제하였다(표 4).
본 분석에서 포함된 공공 NCBI GEO 데이터베이스 내 데이터세트
총 200개의 정상 샘플[이들 중 20개는 레이저포착현미해부(LCM)으로 얻어짐], 16개 다른 데이터세트로부터 1100 종양 샘플(이들 중 87은 LCM에 의해 얻어짐) 및 8개 다른 데이터세트로부터 145 대장 종양 세포주 샘플(74개 독특한 세포주)로 구성된 전체 글로벌 데이터세트를 만들었다. 게다가, 인간 정상 및 종양 줄기 세포 샘플을 포함하는 6개 추가 데이터세트가 또한 포함되었다. 단지 2개 데이터세트만이 참조 대장 CSC 데이터세트와 동일한 마이크로어레이 아키텍처(Microarray architecture) (HuGene ST 1.0)를 갖고, 모든 다른 데이터세트는 Affymetrix U133 plus 2.0 platform을 기초로 하였다. 모든 다른 데이터세트에 대한 원료 발현 데이터(raw expression data) 파일은 NCBI website "Gene Expression Omnibus" (GEO) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)로부터 다운로드하고, R Bioconductor program suite(Gentleman et al., 2004; http://www.bioconductor.org/; http://www.r-project.org/) 내에서 이용가능한 방법을 사용하여 표준 "Robust Multi-array Average" (RMA)으로 가공하였다.
2개의 다른 마이크로어레이 플랫폼을 사용하여 나타나는 기술적 효과들을 정정하기 위하여, 다음 전략들이 적용되었다. 정상 및 종양 대장 데이터세트에서 데이터들을 분명한 배치 효과(batch effect)를 정정하는 ComBat algorithm (Johnson & Rabinovic, 2007)으로 초기에 사전 가공되었다. 동일한 절차를 대장 종양 세포주 데이터세트에도 적용하였다. 이후 전체 조합된 데이터세트에 적용된 2차 ComBat 정정으로 2개의 다른 마이크로어레이 아키텍처로 인한 바이어스를 제거하였다.
정상 및 종양 대장 데이터세트에 존재하는 다수의 샘플로 인하여, 총 데이터 수를 줄이고 정상 및 종양 대장 샘플의 수를 대략 동등하게 만드는 사전 가공 동안 선택 절차를 적용하였다. 샘플들 사이에 평균 중앙 거리를 기초로, 상기 선택 절차는 남은 샘플이 원하는 수에 도달할 때까지 샘플 클러스터(정상 또는 종양)의 중심으로부터 가장 먼 샘플을 순차적으로 제거하였다. 이 절차를 적용하여 105 정상 및 176 종양 샘플을 하부로 선택하였다. 등가화 절차는 77 내지 19의 데이터세트 GSE18105 내에서 LCM 샘플의 수를 줄였다. 대신에 데이터세트 GSE20916의 LCM샘플에 대한 선택은 없었다.
ComBat 알고리즘을 대장 종양 세포주에 적용하여 배치 효과를 제거하였다(미도시).
이들 배치-정정된 하부-데이터세트는, 이후 추가적 6개 줄기-세포 관련 데이터세트를 추가하는 참조 대장 CSC 데이터세트(단지 미분화된 샘플)과 조합되었다. 특히 데이터세트 GSE33112(대장 CSC 배양 샘플)을 추가하는 것은 Affymetrix U133 plus 2.0 platform으로 측정되고 참조 CSC 샘플과 밀접하게 관련된 샘플이 제공되므로 필연적이다. 이것으로 2개 Affymetrix platforms (HuGene ST 1.0 및 U133 plus 2.0) 사이의 아키텍처-특이적 차이점을 정정하는 최종 글로벌 스케일 단계로서 ComBat를 적용할 수 있게 되었다. ComBat 정정을 하기 전에, 글로벌 데이터세트는 분명한 패턴의 마이크로어레이 플랫폼-특이적 샘플 클러스터링을 나타냈다. ComBat 정정 이후에, 이 효과는 GSE33112의 등가 샘플과 밀접하게 클러스터링하는 대장 CSC 샘플과 함께 크게 감소하였다.
글로벌 데이터세트 내에서 미분화된 CSC 샘플을 이후 다음의 다른 서브세트에 대한 알고리즘 RankProd를 사용하여 비교하였다: 마이크로-해부된 대장 정상 및 종양 데이터세트, 마이크로-해부된 대장 정상 및 종양 데이터세트, 및 대장 종양 세포주 데이터세트. 대장 CSC 샘플 및 각 데이터세트 사이에서 평균 배수-변화(FC)는 0.05의 p-값 컷오프에서 RankProd로 계산되었다. 이 p-값 컷오프 이상으로 프로브세트/유전자에 할당된 FC 값은 없었다.
잠재적 표적 유전자의 수는, 이후 양성 FC 차이가 정상 대장 데이터세트로 관찰되는 유전자들만을 받아들여 더 감소되었다. 얻은 리스트의 104 유전자는 이후 보다 상세하게(막 현지화 예상 및 문헌 데이터) 조사되어 전위-막(trans-membrane) 또는 GPI-앵커된 플라즈마 막 단백질로서 이들의 상태를 확인하거나 거절하여, 57 유전자로 선택을 제한하였다. 이후 이들 잠재적 표적은 개별적으로 분석되고 다음 기준에 따라 등급화되었다: (i) 대장 종양 조직 및 세포주(p ≤0.05)에 대한 FC 차이 ≥2 ; (ii) NCBI GEO repository (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc =GSE14938) 내에서, "BioGPS" (http://biogps.org/) 및 "Body Atlas" 데이터세트 GSE14938로부터 추출된 데이터와 비교하여, 대응하는 항체의 잠재적 독성을 예상하는 것과 관련된, 필수 기관으로부터 유래된 정상 조직 내에서 무발현/낮은 발현; (iii) 대안적으로 슬라이싱하거나 또는 쉐딩하여 제조된 용해성 단백질 변이체 및 짧은 외세포(extracellular) 도메인의 각 유전제 생성물에 대한, 무발현; (iv) 2개 온라인 리소스(http://www.uniprot.org/, http://www.genecards.org/, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) 및 과학 공개문헌을 기초로 다른 종양 타입의 각 유전자 생성물에서, 신호전달 경로와 관련되고, 단백질 상호작용 네트워크와 관련된 생물학적 기능 및 역할. 수많은 추가적 면역학적 기준으로, 이소성(ectopic)의 낮은 발현을 갖거나 좋지 못한 면역원성 단백질에 유사하거나, 또는 인간 파라로그(paralog) 및 쥐과 오솔로그(ortholog)와 매우 유사한 단백질을 암호화하는 카운터 스크린 유전자를 유도하여, 제한된 리스트이 21 후보 유전자들을 제조하였다.
실시예 2
대장 CSC에서 선택된 유전자 발현의 특이성 확인
21개 선택된 유전자들의 차등 발현을 qRT-PCR로 확인하고 정량하였다. 마이크로어레이 데이터 생성을 위해 사용된 8개 다른 대장 CSC 세포주는 EGF 및 bFGF로 상보된 규정된 무혈청 배지 내에서 스페로이드로서 전파되었다. 비교를 위하여, 11개 다른 상업적 대장 종양 세포주(ATCC)는 비오틴 포맷 분석에서 사용된 데이터세트에 포함된 것들 중에서 선택된 것으로, ATCC 권고에 따라 배양되었다(표 5)
표 5. qRT-PCR 으로 분석된 대장 종양 세포주.
총 RNA는 제조자의 권고에 따라서 RNAeasy mini kit (Qiagen)을 사용하여 제조되었다. RNA 샘플을 RNase-없는 물 내에서 수집하고, Eppendorf BioPhotometer을 사용하여 260nm에서 흡광도를 측정하여 정량하고 Agilent 2100 bioanalyzer를 사용하여 정성적으로 조절하였다. 각 선택된 유전자의 Mrna 준위를 정량적 역전사-PCR (qRT-PCR)를 사용하여 미분화된 CSC 및 대장 종양 세포주 내에서 비교하였다. 게다가, 대장 CSC내 21개 선택된 유전자의 발현을 인간 정상 대장 조직의 RNA 샘플 내에서 qRT-PCR으로 측정된 것과 비교하였다(FirstChoice Human Colon Total RNA, Life Technologies).
2개 대장 CSC-특이적 마커, OLFM-4 및 Lgr5 (van der Flier et al., 2009; Barker et al. 2007)는 또한 양성 대조군으로 포함되었다. 분석된 세포주(Affymetrix dataset) 내에서 발현이 크게 변화하지 않는 2개 유전자로서 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나아제 (GAPDH) 및 이종 핵 리보뉴클레오 단백질 K (HNRNPK) 각각을 암호화하는 2개 유전자는, 정규화군(normalizer)으로서 포함되었다. 유전자-특이적 프로브 및 프라이머(TaqMan® Expression Assay, Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific)를 사용하는 MicroAmp 96-웰 플레이트에서 분석을 3번 하였다: 40㎕의 반응 혼합물을 25 Ul의 2X Master Mix/ 0.5 uL의 100X RT (Qiagen), 2.5 uL의 각 TaqMan 분석법 및 12 uL 의 H2O 을 포함하는 각 웰에 나누어 넣었다. 5 ng/uL의 농도로 10㎕의 총 RNA를 이후 최종 반응 부피 50㎕로 첨가하고, Perkin Elmer ABI 7900 HT 실시간 열 사이클러 (50°C 30min, 95°C 10min, 40 사이클: 95°C 15sec, 60°C 1min)을 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다. 2^(-ΔΔc-t) 방법을 사용하여 정량적 계산을 하였다.
상부-8개 qRT-PCR 검증된 유전자(정상 대장 및 적어도 3개의 독립된 CSC세포주에서 적어도 4개 다른 종양 세포주 및 정상 대장비 비해 ≥3-배수 CSC 선택성)은 이들의 예상된 면역원성을 기초로 5개까지 축소되었다(표 6).
표 6. 유전자적 면역화를 위해 선택된 대장암 줄기 세포 후보자 항원들
완전한 선택 공정은 도 1에 요약되어 있다.
단백질 준위로, 5개의 선택된 유전자의 대장 CSC에서 우선적 발현을 확인하기 위하여 추가 실험을 수행하였다.
총 단백질 추출물은 각 유전자의 높은 mRNA 준위를 발현하는 대장 CSC세포주 및 동일한 유전자의 낮은 mRNA 준위를 발현하는 ATCC 대장 종양 세포주로부터 제조되었다. 게다가 단백질 추출물은 인간 정상 대장 점막으로부터 제조되었다. 이후 샘플을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯(도 2)으로 분석하였다. 이 분석법은 또한 단백질 준위로 이들의 차등적 mRNA 발현 준위를 기초로 선택된 5개 유전자의 CSC내에서 우선적 발현을 확인하였다.
실시예 3
대장 CSC 막 항원에 대한 모노클로날 항체의 생성
5개 선택된 항원에 대한 모노클로날 항체 (mAbs)는, 대응하는 DNA 코팅-시퀀스를 사용하여 직접적으로 단백질 표적에 대한 항체를 개발할 수 있게 하는 Aldevron/GENOVAC 코어 기술 플랫폼을 사용하여 랫트의 유전적 면역법으로 제조되었다(http://www.aldevron.com/services/antibody-development/genetic-immunization, 다음 참조: 예를 들어 Bioprocessing - Genetic Immunization for Antibody Production. Tutorial: Genovac's Technological Shortcut From Gene to Antibody. By John Thompson, Ph.D., and Stefan Lang, Ph.D., published in Genetic Engineering News, Vol. 22, No. 17, October 1, 2002; Custom-made antibodies produced by genetic immunisation: Applications in drug development, therapy and diagnosis. By Stefan Lang and John Thompson, published in Global Outsourcing Review, Vol. 5, No. 1, Spring 2003; A shortcut from geninucs to drug development. By Jens Lohrmann, Stefan Lang and John Thompson, published in Current Drug Discovery, October 2003). 유전적 면역법은, 종래 면역법 기술에 비하여 몇 가지 장점이 있으며, 이는 특히 적절하게 접혀지고 글리코실화된 항원의 발현 또는 특이적 항원 도메인의 발현이, 높은 친화도 천연 에피토프와, 보다 높은 기능적 활성 성향으로 인식하는 mAbS를 제조할 개연성을 증가시키기 때문이다.
표적 cDNA 시퀸스는 가공된 Aldevron (Freiburg, Germany) 소유의 면역법 벡터(pB8-HA) 및 검출 벡터(pB1-myc) 내로 클론되어, hemagglutinin (HA) tag 및 myc tag를 각각 갖는 프레임 내 세포 표면에서 대응하는 단백질의 이소성 발현을 확보하였다. FGFR4, IL17RB 및 RGMB에 대하여, 상기 구성은 완전한 길이의 시퀀스를 포함하는 반면에, EDAR 및 OR51E1에 대해서는 분명한 외세포 도메인이 삽입되었다.
HEK293-유도체 BOSC23 세포는 선택된 항원 발현 벡터(pB8-HA 또는 pB1-myc 유도체) 및 내부 음성 대조군으로서 상호간 빈 벡터로 일시적으로 공동형질주입(cotransfect)되었다. 항-HA 및 항-myc 항체 둘 다를 사용하는 FACS 분석법으로 모든 5개 항원에 대하여 중요하고 특이적인 플라즈마 막 발현을 확인하였다.
랫트는 금 입자들에 흡수되고 살아있는 동물 세포 내로 직접적으로 피내 투입된 대응하는 DNA를 4-6 유전적으로 적용하여, 면역화 벡터 pB8-FGFR4, pB8-IL17RB, pB8-RGMB, pB8-EDAR-h-ecd pB8-EDAR-h-ecd+TM, 또는pB8-OR51E1-h-syn로 면역화되었다. 이 절차가 면역 반응을 끌어내는지 여부를 제어하기 위하여, 랫트 혈청을 면역화 이후 24-60일 동안 수집하고, PBS/ 1% BSA 중에서 1:1000으로 희석하고, pB1-myc 검출 벡터 내에서 클론된 대응하는 항원 cDNA로 일시적으로 감염된 BOSC23 세포를 사용하는 FACS에 의해 시험되었다. 염소 항-랫트 IgG R-피코에리트린 콘쥬게이트(Southern Biotech)을 2차 항체로서 10 μg/mL로 사용하였다. 음성 대조군으로, 동일한 발현 벡터 내에서 클론된 무관한 cDNA로 감염된, BOSC23 세포는 각 동물의 면역 혈청으로 배양되고 FACS 분석에 제출되었다. 게다가, 검출 벡터 pB1-FGFR4, pB1-IL17RB, pB1-RGMB, pB1-EDAR-h-ecd pB1-EDAR-h-ecd+TM 또는pB1-OR51E1-h-syn의 세포 표면 발현은 항-myc 1차 항체 및 2차 항체로서 10 μg/mL의 염소 항-마우스 IgG R-피코에리트린 콘쥬게이트(Southern Biotech)을 사용하는 FACS로 제어되었다.
다른 항원으로 면역화된 랫트의 모든 집단의 면역 혈청의 특이적 반응성은, 무관한 cDNA로 감염시킨 세포에 비교할 때, 이들 표면에서 대응하는 항원을 발현하는 세포에 대하여 검출될 수 있었다. 다른 항원의 프라즈마 막 발현은 평행 실험으로 확인되었다(미도시).
다음 단계는 각 항원에 면역반응적인 랫트의 비장(splenic) B 세포의 분리 및 적당한 골수종 세포와 함께 이들을 주입하여 혼성세포를 생성하는 단계로 이루어진다. 혼성 세포의 선택 및 클로날 팽창 후, 적당한 특이성을 갖는 항체를 제조하는 이들 혼성 세포들은, pB1-항원-암호화하는 구성으로 일시적으로 감염된 리포터 세포주 BOSC 23의 표면에 이소성으로 발현된 이들의 항원에 대한 대응하는 상청액 면역반응성을 혈구 흐름 평가(flow cytometric evation)하여 확인되었다(표 7).
표 7. 다른 항원을 발현하는 pB8-면역법 벡터로 면역화된 랫트로부터 취해진 림프구를 주입한 수율
분리된 혼성 세포 안정한 부모 클론으로부터, 상청액을 얻었고(14-24/표적, 표 7의 마지막 컬럼), 이는 FACS 분석에 따라 양성 및 항원-특이적인 항체를 포함하였다.
실시예 4
대장 CSC 내생 항원을 향한 대응하는 상청액 면역반응성의 혈구 흐름 평가로 혼성세포 부모 클론의 선택
5개 다른 세포주에서 FACS에 의해 이들의 면역반응성을 평가하는 것으로, 대장 CSC 표면에 결합하는 5개 항원에 대한 양성 상청액의 능력에 대하여 분석하였다. 대응하는 전사를 위하여 낮은 발현의 상업적 대장 종양 세포주가 각 항원에 대해 음성 대조군으로 포함되었다. 상기 분석법은 100㎕의 시험된 상청액을 첨가한 96 웰-마이크로플레이트(3X104 cell/50 ㎕의 세포 배지 중 웰) 내에서 수행되었다. 혼성세포(DMEM/10% FBS)에서 사용된 쥐과 골수종 세포의 조건화된 배지를 음성 대조군으로 포함하였다. 4℃에서 1시간 후, 항-랫트 형광성 2차 항체(Alexa FluorR 647 염소 항-Rat IgG[H+L], Thermo Fisher Scientific)를 첨가하고, 세포들을 5 ug/mL으로 7-아미노액티노미신(aminoactinomicin) D(7-AAD)으로 처리하여 세포 생존력을 제어하였다. 2차 항체로만 배양된 샘플을 또한 추가적인 음성 대조군으로 포함하였다. 세포형광기(cytofluorimeter) FACS LSR II (Becton Dickinson)를 사용하여 혈구 흐름 평가를 수행하였다.
대부분의 경우에, 대장 CSC 및 상업적 대장 종양 세포주 사이에서 선택된 항원 mRNA 발현의 차이는 단백질 준위로 확인되었다.
FACS에 의해 분석된 5개 대장 CSC 세포주 각각에 대하여(Signore et al., 2016), 생존가능한 세포의 평균 형광 강도(MFI)는 평가 파라미터로서 사용되었다. 각 상청액에 대하여, 이 값은 음성 대조군의 MFI에 의해 나누어져서 대조군에 대한 배수 변화(FC) 값을 얻었다. 각 CSC 세포주에 대하여, 상청액은 이들의 FC 값에 따라 랭크되었고, 가장 높은 반응성을 갖는 상청액에 가장 높은 점수를 부여하였다. 각 CSC 세포주에서 각 상청액에 할당된 개별 순위를 더하여, 최종 순위를 얻었다(도 3).
이를 기초로 최고 수행 상청액을 등급화(5-12/항원, 도 3)하고, 단백질 G-Sepharose 상에서 친화도가 정제되고, 5개 대장 CSC 세포주 상에서 세포 생존율 분석법으로 분석되었다.
친화도 정제를 위해, 각 5mL의 상청액을 0.1M 소듐 포스페이트 pH 7.0, 1.5M NaCl, 0.1M EDTA (1X BB) 중 0.5 mL의 단백질 G-Sepharose resin (GammaBind Plus Protein G Sepharose, GE)과 함께 실온에서 2h 동안 배양하였다. 결합 단계 후, 샘플을 빈 크로마토그래피 컬럼(Poly-Prep® columns, Bio-Rad) 내로 이송하고, 수지를 중력에 의해 안정화하게 두고 20부피의 1xBB로 세척하였다. 결합된 항체를 pH 중성화를 위하여 100 uL의 1M Tris pH 9를 포함하는 튜브 내에서 수집된, 1 mL/각 0.1 M Glycine-HCl, pH 2.3으로 2 단계로 용리하였다. 정제된 mAbs를 이후 SDS-PAGE로 정량화하고 제어하였다.
정제된 mAbS를 각 항체에 대하여 2 내지 4 대장 CSC로 수행한 세포 생존률 분석법으로 평가하였다. 간단히, 세포 스페로이드의 효소적 분리 후, 4000 생존가능한 단일 세포가 100㎕의 배양 배지에서 96-웰 마이크로플레이트의 각 웰 내에서 3번 플레이트되었다. 37℃, 5% CO2에서 24시간 배양 후, 10㎕의 각 항체 용액, 또는 Tris-Glycine pH 7 중 1:5-1:10 희석액을 첨가하였다. Tris-Glycine pH 7 중 30 ug/mL으로 랫트 IgG 용액 10㎕을 음성 대조군으로 포함하였다. 37°C, 5% CO2에서 항체로 96 시간 배양한 후, 제조업자의 권고에 따라 세포 생존율은 화학발광성 숙Titer-GloTM(Promega) 시약을 사용하여 측정되었다. 세포 ATP 함량 및 이로 인하여 세포 생존율에 비례하는 발광 강도는 마이크로플레이트 리더(reader) Beckman Coulter DTX 880 Multidetector 을 사용하여 측정되었다.
2 내지 8 개 항체/항원은 항-증식성/세포독성 활성을 나타내며, 가장 효과적인 것은 대응하는 혼성 세포의 하부클로닝을 위해 선택되었다(4 아클론/항원 이하).
실시예 5
선택된 혼성세포 아클론으로부터 얻어진 상청액으로부터 정제된 항체의 캐릭터리제이션
각 항원에 대한 가장 특이적 항체를 제조하는, 4개 부모 혼성세포는 세포주의 안정성 및 모노클로날 특성을 유지하도록 아클론(subclone)되었다.
안정한 아클론 배양조직에 의해 제조된 항체의 양성의 평가는, 실시예 3에서 설명된 것처럼, BOSC 23 리포터 세포주의 표면 상에 이소성적으로 발현된 항원에 대하여 이들의 면역반응성을 FACS 분석으로 수행하였다.
이를 기초로, 3-4 아클론을 각 항원 FGFR4, IL17RB, RGMB 및 EDAR 에 대하여 선택하면서, 5번째 항원 OR51E1에 대해 아클론 상청액은 외세포 도메인(면역화을 위해 사용됨)에 대해서만 반응성을 나타내고 완전한 길이의 단백질에 대해서는 나타내지 않으므로, 따로 두었다(표 8).
표 8. 양성 아클론
대응하는 모노클로날 항체는 단백질 G-Sepharose Fast Flow 친화도 컬럼 (HiTrapTM 단백질 G HP, GE Healthcare) 및 빠른 단백질 액체 크로마토그래피 AKTA 시스템(GE Healthcare)을 사용하는 13개 양성 상청액(무혈청 배지 내) 각 200mL로부터 정제되었다. 0.1 M 글리신-HCl pH 2.5으로 용리되고 100 uL의 1 M Tris pH 9으로 중성화된 1mL-피크 분획물을 풀로 만들고 정제된 IgG를 SDS-PAGE으로 정량화하고 제어하였다.
이들 특이적 표면 항원에 대해 정제된 항체의 결합은 복용량-반응 분석법으로 5개 대장 CSC 세포주 상에서 FACS로 분석하였다. 해리 상수 및 최대 결합 값은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 FACS 분석으로부터 추론되었다. 이들 값들은 mAb 농도의 함수로서, 실시예 4에 정의된 실험 FC 값들을 “1 사이트 결합(hyperbole)”공식에 대입하여 얻었다: Y=Bmax*X/(Kd+X), 여기서 Bmax는 최대 결합 값이고, Kd (해리 상수)는 최대 결합의 반에 도달하는데 필요한 항체 농도이다. 항-FGFR4 및 항-EDAR mAbs는 sub/low 나노 몰 범위(0.2-1.3 nM)의 Kd 값을 갖는, 적어도 2개의 세포주에 대하여 중요한, 복용량-종속 반응성을 나타내면서, 항-IL17RB mAbs는 덜 반응적인 결과(Kd 값은 40 및 125 nM의 사이)를 얻었고, 단지 하나의 항-RGMB mAb만이 양성이었다(표 9).
표 9. 대장 CSC 상의 항-FGF4, 항-EDAR, 항-IL17RB 및 항-RGMB mAbs의 해리 상수 및 최대 결합 값
일부 선택된 항체의 항원 결합 특이성은 항원 발현을 침묵하게 하는 짧은 헤어핀 RNAs (shRNA)을 암호화하는 적당한 렌티바이러스 벡터(GIPZ 렌티바이러스 shRNA, Thermo Fisher Scientific)로 형질 도입된 상업적 대장 종양 세포주로 확인하였다. 상대적으로 높은 발현 준위의 FGFR4, IL17RB 및 RGMB 을 각각 나타내는 3개 세포주, HCT116, SW48 및 SW480가, 대응하는 적당한 전사체의 렌티바이러스 기반 넉다운을 위해 사용되었다. qRT-PCR으로 제어된, FGFR4- IL17RB- 및 RGMB-침묵 세포의 FACS 분석은 대응하는 항원에 대에 대한 항체에 특이성을 나타내었다.
실시예 6
FGFR4가 풍부하고 결손된 대장 CSCs의 증식성 잠재적, 세포 운동성 및 종양유전자의 평가
대장 CSC 세포주 CTSC85에 대해 시험할 때, 다른 표적들에 대해 선택된 항체는 FACS에 의해 바이모달 분포 반응성을 나타내는 것이 관찰되었다(Signore et al., 2016).
대장 CSC에 대한 잠재적 치료 표적으로서 FGFR4를 실험적으로 입증하기 위하여, CSC 세포주 CTSC85를 유세포분석기 세포 분류하여, FGFR4High 및 FGFR4Low 로 각각 2개의 하부집단으로 분리하였고, 이는 항-FGFR4 항체 BFG-5F7-D5을 가지고 한 바이모달 결합 프로파일을 기초로 한다(도 4).
분리 후 직접적으로, 2개 세포 집단을 수 많은 인비트로 분석법으로 평가하여 가능한 기능적 차이들을 강조하였다. 이들 분석법은 2개 분리된 하부 집단에 대한 참조로서 사용된, 부모 이종 세포 집단(모의-분류된 세포)과 함께 병행 수행되었다.
세포 증식을 측정하기 위하여, 2000 세포를 100㎕의 배양 배지 내에서 96웰-마이크로플레이트의 각 웰에 파종하고 3번 복제로 8개의 실험 포인트를 설정하였다. 세포 증식율은, 14일 동안 모니터링하고, 2일마다 생존 세포의 수를 측정하고, 제조자의 프로토콜을 따라 세포 생존력 형광 분석법 CellTiter-BlueTM(Promega)을 사용하였다. 세포 생존력에 비례하는 형광 강도를 마이크로플레이트 리더 Victor 2TM(Wallac, Perkin Elmer)으로 측정하였다. 다른 시간-포인트에 대응하는 3개 형광 강도 값의 평균을 세포 플레이팅 날짜(0일)에 측정한 평균 값으로 정규화하였다(도 5).
게다가, CTSC85 세포의 대조군 집단(모의-분류된) 및 2개 FGFR4High 및 FGFR4Low 하부 집단 둘 다를 제한된 희석액 실험 및 부드러운 한천 내에서 이들의 콜로니 형성 효율에 대해 분석하였다.
액체 배양액에서 클론원성 분석을 위하여, 1, 5, 또는 25 단일 세포를 100㎕의 성장 배지 내 96 웰-마이크로플레이트의 각 웰 내에 파종하였다. 14일 후, 웰 총 수에 대한 콜로니를 포함하는 웰의 수를 각 세포 희석 조건에 대해 계산하여, 콜로니-형성 빈도를 얻었다.
부드러운 한천에서 콜로니 형성 분석을 위하여, 24 웰-플레이트를 사용하였다. 간단하게, 성장 배지에 500㎕의 0.9% 낮은-용융 아가로오스(낮은 용융점, Sea Plaque Agarose, Cambrex BioScience) 용액을 각 웰 내로 나누어 넣고 적어도 1h 동안 4℃에서 고체화시킨다(바닥층). 상부층에 대해서는 동등한 부피의 성장 배지 중 1% 낮은 용융점 아가로즈 용액 및 세포 현탁액 5.2 x 104 세포/mL을 혼합시키고, 500㎕의 혼합물을 각 웰(1.3 x 104 세포/웰)에 이송하고 실온에서 고체화한다. 이후, 10㎕의 배양 배지를 각 웰에 첨가하였다. 각 세포 하부집단 3개 복제품을 플레이팅하고, 37°C, 5% CO2에서 배양하고, 상기 배양액에 신선한 배지를 2일마다 첨가하였다. 세포 콜로니 형성은 도립 광현미경(inverted light microscope) 하에서 모니터링하고 12일 후 배양 콜로니를 계수하였다. 콜로니를 30 이상을 포함하는 것으로 점수가 매겨졌다(도 6).
전체 FGFR4High CTSC85 세포 하부집단은 FGFR4Low 세포 하부집단에 비하여 보다 높은 증식율 및 클론원성 효율을 나타냈다.
3개 CTSC85 세포 집단의 이동 효율 또한 평가되었다. 트랜스웰 이동 분석법은 Corning® FluoroBlock 96 웰-마이크로플레이트를 사용하고, 각 4개의 웰의 상부 챔버(인서트)에 3000 세포를 파종하고, 하부 챔버에 완전히 성장한 배지 200㎕를 첨가하여 수행되었다. 37°C, 5% CO2에서 48h간 배양하고, RT에서 30min 동안 하부 챔버에 첨가된 4 μM Calcein AM 형광성 염료(Thermo Fisher Scientific)로 세포를 염색하였다. 막을 통해 이동한 살아있는 세포와 관련된 형광은 485/535 nm (Ex/Em)에서 하부 마이크로플레이트 리더 Multimode Detector DTX 880 (Beckman Coulter)에서 측정되었다. 디지털 마이크로스코프 카메라(Nikon)가 있는 형광 도립 현미경을 사용하여 상들을 포착하고 염색된 세포들을 Image Jsoftware을 사용하여 계수하였다.
도 7에서, 3개 독립 실험들의 대표적인 결과들이 보여지며, 이는 FGFR4High CTSC85 세포가 FGFR4Low 세포에 비하여 보다 높은 이동 경향성을 갖는다.
인비트로 분석법에서 얻어진 실험 증거를 기초로, 2개 FGFR4 High 및 FGFR4 Low CTSC85 세포 하부집단을 면역결핍성 마우스 내로 주입하여 인비보에서 이들의 종양형성 잠재력을 평가하였다.
실험은 6마리 NOD/SCID 마우스(Charles River)에서 수행하였고, 2개 세포 하부 집단과 동일한 수로 우측 및 좌측 옆구리 피하로 접종하였다. 종양 성장은 종양의 첫번째 출현 후 3 주 동안 1주일에 2번 종양 크기(주축 및 종축)을 버니어 캘리퍼스(vernier caliper)로 측정하여 평가하였다. 종양 부피를 다음 식을 사용하여 계산하였다: TV (mm3) = d2xD/2 여기서 d 및 D는 각각 가장 짧은 직경 및 가장 긴 직경이다.
인비보 실험(도 8)의 결과는 인비트로 데이터에서 함수와 일치하게 FGFR4 발현이 많은 CSC 세포 하부집단이 FGFR4-결손 세포 하부집단에 비하여 종양형성 잠재력이 증가하는 것으로 나타난다는 것을 보였다.
실시예 7
항-FGFR4 모노클로날 항체의 캐릭터리제이션
우리는 종양 표적으로서 FGFR4를 우선적으로 처리하고 이 항원에 대하여 생성된 새로운 모노클로날 항체 유전자를 캐릭터리제이션하였다.
3개의 항-FGFR4 정제된 항체 BFG-2F7-B9, BFG-5E5-B5 및 BFG-5F7-D5의 시토플루오리메트릭 분석(cytofluorimetric analysis)은, 모든 5개 대장 CSC세포주(1.1, 1.2, 18, 85, CRO1) 및 한 패널의 대장(HCT116, SW48, SW620, HT29, DLD1) 및 간(Huh7, HepG2) ATCC 종양세포주에까지 연장되었다. 각 항체는 농도를 증가시키면서 내생 표면 수용체(endogenous surface receptor)에 대한 이들 결합의 복용량-종속성을 평가하였다. 이 분석법은 200㎕의 세포 배지 내에서 105 세포/웰로 96 웰-마이크로플레이트 내에서 수행었으며, 여기서 시험된 항체는 연속적으로 희석되었다. 4℃에서 1h 동안 배양한 후, 항-랫트 형광성 이차 항체(염소, 항-랫트 IgG R-피코에리트린[R-PE] 콘쥬게이트, Southern Biotech)를 첨가하고, 세포를 1 ug/mL의 DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐린돌, 디히드로클로라이드)으로 처리하여 세포 생존력을 제어하였다. 이차 항체로만 배양된 샘플은 음성 대조군으로서 포함되었다. 혈구 흐름 평가는 유세포분석 MACSQuant® VYB (Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행하였다.
얻어진 실험 데이터를 기초로, 각 항체의 결합 친화도는 대조군 샘플의 것(배수 변화, FC)에 대한 각 실험 포인트의 평균 형광 강도의 비를 파라미터로 사용하여 결정되었다. FC 값은 mAb 농도의 함수로서, ug/mL으로 표현되고, 및 Bmax 및 Kd 상수는 실시예 5에 설명된 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 계산되었다.
표 10에 요약된 것처럼, 항-FGFR4 항체는 높은 FGFR4 발현 준위를 갖는 CSC 및 종양 세포주, 특히 2개의 간세포암종 (HCC) 세포주 HepG2 및 Huh7에서 높은, 복용량-종속 반응성을 나타내었으며, Kd 값은 하부/낮은 나노몰 농도 범위(0.4-12 nM)이다. 대조적으로, CTSC18 및 DLD1 세포주는 이들의 FGFR4 낮은 발현 준위와 일치하는 매우 덜 반응적인 결과를 나타냈다.
표 10. 대장 CSC 및 대장(CRC) 및 간(HCC) ATCC 종양세포주에 대한 항-FGFR4 mAbs의 해리 상수 및 최대 결합 값. Kd 값은 Bmax > 2인 곡선으로부터 보간(interpolate)할 때만 신뢰성있다고 생각된다.
항-FGFR4 항체의 결합 친화도 및 특이성은 인간 IgG Fc (고체 상 수용체 결합 분석법)에 융합된 재조합 인간 FGFR4 외세포 도메인에서 인비트로 결합 분석법으로 시험하였다. 간단하게, 96 웰-마이크로플레이트(Nunc MaxiSorp® ELISA 플레이트)를 2 ug/mL로 PBS pH7에서 희석된 50㎕의 항-인간 IgG Fc(Bethyl Laboratories)으로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 비특이적 결합 사이트는 1h 동안 200 uL의 PBS/3% BSA로 포화시키고, 이어서 PBS로 5번 세척했다. 다음에 인간 키메라 수용체 FGFR4-Fc (R&D 시스템)을 1h 동안 1 ug/mL의 PBS/0.3% BSA에 첨가하였다. 마이크로플레이트를 PBS로 5번 세척하고 1h동안 50㎕의 PBS/0.3% BSA 중에서 1:3 연속희석한 항-FGFR4 항체 또는 아이소타입 대조군(Rat IgG2ak, Southern Biotech)으로 배양되었다. 3개 복제품의 각 실험 포인트가 포함되었다. PBS로 5번 세척한 후, 결합된 항체를 HRP-콘쥬게이트된 항-rat IgG 이차 항체 (Southern Biotech) 1:4000로 희석된 것을 사용하여 검출하였고, 1h 동안 배양하고, 이어서 3-10min 동안 색소생산성 기질 TMB (Thermo Fisher Scientific)을 첨가하였다. 반응은 100 ㎕의 2M 황산을 첨가하여 종결하고 450nm에서의 흡광도는 마이크로플레이트 reader Multimode Detector DTX 880 (Beckman Coulter)를 사용하여 측정하였다.
이 분석법에서, 항-FGFR4 항체 BFG-2F7-B9 및 BFG-5F7-D5 둘 다 키메라 수용체(5 ng/mL, 0.03 nM)에 대하여 높고 동일한 결합 친화도를 나타내는 반면, 시험된 최대 농도까지 대조군 면역글로불린으로 어떠한 결합도 검출되지 않았다.
항체 BFG-2F7-B9의 잠재적 치료적 항종양 효과는 인비보 모델에서 2개의 다른 대장암으로 평가되었고, ATCC 세포주 HCT116, 또는CSC 세포주 CTSC85으로 이식된 면역결핍성 마우스를 사용하였다.
제1 이종이식 모델에 대하여, 50% Matrigel (Corning) 중 1.8x106 HCT116 세포의 현탁액은 20마리의 5주된 CD-1 누드 마우스 (Charles River) 각각의 옆구리 피하로 접종되었다. 이식 9일 후, 측정가능한 종양을 나타낸 마우스는 무작위적으로 2개의 집단(n=7)으로 배정되고, 즉 항체 및 대조군 집단으로 배정되고, 두 집단에 평균 종양 부피는 110mm3이다. 마우스는 3 주 동안 일주일에 1번 투여된 PBS 중 50 mg/Kg의 BFG-2F7-B9 항체를 복강내로(IP) 주사로 처리하였다. 대조군 집단은 대응하는 부피로 블랭크 주사(PBS)를 받았다. 마우스 체중은 일주일에 2번 제어하고 종양 크기(주축 및 종축)는 일주일에 2번 버니어 캘리퍼스로 측정되었다. 종양 부피는 다음 식을 사용하여 계산하였다: TV (mm3) = d2xD/2, 여기서 d 및 D는 각각 가장 짧은 직경 및 가장 긴 직경이다.
종양 부피의 감소는 대조군 집단에 대하여 항체로 처리한 마우스에서 료 14일로부터 통계적으로 중요한 차이점이 관찰되었다. 대조적으로 체중감소 또는 임상적 부작용은 관찰되지 않았다(미도시).
제2 이종이식 모델에 대해, 1x106 CTSC85 세포의 현탁액은 22 마리 NOD/SCID 마우스 (Charles River) 각각의 옆구리로 피하로 접종되었다. 이식 약 3주 후, 측정가능한 종양을 나타낸 마우스는 무작위적으로 3개 집단(n=7)으로 배정되었고, 즉 항-FGFR4 항체 BFG-2F7-B9, 무관련 항체 1H4 (아이소타입 대조군) 및 비이클 대조군 집단으로 배정되고, 각 집단의 평균 종양 부피는 70 mm3이다. 마우스는 PBS 중 50 mg/Kg의 BFG-2F7-B9 또는1H4 항체로 IP 주사를 통해 처리되고, 5주 동안 1주일에 한번 투여되었다. 대조군은 대응하는 부피의 블랭크 주사(PBS)를 받았다. 마우스 체중은 1주일에 2번 조절되고, 종양 크기(주축 및 종축)은 일주일에 2번 버니어 캘리퍼스로 측정되었다. 종양 부피는 다음 식을 사용하여 계산되었다: TV (mm3) = d2xD/2, 여기서 d 및 D는 각각 가장 짧은 직경 및 가장 긴 직경이다.
도 10에 보여진 것처럼, 이 실험 결과로 인비트로 및 이비보 모델에서 다르게 관찰된 대장암 세포의 성장을 억제하는 항-FGFR4 항체 BFG-2F7-B9의 능력을 확인하였다. 대조군 집단에 대한 BFG-2F7-B9-처리 집단의 종양 성장율을 비교하면, 차이점은 통계적으로 큰 결과로 나타났다. 체중 손실 또는 임상적 부작용은 치료 동안 관찰되지 않았다(미도시).
실시예 8
쥐과 FGFR4 수용체와 교차 반응하고 리간드-수용체 상호작용을 억제하는 추가적인 항-FGFR4 모노클로날 항체의 선택 및 캐릭터리제이션.
수용체에 대한 FGF의 결합을 억제할 수 있는 새로운 항-FGFR4 항체를 확인할 목적으로, 이에 따라서 이전에 설명된 것들보다 상호작용 리간드-수용체를 차단하는데 더 나은 생물학적 효과를 갖기 위하여 2개의 다른 전략이 행해졌다.
제1 전략:
제1 전략은 수용체의 외세포 영역 상의 항체 결합 도메인을 확인하고 쥐과 수용체 상의 이들의 교차-반응성을 시험하는 것으로 제1 스크리닝에서 양성을 나타낸 원래의 14개 부모 혼성세포 상청액을 재조사하는 것으로 이루어진다. 사실상, 리간드 및 헤파란 설페이트(Goetz & Mohammadi, 2013)와 상호작용에 필요하고 충분한 FGFR4 Ig II 및 Ig III 도메인은 가장 보존적인 교차 다른 종들이다. 게다가, Ig II 및 III에서 인간 수용체 및 쥐과 수용체 사이에서 다른 아미노산 잔기는 FGF 결합 포켓에 반대 표면에 위치된다. 결과적으로, 쥐과 수용체와 교차 반응성 및 도메인 Ig II 및 III에 대한 결합은 리간드-수용체 상호작용과 관련할 수 있는 항체의 분명한 특징들일 수 있다.
인간 FGFR4 수용체의 세포외 영역의 3개 결실 돌연변이(d1, d2, d3)가 생성되었다. d1에서, Ig I 도메인에 대응하는 아미노산 1-118을 포함하는 영역이 결손되었다; d2에서 Ig I 및 산박스에 대응하는 아미노산 1-151을 포함하는 영역이 결손되었다; d3에서, Ig I, 산박스 및 Ig II에 대응하는 아미노산을 포함하는 영역이 결손되었다(아미노산 번호매김은, 신호 펩타이드를 포함하여 완전한 길이(FL) 수용체를 참조한다). FGFR4 FL 및 깍은 형태(truncated form)를 암호화하는 cDNA를 pB1-myc 발현 벡터(실시예 3에 설명됨)에서 myc-tag를 갖는 프레임에서 클론되었다. pB1-FGFR4 FL, d1, d2 및 d3으로 일시적으로 감염되고 14개 부모 혼성세포 상청액으로 실험된 리포터 세포 BOSC23의 FACS 분석으로 완전한-길이 수용체로 향하는 이들의 반응성을 확인하였다. 이들 중 10개는 d1 돌연변이에 완전한 반응성을 유지하고, 이들 중 BFG-5A5 및 BFG 7H9는 d2 돌연변이에서 양성을 완전히 잃었다. 마지막으로, 모든 8개 남아있는 상청액은 이전에 설명한 BFG-2F7, BFG-5E5 및 BFG-5F7을 포함하여 d3 돌연변이에서 음성 결과를 얻었으므로, 도메인 Ig II에 대해 결합 특이성을 나타낸다.
동일한 상청액은 대응하는 pB1-myc 구성으로 감염시 인간, 원숭이, 또는 쥐과 FL FGFR4을 이소성으로 발현하는 일시적으로-감염된 BOSC23 세포에서 FACS로 분석되었다. 13개 상청액은 원숭이 수용체로 향하는 교차-반응성을 나타내면서, 이들 중 단지 3개만 쥐과 수용체에서 또한 양성 결과를 나타낸다. 흥미롭게도, 상청액으로부터 이전에 설명된 항체 BFG-2F7-B9, BFG-5E5-B5 및 BFG-5F7-D5가 분리되었고 대신에 인간 FGFR4에 대해 특이적인 결과를 나타냈다.
Ig II 도메인애 앙성이고 쥐과 수용체에 가장 가교-반응적인 것들 중 하나인 BFG-5B5 상청액은, 대응하는 혼성세포의 서브클로닝을 위해 선택되어, 항체 BFG-5B5-G7을 제조하는 세포 서브클론을 얻었고, 이는 실시예 5에 설명된 것처럼 단백질 G-Sepharose 친화도 크로마토그래피로 정제되었다.
5개 다른 대장 CSC 세포주(1.1, 1.2, 18, 85, CRO1) 및 HCC 세포주 Huh7에 대한 항체 BFG-5B5-G7의 반응성은 실시예 7에 설명된 복용량-반응 실험에서 FACS 분석에 의해 평가되었다. 이전에 설명된 BFG-2F7-B9 항-FGFR4 항체 및 무관한 항체 1H4는 참조로서 포함되었다. 대조군(이차 항체만)에 대한 배수 변화(FC) 값은 ug/mL로 표시된 mAb 농도의 함수로서 플롯되고, Bmax 및 Kd 상수는 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하고 실시예 5에 설명된 '1 사이트 결합 공식'에 적용하여 계산되었다.
표 11에 요약된 것처럼, 항체 BFG-5B5-G7는 높은 FGFR4 준위를 나타내는 모든 세포주에서 BFG-2F7-B9로 측정한 것과 유사한 높은 결합 활성을 나타내는 반면, 낮은 FGFR4 발현하는 CTSC18 세포주는 매우 덜 반응적인 것을 확인하였다. 대조적으로, 무관한 항체 1H4는 모든 시험된 세포주에서 음성 결과를 나타내었다. BFG-5B5-G7에 대해 계산된 Kd 값은 모두 서브나노몰 범위 내이고 BFG-2F7-B9에 대해 계산된 것들에 비교할만하거나 또는 약간 낮았다.
표 11. 5개 대장 CSC 세포주 및 HCC 세포주 Huh7에서 항-FGFR4 mAbs BFG-5B5-G7 및 BFG-2F7-B9의 해리 상수 및 최대 결합 값
FGFR4에 대한 BFG-5B5-G7의 결합 친화도 및 특이성은 실시예 7에 설명된 고체상 수용체 결합 분석법 및 인간 키메라 수용체 FGFR1-Fc, FGFR2-Fc, FGFR3-Fc FGFR4-Fc (R&D Systems)을 사용하여 인비트로 측정되었다. 다른 FGFR-Fcs으로 코팅된 마이크로플레이트는 BFG-5B5-G7 또는 아이소타입 대조군(rat IgG2a)의 농도를 증가시키면서 배양되었다. 이 분석법에서, 항체 BFG-5B5-G7는 FGFR4에 대한 높고 특이적인 친화도(Kd=0.02 ug/mL, 0.1 nM)를 나타내는 반면에, 다른 FGF 수용체 또는 아이소타입 대조군에서는 결합이 관찰되지 않았다.
FGF19-FGFR4 복합체의 형성을 방지/경쟁하는 항체 BFG-5B5-G7의 능력은 실시예 7에 설명된 FGFR4-Fc-종속 고체 상 결합 분석법으로 분석되었고, 여기서 다음 변형을 도입하였다. 1:3 연속 희석의 항체 3개 복제품으로 1h 동안 배양하고, 재조합 FGF19 (Peprotech) 및 저분자량 헤파린(Clexane, mean MW 4.5 kDa, Sigma-Aldrich)을 23nM의 등가몰 농도(이전 복용량-반응 결합 실험으로부터 추론된 kd 값에 대응, 미도시)로 첨가하였다. 2h 배양 후, 마이크로플레이트를 PBS로 5번 세척하고, 1h 동안 PBS/ 0.3% BSA에서 1:1000 희석된 항-FGF19 비오틴화된 항체 (R&D Systems)로 배양하였다. PBS로 5번 세척한 후, 고정된 수용체에 결합된 잔기 FGF19를 % BSA 및 0.02% Tween-20를 포함하는 PBS중 50 ㎕의 HRP-콘쥬게이트된 스트렙트아비딘(Thermo Fisher Scientific/Pierce)을 첨가하여 검출되었다. 30분 배양 후, 과량 스트렙트아비딘을 PBS/0.02% Tween-20로 3번 세척하고 PBS로 2번 이상 세척하여 제거하고, 이어서 12분 동안 색소생산성 기질 TMB(Thermo Fisher Scientific)을 첨가하였다. 상기 반응은 100 ㎕의 2M 황산을 첨가하여 종결하고 450nm에서의 흡광도는 마이크로플레이트 리더 Multimode Detector DTX 880 (Beckman Coulter)를 사용하여 측정하였다.
상기 분석은 다른 FGFR에 비하여 FGFR4에 대한 FGF19 결합 선택성 및 FGF19-FGFR4 상호작용을 억제하는 또 다른 FGFR4 높은 친화도 리간드, FGF1의 능력 모두를 시험하는 것으로 사전에 입증되었다.
이어서 11번의 1:2 연속 희석액의 항체 BFG-5B5-G7 (0.015 ug/mL 내지 15 ug/mL)을 세번 시험하였고, 이는 이전에 기술된 실험 조건하에서 수행되었다. 무관한 항체 1H4는 또한 음성 대조군과 동일한 농도에서 시험되었다.
이 결과는, 이전에 기술된 항-FGFR4 mAbs BFG-2F7-B9 및 무관한 항체 1H4(미도시)와 다른, 항체 BFG-5B5-G7는, 쥐과 수용체에 대한 이들의 반응성과, FGFR 도메인 Ig II에 대한 이의 결합 특이성에 합치하여, FGF19에 대한 FGFR4의 결합을 효율적으로 억제할 수 있었다.
콜레스테롤 7a-히드록실라제(CYP7A1) 및 연결 조직 성장 인자(CTGF)의 발현은 전사적 준위로 정상 및 종양 간 세포 둘다에서 FGFR4 신호전달 경로의 FGF19-종속 활성화에 의해 조절된다(Inagaki et al., 2005; Chiang et al., 2009; Uriarte et al., 2015). FGF19-매개 유전자 조절을 방지하는 항체 BFG-5B5-G7 및 BFG-2F7-B9의 능력은, 혈청 기아 상태 8시간 후, 무혈청 배지에서 항-FGFR mAbs으로 밤새 사전 배양한 HepG2 세포에 대해 평가하였다. FGF19을 이후 세포 용해 6시간 전에 등가몰 함량의 헤파린과 함께 100 ng/mL(4.6 nM)의 농도로 첨가하였다. PBS로 처리한 음성 대조군 샘플을 포함하였다. 양성 대조군으로서 FGFR4 티로신 키나아제 특이적 억제제, BLU9931(Hagel et al., 2015)을 세포 용해 7시간 전에 0.1 uM, 0.3 uM 또는 1 uM의 농도로 첨가하였다. 총 RNA를 HepG2 세포로부터 추출하고 실시예 2에 설명된 것처럼 qRT-PCR 분석법을 3번 수행하였고, 유전자-특이적 프로브 및 프라이머(Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific TaqMan® Gene Expression Assays) 및 GAPDH을 정규화군으로 사용하였다.
공개된 데이터와 합치하여, FGF19의 첨가는 CYP7A1 발현 (약 5 배)을 감소시키고 CTGF 발현 (약 2.5 배)을 증가시켰다. BFG-5B5-G7로 치료는 부분적으로 30 ug/mL(0.2 uM)의 농도로 이미 이들 효과들을 역전시켰고, 화합물 BLU9931의 유사 농도로 관찰된 것들에 비교할만한 준위로 Cyp7A1 Mrna의 증가 및 CTGF mRNA의 감소를 야기하였다.
이들 데이터는 BFG-2F7-B9 (미도시)과 다른 BFG-5B5-G7이, 이 항체에 FACS에 의해 높은 양성을 나타내는 간세포암종 세포에서 FGFR4-종속 신호전달 경로와 간섭할 수 있다는 것을 나타낸다.
연속해서, BFG-5B5-G7 및 BFG-2F7-B9는 FGF19의 Huh7 및 Hep3B 간세포암종 세포주로 처리하여 유도된, 섬유아세포성장인자 수용체 기질 2 (FRS2)의 FGFR4-종속 인산화를 억제하는 이들의 능력에 대해 평가되었다.
혈청 기아 8시간 후, 7.5 ug/mL, 15 ug/mL 및 30 ug/mL의 농도로 BFG-5B5-G7, BFG-2F7-B9 또는 대조군 항체 1H4를 갖는 무혈청 배지에서 세포를 밤새 배양하면서, FGF19 및 헤파린을 세포 용해 10분 전에 등가몰 농도(4.6 nM)로 첨가하였다. BLU9931을 100 또는300 nM의 농도로 세포 용해 1h 전에 양성 대조군으로서 포함하였다. SDS중 총 단백질 용해물을 제조하고 항-포스포-FRS2 항체 (Tyr196, Cell Signalling), 항-FRS2 항체 (LSBio) 및 항-GAPDH 항체(Sigma-Aldrich)을 사용하는 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
항체 BFG-5B5-G7는 복용량-종속 방법으로 2개 세포주에서 FGF19-유도된 FRS2 인산화를 억제하는 데 있어서 BFG-2F7-B9보다 매우 효율적인 반면에, 음성 대조군 항체 1H4는 완전히 불활성이다.
항체 BFG-5B5-G7는 2개 FGFR4-양성 대장 CSC 세포주(CTSC1.2 및 CRO1)의 부드러운 한천에서 콜로니 형성 효율을 감소시킬 수 있는 이들의 능력에 대해 시험되었다. 실험 절차는 실시예 6에 상세히 설명되어 있고 다음 변형이 가능하다. BFG-5B5-G7 또는 무관한 항체 1H4는 상부 부드러운 한천층과 겹쳐진 배양 배지 모두 안에 최종 농도 7.5, 15 또는30 ug/mL으로 포함되었다. 양성 대조군으로서, FGFR4 억제제 BLU9931는 100nM의 농도로 병행 시험되었다. 각 실험 포인트들 4개 복제품을 플레이트하고 37°C, 5% CO2에서 배양하고, 항체 또는 화합물을 포함하는 신선한 배지를 2일 마다 첨가하였다.
세포 콜로니 형성은 도립 광현미경 하에서 모니터링되고, 배양 14일 후 30 이상의 세포를 포함하는 콜로니 수가 결정되었다. BFG-5B5-G7로 2개 CSC세포주를 연속적으로 치료하면 CTSC1.2 대해서는 모든 농도에서 그리고 CTSC CRO1에 대해서 시험한 가장 높은 농도에서 대조군에 비하여 콜로니의 수를 통계적으로 크게 감소시켰다.
제2 전략:
BFG-2F7-B9보다 잠재적으로 높은 항-종양 활성을 갖는 새로운 항-FGFR4 항체를 확인하기 위하여, 새로운 혼성 세포 세포주는, 실시예 3에서 설명된 pB8-HA-FGFR4 발현 벡터로 일반적으로 면역화된 랫트로부터 분리된 저온 보존(cryopreserve)된 림프구로부터 생성되었다. 이 제2 스크리닝을 위하여 2개의 새로운 선택 기준이 도입되었으며, 이는 쥐과 수용체와 교차 반응성(i) 및 대응하는 상청액에 의한 FGF19-FGFR4 상호작용에 간섭하는 능력의 초기 평가(ii)로 이루어진다.
실시예 3에서와 같이, 새로운 혼성세포 세포주가 생성되었고, 혼성세포 선택 및 팽창 단계 후, 인간 수용체 및 쥐과 수용체 둘 다에 대한 대응하는 상청액의 반응성은 발현벡터로 감염된 BOSC23 세포의 FACS 분석에 의해 평가되었다.
이를 기초로, 인간 FGFR4에 양성인 결과를 나타내는 항체를 제조하는 70 혼성세포 세포주가 선택되고(BMK 융합), 이들 중에서 50은 쥐과 수용체에 대해 반응적이고 20은 인간 FGFR4에 대해 특이적이다.
제1 스크리닝(실시예 4)에 대하여, 70개의 선택된 상청액은 대장 CSC 표면에 대한 이들의 결합 효율에 대해 FACS에 의해 분석되었다. 실험은 이전 확인된 항-FGFR4 항체(CTSC1.1, CTSC1.2, CTSC85 및 CTSC CRO1)에 대한 높은 반응성을 갖는 4개 대장 CSC세포주 및 동일한 항체에 대해 낮은 반응성을 갖는 CSC세포주 CTSC18에 대해 수행되었다. 105 세포/웰으로 파종하고 여기에 각 상청액 200㎕을 첨가하여 96 웰-마이크로플레이트 내에서 분석하였다. 혼성 세포주 주입(DMEM/10% FBS)을 위해 사용된 쥐과 골수종 세포의 조건화된 배지를 음성 대조군으로 각 플레이트에 첨가하면서, 항-FGFR4 BFG-2F7-B9 항체를 3 ug/mL의 농도로 양성 대조군으로서 포함하였다. 4℃에서 1h 동안 배양한 후, 항-랫트 형광 이차 항체(Goat 항-랫트 IgG R-피코에리트린[R-PE] 콘주게이트, Southern Biotech)를 첨가하였고, 세포들을 0.25 ug/mL (1 uM)의 DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐리노돌, 디히드로클로라이드)로 처리하여 세포 생존력을 제어하였다. 유세포 분석 평가는 세포형광기(cytofluorimetr) MACSQuant® VYB (Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행하였다.
2개를 제외하고 모든 상청액이 CTSC18 세포주 상에서 음성 결과를 나타내었고 실시예 4에 설명된 것처럼 이들의 FC값에 따라서, 다른 CSC세포주 상에서 이들의 양성성을 기초로 랭크하였다. 높은 FGFR4 발현하는 4개 CSC세포주 각각에 각 상청액에 할당된 개별 순위를 더하여, 최종 순위를 얻고(표 12), 여기서 가장 낮은 번호는 가장 높은 반응성에 대응한다.
표 12. 5개 다른 CSC 세포주에서 70개의 상청액으로 얻어진 FACS 분석 데이터 요약. 배수 변화(FC)는 음성 대조군(골수종 세포 조건화한 배지)에 대한 각 상청액으로 측정한 평균 형광 강도(MFI)의 비이다. 점수는 각 FGFR4-양성 CSC세포주에 대한 FC 값을 기초로 할당되고 최종 순위는 개별 점수들(총 랭킹)을 더하여 계산되었다. 쥐과 수용체와 교차-반응성을 나타내지 않는 상청액은 밑줄로 표시하였다.
병행하여, 70개 상청액의 반응성은 이전 설명된 고체 상 수용체 결합 분석법으로 측정되었다. FGFR4-Fc으로 코팅된 마이크로플레이트 웰은 각 상청액의 부피를 0.08 ㎕ 내지 10㎕으로 부피를 증가시키면서 골수종 세포 조건화된 배지로 최종 부피 50㎕까지 증가시키면서 배양되었다. 다른 표적(BGC-6H7)에 대하여 생성된 항체를 음성 대조군으로 각 플레이트에 첨가하면서, 항-FGFR4 BFG-2F7-B9 항체를 양성 대조군으로서 6ug/mL의 농도로 포함시켰다. 450nm에서 흡광도 값은 조건화된 배지 백그라운드 값(background value)을 추출하여 얻어졌다. 표 13에 요약한 것처럼, BMK-7E4, BMK-8H9 및 BMK-8H10을 제외한 모든 상청액은 다른 정도로 복용량-종속 수용체 결합 활성을 나타냈다. 450nm에서 흡광도 감소가 최소 시험된 부피에서조차 관찰되지 않은 14 상청액은, 보다 낮은 부피 범위를 사용하는 제2 시험에서 평가되었고, 여기서 모든 상청액은 복용량-반응 활성을 나타내었다. 또한 이 경우에 최종 랭크가 표 13에 요약된 것과 같은 2 ㎕ 및 0.08㎕ 상청액 부피로 얻어진 데이터를 기초로 각 상청액에 할당되었다.
표 13. 고체 상 FGFR4-종속 분석법 (n=3)으로 70개 상청액으로 얻어진 결합 데이터의 요약. 가장 낮은 수는 가장 높은 반응성에 대응한다. 최고 18 상청액은 (+) 표시로 나타낸다.
캐릭터리제이션을 더 시킬 수 많은 상청액을 선택하기 위하여 전체 데이터를 평가하였다. 대장 CSC에서 FACS 분석으로부터 유래한 최선의 17 상청액을 우선적으로 처리하였고, 이들 중 13개는 쥐과 수용체에 대해 반응적인 반면에, 다른 4개는 인간 FGFR4에 대해 특이적이다. 이들 상청액은 재조합 수용체에서 2개 결합 분석중 적어도 하나, 즉 FGFR4-종속 고체상 분석법 및 이들의 표면에 수용체를 이소성으로 발현하는 BOSC23 세포에서 결과를 얻었다.
상기 17개 상청액은 이전에 설명된 고체 상 분석법에서 고정된 수용체에 대한 FGF19의 결합을 억제하는 이들의 능력에 대하여 복용량-반응 실험으로 평가되었다. 고정된 FGFR4-Fc는 FGF19 및 헤파린 첨가 전에, 골수종 세포 조건화된 배지를 가지고 각 상청액의 부피를 증가시키면서(0.185 ㎕ 내지 16.6 ㎕) 사전 배양하였고, 최종 부피를 50㎕로 하였다. 모든 3개 결합 분석법에서 비반응적인 결과를 나타내는 상청액을 음성 대조군으로 포함하면서, FGF1을 5nM의 농도로 양성 대조군으로 사용하였다.
도 11에 보여진 것처럼, 17개 분석된 상청액 중 7개는 FGF19-FGFR4 결합의 분명한 복용량-종속 억제를 야기한다. 이들 중에서, 5개는 쥐과 수용체(BMK-1E7, 3B6, 5H9, 6C9, 10G11)와 교차-반응적이며, 단지 2개만이 인간 FGFR4(BMK-8D4 및 BMK-8E3)에 특이적이었다. 흥미롭게도, 이들 7개 상청액은 내생 및 재조합 수용체 둘 다에 결합시 가장 효율적인 것들 중 하나가 되는 결과를 나타냈다.
실시예 9
항-FGFR4 모노클로날 항체의 캐릭터리제이션
7개 선택된 상청액을 제조하는 부모 혼성세포 세포주는 아클론되었고, 안정한 서브클론은 FGFR4를 이소성으로 발현하는 BOSC23 세포에 대해 반응적인 항체를 제조하는 이들 각각에 대해 얻어졌다(실시예 3에 상세함). 대응하는 모노클로날 항체는 실시예 5에 설명된 것처럼 단백질 G-Sepharose 친화도 크로마토그래피로 정제되었다.
3개 다른 대장 CSC 세포주(CTSC1.2, CTSC85 및 CTSC CRO1) 및 HCC 세포주 Huh7에 대한 7개 항체의 반응성은 실시예 7에 설명된 복용량-반응 실험에서 FACS 분석으로 평가되었다. 참조로서, 이전에 설명된 BFG-5B5-G7 항체가 또한 시험되었다. 대조군(이차 항체만)에 대한 배수 변화(FC)값은 ug/mL으로 표현된 mAb 농도의 함수로서 플롯되고, Bmax 및 Kd 상수는 GraphPad Prism 소프트웨어을 사용하고 실시예 5에 설명된 것처럼 "1 사이트 결합 식'에 대입하여 계산되었다.
표 14에 설명된 것처럼, BFG-5B5-G7는 이전 실험에서 보여진 높은 결합 효율을 확인하였다. 새로운 mAbs 중에서, BMK-3B6-E4 및 BMK-6C9-C11는 모든 세포주에서 BFG-5B5-G7으로 측정된 것과 유사한 높은 결합 효율을 나타내었다. 대조적으로, 항체 BMK-1E7-C4, BMK-5H9-D1, BMK-8D4-E2, BMK-8E3-E4 및 BMK-10G11-F3는 BMK-8E3-E4에 대해 매우 덜 반응적이며, BMK-8E3-E4 에 대하여, 곡선은 분석된 세포주 일부에 대해 포화에 도달하지 않았으므로, 어느 정도의 비특이적 오프-표적 결합을 암시한다.
표 14. 3개 대장 CSC세포주 및 HCC 세포주 Huh 7에서 BFG-5B5-G7 및 7개 항-FGFR4 mAbs의 해리 상수 및 최대 결합 값
새로운 mAbs는 실시예 8에 설명된 수용체-종속 고체 상 분석법에서 FGF19-FGFR4 복합체의 형성을 방지/경쟁하는 능력을 확인하였다. 참조로서 포함된, 항체 BFG-5B5-G7으로서, 추가적인 mAbs는 낮은 나노몰 억제 상수를 나타내었다(표 15).
표 15. IC50 값은 항체 농도를 증가시키면서(1:3 연속희석법으로 0.014 내지 30 ug/mL; n=3), 450nm에서의 잔기 흡광도(PBS 대조군의 %)를 기초로 KaleidaGraph 소프트웨어로 실험 데이터를 4P 로지스틱 피팅으로 계산하였다.
HCC 세포주 HepG2의 총 RNA로 qRT-PCR 분석을 수행하여 Cyp7A1 및 CTGF 유전자의 FGF19/FGFR4-종속 발현을 조절하는 항체 능력을 평가하였다. 참조로서 포함된 항체 BFG-5B5-G7에 대해 실시예 8에 설명된 실험 조건 하에서 FGF19(100 ug/mL) 첨가 전에 60 ug/Ml의 각 항체 또는 PBS로 세포를 처리하였다. RNA 추출 및 qRT-PCR 프로토콜은 이전 설명된 것과 동일하였다.
2^(-ΔΔc-t) 계산 방법으로 얻어진 분석 결과들은 도 12에 보여진다. 이전 실험에서처럼, FGF19의 첨가는 CYP7A1 발현(약 5 배)를 줄이고 CTGF 발현(약 2.5 배)를 증가시켰다. Cyp7A1 mRNA 준위의 증가 및 CTGF mRNA의 감소를 각각 야기하는, 새로운 항체 BMK-1E7-C4, BMK-3B6-E4, 및 BMK-6C9-C11뿐만 아니라, BFG-5B5-G7은 부분적으로 이들 효과를 역전시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
연속해서, 상기 항체는 HCC 세포주 Hep3B의 FGF19로 처리하여 유도된, FRS2의 FGFR4-종속 인산화를 억제하는 이들의 능력에 대해 평가되었다. 참조로서 포함된 항체 BFG-5B5-G7에 대해 실시예 8에 설명된 실험 조건하에서 FGF19/헤파린 첨가 전에 60 ug/mL의 각 항체 또는 PBS로 세포를 처리하였다.
이 분석 결과는 도 13에 나타낸다. 양성 대조군 BFG-5B5-G7뿐만 아니라 항체 BMK-1E7-C4, BMK-3B6-E4, BMK-6C9-C11 및 BMK-10G11-F3는 다른 정도라도 FGF19-유도된 FRS2 인산화를 억제할 수 있다.
마지막으로, HCC 세포주 Huh7에서 항체의 항-증식성 활성은 액체의 클론원성 분석법으로 평가되었다. 항체 BFG-5B5-G7 및 FGFR4 억제제 BLU9931는 참조로서 포함되었다.
도 14에 대표적인 결과들이 보여진다. BFG-5B5-G7뿐만 아니라 모든 항체로 Huh7 세포를 연속적으로 처리하면, 다른 정도이지만 대조군에 비하여 콜로니의 수를 감소시켰다. 50-100 ug/mL (0.3-0.6 uM)의 농도로, 참조 항체 BFG-5B5-G7에 의해서 뿐만 아니라 BMK-3B6-E4, BMK-5H9-D1, BMK-6C9-C11, BMK-8D4-E2 및 BMK-8E3-E4에 의해 보여진 항-증식성 효과는 FGFR4 억제제 BLU9931의 유사한 농도로 관찰된 것들에 비교할만하거나 더 높았다.
결과적으로, 이들의 면역학적 및 기능적 성질을 기초로, 3개의 항-FGFR4 모노클로날 항체는 추가 캐릭터리제이션를 위해 선택되었고, 즉 BMK-3B6-E4, BFG-5B5-G7 및 BMK-6C9-C11는 다음 3개 조건들 모두를 만족시켰다: i. 낮은 나노몰 범위의 해리 상수를 갖는 대장 CSCs 및 HCC 세포의 표면에 발현된 수용체에 대한 결합; ii. 높은 수용체 준위를 발현하는 세포에서 FGFR4 신호전달 경로 억제; iii. 항체 약물의 표준 치료 복용량과 적합가능한 농도로 FGFR4 양성 세포에 대한 항-증식성 활성.
실시예 10
항-FGFR4 인간-rat 키메라 항체의 제조 및 캐릭터리제이션
랫트 혼성세포 BFG-5B5-G7, BMK-1E7-C4, BMK-3B6-E4, BMK-5H9-D1, BMK-6C9-C11, BMK-8D4-E2, BMK-8E3-E4, 및 BMK-10G11-F3에 의해 발현된, 면역글로불린 유전자의 VH 및 VL 영역은, 표준 RT-PCR 프로토콜을 사용하여 혼성세포 세포로부터 생성된 cDNA로부터 Aldevron's (Freiburg, Germany) 소유 프라이머로 증폭되었다. 표준 염료-종결 모세관 시퀀싱 방법을 사용하여 시퀀싱한 후, VH 영역을 암호화하는 cDNA는 gWIZ 발현 벡터 (Aldevron) 내로 인간 IgG1 불변 영역에 대한 코딩 시퀀스를 갖는 프레임 내로 클론되는 반면에, VL 영역을 암호화하는 cDNA는 동일한 발현백터 내로 인간 kappa chain 불변 영역을 넣는 코딩 시퀀스를 갖는 프레임 내로 클론되었다(도 15).
단순성 ch3B6, ch6C9 및 ch5B5에 대해 정의된, 3개 키메라 항체 BFG-5B5-G7, BMK-3B6-E4 및 BMK-6C9-C11의 각각의 중사슬 및 경사슬을 암호화하는 발현 벡터는 세포주 293F 내로 일시적으로 공동감염되고, 항체는 ≥2 L의 세포 상청액으로부터 2-3mg/mL의 최종온도로 단백질-A Sepharose 친화도 크로마토그래피에 의해 PBS pH 7.2으로 정제되었다. 수율은 항체 및 제제에 따라서 20 및 30 mg/liter의 상청액이었다. 품질 대조군은 재조합 항체의 순도 및 모노머릭 상태를 확인하였다(도 16).
키메라 항체는 HepG2 및 Huh7 간세포암종 세포의 표면에 발현된 결합 FGFR4의 이들의 능력에 대해 FACS에 의해 제어되었다. ch3B6는 또한 높은 준위의 FGFR4 Y367C 돌연변이 변이체(Roidl et al., 2010)를 발현하는 것으로 설명된, 유방 암 세포주 MDA-MB453에서 시험되었다. 이 분석은 실시예 7에서 설명된 것처럼 수행되었으나, 항-인간 형광 이차 항체(Goat 항-인간 IgG R-피코에리트린[R-PE] 콘쥬게이트, Southern Biotech)는 이 경우에 사용되었다.
도 17에서 대표적인 데이터가 보고된다.
키메라 항체는 낮은 nM 범위로 유사한 해리 상수를 갖는 대응하는 랫트 mAbs의 결합 활성을 유지하는 것으로 확인되었다. 게다가, ch3B6는 MDA-MB453 세포에서 과발현된 FGFR4 Y367C 돌연변이에 효율적으로 결합하는 것으로 보여진다. 이 돌연변이 수용체는 지배적이고, 리간드-독립된, 구성요소적 활성화된 변이체이고, 기존 안타고니스틱 항체로 억제하는 것에 둔감한 것으로 설명되어 있다(Roidl et al., 2010).
FGF 수용체 패밀리의 다른 구성원들에 비하여 FGFR4에 대한 키메라 항체의 결합 친화도 및 특이성은 이후 고체 상 수용체 결합 분석법 및 인간 키메라 수용체 FGFR1-Fc, FGFR2-Fc, FGFR3-Fc 및 FGFR4-Fc (R&D 시스템)을 사용하여 인비트로에서 측정되었다. FGFR1 및 FGFR2 둘다 alpha 및 beta 스플라이싱 변이체가 시험되었다. 게다가, 2개 FGFR2 변이체 각각에 대하여, Ig III 도메인에서 다른 2개 추가적인 대안적 스플라이싱 변이체가 시험되었다. 이것 및 이하 설명된 다른 고체상 결합 분석법은 실시예 7에 설명된 것처럼 필수적으로 수행되었고 다음 변형을 하였다. 96 웰-마이크로플레이트는 4℃에서 밤새 2 ug/mL으로 PBS 중 인간 키메라 수용체 FGFR-Fc으로 직접적으로 코팅하였다. 항체 농도를 증가시키면서 배양한 후, HRP-콘쥬게이트된 염소 항-인간 IgG, Fab 특이적, 이차 항체(Sigma Aldrich)가 1: 2500 희석으로 검출을 위해 사용되었다.
도 18에 대표적인 복용량-반응 결합 곡선이 보여진다.
이 분석법에서, 키메라 항체는 FGFR4에 대한 서브나노몰 친화도를 확인한 반면에, 다른 FGF 수용체에서는 큰 결합은 측정되지 않았다.
다음에, 우리는 항체 농도를 증가시키면서 배양한 후에, 23nM의 등가 농도에서 FGF19/헤파린을 첨가하여 실시예 8에서처럼 수행된 고체상 분석법으로 FGFR4-Fc에 대한 FGF19의 결합을 방지/경쟁하는데 있어서 키메라 항체의 효율을 확인하였다.
대표적인 복용량-반응 억제 곡선은 도 19에 보여진다.
HCC 세포주 Huh7 에서 키메라 항체의 항-증식성 활성은, 액체 상태로 클론원성 분석법으로 평가되었다. FGFR4 억제제 BLU9931는 0.2 uM 내지 5 uM로 농도를 증가시키면서 참조로서 포함된다.
대표적인 결과들은 도 20에 보여진다.
3개 항체로 Huh7 세포를 연속적으로 처리하면, 다른 정도이지만 대조군에 비하여 콜로니 수를 감소시켰다. 30 및 100 ug/mL (0.2 uM 및 0.6 uM, 각각)의 농도로 항체 ch3B6으로 보여진 항-증식적 효과는, 동일한 농도의 화합물 BLU9931로 관찰된 것들에 비교할만하였다. 다른 2개 항체는 덜 중요한 억제 효과를 보였다.
관찰된 항-증식성 효과의 특이성을 확인하기 위하여, 3개 항-FGFR4 키메라 항체는 민감성 HCC 세포주 Huh7에서 FGFR4 신호전달 경로 활성화에 간섭하는 이들의 능력에 대해 평가하였다. 이 목적에 대해, FGF19로 세포 치료로 유도된 어댑터 단백질 FRS2 및 FGFR4의 인산화에 대한 억제 효과는 웨스턴 블롯으로 분석되었다(도 21).
양성 대조군 BLU9931뿐만 아니라, 모든 3개 항체는 Huh7 세포에서 FGF19-유도된 FGFR4 및 FRS2 인산화를 억제할 수 있다.
인비트로 실험 증거를 기초로, 3개 키메라 항체의 잠재적 치료적 항종양 효과는 인비보 모델에서 평가되었고, 이는 HCC 세포주 Huh7로 감염된 면역결핍성 마우스를 사용하였다. 50% Matrigel (Corning) 중 5x106 Huh7 세포의 현탁액을 5-6주 연령의 35 마리의 가슴샘없는 마우스(Envigo) 각각의 옆구리에 피하로 접종하였다. 접종 후 12일에, 측정가능한 종양을 나타내는 마우스는 무작위적으로 4개 집단, 즉 BMK-3B6-E4, BMK-6C9-C11, BFG-5B5-G7 (n=8) 및 대조군(n=7) 집단으로 배정하고, 모든 집단의 평균 종얄 부피는 107mm3 이다. 마우스를 3주 동안 1주일에 2번 PBS중 각 항체 25 mg/Kg을 IP 주사하여 처리하였다. 대조군 집단은 대응하는 부피의 블랭크 주사(PBS)를 받았다. 마우스 체중은 1주일에 2번 제어하고 종양 크기(주축 및 종축)은 1주일에 2번 버니어 캘리퍼스로 측정하였다. 종양 부피는 다음 식을 사용하여 계산하였다:TV (mm3) = d2xD/2, 여기서 d 및 D는 각각 가장 짧은 직경 및 가장 긴직경이다.
대조군 집단에 비하여 각 항체로 처리한 마우스에서 종양 부피의 감소가 관찰되었고, 치료 16일째부터 시작하여 통계적으로 중요한 차이가 시작되었다(도 22). 대조적으로 체중 손실 또는 임상적 부작용은 관찰되지 않았다(미도시).
연구 말기에, 생존하는 마우스를 희생시키고 잔여 종량 덩어리를 수집하고 3개 단편으로 나누어 각각 qRT-PCR, 웨스턴 블롯 및 면역조직화학으로 특이적 생체 지표를 평가하였다.
첫번째로, 우리는, 실시예 8에 상세히 설명된 것처럼, 정상 및 종양 간 세포 둘 다에서 FGFR4 신호전달 경로의 FGF19-종속 활성화에 의해, 처리된 마우스 종양에서, FGFR4- 및 간-특이적 생체 지표의 전사, 즉 조절된 CYP7A1 및 CTGF의 전사를 조절하는 항체의 능력을 mRNA 준위로 평가하였다. 우리는 대응하는 랫트 항-FGFR4 항체로 간세포암종 세포 배양액을 처리하여 이들 2개 유전자의 발현의 FGF-19 조절을 부분적으로 역전시켰다는 것을 사전에 나타내었다(실시예 8 및 9).
이 엑소비보 연구에서, qRT-PCR 분석법은 3개 항-FGFR4 키메라 항체 각각 및 PBS로 처리한 마우스로부터 수집된 종양 샘플들로부터 추출한 총 RNA로 수행하고, 실시예 8에 상세히 설명된 실험 절차를 사용하였다.
이 분석의 결과는 도 23에 보여진다.
키메라 항-FGFR4 항체의 치료적 투여는 종양에서 분석된 생체 지표의 조절을 야기하고, 이는 간 이종이식 모델에서 FGFR4 신호 형질도입 경로 활성화에 대한 안타고니스틱 효과와 일치한다.
관찰된 항-종양 활성의 특이성을 더 확인하기 위하여, 처리된 종양에서 FGFR4 및 MAP 키나아제 ERK1/2(외세포 조절된 키나아제 1 및 2)의 인산화에 대한 항체 억제 효과가 평가되었다. 처리된 마우스 및 대조군 마우스로부터 수집된 종양 샘플로부터 제조된 단백질 추출물은 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다(도 24).
항체 ch3B6는, 처리된 마우스의 종양에서, 대조군 종양에서 측정된 FGFR4 및 ERK1/2 인산화 준위를 크게 감소시키는 것으로 나타났다..
전체적으로, 엑소비보 실험 증거는, 항-FGFR4 키메라 항체로 치료적 치료를 하면 Huh7 종양에서 다른 구성 성분들의 FGFR4 신호전달을 조절하고, 여기서 이들은 성장 억제 효과를 나타내었다.
항체의 수용체-매개 세포내 내재화(internalization)는 이후 Huh7에서 평가되었다. 세포들은 4℃에서 1시간 동안 3개 항-FGFR4 키메라 항체 또는 무관한 항체 1H4로 처리되어 세포 표면 수용체에 대한 결합을 촉진하였다. 샘플들을 배양 말기(시간 0)에 수집하고, 세포들을 37℃에서 이송하여 항체-수용체 복합체의 내재화를 발전시키고, 이전에 설명한 것처럼 FACS 분석을 위하여 다른 시간에 수집하였다. 결과는 표 16에 요약하였다.
표 16. Huh7 세포 내에서 3개 키메라 항체의 FGFR4-종속 내재화. 세포들을 항-FGFR4 항체 또는 무관한 항체 1H4로 1h 동안 4℃(시간 0)에서 처리하고 37℃에서 배양하였다. 샘플을 지정된 시간-포인트에서 수집하고 FACS 분석을 하였다. 데이터는 시간 0에서 측정된 기하학적인 평균 형광값들의 퍼센트로 표현된다.
이 분석은 항-FGFR4 항체로 처리된 샘플에서 막 신호의 시간-종속 감소를 나타내나, 음성 대조군 항체로는 아니었으므로, 이는 특이적, 수용체-매개 세포 내재화를 암시한다.
다음으로, 우리는 FGFR4 외세포 영역 내에서 3개 항체의 항원 결합 사이트를 확인하였다. 이 목적을 위하여, 실시예 8에 상세히 설명된 FL FGFR4를 이소성으로 발현하는 BOSC23 리포터 세포 또는 3개 FGFR4 결실 돌연변이(d1, d2, d3)는 각 항체로 처리되고 이전에 설명된 것처럼 FACS로 분석되었다. 결과는 도 25에 개략적으로 보고된다.
모든 3개 항체는 완전한 길이의 수용체에 이들의 반응성을 확인하였고, d1 돌연변이에 양성을 나타냈으므로, Ig I 도메인과 상호작용을 하지 않는 것을 나타내었다. 항체 ch3B6는 d2 돌연변이에 양성성을 완전히 잃어, 산박스에 대해 결합 특이성을 나타내었다. d2 돌연변이로 향한 반응성을 유지하는 다른 2개 항체는 d3에 음성을 나타내므로, Ig II 도메인에 대해 결합 특이성을 나타내고, ch5B5의 경우에, 대응하는 랫트 항체로 얻어진 결합 데이터를 확인하였다.
항원 결합 사이트의 확인은, 관심있는 항체로 스캐닝한 것을 기초로 에피토프 맵핑 ELISA 기술을 사용하여 경쟁 표적 단백질 아미노산 시퀀스를 포함하는 중첩하는 합성 펩타이드들의 라이브러리를 확인하였다.
이 목적을 위하여, 11개 아미노산이 겹치는 시퀀스를 갖는, 23 및 22개의 15-아미노산 펩타이드는 FGFR4 도메인 Ig I (aa 22-118) 및 Ig II (aa 157-241) 각각의 시퀀스를 기초로 합성되었다. 13개 아미노산이 겹치는 시퀀스를 갖는 26개 추가 15-아미노산 펩타이드는 FGFR4 산박스 도메인(aa 119-156)(JPT 펩타이드 Technologies)의 시퀀스를 기초로 합성되었다. 모든 펩타이드는 스트렙트아비딘-코팅된 마이크로플레이트에 결합할 수 있게 하는 화학적 스페이서를 통해 비오틴에 N-말단에서 콘쥬게이트되었다. 3개 키메라 항체의 결합 특이성은 ELISA에 의해, Ig I, Ig II 및 산박스 도메인에 대응하는 3개 펩타이드 라이브러리에 대해서 평가되었고, 양성 대조군으로서 키메라 항-myc 항체(Absolute Antibody) 및 대응하는 합성 비오틴화한 펩타이드 에피토프(JPT 펩타이드 Technologies)를 포함한다. 스트렙트아비딘 코팅된 높은 결합 능력 96-웰 화이트 마이크로플레이트(Pierce/Thermo Fisher Scientific)의 각 웰은 200 ㎕의 차단 완충제(0.1% BSA 및 0.5% Tween-20을 포함하는 PBS)로 3번 세척하였다. 이후 웰은 100㎕의 각 펩타이드로 코팅되고, 50 uM의 농도로 차단 완충액 내에서 2h 동안 RT에서 흔들어서 현탁되었다. 200㎕의 차단 완충액으로 3번 세척 후, 차단 완충액으로 희석된 각 항체 100㎕을 150㎍/mL의 농도로 첨가하고 RT에서 1.5h 동안 흔들어 배양하였다. 200㎕의 차단 완충액으로 3번 세척한 후, 100㎕의 HRP-콘쥬게이트된 염소 항-인간 IgG, Fab 특이적 이차 항체 (Sigma Aldrich)을 차단 완충액 내에서 1:10000 희석으로 첨가하고 RT에서 1h 동안 흔들면서 배양하였다. 차단 완충액 200㎕으로 4번 세척한 후, 100㎕의 화학발광 HRP 기질(SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce/Thermo Fisher Scientific)을 첨가하고 1min 후, 발광은 마이크로플레이트 리더 Multimode Detector DTX 880 (Beckman Coulter)을 사용하여 측정되었다.
FGFR4 결실 분석으로부터 예상한 것처럼, 키메라 항체 어느 것도 Ig I 도메인(미도시)에 대응하는 펩타이드에 특이적 반응성을 나타내지 않고 항체 ch6C9 및 ch5B5는 또한 산박스에 대응하는 펩타이드에 음성 결과를 나타내었다. ch6C9는 낮은 반응성을 나타내고, 이 반응성은 Ig II 도메인에 대응하는 펩타이드에 다중 피크들로 분포되며, 이것이 이 영역에서 비연속적/컨포멀 에피토프를 인식한다는 것을 암시한다. 대조적으로, ch5B5는 도메인 Ig II 내에서 3개 겹치는 펩타이드에 높고 특이적인 반응성을 나타내므로, 23 아미노산의 선형 에피토프를 규정한다(도 26A).
다른 항체와 다르게, ch3B6는 산박스에 대응하는 특이적 펩타이드에 분명한 양성을 나타내므로, FGFR4 결실 데이터를 확인하였다. 또한 이 경우에 반응성이 별개의 분리된 수의 피크들로 분포되었지만, 이 항체에 대하여 127 및 154 사이의 아미노산을 포함하는 산박스 내에 비연속적 결합 사이트를 정의하는 것이 가능하였다(도 26B). 도 26C에 도시된 인간 FGFR4 단백질 시퀸스 및 마우스 오솔로그 시퀸스의 배열은, 상기 실험적으로 확인된 ch3B6 에피토프 내 결합에 기여하는 잔기가 대응하는 마우스 시퀀스 내에서 보존된다는 것을 나타내므로, 이는 쥐과 수용체에 대한 항체의 관찰된 교차 반응성을 뒷받침한다.
실시예 11
항-FGFR4 항체 ch3B6의 인간화
우리는 이후 선택된 인간 면역글로불린 가변 영역 내로 원래 혼성세포 랫트 CDR 시퀀스를 그래프팅하여 항체 ch3B6의 인간화를 하였다. 인간화된 변이체를 최적화하기 위하여, 원래 랫트 항체 3B6의 것과 가장 유사한 인간 생식계열 면역글로불린 가변 시퀸스를 확인하였고 선택하였다. 기존 면역글로불린 결정 구조체와 상동성을 기초로, 선택된 인간 생식계열 가변 영역의 3D 모델은 중사슬 가변영역 (VH), 및 경사슬 가변영역 (VL) 둘 다에 대해 생성되었다. 3D 모델 내 각 아미노산 위치는, 항원 결합 또는 VH/VL 배향에 잠재적으로 영향을 미치는 아미노산에 대하여 특별히 주의하면서, 대응하는 원래 쥐과 잔기에 의해 치환될 필요가 있는 인간 프레임워크 내 추가적인 아미노산 잔기를 결정하기 위하여 평가되었다. 일부 위치에 대해 인간 또는 랫트 아미노산 사이에서 이론적으로 최적 선택은 사소하지 않으므로 실험적으로 시험되어야만 한다. 이러한 이유로, 인간화된 시퀀스의 약간 다른 버전, VH 3개 및 VL 2개가 각각이 고안되었고, 이들의 조합은 6개 다른 항체를 제조한다. 이 공정은 도 27로 도식화된다.
게다가, 우리는 우리 실험에서 벤치마크로 포함된 기존 인간화된 항-FGFR4 항체(hLD1.v22 Genentech, US9266955B2) 및 아이소타입 대조군으로 사용된 무관한 항체 Bezlotoxumab (Merck & Co)를 선택하였다. 3B6 인간화된 VH 및 VL 변이체의 아미노산 시퀀스는 표 17에 목록화되어 있다.
표 17. 인간화된 가변 시퀀스, VH 및 2VL에 대한 3 변이체가 보여진다. 원래 랫트 3B6 시퀀스에 대한 아미노산 변화는 굵은 글씨로 표시하면서, 그래프팅을 위해 선택된 인간 생식계열 시퀀스에 대한 변화는 밑줄로 표시한다. 표 17은 출현 순으로 각각 SEQ ID NOS 2-4 및 12-13을 개시한다.
항체 3B6을 위해 제안된 5개 아미노산 변이체를 암호화하는 DNA 시퀀스는 필요에 따라 랫트 아미노산을 위한 코돈을 그래프팅 및 제조하기 위하여 선택된 인간 생식계열 면역글로불린 가변 영역의 뉴클레오티드 시퀀스를 기초로 결정되었다. 대조군 항체를 위하여, DNA 시퀀스는 이용가능한 온라인(http://eu.idtdna.com/CodonOpt)에서 코돈 최적화의 도움으로 대신 결정되었다.
5개 3B6 변이체 및 대조군 항체에 대한 합성 DNA 단편이 제조되었고, ch3B6 중사슬 및 경사슬 발현 벡터 내로 이들 단편 각각을 클로닝하기에 적당한 독특한 제한 효소 인식 사이트를 말단에 갖는다(실시예 10). 완전히 인간화된 발현 벡터는, 발현 벡터 gWiz-3B6-E4-G1내에서, 원래 랫트 VH 코딩 시퀀스를 3개 인간화된 3B6 VH 코딩 시퀸스 각각으로 교체하고, 발현 벡터 gWiz-3B6-E4-k 내에서 원래 랫트 VL 코딩 시퀸스를 2개 인간화된 3B6 VL 코딩 시퀸스 각각으로 교체하여 제조되었다(도 28). 동일한 클로닝 전략은 대조군 항체의 중사슬 및 경사슬을 암호화하는 발현 벡터를 제조하는데 사용되었다. 모든 DNA 구성은 시퀀싱에 의해 제어되었다.
6개 인간화된 변이체(표 18) 각각 및 양성 및 음성 대조군 항체의 중사슬 및 경사슬을 암호화하는 발현 벡터는 일시적으로 세포주 293F뿐만 아니라 ch3B6 중사슬 및 경사슬을 발현하는 벡터 내로 공동감염되었다.
표 18. VH 및 VL 시퀸스 조합뿐만 아니라, 6개 인간화된 항체 변이체을 제조하는 대응하는 CDRH 및 CDRL 시퀸스 조합이 목록에 있다. 번호들은 SEQ. ID 번호에 대응한다.
VH VL CDRH1 CDRH2 CDRH3 CDRL1 CDRL2 CDRL3
Hu3B6a 2 12 6 7 9 15 16 17
Hu3B6b 3 12 6 8 9 15 16 17
Hu3B6c 4 12 6 7 9 15 16 17
Hu3B6d 2 13 6 7 9 14 16 17
Hu3B6e 3 13 6 8 9 14 16 17
Hu3B6f 4 13 6 7 9 14 16 17
세포 상청액의 웨스턴 블롯 분석은 모든 다른 3B6 인간화된 변이체는 키메라 3B6 항체보다 높은 준위로 발현되었다는 것을 보였다(도 29).
실시예 12
6개 3B6 인간화된 변이체의 캐릭터리제이션
표 18의 목록에 있는 6개 3B6 인간화된 변이체는 실시예 18에서처럼 수행된 이전 설명된 고체상 분석법에서 고정된 수용체에 대한 FGF19의 결합을 억제하는 이들의 능력에 대한 복용량-반응 실험으로 평가되었다.
고정된 FGFR4-Fc는 FGF19 및 헤파린의 첨가 전에 각 항체의 농도를 증가시키면서 사전 배양되었다. 실시예 11에서 설명된 키메라 ch3B6 항체 및 hLD1.v22 항체는 양성 대조군으로 포함되었고, 무관련 항체 Bezlotoxumab는 아이소타입 대조군으로 사용되었다.
도 30에 보여진 것처럼, 모든 시험된 항체들은 아이소타입 대조군을 제외하고는 FGF19-FGFR4 결합의 분명한 복용량-종속 억제를 야기하며, 이는 sub/low nM 범위으로 IC50 values값을 가지며, 이는 ch3B6 및 양성 대조군 항체에 대해 계산된 것들과 매우 유사하다.
실시예 13
ch3B6 및 상업적 항체 ab41948의 비교적 분석
Abcam에서 시판되는 토끼 폴리클로날 항체, ab41948는 온라인 이용가능한 데이터시트에 따라 인간 FGFR4의 잔기 100-200 내에서 이로부터 유래된 개시되지 않은 시퀀스의 합성 펩타이드에 대하여 나왔다. 이 항체는 인간 수용체와 특이적으로 반응하고 WB, ICC/IF 및 IHC 응용에 적당한 것으로 설명되어 있다. 이용가능한 데이터를 기초로, ch3B6과 다른, ab41948는 쥐과 수용체와 교차-반응하지 않는다.
ab41948가 ch3B6와 임의 생물학적 성질을 공유하는지를 평가하기 위하여, 우리는 2개 항체의 비교분석을 하였다.
1차로, 상업적 항체 ab41948는 우리의 고체상 수용체 결합 분석법 내에서 hFGFR4-Fc 재조합 단백질에 결합할 수 있다는 것을 제어하였다. 이 분석법은 실시예 10에서 설명된 것처럼 근본적으로 수행되었다. 항체 농도를 증가시키면서 배양한 후, 염소 항-토끼 IgG (HL)-HRP 콘쥬게이트 이차 항체(Pierce)를 1:2000 희석액으로 검출을 위해 사용하였다.
도 31a에서 대표적인 복용량-반응 결합 곡선에 의해 보여진 것처럼, ab41948는 서브나노몰 친화도를 가지고 수용체에 효율적으로 결합할 수 있다.
다음으로, 우리는 항체 농도를 증가시키면서 배양한 후, 23nM의 등가몰 농도의 FGF19/헤파린을 첨가하는 것으로, 실시예 8에서처럼 수행된 고체상 분석법으로 FGFR4-Fc에 대한 FGF19의 결합을 방지/경쟁하는 ab41948의 능력을 평가하였다. ch3B6는 양성 대조군으로 평행하게 다시 시험되었다.
대표적인 복용량-반응 억제 곡선은 도 31b에 보여진다. ch3B6가 IC50 값 0.2 ug/mL (1.3 nM)을 갖는 수용체에 대한 FGF19 결합을 효율적으로 억제하는 것을 확인하는 동안에, ab41948는 완전히 불활성인 결과를 가져왔다.
마지막으로, ab41948 항체는 ch3B6와 함께 민감성 HCC 세포주 Huh7에서 FGFR4 신호전달 경로 활성화에 간섭하는 이들의 능력에 대해서 평가되었다. 이 목적을 위하여, FGF19로 세포 처리하여 유도된 하류 이펙터 단백질 FRS2의 인산화에 대한 억제 효과는 웨스턴 블록에 의해 분석되었다(도 31c).
ch3B6에 대조적으로, ab41948는 Huh7 세포에서 FGF19-유도된 FRS2 인산화를 억제할 수 없다는 결과를 얻었다.
결과적으로, 핵심(key) 기능적 분석법으로 ab41948 항체로 보여진 생물학적 활성의 결핍을 기초로, 2개 항체는 FGFR4 산박스 영역 내에서 동일한 에피토프에 결합하지 않는다고 결론을 낼 수 있다.
실시예 14
대장 CSC-유래 이종이식 모델에서 ch3B6 항-종양 활성
우리는 면역결핍성 마우스에서 대장 CSC의 주사로 제조된 피하 종양에 대한 항체 ch3B6의 효과를 분석하였다.
CTSC85 세포를 차가운 PBS에 재현탁시키고 상기 현탁액을 최종 세포 농도 5x106 세포/mL로 등가 부피의 차가운 Matrigel (Becton Dickinson)과 혼합하였다. 26 마리 NOD/SCID 마우스 (Charles River)에 0.2 mL의 세포/Matrigel 현탁액을 피하로 주입하였다. 접종 3주 후, 측정가능한 종양을 나타내는 마우스는 무작위적으로 2개 치료 집단(n=9), 즉 FGFR4 항체 ch3B6 및 비이클 대조군 집단으로 배정하였고, 평균 종양 부피는 각 집단에서 65 mm3 이었다.
마우스는 PBS 중 25 mg/Kg의 ch3B6 항체를 IP 주사하여 처리하고, 2주 동안 1주일에 2번 투여하였다. 상기 대조군은 대응하는 부피로 블랭크 주사(PBS)를 받았다. 마우스 체중은 1주일에 2번 제어되고 종양 크기(주축 및 종축)은 비니어 캘리퍼스로 1주일에 2번 측정되었다. 종양 부피는 다음 식을 사용하여 계산되었다: TV (mm3) = d2xD/2 d 및 D는 각각 가장 짧은 직경 및 가장 긴 직경을 의미한다.
비이클-처리된 대조군에 비하여, ch3B6는 종양의 성장율을 크게 감소시켰다(도 32). 체중 손실이나 임상적 부작용은 치료 동안 관찰되지 않았다.
실시예 15
대장 CSC-유래 간 전이 모델에서 ch3B6 및 ch6C9 항-종양 활성
우리는 면역결핍성 마우스의 간에서 대장 CSC의 주사로 생성된 간 전이에 대한 항체 ch3B6 및 ch6C9의 효과를 분석하였다.
이 목적을 위하여 리포터 CTSC85 LUC-GFP 세포주가 사용되었다. CTSC85 LUC-GFP 세포는 pRRLsin-cPPT-hCMV-hPGK-GFP-Wpre 벡터(Ricci-Vitiani et al., 2004)를 사용하는 렌티바이러스 감염으로 생성되었다. 루시퍼라아제 cDNA를 GFP 렌티바이러스 벡터(Ricci-Vitiani et al., 2004) 내로 클론하였다. 렌티바이러스 입자는 이전에 설명한 것처럼, 포장 인간 배아 신장 세포주 293T에서 칼슘 포스페이트 감염 프로토콜에 의해 제조되었다(Ricci-Vitiani et al., 2004). 바이러스 상청액은 감염 후 48h에 수집되었고 0.45 mm 기공 크기 필터를 통해 여과하고 8 ㎍/ml 폴리브렌의 존재하에서 세포에 첨가되었다. 세포를 1800rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 주사 후, 도입된 세포의 형광을 FACSCanto (Becton Dickinson)으로 평가하였다.
CTSC85 LUC-GFP 세포를 차가운 PBS 내로 재현탁시키고 현탁액을 최종 세포 농도 1.25x107 세포/mL으로 등가 부피의 차가운 Matrigel (Becton Dickinson)과 혼합하였다. 20 ㎕의 세포/Matrigel 현탁액 (250000 세포)을 30마리 NOD/SCID 마우스 (Charles River) 각각의 간 유조직(parenchyma) 내로 주사하였다. 종양 성장은 IVIS Spectrum imager (PerkinElmer)을 사용하는 루시퍼라아제-표지된 암 세포의 생물발광 이미징에 의해 모니터링되었다. 이식 후 10일에 마우스를 무작위적으로 3개 집단(n=7), 즉 ch3B6, ch6C9 및 대조군 집단에 배정하였고, 모든 집단에서 유사한 평균 광자/2차 값을 갖는다. 마우스는 PBS 중 각 항체를 25 mg/Kg으로 하여 IP 주사로 처리하고 4주 동안 1주일에 2번 투여하였다. 대조군 집단은 대응하는 부피의 블랭크 주사(PBS)를 받았다. 마우스 체중 및 종양 성장은 1주일에 1번 측정되었다. 처리된 마우스는 종양 신호 및 체중의 측정을 제외하고는 추가 처리 없이 2주까지 유지되었고 경추탈골법(cervical dislocation)으로 희생되었다.
비이클-처리된 대조군에 비하여, ch3B6 및 ch6C9 둘 다는 종양의 성장율을 줄일 수 있었다(도 33). 특히 ch3B6에 의해 보여진 항-종양 효과는 통계적으로 중요할 정도이다.
체중 손실이나 임상적 부작용은 치료 동안 관찰되지 않았다.
참고문헌
· Abbass SA, Asa SL, Ezzat S. (1997) Altered expression of fibroblast growth factor receptors in human pituitary adenomas. J Clin Endocrinol Metab. 82, 1160-1166
· Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A, Morrison SJ, Clarke MF. (2003) Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100, 3983-3988
· American Cancer Society: Colorectal Cancer Facts and Figures: 2017-2019. http://www.cancer.org/Research/Cancer-Facts-statistics/Colorectal-CancerFactsFigures/colorectal-cancer-facts-figures-2017-2019
· Andre F, Cortes J. (2015) Rationale for targeting fibroblast growth factor receptor signalling in breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 150, 1-8
· Arnold M, Sierra MS, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, Bray F. (2017) Global patterns and trends in colorectal cancer incidence and mortality. Gut 66, 683-691
· Baiocchi M, Biffoni M, Ricci-Vitiani L, Pilozzi E, De Maria R. (2010) New models for cancer research: human cancer stem cell xenografts. Curr Opin Pharmacol. 10, 380-384.
· Bao S, Wu Q, McLendon RE, Hao Y, Shi Q, Hjelmeland AB, Dewhirst MW, Bigner DD, Rich JN. (2006) Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature 444, 756-760
· Barker N, van Es JH, Kuipers J, Kujala P, van den Born M, Cozijnsen M, Haegebarth A, Korving J, Begthel H, Peters PJ, Clevers H. (2007) Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature 449, 1003-1007
· Bartz R, Fukuchi K, Lange T, Gruner K, Ohtsuka T, Watanabe I, Hayashi S, Redondo-Muller M, Takahashi M, Agatsuma T, Bange J, Abraham R. (2016) Abstract 3852: U3-1784, a human anti-FGFR4 antibody for the treatment of cancer. In: Proceedings of the 107th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; 2016 Apr 16-20; New Orleans, LA. Philadelphia (PA): AACR; Cancer Res 2016; 76(14 Suppl): Abstract nr 3852
· Beenken A, Mohammadi M. (2009) The FGF family: biology, pathophysiology and therapy. Nat Rev Drug Discov. 8, 235-253
· Bonnet D, Dick JE (1997) Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Med. 3,730-737
· Brittan M, Wright NA. (2004). The gastrointestinal stem cell. Cell Prolif. 37, 35-53
· Bruix J, Sherman M. (2005) Management of hepatocellular carcinoma. Hepatology 42, 1208-1236
· Bumbaca D, Wong A, Drake E, Arthur E. Reyes II AE, Lin BC, Stephan J-P, Desnoyers L, Ben-Quan Shen B-Q, Dennis MS. (2011) Highly specific off-target binding identified and eliminated during the humanization of an antibody against FGF receptor 4. mAbs 3, 376-386
· Chen C, Wang G. (2015) Mechanisms of hepatocellular carcinoma and challenges and opportunities for molecular targeted therapy. World J Hepatol. 7, 1964-1970
· Chen H, Shen DP, Zhang Z-Z, Liu J-H, Shen Y-Y, Ni X-Z. (2015) Fibroblast growth factor receptor 4 protein expression and clinicopathological features in gastric cancer. World J Gastroenterol. 21, 1838-1844
· Chiang JY. (2009) Bile acids: regulation of synthesis. J Lipid Res. 50, 1955-1966
· Cho SH, Hong CS, Kim HN, Shin MH, Kim KR, Shim HJ, Hwang JE, Bae WK, Chung IJ. (2016) FGFR4 Arg388 is Correlated with Poor Survival in Resected Colon Cancer Promoting Epithelial to Mesenchymal Transition. Cancer Res Treat. Nov 9. doi: 10.4143/crt.2016.457.
· Crose LE, Etheridge KT, Chen C, Belyea B, Talbot LJ, Bentley RC, Linardic CM. (2012) FGFR4 blockade exerts distinct antitumorigenic effects in human embryonal versus alveolar rhabdomyosarcoma. Clin Cancer Res. 18, 3780-3790
· Dalerba P, Dylla SJ, Park IK, Liu R, Wang X, Cho RW, Hoey T, Gurney A, Huang EH, Simeone DM, Shelton AA, Parmiani G, Castelli C, Clarke MF. (2007) Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 10158-10163
Desnoyers LR, Pai R, Ferrando RE, Hotzel K, Le T, Ross J, Carano R, D'Souza A, Qing J, Mohtashemi I, Ashk· Ashkenazi A, French DM (2008) Targeting FGF19 inhibits tumor growth in colon cancer xenograft and FGF19 transgenic hepatocellular carcinoma models. Oncogene 27, 85-97
· Diehn M, Cho RW, Lobo NA, Kalisky T, Dorie MJ, Kulp AN, Qian D, Lam JS, Ailles LE, Wong M, Joshua B, Kaplan MJ, Wapnir I, Dirbas FM, Somlo G, Garberoglio C, Paz B, Shen J, Lau SK, Quake SR, Brown JM, Weissman IL, Clarke MF. (2009) Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature 458, 780-783
· Dienstmann R, Rodon J, Prat A, Perez-Garcia J, Adamo B, Felip E, Cortes J, Iafrate AJ, Nuciforo P, Tabernero J. (2014) Genomic aberrations in the FGFR pathway: opportunities for targeted therapies in solid tumors. Ann Oncol. 25, 552-563
· El-Serag HB, Rudolph KL. (2007) Hepatocellular carcinoma: epidemiology and molecular carcinogenesis. Gastroenterology 132, 2557-2576
· Enguita-Germαn M, Fortes P. (2014) Targeting the insulin-like growth factor pathway in hepatocellular carcinoma. World J Hepatol. 6, 716-737
· Ferlay J., Soerjomataram I, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, Parkin DM, Forman D, Bray F. (2015) Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN. Int. J. Cancer. 136, E359-E386
· Feng S, Shao L, Yu W, Gavine P, Ittmann M. (2012) Targeting fibroblast growth factor receptor signalling inhibits prostate cancer progression. Clin Cancer Res . 18, 3880-3888.
· Fong Y, Kemeny N, Lawrence T. Cancer of the Liver and Biliary Tree. (2001) In: DeVita V, Hellman S, Rosenberg S, editors. Cancer: Principles & Practice of Oncology, pp.1162-1199. Lippincott, Williams & Wilkins
· French DM, Lin BC, Wang M, Adams C, Shek T, Hφtzel K, Bolon B, Ferrando R, Blackmore C, Schroeder K, Rodriguez LA, Hristopoulos M, Venook R, Ashkenazi A, Desnoyers LR. (2012) Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models. PLoS One. 7:e36713
· Frullanti E, Berking C, Harbeck N, Jιzιquel P, Haugen A, Mawrin C, Parise O Jr, Sasaki H, Tsuchiya N, Dragani TA. (2011) Meta and pooled analyses of FGFR4 Gly388Arg polymorphism as a cancer prognostic factor. Eur J Cancer Prev. 20, 340-347.
· Goetz R, Mohammadi M. (2013) Exploring mechanisms of FGF signalling through the lens of structural biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 166-180
· Gregorieff A, Clevers H. (2005) Wnt signalling in the intestinal epithelium: from endoderm to cancer. Genes Dev. 19, 877-890
· Hagel M, Miduturu C, Sheets M, Rubin N, Weng W, Stransky N, Bifulco N, Kim JL, Hodous B, Brooijmans N, Shutes A, Winter C, Lengauer C, Kohl NE, Guzi T. (2015) First Selective Small Molecule Inhibitor of FGFR4 for the Treatment of Hepatocellular Carcinomas with an Activated FGFR4 Signalling Pathway. Cancer Discov. 5, 424-437
· Hierro C, Rodon J, Tabernero J. (2015) Fibroblast Growth Factor (FGF) Receptor/FGF Inhibitors: Novel Targets and Strategies for Optimization of Response of Solid Tumors. Semin Oncol. 42, 801-819
Ho HK, Pok S, Streit S, Ruhe JE, Hart S, Lim KS, Loo HL, Aung MO, Lim SG, Ullrich A. (2009) Fibroblast growth ·factor receptor 4 regulates proliferation, anti-apoptosis and alpha-fetoprotein secretion during hepatocellular carcinoma progression and represents a potential target for therapeutic intervention. J Hepatol. 50, 118-127
· Hoofnagle JH. (2004) Hepatocellular carcinoma: summary and recommendations. Gastroenterology 127, S319-S323
· Hopfner M, Schuppan D, Scherubl H. (2008) Growth factor receptors and related signalling pathways as targets for novel treatment strategies of hepatocellular cancer. World J Gastroenterol. 14, 1-14
· Huang EH, Hynes MJ, Zhang T, Ginestier C, Dontu G, Appelman H, Fields JZ, Wicha MS, Boman BM. (2009) Colon cancer stem cells hydrogenase 1 is a marker for normal and malignant human colonic stem cells (SC) and tracks SC overpopulation during colon tumorigenesis. Cancer Res. 69, 3382-3389
· Huang HP, Feng H1, Qiao HB1, Ren ZX1, Zhu GD1. (2015) The prognostic significance of fibroblast growth factor receptor 4 in non-small-cell lung cancer. Onco Targets Ther. 8, 1157-1164.
· Igawa T, Tsunoda H, Kuramochi T, Sampei Z, Ishii S, Hattori K. MAbs. 2011 May-Jun;3(3):243-52. Engineering the variable region of therapeutic IgG antibodies.
· Inagaki T, Choi M, Moschetta A, Peng L, Cummins CL, McDonald JG, Luo G, Jones, SA, Goodwin B, Richardson JA, et al. (2005). Fibroblast growth factor 15 functions as an enterohepatic signal to regulate bile acid homeostasis. Cell Metab. 2, 217-225
· Ito S, Fujimori T, Furuya A, Satoh J, and Nabeshima Y. (2005) Impaired negative feedback suppression of bile acid synthesis in mice lacking betaKlotho. J. Clin. Invest. 115, 2202-2208
· Kalinina J, Dutta K, Ilghari D, Beenken A, Goetz R, Eliseenkova AV, Cowburn D, Mohammadi M. (2012) The alternatively spliced acid box region plays a key role in FGF receptor autoinhibition. Structure 20, 77-88
· Kan M, Wu X, Wang F, McKeehan WL. (1999) Specificity for Fibroblast Growth Factors Determined by Heparan Sulfate in a Binary Complex with the Receptor Kinase. J. Biol Chem. 274, 15947-15952
· Katoh M, Nakagama H. (2014). FGF receptors: cancer biology and therapeutics. Med Res Rev. 34, 280-300
· Lapidot T, C. Sirard C, Vormoor J, Murdoch B, Hoang T, Caceres-Cortes J, Minden M, Paterson B, Caligiuri MA, Dick JE. (1994) A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature 367, 645-648
· Li CS, Zhang SX, Liu HJ, Shi YL, Li LP, Guo XB, Zhang ZH. (2014) Fibroblast growth factor receptor 4 as a potential prognostic and therapeutic marker in colorectal cancer. Biomarkers 19, 81-85
· Lin BC, Wang M, Blackmore C, Desnoyers LR. (2007) Liver-specific activities of FGF19 require Klotho beta. J Biol Chem 282: 27277-27284
· Lin BC, Desnoyers LR. (2012) FGF19 and cancer. Adv Exp Med Biol. 728, 183-194
· Liu R, Li J, Xie K, Zhang T, Lei Y, Chen Y, Zhang L, Huang K, Wang K, Wu H, Wu M, Nice EC, Huang C, Wei Y. (2013) FGFR4 promotes stroma-induced epithelial-to-mesenchymal transition in colorectal cancer. Cancer Res. 73, 5926-5935
· Llovet JM, Villanueva A, Lachenmayer A, et al. Advances in targeted therapies for hepatocellular carcinoma in the genomic era (2015) Nat Rev Clin Oncol. 12: 408-424
· Maugeri-Sacca M, Vigneri P, De Maria R. (2011) Cancer Stem Cells and Chemosensitivity. Clin Cancer Res. 17:4942-4947
· Olsen SK, Ibrahimi OA, Raucci A, Zhang F, Eliseenkova AV, Yayon A, Basilico C, Robert J. Linhardt RJ, Schlessinger J, and Moosa Mohammadi M. (2004) Insights into the molecular basis for fibroblast growth factor receptor autoinhibition and ligand-binding promiscuity PNAS 101: 935-940
· Onwuazor ON, Wen XY, Wang DY, Zhuang L, Masih-Khan E, Claudio J, Barlogie, B, Shaughnessy JD Jr, and Stewart AK (2003) Mutation, SNP, and isoform analysis of fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) in 150 newly diagnosed multiple myeloma patients. Blood 102: 772-773.
· Pai R, Dunlap D, Qing J, Mohtashemi I, Hotzel K, French DM. (2008) Inhibition of fibroblast growth factor 19 reduces tumor growth by modulating beta-catenin signalling. Cancer Res. 68:5086-5095
· Pai R, French D, Ma N, Hotzel K, Plise E, Salphati L, Setchell KDR, Ware J, Lauriault V, Schutt L, Hartley D, Dambach, D. (2012) Antibody-Mediated Inhibition of Fibroblast Growth Factor 19 Results in Increased Bile Acids Synthesis and Ileal Malabsorption of Bile Acids in Cynomolgus Monkeys. Toxicol Sci 126: 446-456
· Pelaez-Garc
Figure 112020019445964-pct00024
a A, Barderas R, Torres S, Hernαndez-Varas P, Teixidσ J, Bonilla F, de Herreros AG, Casal JI. (2013) FGFR4 role in epithelial-mesenchymal transition and its therapeutic value in colorectal cancer. PLoS One. 8(5): e63695
· Reya T, Morrison S J, Clarke M F, Weissman IL. (2001) Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature 　414, 105-111
· Ricci-Vitiani L, Lombardi DG, Pilozzi E, Biffoni M, Todaro M, Peschle C, De Maria R (2007) Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature 445,111-115
· Ricci-Vitiani L,　Pedini F,　Mollinari C,　Condorelli G,　Bonci D,　Bez A,　Colombo A,　Parati E,　Peschle C,　De Maria R. (2004) Absence of caspase 8 and high expression of PED protect primitive neural cells from cell death. J Exp Med. 200, 1257-1266.
· Roidl A, Berger HJ, Kumar S, Bange J, Knyazev P, Ullrich A. (2009) Resistance to chemotherapy is associated with fibroblast growth factor receptor 4 up-regulation. Clin Cancer Res. 15, 2058-2066
· Roidl A, Foo P, Wong W, Mann C, Bechtold S, Berger HJ, Streit S, Ruhe JE, Hart S, Ullrich A, Ho HK. (2010) The FGFR4 Y367C mutant is a dominant oncogene in MDA-MB453 breast cancer cells. Oncogene 29, 1543-1552
· Sahadevan K, Darby S, Leung HY, Mathers ME, Robson CN, Gnanapragasam VJ. (2007) Selective over-expression of fibroblast growth factor receptors 1 and 4 in clinical prostate cancer. J Pathol. 213, 82-90
· Shmelkov SV, Butler JM, Hooper AT, Hormigo A, Kushner J, Milde T, St Clair R, Baljevic M, White I, Jin DK, Chadburn A, Murphy AJ, Valenzuela DM, Gale NW, Thurston G, Yancopoulos GD, D'Angelica M, Kemeny N, Lyden D, Rafii S. (2008) CD133 expression is not restricted to stem cells, and both CD133+ and CD133- metastatic colon cancer cells initiate tumors. J. Clin. Invest. 118, 2111-2120
· Signore M, Buccarelli M, Pilozzi E, De Luca G, Cappellari M, Maurizio Fanciulli M, Frauke Goeman F, Melucci E, Biffoni M, Ricci-Vitiani L. (2016) UCN-01 enhances cytotoxicity of irinotecan in colorectal cancer stem-like cells by impairing DNA damage response. Oncotarget. 7, 44113-44128.
· Singh SK, Clarke ID, Terasaki M, Bonn VE, Hawkins C, Squire J, Dirks PB. (2003) Identification of a cancer stem cell in human brain tumors Cancer Res. 63, 5821-5828
· Spinola M, Leoni VP, Tanuma J, Pettinicchio A, Frattini M, Signoroni S, Agresti R, Giovanazzi R, Pilotti S, Bertario L, Ravagnani F, Dragani TA. (2005a) FGFR4 Gly388Arg polymorphism and prognosis of breast and colorectal cancer. Oncol Rep. 14, 415-419
· Spinola M, Leoni V, Pignatiello C, Conti B, Ravagnani F, Pastorino U, Dragani TA. (2005b) Functional FGFR4 Gly388Arg polymorphism predicts prognosis in lung adenocarcinoma patients. J Clin Oncol. 23, 7307-7311
· Streit S, Bange J, Fichtner A, Ihrler S, Issing W, Ullrich A. (2004) Involvement of the FGFR4 Arg388 allele in head and neck squamous cell carcinoma. Int J Cancer 111, 213-217
· Taylor JG, Cheuk AT, Tsang PS, Chung JY, Song YK, Desai K, Yu Y, Chen QR, Shah K, Youngblood V, Fang J, Kim SY, Yeung C, Helman LJ, Mendoza A, Ngo V, Staudt LM, Wei JS, Khanna C, Catchpoole D, Qualman SJ, Hewitt SM, Merlino G, Chanock SJ, Khan J. (2009) Identification of FGFR4-activating mutations in human rhabdomyosarcomas that promote metastasis in xenotransplanted models. J Clin Invest. 119, 3395-3407
· Thorgeirsson SS, Grisham JW. (2002) Molecular pathogenesis of human hepatocellular carcinoma. Nature Genet. 31, 339-346
· Todaro M, Gaggianesi M, Catalano V, Benfante A, Iovino F, Biffoni M, Apuzzo T, Sperduti I, Volpe S, Cocorullo G, Gulotta G, Dieli F, De Maria R, Stassi G (2014) CD44v6 Is a Marker of Constitutive and Reprogrammed Cancer Stem Cells Driving Colon Cancer Metastasis. Cell Stem Cell 14, 342-356
· Todaro M, Alea MP, Di Stefano AB, Cammareri P, Vermeulen L, Iovino F, Tripodo C, Russo A, Gulotta G, Medema JP, Stassi G. (2007) Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell. 1, 389-402
· Trovato FM, Tognarelli JM, Crossey MM, , Catalano D, Taylor-Robinson SD, Trovato GM. (2015) Challenges of liver cancer: Future emerging tools in imaging and urinary biomarkers. World J Hepatol. 7, 2664-2675
· Turkington RC, Longley DB, Allen WL, Stevenson L, McLaughlin K, Dunne PD, Blayney JK, Salto-Tellez M, Van Schaeybroeck S, Johnston PG. (2014) Fibroblast growth factor receptor 4 (FGFR4): a targetable regulator of drug resistance in colorectal cancer. Cell Death Dis. 5:e1046
· Uriarte I, Latasa MU, Carotti S, Fernandez-Barrena MG, Garcia-Irigoyen O, Elizalde M, Urtasun R, Vespasiani-Gentilucci U, Morini S, de Mingo A, Mari M, Corrales FJ, Prieto J, Berasain C, Avila MA. (2015) Ileal FGF15 contributes to fibrosis-associated hepatocellular carcinoma development. Int J Cancer. 136, 2469-2475
· Valent P, Bonnet D, De Maria R, Lapidot T, Copland M, Melo JV, Chomienne C, Ishikawa F, Schuringa JJ, Stassi G, Huntly B, Herrmann H, Soulier J, Roesch A, Schuurhuis GJ, Wφhrer S, Arock M, Zuber J, Cerny-Reiterer S, Johnsen HE, Andreeff M, Eaves C. (2012) Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nat Rev Cancer. 12, 767-75
· van der Flier LG, Haegebarth A, Stange DE, van de Wetering M, Clevers H. (2009) OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology 137, 15-17
· Worns MA, Galle PR. (2014) HCC therapies-lessons learned. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 447-452
· Wu X, Ge H, Lemon B, Vonderfecht S, Weiszmann J, Hecht R, Gupte J, Hager T, Wang Z, Lindberg R, Li Y. (2010) FGF19-induced hepatocyte proliferation is mediated through FGFR4 activation. J Biol Chem. 285, 5165-5170
· Wu X, Li Y. (2012) Understanding the structure-function relationship between FGF19 and its mitogenic and metabolic activities. Adv Exp Med Biol. 728, 195-213
· Xie, M. H., Holcomb, I., Deuel, B., Dowd, P., Huang, A., Vagts, A., Foster, J.,Liang, J., Brush, J., Gu, Q., et al. (1999) FGF-19, a novel fibroblast growth factor with unique specificity for FGFR4. Cytokine 11, 729-735
· Xu B, Tong N, Chen SQ, Hua LX, Wang ZJ, Zhang ZD, Chen M. (2011) FGFR4 Gly388Arg polymorphism contributes to prostate cancer development and progression: a meta-analysis of 2618 cases and 2305 controls. BMC Cancer Feb 24; 11:84
· Yang Y, Zhou Y, Lu M, An Y, Li R, Chen Y, Lu DR, Jin L, Zhou WP, Qian J, Wang HY. (2012) Association between fibroblast growth factor receptor 4 polymorphisms and risk of hepatocellular carcinoma. Mol Carcinog. 51, 515-521.
· Ye YW, Hu S, Shi YQ, Zhang XF, Zhou Y, Zhao CL, Wang GJ, Wen JG, Zong H. (2013) Combination of the FGFR4 inhibitor PD173074 and 5-fluorouracil reduces proliferation and promotes apoptosis in gastric cancer. Oncol Rep. 30, 2777-2784
· Yoshida K, Murata M, Yamaguchi T, Matsuzaki K. (2014) TGF-beta/Smad signalling during hepatic fibro-carcinogenesis. Int J Oncol. 45, 1363-1371
· Yu C, Wang F, Kan M, Jin C, Jones RB, Weinstein M, Deng CX, McKeehan WL. (2000) Elevated cholesterol metabolism and bile acid synthesis in mice lacking membrane tyrosine kinase receptor FGFR4. J. Biol. Chem. 275, 15482-15489
· Yu W, Feng S, Dakhova O, Creighton CJ, Cai Y, Wang J, Li R, Frolov A, Ayala G, Ittmann M. (2011) FGFR4 Arg³8*?* enhances prostate cancer progression via extracellular signal-related kinase and serum response factor signalling. Clin Cancer Res. 17, 4355-4366
· Zaid TM, Yeung TL, Thompson MS, Leung CS, Harding T, Co NN, Schmandt RS, Kwan SY, Rodriguez-Aguay C, Lopez-Berestein G, Sood AK, Wong KK, Birrer MJ, Mok SC. (2013) Identification of FGFR4 as a potential therapeutic target for advanced-stage, high-grade serous ovarian cancer. Clin Cancer Res. 19, 809-820
· Zeuner A,Todaro M, Stassi G, De Maria, R. (2014) Colorectal cancer stem cells: From the crypt to the clinic. Cell Stem Cell 15, 692-705
· Zhang X, Ibrahimi OA, SK, Umemori H, Mohammadi M, David M. Ornitz DM. (2006) Receptor Specificity of the Fibroblast Growth Factor Family. J. Biol. Chem. 281, 15694-15700.
· Zhou SK, Schuetz JD, Bunting KD, Colapietro A-M, Sampath J, Morris JJ, Lagutina I, Grosveld GC, Osawa M, Nakauchi H, Sorrentino BP. (2001) The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Med. 7, 1028-1034
<110> EXIRIS S.R.L. <120> MONOCLONAL ANTIBODY ANTI-FGFR4 <130> IP2035IT <150> EP 17186454.9 <151> 2017-08-16 <160> 102 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asn Pro Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Ser Ala Lys Ser Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Phe Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Tyr Asn Asn Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asn Pro Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Tyr Asn Asn Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Asn Pro Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Tyr Asn Asn Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asn Pro Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Ser Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Tyr Asn Asn Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note+"Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 5 Asn Tyr Tyr Met Ala 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note+"Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 6 Asn Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note+"Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 7 Thr Ile Asn Pro Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note+"Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 8 Asn Ile Asn Pro Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note+"Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 9 Leu Tyr Asn Asn Tyr Ala Phe Asp Tyr 1 5 <210> 10 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 10 Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Arg Val Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Thr Leu Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Gly Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp 65 70 75 80 Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Trp Asn Asp Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys 100 105 <210> 11 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 11 Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Arg Val Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Thr Leu Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Gly Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp 65 70 75 80 Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Trp Asn Asp Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 12 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 12 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Leu 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Asn Asp Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 13 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 13 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Thr Leu 20 25 30 Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Asn Asp Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note+"Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 14 Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Thr Leu Met His 1 5 10 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note+"Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 15 Arg Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Leu Leu His 1 5 10 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note+"Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 16 Gly Thr Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note+"Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 17 Gln Gln Ser Trp Asn Asp Pro Pro Thr 1 5 <210> 18 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 18 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctagtgcagc ctggaaggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctcaggatt cactttcagt aattattaca tggcctgggt ccgccaggct 120 ccaaagaagg gtctggagtg ggtcgcaacc attaatccca gtggtaccag aacttactat 180 ccagactccg tgaaaggccg attcactctc tccagagata gtgcaaagag cagcctatat 240 ctgcaaatga acagtctgaa gtctgaggac acggccactt tttactgtgc aaggctttat 300 aacaactacg cttttgatta ctggggccag ggagtcatgg tcacagtctc ctca 354 <210> 19 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 19 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctagtgcagc ctggaaggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctcaggatt cactttcagt aattattaca tggcctgggt ccgccaggct 120 ccaaagaagg gtctggagtg ggtcgcaacc attaatccca gtggtaccag aacttactat 180 ccagactccg tgaaaggccg attcactctc tccagagata gtgcaaagag cagcctatat 240 ctgcaaatga acagtctgaa gtctgaggac acggccactt tttactgtgc aaggctttat 300 aacaactacg cttttgatta ctggggccaa ggagtcatgg tcactgtctc ctca 354 <210> 20 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 20 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aactattaca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataaacccta gcggaaccag aacctactat 180 ccagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagactgtac 300 aacaattacg cctttgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354 <210> 21 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 21 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aactattaca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaacccta gcggaaccag aacctactat 180 ccagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagactgtac 300 aacaattacg cctttgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354 <210> 22 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 22 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aactattaca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataaacccta gcggaaccag aacctactat 180 ccagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca gcgccaagag ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagactgtac 300 aacaattacg cctttgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354 <210> 23 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 23 gatgtccaga tgacccagtc tcctgctttg gctgtgtctc caggagagag ggtttccatc 60 tcctgtaggg ccagtgaaag tgtcagtaca cttatgcact ggtaccaaca gaaaccagga 120 cagcaaccca aactcctcat ctacggtaca tccaacctag agtctggagt ccctgccagg 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc accctcaaca tagatcctgt ggaggctgat 240 gacactgcaa cctatttctg tcagcagagt tggaatgatc ctccgacgtt cggtggaggc 300 accaagctgg aagtgaaa 318 <210> 24 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 24 gatgtccaga tgacccagtc tcctgctttg gctgtgtctc caggagagag ggtttccatc 60 tcctgtaggg ccagtgaaag tgtcagtaca cttatgcact ggtaccaaca gaaaccagga 120 cagcaaccca aactcctcat ctacggtaca tccaacctag agtctggagt ccctgccagg 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc accctcaaca tagatcctgt ggaggctgat 240 gacactgcaa cctatttctg tcagcagagt tggaatgatc ctccgacgtt cggtggaggc 300 accaagctgg aattgaaa 318 <210> 25 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 25 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtga gagcattagc accctgttac actggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatggc acctccaact tggagagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttggaacg accctcccac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 26 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 26 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtga gagcgtgagc accctgatgc actggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatggc acctccaact tggagagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttggaacg accctcccac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 27 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 27 Asp Glu Asp Pro Lys Ser His Arg Asp Pro Ser Asn Arg His Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Gln Gln Ala Pro Tyr Trp Thr His Pro Gln Arg 20 25 <210> 28 <211> 1392 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 28 atgaatctac ttctgatcct tacctttgtt gcggccgctg ttgcggaggt gcagctggtg 60 gagtctgggg gaggcctagt gcagcctgga aggtccctga aactctcctg tgcagcctca 120 ggattcactt tcagtaatta ttacatggcc tgggtccgcc aggctccaaa gaagggtctg 180 gagtgggtcg caaccattaa tcccagtggt accagaactt actatccaga ctccgtgaaa 240 ggccgattca ctctctccag agatagtgca aagagcagcc tatatctgca aatgaacagt 300 ctgaagtctg aggacacggc cactttttac tgtgcaaggc tttataacaa ctacgctttt 360 gattactggg gccaaggagt catggtcact gtctcctcag cgtcgaccaa gggcccatcg 420 gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 480 ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 540 agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 600 gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 660 aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 720 acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgcgaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaat ga 1392 <210> 29 <211> 1392 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 29 atgaatctac ttctgatcct tacctttgtt gcggccgctg ttgcggaggt gcagctggtg 60 gagtctgggg gaggcttggt ccagcctggg gggtccctga gactctcctg tgcagcctct 120 ggattcacct ttagtaacta ttacatgagc tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg 180 gagtgggtgg ccaccataaa ccctagcgga accagaacct actatccaga ctctgtgaag 240 ggccgattca ccatctccag agacaacgcc aagaactcac tgtatctgca aatgaacagc 300 ctgagagccg aggacacggc tgtgtattac tgtgcgagac tgtacaacaa ttacgccttt 360 gactactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag cgtcgaccaa gggcccatcg 420 gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 480 ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 540 agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 600 gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 660 aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 720 acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgcgaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaat ga 1392 <210> 30 <211> 1392 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 30 atgaatctac ttctgatcct tacctttgtt gcggccgctg ttgcggaggt gcagctggtg 60 gagtctgggg gaggcttggt ccagcctggg gggtccctga gactctcctg tgcagcctct 120 ggattcacct ttagtaacta ttacatgagc tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg 180 gagtgggtgg ccaacataaa ccctagcgga accagaacct actatccaga ctctgtgaag 240 ggccgattca ccatctccag agacaacgcc aagaactcac tgtatctgca aatgaacagc 300 ctgagagccg aggacacggc tgtgtattac tgtgcgagac tgtacaacaa ttacgccttt 360 gactactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag cgtcgaccaa gggcccatcg 420 gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 480 ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 540 agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 600 gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 660 aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 720 acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgcgaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaat ga 1392 <210> 31 <211> 1392 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 31 atgaatctac ttctgatcct tacctttgtt gcggccgctg ttgcggaggt gcagctggtg 60 gagtctgggg gaggcttggt ccagcctggg gggtccctga gactctcctg tgcagcctct 120 ggattcacct ttagtaacta ttacatgagc tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg 180 gagtgggtgg ccaccataaa ccctagcgga accagaacct actatccaga ctctgtgaag 240 ggccgattca ccatctccag agacagcgcc aagagctcac tgtatctgca aatgaacagc 300 ctgagagccg aggacacggc tgtgtattac tgtgcgagac tgtacaacaa ttacgccttt 360 gactactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag cgtcgaccaa gggcccatcg 420 gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 480 ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 540 agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 600 gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 660 aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 720 acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgcgaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaat ga 1392 <210> 32 <211> 687 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 32 atgaatctac ttctgatcct tacctttgtt gcggccgctg ttgcggatgt ccagatgacc 60 cagtctcctg ctttggctgt gtctccagga gagagggttt ccatctcctg tagggccagt 120 gaaagtgtca gtacacttat gcactggtac caacagaaac caggacagca acccaaactc 180 ctcatctacg gtacatccaa cctagagtct ggagtccctg ccaggttcag tggcagtggg 240 tctgggacag acttcaccct caacatagat cctgtggagg ctgatgacac tgcaacctat 300 ttctgtcagc agagttggaa tgatcctccg acgttcggtg gaggcaccaa gctggaattg 360 aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa 420 tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta 480 cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag 540 gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa agcagactac 600 gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca 660 aagagcttca acaggggaga gtgttga 687 <210> 33 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 33 atgaatctac ttctgatcct tacctttgtt gcggccgctg ttgcggacat ccagatgacc 60 cagtctccat cctccctgtc tgcatctgta ggagacagag tcaccatcac ttgccgggca 120 agtgagagca ttagcaccct gttacactgg tatcagcaga aaccagggaa agcccctaag 180 ctcctgatct atggcacctc caacttggag agtggggtcc catcaaggtt cagtggcagt 240 ggatctggga cagatttcac tctcaccatc agcagtctgc aacctgaaga ttttgcaact 300 tactactgtc aacagagttg gaacgaccct cccactttcg gcggagggac caaggtggag 360 atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg 420 aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa 480 gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag 540 caggacagca aggacagcac ctacagcctc agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac 600 tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc 660 acaaagagct tcaacagggg agagtgttga 690 <210> 34 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 34 atgaatctac ttctgatcct tacctttgtt gcggccgctg ttgcggacat ccagatgacc 60 cagtctccat cctccctgtc tgcatctgta ggagacagag tcaccatcac ttgccgggca 120 agtgagagcg tgagcaccct gatgcactgg tatcagcaga aaccagggaa agcccctaag 180 ctcctgatct atggcacctc caacttggag agtggggtcc catcaaggtt cagtggcagt 240 ggatctggga cagatttcac tctcaccatc agcagtctgc aacctgaaga ttttgcaact 300 tactactgtc aacagagttg gaacgaccct cccactttcg gcggagggac caaggtggag 360 atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg 420 aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa 480 gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag 540 caggacagca aggacagcac ctacagcctc agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac 600 tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc 660 acaaagagct tcaacagggg agagtgttga 690 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 35 Ala Pro Tyr Trp Thr His Pro Gln Arg Met Glu Lys Lys Leu His 1 5 10 15 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 36 Thr His Pro Gln Arg Met Glu Lys Lys Leu His Ala Val Pro Ala 1 5 10 15 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 37 Arg Met Glu Lys Lys Leu His Ala Val Pro Ala Gly Asn Thr Val 1 5 10 15 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 38 Lys Leu His Ala Val Pro Ala Gly Asn Thr Val Lys Phe Arg Cys 1 5 10 15 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 39 Val Pro Ala Gly Asn Thr Val Lys Phe Arg Cys Pro Ala Ala Gly 1 5 10 15 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 40 Asn Thr Val Lys Phe Arg Cys Pro Ala Ala Gly Asn Pro Thr Pro 1 5 10 15 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 41 Phe Arg Cys Pro Ala Ala Gly Asn Pro Thr Pro Thr Ile Arg Trp 1 5 10 15 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 42 Ala Ala Gly Asn Pro Thr Pro Thr Ile Arg Trp Leu Lys Asp Gly 1 5 10 15 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 43 Pro Thr Pro Thr Ile Arg Trp Leu Lys Asp Gly Gln Ala Phe His 1 5 10 15 <210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 44 Ile Arg Trp Leu Lys Asp Gly Gln Ala Phe His Gly Glu Asn Arg 1 5 10 15 <210> 45 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 45 Lys Asp Gly Gln Ala Phe His Gly Glu Asn Arg Ile Gly Gly Ile 1 5 10 15 <210> 46 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 46 Ala Phe His Gly Glu Asn Arg Ile Gly Gly Ile Arg Leu Arg His 1 5 10 15 <210> 47 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 47 Glu Asn Arg Ile Gly Gly Ile Arg Leu Arg His Gln His Trp Ser 1 5 10 15 <210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 48 Gly Gly Ile Arg Leu Arg His Gln His Trp Ser Leu Val Met Glu 1 5 10 15 <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 49 Leu Arg His Gln His Trp Ser Leu Val Met Glu Ser Val Val Pro 1 5 10 15 <210> 50 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 50 His Trp Ser Leu Val Met Glu Ser Val Val Pro Ser Asp Arg Gly 1 5 10 15 <210> 51 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 51 Val Met Glu Ser Val Val Pro Ser Asp Arg Gly Thr Tyr Thr Cys 1 5 10 15 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 52 Val Val Pro Ser Asp Arg Gly Thr Tyr Thr Cys Leu Val Glu Asn 1 5 10 15 <210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 53 Asp Arg Gly Thr Tyr Thr Cys Leu Val Glu Asn Ala Val Gly Ser 1 5 10 15 <210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 54 Tyr Thr Cys Leu Val Glu Asn Ala Val Gly Ser Ile Arg Tyr Asn 1 5 10 15 <210> 55 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 55 Val Glu Asn Ala Val Gly Ser Ile Arg Tyr Asn Tyr Leu Leu Asp 1 5 10 15 <210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 56 Glu Asn Ala Val Gly Ser Ile Arg Tyr Asn Tyr Leu Leu Asp Val 1 5 10 15 <210> 57 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 57 Phe Arg Cys Pro Ala Ala Gly Asn Pro Thr Pro Thr Ile Arg Trp Leu 1 5 10 15 Lys Asp Gly Gln Ala Phe His 20 <210> 58 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 58 Ile Thr Gly Asp Ser Leu Thr Ser Ser Asn Asp Asp Glu Asp Pro 1 5 10 15 <210> 59 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 59 Thr Gly Asp Ser Leu Thr Ser Ser Asn Asp Asp Glu Asp Pro Lys 1 5 10 15 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 60 Gly Asp Ser Leu Thr Ser Ser Asn Asp Asp Glu Asp Pro Lys Ser 1 5 10 15 <210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 61 Asp Ser Leu Thr Ser Ser Asn Asp Asp Glu Asp Pro Lys Ser His 1 5 10 15 <210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 62 Ser Leu Thr Ser Ser Asn Asp Asp Glu Asp Pro Lys Ser His Arg 1 5 10 15 <210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 63 Leu Thr Ser Ser Asn Asp Asp Glu Asp Pro Lys Ser His Arg Asp 1 5 10 15 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 64 Thr Ser Ser Asn Asp Asp Glu Asp Pro Lys Ser His Arg Asp Pro 1 5 10 15 <210> 65 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 65 Ser Ser Asn Asp Asp Glu Asp Pro Lys Ser His Arg Asp Pro Ser 1 5 10 15 <210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 66 Ser Asn Asp Asp Glu Asp Pro Lys Ser His Arg Asp Pro Ser Asn 1 5 10 15 <210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 67 Asn Asp Asp Glu Asp Pro Lys Ser His Arg Asp Pro Ser Asn Arg 1 5 10 15 <210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 68 Asp Asp Glu Asp Pro Lys Ser His Arg Ser Pro Ser Asn Arg His 1 5 10 15 <210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 69 Asp Glu Asp Pro Lys Ser His Arg Asp Pro Ser Asn Arg His Ser 1 5 10 15 <210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 70 Glu Asp Pro Lys Ser His Arg Asp Pro Ser Asn Arg His Ser Tyr 1 5 10 15 <210> 71 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 71 Asp Pro Lys Ser His Arg Asp Pro Ser Asn Arg His Ser Tyr Pro 1 5 10 15 <210> 72 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 72 Pro Lys Ser His Arg Asp Pro Ser Asn Arg His Ser Tyr Pro Gln 1 5 10 15 <210> 73 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 73 Lys Ser His Arg Asp Pro Ser Asn Arg His Ser Tyr Pro Gln Gln 1 5 10 15 <210> 74 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 74 Ser His Arg Asp Pro Ser Asn Arg His Ser Tyr Pro Gln Gln Ala 1 5 10 15 <210> 75 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 75 His Arg Asp Pro Ser Asn Arg His Ser Tyr Pro Gln Gln Ala Pro 1 5 10 15 <210> 76 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 76 Arg Asp Pro Ser Asn Arg His Ser Tyr Pro Gln Gln Ala Pro Tyr 1 5 10 15 <210> 77 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 77 Asp Pro Ser Asn Arg His Ser Tyr Pro Gln Gln Ala Pro Tyr Trp 1 5 10 15 <210> 78 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 78 Pro Ser Asn Arg His Ser Tyr Pro Gln Gln Ala Pro Tyr Trp Thr 1 5 10 15 <210> 79 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 79 Ser Asn Arg His Ser Tyr Pro Gln Gln Ala Pro Tyr Trp Thr His 1 5 10 15 <210> 80 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 80 Asn Arg His Ser Tyr Pro Gln Gln Ala Pro Tyr Trp Thr His Pro 1 5 10 15 <210> 81 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 81 Arg His Ser Tyr Pro Gln Gln Ala Pro Tyr Trp Thr His Pro Gln 1 5 10 15 <210> 82 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 82 His Ser Tyr Pro Gln Gln Ala Pro Tyr Trp Thr His Pro Gln Arg 1 5 10 15 <210> 83 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 83 Ser Tyr Pro Gln Gln Ala Pro Tyr Trp Thr His Pro Gln Arg Met 1 5 10 15 <210> 84 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 84 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asn Pro Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Tyr Asn Asn Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 85 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 85 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asn Pro Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Phe Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Tyr Asn Asn Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 86 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 86 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asn Pro Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Ser Ala Lys Ser Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Phe Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Tyr Asn Asn Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 87 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 87 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asn Pro Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Ser Ala Lys Ser Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Tyr Asn Asn Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 88 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 88 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asn Pro Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Tyr Asn Asn Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 89 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 89 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Leu 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gln Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Trp Asn Asp Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 90 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 90 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Thr Leu 20 25 30 Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gln Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Trp Asn Asp Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 91 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 91 Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Leu 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Trp Asn Asp Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 92 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 92 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aactattaca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataaacccta gcggaaccag aacctactat 180 ccagactctg tgaagggccg attcaccctc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagactgtac 300 aacaattacg cctttgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354 <210> 93 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 93 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aactattaca tggcctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataaacccta gcggaaccag aacctactat 180 ccagactctg tgaagggccg attcaccctc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctacct tctactgtgc gagactgtac 300 aacaattacg cctttgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354 <210> 94 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 94 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aactattaca tggcctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataaacccta gcggaaccag aacctactat 180 ccagactctg tgaagggccg attcaccctc tccagagaca gcgccaagag ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctacct tctactgtgc gagactgtac 300 aacaattacg cctttgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354 <210> 95 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 95 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aactattaca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataaacccta gcggaaccag aacctactat 180 ccagactctg tgaagggccg attcaccctc tccagagaca gcgccaagag ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagactgtac 300 aacaattacg cctttgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354 <210> 96 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 96 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aactattaca tggcctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataaacccta gcggaaccag aacctactat 180 ccagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctacct attactgtgc gagactgtac 300 aacaattacg cctttgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354 <210> 97 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 97 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtga gagcattagc accctgttac actggtatca gcagaaacca 120 gggaaacagc ctaagctcct gatctatggc acctccaact tggagagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttactt ctgtcaacag agttggaacg accctcccac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 98 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 98 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtga gagcgtgagc accctgatgc actggtatca gcagaaacca 120 gggaaacagc ctaagctcct gatctatggc acctccaact tggagagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttactt ctgtcaacag agttggaacg accctcccac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 99 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 99 gacgtgcaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtga gagcattagc accctgttac actggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatggc acctccaact tggagagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttactt ctgtcaacag agttggaacg accctcccac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 100 <211> 89 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Ala Arg Gly Ser Met Ile Val Leu Gln Asn Leu Thr Leu Ile Thr Gly 1 5 10 15 Asp Ser Leu Thr Ser Ser Asn Asp Asp Glu Asp Pro Lys Ser His Arg 20 25 30 Asp Pro Ser Asn Arg His Ser Tyr Pro Gln Gln Ala Pro Tyr Trp Thr 35 40 45 His Pro Gln Arg Met Glu Lys Lys Leu His Ala Val Pro Ala Gly Asn 50 55 60 Thr Val Lys Phe Arg Cys Pro Ala Ala Gly Asn Pro Thr Pro Thr Ile 65 70 75 80 Arg Trp Leu Lys Asp Gly Gln Ala Phe 85 <210> 101 <211> 89 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 101 Ala Arg Gly Ser Met Thr Val Val His Asn Leu Thr Leu Leu Met Asp 1 5 10 15 Asp Ser Leu Thr Ser Ile Ser Asn Asp Glu Asp Pro Lys Thr Leu Ser 20 25 30 Ser Ser Ser Ser Gly His Val Tyr Pro Gln Gln Ala Pro Tyr Trp Thr 35 40 45 His Pro Gln Arg Met Glu Lys Lys Leu His Ala Val Pro Ala Gly Asn 50 55 60 Thr Val Lys Phe Arg Cys Pro Ala Ala Gly Asn Pro Met Pro Thr Ile 65 70 75 80 His Trp Leu Lys Asp Gly Gln Ala Phe 85 <210> 102 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Asp Glu Asp Pro Lys Ser His Arg Asp Pro Ser Asn Arg His Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Gln Gln Ala Pro Tyr Trp Thr His Pro Gln Arg 20 25

Claims (28)

  1. 인간 FGFR4의 아미노산 119 및 156 사이에 포함된 FGFR4의 산박스(acid box) 도메인 내 에피토프를 인식하고 FGFR4에 대한 FGF19 결합을 억제하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로,
    (a) (i) SEQ ID NO: 5 또는 6의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 CDR1,
    (ii) SEQ ID NO: 7 또는 8의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 CDR2, 및
    (iii) SEQ ID NO: 9의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 CDR3을 포함하는 중사슬, 및
    (b)(i) SEQ ID NO: 14 또는 15의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 CDR1,
    (ii) SEQ ID NO: 16의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 CDR2, 및
    (iii) SEQ ID NO: 17의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 CDR3을 포함하는 경사슬을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은,
    (a) (i) SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, 및 SEQ ID NO: 9의 아미노산 시퀀스을 포함하는 중사슬 CDR,
    (ii) SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 및 SEQ ID NO: 9의 아미노산 시퀀스을 포함하는 중사슬 CDR, 또는
    (iii) SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, 및 SEQ ID NO: 9의 아미노산 시퀀스을 포함하는 중사슬 CDR을 포함하는 중사슬, 및
    (b) (i) SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 CDR1,
    (ii) SEQ ID NO: 16의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 CDR2, 및
    (iii) SEQ ID NO: 17의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 CDR3을 포함하는 경사슬을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은,
    (a) 이의 중사슬의 가변 영역이 SEQ ID NO: 18-22 및 SEQ ID NO: 92-96 에서 선택된 어느 하나의 시퀀스들과 적어도 80% 아이덴티티를 갖는 뉴클레오티드 시퀀스로 코딩되고,
    (b) 이의 경사슬의 가변 영역이 SEQ ID NO: 23-26 및 SEQ ID NO: 97-99 에서 선택된 어느 하나의 시퀀스와 적어도 80% 아이덴티티를 갖는 뉴클레오티드 시퀀스로 코딩되고,
    상기 항체가 이의 결합 특이성을 유지하는, 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은,
    (a) SEQ ID NO: 1-4 또는 SEQ ID NO: 84-88 중 어느 하나의 아미노산 시퀀스 또는 상기 시퀀스 중 어느 하나와 적어도 85% 아이덴티티를 갖는 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역, 및
    (b) SEQ ID NO: 10-13 또는 SEQ ID NO: 89-91 중 어느 하나의 아미노산 시퀀스 또는 상기 시퀀스 중 어느 하나와 적어도 85% 아이덴티디를 갖는 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함하고,
    상기 항체가 이의 결합 특이성을 유지하는, 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체는
    (a) (i) SEQ ID NO: 6의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRH1,
    (ii) SEQ ID NO: 7의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRH2, 및
    (iii) SEQ ID NO: 9의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRH3을 포함하는 중사슬 및
    (b) (i) SEQ ID NO: 14의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRL1,
    (ii) SEQ ID NO: 16의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRL2 및
    (iii) SEQ ID NO: 17의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRL3을 포함하는 경사슬을 포함하는 인간 항체인, 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체는
    (a) (i) SEQ ID NO: 6의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRH1,
    (ii) SEQ ID NO: 7의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRH2 및
    (iii) SEQ ID NO: 9의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRH3을 포함하는 중사슬 및
    (b) (i) SEQ ID NO: 15의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRL1,
    (ii) SEQ ID NO: 16의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRL2 및
    (iii) SEQ ID NO: 17의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRL3을 포함하는 경사슬을 포함하는 인간 항체인, 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항체는
    (a) (i) SEQ ID NO: 6의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRH1,
    (ii) SEQ ID NO: 8의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRH2, 및
    (iii) SEQ ID NO: 9의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRH3을 포함하는 중사슬, 및
    (b) (i) SEQ ID NO: 14의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRL1,
    (ii) SEQ ID NO: 16의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRL2, 및
    (iii) SEQ ID NO: 17의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRL3을 포함하는 경사슬을 포함하는 인간 항체인, 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항체는
    (a) (i) SEQ ID NO: 6의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRH1,
    (ii) SEQ ID NO: 8의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRH2, 및
    (iii) SEQ ID NO: 9의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRH3을 포함하는 중사슬, 및
    (b) (i) SEQ ID NO: 15의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRL1,
    (ii) SEQ ID NO: 16의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRL2, 및
    (iii) SEQ ID NO: 17의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRL3을 포함하는 경사슬을 포함하는 인간 항체인, 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  9. 제1항에 있어서, 상기 항체는
    (a) (i) SEQ ID NO: 5의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRH1,
    (ii) SEQ ID NO: 7의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRH2, 및
    (iii) SEQ ID NO: 9의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRH3를 포함하는 중사슬 및
    (b) (i) SEQ ID NO: 14의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRL1,
    (ii) SEQ ID NO: 16의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRL2, 및
    (iii) SEQ ID NO: 17의 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRL3을 포함하는 경사슬을 포함하는 랫트 또는 키메라 모노클로날 항체인, 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  10. 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 단리된 핵산:
    (a) 제1항의 항체를 암호화하는 핵산 시퀸스,
    (b) SEQ ID NO: 18-26, SEQ ID NO: 28-34 및 SEQ ID NO: 92-99 중 어느 하나를 포함하는 핵산 시퀀스, 및
    (c) 상기 (a) 또는 (b)의 시퀀스들 중 어느 하나에 상보적인 핵산 시퀸스.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 핵산은 SEQ ID NO: 18-22 및 SEQ ID NO: 92-96 으로부터 선택된 적어도 하나의 시퀀스와, SEQ ID NO: 23-26 및 SEQ ID NO: 97-99 으로부터 선택된 적어도 하나의 시퀀스를 포함하는 핵산.
  12. 제10항의 핵산 시퀀스를 포함하는 벡터.
  13. 비인간 형질전환 동물이고, 제10항 또는 제11항 중 어느 한 항의 핵산 시퀀스, 또는 제12항의 벡터를 포함하는 숙주.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 FGFR4 발현, 과발현 또는 과잉행동과 관련된 질병의 인비보 진단, 예방 또는 치료용이고, 상기 질병은 대장암, 간세포암종 (HCC), 유방암, 위암, 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 결장 직장암(colorectal cancer), 전립선암, 뇌하수체 암, 난소암, 부드러운 조직 육종, 흑색종양, 두부 및 목 편평암(head and neck squamous) 암종, 폐 아데노암종, 또는 종양 전이의 형성인, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하고, FGFR4 발현, 과발현 또는 과잉행동과 관련된 암 질병의 인비보 진단, 예방 또는 치료용 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 암 질병은 대장암, 간세포암종 (HCC), 유방암, 위암, 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 결장 직장암(colorectal cancer), 전립선암, 뇌하수체 암, 난소암, 부드러운 조직 육종, 흑색종양, 두부 및 목 편평암(head and neck squamous) 암종, 폐 아데노암종, 또는 종양 전이의 형성인, 암 질병의 인비보 진단, 예방 또는 치료용 조성물.
  17. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 FGFR4 발현, 과발현 또는 과잉행동과 관련된 질병의 인비보 진단, 예방 또는 치료용이고, 상기 질병은 대사성 질환, 심혈관계 질환 또는 만성 신장 질환인, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 질병은 대사증후군, 당뇨병 및 비만으로부터 선택된 대사성 질환; 또는 심실 비대증, 심장 비대증, 고혈압, 울혈성심부전, 좌심실 비대증, 요독성 심장근육병증, 당뇨성 심장근육병증, 및 일차 심장근육병증로부터 선택된 심혈관계 질환인, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  19. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 대장암 줄기 세포의 인비보 검출 또는 죽임, 또는 이들의 발달 또는 분화에 영향을 미치거나 억제하기 위한 용도인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  20. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하고, 대장암 줄기 세포의 인비트로 검출하기 위한 용도의 조성물.
  21. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 비이클 또는 부형제를 포함하는, FGFR4 발현, 과발현 또는 과잉행동과 관련된 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서, 상기 질병은 대장암, 간세포암종 (HCC), 유방암, 위암, 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 결장 직장암(colorectal cancer), 전립선암, 뇌하수체 암, 난소암, 부드러운 조직 육종, 흑색종양, 두부 및 목 편평암(head and neck squamous) 암종, 폐 아데노암종, 또는 종양 전이의 형성인, 약제학적 조성물.
  22. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 콘쥬게이트 (ADC).
  23. 제22항에 있어서,
    상기 항체에 부착되는 약물 성분이 아우리스타틴(auristatin), 메이탄시노이드(maytansinoid), 칼리케아마이신(calicheamycin), 투불리신(tubulysin), 듀오카르마이신(duocarmycin), 벤조디아제핀(benzodiazepine), 독소루비신(doxorubicin), 안트라시클린(anthracyclin), 리족신(rhizoxin), 타일란스타틴(thailanstatin), 스플리스오스타틴(spliceostatin), 및 크립토피신(cryptophycin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 독소인, 항체-약물 콘쥬게이트 (ADC).
  24. 제23항에 있어서,
    여기서 상기 콘쥬게이트가 다음 화학식(I)을 갖고,

    여기서 R는 -CO-CH2-X-(A)n-B이고,
    여기서 X는 NRa로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 Ra 은 H 및 C1-C10 알킬, 및 O로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    A는, 존재하거나 부존재할 수 있으며, 자가-희생기 링커이고,
    n 은 0 또는 1이고,
    B는 제1항의 모노클로날 항체이고;
    이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 항체-약물 콘쥬게이트 (ADC).
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
KR1020207005364A 2017-08-16 2018-08-01 모노클로날 항체 항-fgfr4 KR102644658B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17186454.9A EP3444275A1 (en) 2017-08-16 2017-08-16 Monoclonal antibody anti-fgfr4
EP17186454.9 2017-08-16
PCT/EP2018/070848 WO2019034427A1 (en) 2017-08-16 2018-08-01 ANTI-FGFR4 MONOCLONAL ANTIBODY

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200040772A KR20200040772A (ko) 2020-04-20
KR102644658B1 true KR102644658B1 (ko) 2024-03-08

Family

ID=59631675

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207005364A KR102644658B1 (ko) 2017-08-16 2018-08-01 모노클로날 항체 항-fgfr4

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11643467B2 (ko)
EP (2) EP3444275A1 (ko)
JP (1) JP7235723B2 (ko)
KR (1) KR102644658B1 (ko)
CN (1) CN111315777A (ko)
AU (1) AU2018317651A1 (ko)
CA (1) CA3072284A1 (ko)
WO (1) WO2019034427A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111471109B (zh) * 2020-04-08 2021-07-23 中国科学院深圳先进技术研究院 一种抗成纤维细胞生长因子受体4单克隆抗体及其制备方法和用途
WO2022076898A1 (en) * 2020-10-09 2022-04-14 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Binders and chimeric antigen receptors which specifically bind fibroblast growth factor receptor 4
CN112679608B (zh) * 2021-03-22 2021-06-15 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 一种抗fgf19抗体及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011527322A (ja) 2008-07-08 2011-10-27 サノフイ−アベンテイス Ｆｇｆ−ｒ４受容体特異的拮抗薬
WO2014105849A1 (en) 2012-12-28 2014-07-03 Xoma (Us) Llc Antibodies specific for fgfr4 and methods of use
JP2014516511A (ja) 2011-04-07 2014-07-17 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｆｇｆｒ４抗体及び使用方法
WO2016023894A1 (en) * 2014-08-11 2016-02-18 U3 Pharma Gmbh Human anti-fgfr4 antibody

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
ATE102631T1 (de) 1988-11-11 1994-03-15 Medical Res Council Klonierung von immunglobulin sequenzen aus den variabelen domaenen.
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
ES2139598T3 (es) 1990-07-10 2000-02-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de miembros de parejas de union especifica.
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
DE69233254T2 (de) 1991-06-14 2004-09-16 Genentech, Inc., South San Francisco Humanisierter Heregulin Antikörper
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5885793A (en) 1991-12-02 1999-03-23 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
EP0656941B1 (en) 1992-03-24 2005-06-01 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
ATE193301T1 (de) 1993-03-09 2000-06-15 Genzyme Corp Verfahren zur isolierung von proteinen aus milch
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
EP0731842A1 (en) 1993-12-03 1996-09-18 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6696248B1 (en) 1995-08-18 2004-02-24 Morphosys Ag Protein/(poly)peptide libraries
CA2229043C (en) 1995-08-18 2016-06-07 Morphosys Gesellschaft Fur Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
WO1999029888A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
IL142025A0 (en) 1999-07-20 2002-03-10 Morphosys Ag Novel methods for displaying (poly) peptides/proteins on bacteriophage particles via disulfide bonds
AU2002329540A1 (en) 2001-06-20 2003-01-02 Morphosys Ag Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
US7531304B2 (en) 2002-01-31 2009-05-12 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. Method for screening FGFR-4 agonists
EP1532175B1 (en) 2002-03-22 2012-10-17 Aprogen, Inc. Humanized antibody and process for preparing the same
EP2229955A1 (en) 2003-10-16 2010-09-22 Imclone LLC Fibroblast growth factor receptor-1 inhibitors and methods of treatment using the same
AU2004312376A1 (en) 2003-12-19 2005-07-21 Five Prime Therapeutics, Inc. Fibroblast growth factor receptors 1, 2, 3, and 4 as targets for therapeutic intervention
WO2005097832A2 (en) 2004-03-31 2005-10-20 Genentech, Inc. Humanized anti-tgf-beta antibodies
EP2094733A1 (en) 2006-11-03 2009-09-02 U3 Pharma GmbH Fgfr4 antibodies
EP1918376A1 (en) 2006-11-03 2008-05-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. FGFR4 promotes cancer cell resistance in response to chemotherapeutic drugs
JP5787757B2 (ja) * 2008-08-04 2015-09-30 ファイブ プライム セラピューティックス インコーポレイテッド Ｆｇｆｒ細胞外ドメイン酸性領域突然変異タンパク質
CN102224170A (zh) * 2008-09-03 2011-10-19 利琴蒂亚有限公司 抑制与fgfr4相关的癌细胞侵袭的材料和方法
US20160039936A1 (en) 2011-06-24 2016-02-11 University Of Miami Fibroblast growth factor receptor inhibition for the treatment of disease
EP2872491B1 (en) 2012-07-11 2021-05-05 Blueprint Medicines Corporation Inhibitors of the fibroblast growth factor receptor
JP2016520516A (ja) 2013-03-12 2016-07-14 ザ・トランスレーショナル・ジェノミクス・リサーチ・インスティチュート 線維芽細胞増殖因子４に対するハイブリドーマクローンおよびモノクローナル抗体
US9498532B2 (en) 2013-03-13 2016-11-22 Novartis Ag Antibody drug conjugates
TW201612518A (en) 2014-01-17 2016-04-01 Sanofi Sa Methods of identifying patients suffering from liver cancer who will most likely benefit from a treatment with an antagonist anti-FGFR4 antibody
WO2016134294A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as fgfr4 inhibitors
EP3069734A1 (en) 2015-03-17 2016-09-21 Exiris S.r.l. Cryptophycin-based antibody-drug conjugates with novel self-immolative linkers
KR20170129757A (ko) 2015-03-25 2017-11-27 노파르티스 아게 Fgfr4 억제제로서의 포르밀화 n-헤테로시클릭 유도체
US11078286B2 (en) * 2015-09-20 2021-08-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies specific for fibroblast growth factor receptor 4 (FGFR4) and methods of their use
US11661451B2 (en) * 2017-07-27 2023-05-30 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-CD147 antibody

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011527322A (ja) 2008-07-08 2011-10-27 サノフイ−アベンテイス Ｆｇｆ−ｒ４受容体特異的拮抗薬
JP2014516511A (ja) 2011-04-07 2014-07-17 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｆｇｆｒ４抗体及び使用方法
WO2014105849A1 (en) 2012-12-28 2014-07-03 Xoma (Us) Llc Antibodies specific for fgfr4 and methods of use
WO2016023894A1 (en) * 2014-08-11 2016-02-18 U3 Pharma Gmbh Human anti-fgfr4 antibody

Also Published As

Publication number Publication date
CN111315777A (zh) 2020-06-19
WO2019034427A1 (en) 2019-02-21
EP3444275A1 (en) 2019-02-20
JP7235723B2 (ja) 2023-03-08
US20210230280A1 (en) 2021-07-29
EP3668895A1 (en) 2020-06-24
AU2018317651A1 (en) 2020-02-20
US11643467B2 (en) 2023-05-09
JP2020537490A (ja) 2020-12-24
CA3072284A1 (en) 2019-02-21
KR20200040772A (ko) 2020-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI781120B (zh) Ｐｄ-１之抗體及其用途
US10208120B2 (en) Anti-FGFR2/3 antibodies and methods using same
US8841424B2 (en) Humanized AXL antibodies
DK2199390T3 (en) ANTI-EphA2 ANTIBODY
DK2636736T3 (en) Novel anti-dr5 antibody
JP2024026140A (ja) Ｌｉｌｒｂ２に対する抗体
KR20100097684A (ko) Ａｘｌ 항체
CN111565751A (zh) 治疗高危多发性骨髓瘤的方法
AU2011278227B2 (en) Superior efficacy of CD37 antibodies in CLL blood samples
KR102644658B1 (ko) 모노클로날 항체 항-fgfr4
US20220119545A1 (en) Cdcp1-targeted therapies
EP2270053A1 (en) Humanized AXL antibodies
TW202300527A (zh) 使用ｇｒｅｍ１拮抗劑治療疾病的方法
US20240076382A1 (en) CD1a ANTIBODIES AND USES THEREOF
TW202340243A (zh) 抗ｃｄ３９抗體及其用途
WO2023215719A1 (en) Anti-tigit antibodies and uses of the same
TW202321309A (zh) 使用至少結合ｅｇｆｒ之抗體治療免疫檢查點抑制劑治療之具高ｅｇｆｒ表現的癌症
CN116194483A (zh) 使用抗cd73抗体的癌症治疗方法
BR112020006860A2 (pt) composição para depleção de células t citotóxicas

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant