KR102617297B1 - 클로스트리디움 디피실리 감염의 치료 또는 예방용 조성물 - Google Patents
클로스트리디움 디피실리 감염의 치료 또는 예방용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 클로스트리디움 신덴스, 블라우티아 프로덕타 및 엔테로코커스 패시움의, 균체, 배양물, 파쇄물 및 추출물로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하는, 클로스트리디움 디피실리(Clostridium difficile) 감염을 예방 또는 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다.
Description
본원은 클로스트리디움 신덴스(Clostridium scindens), 블라우티아 프로덕타(Blautia producta) 및 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 이에 추가로 블라우티아 패시스(Blautia faecis) 및 프로테우스 테라(Proteus terrae) 중 1종 이상을 포함하는 클로스트리디움 디피실리 감염의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.
클로스트리디움 디피실리(Clostridium difficile)는 혐기성 포자 형성 그람 양성 병원체 균으로서 위장관에 콜로니를 형성한 후 설사를 일으키는 독소를 생산하여 심할 경우에는 위막성 대장염을 일으키는 임상적으로 매우 중요한 클로스트리디움속의 세균 중 하나이다.
병원성 클로스트리디움 디피실리는 장내독소(toxin A), 세포독소(toxin B) 및 2성분 독소(Binary toxin)로 알려진 독소를 생산하여, 중증의 설사, 독성거대결장, 천공, 패혈증, 위막성 대장염을 일으킨다. 특히, 독소 A는 분비성, 출혈성 설사를 유발하며, 독소 B는 세포독소로서 조직배양 세포에서 파괴적인 세포병변 효과를 나타낸다.
다양한 항생제가 클로스트리디움 디피실리 관련 질환(Clostridium difficile associated disease, CDAD)과 연관성이 있는 것으로 알려져 있다. 클로스트리디움 디피실리의 장관 내 획득은 입원 환자의 약 10-25%에서 발생하고, 입원기간에 따라 증가하는 것으로 밝혀졌다. 병원성 클로스트리디움 디피실리는 감염된 환자의 설사에서 균체가 배출된 후 포자를 형성하여 체외에서 오랜 기간 생존할 수 있다. 따라서, 클로스트리디움 디피실리는 장기간 환경에 생존해 있을 수 있고, 다시 포자가 구강을 통하여 추가적인 감염을 일으킴으로써 병원 내에서 클로스트리디움 디피실리가 집단 발병할 수 있다.
현재 클로스트리디움 디피실리 감염(Clostridium Difficile Infection, CDI) 치료에 활용하는 표준 치료법은 항생제 처방이나, 비교적 낮은 치료 성공률 및 높은 재발률을 보이는 것으로 알려져 있다. Metronidazole과 vancomycin은 일차 치료 시에도 치료 성공률에 제한이 있고 20~30%의 재발률을 보이며, 첫 번째 재발 시 치료 성공률은 70%이고 그 이상의 재발에서는 35%까지 감소하며, 고독성 균주에 의한 난치성 중증 CDI 및 재발형 CDI에 활용하기에 부적절하다. 그리고 Fidaxomicin은 C. 디피실리 독소 A, B 합성과 포자 형성을 억제하며, 재발률 역시 타 항생제에 비해 낮은 편이지만, 가격이 높으며 구역, 구토, 발열, 어지럼증, 간효소치의 증가 등이 여전히 문제되고 있다. Nitazoxanide의 치료제로의 가능성 역시 제시된 바 있으나, 아직까지 관련 연구가 미비한 편이다.
최근에는 CDI의 예방 및 치료법으로 분변 미생물총 이식 (fecal microbiota transplantation, FMT) 및 백신, 핵심 미생물군 투여 등을 활용하는 비-항생제 치료법이 제시되었다. 건강한 제공자(donor)의 대변을 환자의 장관에 투여하는 FMT는 난치성 또는 재발성 CDI 치료 방법 중 하나로써, CDI 환자 317명을 대상으로 한 28개 연구를 종합한 결과 92%의 회복률과 높은 재발방지 효과를 보인다고 보고되었다. 그러나, FMT 치료법은 높은 치료 성공률과 낮은 재발률에도 불구하고, 일반인들이 감수하기에는 불쾌감을 줄 수 있는 시술 과정과 비표준화적인 처치, 병원균 전파 등의 여러 제약 조건을 가지고 있다. 변성 독소 A, B를 포함한 C. 디피실리 백신 역시 재발성 CDI 환자에서 효과를 보인다는 연구가 진행 중에 있으나, 상용화에는 상당한 시간이 소요될 것으로 보인다.
한편, 장내에서 분리한 유익 미생물은 장 생태계 변화 등을 일으킬 수 있으며, 결과적으로 C. 디피실리와의 공간 및 자원 경쟁관계를 유지한다. 이들을 처리할 경우 실제로 metronidazole 또는 vancomycin과 동일한 수준의 치료 효과를 보이며, 재발률 역시 현저하게 낮아진다는 연구결과가 보고된 바 있다(Ollech et al., Best Practice & Research Clinical Gastroenterology, 2016, Vol. 30, No. 1, pp. 111-118). 따라서, CDI의 예방 및 치료에 있어 큰 기여를 할 수 있는 기능성 유익균주를 확보 및 양산화하는 과정은 항생제 요법을 보완/대체할 수 있는 방법으로써 매우 중요한 의의를 가진다.
현재 일정한 균주 조합을 이용하여 CDI의 치료를 시도하거나(예컨대, 한국 공개특허 제2019-0030687호), 제어성 T 세포의 증식 및/또는 축적을 유도하여 면역에 의한 과도한 염증을 억제함으로써, 자가면역질환, 염증성 질환 등과 함께 세균 감염의 예방 또는 치료를 시도하고자 한 예(유럽 특허 제2 575 835호) 등이 알려져 있다. 또한, 쎄레스 테라퓨틱스 및 베단타 바이오사이언스가 프로바이오틱스를 이용한 CDI 치료제에 대한 임상시험을 진행 중이나, 아직 프로바이오틱스를 유효성분으로 포함하는 CDI 치료제는 상용화되어 있지 않다.
이에, 본 발명자들은 클로스트리디움 디피실리 감염을 예방 또는 치료할 수 있는 균을 발굴하기 위해 연구 노력한 결과, 클로스트리디움 디피실리 성장 억제효과를 갖는 클로스트리디움 신덴스(Clostridium scindens) KBL987(KCTC13277BP)를 발굴한 바 있다(특허출원 제2017-0122608호).
이에 더 나아가, 본 발명자들은 클로스트리디움 신덴스와 조합하여 CDI 억제 효과를 나타내는 균주를 찾기 위해 연구를 계속한 결과, 블라우티아 프로덕타(Blautia producta) 및 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 이에 추가로 블라우티아 패시스(Blautia faecis) 및 프로테우스 테라(Proteus terrae) 중 1 종 이상을 클로스트리디움 신덴스와 함께 조합하여 사용하는 경우 우수한 CDI 억제효과를 달성할 수 있음을 찾아내어 본 발명을 완성하였다.
Ollech et al., Best Practice & Research Clinical Gastroenterology, 2016, Vol. 30, No. 1, pp. 111-118
본 발명의 목적은 클로스트리디움 신덴스, 블라우티아 프로덕타 및 엔테로코커스 패시움의, 균체, 배양물, 파쇄물 및 추출물로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하는, 클로스트리디움 디피실리 감염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 클로스트리디움 신덴스, 블라우티아 프로덕타 및 엔테로코커스 패시움의, 균체, 배양물, 파쇄물 및 추출물로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하는, 클로스트리디움 디피실리 감염의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 클로스트리디움 디피실리 감염에 우수한 예방 또는 치료 효과를 갖는 균주 조합을 발굴하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 클로스트리디움 신덴스(Clostridium scindens), 블라우티아 프로덕타(Blautia producta) 및 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)과, 선택적으로 블라우티아 패시스(Blautia faecis) 및 프로테우스 테라(Proteus terrae) 중 1종 이상의 조합이 클로스트리디움 디피실리 감염에 대하여 우수한 예방 및 치료 효과를 나타낸다는 것을 실험적으로 증명하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 실시 태양으로서, 본 발명은 클로스트리디움 신덴스, 블라우티아 프로덕타 및 엔테로코커스 패시움의, 균체, 배양물, 파쇄물 및 추출물로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하는, 클로스트리디움 디피실리 감염의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 클로스트리디움 신덴스, 블라우티아 프로덕타 및 엔테로코커스 패시움의, 균체, 배양물, 파쇄물 및 추출물로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하는, 클로스트리디움 디피실리 감염의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 예로서, 본 발명의 약학 조성물 또는 식품 조성물은 블라우티아 패시스(Blautia faecis) 및 프로테우스 테라(Proteus terrae) 중 1 종 이상의, 균체, 배양물, 파쇄물 및 추출물로 이루어진 군 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 클로스트리디움 디피실리 감염의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 클로스트리디움 디피실리 감염의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물은 클로스트리디움 신덴스, 블라우티아 프로덕타 및 엔테로코커스 패시움의, 균체, 배양물, 파쇄물 및 추출물로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명에서 용어 "균체"는 생균체와, 가열, 가압 또는 약물처리 등으로 살균처리된 사균체를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 정제된 균체를 포함한다.
본 발명에서, 용어 "배양물"은 균주를 공지의 배지에서 배양시켜 수득한 산물을 의미하며, 상기 산물은 균주를 포함할 수 있다. 상기 배지는 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 선택될 수 있으며, 예를 들어, Cholate 한천 배지, yBHI 한천 배지, GAM 한천 배지, MRS 한천 배지, MRS 액체배지, GAM 액체 배지 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 균주에 따라서 적합한 배지를 선택할 수 있으며, 예컨대, 프로테우스 테라와 엔테로코커스 패시움의 경우 Cholate 한천 배지, 블라우티아 프로덕타 및 블라우티아 패시스의 경우 yBHI 한천 배지, 클로스트리디움 신덴스의 경우 GAM 한천 배지를 선택할 수 있다.
본 발명에서 용어 "파쇄물"은 균체를 효소 처리, 균질화 또는 초음파 처리 등으로 파괴한 것을 의미하며, 용어 "추출물"은 균주를 임의의 적절한 추출용매로 추출하여 수득한 산물을 의미하며, 균주의 종류에 따라서 적합한 추출 용매를 선택할 수 있다.
본 발명에서, 클로스트리디움 신덴스는 바람직하게는 서열번호 1과 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한 16s rDNA 서열을 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 클로스트리디움 신덴스는 기탁번호 KCTC13277BP의 클로스트리디움 신덴스 KBL987 균주일 수 있다. 상기 균주는 2017. 5. 29.에 한국생명공학연구원에 "클로스트리디움 신덴스 SNUG 40402"로 기탁되었으나, 2019. 7. 26.자로 "클로스트리디움 신덴스 KBL987"로 명칭 변경된 것이다.
본 발명에서, 블라우티아 프로덕타는 바람직하게는 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나와 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한 16s rDNA 서열을 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 블라우티아 프로덕타는 바람직하게는 2008년 한국생명공학연구원에 기탁된 기탁번호 KCTC15607인 블라우티아 프로덕타 ATCC27340 균주, 기탁번호 KCTC13915BP인 블라우티아 프로덕타 KBL988 균주, 기탁번호 KCTC13917BP인 블라우티아 프로덕타 KBL990 균주 또는 기탁번호 KCTC13918BP인 블라우티아 프로덕타 KBL991 균주일 수 있다.
본 발명에서, 엔테로코커스 패시움은 바람직하게는 서열번호 6과 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한 16s rDNA 서열을 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 엔테로코커스 패시움은 바람직하게는 기탁번호 KCTC13914BP 의 엔테로코커스 패시움 KBL986 균주일 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 클로스트리디움 디피실리 감염의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 클로스트리디움 디피실리 감염의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물은 클로스트리디움 신덴스, 블라우티아 프로덕타 및 엔테로코커스 패시움에 추가하여, 선택적으로 블라우티아 패시스 및 프로테우스 테라 중 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물은 블라우티아 패시스 및 프로테우스 테라 모두를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 블라우티아 패시스는 바람직하게는 서열번호 7과 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한 16s rDNA 서열을 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 블라우티아 패시스는 바람직하게는 기탁번호 KCTC13916BP의 블라우티아 패시스 KBL989 균주일 수 있다.
본 발명에서 프로테우스 테라는 바람직하게는 서열번호 8과 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한 16s rDNA 서열을 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 프로테우스 테라는 바람직하게는 기탁번호 KCTC13933BP인 프로테우스 테라 KBL985 균주일 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물 및 식품 조성물은 클로스트리디움 디피실리 감염 시 체중 감소를 억제하고 생존율을 향상시키는데 탁월한 효과를 나타내며, stool c.f.u. 및 stool toxin의 양도 현저히 감소시키므로, 클로스트리디움 디피실리 예방, 치료 또는 개선에 우수한 효능을 갖는다.
본 발명에서, 용어 "클로스트리디움 디피실리 감염" 또는 "CDI"는 클로스트리디움 디피실리 감염 또는 이와 연관되어 발현되는 항균제 관련 설사, 클로스트리디움 디피실리로 인한 장 질환, 위장관의 염증 등을 포괄한다. 항생제 사용을 포함한 다양한 요인이 위장관의 장내 불균형을 유도할 수 있으며, 이는 병원성 미생물, 예컨대 C. 디피실리에 의한 콜로니 형성을 허용할 수 있다. 이러한 콜로니 형성 또는 병원성 감염은 CDI에 특징적인 주요 증상 중 하나인 설사를 포함하여 대상체에게서 각종 부작용을 초래할 수 있다. CDI의 경우, 설사는 C. 디피실리의 독소 B 생산의 결과인 것인 것으로 여겨지며, 이는 장 상피 세포들 간의 밀착 연접부를 개방시켜, 혈관 투과성, 출혈 및 염증을 증가시킨다.
본 발명에서, 클로스트리디움 디피실리 감염의 증상은 범위가 경증에서 중증에 이를 수 있으며, 설사, 열 및 고통스러운 복부 경련을 포함한다. 클로스트리디움 디피실리 감염은 또한 생명을 위협하는 합병증, 예를 들어, 가스의 축적으로 인한 장의 극심한 부종(중독성 거대결장증(toxic megacolon))으로 이어질 수 있다. 클로스트리듐 디피실리-관련 질환 (CDAD)은 클로스트리디움 디피실리로부터 생성된 독소에 의해 유발되는 광범위한 설사 질환을 포함하며, 위막의 존재에 관계없이 극심한 대장염(colitis)의 경우를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물 및 식품 조성물은 클로스트리디움 디피실리 감염을 겪고 있는 대상체 또는 클로스트리디움 디피실리 감염에 대한 치료를 받았으나 감염이 재발된 대상체에서 감염을 치료하기 위하여 투여될 수 있다. 클로스트리디움 디피실리 감염을 겪고 있는 대상체는 무증상 보균자일 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 클로스트리디움 디피실리에 감염될 위험이 있는 대상체, 예컨대 병원성 감염이 있었던 대상체, 항생제로 치료받은 경력이 있는 대상체, 병원성 감염에 걸릴 위험을 증가시키는 절차(예컨대, 수술 및/또는 입원)가 진행될 대상체에 예방 목적으로 투여될 수도 있다.
본 발명에서 용어 "예방"은 본 발명의 약학 조성물의 투여로 클로스트리디움 디피실리 감염 및 이와 관련된 질환, 증상 등을 방지(averting), 지연(delaying), 방해(impeding) 또는 저해(hindering)하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 "치료"는 본 발명의 약학 조성물의 투여로 클로스트리디움 디피실리 감염 및 이와 관련된 질환, 증상 등을 개선, 치유, 감소 또는 질병의 진행을 감소 또는 정지시키는 것을 의미한다.
본 발명의 약학 조성물 및 식품 조성물은 본 발명의 균주 조합을 임의의 형태로, 예를 들어 수성 형태로, 예컨대 반고체 형태에 포매된 용액 또는 현탁액으로, 분말 형태로 또는 동결 건조된 형태로 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 조성물의 일부 또는 전부 균주는 동결건조된다. 조성물, 특히 균주를 포함하는 조성물을 동결건조시키는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, US 3,261,761; US 4,205, 132; PCT 공보 WO 2014/029578 및 WO 2012/098358 참조). 본 발명의 균주 조합은 조합물로서 동결건조될 수 있고/있거나 별도로 동결건조되고, 투여 전에 조합될 수 있다. 또한 각 균주는 이를 다른 균주와 조합하기 전에 약학적으로 허용가능한 부형제와 조합될 수 있거나 또는 다수의 동결건조된 박테리아가 동결건조된 형태로 유지되면서 조합될 수 있고, 일단 조합되면 박테리아의 혼합물이 연속해서 제약 부형제와 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 일부 또는 전부의 균주는 동결건조된 케이크일 수 있다.
본 발명의 각 균주는 관련 기술분야에 널리 공지된 발효 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성 성분은 혐기성 박테리아 종의 신속한 성장을 지원할 수 있는 혐기성 발효기를 사용하여 제작된다. 혐기성 발효기는, 예를 들어, 교반 탱크 반응기 또는 일회용 웨이브 생물 반응기일 수 있다. 발효 산물은 당업계에 공지된 기술, 예컨대 원심분리 및 여과에 의해 정제 및 농축될 수 있고, 관련 기술분야에 널리 공지된 기술에 의해 임의로 건조 및 동결건조될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약학 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 약학 조성물은 바람직하게는 경구, 직장내 투여 또는 정맥 주사를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 대상체에 1일 1회 이상, 예컨대 1일 2회, 1일 3회 등으로 투여될 수 있다. 단위 투여량은 대상체를 위한 단위 투여에 적합하게 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 약제학적 담체를 포함하며 치료 효과를 나타내는 본 발명의 균주 조합의 예정된 양을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물의 일반적인 투여량은 1회에 0.001-10 g, 바람직하게는 0.01 내지 5 g 범위 내이다. 이와 같이 투여할 때, 본 발명의 균주 조합은 1일 1x103 cfu/일 내지 1x1011 cfu/일로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 1x107 cfu/일 내지 1x1010 cfu/일, 보다 바람직하게는 1x109 cfu/일로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물은 장(예를 들어, 소장 및/또는 결장)으로의 전달을 위해 제형화된다. 일부 실시양태에서, 박테리아는 위에서의 가혹한 환경에서 박테리아의 생존을 증가시켜 주는 장용 코팅과 함께 제형화된다. 장용 코팅은 위에 있는 위액의 작용에 저항하여 그 안에 혼입되는 박테리아가 위를 통과하여 장으로 전달되도록 하는 것이다. 장용 코팅은 관련 기술분야에 널리 공지된 중합체 및 공중합체, 예컨대 상업적으로 이용 가능한 EUDRAGIT[에보닉 인더스트리즈(Evonik Industries)]로 이루어질 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서 클로스트리디움 신덴스, 블라우티아 프로덕타 및 엔테로코커스 패시움의, 균체, 배양물, 파쇄물 및 추출물로 이루어진 군 중 하나 이상, 및 선택적으로 블라우티아 패시스 및 프로테우스 테라 중 1 종 이상의, 균체, 배양물, 파쇄물 및 추출물로 이루어진 군 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 클로스트리디움 디피실리 감염의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 식품 조성물은 CDI의 예방 또는 개선에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 건강기능식품 또는 기능성 음료로 용이하게 활용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 식품용 조성물이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미한다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물 형태로 제공되는 경우, 본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함할 수 있다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등, 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등, 올리고당 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로 덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서 천연 감미제(타우마틴, 스테비아 추출물, 레바우디오시드 A, 글리시리진 등) 및 합성 감미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 생산될 수 있고, 본 발명의 약학 조성물과 동일한 양의 균체(예를 들어, 중량, 양 또는 CFU를 기준으로 함)를 함유할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 100중량%, 바람직하게는 1 중량% 내지 99 중량%로 본 발명의 균주 조합을 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100 mL 당 0.001 g 내지 10 g, 바람직하게는 0.01 g 내지 1 g의 비율로 포함될 수 있다. 식품 중의 균체의 양은 식품의 용량, 식품의 소비 빈도, 식품에 함유된 균주의 종류, 식품 중의 수분량, 및/또는 식품 중의 균주의 생존을 위한 부가의 조건을 포함한 다양한 요인에 좌우될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물을 제조함에 있어서, 본 발명의 균주 조합과 함께, 인간이나 동물이 섭취하기에 적합하고 섭취시 병원성 유해 세균을 억제하거나 포유동물 장관 내의 미생물 균형을 개선시킬 수 있는 임의의 프로바이오틱 균주를 사용할 수 있다. 그러한 프로바이오틱 미생물의 예로는, 락토바실러스(Lactobacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 류코노스톡(Leuconostoc), 락토코커스(Lactococcus), 바실러스(Bacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus) 속의 세균 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물 및/또는 식품 조성물은 동결보호제를 더 포함할 수 있다. 상기 동결보호제는 비자연적으로 발생한(non-naturally occurring) 물질 또는 자연적으로 발생한 물질일 수 있으며, 상기 조성물 또는 이에 포함된 미생물 균주를 동결건조하는 과정에서 상기 미생물의 파괴, 손상을 방지, 저감시키거나 동결건조에 의한 미생물의 활성 저하, 손실을 방지, 저감시켜 본래의 활성을 유지시킬 수 있는 물질이라면 그 종류에 제한없이 적용될 수 있다. 예를 들어, 상기 동결보호제는 트레할로스, 글리세롤, 말토덱스트린, 탈지유, 전분, 콩가루, 당류, 아미노산, 펩타이드, 젤라틴, 글리세롤, 당알콜, 유청, 알긴산, 아스코르빈산, 효모 추출물, 마늘 추출물 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 동결보호제는 상기 조성물 총 중량에 대하여 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량% 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물 및/또는 식품 조성물은 동결보호제를 더 포함함에 따라 동결건조된 형태의 제제로 제공될 수 있으며, 이에 따라 보관, 저장, 운반, 이동, 유통 또는 상기 조성물의 섭취에 보다 유리한 장점 및 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점에서 약학적 유효량의 본 발명의 균주 조합을 클로스트리디움 디피실리의 예방 또는 치료가 요구되는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 클로스트리디움 디피실리의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 질환의 예방 또는 치료의 개체는 인간을 포함한 모든 동물을 포함한다. 예를 들어, 개, 고양이, 마우스 등의 동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 또 다른 관점에서 클로스트리디움 디피실리의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 본 발명의 균주 조합 또는 조성물의 용도, 및 클로스트리디움 디피실리의 예방 또는 치료제의 제조를 위한 상기 균주 조합 또는 조성물의 용도를 제공한다.
상기 질환의 예방 또는 치료 방법에 사용되는 약학 조성물 및 투여 방법은 상기에서 설명하였으므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명은 그 적용에 있어서 하기 설명에 제시되거나 또는 도면에 예시된 성분의 배열 및 구성의 세부 사항으로 제한되지 않는다. 본 발명은 다른 실시양태가 가능하고 다양한 방식으로 실시되거나 또는 수행될 수 있다. 또한, 본원에 사용된 어구 및 전문 용어는 설명하기 위한 것이며 제한적인 것으로 간주되서는 안된다. 본원에서 "포함하는", "포함하는" 또는 "갖는", "함유하는", "포함한" 및 그의 변형의 사용은 그 다음에 열거된 항목 및 그의 등가물뿐만 아니라 부가 항목을 포괄한다는 것을 의미한다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가져야 한다. 본 개시내용의 방법 및 기술은 일반적으로, 관련 기술분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라서 수행된다. 일반적으로, 본원에 기재된 생화학, 효소학, 분자 및 세포 생물학, 미생물학, 바이러스학, 세포 또는 조직 배양, 유전학 및 단백질 및 핵 화학과 관련되어 사용되는 명명법 및 이의 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 본 개시내용의 방법 및 기술은 일반적으로, 관련 기술분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라서, 및 달리 표시되지 않는 한 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적 및 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다.
클로스트리디움 신덴스, 블라우티아 프로덕타 및 엔테로코커스 패시움과, 선택적으로 블라우티아 패시스 및 프로테우스 테라 중 1종 이상을 포함하는 본 발명의 균주 조합은 클로스트리디움 디피실리 감염 시 우수한 체중 감소 억제 및 생존율 향상 효과를 나타내고, stool c.f.u. 및 stool toxin의 양도 현저히 감소시키는바, 클로스트리디움 디피실리 감염의 예방 및 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 균주 조합의 C. 디피실리 감염 억제 효과를 실험하기 위한 동물 모델의 모식도이다.
도 2는 도 1의 동물 모델에서 C. 디피실리 포자 감염 48 시간 및 72 시간 후의 체중 감소율(각각 도 2a 및 도 2b) 및 생존율(도 2c)을 도시한 것이다.
도 3은 도 1의 동물 모델에서 각 균주의 단독 투여 및 Cs와의 병용 투여 시 시간의 경과에 따른 체중 변화율 및 생존율을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 균주 조합의 C. 디피실리 감염 억제 효과를 실험하기 위한 또 다른 동물 모델의 모식도이다.
도 5는 도 4의 동물 모델에서 C. 디피실리 포자 감염 후 시간 경과에 따른 체중 변화를 도시한 것이다.
도 6은 도 4의 동물 모델에서 포자 감염 후 48 시간 및 72 시간 후의 체중 변화(각각 도 6a 및 도 6b) 및 생존율(도 6c)을 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 5종의 균주 조합과 4종의 균주 조합의 체중 감소율 및 생존율을 비교 실험한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 균주 조합의 투여량 변화에 따른 체중 감소 억제 효과를 측정한 결과이다.
도 9는 다양한 블라우티아 프로덕타 균주를 사용한 본 발명의 균주 조합에서 시간 경과에 따른 체중 변화(도 9a), 포자 감염 후 48시간 및 72시간 후의 체중 변화(각각 도 9b 및 도 9c), 생존율(도 9d), 24시간 경과 후의 stool c.f.u. 및 stool toxin(각각 도 9e 및 도 9f)을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 최적의 균주 조합(CBBE: Cs+Bp+Bf+Ef)과 다른 조합의 균주들의 CDI 감염 억제 효과를 다양한 방법으로 측정하여 비교한 결과이다. 도 10a는 상기 조합과 Cs 균주 단독 투여 시의 시간 경과에 따른 체중 변화, 생존율, 24시간 경과 후의 stool c.f.u. 및 stool toxin을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 10b는 다른 조합의 균주들을 투여한 경우의 체중 변화를 비교한 결과이고, 도 10c 내지 도 10e는 C. 디피실리의 균 수, stool c.f.u. 및 stool toxin을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 Ex vivo 실험을 통해 본 발명의 최적의 균주 조합(CBBE: Cs+Bp+Bf+Ef)의 효과를 확인한 실험 결과를 나타낸 것으로, Bp+Bf+Ef(ΔCS), Cs+Bf+Ef(ΔBP), Cs+Bp+Ef(ΔBF), Cs+Bp+Bf(ΔEF)의 조합이나 Cs 단독 접종 시의 결과와 비교하였다. 각각 상대적인 C. 디피실리 양(도 11a), 이차담즙산(DCA)의 양(도 11b), pH 측정 결과(도 11c), CBBE 내 각 균주와 pH의 상관관계(도 11d) 및 CBBE 내 각 균주와 C. 디피실리의 음의 상관관계(도 11e)를 도시한 것이다.
도 12 내지 15는 본 발명에 따른 4종의 균주 조합이 Treg 세포에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험 모식도 및 실험 결과를 도시한 것이다.
도 2는 도 1의 동물 모델에서 C. 디피실리 포자 감염 48 시간 및 72 시간 후의 체중 감소율(각각 도 2a 및 도 2b) 및 생존율(도 2c)을 도시한 것이다.
도 3은 도 1의 동물 모델에서 각 균주의 단독 투여 및 Cs와의 병용 투여 시 시간의 경과에 따른 체중 변화율 및 생존율을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 균주 조합의 C. 디피실리 감염 억제 효과를 실험하기 위한 또 다른 동물 모델의 모식도이다.
도 5는 도 4의 동물 모델에서 C. 디피실리 포자 감염 후 시간 경과에 따른 체중 변화를 도시한 것이다.
도 6은 도 4의 동물 모델에서 포자 감염 후 48 시간 및 72 시간 후의 체중 변화(각각 도 6a 및 도 6b) 및 생존율(도 6c)을 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 5종의 균주 조합과 4종의 균주 조합의 체중 감소율 및 생존율을 비교 실험한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 균주 조합의 투여량 변화에 따른 체중 감소 억제 효과를 측정한 결과이다.
도 9는 다양한 블라우티아 프로덕타 균주를 사용한 본 발명의 균주 조합에서 시간 경과에 따른 체중 변화(도 9a), 포자 감염 후 48시간 및 72시간 후의 체중 변화(각각 도 9b 및 도 9c), 생존율(도 9d), 24시간 경과 후의 stool c.f.u. 및 stool toxin(각각 도 9e 및 도 9f)을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 최적의 균주 조합(CBBE: Cs+Bp+Bf+Ef)과 다른 조합의 균주들의 CDI 감염 억제 효과를 다양한 방법으로 측정하여 비교한 결과이다. 도 10a는 상기 조합과 Cs 균주 단독 투여 시의 시간 경과에 따른 체중 변화, 생존율, 24시간 경과 후의 stool c.f.u. 및 stool toxin을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 10b는 다른 조합의 균주들을 투여한 경우의 체중 변화를 비교한 결과이고, 도 10c 내지 도 10e는 C. 디피실리의 균 수, stool c.f.u. 및 stool toxin을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 Ex vivo 실험을 통해 본 발명의 최적의 균주 조합(CBBE: Cs+Bp+Bf+Ef)의 효과를 확인한 실험 결과를 나타낸 것으로, Bp+Bf+Ef(ΔCS), Cs+Bf+Ef(ΔBP), Cs+Bp+Ef(ΔBF), Cs+Bp+Bf(ΔEF)의 조합이나 Cs 단독 접종 시의 결과와 비교하였다. 각각 상대적인 C. 디피실리 양(도 11a), 이차담즙산(DCA)의 양(도 11b), pH 측정 결과(도 11c), CBBE 내 각 균주와 pH의 상관관계(도 11d) 및 CBBE 내 각 균주와 C. 디피실리의 음의 상관관계(도 11e)를 도시한 것이다.
도 12 내지 15는 본 발명에 따른 4종의 균주 조합이 Treg 세포에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험 모식도 및 실험 결과를 도시한 것이다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 어떠한 방식으로든지 추가로 제한하는 것으로서 해석되서는 안된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌 (참고 문헌, 허여된 특허, 공개된 특허 출원 및 계류중인 특허 출원 포함)의 전체 내용은 특히 상기 언급된 교시를 위해, 본원에 명백하게 참조로 포함된다. 그러나, 어떠한 참고문헌의 인용도 그 참고문헌이 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다.
실시예 1. 후보 균주 및 클로스트리디움 디피실리 배양
1-1. 후보 균주의 배양
클로스트리디움 디피실리 감염(CDI)에 대한 치료 또는 증상 개선 효능이 있는 균주들을 확인하기 위하여, 프로테우스 테라(Proteus terrae)와 엔테로코커스 패시움(Enterococcus facium)을 Cholate agar, 블라우티아 프로덕타(Blautia producta)와 블라우티아 패시스(Blautia faecis)를 yBHI agar에, 클로스트리디움 신덴스(Clostridium scindens)를 GAM agar에서 배양하였다. 24시간 간격으로 총 2회의 계대배양(subculture)을 통해 활성화시킨 후 실험에 사용하였다. 본원 실시예에서 사용된 균주들의 기탁 정보는 다음과 같다. 이하에서는 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 클로스트리디움 신덴스는 'Cs'로, 블라우티아 프로덕타는 각 균주의 종류에 따라 각각 'BpKCTC 또는 Bp, BpYA44, BpMG11, BpMA68'로, 엔테로코커스 패시움은 'Ef'로, 블라우티아 패시스는 'Bf'로, 프로테우스 테라는 'Pt'로 기재하기도 한다.
| 기탁번호 | 기탁일 | 약어 | |||
| 클로스트리디움 신덴스 KBL987 | KCTC 13277BP | 2017. 5. 29. | Cs | ||
| 블라우티아 프로덕타 | ATCC27340 | KCTC15607 | 2008 | Bp* | BpKCTC |
| KBL988 | KCTC 13915BP | 2019. 8. 16. | BpYA44 | ||
| KBL990 | KCTC 13917BP | 2019. 8. 16. | BpMG11 | ||
| KBL991 | KCTC 13918BP | 2019. 8. 16. | BpMA68 | ||
| 엔테로코커스 패시움 KBL986 | KCTC 13914BP | 2019. 8. 16. | Ef | ||
| 블라우티아 패시스 KBL989 | KCTC 13916BP | 2019. 8. 16. | Bf | ||
| 프로테우스 테라 KBL985 | KCTC 13933BP | 2019. 9. 3. | Pt | ||
* 하기 실시예에서 Bp로 언급되는 경우, BpKCTC를 지칭한다.
1-2. 클로스트리디움 디피실리 배양 및 포자 생성
CDI 동물모델에 사용하기 위한 클로스트리디움 디피실리 균주를 배양하여 이로부터 포자를 생성하기 위하여, 클로스트리디움 디피실리 VIP10463 균주를 BHIS agar 배지에 배양하고, 24시간 간격으로 총 2회의 계대 배양을 통해 활성화시킨 후, BHIS broth에 접종하여 24시간 배양하였다. 배양된 균주의 Optical density(OD) 값이 0.2가 되게 조정한 후 SMC agar 배지에 100 ㎕씩 분주하여 도말하고, 37 ℃에서 7일간 배양하였다. 이후 SMC agar에 모든 균체를 긁어 모아 Cold PBS에 현탁한 후 4 ℃에서 24시간 보관하고, 14,000 rpm에서 1분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 Cold PBS로 다시 현탁하는 과정을 2회 반복하였다. 상기 과정을 반복하여 세척된 펠렛은 1 ㎖의 70% 에탄올에 1시간 보관하고, 14,000 rpm에서 1분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 Cold PBS로 세척하는 과정을 2회 반복하였다. 이후 1 ㎖ Cold PBS에 현탁시켜 사용하기 전까지 4 ℃에 보관하였다.
실시예 2. CDI 동물모델에서의 클로스트리디움 디피실리 감염 억제 효능평가 (1) - 각 균주를 4회 투여
2-1: CDI 동물 모델 준비 및 균주 투여
본 실시예에서는 Bp, Ef, Bf 및 Pt 각각을 Cs와 병용 투여시 상승적 CDI 억제 효과가 달성되는지 여부를 확인하기 위하여, Bp, Ef, Bf, Pt 및 Cs 각각의 단독 투여 실험군, Bp, Ef, Bf 및 Pt 각각을 Cs와 병용 투여한 병용 투여 실험군, 대조군으로서 비-감염군 및 PBS를 투여한 감염군에 대해 하기 실험을 진행하였다.
CDI 증상 발현을 위해 C57BL/6 female 6주령의 마우스를 사용하였다. 동물실험 시설에 입고된 마우스는 1주간 순화 및 안정화 기간을 거치고 체중을 측정하여 그룹간 체중 평균과 표준편차를 맞추었다. 각 군당 8마리의 마우스를 배정하였으며, 실험은 2세트 반복하였다.
CDI 예방 동물모델(도 1 참조)에서 3일간 항생제 칵테일(kanamycin (0.4 ㎎/㎖), gentamicin (0.035 ㎎/㎖), colistin (850 U/㎖), metronidazole (0.215 ㎎/㎖), vancomycin (0.045 ㎎/㎖))을 음수 투여하여 장내 미생물 균주를 교란시킨 C57BL/6 마우스에 항생제 투여 3일째 되는 날부터 24시간 간격으로 상기 실험군의 후보 균주를 3회 경구용 존데(zonde)로 경구투여(1×109 CFU/㎖, 200 ㎕/마리)하였고, 3회차 투여 시점으로부터 12시간 경과 후에 후보 균주를 1회 투여하였다. 마지막 후보 균주 투여 시점의 12시간 전에 clindamycin을 복강투여하였고, 마지막 후보 균주 투여 24시간 후에 10,000개의 상기 실시예 1-2로부터 얻은 클로스트리디움 디피실리(C. 디피실리)의 포자를 200 ㎕ PBS에 현탁하여 실험 동물에 경구 투여함으로써 C. 디피실리를 감염시켰다. 각 실험 군 및 대조군의 마우스에서 나타나는 CDI 증상(체중변화) 및 생존에 미치는 영향을 8일간 매일 측정하였다.
2-2: 결과 분석
도 2a 및 도 2b는 포자 감염 후 각각 48시간 및 72시간 후의 체중 감소율을 측정한 결과를 도시하고 있다. C. 디피실리를 감염하지 않은 대조군(non infection)에서의 체중 변화 양상과 비교할 때, C. 디피실리를 감염시킨 후 PBS만을 투여한 대조군(PBS infection)에서는 마우스의 체중이 현저히 감소되는 것으로 나타났다. Bp(BpKCTC) 및 Ef 투여군의 경우 단독 투여시에 비하여 Cs 병용 투여시 체중 감소 억제율이 유의적으로 증가하였고, Bf 및 Pt 투여군의 경우 단독 투여시 Cs와 병용 투여한 경우보다 체중 감소 억제율에서 보다 우수한 효과를 나타내었으며, 이러한 경향성은 72시간 후에 보다 뚜렷하게 관찰되었다.
한편, C. 디피실리를 감염시킨 마우스의 생존율을 측정한 결과, Cs, Bp 및 Ef 단독 투여군은 약 60~80%의 생존율을 나타내, PBS만을 투여한 대조군의 마우스에서의 생존율에 비해 CDI 감염에 대한 생존율을 증가시키는 효과가 있는 것으로 나타났다. 특히, Ef와 Cs의 병용 투여군 및 Bp와 Cs의 병용 투여군에서는 100%의 생존율을 나타내어 Bp와 Ef의 경우 Cs와의 병용 투여에 의하여 생존율 상승 효과가 있음을 확인할 수 있었다(도 2c).
또한, 상기 체중변화 및 생존율 변화 실험 결과를, C. 디피실리 감염 시점 이후 시간의 경과에 따라 다시 정리하여 도 3a 내지 도 3d에 도시하였다. 그 결과, C. 디피실리 감염의 급성기(감염 후 약 2~5일 경과 후)에 체중 감소가 나타났던 투여군들의 경우에도, 급성기가 경과한 후에는 C. 디피실리를 감염시키지 않은 대조군의 마우스 체중과 유사한 수준으로 회복하는 것으로 나타났다. 또한, 생존율의 경우 각 균주들의 단독 또는 병용투여군들 간의 생존율의 차이는 나타났으나 모두 PBS 투여군에 비해 생존율이 더 높게 유지되었다. 특히 Bp 및 Ef의 경우 Cs와의 병용투여군에서, 그리고 Bf 및 Pt의 경우 단독 투여군에서 감염의 급성기(감염 후 약 2~5일 경과 후)의 체중 감소 억제율 및 생존율이 우수한 것으로 나타났다(도 3 참조). 도 3에 도시된 Bf 및 Pt 단독 투여군 및 Bp와 Ef의 Cs와의 병용투여군의 평균 최저 체중은 다음과 같다:
| Bf 단독 투여 | Bp+Cs | Ef+Cs | Pt 단독 투여 | |
| 반복세트 / n | 2세트 / 8 | 2세트 / 8 | 2세트 / 8 | 2세트 / 8 |
| 평균 최저 체중 | 88.7914%(p.i.2) | 92.296%(p.i.2) | 85.532%(p.i.2) | 94.722%(p.i.2) |
| 사망률 | 0% | 0% | 0% | 0% |
* p.i.는 감염 후 일 수를 의미한다.
실시예 3. CDI 동물모델에서 클로스트리디움 디피실리 감염 억제 효능평가 (2) - 각 균주를 2회 투여
3-1: CDI 동물 모델 준비 및 균주 투여
Bp, Ef, Bf, Pt 및 Cs 균주를 단독으로 투여한 경우 또는 이들을 조합하여 병용 투여한 경우의 CDI에 대한 예방 효과를 실시예 2와 다른 동물 모델에서 다시 관찰하였다.
CDI 증상 발현을 위해 C57BL/6 female 6주령의 마우스를 사용하였고, 각 군당 4마리의 마우스를 배정하였다. 동물실험 시설에 입고된 마우스는 1주간 순화 및 안정화 기간을 거치고 체중을 측정하여 그룹간 체중 평균과 표준편차를 맞추었다.
C. 디피실리 포자 투여 6일전 항생제 칵테일(kanamycin (0.4 ㎎/㎖), gentamicin (0.035 ㎎/㎖), colistin (850 U/㎖), metronidazole (0.215 ㎎/㎖), vancomycin (0.045 ㎎/㎖))을 3일간 동물모델에 음수로 제공하고, 정상 식수로 교체한 후 2일간 안정화시켰다.
상기 안정화된 동물 모델에, C. 디피실리 포자 투여 24시간 전 Clindamycin (10 ㎎/㎏)을 복강 투여한 직후, 후보 균주를 경구 투여(1×109 CFU/㎖, 200 ㎕/마리)하고, 포자 감염 12시간 전 후보 균주를 한번 더 투여하였다. 마지막 후보 균주를 투여하고 12시간 후에 10,000개의 상기 실시예 1-2로부터 얻은 C. 디피실리 포자를 200 ㎕ PBS에 현탁하여 실험 동물에 경구 투여하여 감염을 유도하였다. C. 디피실리 포자 감염 당시의 체중을 측정한 후 24시간 간격으로 체중 측정과 사망 개체를 측정하여, CDI 감염 저해 효능을 확인하였다(도 4).
상기 실험을 2회 반복 수행하였고, 2번째 실험에서는 Cs와 Bp, Ef, Pt 및 Bf를 모두 병용 투여한 군에 대해서도 실험하였다.
3-2: 결과 분석
2회 실험 각각에서 측정된 각 후보 균주 투여군의 평균 최저 체중 및 사망률을 하기 표 3 및 표 4에 각각 나타내었고, C. 디피실리 감염 이후 시간의 경과에 따른 체중 변화를 도 5에 나타내었다.
| Bf 단독 투여 | Bp+Cs | Ef+Cs | Pt 단독 투여 | |
| 반복 세트 / n | 1세트 / 4 | 1세트 / 4 | 1세트 / 4 | 1세트 / 4 |
| 평균 최저 체중 | 85.5882%/p.i.3 | 90.3797%/p.i.2 | 91.3861%/p.i.2 | 87.40408%/p.i.3 |
| 사망률 | 0% | 0% | 0% | 0% |
| Bf 단독 투여 | Bp+Cs | Ef+Cs | Pt 단독 투여 | Bp+Ef+Bf+Pt +Cs |
|
| 반복 세트 / n | 1세트 / 4 | 1세트 / 4 | 1세트 / 4 | 1세트 / 4 | 1세트 / 4 |
| 평균 최저 체중 | - | 81.6312% / p.i.3 | 79.5231% / p.i.3 | 80.8238% / p.i.3 | 90.2471% / p.i.2 |
| 사망률 | 100% | 0% | 25% | 50% | 0% |
표 4에서 확인되는 바와 같이, 두번째 실험에서 Cs와 Bp, Ef, Bf 및 Pt를 모두 병용 투여한 군에서 가장 탁월한 체중 감소 억제 및 생존율 향상 효과를 나타내었다. 포자 감염 후 시간 경과에 따른 체중 변화율을 살펴보아도, 상기 5종의 균주를 모두 병용 투여한 군에서 다른 군들에 비하여 우수한 체중 감소 억제율을 나타내었다(도 5 참조). 한편, CDI 유도 후 48시간 및 72시간 후의 체중 변화 및 생존율을 측정한 2회 실험 결과(단, 2번째 실험에서 Cs와 Bp, Ef, Pt 및 Bf를 모두 병용 투여한 군의 실험결과 제외)를 합쳐서 도 6a 내지 도 6c에 나타내었다. 도 6a 내지 도 6c에 나타난 결과를 살펴보면, Bp와 Cs 병용 투여군 및 Ef와 Cs 병용 투여군은 Cs 단독 투여군보다 체중 감소 억제 및 생존율이 향상되는 경향을 보였으나, Bf 단독 투여군 및 Pt 단독 투여군은 Cs 단독 투여군보다 생존율 향상 측면에서 효과가 열등하였다. 도 6a 내지 도 6c에 도시된 실험 결과는 전체적으로 각 군별 효과 차이가 크지 않았는데, 동물 모델이 변경되면서 각 균주의 장내 정착에 필요한 시간이 감소되었던 것이 하나의 이유로 생각된다.
실시예 4. 병용 투여 시 상승 효과를 나타내는 핵심 균주의 확인
실시예 4-1. 각 균주의 상승 효과에 대한 기여 여부 확인
실시예 3에서 가장 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인된 5개 균주 모두를 병용 투여하는 조합(Cs, Bp, Ef, Bf 및 Pt)에서, 각각 하나의 균주를 제외한 4개 균주를 병용 투여하는 다섯 가지 조합의 CDI 억제 효능을 실시예 3에서 사용한 것과 동일한 동물 모델을 사용하여 평가하였다.
비-감염군(Non-infection), PBS 투여 감염군(PBS infection), Cs 단독 투여군의 3개 대조군과 함께, 5개 균주 조합(Cs, Bp, Ef, Bf 및 Pt의 조합; Mix) 및 상기 5개 균주 조합에서 각각 하나의 균주를 제외한 4개 균주 조합(Mix-Cs, Mix-Bp, Mix-Ef, Mix-Bf 및 Mix-Pt)에 대하여, 그룹당(총 9그룹) 4마리씩 2번 반복 실험하였다. 실험군에서 균주는 1×109 CFU/㎖의 농도로 투여하였다.
상기 3개의 대조군과 6개의 실험군에 대해 체중 감소율 및 생존율을 측정한 결과를 도 7a 내지 도 7c에 나타냈다.
도 7a 내지 도 7c로부터 확인되듯이, Cs, Bp, Ef의 경우 조합에서 배제되는 경우 CDI 억제 효능이 유의적으로 감소하는 것으로 나타나, 다른 균주들과 조합되어 병용 투여되었을 때 상승적인 CDI 억제 효과에 기여하는 균으로 밝혀졌다. 이러한 결과를 통하여 Cs를 비롯해 Bp 및 Bf가 CDI 억제 효능을 발휘하는데 중요한 역할을 하며, 실시예 3에서 확인된 바와 같이 Bp와 Ef가 Cs과 함께 조합 사용되었을 때 상승적 CDI 억제 효과를 나타낸다는 점을 재확인할 수 있었다.
실시예 4-2. 균주 투여량 변화에 따른 CDI 억제 효과 확인
또한, 실시예 3과 동일한 방법으로, 5종 균주의 조합(Cs, Bp, Ef, Bf 및 Pt)에서 균주의 전체 투여 농도를 각각 1×107 CFU/㎖(Mix7 실험군), 1×108 CFU/㎖(Mix8 실험군), 1×109 CFU/㎖(Mix9 실험군)로 달리하여 CDI 억제 효능의 변화를 확인하였다. CDI 유도 이후 체중 변화를 측정한 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, CDI 유도 시 일반적으로 대조군(PBS 투여 감염군)의 체중은 20% 정도 감소하는 것으로 나타난 반면, 5종의 균주를 모두 투여하되 균주 투여량을 달리한 3개의 실험군에서, 1×109 CFU/㎖ 및 1×108 CFU/㎖로 5종 균주를 투여한 실험군(각각 Mix9과 Mix8 실험군)의 경우 대조군에 비해 체중 감소율이 유의적으로 감소하였음을 확인할 수 있었다. 그러나, 투여량이 1×107 CFU/㎖인 경우(Mix7 실험군), 체중 감소 억제 면에서 대조군과 유의적 차이가 나타나지 않았다. 따라서, 5종 균주의 투여 시 투여 농도가 1×108 CFU/㎖이상일 때 더욱 우수한 CDI 억제 효과가 나타남을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 상승된 C. 디피실리 감염 억제 효과를 나타내는 최적의 균주 조합 선정
앞서 기재한 실시예에서 Bp와 Ef를 Cs와 함께 조합 사용하였을 때 상승적 CDI 억제 효과가 확인되었는바, 본 실시예에서는 이들 3종 균주 조합을 기초로 추가로 Pt 또는 Bf를 조합하는 경우 CDI 억제 효과를 더욱 상승시킬 수 있는지 확인하였다. 또한, 본 발명의 균주 조합에서 동일한 종에 속하는 상이한 균주를 사용하여도 동등한 CDI 억제 효과를 달성할 수 있을지 확인하기 위해 4종의 Bp 균주(BpKCTC, BpMG11, BpYA44, BpMA68)를 사용하여 실험을 수행하였다.
실시예 3과 동일한 동물 모델을 이용하되, 비-감염군, PBS 감염군, Cs 단독 투여, Cs+Bf+Ef, Cs+Bp+Ef, Cs+BpKCTC, BpMG11, BpYA44 및 BpMA68 중 어느 하나+Ef+Bf의 총 9군으로 나누어 2회 실험하였다.
각 실험군에서 시간 경과에 따른 체중 변화, CDI 유도 48시간 및 72시간 후의 체중 변화, 생존율, 24시간 경과 후 stool c.f.u, 24시간 경과 후 stool toxin 을 측정한 결과를 도 9a 내지 9f에 도시하였다.
도 9a 내지 9f의 결과를 종합하여 보면, Cs+Bp+Ef+Bf의 4종의 균주 조합에서 Cs 단독 투여나 Cs+Bp+Ef 또는 Cs+Bp+Bf의 3종 균주 조합에 비하여 체중 감소 억제 및 생존율 측면에서 우수한 효과를 나타내었으며, C. 디피실리 감염 유도 24시간 후 stool c.f.u. 및 stool toxin도 현저히 감소됨을 확인하였다. 또한, 이러한 본 발명의 효과는 Bp 균주로서 BpKCTC, BpMA66, BpYA44 및 BpMG11를 사용하는 경우 모두 공통적으로 관찰되어 본 발명에 따른 균주 조합에서 각 종에 속하는 다양한 균주를 이용하여 CDI 감염 억제 효과를 달성할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 6. 최적의 균주 조합(Cs, Bp, Bf 및 Ef)의 상승적 효과 재확인
실시예 5에서 우수한 CDI 억제 효과를 나타냈던 최적의 균주 조합인, Cs, Bp, Bf 및 Ef 균주의 조합에 따른 상승적 CDI 억제 효과를 다시 한 번 확인하였다.
먼저, Cs+Bp+Bf+Ef 조합을 투여한 경우와 Cs 균주를 단독으로 투여한 경우에 따른 효과 차이를 비교하였다.
또한, Cs+Bp+Bf+Ef 조합을 투여한 경우와 이것에 Pt를 추가한 Cs+Bp+Bf+Ef+Pt 조합을 투여한 경우, 또는 Bf 대신 Pt를 추가한 Cs+Bp+Pt+Ef 조합을 투여한 경우에 따른 효과 차이를 비교하였다. 나아가, 3가지 균주 Cs+Bp+Ef 조합을 투여한 경우와의 효과 차이를 비교하였다.
실시예 3과 동일한 동물 모델을 이용하되, PBS 감염군, Cs+Bp+Bf+Ef 투여군, Cs 단독 투여군, Cs+Bp+Bf+Ef+Pt 투여군, Cs+Bp+Pt+Ef 투여군 및 Cs+Bp+Ef 투여군으로 나누어 2회 실험하여 각 실험군에서 시간 경과에 따른 체중 변화, 생존율, C. 디피실리의 c.f.u, 24시간 경과 후 stool c.f.u, 24시간 경과 후 stool toxin 을 측정한 결과를 도 10a 내지 도 10e에 도시하였다.
도 10a 내지 도 10e의 결과를 종합하여 보면, Cs+Bp+Bf+Ef의 4종의 균주 조합에서는, Cs 균주를 단독 투여하거나 Cs+Bp+Bf+Ef+Pt 조합, Cs+Bp+Pt+Ef 조합 또는 Cs+Bp+Ef 조합으로 투여하는 경우에 비하여 체중 감소 억제 및 생존율 측면에서 우수한 효과를 나타내었으며, C. 디피실리 감염 유도 24시간 후 stool c.f.u. 및 stool toxin도 현저히 감소됨을 확인하였다.
특히, Cs+Bp+Bf+Ef의 4종의 균주 조합의 경우, 여기에 Pt를 추가한 조합으로 투여시킨 경우와 비교할 때에도 체중 감소를 억제하는 효과가 더욱 우수하게 나타났다(도 10b). 따라서, CDI 감염 억제 효과를 나타내는 균주를 더 많이 투여한다고 해서 반드시 더 우수한 효과를 나타내는 것은 아니라는 점을 확인할 수 있었고, 다양한 균주 조합들 중에서도 Cs+Bp+Bf+Ef의 조합이 가장 우수한 효과를 기대할 수 있음을 확인할 수 있었다.
또한, Cs+Bp+Bf+Ef 조합과 같이 4가지 균주를 조합하여 투여한 경우, Cs+Bp+Ef 조합으로 3가지 균주를 조합해 투여한 경우와 비교하여 stool c.f.u. 및 stool toxin의 감소 효과 역시 매우 현저한 것으로 측정되었으므로, C. 디피실리의 장내 정착이나 감염 후 장내 독소 생성을 억제하여 CDI 감염에 대한 저해 효과가 더 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 7. 최적의 균주 조합(Cs, Bp, Bf 및 Ef)의 Ex vivo 실험
실시예 5에서 우수한 CDI 억제 효과를 나타냈던 최적의 균주 조합인, Cs, Bp, Bf 및 Ef 균주 조합의 CDI 억제 효과를 Ex vivo 실험을 통해 확인하였다.
실시예 3과 동일한 동물 모델을 이용하되, Clindamycin 투여 24시간 후 개복하여 막창자(cecum) 부분을 분리하여 무게를 측정하였다. 그리고 이를 5% 내지 10%(W/V)의 농도가 되도록 PBS로 희석한 다음, 상기 막창자로부터 분리한 1% 배양액을 14 ㎖ round bottom tube에 1 ㎖씩 분주하였다. 대조군과 실험군 모두 C. 디피실리를 1×107 CFU/㎖ 만큼 접종하였으며, 실험군에는 본 발명의 균주를 1×107 CFU/㎖ 접종하였다. 실험군에는 Cs 균주를 단독 접종하거나 다양한 조합의 균주를 접종하였고 대조군에는 PBS를 접종하여 37 ℃의 온도에서 36시간 배양하였다. 구체적으로, Cs+Bp+Bf+Ef(CBBE), Bp+Bf+Ef(ΔCS), Cs+Bf+Ef(ΔBP), Cs+Bp+Ef(ΔBF), Cs+Bp+Bf(ΔEF)의 조합으로 실험군을 구성하였다. 배양액을 원심분리하여 침전물로부터 박테리아 DNA를 추출하였고, 상층액은 pH를 측정하였다. 상기 분리된 박테리아 DNA는 각 균주에 대한 종 특이적 프라이머(클로스트리디움 디피실리, 클로스트리디움 신덴스, 블라우티아 프로덕타, 블라우티아 패시스의 종 특이적 프라이머, 서열번호 9 내지 서열번호 16)를 사용하여 정량하였다.
도 11a에서는 각 균주의 조합에 따른 C. 디피실리의 상대적인 수를 측정하여 도시하였으며, 실험군에서는 모두 대조군에 비해 C. 디피실리의 감소 효과가 나타났고 특히 Cs+Bp+Bf+Ef(CBBE)의 조합에서 가장 효과가 우수하게 나타났다. 한편, Ex vivo의 샘플 내에서 CDI 감염에 대한 억제 효능이 있는 이차담즙산(deoxycholic acid; DCA)의 농도를 측정하여 비교한 결과, Cs+Bp+Bf+Ef(CBBE) 조합의 경우와 Cs 단독 접종의 경우의 수치가 유사하게 측정되어 두 가지 경우 모두 CDI 감염 억제 효능이 우수하게 나타남을 확인하였다(도 11b).
원심분리한 상층액의 pH 분석 결과, Cs+Bp+Bf+Ef(CBBE) 조합의 접종 실험군에서는 샘플 내 pH가 낮게 형성되어, 상기 균주 조합에 의한 CDI 감염 억제 효과는, 이차담즙산에 의한 요인과 pH를 낮추는 요인에 의해 발생하는 것임을 확인할 수 있었다(도 11c). 그리고, Cs+Bp+Bf+Ef(CBBE)의 샘플 내 각 균주들의 수를 측정하여 이를 pH 및 C. 디피실리 균주의 수와 비교함으로써 상관관계를 분석한 결과, 샘플의 pH를 낮추는 역할을 하는 것은 Bp와 Bf에 의한 것임을 확인할 수 있었으며, C. 디피실리의 생장 억제에는 Bp, Bf 및 Cs 균주가 관련되어 있음을 확인할 수 있었다(도 11d 및 도 11e). 따라서, 상기 균주의 조합은 담즙산의 생성 및 pH의 감소를 통해 CDI 감염 억제와 관련하여 상승 효과를 나타낼 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 8. 본 발명의 균주 조합은 면역계에 영향을 미치지 않음
CD4+ T 세포는 전사 인자인 Foxp3를 발현하며 면역학적 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 대장에는 Foxp3 발현 세포가 다수 존재하고 대장에 국재하는 Treg 세포만이 면역 억제 사이토카인인 IL-10을 높은 수준으로 항상적으로 발현한다고 보고되어 있다. 이에, Treg 세포를 유도함으로써 면역에 의한 과도한 염증을 억제하여 자가면역질환, 염증성 질환 및 다양한 세균 감염을 예방 또는 치료하려는 시도가 있었다(유럽 특허 제2 575 835호).
본 실시예에서는 본 발명의 균주 조합이 나타내는 C. 디피실리 감염 억제 효과가 Treg 세포의 유도와 관련된 것인지 여부를 확인하기 위하여, 항생제 미처리군(ABX(-)), 항생제 처리+PBS 투여군(ABX(+)_PBS), 항생제 처리 및 본 발명의 균주 조합 투여군(ABX(+)_MIX), 및 항생제 처리+양성 대조 균주 투여군(ABX(+)_KBL693)의 4군으로 나누어 실험하였으며, 각 군당 4마리의 마우스를 배정하였다. 본 발명의 균주 조합으로는 Ef(KBL986) + Cs(KBL987) + Bp(KBL988) + Bf(KBL989)를 투여하였으며, 투여량은 3일째까지는 마우스당 총 1~5 × 108 CFU/200 ㎕, 4일 및 5일에는 1~5 × 109 CFU/200 ㎕이었다. 또한, 양성 대조 균주로는 락토바실러스 크리파투스 KBL693 (기탁일: 2018. 4. 27., 기탁번호: KCTC 13519BP)를 투여하였다.
항생제 미처리군을 제외한 나머지 3군에서는 마우스에 9일간 항생제(ABX)를 처리함으로써 장내 미생물을 제거하고, 3일간 안정화 후에 3일째부터 매일 1회 PBS, 본 발명의 균주 조합 또는 양성 대조 균주를 5일간 투여하였다. 3일 투여 후(D3) 및 5일 투여를 완료한 후 2일 후(D7)에 희생한 마우스에서 colonic LP, siLP 및 mesenteric LNs의 Treg 세포와 iTreg 세포를 측정하였다(도 12).
측정 결과, colonic Treg 세포는 D3보다 D7에서 증가되어 항생제 처리가 제대로 이루어졌음을 확인할 수 있었다(도 13a). 본 발명의 균주 조합을 투여한 군은 PBS를 투여한 군과 유사한 colonic Treg 세포 및 iTreg 세포 수준을 나타내어 Treg 세포의 증가를 유도하지 않는 것으로 나타났다(도 13). 반면에, 양성 대조 균주인 KBL693 투여 균주에서는 Foxp3+Treg의 상당한 증가를 나타내었다(도 15의 좌측 도면 참조). 한편, siLP 및 mesenteric LNs의 경우, 항생제 처리 및 본 발명 균주 조합 투여에 의하여 영향을 받지 않았다(도 13b, 도 14 및 도 15).
이상으로 본 발명의 특정 실시 태양을 상세히 설명하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아님은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 보호 범위는 첨부된 청구항과 이들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
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Infection
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clostridium scindens
<400> 1
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ggtagttggc ggggtaacgg cccaccaagc cgacgatcag tagccgacct gagagggtga 300
ccggccacat tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata 360
ttgcacaatg ggggaaaccc tgatgcagcg acgccgcgtg aaggatgaag tatttcggta 420
tgtaaacttc tatcagcagg gaagaagatg acggtacctg actaagaagc cccggctaac 480
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aaagggagcg tagacggcga tgcaagccag atgtgaaagc ccggggctca accccgggac 600
tgcatttgga actgcgtggc tggagtgtcg gagaggcagg cggaattcct agtgtagcgg 660
tgaaatgcgt agatattagg aggaacacca gtggcgaagg cggcctgctg gacgatgact 720
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<210> 6
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enterococcus faecium
<400> 6
ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa gtcgtacgct tctttttcca 60
ccggagcttg ctccaccgga aaaagaagag tggcgaacgg gtgagtaaca cgtgggtaac 120
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aatcttcggc aatggacgaa agtctgaccg agcaacgccg cgtgagtgaa gaaggttttc 420
ggatcgtaaa actctgttgt tagagaagaa caaggatgag agtaactgtt catcccttga 480
cggtatctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt 540
ggcaagcgtt gtccggattt attgggcgta aagcgagcgc aggcggtttc ttaagtctga 600
tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa ctgggagact tgagtgcaga 660
agaggagagt ggaattccat gtgtagcggt gaaatgcgta gatatatgga ggaacaccag 720
tggcgaaggc ggctctctgg tctgtaactg acgctgaggc tcgaaagcgt ggggagcaaa 780
caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttggagggtt 840
tccgcccttc agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acgaccgcaa 900
ggttgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt 960
cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcctt tgaccactct agagatagag 1020
cttccccttc gggggcaaag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1080
atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttattgt tagttgccat cattcagttg 1140
ggcactctag caagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat 1200
catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg gaagtacaac gagttgcgaa 1260
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gcctgcatga agccggaatc gctagtaatc gcggatcagc acgccgcggt gaatacgttc 1380
ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga 1440
ggtaaccttt ttggagccag ccgcctaagt gggatagatg attggggtga agtcgtaaca 1500
1500
<210> 7
<211> 1444
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Blautia faecis
<400> 7
ggctcaggat gaacgctggc ggcgtgctta acacatgcaa gtcgaacggg aaacatttta 60
ttgaagcttc ggcggattta atttgtttct agtggcggac gggtgagtaa cgcgtgggta 120
acctgcctta tactggggga taacagccag aaatgactgc taataccgca taagcgcaca 180
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taaacgatga atactaggtg tcagggagca cagctctttg gtgccgccgc aaacgcatta 840
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catgggagtc agtaacgccc gaagtcagtg acctaactgc aaggaggagc tgccgaagcg 1440
ggac 1444
<210> 8
<211> 1443
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Proteus terrae
<400> 8
taacacatgc aagtcgagcg gtaacaggag aaagcttgct ttcttgctga cgagcggcgg 60
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gctggtctga gaggatgatc agccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300
aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg atgcagccat gccgcgtgta 360
tgaagaaggc cttagggttg taaagtactt tcagcgggga ggaaggtgtt aagattaata 420
ctcttagcaa ttgacgttac ccgcagaaga agcaccggct aactccgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacgg agggtgcaag cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgc acgcaggcgg 540
tcaattaagt cagatgtgaa agccccgagc ttaacttggg aattgcatct gaaactggtt 600
ggctagagtc ttgtagaggg gggtagaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660
tggaggaata ccggtggcga aggcggcccc ctggacaaag actgacgctc aggtgcgaaa 720
gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gctgtaaacg atgtcgattt 780
agaggttgtg gtcttgaacc gtggcttctg gagctaacgc gttaaatcga ccgcctgggg 840
agtacggccg caaggttaaa actcaaatga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 900
atgtggttta attcgatgca acgcgaagaa ccttacctac tcttgacatc cagagaatcc 960
tttagagata gaggagtgcc ttcgggaact ctgagacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag 1020
ctcgtgttgt gaaatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat cctttgttgc 1080
cagcgcgtga tggcgggaac tcaaaggaga ctgccggtga taaaccggag gaaggtgggg 1140
atgacgtcaa gtcatcatgg cccttacgag tagggctaca cacgtgctac aatggcagat 1200
acaaagagaa gcgacctcgc gagagcaagc ggaactcata aagtctgtcg tagtccggat 1260
tggagtctgc aactcgactc catgaagtcg gaatcgctag taatcgtaga tcagaatgct 1320
acggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg agtgggttgc 1380
aaaagaagta gtagcttaac cttcgggagg gcgcttacca ctttgtgatt catgactggg 1440
gtg 1443
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clostridium Difficile forward primer
<400> 9
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<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clostridium Difficile reverse primer
<400> 10
agtagtatct actaccatta acagtctgc 29
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clostridium scindens forward primer
<400> 11
ctacggctac gggcagatg 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clostridium scindens reverse primer
<400> 12
ggatgtacca ctggccttct 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> Blautia producta forward primer
<400> 13
cccggggagt aaagttgaat 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Blautia producta reverse primer
<400> 14
cgtcaggaaa agtggcttct 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Blautia faecis forward primer
<400> 15
tgagacgaaa tccagtgcag 20
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Blautia faecis reverse primer
<400> 16
cagtcggatt gcaagtaatt gacaat 26
Claims (12)
- 클로스트리디움 신덴스(Clostridium scindens), 블라우티아 프로덕타(Blautia producta) 및 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)의, 균체, 배양물, 파쇄물 및 추출물로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하는, 클로스트리디움 디피실리(Clostridium difficile) 감염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
클로스트리디움 신덴스가 서열번호 1과 97% 이상 동일한 16s rDNA 서열을 갖고, 블라우티아 프로덕타가 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나와 97% 이상 동일한 16s rDNA 서열을 갖고, 엔테로코커스 패시움이 서열번호 6과 97% 이상 동일한 16s rDNA 서열을 갖는, 약학 조성물. - 제 1 항에 있어서,
클로스트리디움 신덴스가 기탁번호 KCTC13277BP인 클로스트리디움 신덴스 KBL987 균주이고, 블라우티아 프로덕타가 기탁번호 KCTC15607인 블라우티아 프로덕타 ATCC27340 균주, 기탁번호 KCTC13915BP인 블라우티아 프로덕타 KBL988 균주, 기탁번호 KCTC13917BP인 블라우티아 프로덕타 KBL990 균주 또는 기탁번호 KCTC13918BP인 블라우티아 프로덕타 KBL991 균주이며, 엔테로코커스 패시움이 기탁번호 KCTC13914BP인 엔테로코커스 패시움 KBL986 균주인, 약학 조성물. - 제 1 항에 있어서,
블라우티아 패시스(Blautia faecis) 및 프로테우스 테라(Proteus terrae) 중 1 종 이상의, 균체, 배양물, 파쇄물 및 추출물로 이루어진 군 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 약학 조성물. - 제 4 항에 있어서,
블라우티아 패시스가 서열번호 7과 97% 이상 동일한 16s rDNA 서열을 갖고, 프로테우스 테라가 서열번호 8과 97% 이상 동일한 16s rDNA 서열을 갖는, 약학 조성물. - 제 4 항에 있어서,
블라우티아 패시스가 기탁번호 KCTC13916BP인 블라우티아 패시스 KBL989 균주이고, 프로테우스 테라가 기탁번호 KCTC13933BP인 프로테우스 테라 KBL985 균주인, 약학 조성물. - 제 4 항에 있어서,
블라우티아 패시스 및 프로테우스 테라의, 균체, 배양물, 파쇄물 및 추출물로 이루어진 군 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 약학 조성물. - 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
1X108 CFU/ml 내지 1X1011 CFU/ml의 균체를 포함하는, 약학 조성물. - 클로스트리디움 신덴스, 블라우티아 프로덕타 및 엔테로코커스 패시움의, 균체, 배양물, 파쇄물 및 추출물로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하는, 클로스트리디움 디피실리 감염의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제 9 항에 있어서,
블라우티아 패시스 및 프로테우스 테라 중 1 종 이상의, 균체, 배양물, 파쇄물 및 추출물로 이루어진 군 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 식품 조성물. - 제 9 항에 있어서,
블라우티아 패시스 및 프로테우스 테라의, 균체, 배양물, 파쇄물 및 추출물로 이루어진 군 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 식품 조성물. - 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
1X108 CFU/ml 내지 1X1011 CFU/ml의 균체를 포함하는, 식품 조성물.
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