CN109721656B - 靶向rankl的治疗性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了RANKL的单克隆抗体，特别是高亲和力的RANKL人源化单克隆抗体。本发明还提供与人、食蟹猴和小鼠的RANKL交叉反应的功能性单克隆抗体。本发明进一步提供了本发明的抗体的氨基酸序列、克隆或表达载体、宿主细胞和用于表达或分离抗体的方法、鉴定抗体的表位。还提供包含本发明抗体的治疗组合物。本发明还提供了用抗RANKL抗体治疗癌症和其它疾病的方法。

Description

靶向RANKL的治疗性抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年10月27日提交的PCT专利申请序列号PCT/CN2017/108054的权益和优先权，其全部内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明一般涉及针对RankL的抗体及其组合物，以及使用抗RankL抗体治疗与骨丢失相关的疾病的疗法。
背景技术
NF kappa-B配体(RANKL)的受体激活剂，也称为骨保护素配体(OPGL)和肿瘤坏死因子配体超家族成员11(TNFSF11)，是TNF超家族的成员(Anderson DM,et.al,Nature 390(6656):175-179)。RANKL可以在细胞表面或以可溶形式表达(Findlay DM,et.al,Osteoporos Int 22(10):2597-2602)。通过与破骨细胞及其前体上的受体RANK结合，介导破骨细胞的形成、活化和存活(Hsu H,et.al,Proc Natl Acad Sci U S A.1999Mar 30；96(7):3540-2545)。越来越多的证据也表明，肿瘤细胞在骨内相互作用，刺激RANK-RANKL***的受体激活剂，导致癌症诱发的骨质破坏(Roodman GD,N Engl J Med 2004；350:1655-1664)。
早期动物研究证明了RANKL作为治疗破骨细胞介导的骨丢失的治疗靶标的潜力(Lacey DL,et.al,Cell.1998；93:165-176；Ann E.Kearns,et.al,Endocrine Reviews 29(2):155-192)。使用OPG Fc融合蛋白(一种内源性RNAKL抑制剂)的动物研究和临床试验提供了RANKL在骨重建中至关重要的有力证据(Ann E.Kearns,et.al,Endocrine Reviews 29(2):155-192；Bekker PJ,J Bone Miner Res.2001；16:348-360)。
Denosumab是一种经FDA批准的RANKL全人单克隆抗体，其临床研究显示椎骨、非椎骨和髋部骨折明显减少，并提供了与绝经后骨质疏松症女性使用denosumab相符的证据(David W.Dempster,Clin Ther.2012；34:521-536)。三项关键的随机III期试验也表明，Denosumab在预防骨骼相关事件(SRE)方面优于唑来膦酸，对晚期癌症骨转移患者具有良好的安全性和便利性(Clin Ther.2012；34:521-536；Prasad Narayanan,Journal ofCancer.2013；2(4):272-277)。
发明内容
本发明提供分离的抗体，特别是单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
一方面，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段与人、猴和小鼠RANKL结合。
一方面，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段
a)结合于人RANKL，KD为6.98E-10M以下；并且
b)结合于猴RANKL，KD为5.32E-11M以下。
前述抗体或抗原结合片段具有下列性质中的至少一种：
a)结合于人RANKL，KD为6.98E-10M至6.33E-11M，并且结合于猴RANKL，KD为5.32E-11M至9.03E-12M；
b)抑制RANKL介导的细胞功能；
c)抑制RAW细胞分化成破骨细胞样细胞。
本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，其包含一个氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自由SEQ ID NOs﹕1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、和14所组成的组中的序列具有至少70％、80％、90％、95％、或99％的同源性，
其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合RANKL。
本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，其包含一个氨基酸序列，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NOs﹕1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、和14所组成的组中的序列，
其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合RANKL。
本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，包含：
a)重链可变区，其具有的氨基酸序列与选自由SEQ ID NOs﹕1、2、3、4、5、6、和7所组成的组中的序列具有至少70％、80％、90％或95％的同源性；以及
b)轻链可变区，其具有的氨基酸序列与选自由SEQ ID NOs﹕8、9、10、11、12、13、和14所组成的组中的序列具有至少70％、80％、90％或95％的同源性，
其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合RANKL。
本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，包含：
a)重链可变区，其具有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO﹕1、2、3、4、5、6、和7所组成的组中的序列；以及
b)轻链可变区，其具有的氨基酸序列选自由SEQ ID NOs﹕8、9、10、11、12、13、和14所组成的组中的序列，
其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合RANKL。
在各种实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：
a)具有选自SEQ ID NO﹕1的氨基酸序列的重链可变区；和
b)具有选自SEQ ID NO﹕8的氨基酸序列轻链的可变区，
其中抗体或抗原结合片段特异性结合RANKL；
或抗体或其抗原结合片段包括：
a)具有选自SEQ ID NO﹕2的氨基酸序列的重链可变区；和
b)具有选自SEQ ID NO﹕9的氨基酸序列的轻链可变区，
其中抗体或抗原结合片段特异性结合RANKL；
或抗体或其抗原结合片段包括：
a)具有选自SEQ ID NO﹕3的氨基酸序列的重链可变区；和
b)具有选自SEQ ID NO﹕10的氨基酸序列的轻链可变区，
其中抗体或抗原结合片段特异性结合RANKL；
或抗体或其抗原结合片段包括：
a)具有选自SEQ ID NO﹕4的氨基酸序列的重链可变区；和
b)具有选自SEQ ID NO﹕11的氨基酸序列的轻链可变区，
其中抗体或抗原结合片段特异性结合RANKL；
或抗体或其抗原结合片段包括：
a)具有选自SEQ ID NO﹕5的氨基酸序列的重链可变区；和
b)具有选自SEQ ID NO﹕12的氨基酸序列的轻链可变区
其中抗体或抗原结合片段特异性结合RANKL；
或抗体或其抗原结合片段包括：
a)具有选自SEQ ID NO﹕6的氨基酸序列的重链可变区；和
b)具有选自SEQ ID NO：13的氨基酸序列的轻链可变区，
其中抗体或抗原结合片段特异性结合RANKL；
或抗体或其抗原结合片段包括：
a)具有选自SEQ ID NO：7的氨基酸序列的重链可变区；和
b)具有选自SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区，
其中抗体或抗原结合片段特异性结合RANKL；
所述抗体的序列示于表1和序列表中。
表1抗体的氨基酸序列
Figure GDA0003672842130000041
Figure GDA0003672842130000051
另一方面，本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，包含互补决定区(CDR)，其具有的氨基酸序列选自由SEQ ID NOs﹕15-36所组成的组中的序列，
其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合RANKL。
另一方面，本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，包含：
包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区；以及
包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，
其中重链可变区CDR3序列包含选自由SEQ ID NO﹕15、16、17所组成的组中的氨基酸序列及其保守性修饰，
其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合RANKL。
优选地，其中前述抗体或其抗原结合片段的所述轻链可变区CDR3序列包含选自由SEQ ID NOs﹕18、19、20、21所组成的组中的氨基酸序列及其保守性修饰。
优选地，其中前述抗体或其抗原结合片段的所述重链可变区CDR2序列包含选自由SEQ ID NO﹕22、23、24、25所组成的组中的氨基酸序列及其保守性修饰。
优选地，其中前述抗体或其抗原结合片段的所述轻链可变区CDR2序列包含选自由SEQ ID NO﹕26、27、28、29所组成的组中的氨基酸序列及其保守性修饰。
优选地，其中前述抗体或其抗原结合片段的所述重链可变区CDR1序列包含选自由SEQ ID NO﹕30、31、32所组成的组中的氨基酸序列及其保守性修饰。
优选地，本发明所述的抗体，其中前述抗体或其抗原结合片段的所述轻链可变区CDR1序列包含选自由SEQ ID NO﹕33、34、35、36所组成的组中的氨基酸序列及其保守性修饰。
在更优选的实施方案中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合RANKL并且包含：包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区；和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：
a)重链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO：30、31和32的氨基酸序列的氨基酸序列，所述CDR2序列包含选自氨基酸的氨基酸序列SEQ ID NO：22、23、24、和25的酸序列，所述CDR3序列包含选自SEQ ID NO：15、16、和17的氨基酸序列的氨基酸序列；
b)和轻链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NOs：33、34、35、和36的氨基酸序列的氨基酸序列，CDR2序列包含选自组的氨基酸序列由SEQ ID NO：26、27、28、和29的氨基酸序列组成的CDR3序列包含选自SEQ ID NOs：18、19、20、和21的氨基酸序列的氨基酸序列，
其中抗体或抗原结合片段特异性结合RANKL。
优选的抗体或其抗原结合片段包括：
a)包含SEQ ID NO：30的重链可变区CDR1；
b)包含SEQ ID NO：22的重链可变区CDR2；
c)包含SEQ ID NO：15的重链可变区CDR3；
d)包含SEQ ID NO：33的轻链可变区CDR1；
e)包含SEQ ID NO：26的轻链可变区CDR2；
f)包含SEQ ID NO：18的轻链可变区CDR3；
其中抗体或抗原结合片段特异性结合RANKL。
另一种优选的抗体或其抗原结合片段包括：
a)包含SEQ ID NO：31的重链可变区CDR1；
b)包含SEQ ID NO：23的重链可变区CDR2；
c)包含SEQ ID NO：16的重链可变区CDR3；
d)包含SEQ ID NOs：34的轻链可变区CDR1；
e)包含SEQ ID NO：27的轻链可变区CDR2；
f)包含SEQ ID NO：19的轻链可变区CDR3；
其中抗体或抗原结合片段特异性结合RANKL。
另一种优选的抗体或其抗原结合片段包括：
a)包含SEQ ID NO：32的重链可变区CDR1；
b)包含SEQ ID NO：24的重链可变区CDR2；
c)包含SEQ ID NO：17的重链可变区CDR3；
d)包含SEQ ID NO：35的轻链可变区CDR1；
e)包含SEQ ID NO：28的轻链可变区CDR2；
f)包含SEQ ID NO：20的轻链可变区CDR3；
其中抗体或抗原结合片段特异性结合RANKL。
另一种优选的抗体或其抗原结合片段包括：
a)包含SEQ ID NO：30的重链可变区CDR1；
b)包含SEQ ID NO：25的重链可变区CDR2；
c)包含SEQ ID NO：15的重链可变区CDR3；
d)包含SEQ ID NO：36的轻链可变区CDR1；
e)包含SEQ ID NO：29的轻链可变区CDR2；
f)包含SEQ ID NO：21的轻链可变区CDR3；
其中抗体特异性结合RANKL。
另一种优选的抗体或其抗原结合片段包括：
a)包含SEQ ID NO：30的重链可变区CDR1；
b)包含SEQ ID NO：22的重链可变区CDR2；
c)包含SEQ ID NO：15的重链可变区CDR3；
d)包含SEQ ID NO：33的轻链可变区CDR1；
e)包含SEQ ID NO：26的轻链可变区CDR2；
f)包含SEQ ID NO：18的轻链可变区CDR3；
其中抗体或抗原结合片段特异性结合RANKL。
另一种优选的抗体或其抗原结合片段包括：
a)包含SEQ ID NO：31的重链可变区CDR1；
b)包含SEQ ID NO：23的重链可变区CDR2；
c)包含SEQ ID NO：16的重链可变区CDR3；
d)包含SEQ ID NO：34的轻链可变区CDR1；
e)包含SEQ ID NO：27的轻链可变区CDR2；
f)包含SEQ ID NO：19的轻链可变区CDR3；
其中抗体或抗原结合片段特异性结合RANKL。
另一种优选的抗体或其抗原结合片段包括：
a)包含SEQ ID NO：32的重链可变区CDR1；
b)包含SEQ ID NO：24的重链可变区CDR2；
c)包含SEQ ID NO：17的重链可变区CDR3；
d)包含SEQ ID NO：35的轻链可变区CDR1；
e)包含SEQ ID NO：28的轻链可变区CDR2；
f)包含SEQ ID NO：20的轻链可变区CDR3；
其中抗体或抗原结合片段特异性结合RANKL。
所述抗体的CDR序列显示在表2和序列表中。
表2抗体的CDR序列
Figure GDA0003672842130000091
本发明的抗体可以是嵌合抗体。
本发明的抗体可以是人源化抗体。
本发明的抗体可以是完全人抗体。
本发明的抗体可以是大鼠抗体。
本发明所述抗体或抗原结合片段具有下列性质中的至少一种：
a)结合于人RANKL，KD为6.98E-10M至6.33E-11M，和结合于猴RANKL，KD为5.32E-11M至9.03E-12M；
b)抑制RANKL介导的细胞功能；
c)抑制RAW细胞分化成破骨细胞样细胞。
在另一方面，本发明提供了编码抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
本发明提供克隆或表达载体，其包含编码抗体的核酸分子或其抗原结合片段。
本发明还提供了包含一种以上克隆或表达载体的宿主细胞。
另一方面，本发明提供了一种方法，包括培养上述宿主细胞并分离抗体；其中，通过在具有人RankL蛋白的小鼠中免疫来制备抗体。
本发明提供了包含人免疫球蛋白重链和轻链转基因的转基因动物诸如小鼠，其中所述动物表达本发明的抗体。
本发明提供了由本发明的动物制备的杂交瘤，其中杂交瘤产生所述抗体。
在又一方面，本发明提供一种药物组合物，包含如本发明所述的抗体或其抗原结合片段，以及一种以上药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
本发明提供一种用于制备抗RANKL抗体或其抗原结合片段的方法，包括：
(a)提供：
(i)一个重链可变区的抗体序列，其包含选自由SEQ ID NO﹕30-32所组成的组中的CDR1序列，选自由SEQ ID NO﹕22-25所组成的组中的CDR2序列以及选自由SEQ ID NO﹕15-17所组成的组中的CDR3序列；和/或
(ii)一个轻链可变区的抗体序列，其包含选自由SEQ ID NOs﹕33-36所组成的组中的CDR1序列，选自由SEQ ID﹕26-29所组成的组中的CDR2序列以及选自由SEQ ID NOs﹕18-21所组成的组中的CDR3序列；并且
(b)将改变的抗体序列表达成蛋白质。
本发明还提供了预防或治疗受试者骨丢失相关疾病的方法，该方法包括给需要的受试者施用治疗有效量的本发明的上述抗体或抗原结合片段。
本发明还提供预防或治疗受试者骨丢失相关疾病的组合方法，包括给予需要的受试者治疗有效量的本发明的上述抗体或抗原结合片段，并给予受试者治疗有效量的免疫检查点抗体。
本发明中的免疫检查点抗体包括CTLA-4抗体、PD-1抗体、或PD-L1抗体。
本发明还提供了所述抗体或其抗原结合片段在制备用于预防或治疗与骨丢失相关的疾病的药物中的用途。
所述疾病包括克罗恩病、***、慢性肾病、痛风、类风湿性关节炎、神经性厌食症、重型地中海贫血症、状腺功能亢进症、或癌症。
所述癌症选自黑素瘤、肾癌、***癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、和直肠癌。
发明的有益效果
本发明中公开的抗体具有高结合亲和力，特异性结合人和猴RANKL蛋白；有效预防或治疗与骨丢失相关的疾病。
其中一种抗体不仅与人和猴RANKL结合，而且还与鼠RANKL结合，这可大大促进其在小鼠肿瘤模型中的功效的临床前验证。
附图说明
图1示出抗体WBP114.5.2.1、WBP114_5.14.1、WBP114_5.20、WBP114_7.80、和Prolia与人RANKL的结合。
图2示出WBP114.5.2.1、WBP114_5.14.1、WBP114_5.20、WBP114_7.80、和Prolia的阻断测定。
图3示出抗体WBP114_5.20与小鼠RANKL的依赖性结合。
图4示出所选抗体的NF-κB报告基因测定。
图5示出所选抗体的RAW264.7细胞分化测定。
图6显示针对Prolia的所选抗体的表位联合。
图7显示了人源化抗体的ELISA结合测定。
图8显示了人源化抗体的ELISA阻断测定。
图9显示了人源化抗体的NF-κB报告基因测定。
图10显示人源化抗体的RAW264.7细胞分化测定。
具体实施方式
下面通过具体实施方式及实验数据对本发明作进一步的说明。尽管为了清楚的目的，在下文中使用了专用术语，但这些术语并不意味着定义或限制本发明的范围。
术语“核因子-κB配体的受体激活剂”、“RANKL”、“TNF相关的激活诱导的细胞因子”、“TRANCE”、“骨保护素配体”、“OPGL”、“破骨细胞分化因子”、“ODF”术语可互换使用，包括变体、同种型、人RANKL的物种同源物或其他物种的RANKL，以及具有至少一个具有RANKL的共同表位的类似物。
如本文中所使用，术语“抗体”包括完整抗体和任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。“抗体”是指包含至少两条重链(H)和两条轻链(L)并通过二硫键相互连接的，或其抗原结合部分的蛋白质。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域，CH1，CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区的。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分成：称为互补决定区(CDR)的高变区，以及穿插分布的称为构架区(FR)的更保守区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端以下面的顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。
术语“抗体”，在本申请中所用的是指免疫球蛋白或其片段或它们的衍生物，并且包括其包含的抗原结合位点的任何多肽，而不管其是否是在体外或体内产生。该术语包括但不限于，多克隆、单克隆、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂合的、突变的、嫁接的抗体。术语“抗体”还包括抗体片段例如Fab、F(ab')2、FV、scFv、Fd、dAb和其它保留抗原结合功能的抗体片段，即，能够与RANKL的特异性结合。通常情况下，这样的片段将包括抗原结合片段。
术语“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”和“结合片段”是指一种抗体分子，其包含负责抗体和抗原之间特异结合的氨基酸。例如，在抗原较大的情况下，抗原结合片段可能只结合抗原的一部分。抗原分子中负责与抗原结合片段特异性相互作用的部分被称为“表位”或“抗原决定簇”。
抗原结合片段通常包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)，然而，它不一定必须包括两者。例如，一个所谓的Fd抗体片段仅由VH结构域组成，但仍保留了完整抗体的一些抗原结合功能。
上述术语“表位”定义为抗原决定簇，其特异性结合/识别结合片段。结合片段可以特异性与针对靶结构独特的构象或连续表位进行结合/相互作用，例如人类RANKL和鼠源RANKL。构象或不连续表位的特征在于多肽抗原在一级序列中是分离的两个或多个离散的氨基酸残基，但多肽折叠成天然蛋白/抗原时是一起聚集在在分子的表面上的。构成表位的两个或多个离散的氨基酸残基存在于一个或多个多肽链的独立部分。当多肽链折叠成三维结构，这些残基聚集在分子表面以构成表位。与此相反，由两个或多个离散的氨基酸残基组成的连续或线性表位，其存在于多肽链的单个线性区段。
本文中所描述的术语“交叉反应性”指的对人类、猴、和/或鼠源(小鼠或大鼠)相同靶分子的抗原片段的结合。因此，“交叉反应性”应被理解为与在不同物种中表达的相同分子X的种属间反应。识别人RANKL、猴、和/或鼠RANKL(小鼠或大鼠)的单克隆抗体的交叉反应特异性可通过FACS分析确定。
如本文所用，术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。除非特别指出，术语“患者”或“受试者”可以互换使用。
术语“治疗”和“治疗方法”是指治疗性治疗和预防性/预防措施。那些需要治疗者包括已具有特定医学病症，以及那些可能最终获得该病症的个体。
术语“保守性修饰”，即，不显著影响或改变由该核苷酸序列编码或包含该氨基酸序列的抗体结合特性的核苷酸和氨基酸序列修饰物。这类保守性序列修饰物包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如定点突变和PCR介导的突变将修饰引入序列。保守性氨基酸取代包括这种取代，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域进行定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)，β分支的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例
实施例1:抗体产生
1.免疫和抗体杂交瘤的产生
1.1免疫
Balb/c小鼠大约每3天通过足垫注射人RankL蛋白。注射6次后进行第一滴度测试。
1.2血清滴度检测
ELISA测定用于测量小鼠血清中抗体的滴度。为了测量抗体的滴度，将板(Nunc)在4℃下以1μg/mL的人RankL包被过夜，然后在室温下用封闭缓冲液(1×PBS/2％BSA)封闭1小时。在封闭缓冲液中以1:100稀释开始以1:3滴定的大鼠血清，并在室温下温育1小时。然后洗涤平板，随后与二抗山羊抗小鼠IgG Fc HRP一起温育1小时。洗涤后，加入TMB底物，用2MHCl终止相互作用。使用酶标仪(Molecular Device)读取450nm处的吸光度。
通过ELISA测定法测定血清中抗原特异性抗体的滴度。选择血清滴度为312500或更高的小鼠进行杂交瘤融合。
2.杂交瘤的产生
在无菌条件下从免疫小鼠收集***和脾，并使用Ficoll-Paque PLUS梯度离心制备淋巴细胞。然后使用电融合装置(BTX ECM2001)将分离的细胞与骨髓瘤细胞P3以1:1的比例融合。融合后将细胞转移至1/2HA培养基。每96孔板接种5×105个细胞。
3.抗体筛选
杂交瘤上清液用于初筛。然后通过ELISA阻断测定筛选抗原特异性杂交瘤。
通过ELISA的结合测定：将板(Nunc)在4℃下以1μg/mL的人RankL包被过夜。封闭和洗涤后，将杂交瘤上清液转移到平板中并在室温下温育1小时。然后洗涤平板，随后与二抗山羊抗小鼠IgG Fc HRP一起温育1小时。洗涤后，加入TMB底物，用2M HCl终止相互作用。使用酶标仪(Molecular Device)读取450nm处的吸光度。
通过ELISA阻断测定：将板(Nunc)在4℃下用5μg/mL的Rank-Fc融合蛋白包被过夜。将杂交瘤上清液与250ng/mL RankL-His混合，并在4℃下温育过夜。Prolia用作阳性对照。封闭和洗涤后，将混合物加入板中并温育1小时。然后洗涤平板，随后与抗His Ab-HRP一起温育。洗涤后，加入TMB底物，用2M HCl终止相互作用，使用酶标仪(Molecular Device)读取450nm处的吸光度。
选择可阻断人Rank配体与人Rank结合的抗体用于进一步表征。从杂交瘤上清液中纯化具有结合和阻断活性的所选抗体。同时，亚克隆选择的杂交瘤系。通过结合和阻断ELISA测定验证杂交瘤亚克隆，并且还检测它们的同种型。
4.亚克隆
将每个选择的细胞系的杂交瘤细胞以0.5、1和5个细胞/孔的密度接种在96孔板中。挑选单个克隆并在结合ELISA中测试。选择每个杂交瘤系的三个亚克隆并冷冻。
5.抗体纯化
在将pH调节至7.0后，将收获的杂交瘤上清液上样至蛋白A柱(MabSelect SuRe，GE)。通过甘氨酸洗脱抗体，然后立即使用1M Tris中和。通过Nano Drop(Thermal-Fisher)测试抗体浓度。通过SDS-PAGE(Invitrogen，NuPAGE4％-12％Bis-Tris Gel)和HPLC-SEC(Agilent)评估蛋白质的纯度。
6.抗体同种型
通过ELISA鉴定抗体同种型。将板(Nunc)用1μg/mL的山羊抗小鼠IgG1/抗小鼠IgG2a/抗小鼠IgG2b/抗小鼠IgG3/抗小鼠IgM抗体在4℃下包被过夜。封闭和洗涤后，将杂交瘤上清液转移到包被的板上并在室温下温育1小时。然后将板与二抗山羊抗小鼠κHRP或山羊抗小鼠λHRP(Southern Biotech)一起温育45分钟。洗涤后，加入TMB底物，用2M HCl终止相互作用。使用酶标仪(Molecular Device)读取450nm处的吸光度。
鼠抗体的同种型如表3所示。
表3.鼠抗体的同种型
Figure GDA0003672842130000181
7.抗体序列
使用Trizol试剂(Invitrogen-15596018)从hyridoma细胞中提取RNA。使用5'-RACE试剂盒(Takara-28001488)扩增cDNA，然后使用3'-简并引物和3'-接头引物(ExTaq：Takara-RR001B)进行PCR扩增。将PCR片段***pMD18-T载体(Takara-D101C)中，并送测序(Shanghai Biosune)。
鼠抗RankL抗体的可变区氨基酸序列示于表4中，可变区DNA序列示于表5中。
表4.鼠抗RankL抗体的可变区氨基酸序列
Figure GDA0003672842130000182
Figure GDA0003672842130000191
划线序列分别是CDR1-3。
表5.鼠抗RankL抗体的可变区DNA序列
Figure GDA0003672842130000192
Figure GDA0003672842130000201
实施例2:鼠源抗体的表征
1.ELISA结合
抗体WBP114.5.2.1、WBP114_5.14.1、WBP114_5.20、和WBP114_7.80表现出亚纳摩尔结合活性，并且它们的EC50值与Prolia相当。结合EC50和最大结合值总结在表6和图1中。
表6.抗体的ELISA结合
Figure GDA0003672842130000211
2.阻断测定
抗体WBP114.5.2.1、WBP114_5.14.1、WBP114_5.20、和WBP114_7.80可以阻断RANKL与RANK的结合。WBP114.5.2.1、WBP114_5.14.1和WBP114_7.80显示出与Prolia相当的阻断活性。抑制IC50值总结在表7和图2中。
表7.抗体阻断分析
Figure GDA0003672842130000212
3.对小鼠RNAKL的交叉结合活性
将ELISA板(Nunc)用小鼠RankL以5μg/mL在4℃下包被过夜。封闭和洗涤后，加入1μg/mL抗体样品或Prolia并温育1小时。然后洗涤平板，随后与第二抗体抗小鼠IgG Fc HRP/抗人IgG Fc HRP(Bethyl)一起温育1小时。洗涤后，加入TMB底物，用2M HCl终止相互作用。使用酶标仪(Molecular Device)读取450nm处的吸光度。通过ELISA检测与鼠RANKL的结合。抗体WBP114_5.20可以与鼠RANKL结合(图3)，EC50为0.067nM。WBP114.5.2.1、WBP114_5.14.1、WBP114_7.80和Prolia不与小鼠RANKL结合(数据未显示)。
4.NF-kB报告基因测定
使用含有RANK和NF-kB-luc的工程化HK293细胞系测量抗体中和RANKL介导的细胞功能的能力。
将293F细胞以5×105细胞/mL的密度重悬于FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen-12338)中。将1mL/孔的293F细胞悬浮液转移到24孔板中。将pG1-NF-kB载体在Opti-MEM I Reduced Serum Medium(Invitrogen-31985)中稀释。将PlasFect稀释于Opti-MEM I Reduced Serum Medium中。温育5分钟后，将稀释的pG1-NF-kB和PlasFect组合。轻轻混合并在室温下温育20分钟。将混合物加入细胞中并在37℃温育过夜。
将转染的293F-pG1-NF-kB细胞以5000个细胞/孔的密度接种在96孔板(Corning3916)中的FreeStyle 293表达培养基中。将RANKL和各种浓度的抗体的混合物在4℃下预温育30分钟并加入细胞中。RANKL的终浓度为300ng/mL。在37℃温育24小时后，向每个孔中加入50μL/孔Nano-Glo荧光素酶(Promega-N1120)并在室温下温育5分钟(避光)。通过MDSpectraMax M5e读取荧光。抑制率计算为[V(RANKL)-V(样品)]/[V(RANKL)-V(空白)]×100％。V(RANKL)＝(细胞+RANKL)的RFU，V(样品)＝(细胞+RANKL+Ab)的RFU，V(空白)＝细胞的RFU。
测量抗体对RANKL诱导型荧光素酶活性的抑制(图4)。抑制IC50值总结在表4中。抗体WBP114.5.2.1、WBP114_5.14.1、WBP114_7.80显示出与Prolia相当的抑制活性。抗体WBP114_5.20的抑制活性略低于Prolia(表8)。
表8.NF-kB报告基因测定
Figure GDA0003672842130000231
5.RAW264.7细胞分化测定
使用RAW细胞分化测定检查抗体对破骨细胞形成的抑制。RANKL可以刺激RAW细胞分化为破骨细胞样细胞，并且可以通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性来测量分化。
将RAW264.7细胞以2×104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，在含有10％FBS的DMEM培养基中。将板在37℃下温育过夜。将RANKL和各种浓度的抗体的混合物加入细胞中。RANKL的终浓度为100ng/mL。4或5天后，除去培养基，向细胞中加入60μL裂解缓冲液(0.1M柠檬酸、0.1M柠檬酸三钠盐、0.1％Triton X-100)。除去40μL上清液，并使用TRAP测定试剂盒(Beyotime Biotechnology，货号P0332)检测酒石酸抗性酸性磷酸酶。通过MD SpectraMaxM5e在405nm处读板。按照下式计算抑制率：[V(RANKL)-V(样品)]/[V(RANKL)-V(空白)]×100％(V(RANKL)＝(细胞+RANKL)的RFU，V(样品)＝(细胞+RANKL+Prolia)的RFU，V(空白)＝细胞的RFU。
计算抑制率(图5)，并且将抑制IC50总结在表9中。
表9.RAW264.7细胞分化测定
Figure GDA0003672842130000232
Figure GDA0003672842130000241
6.SPR的亲和力
通过Biacore测试所选抗体对人和食蟹猴RANKL的动力学结合亲和力。使用Biacore T200(GE)通过SPR测定检测对人和食蟹猴RankL的抗体结合亲和力。将每种抗体捕获在蛋白A固定的CM5传感器芯片(GE)上或直接固定到芯片上。将不同浓度的人或食蟹猴RankL以30μL/分钟的流速注射到传感器芯片上。在每个结合循环后，通过甘氨酸(pH 1.5)再生芯片。
从测试传感器中减去空白表面和缓冲通道的传感图。使用Langmiur分析通过1:1模型拟合实验数据。使用34KDa的分子量来计算分析物的摩尔浓度。
6.1.对人类RANKL的亲和力
SPR结果显示抗体WBP114.5.2.1、WBP114_5.14.1、WBP114_7.80对人RANKL的亲和力高于Prolia。WBP114_5.20的亲和力略低于Prolia。
表10.对人类RANKL的亲和力
Figure GDA0003672842130000242
Figure GDA0003672842130000251
6.2对食蟹猴RANKL的亲和力
表11.对食蟹猴RANKL的亲和力
Figure GDA0003672842130000252
7.表位联合
通过ELISA将抗体与Prolia结合。将ELISA板(Nunc)用Prolia在4℃下包被过夜。从10μg/mL开始连续稀释抗体，并与20ng/mL RankL-His蛋白混合。封闭和洗涤后，将混合物加入板中并温育1小时。然后洗涤平板，随后与二抗抗His HRP一起温育。洗涤后，加入TMB底物，用2M HCl终止相互作用。使用酶标仪(Molecular Device)读取450nm处的吸光度。
在针对Prolia的竞争性ELISA测定中测试抗体WBP114.5.2.1、WBP114_5.14.1、WBP114_5.20、和WBP114_7.80(图6)。与Prolia相比，WBP114.5.2.1、WBP114_5.14.1、和WBP114_7.80在相同或非常接近的表位与RANKL结合。基于竞争性ELISA结果和不同的交叉反应性质，抗体WBP114_5.20可以与Prolia在不同或部分重叠的表位上与RANKL结合。
实施例3:人源化抗体的产生
1.重组嵌合抗体的产生
将每种鼠抗体的V区DNA克隆到含有人恒定区基因的pcDNA3.3载体中。用编码抗体重链和轻链的质粒转染HEK293细胞。通过除去细胞并过滤收获来自转染细胞的上清液。通过蛋白A柱(MabSelect SuRe，GE)纯化抗体，并将缓冲液交换到PBS中。通过Nanodrop检测抗体浓度。通过SDS-PAGE(Invitrogen，NuPAGE4％-12％Bis-Tris Gel)和HPLC-SEC(Agilent)评估纯度。
2.人源化
“Best Fit”方法用于人源化抗体轻链和重链。对于轻链，对相应V基因的氨基酸序列进行内部人种系V基因数据库的比对。通过使用Kabat CDR定义小鼠CDR序列，替换顶部命中的人CDR序列来衍生人源化VL基因的序列。对于重链，衍生出4个人源化序列。对于轻链，得到第一序列。通过对人种系V基因数据库的小鼠框架进行比对来创建三个额外的序列。使用扩展CDR定义框架，其中Kabat CDR1在N末端延伸5个氨基酸。前三次命中用于获得人源化VH基因的序列。对人源化基因进行反向翻译，对哺乳动物表达进行密码子优化，并通过GeneArt Costum Gene Synthesis(Life Technologies)合成。将合成基因重新克隆到IgG表达载体中，表达并纯化。人源化抗RankL抗体的可变区序列示于表12和13中。
表12.人源化抗RankL抗体的可变区氨基酸序列
Figure GDA0003672842130000261
Figure GDA0003672842130000271
表13.人源化抗RankL抗体的可变区DNA序列
Figure GDA0003672842130000272
Figure GDA0003672842130000281
实施例4:人源化抗体的表征
1.ELISA结合
人源化抗体WBP1141-5.2.1-z1-IgG4和WBP1141-7.80-z1-IgG4表现出与Prolia相当的结合活性。结合EC50值总结于表14中。
表14.人源化抗体的ELISA结合
Figure GDA0003672842130000291
2.阻断实验
人源化抗体可以阻断RANKL与RANK的结合。WBP1141-5.2.1-z1-IgG4和WBP1141-7.80-z1-IgG4显示出与Prolia相当的阻断活性。抑制IC50值总结在表15中。
表15.人源化抗体的阻断实验
Figure GDA0003672842130000292
3.SPR亲和力
通过Biacore测试人源化抗体对人和食蟹猴RANKL的动力学结合亲和力。
3.1对人类RankL的亲和力
人源化抗体WBP1141-5.2.1-z1-IgG4和WBP1141-7.80-z1-IgG4维持其对人RankL的原始亲和力。WBP1141-5.2.1-z1-IgG4和WBP1141-7.80-z1-IgG4对人RankL的亲和力比Prolia高10倍以上(表16)。
表16.对人类RANKL的亲和力
Figure GDA0003672842130000293
Figure GDA0003672842130000301
3.2对食蟹猴RANKL的亲和力
人源化抗体WBP1141-5.2.1-z1-IgG4和WBP1141-7.80-z1-IgG4显示出对食蟹猴RankL的皮摩尔亲合力。
表19.对食蟹猴RANKL的亲和力
Figure GDA0003672842130000302
4.NF-kB报告基因测定
测量抗体对RANKL诱导型荧光素酶活性的抑制(图9)。抑制IC50值总结在表17中。人源化抗体WBP1141-5.2.1-z1-IgG4和WBP1141-7.80-z1-IgG4显示出比Prolia稍好的抑制活性。
表17.NF-kB报告基因分析
Figure GDA0003672842130000303
5.RAW264.7细胞分化测试
测量人源化抗体对RAW264.7细胞分化的抑制(图10)，并且IC50值总结在表18中。人源化抗体WBP1141-5.2.1-z1-IgG4和WBP1141-7.80-z1-IgG4显示出与Prolia相当的抑制活性。
表18.RAW264.7细胞分化测试
Figure GDA0003672842130000304
Figure GDA0003672842130000311
序列表
<110> 上海药明生物技术有限公司（WuXi Biologics (Shanghai) CO., LTD.）
<120> 靶向RANKL的治疗性抗体
<130> PCTF1704
<150> PCT/CN2017/108054
<151> 2017-10-27
<160> 50
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP114_5.2.1的重链可变区
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Lys Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Pro Lys Val
50 55 60
Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Gln Tyr Lys Tyr Asp Trp Tyr Phe Gly Val Trp Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP114_7.80的重链可变区
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Leu Gly Tyr Thr Leu Thr Asp Phe
20 25 30
Lys Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Gln Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Arg Gly Ser Arg Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP114_5.20的重链可变区
<400> 3
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Gly Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Met Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Phe Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Gly Asn Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 4
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP114_5.14.1的重链可变区
<400> 4
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Lys Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Lys Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Val
50 55 60
Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Ile Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gln Tyr Lys Tyr Asp Trp Tyr Phe Gly Val Trp Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP1141-5.2.1-z1-IgG4的重链可变区
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Lys Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Pro Lys Val
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Gln Tyr Lys Tyr Asp Trp Tyr Phe Gly Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP1141-7.80-z1-IgG的重链可变区
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asp Phe
20 25 30
Lys Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Arg Gly Ser Arg Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP1141-5.20-z1-IgG的重链可变区
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Met Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Phe Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Gly Asn Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP114_5.2.1的轻链可变区
<400> 8
Asp Ile Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Met Phe Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Gly Asn
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Phe Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Asn Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Arg Asn Ala Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP114_7.80的轻链可变区
<400> 9
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Gly Ala Thr Val Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Leu Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP114_5.20的轻链可变区
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Met Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP114_5.14.1的轻链可变区
<400> 11
Asp Ile Gln Arg Ile His Phe Pro Trp Ser Met Phe Ala Phe Trp Gly
1 5 10 15
Ala Arg Val Ile Phe Ser Cys Gly Val Ser Gln Ala Ile Arg Gly Asn
20 25 30
Leu Asp Gly Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ile Phe Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Pro Ser Asn Leu Asn Leu Gly Val Pro Pro Gly Phe Arg Ala
50 55 60
Arg Gly Leu Gly Ser Asp Tyr Phe Phe Thr Ile Thr Thr Leu Asp Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Pro Asp Tyr Ser Phe Phe Gln Arg Asn Ala Phe Pro Ser
85 90 95
Pro Phe Gly Gly Gly Thr Lys Arg Lys Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP1141-5.2.1-z1-IgG4的轻链可变区
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Gly Asn
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Asn Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Arg Asn Ala Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP1141-7.80-z1-IgG的轻链可变区
<400> 13
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP1141-5.20-z1-IgG的轻链可变区
<400> 14
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Met Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重链CDR3
<400> 15
Gln Tyr Lys Tyr Asp Trp Tyr Phe Gly Val
1 5 10
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重链CDR3
<400> 16
Arg Gly Ser Arg Arg Gly Phe Ala Tyr
1 5
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重链CDR3
<400> 17
Gly Tyr Gly Gly Asn Ser Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链CDR3
<400> 18
Leu Gln Arg Asn Ala Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链CDR3
<400> 19
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链CDR3
<400> 20
Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链CDR3
<400> 21
Phe Phe Gln Arg Asn Ala Phe Pro Ser Pro
1 5 10
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重链CDR2
<400> 22
Lys Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Pro Lys Val Gln
1 5 10 15
Asp
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重链CDR2
<400> 23
Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重链CDR2
<400> 24
Thr Met Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Phe Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重链CDR2
<400> 25
Lys Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Val Gln
1 5 10 15
Asp
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链CDR2
<400> 26
Ser Thr Ser Asn Leu Asn Ser
1 5
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链CDR2
<400> 27
Arg Ala Ser Asn Leu Gln Ser
1 5
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链CDR2
<400> 28
Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链CDR2
<400> 29
Ser Pro Ser Asn Leu Asn Leu
1 5
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重链CDR1
<400> 30
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His
1 5 10
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重链CDR1
<400> 31
Gly Tyr Thr Leu Thr Asp Phe Lys Met His
1 5 10
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重链CDR1
<400> 32
Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr Asp Met Ser
1 5 10
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链CDR1
<400> 33
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Gly Asn Leu Asp
1 5 10
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链CDR1
<400> 34
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His
1 5 10 15
<210> 35
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链CDR1
<400> 35
Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Met Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链CDR1
<400> 36
Gly Val Ser Gln Ala Ile Arg Gly Asn Leu Asp
1 5 10
<210> 37
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP114_5.2.1的重链可变区
<400> 37
gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagac cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag gttctggctt caacattaaa gacacctata tgcactgggt gaagcagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg gattggaaag attgatcctg cgaatggtaa cactaaatat 180
aacccgaagg tacaggacaa ggccactata acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240
ctacacctca gcagcctgac atttgaggac actgccgtct attattgttc tagacaatat 300
aaatacgact ggtacttcgg tgtctggggc gcagggacca cggtcaccgt ctcctca 357
<210> 38
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP114_7.80的重链可变区
<400> 38
caggttcaac tgcagcagtc tggggctgaa ctggtgaggc ctggggcttc agtgaggctg 60
tcctgcaagg ctttgggcta cacattaact gactttaaaa tgcactgggt gaagcagaca 120
cctgtgcatg gcctgcaatg gattggagct attcatccag gaagtggtgg tactgcctac 180
aatcagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atggaactca gcagtctgac atctgaggac tctgctgtct attattgttc aagacggggg 300
tcacgacgag gatttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354
<210> 39
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP114_5.20的重链可变区
<400> 39
gaagtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cgctttcagt gactatgaca tgtcttgggg tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc atgagtagtg gtggtagtta catcttctat 180
ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaggaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac tcggcctttt attactgtgc aagaggttac 300
ggtggtaact cggcctggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360
<210> 40
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP114_5.14.1的重链可变区
<400> 40
gagattcagc tgcagcagtc tggggcagac cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag gttctggctt caacattaaa gacacctata tgcactgggt gaagaagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg gattggaaag attgatcctg cgaatggtaa cactaaatat 180
gacccgaagg tacaggacaa ggccactata acagcagaca catcctccaa catagcctac 240
ttgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attattgtac tagacaatat 300
aaatacgact ggtacttcgg tgtctggggc gcagggacca cggtcaccgt ctcctca 357
<210> 41
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP114_5.2.1的轻链可变区
<400> 41
gacatccaga tgattcagtc tccatcgtcc atgtttgcct ctctgggaga cagagtcagt 60
ctctcttgtc gggctagtca gggcattaga ggtaatttag actggtatca gcagaaacca 120
ggtggaactt ttaaactcct gatctactcc acatccaatt taaattctgg tgtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggtcagat tattctctca caatcagcac cctagagtct 240
gaagattttg cagactatta ctgtctacag cgtaatgcgt ttccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa a 321
<210> 42
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP114_7.80的轻链可变区
<400> 42
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctcttgggca gggggccacc 60
gtatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca atagttttat gcactggtac 120
cagcagaaac caggactgcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctacaatct 180
gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat 240
cctgtggagg ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300
acgttcgggg gggggaccaa gctggaaata aaa 333
<210> 43
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP114_5.20的轻链可变区
<400> 43
gatattgtga tgacgcaggc tgcattctcc aatccagtca ctcttggaac atcagcttcc 60
atctcctgca ggtctactaa gagtctccta catagtaatg gcatgactta tttgtattgg 120
tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcagatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagt gggtcaggaa ctgactttac actgagaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgtg ctcaaaatct agaacttccg 300
tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336
<210> 44
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP114_5.14.1的轻链可变区
<400> 44
gacatccaga ggattcattt tccttggtcc atgtttgctt tttggggagc cagagtcatt 60
ttttcttgtg gggttagtca ggccattaga ggtaatttag acgggtatca gcagaaacca 120
gggggaattt ttaaattcct gatttattcc ccatccaatt taaatttggg ggtcccacca 180
gggttcaggg ccaggggttt ggggtcagat tattttttca ccatcaccac cttagattct 240
gaagattttc cagattattc ctttttccag cgtaatgcgt ttccgtcccc gttcggaggg 300
gggaccaagc ggaaaataaa a 321
<210> 45
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP1141-5.2.1-z1-IgG4的重链可变区
<400> 45
gaggtgcagc tggtccagag cggggccgaa gtgaagaaac caggagctac agtgaagatc 60
tcatgcaaag tcagcggctt caacattaag gacacttaca tgcactgggt gcagcaggct 120
ccaggaaagg ggctggagtg gatgggcaaa atcgaccccg caaacgggaa taccaagtac 180
aatcctaaag tgcaggatag ggtcactatt accgcagaca caagcactga taccgcctat 240
atggagctga gctccctgcg gtccgaagac accgccgtgt actattgtag ccggcagtac 300
aaatatgatt ggtattttgg cgtctgggga cagggcacca cagtgacagt ctctagt 357
<210> 46
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP1141-7.80-z1-IgG的重链可变区
<400> 46
caggtgcagc tggtccagtc cggagcagag gtgaagaaac ccggagcttc cgtgaaggtc 60
tcttgcaaag ccagtggcta caccctgaca gacttcaaga tgcactgggt gcgacaggct 120
ccaggacagg gcctggaatg gatgggagca atccatcctg gatccggagg aaccgcatac 180
aaccagaagt ttaaagggcg agtgactatg accagagaca catcaactag caccgtctat 240
atggagctga gctccctgcg gtctgaagat acagctgtgt actattgttc acggagaggc 300
agcaggcgcg ggttcgcata ttgggggcag ggaacactgg tgactgtctc tagt 354
<210> 47
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP1141-5.20-z1-IgG的重链可变区
<400> 47
gaggtgcagc tggtggagag cggaggaggc ctggtgaaac ccggaggcag cctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt cgccttcagc gactacgaca tgagctgggt gagacaggcc 120
cctggcaagg gactggagtg ggtgagcacc atgagcagcg gcggcagcta catcttctac 180
cccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa cagcctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caggggctat 300
ggcggaaaca gcgcctggtt cgcctactgg ggacagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360
<210> 48
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP1141-5.2.1-z1-IgG4的轻链可变区
<400> 48
gacatccaga tgactcagtc ccctagctcc gtgtcagcaa gcgtcggcga tcgggtgacc 60
atcacatgca gagccagcca gggaattagg ggcaacctgg actggtacca gcagaagccc 120
gggaaagctc ctaagctgct gatctattcc acatctaacc tgaattccgg agtcccaagc 180
cggttcagtg gatcaggaag cggaaccgac tttactctga ccatttctag tctgcagcca 240
gaggatttcg ccacatacta ttgtctgcag cgcaatgctt tcccctacac atttggccag 300
gggactaaac tggaaattaa g 321
<210> 49
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP1141-7.80-z1-IgG的轻链可变区
<400> 49
gatatcgtgc tgacccagag cccagcatcc ctggctgtct ccccaggaca gcgggctacc 60
attacatgca gagcaagcga gtccgtggac tcttacggaa acagtttcat gcactggtat 120
cagcagaagc ctggccagcc ccctaaactg ctgatctaca gggcctcaaa tctgcagagc 180
ggcgtgcctg ctcggttctc tggcagtggg tcaggaaccg actttactct gaccattaac 240
ccagtcgaag caaacgatac agccaattac tattgtcagc agtctaatga ggacccctat 300
acatttggcc aggggactaa gctggaaatc aaa 333
<210> 50
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> WBP1141-5.20-z1-IgG的轻链可变区
<400> 50
gacatcgtga tgacccagag ccccctgagc ctgcctgtga cacctggcga acccgcctcc 60
atcagctgca ggagcaccaa gagcctgctg cacagcaacg gcatgaccta cctgtactgg 120
tacctgcaga agcctggcca gagcccccag ctgctcatct accagatgag caacctggcc 180
agcggagtgc ccgacagatt tagcggcagc ggcagcggaa ccgacttcac cctgaagatc 240
agcagggtgg aggccgagga tgtgggcgtg tactattgcg cccagaacct ggagctgccc 300
tggacattcg gccagggcac caagctggag atcaag 336
2

Claims (19)

1.一种抗体或其抗原结合片段，包含：
包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区；以及
包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，
其中所述重链可变区CDR1序列如SEQ ID NO﹕30所示，所述重链可变区CDR2序列如SEQID NO﹕22所示，所述重链可变区CDR3序列如SEQ ID NO﹕15所示；
所述轻链可变区CDR1序列如SEQ ID NO﹕33所示，所述轻链可变区CDR2序列如SEQ IDNO﹕26所示，所述轻链可变区CDR3序列如SEQ ID NO﹕18所示；
其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合RANKL。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区如SEQ ID NO﹕1所示；所述轻链可变区如SEQ ID NO﹕8所示。
3. 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区如SEQ ID NO﹕5所示；所述轻链可变区如SEQ ID NO﹕12所示。
4. 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段结合于人和猴的RANKL。
5.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段
a) 结合于人RANKL，KD为6.98E-10 M 以下；并且
b) 结合于猴RANKL，KD为5.32E-11 M以下。
6.如权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段具有下列性质中的至少一种：
a) 结合于人RANKL，KD为6.98E-10 M至6.33E-11 M，并且结合于猴RANKL，KD为5.32E-11M至9.03E-12 M；
b) 抑制RANKL介导的细胞功能；
c) 抑制RAW细胞分化成破骨细胞样细胞。
7.如权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、或大鼠抗体。
8.一种核酸分子，其编码如权利要求1至7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
9.一种克隆或表达载体，其包含如权利要求8所述的核酸分子。
10.一种宿主细胞，其包含一个以上如权利要求9所述的克隆或表达载体。
11.一种用于生产如权利要求1至7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，包括培养如权利要求10所述的宿主细胞，并且分离所述抗体。
12.一种药物组合物，包含如权利要求1至7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及一种以上药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
13.一种用于制备抗RANKL抗体或其抗原结合片段的方法，包括：
(a) 提供：
(i) 一个重链可变区的抗体序列，其包含SEQ ID NO﹕30所示的CDR1序列，SEQ ID NO﹕22所示CDR2序列以及SEQ ID NO﹕15所示的CDR3序列；和
(ii) 一个轻链可变区的抗体序列，其包含SEQ ID NO﹕33所示的CDR1序列， SEQ IDNO﹕26所示的CDR2序列以及SEQ ID NO﹕18所示的CDR3序列；并且
(b) 将编码所述抗体序列的基因序列表达成蛋白质。
14.如权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于预防或治疗受试者骨丢失相关疾病的药物中的用途。
15.如权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和免疫检查点抗体在制备用于预防或治疗受试者骨丢失相关疾病的联合用药药物中的用途。
16.如权利要求14或15的用途，其中所述免疫检查点抗体是CTLA-4抗体、PD-1抗体或PD-L1抗体。
17.如权利要求14-16中任一项所述的用途，其中所述疾病选自克罗恩病、***、慢性肾病、痛风、类风湿性关节炎、神经性厌食症、重型地中海贫血症、甲状腺功能亢进症或癌症。
18.如权利要求17的用途，其中所述癌症选自由黑素瘤、肾癌、***癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌、子宫癌、卵巢癌、和直肠癌所组成的组中的癌症。
19.如权利要求18的用途，其中所述黑素瘤为皮肤或眼内恶性黑色素瘤。
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