KR102612071B1

KR102612071B1 - 곰보배추 추출물 및 병풀 추출물을 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물

Info

Publication number: KR102612071B1
Application number: KR1020210107972A
Authority: KR
Inventors: 곽종복
Original assignee: 주식회사 올인온
Priority date: 2021-01-15
Filing date: 2021-08-17
Publication date: 2023-12-08
Also published as: KR20220103608A

Abstract

본 발명은 곰보배추 추출물 및 병풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 라디칼 소거능을 나타내며, 염증 및 가려움증 유발 인자를 유전자, 단백질 수준에서 유의미하게 억제함으로써 우수한 항산화, 항염증 및 항가려움증 효과를 가지므로 항산화 및 항염증용 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

곰보배추 추출물 및 병풀 추출물을 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물 {Composition for anti-oxidation and anti-inflammation comprising Salvia plebeia extract and Centella asiatica extract}

본 발명은 곰보배추 추출물 및 병풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물에 관한 것이다.

염증반응은 생체조직이 손상을 입었을 때 일어나는 방어적 반응으로, 활성화된 면역세포에 의해 필연적으로 일어나는 일련의 면역반응이다. 염증반응에는 면역세포를 활성화시켜 염증매개물질인 산화질소(nitric oxide, NO), 염증성사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 및 프로스타글란딘(prostaglandin E2, PGE2) 등이 생성되며, 이로 인해 활성산소종(reactive oxygen species)과 같은 자유라디칼(free radical)이 수반되어 2차 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다.

한편, 자유라디칼은 세포에 축적되며 높은 반응성으로 인해 세포가 손상되고 이로 인해 세포의 생장 또는 증식이 방해되어 손상된 피부 세포의 재생이 더디게 일어나 상처, 발진 등 이차적인 피부 병변 및 이로 인한 가려움증이 발생할 수 있으며, 체내 대사과정의 이상으로 인해 피부 색소 침착, 탄력 저하 등 노화가 가속화될 수 있다.

따라서 NO나 PGE2의 생성, 염증성사이토카인의 발현 억제와 염증에 의한 자유라디칼의 생성 억제는 염증성질환을 치료하는데 있어서 중요한 목표가 된다. 일반적으로 염증성질환을 치료하는데 사용되는 스테로이드성 소염 약물은 녹내장, 백내장, 고혈압, 조울증, 체중증가, 당뇨병, 골다공증 등과 같은 질환을 유발할 뿐만 아니라 항산화능을 저하시킨다는 단점이 있다. 그러므로, 이러한 부작용이나 세포 독성에 대한 위험이 없거나 최소화된 소재의 개발이 필요한 실정이며, 이를 위해 천연 소재를 이용한 연구가 활발히 진행되고 있다.

한국공개특허 제10-2007-0016261호

상기한 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 우수한 항산화 및 항염증 효능을 가지는 곰보배추 및 병풀 추출물을 포함하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

곰보배추(Salvia plebeia R. BR)는 배암차즈기 또는 설견초라고도 하며, 한해살이지만 다 크면 줄기가 대처럼 단단한 것이 특징이다. 속명 살비아(Salvia)는 '치료하다(salvare)'라는 라틴어에서 유래하여 여기에 속하는 대부분의 종을 약용 또는 식용으로 이용하는데, 최근 연구에 따르면 곰보배추는 강한 항산화 물질을 포함하는 것으로 밝혀졌다. 그러나 세포 독성이 강하여 약용이나 식용으로 사용 시 주의가 필요하다.

병풀(Centella asiatica)은 국내 산이나 들에 흔히 자라는 여러해살이풀로, 일본, 중국 등 아시아 지역에 주로 분포한다. 최근에는 병풀이 세균, 진균 등에 대해 항균 효과가 있다고 하여 항균용 화장품 제조에 이용되고 있으나, 단독사용으로는 큰 항균 효과를 기대하기 어렵다는 단점이 있다.

이러한 곰보배추와 병풀은 일부 연구에 의해 항산화 또는 항염증 효과가 있는 것이 보고되었으나, 이들의 혼합물에 대한 세포 독성, 항산화 및 항염증 효과에 관해 연구된 바가 전혀 없다.

따라서, 본 발명에서는 유효성분으로 곰보배추 추출물과 병풀 추출물을 최적의 비율로 포함함으로써 세포 독성이 보완되어 안전하고 우수한 항산화 및 항염증 효과를 나타내는 조성물인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 양상은 곰보배추 추출물 및 병풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용된 “곰보배추 추출물”, “병풀 추출물”은 곰보배추과 병풀을 단독 사용하거나 혼합 사용하여 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액이나 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.

상기 곰보배추 추출물 및 병풀 추출물은 자연에서 채취하거나 상업적으로 재배, 판매하는 곰보배추 또는 병풀을 이용할 수 있으며, 이때 곰보배추 또는 병풀은 가공하지 않은 날 것이거나 동결, 건조 등의 가공을 거친 상태일 수 있으며, 곰보배추 또는 병풀의 꽃, 잎, 잎자루, 줄기, 뿌리 등을 선택적으로 사용하거나 또는 이들을 모두 사용하여 얻은 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 추출물은 당 업계에 공지된 추출 방법을 제한 없이 사용하여 얻은 것일 수 있다. 상기 추출 방법은 일례로, 냉침추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출, 열수 추출, 가압 추출, 용매 추출 등을 들 수 있으며, 효과적인 활성성분 추출을 위해 2종 이상의 추출 방법을 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4개의 알코올, 프로필렌글라이콜, 부틸렌글라이콜, 글리세린, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 클로로포름, 다이에틸에테르, 다이클로로메탄, 헥산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 용매로 추출된 것일 수 있다.

발명의 일 구체예에 따르면, 상기 추출물은 감압 농축 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 추출물은 상술한 추출 방법에 의한 추출물뿐만 아니라 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예를 들어, 일정한 분자량 컷-오프(cut-off) 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시한 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 곰보배추 추출물 및 병풀 추출물은 곰보배추 또는 병풀과 5 내지 20배의 용매 (바람직하게는, 10 내지 15배의 용매)를 혼합한 후 0.5 내지 8시간 (바람직하게는, 1 내지 5시간) 환류 추출한 후 여과액을 감압 농축하고, 동결 건조하여 얻은 것일 수 있다.

이러한 곰보배추 추출물 및 병풍 추출물은 두 추출물의 세포 독성을 보완하고 우수한 항염증 효능을 나타내기 위해 적절한 비율로 혼합된 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 곰보배추 추출물과 병풀 추출물의 5 ~ 10 : 1 ~ 5의 중량비로 혼합한 것일 수 있다.

보다 구체적으로, 곰보배추 추출물과 병풀 추출물의 혼합 비율은 7 : 3의 중량비일 수 있다.

이때 곰보배추 추출물의 비율이 상기 하한치 미만인 경우에는 세포 독성이 강하지 않으나 염증을 유발하는 산화질소의 생성을 효과적으로 억제하지 못해 우수한 항염증 효과를 기대할 수 없으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 병풀 추출물에 의한 세포 보호 효과가 제대로 발휘되지 않아 강한 세포 독성을 나타낼 수 있다.

이러한 조성물은 총 플라보노이드 및 폴리페놀을 다량 함유하여 우수한 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능을 나타내며, NO, PGE2, 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6 및 TNF-a), NF-κB 활성과 같은 염증 관련 인자의 발현 및 분비를 억제하고, 가려움증을 유발하는 사이토카인, 히스타민 등 관련 인자의 분비를 억제함으로써 항산화, 항염증 및 항가려움증 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 조성물은 곰보배추 추출물 및 병풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 항염증 및 항가려움증 조성물로 제공할 수 있다.

본 발명에서 사용된 “항산화”는 산화를 억제하는 작용을 의미하는 것으로, 산화적스트레스(oxidative stress)가 유발되면 잠재적인 세포손상 및 병리적 질환을 일으키게 된다. 이러한 산화적스트레스의 직접적 원인이 되는 활성산소종은 불안정하고 반응성이 높아 여러 생체물질과 쉽게 반응하고, 체내 고분자들을 공격하여 세포와 조직에 비가역적인 손상을 일으키거나 돌연변이, 세포독성 및 발암 등을 초래하게 된다.

본 발명에서 사용된 “항염증”은 염증이 일어나는 과정 또는 이에 관여하는 물질을 억제하는 것을 의미하며, 항염증 효과를 내기 위해서는 염증 반응에 작용하는 NO나 PGE2, IL-1β 및 TNF-a와 같은 염증성 사이토카인의 발현을 억제 또는 제어하는 것이 핵심이다.

본 발명에서 사용된 “항가려움”은 피부 질환에서 가장 주요하게 나타나는 가려움증을 완화하거나 경감시키는 것을 의미한다. 가려움증은 통증을 동반할 수 있고, 다양한 원인에 의해 유발되는데, 상처, 발진 등의 이차적인 피부 병변을 유발하며, 가려워서 긁게 되면 가려움증 유발 물질이 분비되어 가려움증이 더욱 심해지는 악순환이 발생하게 된다. 가려움증을 유발하는 물질로 알려진 IL-4, IL-31 및 히스타민의 발현을 억제 또는 제어하는 것이 가려움증 치료의 핵심이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 조성물은 총 폴리페놀 10.367±0.51 ㎎ GAE/g, 총 플라보노이드 37.98±2.39 ㎎ QE/ｇ을 포함하여 우수한 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능을 나타내며, 세포 독성이 없으며, 면역세포에서 분비하는 산화질소, 프로스타글란딘, IL-1β, IL-6 및 TNF-a와, 비만세포에서 분비하는 IL-4, IL-31 및 히스타민을 유전자 및 단백질 수준에서 발현을 유의적으로 억제한다.

이러한 조성물은 피부를 비롯한 전신의 가려움증을 완화하는 용도로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 샴푸, 바디클렌져, 비누, 폼클렌져, 스킨, 로션, 크림, 연고, 스프레이, 치약, 물티슈, 동물용 물티슈, 애완동물용 세정제, 섬유유연제, 렌즈 세정제, 여성용 청결제 등으로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 피부용, 두피용, 구강용, 안구용 또는 질(膣)용 조성물인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 항산화 및 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 화장료 조성물은 항산화 물질을 다량 함유하며 가려움증 유발 인자인 IL-4, IL-31 및 히스타민의 발현을 효과적으로 억제함으로써 피부 가려움을 완화 또는 경감하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 화장료 조성물은 항산화 물질을 다량 함유하며 피부 색소인 멜라닌의 생성을 효과적으로 억제함으로써 피부톤을 밝게 개선하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 화장료 조성물의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글라이콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 징크옥사이드 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토오스, 탈크, 실리카, 알루미늄하이드록사이드, 칼슘실리케이트, 폴리아마이드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하이드로카본, 프로판/부탄 또는 다이메틸에터와 같은 추진제를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 아이소프로판올, 다이에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글라이콜, 1,3-부틸렌글라이콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤지방족에스터, 폴리에틸렌글라이콜 또는 솔비탄의 지방산 에스터가 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글라이콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 아이소스테아릴알코올, 폴리옥시에틸렌 솔비톨에스터 및 폴리옥시에틸렌솔비탄 에스터와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄메타하드록사이드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 항산화 및 항염증용 조성물을 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 가려움증은 피부염, 알레르기, 질염, 아토피, 천식, 결막염, 백내장, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 폐혈증, 위궤양, 위염, 크론병, 치질, 강직성 척추염, 루푸스, 섬유근통, 건선, 관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 다발성 경화증, 당뇨병, 피부경화증, 통풍, 퇴행성 신경질환, 규폐증, 죽상동맥경화증 및 허혈로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정 셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이드실리콘다이옥사이드, 하이드록시칼슘포스페이트, 락토오스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말 셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글라이콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 솔비톨 및 탈크 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에 따른 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 약제의 제조시에 통상적으로 이용되는 것으로, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 트레할로스, 하이알루로닉애씨드, 전분, 아카시아고무, 칼슘포스페이트, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘실리케이트, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 및 미네랄오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따른 약학 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (22th ed., 2013)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 지용성 폴리페놀 성분이 증가된 생약 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여 시 복강내 주사, 직장내 주사, 피하 주사, 정맥 주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본발명에서 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수 혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 조성물은 개별치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 구체예에 따른 약학 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 0.01 ㎎ 내지 100 ㎎, 또는 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 곰보배추 추출물 및 병풀 추출물을 포함하는 조성물은 라디칼 소거능을 나타내며, 염증 및 가려움증 유발 인자를 유전자, 단백질 수준에서 유의미하게 억제함으로써 우수한 항산화, 항염증 및 항가려움증 효과를 가지므로 항산화 및 항염증용 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 곰보배추 추출물 및 병풀 추출물의 혼합 비율별 세포 생존율을 측정한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 곰보배추 추출물 및 병풀 추출물의 혼합비율별 NO 생성량을 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 곰보배추 및 병풀 혼합물에 의한 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 곰보배추 및 병풀 혼합물에 의한 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 곰보배추 및 병풀 혼합물에 의한 RAW264.7 세포의 세포생존율을 측정한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 곰보배추 및 병풀 혼합물에 의한 NOS2 유전자의 mRNA 발현량을 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 곰보배추 및 병풀 혼합물에 의한 PTGS2 유전자의 mRNA 발현량을 측정한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 곰보배추 및 병풀 혼합물에 의한 IL1B 유전자의 mRNA 발현량을 측정한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 곰보배추 및 병풀 혼합물에 의한 IL6 유전자의 mRNA 발현량을 측정한 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 곰보배추 및 병풀 혼합물에 의한 TNFA 유전자의 mRNA 발현량을 측정한 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 곰보배추 및 병풀 혼합물에 의한 ERK의 단백질 발현량을 측정한 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 곰보배추 및 병풀 혼합물에 의한 JNK의 단백질 발현량을 측정한 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 곰보배추 및 병풀 혼합물에 의한 P38의 단백질 발현량을 측정한 결과이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 곰보배추 및 병풀 혼합물에 의한 NO 생성량을 측정한 결과이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 곰보배추 및 병풀 혼합물에 의한 PGE2 생성량을 측정한 결과이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 곰보배추 및 병풀 혼합물에 의한 IL-1β 생성량을 측정한 결과이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 곰보배추 및 병풀 혼합물에 의한 IL-6 생성량을 측정한 결과이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 곰보배추 및 병풀 혼합물에 의한 TNF-a 생성량을 측정한 결과이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 곰보배추 및 병풀 혼합물에 의한 MC/9 세포의 세포생존율을 측정한 결과이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 곰보배추 및 병풀 혼합물에 의한 IL4 유전자의 mRNA 발현량을 측정한 결과이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 곰보배추 및 병풀 혼합물에 의한 IL31 유전자의 mRNA 발현량을 측정한 결과이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른 곰보배추 및 병풀 혼합물에 의한 IL-4의 단백질 발현량을 측정한 결과이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 곰보배추 및 병풀 혼합물에 의한 히스타민의 단백질 발현량을 측정한 결과이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 곰보배추 및 병풀 혼합물에 의한 IL-31의 단백질 발현량을 측정한 결과이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하며 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 곰보배추 추출물의 제조

곰보배추는 평창 백옥포리 큰골에서 야생으로 키워져 2020년 7월에 수확한 것으로, 줄기를 포함한 잎을 -4℃에서 2일간 냉동건조하여 원물로 사용하였다. 이후, 곰보배추 40 g에 70% 에탄올 500 ㎖를 넣고 3시간 동안 환류 추출한 후, 여과액을 회전 진공 농축기(rotary vacuum evaporator) (EYELA FDU-540, 일본)로 감압 농축하였으며, 농축된 용액을 동결건조기(freeze dryer) (일신바이오베이스, 한국)로 동결 건조하여 곰보배추 에탄올 추출물(Salvia plebeia R. BR ethanol extract)을 수득하였다. 곰보배추 추출물로 3.84 g (수율 9.60%)의 분말을 획득하여 초저온 냉동고 (-80℃)에서 보관하면서 실험에 필요한 농도로 증류수에 희석해 사용하였다.

실시예 2. 병풀 추출물의 제조

병풀은 평창 백옥포리 큰골에서 야생으로 키워져 2020년 7월에 수확한 것으로, 잎자루를 포함한 병풀 잎을 -4℃에서 2일간 냉동건조하여 원물로 사용하였다. 이후, 병풀 40 g에 70% 에탄올 500 ㎖를 넣고 3시간 동안 환류 추출한 후, 여과액을 회전 진공 농축기(rotary vacuum evaporator) (EYELA FDU-540, 일본)로 감압 농축하였으며, 농축된 용액을 동결건조기(freeze dryer) (일신바이오베이스, 한국)로 동결 건조하여 병풀 에탄올 추출물(Centella asiatica ethanol extract)을 수득하였다. 병풀 추출물로 3.84 g (수율 9.60%)의 분말을 획득하여 초저온 냉동고(-80℃)에서 보관하면서 실험에 필요한 농도로 증류수에 희석해 사용하였다.

실험예 1. 곰보배추 추출물 및 병풀 추출물의 최적 혼합 비율 설정

곰보배추 추출물과 병풀 추출물의 최적 혼합 비율을 설정하기 위하여, 각 추출물 및 이들의 혼합물을 이용하여 세포 독성 및 항염 효능을 분석하였다.

1-1. 세포 독성

세포 독성을 측정하기 위하여, MTT 분석(assay)를 수행하였다.

RAW264.7 세포는 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 조성된 DMEM 배지 (Gibco BRL, 미국)를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건이 유지되는 세포배양기에서 배양하였으며, 2 ~ 3일 주기로 계대 배양하여 실험을 진행하였다.

이후, RAW264.7 세포를 96웰 플레이트에 2X10⁵ cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 곰보배추 추출물과 병풍 추출물을 단독 또는 7 : 3의 비율로 혼합하여 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 각 well에 MTT 용액 20 μL (5 mg/ml)을 넣고 37℃에서 4시간 CO2 세포배양기에서 배양하였다. 이후 10⁸ μL의 세포배양액을 얻고, 메탄올/DMSO 용액이 1:1로 들어간 용액 180 μL를 각 well에 첨가하여 셰이커(shaker)에서 섞은 후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로표시하였다.

그 결과, 도 1을 참조하면, 곰보배추 추출물은 50 ug/ml 이상의 농도에서 80% 이상의 세포사멸을 나타낸 반면, 병풍 추출물은 100 ug/ml 이상의 농도에서 오히려 세포 보호를 나타내는 것으로 세포 재생 효과가 있는 것으로 예상될수 있다.

한편, 곰보배추 추출물과 병풀 추출물을 7 : 3의 비율로 처리한 경우에는 병풀 추출물에 의해 곰보배추 추출물의 세포 독성이 완화된 것을 알 수 있었다.

1-2. 항염 효능

항염 효능의 지표로서 NO 생성량을 측정하기 위하여, NO 분석 키트(Intronbio, Korea)를 사용하였다. RAW264.7 세포를 24웰 플레이트에 4X10⁴cells/welll로 분주하여 24시간 동안 배양하고 추출물을 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도로 처리하고 2시간 후, 100 ng/㎖의 LPS를 하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 96웰 플레이트에 세포배양액 100 ㎕를 넣고 N1 완충액 50 ㎕를 추가하여 상온에서 10분간 반응시켰으며, 반응 후 N2 완충액 50 ㎕를 추가하여 상온에서 10분간 반응시켰다. 반응 후, 540 ㎚에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 생성량을 백분율로 표시하였다.

그 결과, 도 2를 참조하면, 곰보배추 추출물 및 병풀 추출물은 각각 농도 의존적으로 NO 생성을 억제하나, 병풀 추출물의 NO 생성 억제는 곰보배추 추출물에 비해 약한 것으로 나타났다.

그러나 곰보배추 추출물과 병풀 추출물을 7 : 3의 비율로 처리한 경우에는 단독 병풀 추출물을 처리한 경우에 비해 NO 생성 억제가 높은 것으로 나타나, 항염 효능이 향상된 것을 알 수 있었다.

이러한 결과를 통해, 곰보배추 추출물과 병풀 추출물을 7 : 3의 비율로 혼합 사용하는 것이 곰보배추 추출물에 의한 세포 독성을 완화하고 병풀 추출물에 의한 NO 생성 억제를 향상시키는데 효과적이므로, 우수한 항산화 및 항염 효과를 기대할 수 있다.

이후 실험에서는 곰보배추 추출물과 병풀 추출물을 7 : 3의 비율로 혼합한 곰보배추 및 병풀 혼합물 (이하 'SCE'라 함)을 사용하였다.

실험예 2. 곰보배추 및 병풀 혼합물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

총 폴리페놀 측정을 위하여, SCE 1 ㎖ (농도 20 ㎎/㎖)에 50% 페놀시약(folin-Ciocalteu's phenol reagent) (Merck, 독일) 0.5 ㎖를 가하여 실온에서 3분간 반응시켰다. 반응용액에 Na2CO3 포화용액 1 ㎖와 증류수 7.5 ㎖를 차례로 혼합하여 30분간 정치시킨 뒤, 14,000 g에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 취해 760 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 총 페놀 함량은 갈산(gallic acid, GAE)(Sigma, 미국)을 표준물질로 이용하여 작성한 검량선에 따라 함량을 구하였다.

총 플라보노이드 측정을 위하여, SCE 0.1 ㎖ (농도 20 ㎎/㎖)과 80% 에탄올 0.9 ㎖을 혼합한 혼합물 0.5 ㎖에 10% 질산알루미늄(aluminium nitrate)와 1M 아세트산칼륨(potassium acetate) 0.1 ㎖ 그리고 80% 에탄올 4.3 ㎖을 가하여 실온에 40분 방치한 뒤 415 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 퀘르세틴(quercetin, QE)을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.

그 결과, SCE의 총 폴리페놀 함량은 103.67±0.51 ㎎ GAE/g, 총 플라보노이드 함량은 37.98±2.39 ㎎ QE/ｇ인 것으로 나타났다.

실험예 3. 곰보배추 및 병풀 혼합물의 항산화 효능

곰보배추 및 병풀 혼합물의 항산화력을 평가하기 위하여, 라디칼 소거능(radical scavenging ability)을 측정하였다.

3-1. DPPH 라디칼 소거능 측정

SCE의 최종 농도가 25, 50, 100, 250, 500, 1000 ㎍/㎖의 농도로 될 수 있게 증류수로 희석시켰으며, 에탄올에 용해시킨 0.2 mM의 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) 용액 150 ㎕와 시료를 100 ㎕씩 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 마이크로 플레이트 측정기(micro plate reader) (Molecular Devices, U.S.A)를 통해 517 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 양성대조군으로는 아스코르브산(ascorbic acid)를, 음성대조군으로는 증류수를 넣었으며, DPPH 용액의 대조군으로는 에탄올을 넣어 보정 값을 얻었다. DPPH 자유라디칼 소거율은 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.

[수학식 1]

그 결과, 도 3을 참조하면, SCE의 DPPH 라디칼 소거능은 농도 의존적으로 증가하였으며, 이때 IC₅₀ 값은 61.54 ㎍/㎖인 것으로 확인되었다.

또한, 각각의 개별 조성물인 실시예 1의 곰보배추 추출물 단독(1000 ㎍/㎖)과, 실시예 2의 병풀 추출물 단독(1000 ㎍/㎖)에 대해 동일한 실험을 추가로 진행하였으며, 도 3에 나타내어 함께 비교하였다.

3-2. ABTS 라디칼 소거능 측정

SCE의 최종 농도가 25, 50, 100, 250, 500, 1000 ㎍/㎖의 농도로 될 수 있게 희석시켰으며, ABTS 용액은 7.4 mM ABTS(2,2-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))와 2.6 mM 과황산칼륨(potassium persulphate)을 혼합한 후, 암소(dark place)에 하루 동안 방치하여 양이온(ABTS+)을 형성시킨 다음 732 ㎚에서 흡광도를 측정하여 흡광도 값이 1.5 이하가 나오도록 증류수로 희석하고, 희석된 ABTS+ 용액 150 ㎕와 시료 5 ㎕를 혼합하고, 실온에서 10분간 반응시킨 후, 마이크로 플레이트 측정기를 통해 732 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. SCE의 항산화능은 하기 수학식 2와 같이, 증류수를 대조군으로 하여 대조군에 대한 ABTS 라디칼 소거능을 백분율로 나타내었다.

[수학식 2]

그 결과, 도 4를 참조하면, SCE의 ABTS 라디칼 소거능은 농도 의존적으로 증가하였으며, 이때 IC₅₀ 값이 46.94 ㎍/㎖인 것으로 확인되었다.

또한, 각각의 개별 조성물인 실시예 1의 곰보배추 추출물 단독(1000 ㎍/㎖)과, 실시예 2의 병풀 추출물 단독(1000 ㎍/㎖)에 대해 동일한 실험을 추가로 진행하였으며, 도 4에 나타내어 함께 비교하였다.

실험예 4. 곰보배추 및 병풀 혼합물의 항염 효능

면역세포로서 대식세포인 RAW264.7 세포를 이용하여 곰보배추 및 병풀 혼합물의 세포 독성, 염증 관련 인자의 유전자 및 단백질 발현량, 생성량을 측정하였다.

4-1. 세포 독성

이후, RAW264.7 세포를 24웰 플레이트에 1X10⁵ cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, SCE를 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 시료의 양성대조군으로는 아스코르브산(ascorbic acid)를, 음성대조군으로 증류수를 처리하였다. 배양 후 배양액 100 ㎕당 EZ-Cytox 용액 (Daeilab, 한국) 10 ㎕을 첨가하여 세포배양기에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 450 ㎚에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다.

그 결과, 도 5를 참조하면, SCE는 200 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 RAW264.7 세포의 세포생존율을 약 100% 수준으로 유지하였으며, 400 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 RAW264.7 세포의 세포생존율을 약간 감소시킨 것으로 나타나, 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다.

또한, 각각의 개별 조성물인 실시예 1의 곰보배추 추출물 단독(400 ㎍/㎖)과, 실시예 2의 병풀 추출물 단독(400 ㎍/㎖)에 대해 동일한 실험을 추가로 진행하였으며, 도 5에 나타내어 함께 비교하였다.

4-2. 유전자 발현량 측정

6웰 플레이트에 RAW264.7 세포를 2X10⁶ cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 SCE를 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 2시간 후, 100 ng/㎖의 LPS를 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 이후, 총 RNA 추출 키트(total RNA prep kit) (Intronbio, 한국)를 이용하여 세포의 RNA를 추출하였다. 1,200 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 얻은 세포에 easy blue 1 ㎖와 클로로포름(chloroform) 200 ㎕를 넣고 볼텍싱(vortexing)한 후, 13,000 rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액 400 ㎕와 결합 완충액(binding buffer) 400 ㎕를 실온에서 1분 동안 반응시킨 뒤 반응액 700 ㎕를 컬럼(column)에 주입하여 13,000 rpm에서 30초 동안 원심분리하였다. 컬럼에 세척 완충액(washing buffer) A를 700 ㎕ 넣고 13,000 rpm에서 30초 동안 원심분리 후, 세척 완충액 B를 700 ㎕ 넣고 동일하게 원심분리하였다. 컬럼 하단을 1.5 ㎖ 튜브(tube)로 교체한 후, 컬럼에 용출 완충액(elution buffer)을 30 ㎕ 넣고 1분 동안 반응시킨 뒤 13,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 총 RNA를 추출하였다.

역전사(reverse transcription) 반응은 RT 프리믹스 키트(accupower cyclescript RT premix kit) (Bioneer, 한국)의 혼합물(mixture) (반응 완충액(reaction buffer), dNTPs 혼합물, RNase 억제제(inhibitor), 안정제(stabilizer) 및 올리고(oligo)-dT15 프라이머 포함)에 총 RNA를 1 ㎍ 넣고 DEPCDW을 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 첨가하였다. 이 혼합액을 잘 섞은 후, 45℃에서 60분 반응시켜 first-strand cDNA를 합성하고, 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLVRT(reverse transcriptase)를 불활성화 시켜 합성이 완료된 cDNA를 PCR(polymerase chain reaction)에 사용하였다.

합성이 완료된 cDNA를 증폭시키기 위하여 real-time PCR을 진행하였으며, real-time 전용 튜브에 cDNA 1 ㎕, 각 프라이머 2 ㎕, SYBR Green (Qiagen, 독일) 10 ㎕, DEPC-DW 5 ㎕씩 넣어 95℃에서 2분 동안 반응시키고 다음 95℃에서 5초, 62.5℃에서 30초를 40회 반복하여 유전자를 증폭시켰다. 유전자 발현량은 대조군과 비교하여 계산하였으며, 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 1과 같다.

유전자	프라이머	프라이머 서열 (5'-3')
NOS2	정방향	CGAAACGCTTCACTTCCAA
NOS2	역방향	TGAGCCTATATTGCTGTGGCT
PTGS2	정방향	AACCGCATTGCCTCTGAAT
PTGS2	역방향	CATGTTCCAGGAGGATGGAG
IL1B	정방향	AAGAAGAGCCCATCCTCTGT
IL1B	역방향	GGAGCCTGTAGTGCAGTTGT
IL6	정방향	AGTCCTTCCTACCCCAATTTCC
IL6	역방향	GGTCTTGGTCCTTAGCCACT
TNFA	정방향	ATGGCCTCCCTCTCATCAGT
TNFA	역방향	TTTGCTACGACGTGGGCTAC
ACTB	정방향	AACCGCATTGCCTCTGAAT
ACTB	역방향	CATGTTCCAGGAGGATGGAG

실험 결과는 SPSS 210를 이용하여 평균±표준오차(mean±standard error of mean)으로 나타내었으며, ANOVA를 사용하여 다중 비교하였고 Tukey's HSD test를 통해 p＜0.05, p＜0.01 및 p＜0.001 수준에서 유의성을 검정하였다. 이후 실험 결과에 대해서도 동일한 방법으로 유의성을 검정하였다.

그 결과, 도 6 내지 10을 참조하면, SCE는 농도 의존적으로 가려움증을 유발하는 NO 합성 효소 (NOS2), 프로스타글란딘 합성 효소 (PTGS2), IL-1β, IL-6 및 TNF-a 유전자의 mRNA 발현량을 감소시킨 것으로 나타났다.

또한, 각각의 개별 조성물인 실시예 1의 곰보배추 추출물 단독(200 ㎍/㎖)과, 실시예 2의 병풀 추출물 단독(200 ㎍/㎖)에 대해 동일한 실험을 추가로 진행하였으며, 도 6 내지 도 10에 나타내어 함께 비교하였다.

4-3. 단백질 발현량 측정

RAW264.7 세포를 6웰 플레이트에 2X10⁶ cells/welll로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 SCE를 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 2시간 후, 100 ng/㎖의 LPS를 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 이후, 1,200rpm에서 5분 동안 원심분리하여 얻은 세포를 D-PBS로 2회 세척하고 세포 펠렛(pellet)에 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail) Ⅰ (Sigma-Aldrich, 미국), 포스파타아제 억제제(phosphatase inhibitor) Ⅱ 및 Ⅲ가 포함된 RIPA 완충액(buffer) (Thermo Fisher, 미국)을 넣어 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 BCA 단백질 정량 키트(proein assay kit) (Thermo Fisher, 미국)를 이용하여 정량하였으며, 로딩(loading) 완충액과 섞어 95℃에서 5분간 반응시켜 준비하였다. 준비된 단백질은 10% 아크릴아마이드겔(acrylamide gel)을 통해 SDS-PAGE하여 크기별로 분리하였으며, PVDF 막(membrane)에 이동시켰다. 단백질이 옮겨진 막을 3% BSA에 담가 상온에서 2시간 반응시켰다. TBS-T 완충액을 이용하여 세척하고 1차 항체(primary antibody)로서 p44/42 MAPK(Erk1/2)(137F5) Rabbit mAb (Cell signaling, 미국; 이하 동일함), Phospho-p44/42 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)(D13.14.4E) XP® Rabbit mAb, SAPK/JNK 항체, Phospho-SAPK/JNK(Thr183/Tyr185)(G9) Mouse mAb, p38 MAPK 항체 또는 Phospho-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)(D3F9) XP® Rabbit mAb를 넣어 4℃에서 16시간 반응시켰다. 다시 3회 세척하고 2차 항체(secondary antibody) (Jackson immunoresearch, 미국)를 넣어 상온에서 1시간 반응시켰으며, 다시 세척하고 ECL 용액(solution)을 통해 단백질을 발색시켰다. 이후, chemidoc fusion FX (Vilber Lourmat, 프랑스)를 통해 단백질 발현량을 분석하였다.

그 결과, 도 11 내지 13을 참조하면, SCE는 농도 의존적으로 사이토카인, 산화질소, 프로스타글란딘 등과 같이 염증 유발 인자의 발현에 관여하는 ERK, JNK 및 P38의 단백질 발현량을 감소시킨 것으로 나타났다.

또한, 각각의 개별 조성물인 실시예 1의 곰보배추 추출물 단독(200 ㎍/㎖)과, 실시예 2의 병풀 추출물 단독(200 ㎍/㎖)에 대해 동일한 실험을 추가로 진행하였으며, 도 11 내지 도 13에 나타내어 함께 비교하였다.

4-4. 바이오마커 생성량 측정

NO 생성량을 측정하기 위하여, NO 분석 키트 (Intronbio, Korea)를 사용하였다. RAW264.7 세포를 24웰 플레이트에 1X10⁵ cells/welll로 분주하여 24시간 동안 배양하고 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 SCE를 처리하고 2시간 후, 100 ng/㎖의 LPS를 하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 96웰 플레이트에 세포배양액 100 ㎕를 넣고 N1 완충액 50 ㎕를 추가하여 상온에서 10분간 반응시켰으며, 반응 후 N2 완충액 50 ㎕를 추가하여 상온에서 10분간 반응시켰다. 반응 후, 540 ㎚에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 생성량을 백분율로 표시하였다.

PGE2, IL-1β, IL-6 및 TNF-a 생성량을 측정하기 위하여, 각각 mouse PGE2 ELISA kit (R&D Systems, 미국), mouse IL-1β ELISA kit(Komabiotech, 한국), mouse IL-6 ELISA kit (Komabiotech, 한국), mouse TNF-a ELISA kit (Komabiotech, 한국)를 사용하였다. RAW264.7 세포를 6웰 플레이트에 2X10⁶ cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하고 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 SCE를 처리하고 2시간 후, 100 ng/㎖의 LPS를 하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 이후, 1,200 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 얻은 세포배양액을 100 ㎕씩 넣고 상온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후 플레이트에 있는 시약을 버리고 세척 완충액을 넣어 4회 세척하였다. 세척 후 검출 항체(detection antibody)를 100 ㎕씩 추가하여 상온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후 플레이트에 스트렙트아비딘(streptavidin)-HRP 100 ㎕씩 추가하여 상온에서 30분 반응시켰다. 반응 후 TMB 또는 pink-ONE solution 100 ㎕씩 각 웰에 넣은 후 15분간 반응시키고 반응 정지액(stop solution) 100 ㎕를 추가하여 마이크로 플레이트 측정기를 통해 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 표준곡선(standard curve)를 기준으로 절대값으로 나타내었다.

그 결과, 도 14 내지 18을 참조하면, SCE는 농도 의존적으로 NO, PGE2, IL-1β, IL-6 및 TNF-a 생성량을 감소시킨 것으로 나타났다.

또한, 각각의 개별 조성물인 실시예 1의 곰보배추 추출물 단독(200 ㎍/㎖)과, 실시예 2의 병풀 추출물 단독(200 ㎍/㎖)에 대해 동일한 실험을 추가로 진행하였으며, 도 14 내지 도 18에 나타내어 함께 비교하였다.

실험예 5. 곰보배추 및 병풀 혼합물의 항가려움 효능

비만세포인 MC/9 세포를 이용하여 곰보배추 및 병풀 혼합물의 세포독성, 가려움증 유발 인자의 유전자 및 단백질 발현량을 측정하였다.

5-1. 세포 독성

MC/9 세포는 10% FBS, 10% T-stim, 0.05 mM, 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol) (Gibco BRL, 미국), 2 mM L-글루타민(glutamine) 및 100 ㎍/㎖ 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 함유된 DMEM 배지 (Gibco BRL, 미국)를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건이 유지되는 세포배양기에서 배양하였으며, 2 ~ 3일 주기로 계대 배양하여 실험을 진행하였다.

이후, MC/9 세포를 48웰 플레이트(48-well plate)에 1X10⁵ cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, SCE를 10, 20, 40, 50㎍/㎖의 농도로 처리하여 다시 12시간 동안 배양하였다. 시료의 양성대조군으로는 아스코르브산(ascorbic acid)를, 음성대조군으로 증류수를 처리하였다. 배양 후 배양액 100 ㎕당 EZ-Cytox 용액 (Daeilab, 한국) 10 ㎕을 첨가하여 세포배양기에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 450 ㎚에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다.

그 결과, 도 19를 참조하면, SCE는 40 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 MC/9 세포주의 세포생존율을 약 100% 수준으로 유지하였으며, 50 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 MC/9 세포주의 세포생존율을 약간 감소시킨 것으로 나타나, 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다.

또한, 각각의 개별 조성물인 실시예 1의 곰보배추 추출물 단독(50 ㎍/㎖)과, 실시예 2의 병풀 추출물 단독(50 ㎍/㎖)에 대해 동일한 실험을 추가로 진행하였으며, 도 19에 나타내어 함께 비교하였다.

5-2. 유전자 발현량 측정

6웰 플레이트에 MC/9 세포를 2X10⁶ cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 SCE를 10, 20, 40 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 1시간 뒤, 1㎍/㎖의 DNP-IgE (Sigma-Aldrich, 미국)를 추가하여 12시간 동안 배양하였다. 이후, 실험예 4와 동일한 방법으로 총 RNA 추출, cDNA 합성, 유전자 증폭하여 유전자 발현량을 측정하였다. 여기서 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 2와 같다.

유전자	프라이머	프라이머 서열 (5'-3')
IL4	정방향	CAACCCCCAGCTAGTTGTCA
IL4	역방향	TGTCGCATCCGTGGATATGG
IL31	정방향	TCAGCAGACGAATCAATACAGC
IL31	역방향	TCGCTCAACACTTTGACTTTCT
ACTB	정방향	ATCGTGGGGCGCCCCAGGCACCA
ACTB	역방향	GGGGTACTTCAGGGTGAGGA

그 결과, 도 20 및 21을 참조하면, SCE는 농도 의존적으로 가려움증을 유발하는 IL-4 및 IL-31 유전자의 mRNA 발현량을 감소시킨 것으로 나타났다.

또한, 각각의 개별 조성물인 실시예 1의 곰보배추 추출물 단독(40 ㎍/㎖)과, 실시예 2의 병풀 추출물 단독(40 ㎍/㎖)에 대해 동일한 실험을 추가로 진행하였으며, 도 20 및 21에 나타내어 함께 비교하였다.

5-3. 단백질 발현량 측정

6웰 플레이트에 MC/9 세포를 2X10⁶ cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 SCE를 10, 20, 40 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 1시간 뒤, 1㎍/㎖의 DNP-IgE를 추가하여 6시간 동안 배양하였다. 이후, 실험예 4와 동일한 방법으로 단백질 발현량을 측정하였다. 여기서 1차 항체로 IL-4 항체 (Santa Cruz Biotechnology, 미국), 히스타민 항체 (LSBio, 미국) 또는 IL-31 항체 (LSBio, 미국)를 사용하였다.

그 결과, 도 22 내지 24를 참조하면, SCE는 농도 의존적으로 IL-4, IL-31 및 히스타민의 단백질 발현량을 감소시킨 것으로 나타났다.

또한, 각각의 개별 조성물인 실시예 1의 곰보배추 추출물 단독(40 ㎍/㎖)과, 실시예 2의 병풀 추출물 단독(40 ㎍/㎖)에 대해 동일한 실험을 추가로 진행하였으며, 도 22 내지 도 24에 나타내어 함께 비교하였다.

이러한 결과를 종합하면, 본 발명에 따른 곰보배추 및 병풀 추출물은 총 폴리페놀 및 플라보노이드를 다량 함유하여 라디칼을 효과적으로 제거하는 우수한 항산화 효능과 함께 염증을 유발하는 사이토카인 (IL-1β 및 IL-6), 산화질소 및 프로스타글란딘의 발현, 분비를 효과적으로 억제하는 우수한 항염증 효능을 나타내며, 가려움증을 유발하는 사이토카인 (IL-4, IL-31) 및 히스타민의 발현, 분비 또한 억제함으로써 피부를 비롯한 전신에서 나타날 수 있는 가려움증을 효과적으로 완화 또는 경감시키고, 피부톤을 밝고 깨끗하게 유지하는데 유용할 것으로 기대된다.

한편, 각각의 개별 조성물인 실시예 1의 곰보배추 추출물 단독과 실시예 2의 병풀 추출물 단독을 이용하여 진행한 실험과 비교한 결과, 동일한 농도 기준으로, SCE의 수치는, 곰보배추 추출물 단독에 대한 실험 수치 및 병풀 추출물 단독에 대한 실험 수치에 비해 우수한 효과를 나타낸 바, 구성 성분들의 혼합을 통한 예기치 못한 효과가 나타났음을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

곰보배추를 용매로 추출한 곰보배추 추출물과; 병풀을 용매로 추출한 병풀 추출물을;
5 ~ 10 : 1 ~ 5의 중량비로 혼합한 곰보배추 및 병풀 혼합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는,
항산화 및 항염증용 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4개의 알코올, 프로필렌글라이콜, 부틸렌글라이콜, 글리세린, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 클로로포름, 다이에틸에테르, 다이클로로메탄, 헥산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 용매로 추출된 것인, 조성물.
삭제
청구항 1에 있어서,
상기 조성물은 피부용, 두피용, 구강용, 안구용 또는 질(膣)용인 것인, 조성물.
청구항 1의 조성물을 포함하는 항산화 및 항염용 화장료 조성물.
청구항 5에 있어서,
상기 화장료 조성물은 피부 가려움을 완화 또는 경감하는 것인 항산화 및 항염용 화장료 조성물.
청구항 5에 있어서,
상기 화장료 조성물은 피부톤을 밝게 개선하는 것인 항산화 및 항염용 화장료 조성물.