KR102609289B1 - 비-동물성 배지에서의 박테리아 증식 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 혈액과 같은 동물 유래 물질이 결여된 배양 배지에서 미생물을 배양하기 위한 툴, 조성물 및 방법에 관한 것이며, 특히 육류-무첨가 배지 조성물에 관한 것이다.
Description
본 출원은 2018년 12월 6일자 미국 가출원번호 62/775,987에 대해 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 혈액과 같은 동물 유래 물질이 함유되지 않은 배양 배지에서 미생물을 배양하기 위한 툴, 조성물 및 방법에 관한 것이며, 특히 육류-무첨가 배지 조성물에 관한 것이다.
환경, 감염된 조직, 생물학적 검체, 조직으로부터 유래하거나 또는 유전자 조작된 미생물은, 비-제한적으로, 진단 또는 동정 목적, 증식 및 증폭 (예, 세포 또는 존재할 수 있는 바이러스 또는 박테리아와 같은 세포내 감염물) 및 클로닝을 비롯한 여러가지 이유로, 실험실 환경에서 배양 및 유지된다. 세포 배양은 세포, 조직 또는 장기를 조성이 공지된 영양 배양 배지에서 무균 조건 하에 세포, 조직 또는 장기를 유지시키거나 또는 생장시키기 위한 기법들 총체를 포함한다. 조직 배양은 미세증폭으로 알려진 방법으로 클론들을 제조하기 위해 널리 사용되고 있다. 박테리아 및 유전자 변형된 미생물과 같은 미생물은 흔히 특정 균주 또는 혈청형을 동정하거나 또는 항미생물제 (예, 항생제)와 같은 다양한 화학적 화합물에 대한 민감도 또는 내성을 검사하기 위해 배양한다.
모든 경우에, 미생물의 증식은 복제 가능성을 보장하고 의미있는 결과를 수득하기 위해 조심스럽게 제어되고 모니터링된다. 증식 배지는 액체 또는 형태 상 고체 배지인 고체, 또는 아가와 같은 반고체일 수 있다. 각 배지는, 어떤 형태이던 간에, 특정 미생물에 필요한 필수 영양분을 함유하여야 한다. 필수 영양분은, 비-필수 영양분과 구분되는 것으로서, 세포가 스스로 만들지 못하는 화학적 화합물이며, 그래서 환경으로부터 직접 획득하여야 한다. 액체 배지에는 다양한 유형의 동물 혈청 (예, 소 태아 혈청, 말 혈청, 염소 혈청)들이 이러한 필수 영양분을 제공하기 위해 포함되고, 고체 배지의 경우에는 필수 성분들은 동물 추출물 (예, 소 추출물)에 의해 공급된다. 동물 혈청 및 추출물은 비싸고, 그 구성 성분들이 정확하게 균일하지 않다. 그러나, 여러가지 다수 유형의 세포를 증폭시키는데에는 혈액과 같은 동물성 생산물이 증식에 필요하다. 비-동물성 배양 배지를 공급하는 것이 비용이 절감될 것이고, 검사 및 실험을 표준화하는데 도움이 될 것이다.
본 발명은 현행 전략 및 계획과 관련된 문제 및 단점들을 해결하고, 동물성 생산물이 필요없는 미생물 유지 및 증폭을 위한 새로운 장치 및 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예는 하나 이상의 염; 마그네슘 염; 칼슘 염; 소이 밀 (soy meal); 다당류; 2종 이상의 아미노산; 효모 추출물; 철(II) 염 또는 철(I) 염; 및 피루베이트를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 하나 이상의 염은 염화나트륨을 포함한다. 바람직하게는, 마그네슘 염은 염화마그네슘 또는 황산마그네슘을 포함한다. 바람직하게는, 칼슘 염은 염화칼슘 또는 황산칼슘을 포함한다. 바람직하게는, 소이 밀은 소이 밀의 효소적 가수분해물을 포함한다. 바람직하게는, 2종 이상의 아미노산은 시스테인 및 티아민을 포함한다. 바람직하게는, 당류는 글루코스를 포함한다. 바람직하게는, 철(II) 염 또는 철(I) 염은 황산철(II), 구연산 철 또는 둘다를 포함한다. 바람직하게는, 조성물은 수용액 또는 건조 분말을 포함한다. 바람직하게는, 수용액은 약 1-5 g/L의 하나 이상의 염; 약 0.1-2.0 g/L의 마그네슘 염; 약 0.001-0.1 g/L의 칼슘 염; 약 2-10 g/L의 소이 밀; 약 5-20 g/L의 다당류; 약 0.001-0.1 g/L의 2종 이상의 아미노산; 약 1-10 g/L의 효모 추출물; 약 0.0001-0.001%의 철(II) 염 또는 철(I) 염; 및 약 0.01-1.0%의 피루베이트를 포함한다.
본 발명의 다른 조성물은 하나 이상의 염; 소이 밀; 당류; 효모 추출물; 식물 단백질 가수분해물, 철(II) 염 또는 철(I) 염; 및 피루베이트를 포함한다. 바람직하게는, 하나 이상의 염은 염화나트륨을 포함한다. 바람직하게는, 소이 밀은 소이 밀의 효소적 가수분해물을 포함한다. 바람직하게는, 당류는 글루코스를 포함한다. 바람직하게는, 효모 추출물은 식물성 효모 추출물을 포함한다. 바람직하게는, 식물 단백질 가수분해물은 아톨레이트 (atholate)를 포함한다. 바람직하게는, 철(II) 염 또는 철(I) 염은 황산철(II) 또는 구연산 철을 포함한다. 바람직하게는, 소이 밀의 효소적 가수분해물은 약 0.5-10%의 농도로 존재하고, 다당류는 약 0.5-5%의 농도로 존재하고, 식물성 효모 추출물은 약 0.1-10%의 농도로 존재하고, 식물 단백질 가수분해물은 약 1-10%의 농도로 존재하고, 철(II) 염 또는 철(I) 염은 약 0.001-0.01%의 농도로 존재하고, 피루베이트는 약 0.01-1.0%의 농도로 존재한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 수용액, 건조 분말 또는 아가와 같은 반고체이다.
본 발명의 다른 구현예는, 미생물 샘플을 수득하는 단계; 및 미생물을 본 발명의 조성물을 포함하는 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 미생물 배양 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 미생물은 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예들 및 이점들이 후술한 설명에서 일부 기술되며, 이러한 설명으로부터 명확해지거나 또는 본 발명을 실시함으로써 학습할 수 있다.
스트렙토코커스 뉴모니애와 같은 미생물은 통상적으로 혈액 아가 플레이트에서 배양한다. 이러한 유형의 박테리아는 동물 혈액이 첨가되지 않은 배지에서는 증식하지 않는다. 증식 배지에서 동물 혈액의 요건은 정확한 표준화를 허용하지 않으며, 비용을 증가시키고, 종종 공급이 제한적이다. 아울러, 혈액 및 혈액 산물이 인증될 수도 있지만, 인증이 TSE (전염성 해면형 뇌병증 (예, 소 해면형 뇌병증 (BSE))와 같은 물질이 존재하지 않는다는 것을 보장해주는 것은 아니다.
동물성 생산물이 전혀 없는 배양 배지에서 미생물의 증식 및 증폭을 유지시키는 배지가 놀랍게도 발견되었다. 배양 배지에 동물성 생산물의 부재는 실질적으로 비용을 절감하고, 표준화를 높이고, 안전성을 실질적으로 개선한다. 또한, 본원에 기술된 바와 같은 비-동물성 배지는 동일한 미생물을 혈액 아가 플레이트에서 증식시키는 것과 비교해 거의 동일한 증식을 제공해주었다.
본 발명의 일 구현예는 스트렙토코커스 뉴모니애와 같은 다양한 스트렙토코커스 종들을 증식 및 증폭시키기 위한 비-동물성 배지에 관한 것이다. 배지는 동물성 생산물을 함유하지 않으므로, 배지는 인간 등의 동물로부터 수득되거나 또는 유래된 혈액, 혈액 산물 또는 혈청을 함유하지 않는다. 바람직하게는, 제외되는 동물성 생산물은 포유류의 생산물이며, 동물 태아 또는 어린 또는 늙은 동물을 포함한다. 전형적인 동물 혈청으로는, 예를 들어, 소 혈청 (예를 들어, 소 태아 혈청), 염소 혈청, 말 혈청 및 이러한 동물로부터 수득되는 생산물을 포함한다.
조성물은 하나 이상의 염; 마그네슘 염; 칼슘 염; 소이 밀; 당류; 2종 이상의 아미노산; 효모 추출물; 철(II) 염 또는 철(I) 염; 및 피루베이트를 포함한다. 바람직하게는, 하나 이상의 염은 염화나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨 또는 황산칼륨을 작용 농도 약 1-5 g/L로 포함한다. 바람직하게는, 마그네슘 염은 염화마그네슘 또는 황산마그네슘을 작용 농도 약 0.1-2.0 g/L로 포함한다. 바람직하게는, 칼슘 염은 염화칼슘 또는 황산칼슘을 작용 농도 약 0.001-0.1 g/L로 포함한다. 바람직하게는, 소이 밀은 소이 밀의 효소적 가수분해물, 예를 들어 아톨레이트를 작용 농도 약 2-10 g/L로 포함한다. 바람직하게는, 당류는 글루코스, 덱스트로스, 슈크로스, 프럭토스 또는 개질되거나 치환된 다당류를 작용 농도 약 5-20 g/L로 포함한다. 바람직하게는, 2종 이상의 아미노산은 시스테인 및 티아민을 총 작용 농도 약 0.001-0.1 g/L로 포함한다. 바람직하게는, 효모 추출물은 작용 농도가 약 1-10 g/L이다. 바람직하게는, 철(II) 염 또는 철(I) 염은 황산철(II) 또는 구연산 철을 작용 농도 약 0.0001-0.001%로 포함한다. 바람직하게는, 피루베이트는 소듐 피루베이트를 작용 농도 약 0.01-1.0%로 포함한다.
다른 바람직한 조성물은 하나 이상의 염; 소이 밀; 당류; 효모 추출물; 식물 단백질 가수분해물, 철(II) 염 또는 철(I) 염; 및 피루베이트를 포함한다. 바람직하게는, 하나 이상의 염은 염화나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨 또는 황산칼륨을 작용 농도 약 0.5-4%로 포함한다. 바람직하게는, 소이 밀은 소이 밀의 효소적 가수분해물, 예를 들어 SoyTone을 작용 농도 약 0.5-10%로 포함한다. 바람직하게는, 당류는 글루코스, 덱스트로스, 슈크로스, 프럭토스, 또는 개질되거나 치환된 당류를 작용 농도 약 0.5-5%로 포함한다. 바람직하게는, 식물성 효모 추출물은 예를 들어 식물성 효모 추출물을 작용 농도 약 0.1-10%로 포함한다. 바람직하게는, 식물 단백질 가수분해물은 아톨레이트를 작용 농도 약 1-10%로 포함한다. 바람직하게는, 철(II) 염 또는 철(I) 염은 황산철(II) 또는 구연산 철을 작용 농도 약 0.001-0.01%로 포함한다. 바람직하게는, 피루베이트는 소듐 피루베이트를 작용 농도 약 0.01-1.0%로 포함한다.
본원에 기술된 조성물들은 건조 분말 (예, 동결건조된), 액체 조성물 또는 반고체 (예, 아가)와 같이 장기간 주위 온도에서 유지시킬 수 있다. 그 기간은, 예를 들어, 수주, 수개월 또는 수년일 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 살균 여과, 가열 살균, 방사성 조사 살균 또는 이들의 조합에 의해 무균적으로 제조된다. 건조 분말은, 바람직하게는, 아가 또는 아가 플레이트를 제조하기 위한 기타 안정적인 지지제 (support)와 혼합되거나, 또는 액체 배지로서 유지된다. 조성물에서 아가 %는 당해 기술 분야의 당업자에 의해 미생물의 특이적인 특징을 토대로 결정된다.
본 발명의 다른 구현예는 유기체를 본원에 기술된 조성물과 접촉시킴으로써 미생물을 배양 및 증폭시키는 방법에 관한 것이다. 바람직한 미생물은 스트렙토코커스 sp. (예를 들어, 스트렙토코커스 뉴모니애), 스타필로코커스 sp. (예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)), 슈도모나스 sp. (예를 들어, 슈도모나스 에어루지노사 (Pseudomonas aeruginosa)), 에세리키아 sp. (예를 들어, 에세리키아 콜라이 (Escherichia coli)), 시겔라 sp., 살모넬라 sp., 네이세리아 sp., 및 이들의 조합을 포함한다. 이들 각각에 대한 구체적인 생장 조건은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 공지되어 있으며, 원하는 미생물의 최대 생장을 목적으로 다양한 부가적인 비-동물성 성분들을 함유할 수 있다.
하기 실시예들은 본 발명의 구현예를 예시하지만, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예
실시예 1 스트렙토코커스 뉴모니애의 증식
혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F로 명명된 스트렙토코커스 뉴모니애 균주 20종의 글리세롤 스톡 (PNU)을 입수하여, 선택한 규정된 철 첨가된 육류 무첨가 (MF) 폐렴구균 배지에서 아가 플레이트 및 액체 브로스 둘다에서 증식 능력을 검사하였다. 배지는 종균 제조를 촉진하므로, 혈액 아가 계대 배양을 하지 않을 수 있는 것으로 확인되었다. 육류-무첨가 (MF) 배지 2종은 PNU-Fe 및 SoyTone-Fe로 지칭한다. SoyTone은 (미국 VWR corporation 사에서 상업적으로 구입가능한) 소이 밀의 효소 분해물이다. MF 배지에서 배양된 균주의 다당류 수율을 미니-생물반응조 발효 배치에 의해 수득한 상층액과 부분 다운-스트림 정제에 의해 비교하였다.
글리세롤 스톡으로부터 출발하여, 균주 20종을 5% 양 혈액 아가 플레이트와 함께 트립티카제 소이 아가 (TSA)에서 배양하였다. 각 균주는 혈액 아가 플레이트에서 수득하여, 철 첨가제가 함유된 PNU-Fe 및 SoyTone-Fe 플레이트 둘다에서 3일 연속 계대 배양하였다. 각 계대 배양은 단일 콜로니 5-10개 (200 ㎕ 파이펫을 이용한 멸균 팁을 사용해)를 취해, 96웰 플레이트의 U자 바닥형 웰 내 배지 50 ㎕로 옮겼다. 각각 혼합하고, 세포 현탁물 50 ㎕를 MF 배지 플레이트 위에 배치하여 균일하게 분산하였다. 3차 계대 배양 후, MF 배지를 10 ml 액체 브로스 접종 미니-생물반응조에 각 배양물과 함께 접종하였다. 균주 증식을 OD590에 의해 측정하였다.
2.5±0.3 OD590에 도달하면, 배양물 배치를 2개로 나누었다. 하나는 세포 종균을 제조하는데 사용하고, 다른 하나는 최종적으로 소듐 데옥시콜레이트를 처리한 다음 원심분리에 의해 세포를 분리하였다. 배양 상층물에 효소를 처리하였다. 효소 처리 후 상층물을 100k 스핀 필터에서 농축하고, 체류물을 수집하였다. 이 체류물에서 브로스 ml 당 다당류의 함량을 QC에 의해 분석하였다.
각 균주는 동일하게 처리하였으며, 균주는 작용 스톡으로부터 취해 옵토킨 (optochin) 디스크의 존재 하에 5% 양 혈액이 첨가된 트립티카제 소이 아가 플레이트에 스트리킹하였다. 이들 플레이트는 37℃ 및 5% CO2에서 16시간 인큐베이션하였다. 콜로니 증식은 옵토킨 디스크, 응집 반응, 그람 염색 및 콜로니 형태에 의해 검증하였다.
각 콜로니로부터 단일 균주를 철 첨가제가 함유된 육류-무첨가 배지 아가 플레이트에서 계대 배양하였다. veggie [육류-무첨가 배지] 플레이트 상의 단일 콜로니로부터 총 3회 계대 배양을 수행하였다. 플레이트는 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 인큐베션하였다.
PNU-Fe 배지 조성물
플레이트를 1 L 배치로 제조하여 플레이트 40개를 준비하였다. 소듐 피루베이트, 황산철(II) 및 구연산 철을 제외한 모든 성분들은 미리 자동멸균기에서 멸균하였다. 피루베이트 첨가물은 1% 스톡으로 준비하고, 철 첨가물은 0.4% 스톡으로 제조하였으며, 0.2 ㎛로 여과한 다음 플레이트에 붓기 전에 조성물의 자동멸균한 나머지 분획에 무균적으로 첨가하였다 (%는 w/v임).
IVT PNU-Fe 브로스는 하기 조성으로 표준 프로토콜에 따라 준비하였다. 브로스는 50x 스톡 염 용액 각각 20 mL, 50x Hi-Soy 용액 100 mL 및 10x 슈거 (sugar) 스톡 용액 100 mL로 제조하였다. 총 부피는 Milli-Q 워터를 사용해 1.0 L로 만들었다. Hi-Soy는 용해성이 우수하고 다용도로 사용되는 소이 밀의 효소적 가수분해물 (Sigma-Aldrich 사에서 상업적으로 구입가능)이다. 염 및 소이 성분들은 멸균 처리를 위해 자동멸균기에서 멸균하고, 슈거 스톡은 0.2 ㎛에서 여과하였다.
PNU-Fe 조성물
● 자동멸균 처리 성분
o NaCl, 최종 농도: 2.0 g/L
o MgSO4, 최종 농도: 0.5 g/L
o KH2PO4, 최종 농도: 0.7 g/L
o CaCl2, 최종 농도: 0.02 g/L
o Hi-Soy, 최종 농도: 4.0 g/L
● 슈거 성분들
o D-글루코스, 최종 농도: 10.0 g/L
o L-시스테인, 최종 농도: 0.2 g/L
o 티아민 HCl, 최종 농도: 0.02 g/L
o 효모 추출물, 최종 농도: 5.0 g/L
● 첨가물:
● 황산철(II), 최종 농도: 0.004%[w/v]
● 구연산 철, 최종 농도: 0.004%[w/v]
● 소듐 피루베이트: 0.1%[w/v]
SoyTone
-Fe 배지 조성물
:
Soytone 1.0%
트립톤 대체제 아톨레이트 0.5%
글루코스 1.0%
Veggie 효모 추출물 0.5%
NaCl 1.0%
첨가물:
소듐 피루베이트 0.1%
황산철(II) 0.004%
구연산 철 0.004%
실시예
2
(a) 5% 양 혈액이 첨가된 트립티카제 소이 아가 ( TSA )를 이용한 경우 0일
전술한 균주 20종 모두 혈액 아가 플레이트에서 밤새 양호하게 증식하는 것으로 나타났다. 스트리킹 후, 옵토킨 디스크를 스트리크 주변부에 배치하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 콜로니 증식을 옵토킨 디스크의 저해 존, 응집 반응, 그람 염색 및 콜로니 형태에 의해 검증하였다.
모든 혈청형들이 혈액 아가 플레이트 상에서 정상적인 컨플루언트 증식을 나타내었다. 옵토킨 디스크 및 그람 염색 결과는 양성이었다. 현미경을 이용한 형태 검경에서 순수한 것으로 검증되었다.
(b) 액체 배지 증식 및 종균 (글리세롤 스톡 ) 제조
3차 계대 배양한 후, 50 ml [팔콘 코니칼 바닥] 튜브에서 액체 PNU-Fe 브로스 20 ml에 접종하여, 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 0.25 내지 0.3 OD620에 도달한 후.
증식물을 회수하고, 펠릿을 15% 글리세롤이 함유된 종균 배지에 다시 현탁하였다. 종균 스톡 (1 ml 바이얼 5-9개)을 준비하여, 사용시까지 -80℃에서 보관하였다. 23F, 7F, 6B, 15B, 12F, 4, 14, 8, 5, 9V, 18C, 3, 33F, 22F, 6A 및 19F의 종균 바이얼을 대상으로, 미니-생물반응조에 접종하기 전에, 접종원 증식성을 확인하기 위해, PNU-Fe에서 이의 증식을 검사하였다.
(c) 미니- 생물반응조 발효
미니-생물반응조의 어셈블리 및 멸균 처리는 발효 증식 조건에서와 같은 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. 배양물의 증식 (OD 590)과 더불어 pH(7.2)를 모니터링하였다. OD590이 1±0.3에 도달하면, 모든 혈청에 대해 피드 펌프를 작동시켰다.
(2.5±0.3 OD590)에 도달한 후, 200 ml 배치 발효를 완료하고, 배양물을 2개로 나누었다. 200 ml 배양물 중 100 ml은 종균을 제조하는데 사용하였다. 50 ml 멸균 코니칼 팔콘 튜브 2개에 배양물을 넣어, 4000g [PNU3의 경우, 10000 g]에서 25분간 4℃에서 원심분리하였다. 세포 펠릿을 건드리지 않으면서 상층물을 따라 내었다. 펠릿의 세포를 표준 프로토콜에 따라 준비한 15% 글리세롤 매질에 OD 2.50이 되도록 재현탁하였다. 15% 글리세롤 매질의 필요한 부피 = (배양물의 최종 OD) x (최종 상층물 부피)/2.5. 나머지 100 ml는 0.15% DOC를 37℃에서 30분간 처리하여 사멸시키고, 후술한 부분 다운-스트림 정제하여 다당류 수율을 추정하는데 사용하였다.
(d) 다운- 스트림 정제
● 상기 DOC 처리한 배양물을 세포 파편 분리를 위해 40분간 11k에서 원심분리하였다.
● 상층물을 수집하고, 완충화한 다음 (최종 농도 20.0 mM Tris, 2.0 mM MgCl2, pH 8.0), 뉴클레아제 및 프로테이나제를 연속적으로 처리하였다.
● 뉴클레아제 처리: 37℃에서 4시간 동안 150 RPM으로 진탕 혼합.
● 프로테이나제 처리: 뉴클레아제를 처리한 후, 최종 프로테이나제 처리를 37℃에서 16시간 동안 150 RPM으로 진탕 혼합하면서 수행하였다.
● 100K 스핀 여과에 의한 농축.
● 효소 처리된 상층물 중 45 mL (나머지 55 ml은 2-8℃에서 보관) 분액은 100K 원심분리 스핀-필터를 사용해 농축하였다. 매번 15 ml 효소 처리된 배양 상층물을 100K 스핀 필터 위에 놓고, 탁상형 원심분리기에서 5000 RPM으로 30분간 4℃에서 스핀 다운하였다. 체류물은 150mM NaCl 5 ml로 수세하여 스핀 다운시키고, 최종적으로 표준화된 체류물 1 ml을 수집하였다. 이 샘플은 안트론 분석, 다중 분석을 위해 QC 분석하고, 혈청형 특이 다당류를 정량하기 위해 비탁 측정하였다.
미니바이오 발효
6A 종균 배양 PNU-Fe 및 혈액 아가 플레이트. 육류-무첨가 (계대 배양) 종균 1 ml을 PNU-Fe 액체 배지 (pH7.2) 9 ml에 50 ml 코니칼 튜브에서 접종하고, 5% CO2 배양기에서 37℃에서 150 rpm으로 교반하면서 4시간 동안 배양하였다. 250 ml 용기 미니-생물반응조를 이용한 평균 시간을 어셈블리하였다. pH 프로브를 교정하여 생물반응조에 넣고, 드라이 사이클 스팀 멸균을 위해 과정을 진행하였다. 이후, PNU-Fe 액체 배지 90 ml을 무균적으로 용기로 옮겼다. 베이스 10 ml 분액을 생물반응조와 연결된 지정된 15 ml 무균 튜브로 무균적으로 옮기고, 용기에서 생물반응조까지 튜브를 통해 흐르(프라이밍)게 하였다.
Applikon 미니-바이오-발효를 운영하는 Bioexpert 소프트웨어 및 My-컨트롤을 이용해, 설정된 파라미터, 즉 온도 (37±0.5℃), pH 7.2 및 교반 150 RPM에 도달하였다. 이후, 생물반응조의 무균 격막 포트를 통해 멸균 시린지와 바늘을 사용해 미니-바이오 용기에 (코니칼 튜브에서 4시간 배양한 접종원을) 접종하였다. 접종한 후 샘플 1 ml을 생물반응조로부터 무균적으로 취하여 0시간 OD를 수득하였다. 발효 공정을 설정 포인트에서 계속 진행하였다. 배양물의 OD가 1.2-1.7에 도달할 때까지 매시간 OD를 측정하였다. 각 시간대의 샘플을 또한 현미경 슬라이드에서 검경하였다.
이들 샘플에 대한 그람 염색을 수행하여, 발효 단계 동안의 배양물의 순도를 확인하였다.
콜로니
면역블롯에
의한 육류-무첨가 배지 PNU 종균 확인
육류 무첨가 배지에서 계대 배양한 폐렴간균 종균을 혈액 아가 및 육류 무첨가 아가 (PNU-Fe) 플레이트에서 밤새 배양하였다. 균주는 각 플레이트로부터 니트로셀룰로스 막으로 블롯팅하였다. 블롯팅한 막을 처리하기 전 건조시켰다. 각 막을 PBS 완충제 중의 2% BSA 용액으로 차단 처리한 다음 각각의 1차 항체 (혈청으로부터 1:500 희석)와 함께 인큐베이션하였다. 1차 항체와 인큐베이션한 후, 막을 0.1% Tween 20/PBS 완충제로 헹구었다. 헹군 후, 막을 HRP 항-토끼 2차 항체 (혈청으로부터 1:500 희석)와 함께 인큐베이션하였다. 막을 HRP 키트를 사용해 가시화하였다.
1차 항체: 폐렴구균 항혈청, 스타텐 (Staten)은 상업적으로 구입하였다 (Serum Institute of India Pvt. Ltd., India). 2차 항체: Anti Rabit IgG (H+L), HRP 접합체는 상업적으로 구입하였다(Cat#20320, Lot#AD1527-L, Alpha Diagnostics).
육류-무첨가 아가 배지에서 계대 배양한 폐렴구균 종균을 혈액 및 육류 무첨가 PNU-Fe 플레이트에서 배양하고, 이의 실체를 검증하기 위한 면역블롯을 위해 루프 스트리킹을 수행하였다. (육류-무첨가 배지 100 ml에 대해) Applikon 미니바이오발효 셋업을 접종에 이용하였다.
미니-바이오 발효 공정에서, 육류-무첨가 배양한 배양물로부터 mid-log 수준의 다당류 수율을 용이하게 수득하기 위해, 배양물은 OD 590 1.2-1.7에 도달할 때까지 배양하였다. 여러가지 균주들이 약간의 차이를 보이면서 4-6시간내에 최적 OD590 1.2-1.7에 도달하였다. 발효 배치는 0.15% DOC를 처리해 종료시켰다. DCC 처리된 브로스를 전술한 바와 같이 다당류를 일부 정제하기 위해 처리하였다.
그 결과, PNU-Fe 및 SoyTone-Fe 육류 무첨가 액체 배지 둘다 폐렴구균 증식을 뒷받침하는 것으로 확인된다. 트립톤 대체제 아톨레이트가 첨가된 PNU-Fe 배지 플레이트에서 보다 우수한 증식이 관찰되었다. 철 첨가는 PNU 일반 배지 조성물을 농화시켰다. 전술한 전체 균주들에서 육류-무첨가 아가 배지 배양을 이용해 글리세롤 종균이 성공적으로 제조되었다. 종균을 미니 바이오-발효기 증식으로 검사한 다음 브로스에서 다당류 수율을 추정하였으며, 그 결과 이전에 관찰된 혈액 아가 배양 종균에서와 비슷하였다.
| 표 1 미니 생물반응조에서 PNU14 육류 무첨가 종균 배양 미니바이오 발효 PS 수율 추정 |
|
| 균주# | PS 수율 ㎍/ml |
| 6A | 201.33 |
| 19F | 204.20 |
| 33F | 167.56 |
| 12F | 119.75 |
| 7F | 233.34 |
| 4 | 390.09 |
미니바이오 발효기 증식과 육류 무첨가 배지에서 배양한 이들 균주의 다당류 발현 및 수율 비교를 검증하기 위해 실험을 계속 진행하였다.
실험은 기존 PNU 일반 배지에 1) 아톨레이트 단독 또는 2) 아톨레이트 + 피루베이트 + 철 첨가물을 첨가한 부가적인 PNU 배지의 효과를 파악하기 위해 실험을 수행하였다. 아톨레이트는 표준 카세인 가수분해물 (미국 메릴랜드 Athena Environmental Sciences, Inc. 사로부터 구입)의 성능 및 영양 특징과 일치하는 식물 단백질 가수분해물 블렌드이다.
사용 균주/바이얼: 접종용 PNU19F WSL [작업 종균 lot] 1 ml
배지 1: 일반 PNU 배지 + 0.5% 트립톤 대체제 아톨레이트 pH 7.2 (첨가물 없음).
배지 2: 일반 PNU 배지 + 0.5% 트립톤 대체제 아톨레이트 pH7.2 (+ 첨가물: 소듐 피루베이트 0.1% + Fe+ 2 0.004% + Fe+ 3 0.004%).
미니-발효기 파라미터는 배지 증식 2가지에서 동일하였다 (150rpm, pH7.2를 증식하는 동안 유지, 온도 37.5℃). 발효기에 0.15% DOC를 첨가하여 발효 배치를 종료시켰다. 약 3-6시간 동안의 결과를 표 2에 나타낸다.
| 표 2 OD 590nm에서의 판독값 |
||
| 시간 | 배지 1 | 배지 2 |
| 3h | 0.8 | 0.57 |
| 4h | 2.46 | 3.07 |
| 5h | 3.63 | 4.90 |
| 5h 45m | 4.23 | 6.13 |
| 6h 15m | 4.10 | 5.95 |
상당한 점성 및 응집 반응이 양쪽에서 관찰되었으며, 배지 2에서 더 상당하였다. (0.15%) DOC 존재 하에, 효소 완충제와 효소를 직접 첨가해 밤새 37℃에서 처리하여, 원심분리가 용이하게 진행되게 하였으며, 세포 파편을 분리하여 상층물 200 ml을 수득하였다.
프로테이나제 처리 후 100 Kd TFF 농축 단계는 기존 PNU 다운-스트림 프로토콜에 따라 수행하였다.
마지막으로, 상층물 200 ml를 75 ml로 농축하고, 이중 샘플 1 ml을 QC 분석하였다. 다당류, 단백질 및 핵산 함량을 각 배지에서 결정하였다. 그 결과는 표 3에 나타낸다.
| 표 3 PS QC 결과 원 데이터 |
||
| 결과 | 배지 1 | 배지 2 |
| 다당류 | 1284.4 ㎍/ml 또는 482 mg/L | 2720.0 ㎍/ml 또는 1.02 g/L |
| 단백질 함량 | 2.9% | 2.9% |
| 핵산 함량 | 0.05% | 0.05% |
당해 기술 분야의 당업자라면 본 발명에 대한 다른 구현예들 및 용도가 본원에 기술된 본 발명의 설명과 실시를 고려해 자명할 것이다. 본원에 인용된 모든 참조문헌들은, 모든 간행물, 미국 및 외국 특허 및 특허 출원을 비롯하여, 원용에 의해 구체적이고 전체적으로 본 명세서에 포함된다. 본 설명과 실시예는 단순 예로 간주되며, 본 발명의 진정한 범위 및 사상은 첨부된 청구항에 의해 정해지는 것으로 의도된다. 또한, 용어 "포함하는"은 용어"로 구성되는" 및 "로 필수적으로 구성되는"를 포함한다.
Claims (25)
- 하나 이상의 염; 마그네슘 염; 칼슘 염; 소이 밀 (soy meal); 당류; 2종 이상의 아미노산; 효모 추출물; 철(II) 염 또는 철(I) 염; 및 피루베이트를 포함하며, 동물성 생산물을 함유하지 않는,
스트렙토코커스 종 균주의 성장 및 증식용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 하나 이상의 염이 염화나트륨을 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 마그네슘 염이 염화마그네슘 또는 황산마그네슘을 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 칼슘 염이 염화칼슘 또는 황산칼슘을 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 소이 밀이 소이 밀의 효소 가수분해물을 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 2종 이상의 아미노산이 시스테인 및 티아민을 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 당류가 글루코스를 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 철(II) 염 또는 철(I) 염이 황산철(II) 또는 구연산 철을 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서,
수용액 또는 건조 분말인, 조성물. - 제9항에 있어서,
상기 수용액이 하나 이상의 염 1-5 g/L; 마그네슘 염 0.1-2.0 g/L; 칼슘 염 0.001-0.1 g/L; 소이 밀 2-10 g/L; 당류 5-20 g/L; 2종 이상의 아미노산 0.001-0.1 g/L; 효모 추출물 1-10 g/L; 철(II) 염 또는 철(I) 염 0.0001-0.001 w/v%; 및 피루베이트 0.01-1.0 w/v%를 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서,
제외되는 상기 동물성 생산물이 포유류로부터 수득되거나 유래되는 것인, 조성물. - 제1항에 있어서,
제외되는 상기 동물성 생산물이 포유류로부터 수득되거나 유래되고, 소 태아 혈청, 소 혈청, 염소 혈청, 및 말 혈청 중 하나 이상인, 조성물. - 미생물로서 스트렙토코커스 종 균주의 배양 방법으로서,
미생물 샘플을 수득하는 단계; 및
상기 미생물을 제1항의 조성물을 포함하는 배지와 접촉시키는 단계
를 포함하는, 배양 방법. - 제13항에 있어서,
상기 미생물이 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)를 포함하는, 방법. - 하나 이상의 염; 소이 밀; 당류; 효모 추출물; 식물 단백질 가수분해물, 철(II) 염 또는 철(I) 염; 및 피루베이트를 포함하며, 동물성 생산물을 함유하지 않는,
스트렙토코커스 종 균주의 성장 및 증식용 조성물. - 제15항에 있어서,
상기 하나 이상의 염이 염화나트륨을 포함하는, 조성물. - 제15항에 있어서,
상기 소이 밀이 소이 밀의 효소적 가수분해물을 포함하는, 조성물. - 제15항에 있어서,
상기 당류가 글루코스를 포함하는, 조성물. - 제15항에 있어서,
상기 효모 추출물이 식물성 효모 추출물 (vegetable yeast extract)을 포함하는, 조성물. - 제15항에 있어서,
상기 식물 단백질 가수분해물이 표준 카세인 가수분해물을 포함하는 식물 단백질 가수분해물 블렌드를 포함하는, 조성물. - 제15항에 있어서,
상기 철(II) 염 또는 철(I) 염이 황산철(II) 또는 구연산 철을 포함하는, 조성물. - 제15항에 있어서,
수용액 또는 건조 분말인, 조성물. - 제17항에 있어서,
상기 소이 밀의 효소적 가수분해물의 농도가 0.5-10 w/v%이고, 상기 다당류의 농도가 0.5-5 w/v%이고, 상기 식물성 효모 추출물의 농도가 0.1-10 w/v%이고, 상기 식물 단백질 가수분해물의 농도가 1-10 w/v%이고, 상기 철(II) 염 또는 철(I) 염의 농도가 0.001-0.01 w/v%이고, 상기 피루베이트의 농도가 0.01-1.0 w/v%인, 조성물. - 미생물로서 스트렙토코커스 종 균주의 배양 방법으로서,
미생물 샘플을 수득하는 단계; 및
상기 미생물을 제15항의 조성물을 포함하는 배지와 접촉시키는 단계
를 포함하는, 배양 방법. - 제24항에 있어서,
상기 미생물이 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)를 포함하는, 방법.
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| US20180274004A1 (en) * | 2014-05-09 | 2018-09-27 | Institute For Environmental Health, Inc. | Recombinant phage and methods of detecting listeria |
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