KR102599010B1 - 항-herv-k 엔벨로프 항체 및 그 용도 - Google Patents

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조셉 페리 스타이너
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Abstract

본 발명은 글리코실화 또는 자연적 입체구조에 의해 영향을 받지 않는 보존 영역을 표적화하는 HERV-K 엔벨로프에 대한 신규한 항체, 및 진단 및/또는 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다.

Description

항-HERV-K 엔벨로프 항체 및 그 용도
본 발명은 글리코실화(glycosylation) 또는 자연적 입체구조(native conformation)에 의해 영향을 받지 않는 보존 영역을 표적화하는 HERV-K 엔벨로프(envelope)에 대한 신규한 항체, 및 진단 및/또는 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다.
근위축성 측삭 경화증 (ALS) 질환은 프랑스 신경학자 Jean-Martin Charcot에 의해 처음 설명되었고, 그 이름은 피질척수 운동 뉴런의 하향 축색돌기가 측삭 척수에서 바뀐 구조를 보이는 피질척수 운동 뉴런의 퇴화 (측삭 경화증) 및 근육 소모와 관련된 2차 탈신경(denervation)을 보이는 척추 운동 뉴런의 소멸 (근위축증)을 모두 반영한다 (Taylor, Brown, 및 Cleveland 2016). 실제로, ALS는 수의 운동의 계획, 통제 및 실행과 관련되는 대뇌 운동 피질, 뇌간 및 척수의 운동 뉴런 퇴행으로 인한 점진적이고 궁극적으로 치명적인 신경 퇴행성 질환이다. 치명적인 결과는 통상적으로 진단 3 내지 5년 후에 발생한다 (Taylor, Brown, 및 Cleveland 2016). ALS의 유병률(prevalence)은 약 100,000건 중에 5 사례에 달하는데, 이는 이 질환의 급속한 치사율을 반영한다 (Taylor, Brown, 및 Cleveland 2016). ALS 사례의 약 10%는 특정 게놈(genome) 돌연변이와 관련하여, 가족 (유전적 ALS)에서 유전적으로 전해지는 것으로 보인다. 예를 들어, 가족성 ALS의 약 20%는 초과산화물 불균등화효소 (sod1) 유전자의 돌연변이와 관련이 있다 (Vucic 및 Kiernan 2009; Rosen 1993). 다른 비-가족성 사례들은 산발적 ALS (ALS 사례의 90%)로 분류되고 (Lagier-Tourenne 및 Cleveland 2009), 이는 가족력이 없이 발생하는 것을 의미한다.
파킨슨병, 헌팅턴병, 알츠하이머 질환, 전측두엽 퇴행 (FTLD)과 ALS와 같은 신경 퇴행성 장애는 중추신경계에서 뉴런과 신경교세포의 내부 및 외부 모두에서 미스폴드 단백질(misfolded protein)이 축적되는 것과 관련이 있다 (Polymenidou 및 Cleveland 2011). 이러한 미스폴드 단백질 응집체는 각 질환의 병리학적 특징이며, 개시 사건 이후 프리온-유사 메커니즘을 통해서 세포에서 세포로 퍼질 수 있다. 한 가지 널리 알려진 견해는, 독성 특징을 얻을 수 있는 내인성 단백질의 미스폴드 버전을 갖는, 이러한 응집체가 잠재적으로 응집체 내의 필수 세포 성분의 증가된 소수성 및/또는 격리, 산화 종의 생성, 프로테아좀 억제 및 다른 경로를 통해서 질환의 개시 및 진행에 중요한 역할을 한다는 것이다. 다른 견해는 큰 응집체가 독성 형태를 나타내지 않지만, 대부분의 기술에 의해 검출되지 않는 독성이 더 강한 올리고머 종(oligomeric species)으로부터 세포를 보호하기 위한 방어 세포 반응의 최종 산물이라는 것이다 (Polymenidou 및 Cleveland 2011).
ALS 환자의 혈청 시료에 대한 연구는, 외인성 바이러스인 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 또는 인간 T 세포 백혈병 바이러스 (HTLV)에 대해 혈청 음성이었지만, 이러한 HIV-감염 환자와 비교할 수 있는 수준을 가진 ALS 시료의 50 내지 60%에서 역전사 효소 (RT) 활성을 보였다 (MacGowan 등. 2007; McCormick 등. 2008; Andrews 등. 2000; Steele 등. 2005). 이는 뮤린(murine)과 인간의 레트로바이러스 모두 ALS-유사 증후군을 일으킬 수 있다는 인식 이후 몇 년 동안 레트로바이러스의 관련성이 의심된 사실과 일치한다 (McCormick 등. 2008). HIV-양성 환자의 ALS-유사 장애는 항레트로바이러스 요법으로 완화될 수 있다 (Moulignier 등. 2001; von Giesen 등. 2002). 이것은 HIV-감염 환자의 ALS 증상학에 유효하고 그럼에도 불구하고 ALS 사례의 독특한 하위-범주를 나타낼 수 있다.
ALS 환자의 직계가족의 혈청에서도 증가된 RT 활성이 발견되었는데, 이는 RT 활성이 인간 내인성 레트로바이러스 (HERVs) 중에서 유전된 활성 카피들로부터 유래할 수 있다는 추측으로 이어지며, 이는 우리 게놈의 8%를 나타낸다 (Steele 등. 2005).
ALS에서와 같이 RT 활성 검출은 이 효소의 기원을 밝히진 못했지만, 그럼에도 불구하고, 사-후 뇌에서 HERV-K의 관련성이 밝혀졌다 (Douville 등. 2011). 염기서열 분석 결과, 7q34와 7q361 염색체 위치(loci) (HERV-K의 서브패밀리인 HML-2 및 HML-3에 각각 해당)가 대조군에 비해 ALS 환자에서 더 자주 발현된다는 것이 밝혀졌다 (Douville 및 Nath 2014). 또한, HERV-K gag- pol 및 엔벨로프 RNA 모두 대조군에 비해 ALS 환자의 뇌에서 현저하게 증가된 발현을 보였다 (Li 등. 2015).
인간 뉴런 배양에서 HERV-K의 발현은, 전체 HERV-K 게놈 또는 HERV-K-엔벨로프 유전자 단독으로 형질주입(transfection) 후에 용량 의존적 방식으로 신경돌기 수축(retraction) 및 뉴런 수의 감소에 의해 관찰되는 것과 같은, 뉴런 세포독성을 야기한다. 이는 세포내 HERV-K-엔벨로프 단백질이 신경독성에 기여할 수 있음을 시사한다. 이것은 CRISP/casp9 분석에 의해 확인되었는데 이는VP64 전사 인자에 의한 LTR 활성화를 통해 HERV-K의 발현이 2배(twofold)로 증가되는 것을 허용한다 (Li 등. 2015). HERV-K 발현은 마이크로글리아(microglia)에 대한 이온화된 칼슘-결합 어댑터 분자 1 (Iba-1) 마커로 측정된 면역 반응성과 무관한 대뇌피질 뉴런에서 HERV-K-엔벨로프 유전자를 발현하는 유전자 이식(transgenic) 마우스 in vivo에서의 운동 피질 체적(volume)의 손실을 일으킨다 (Li 등. 2015). 행동 분석으로 HERV-K-엔벨로프 유전자 이식 마우스는 단거리를 이동하고, 더 긴 기간동안 쉬며 그리고 뒷다리의 찰과상이 증가된 경직의 증거를 보여주는 로타로드 성능 시험(rotarod performance test)에서 더 빨리 떨어졌다. 이러한 운동 기능장애 외에도, 유전자 이식 마우스는 호흡을 위한 사지와 척추 근육의 엄청난 약점이 발달되어 10개월까지 50%의 사망률을 낳았다 (Li 등. 2015).
흥미롭게도, HERV-K RT 발현은 ALS 환자의 뉴런에서 TDP-43 수치가 증가한 것과 관련이 있으며, 이는 RT 발현이 질환의 다른 비정상적인 세포 과정의 특징과 함께 발생한다는 것을 시사한다 (Buratti 및 Baralle 2009; Geser 등. 2009; Douville 등. 2011). ALS에서 이러한 프리온-유사 메커니즘에 대한 증거는 현재 주요 미스폴드 단백질인, SOD1과 TDP-43을 수반한다 (Polymenidou 및 Cleveland 2011). 최근 Li 및 그외 사람들은 TDP-43이 인간 뉴런에서 HERV-K-엔벨로프 발현을 활성화 시킬 수 있음을 증명하였는데, 이는 TDP-43이 HERV-K 긴 말단 반복 (LRT) 영역인 726-CCCTCTCCC-734에 결합할 수 있다는 관찰과 일치한다 (Li 등. 2015). 또한 내인성 TDP-43 침묵(silencing)이 HERV-K 발현을 감소시키는 것을 보여주었다. 이러한 결과는 in vitro에서 정상 TDP-43이 인간 성상세포(astrocyte)와 뉴런에서 HERV-K 전사에 영향을 미치지 않는 반면, TDP-43이 HERV-K 프로모터의 U5 영역에서 결합 부위를 가지고 있다는 것을 보여줌으로써 최근에 보완되었다. 후자의 결합은 염증, 예를 들어, 종양 괴사 인자 (TNFα)가 있거나, 또는 프로테아좀의 억제로 증가된다 (Manghera, Ferguson-Parry, 및 Douville 2016). 흥미롭게도, 같은 연구에서 TDP-43의 과발현은 야생-형 (정상) TDP-43이 그렇지 않을 때, HERV-K 바이러스 단백질 발현과 축적을 증가시켰다. 또한, ALS 대뇌피질 뉴런에서 스트레스 과립과 자가포식 반응이 증가된 증거에도 불구하고, 이들 세포는 과도한 HERV-K 단백질 축적을 제거하지 못했다. 통상적으로 대부분의 레트로바이러스 억제 인자들은, TDP-43 프로모터가 인터페론 조절 인자 (IRF1, IRF3)와 핵 인자-카파 B (NFκB)에 대한 결합 부위를 포함하고 있기 때문에 인터페론- 및 염증-관련 전사 인자에 반응할 가능성이 높다 (Douville 등. 2011).
종합하면, 이러한 결과들은 내인성 레트로바이러스 요소 및 HERV-K가 ALS의 병태생리에 수반되고, TDP43과 이 단백질병증(proteinopathy) 사이에 결여된 연결고리일 수 있음을 시사한다 (Alfahad 및 Nath 2013). 따라서 ALS 환자의 뉴런 내에서 HERV-K 엔벨로프 단백질 발현은 신경 퇴행 및 질환 병인에 기여할 수 있다.
현재까지, 증상의 치료로서, 라일루졸(riluzole)이 비교적 효과적인 약물로 남아 있으나 환자의 평균 생존기간을 3 내지 6개월까지 연장할 뿐이다 (Hardiman, van den Berg, 및 Kiernan 2011). 현재의 치료 프로토콜은 다분야통합 설정(multidisciplinary setting)에서 제공되는 증상 관리 및 삶의 질 보존에 기반을 두고 있다. 효율적인 치료법의 발견은 이 급속하게 치명적인 질환을 가진 환자들에게 여전히 중요한 필요성으로 남아 있다 (Hardiman, van den Berg, 및 Kiernan 2011).
따라서, ALS를 치료하기 위한 효과적인 치료제에 대해 충족되지 않은 필요성이 남아있다.
본 발명은 글리코실화 또는 자연적 입체구조에 의해 영향을 받지 않는 보존된 영역을 표적화 하는 HERV-K 엔벨로프에 대한 신규한 항체, 및 진단 및/또는 치료에서의 그의 용도를 제공한다.
발명자들은 예기치 않은 특성을 나타내는 HERV-K 엔벨로프 단백질에 대한 새로운 항체를 개발했다.
발명자들은 본 발명에 따른 항체인, GN_mAb_Env_K01이, HERV-K-엔벨로프 단백질 표면의 SLDKHKHKKLQSFYP (서열번호: 9) 선형 에피토프에 선택적으로 결합하는 뮤린 단일클론 항체 (mAb)임을 도시하였다. GN_mAb_Env_K01은 IgG2b/kappa 뮤린 서브클래스 (subclass)의 전체-길이 항체이다. GN_mAb_Env_K01의 생물학적 활성은 ELISA와 웨스턴 블롯팅(western blotting) 면역분석에서 확인되었다. 놀랍게도 상업적 항-HERV-K-엔벨로프 항체는 글리코실화 구조를 검출하는데 실패한 반면, GN_mAb_Env_K01은 자연적 및 변성된 HERV-K-엔벨로프 단백질뿐만 아니라 비-글리코실화 및 글리코실화 구조를 모두 인식하였다.
더욱이 매우 예기치 않게, 표적 에피토프는 데이터베이스에 기재된 HERV-K 엔벨로프 유전자에서 안정한 아미노산 서열로 매우 보존된 것으로 보였다. 이것은 HERV-K 카피가 엔벨로프 단백질의 병원성 발현에 수반되어 있더라도, 이 항체에 독특한 위치(positioning)를 부여하는 것이다. 이러한 예기치 않은 결과는 GN_mAb_Env_K01이 HERV-K 엔벨로프 단백질을 표적으로하는 최초의 도구라는 것을 나타낸다. 또한 그것은 그러한 단일클론 항체를 선택하고 얻는 것이 면역의 주어진 프로토콜에 의해 숙련된 사람들에게도 예견되거나 예측될 수 없다는 것을 보여준다.
따라서, 본 발명은 에피토프 SLDKHKHKKLQSFYP (서열번호: 9)에 결합하는 HERV-K 엔벨로프 단백질을 인식하는 항체에 관한 것이다.
또한 본 발명은 치료에 사용하기 위해 상기 항체가 에피토프 SLDKHKHKKLQSFYP (서열번호: 9)에 결합하는 HERV-K 엔벨로프 단백질을 인식하기 위한 항체에 관한 것이다.
또한 본 발명은 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 바람직하게는 산발적 ALS를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 에피토프 SLDKHKHKKLQSFYP (서열번호: 9)에 결합하는 HERV-K 엔벨로프 단백질을 인식하는 항체에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 항체 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 생물학적 시료와 상기 정의된 항-HERV-K 엔벨로프 항체를 접촉시키는 단계를 포함하는 생물학적 시료에서 HERV-K 엔벨로프 단백질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 또한 본 발명은 상기 환자로부터 획득한 생물학적 시료를 상기 정의된 항-HERV-K 엔벨로프 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 환자에서 ALS, 특히 산발적 ALS를 진단하는 방법에 관한 것이다.
도 1: 카파 경쇄를 가지고 있는 뮤린 항체인 GN_mAb_Env_K01.
항-뮤린 면역 글로불린에 의해 포획된 GN_mAb_Env_K01 하이브리도마 (단일클론 스테이지)의 1:10으로 희석된 상등액으로 아이소타이핑이 ELISA에 의해 수행되었다. 다양한 항-마우스 경쇄 (A) 또는 중쇄 (B) 항체를 이용한 검출은 GN_mAb_ENV_K01이 IgG2b/카파 뮤린 항체임을 보여주었다. 결과는 중복값 ± SD의 OD450nm 평균으로 플롯되었다.
도 2: GN_mAb_Env_K01 경쇄 및 중쇄 서열.
하이브리도마 세포에서 RNA를 추출하여 PCR에 의해 증폭된 cDNA로 역전사한 후, 뮤린 항체 중쇄 (A) 및 경쇄 (B)를 인코딩하는 cDNA를 표적으로 하는 프라이머로 염기서열을 분석하였다. (A) 카파 경쇄에서 CDR1 (굵은), CDR2 (밑줄) 및 CDR3 (굵은 이텔릭체) 서열; (B) 중쇄에서 CDR4 (굵은), CDR5 (밑줄) 및 CDR6 (굵은 이텔릭체) 서열; 일정한 뮤린 IgG2 서열 (회색 이탤릭체).
도 3: HERV-K-엔벨로프 SLDKHKHKKLQSFYP 에피토프에 결합하는 GN_mAb_Env_K01.
HERV-K-엔벨로프 (MyBiosource) (오른쪽)로부터 각 펩타이드의 강도 프로파일 (왼쪽)이 나열된다. 이 15개의 아미노산과 1개의 잔기의 오프셋을 갖는 펩타이드들은 GN_mAb_Env_K01이 선형 SLDKHKHKKLQSFYP (서열번호: 9) 에피토프에 결합함을 보여주었다. 결과는 표준 96-웰 플레이트 ELISA-측정기와 유사한 CCD 카메라에서 얻은 신호 강도 (mAU)로 표시되었다.
도 4: ELISA에서 GN_mAb_ENV_K01에 의해 검출되는 글리코실화HERV-K 엔벨로프.
AMSBIO (B) (1μg/ml)의 GN_mAb_Env_K01 (A) 또는 항-HERV-K-엔벨로프는 다양한 희석 (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400)으로 HEK 세포 용해물에서 ELISA의 주요 항체로 사용되었다. 항-HERV-K-엔벨로프 (AMSBio)와 달리 GN_mAb_Env_K01는 글리코실화 HERV-K-엔벨로프를 인식했다. 결과는 중복값 ± SD의 OD450nm 평균으로 플롯되었다.
도 5: ELISA에서 GN_mAb_ENV_K01에 의해 검출되는 비-글리코실화 HERV-K-엔벨로프.
대장균으로부터 1μg/ml의 his-SUMO-HERV-K-엔벨로프 재조합 단백질에서 AMSBIO (1μg/ml)의 GN_mAb_Env_K01 또는 항-HERV-K-엔벨로프를 ELISA의 1차 항체로 사용하였다. 모든 항-HERV-K-엔벨로프 모두 비-글리코실화 HERV-K-엔벨로프 단백질을 인식하였다. 결과는 중복값 ± SD의 OD450nm 평균으로 플롯되었다.
도 6: GN_mAB_ENV_K01을 이용한 웨스턴 블롯팅에 의한 HERV-K 엔벨로프 검출.
AMSBIO (웰 #1 및 2)의 항-HERV-K-엔벨로프 (1μg/ml) 또는 GN_mAb_Env_K01 하이브리도마 (웰 # 3 및 4)의 희석된 (1:5) 상등액을 웨스턴 블롯팅에서 1차 항체로 사용하였다. his-SUMO로 태그된 HERV-K-엔벨로프의 02μg를 웰 # 1 및 3에 침전시키고 HERV-K-엔벨로프가 형질주입된 HEK 세포로부터의 단백질 추출물 245μg을 웰 # 2 및 4에 침전시켰다. 비-글리코실화 his-SUMO로 태그된 HERV-K-엔벨로프는 높은 MW의 다량체와 낮은 MW의 절단된 단편과 함께 모든 항체에 의해 75kDa에서 검출되었다. 글리코실화 HERV-K-엔벨로프 (90kDa)는 GN_mAb_Env_K01으로만 검출되었다.
MW: 분자량.
도 7: GN_mAb_Env_K01 (GN K01) 항체는 세포외 HERV-K 엔벨로프 단백질에 의해 유도된 세포독성으로부터 인간 뉴런 세포를 특이적으로 보호한다: 세포 생존 분석.
뉴런 배양물은 분화 배지 (실시예 2 참조)와 IgG 시료 GN K01 또는 3 ug / mL의 최종 농도에서 대조군 비-면역 IgG (Thermo Product #MA 1-10418)로 처리했다. 전-배양 60 분 후에, 재조합 HERV-K 엔벨로프 단백질 (My BioSource, 아미노산 90-632, Cat # MBS1391552)을 100 nM의 최종 농도에 첨가하였다. GN K01 Ig의 하나의 시료는 HERV-K 엔벨로프와 30분 동안 전-배양한 다음, 인간 뉴런에 함께 첨가하였다. 뉴런 배양물은 GE INCell Analyzer 2000 BioImager를 이용하여 관찰되었으며, 각 웰 (웰당 4개의 이미지)의 영상을 다양한 시점에서 획득하였다. GE Investigator 고함량 영상 소프트웨어를 이용하여 뉴런의 수가 측정되었다. 히스토그램 바 위에 화살표가 GN_mAb_Env_K01 (GN K01) 항체에 대한 결과를 보여주고 있다.
도 8: GN_mAb_Env_K01 (GN K01) 항체는 세포외 HERV-K 엔벨로프 단백질에 의해 유도된 세포독성으로부터 인간 뉴런 세포를 특이적으로 보호한다: 신경돌기 길이.
뉴런 배양물은 분화 배지 (상기 기재된)와 IgG 시료 GN K01 또는 3 ug/mL의 최종농도에서 비-면역 IgG (Thermo Product #MA 1-10418)로 처리했다. 전-배양 60분 후에, 재조합 HERV-K 엔벨로프 단백질 (My BioSource, 아미노산 90-632, Cat # MBS1391552)을 100nM의 최종 농도에 첨가하였다. 뉴런 배양물은 GE INCell Analyzer 2000 BioImager를 이용하여 관찰하였으며, 각 웰 (웰당 4개의 이미지)의 영상을 다양한 시점에서 획득하였다. GE Investigator 고함량 영상 소프트웨어를 이용하여 평균 신경섬유 길이가 결정되었다.
도 9: GN_mAb_Env_K01 (GN K01) 항체는 세포외 HERV-K 엔벨로프 단백질에 의해 유도된 세포독성으로부터 인간 뉴런 세포를 특이적으로 보호한다: 뉴런 글로벌 전기생리학적 활성.
웰에서 스파이크 비율이 증가되어 나타난, 전기생리학적 활성은, in vitro에서 21일까지 현저하게 증가되었고 모든 웰에서 하루에 5분 동안 자발적 전기 활성을 기록함으로써 모니터링되었다. 이 시점에서, 인간 뉴런 배양물은 분화 배지 (상기 기재된)와 GN K01 또는 대조군 비-면역 IgG (Thermo Product #MA 1-10418)를 3 ug/mL의 최종 농도로 처리하였다. 전-배양 60분 후에, 재조합 HERV-K 엔벨로프 단백질 (My BioSource)은 100nM의 최종 농도로 첨가되었다. 후 처리 24시간 초반부터, 매일 자발적 전기 활성이 기록되었다. HERV-K 엔벨로프 노출 후 24시간 째에 처리 그룹에 대하여 평균 연소율을 측정하였다. 히스토그램 바 위에 화살표가 GN_mAb_Env_K01 (GN K01) 항체로 결과를 보여주고 있다.
정의
본 발명에서 사용되는 용어 "치료(treating or treatment)"는, 이 용어가 적용되는 장애나 상태의 진행을 역행시키거나, 완화시키거나, 억제하거나 또는 이를 예방하거나, 이 용어가 적용되는 장애나 상태의 하나 또는 그 이상의 증상을 역행시키거나, 완화시키거나, 억제하거나 또는 이를 예방하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는, "예방"이란 용어는 임상적 진단을 허용할 수 있는 임상적 증상들, 전형적 병변들 또는 생리학적 기능장애가 아직 발생하지 않은 한 개체에서 상기 질환이나 상태의 발생을 예방하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는, 용어 "항체" 또는 "면역글로불린"은 동일한 의미를 가지며, 본 발명 내에서 동일하게 사용된다. 본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역 활성 부분, 즉, 항원에 특이하게 결합하는 항원 결합 자리를 포함하는 분자를 의미한다. 이런 점에서, 상기 용어 "항체"는 전체 항체 분자들 뿐만 아니라 항체 단편들 및 이들의 유도체들도 포함한다.
본 발명에서 사용되는, "항체의 단편"이란 표현은 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3)과 같은 초가변 영역을 모방하는 항체의 한 부분을 의미한다. 본 발명에 따른 항체 단편은 상기 항체의 결합 친화성 및 특이성을 보유한다. 상기 단편들은 상기 항체의 기능성 등가물이며 상기 항체와 실질적으로 동일한 항원 결정 부위(epitope)에 결합한다. 항체 단편의 예로서 중쇄, 경쇄, VL, VH, Fv, Fab, Fab', F(ab)2, 및 F(ab')2를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 사용되는, "항체 유도체"란 표현은 본 발명의 상기 항체의 한 단편, 바람직하기로는 상기 항체의 적어도 하나의 CDR, 바람직하게는 적어도 하나의 CDR3을 포함하는 상기 항체, 자연적 서열 (예. 다른 종 (species)의 링커 서열.)과 다른 적어도 하나의 서열에 융합된 상기 항체를 의미하며, 상기 유도체는 본 발명의 항체에 비교할 만한 결합 친화성 및 HERV-K 엔벨로프에 대한 특이성을 가진다. 본 발명에 따른 상기 유도체들은 상기 항체에 결합 친화성 및 특이성을 보유한다. 상기 유도체들은 상기 항체의 기능 적 등가물들이며 이들은 상기 항체와 실질적으로 동일한 항원결정부위에 결합한다. 항체 유도체의 예로서 scFv, (scFv)2 및 디아바디(diabody)를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
자연적 항체에 있어서, 두 개의 중쇄 (HC)는 각각 이황화 결합에 의해 연결되며, 각 중쇄는 이황화 결합에 의해 경쇄 (LC)에 연결된다. 경쇄의 종류에는 람다(lambda (l))와 카파(kappa (k))의 두 가지가 있다. 항체 분자의 기능적 활성을 결정하는 것에는 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE의 다섯 가지 주요한 중쇄 클래스 (또는 아이소타입(isotypes))가 있다. 각 쇄(chain)는 명백히 구별되는 서열 도메인을 포함한다.
통상적으로, 경쇄는 하나의 가변 도메인 (VL) 및 하나의 불변 도메인 (CL)인 2개의 도메인을 갖는다. 중쇄는, 하나의 가변 도메인 (VH) 및 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3, CH으로 통침됨)인 4개의 도메인을 포함한다. 경쇄 가변 도메인 (VL)과 중쇄 가변 도메인 (VH)은 모두 항원 에피토프에 특이적 결합 부위를 결정한다. 경쇄 불변 영역 도메인 (CL)과 중쇄 불면 영역 도메인 (CH)은 항체 사슬 결합, 분비, 태반-경유 운동, 보체 결합, 및 Fc 수용체 (FcR)에 결합하는 것과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다. Fv 단편은 면역글로불린의 Fab 단편의 N-말단 부분이며 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 가변 부분으로 이루어져 있다. 항체의 특이성은 항원성 에피토프와 항체 결합 부위 사이의 구조적 상보성에 있다. 항체 결합 부위들은 주로 초가변(hypervariable) 영역 또는 상보성 결정 영역 (complementarity determining regions, CDRs)으로부터의 잔기들로 구성된다. 간혹, 비-초가변 또는 골조 영역으로부터의 잔기들은 전체 도메인 구조이고 결과적으로 결합 부위에 영향을 미친다. 상보성 결정 영역 또는 CDRs는 함께 자연적 면역글로불린 결합 부위에 대한 자연적 Fv 영역의 결합 친화력 및 특이성을 정의하는 아미노산 서열들이다. 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄는 각각 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 및 H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3으로 지정된 3개의 CDR을 가진다. 따라서, 항원-결합 부위는, 중쇄 및 경쇄 V 영역으로부터 CDR 세트를 포함하는 3개의 CDRs를 갖는다. 골조 영역 (framework regions, FRs)은 CDRs 사이에 위치한 아미노산 서열들을 의미한다.
본 발명에서 사용되는, 용어 "키메라 항체(chimeric antibody)"는 임의의 종(species), 바람직하게는 마우스 항체의 하나의 VH 도메인 및 하나의 VL 도메인, 및 인간 항체의 CH 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 항체를 의미한다.
본 발명에 따른, 용어 "인간화된 항체(humanized antibody)"는 인간 항체로부터의 가변 영역 골조 및 불변 영역들을 갖는 항체를 의미하나, 임의의 종, 바람직하게는 마우스 항체의 CDRs을 보유하는 것을 의미한다.
용어 "Fab"은 약 50,000의 분자량을 갖는 항체 단편 및 항원 결합 활성을 나타내며, 여기서 IgG를 단백질 분해 효소(protease)인, 파파인(papaine)으로 처리하여 얻은 단편들 중에서, H 사슬의 N-말단 사이드와 전체 L 사슬의 약 절반이 이황화 결합에 의해 함께 결합된다.
본 발명에 따른, 용어 "F(ab')2"는 100,000의 분자량 및 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 의미하며, IgG를 단백질 분해 효소인, 펩신(pepsin)으로 처리하여 얻은 단편들 중에서, 이황화 결합으로 결합된 힌지(hinge) 영역의 Fab보다 약간 더 크다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "Fab'"는 약 50,000의 분자량 및 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 의미하며, F(ab')2의 힌지 영역의 이황화 결합을 절단함으로써 얻어 진다.
"단일 사슬 Fv" 또는 "scFv"라는 표현은, 공유 결합으로 연결된 VH::VL 헤테로다이머(heterodimer)인 폴리펩타이드를 말하고; 대개 펩타이드-인코딩 링커(peptide-encoding linker)에 의해 연결된 VH 및 VL를 인코딩하는 유전자들을 포함하는 유전자 융합으로부터 발현된다. "dsFv"는 이황화 결합에 의해 안정화된 VH::VL 헤테로다이머이다. 2가(divalent) 및 다가(multivalent) 항체 단편들은 1가(monovalent) scFv와 자발적 연계(spontaneous association)를 통해 형성되거나, 또는 2가 sc(Fv)2와 같은 펩타이드 링커에 의해 1가 scFv를 커플링함으로써 발생될 수 있다.
용어 "디아바디(diabodies)"는 2개의 항원-결합 부위를 가지는 작은 항체 단편들을 의미하며, 이들 단편들은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL)에 있는 하나의 경-쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중-쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 사슬에 있는 두 도메인 사이의 페어링(pairing)을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 이용함으로써, 도메인들은 다른 사슬의 상보적 도메인과 페어링을 하게 되어 2개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다.
본 발명에서 사용되는, 표현 "본 발명의 항체"는 유도되는 항체, 즉, HERV-K 엔벨로프 단백질 (HERV-K Env)에 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게는 유형-K 인간 내인성 레트로바이러스 패밀리 (HERV-K) 엔벨로프 단백질에, 더욱 바람직하게는 서열번호: 9로 표시되는 에피토프에 결합하는 것인, 항체를 의미한다.
본 발명에서 사용되는, 용어 "생물학적 시료"는 in vitro에서 평가의 목적으로 수득하는 임의의 생물학적 시료를 의미한다. 본 발명에서, 시료 또는 환자 시료는 임의의 체액 또는 질환-특이적 조직 및 생체검사와 같은 병변을 포함할 수 있다. 체액의 예로서는 혈액, 혈청, 혈장, 유두유출액, 소변, 타액, 윤활액 및 뇌척수액 (CSF)을 들 수 있다.
통상적으로 본 발명의 항체는 HERV_K 엔벨로프 단백질에 뉴런이 노출된 것에 의해 유도된 세포 독성으로부터 인간 뉴런을 보호한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 항체는 바람직하게, 다음의 기능적 특성 중 하나 또는 그 이상을 나타낸다:
- HERV_K 엔벨로프 단백질에 노출된 뉴런의 뉴런 기능 활성을 보존하는 것;
- HERV_K 엔벨로프 단백질에 노출된 뉴런의 세포 생존 능력을 보존하는 것; 및/또는
- HERV_K 엔벨로프 단백질에 노출된 뉴런의 뉴런 형태를 보존하는 것.
본 발명의 실시예 2에서 설명된 바와 같이 세포외 HERV-K 엔벨로프 세포 독성에 대한 뉴런 기능 활성에 미치는 본 발명에 따른 항체의 보호 효과는 in vitro에서 평가될 수 있다. 특히, 이러한 효과는 재조합 HERV-K 엔벨로프 단백질로 처리한 후, in vitro에서 인간 뉴런의 자발적 전기생리학적 활성을 기록함으로써 평가될 수 있다. 따라서, 상기 재조합 HERV-K 엔벨로프 단백질로 비-처리된 인간 뉴런과 비교할 때, 통상적으로 본 발명의 항체로 치료하는 것은 재조합 HERV-K 엔벨로프 단백질에 노출된 인간 뉴런의 자발적 활성을, 적어도 50%, 특히 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%까지 회복시킨다.
일 구현예에 있어서, 예를 들어 실시예 2에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 항체의 보호 효과는 재조합 HERV-K 엔벨로프 단백질로 치료된 후 뉴런 배양 생존율을 분석함으로써 선택적으로 또는 추가적으로 in vitro에서 평가될 수 있다. 이러한 실시예에서 통상적으로, 본 발명의 상기 항체로 비-처리된 인간 뉴런의 생존율을 비교할 때, 본 발명의 항체로 치료하는 것은 재조합 HERV-K 엔벨로프 단백질과 전-배양된 인간 뉴런의 생존율을 적어도 20%까지 증가시킨다.
일 구현예에 있어서, 예를 들어 실시예 2에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 항체의 보호 효과는 재조합 HERV-K 엔벨로프 단백질로 치료된 후 배양된 인간 뉴런의 뉴런 형태 (예를 들어 신경돌기 길이와 같은)를 추정함으로써, 선택적으로 또는 추가적으로 in vitro에서 평가될 수 있다. 이러한 실시예에서 통상적으로, 본 발명의 상기 항체로 비-처리된 인간 뉴런의 생존율을 비교할 때 본 발명의 항체로 치료하는 것은 재조합 HERV-K 엔벨로프 단백질과 전-배양된 인간 뉴런의 신경돌기 길이를 적어도 20%까지 증가시킨다.
일 구현예에 있어서, 본 발명의 항체는 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5 및 서열번호: 6으로 표시되는 6개 CDR의 각각을 포함한다.
일 구현예에 있어서, 본 발명의 항체는:
- 서열번호: 1로 표시되는 CDR-L1, 서열번호: 2로 표시되는 CDR-L2 및 서열번호: 3 으로 표시되는 CDR-L3의 3개 CDR의 각각을 포함하는 가변 도메인에 있는 경쇄; 및
- 서열번호: 4로 표시되는 CDR-H1, 서열번호: 5로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호: 6으로 표시되는CDR-H3의 3개 CDR의 각각을 포함하는 가변 도메인에 있는 중쇄를 포함한다.
상기에 언급된 상보성 결정 영역 (CDRs)은 표 1에 개시되어 있다:
[표 1] 본 발명에 따른 항체의 CDR 도메인
일 구현예에 있어서, 본 발명의 항체, 단편 또는 유도체는:
- 서열번호 : 7로 표시되는 경쇄 가변 영역 (VL); 및
- 서열번호 : 8로 표시되는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다.
상기에 언급된 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 표 2에 개시되어 있다:
[표 2] 본 발명에 따른 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역
일 구현예에 있어서, 본 발명의 항체, 단편 또는 유도체는 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, 디아바디, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에 있어서, 본 발명의 항체는 단일클론 항체이다. 본 발명의 단일클론 항체는 1가, 2가, 다가, 단일특이적(monospecific), 이중특이적(bispecific) 또는 다중특이적이다. 또 다른 구현예에 있어서, HERV-K 엔벨로프에 대한 직접적인 항체는 결합 단편 또는 컨쥬게이트이다. 예를 들어, 본 발명의 항체들은 성장 억제제(growth inhibitory agent), 세포독성제(cytotoxic agent) 또는 프로드러그-활성화 효소(prodrug-activating enzyme)에 결합될 수 있다.
본 발명의 항체에 대한 또 다른 유형의 아미노산 수정은 항체의 원래 글리코실화 패턴을 변경하는데 유용할 수 있다. "변경(altering)"은 항체에서 발견되는 하나 또는 그 이상의 탄수화물 부분(moieties)을 삭제하는 것, 및/또는 항체에 존재하지 않는 하나 또는 그 이상의 글리코실화 부위를 추가하는 것을 의미한다. 항체의 글리코실화는 통상적으로 N-링크되어 있다. "N-링크된(N-linked)"이란 아스파라긴 잔기의 사이드 사슬에 탄수화물 부분이 부착되는 것을 말한다. 트리펩타이드(tripeptide) 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌은, 아스파라긴 측쇄에 탄수화물 부분을 효소적으로 부착하기 위한 인식 서열들이고, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. 따라서 하나의 폴리펩타이드에 있는 이러한 트리펩타이드 서열 중 하나는 잠재적 글리코실화 부위를 생성한다. 항체에 글리코실화 부위를 첨가하는 것은 상기-기재된 트리펩타이드 서열 (N-링크된 글리코실화 부위)을 하나 또는 그 이상 갖도록 아미노산 서열을 변경함으로써 용이하게 성취될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 단일클론 인간화된 항체며, 보다 바람직하게는 IgG4 인간화 단일클론 항체이다.
상기 인간화된 항체는 CDRs 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 인간 항체와 동일한 중쇄 불변 영역; 및 인간 항체와 동일한 경쇄 영역을 인코딩하는 유전자를 가지는 동물 세포를 위한 벡터에 삽입하고, 상기 발현 벡터를 동물세포에 도입하여 얻음으로써 제조될 수 있다. 인간화된 항체 발현 벡터는 항체의 중쇄를 인코딩하는 유전자와 항체의 경쇄를 인코딩하는 유전자가 별도의 벡터에 있는 유형이거나 또는 유전자 모두가 동일한 벡터(tandem 유형)에 있는 유형일 수 있다. 인간화된 항체 발현 벡터의 구축 용이성, 동물 세포로의 도입 용이성, 동물 세포에서의 항체의 중쇄 및 경쇄의 발현 수준 사이의 균형과 관련하여, tandem 유형의 인간화된 항체 발현 벡터가 더욱 바람직하다. tandem 유형의 인간화 항체 발현 벡터의 예로서는 pKANTEX93, pEE18, 등을 들 수 있다. 통상적 재조합 DNA 및 유전자 형질주입 기술을 바탕으로 한 인간화된 항체를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 항체는 CDR-그라프트, 베니어링(veneering) 또는 재표면화(resurfacing), 및 사슬 셔플링을 포함하는 당업계에 알려진 다양한 기술을 사용하여 인간화될 수 있다. 이러한 항체를 제조하기 위한 일반적인 재조합 DNA 기술도 알려져 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시예는 다음을 포함하는 단일클론 인간화된 항체에 관한 것이다:
- 하나의 경쇄, 여기서 가변 도메인은 서열번호: 1로 표시되는 CDR-L1, 서열번호: 2로 표시되는 CDR-L2, 및 서열번호: 3로 표시되는 CDR-L3의 3개 CDR의 각각을 포함하고; 및
- 하나의 중쇄, 여기서 가변 도메인은 서열번호: 4로 표시되는 CDR-H1, 서열번호: 5로 표시되는, CDR-H2, 및 서열번호: 6로 표시되는 CDR-H3의 3개 CDR의 각각을 포함한다.
약학 조성물
본 발명의 다른 목적은 HERV-K 엔벨로프 단백질 (HERV-K Env)에 대한 직접적인 항체의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
상기에 기재된 본 발명의 임의의 치료제는 약학적으로 허용가능한 부형제, 및 생분해성 중합체와 같은 것이 선택적으로 서방성 매트릭스와 결합되어 치료 조성물로 형성될 수 있다.
"약학적으로(pharmaceutically)"또는 "약학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)"은 포유류, 특히 인간에게, 적절히 투여될 때 부작용, 알레르기 또는 기타 다른 부적절한 반응 (untoward reaction)을 일으키지 않는 분자체(molecular entities) 및 조성물을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제는 임의의 유형의 무독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 재료 또는 제형 보조제를 말한다.
약학 조성물의 형태, 투여 경로, 투여량 및 요법은 자연적으로 치료 대상 상태, 질병의 심각성, 환자의 나이, 체중 및 성별 등에 의존한다.
본 발명의 약학 조성물은 국소(topical), 경구(oral), 비강(intranasal), 안구내(intraoptical), 정맥내(intravenous), 척수내 (직접적으로 뇌척수액에서), 근육내(intramuscular) 또는 피하(subcutaneous) 투여 등에 대해 제형화될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 특히 척수내 투여를 위해 제형화된 조성물은 이점이 있을 수 있다. 실제로, 척수내 투여 모드는 마우스 항체와 같은 비인간 항체 또는 특정 치료 전략에서 키메라 항체의 단기 투여를 허용할 수 있다. 실제로, CNS의 "면역-회피" 생리는 전신적인 경로를 통해 투여할 때 불가능할 수 있는 내성(tolerance)을 허용한다. 따라서 척수내 주입 모드는 일반적인 신경학적, 신경외과적 실무이다. 예를 들어, 리투시맵(rituximab)은 다발성 경화증과 CNS 림프종 환자에서 자궁내에서 사용되어온 마우스-인간 키메라 항체다 (특히 보난 M, 페라리 S, 베르탄도 E, 데마슬 S, 크림 E, 미켈 M, 바로소 B "다발성 경화증에서의 자궁내 리투시맵 요법 : 미래의 시험의 필요성을 뒷받침하는 증거 검토. 커 약물 표적". 2014;15(13):1205-14. 토핑 J, 돕슨 R, 라핀 S, 마실리안스키 A, 크롭스호퍼 H, 레펠트 D, 지오바노니 G, 에브도센코 E. "다발성 경화증에서 자궁내 리투시맵이 바이오 마커에 미치는 영향". 멀트 스크러 상대성 장애. 2016 Mar;6:49-53. 및 카도시 C, 리 J, 웡 VS, 첸 L, 차 S, 문스터 P, 로웰 CA, 슈만 MA, 루벤스테인 JL. "재발성 중추신경계 림프종에서의 상보적 활성화 및 심실내 리투시맵 분포". Clin Cancer Res. 2014 Feb 15;20(4):1029-41).
바람직하게는, 약학 조성물은 주사제로 가능한 제제를 위한 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함한다. 이들 약학 조성물은 특히 등장액, 멸균, 식염수 (모노소듐 또는 디소듐 포스페이트, 소듐, 포타슘, 칼슘 또는 염화마그네슘 등 또는 이들 염의 혼합물)에 있거나, 또는 건조, 특히 동결 건조된 조성물일 수 있으며, 멸균수나 생리식염수를 추가하는 즉시, 경우에 따라, 주사용 용액을 구성할 수 있다.
투여에 사용되는 용량은 다양한 파라미터의 함수로서 적용될 수 있으며, 특히, 관련 병리학 또는 선택적으로 바람직한 치료 기간 동안 사용되는 투여 방식의 함수로서 적용될 수 있다.
약학 조성물을 제조하기 위해, HERV-K 엔벨로프 단백질 (HERV-K Env)에 대한 용량의 항체를 약학적으로 허용가능한 담체 또는 수용성 배지에 용해하거나 분산시킬 수 있다.
주사용에 적합한 약학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액; 참기름, 낙화생유 또는 수용성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제제; 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액을 즉시 제조하기 위한 멸균 산제를 포함한다. 모든 경우에 있어서, 제형은 멸균상태에 있어야 하며 주사가 용이할 정도의 액체 상태에 있어야 한다. 제형은 제조, 저장 조건에서 안정해야 하며, 박테리아나 곰팡이와 같은 미생물의 오염에 대비하여 보존되어야 한다.
자유 염기(free base) 또는 약학적으로 허용가능한 염으로서 활성 화합물의 용액은 히드록시셀룰로오스와 같은 계면활성제와 물에서 적절히 혼합하여 제조할 수 있다. 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물을 오일 내에서 제조할 수도 있다. 일반적인 보관 및 사용 조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 번식을 막기 위하여 보존료를 포함한다.
제형에 따라서, 용액은 투여 제형(dosage formulation)에 맞게 치료 효과를 볼 수 있는 용량으로투여될 것이다. 이러한 제형은 상기 기재된 주사용 용액의 종류와 같은 다양한 제형으로 용이하게 투여되지만, 약물 방출 캡슐 등을 사용할 수도 있다.
바람직하게는, 본 발명의 HERV-K 엔벨로프 단백질 (HERV-K Env)에 대한 항체는 그것이 가용화되고, 저장되고, 환자에게 주입된 버퍼로 제조될 수 있고, 환자에게 투여된다. 바람직하게는, 상기 버퍼는 20mM 히스티딘, 5% 수크로오스, 및 0.01% pH6.0인 폴리소르베이트 20을 포함한다.
수용액에서 비경구 투여를 위해, 예를 들면, 상기 용액은 적절히 버퍼될 수 있으며, 상기 액체 희석액을 충분한 식염수 또는 글루코스로 등장액으로 만든다. 이들 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적당하다. 이런 점에서, 본 발명의 개시 내용에 비추어 볼 때, 사용가능한 멸균 수용성 배지는 당업자에게 알려져 있을 것이다. 예를 들면, 하나의 용량은 1 ml의 등장 NaCl 용액에 용해될 수 있으며, 1000 ml의 피하주입액(hypodermolysis fluid)에 첨가되거나 또는 수액(infusion) 예정 부위에 주사된다 (실시예 잠조, "레밍턴의 제약 과학" 15판 에디션, 페이지 1035-1038 및 1570-1580) 치료 대상 환자의 상태에 따라 필요한 경우 용량을 다소 변경할 수 있다. 투여를 담당하는 사람은 어떠한 경우에도 각 개개 환자에게 적절한 용량을 결정한다.
정맥내 또는 근육내 주사와 같이 비경구 투여용으로 제조된 화합물들 외에도, 기타 약학적으로 허용가능한 형태, 예, 정제 또는 기타 경구용 고체 제제; 시간 방출(time release) 캡슐들; 및 현재 사용 중인 기타 다른 형태들을 포함한다.
본 발명의 진단 방법
다른 측면에서, 본 발명은 또한 상기 생물학적 시료와 상기 정의된 항-HERV-K 엔벨로프 항체를 접촉시키는 단계를 포함하는 생물학적 시료에서 HERV-K 엔벨로프 단백질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 또한 상기 환자로부터 수득된 생물학적 시료를 상기 정의된 항-HERV-K 엔벨로프 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는 환자에서 ALS를 진단하는 방법에 관한 것이다.
통상적으로 생물학적 시료는 뇌척수액과 같은 체액일 수 있다.
본 발명에 따른 치료 방법 및 모니터링 방법
일 양상에 있어서, 본 발명은 또한 상기 환자에게 상기 정의된 바와 같이 HERV-K 엔벨로프 단백질을 인식하는 효과적인 용량의 항체를 투여하는 단계를 포함하는 ALS로 고통받는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 환자는 ALS, 특히 산발적 ALS로 고통받는 환자이다.
통상적으로, 상기 항체는 정맥내 또는 피하로 투여된다.
본 발명은 또한 ALS, 특히 산발적 ALS로 고통받는 환자의 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은:
1) 생물학적 시료에서 HERV-K 바이러스를 검출 및/또는 정량함으로써 환자의 예후를 예측하는 단계; 및 그 다음
2) 만약 상기 단계 1)이 인간 내인성 레트로바이러스 (HERV) 유형 K의 발현을 나타내는 경우, 본 발명의 방법은 본 발명의 항체를 상기 환자에게 제공하는 단계를 포함한다.
또한 본 발명은 ALS, 특히 산발적 ALS로 고통받는 환자의 치료에 대한 반응을 모니터링하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은:
a. 본 발명에 따른 항체로 상기 환자를 치료하는 단계: 그 다음
b. 상기 환자의 생물학적 시료에서 HERV-K를 검출 및/또는 정량화하는 단계를 포함한다.
본 발명에 있어서, ALS로 고통받는 환자의 치료에 대한 반응을 모니터링하는 경우에, 생물학적 시료는 혈액, 뇌척수액, 소변 또는 질환-특이적인 조직 생검과 같은 체액의 시료일 수 있다.
통상적으로, 검출 및/또는 정량화 단계는 당업자에게 잘 알려진 일상적인 기술에 따라 수행될 수 있다. 통상적으로, 상기 단계는 환자의 생물학적 시료를 프로브, 프라이머, 리간드 또는 항체와 같은 선택적 시약과 접촉시킴으로써 시료에서 원래의 핵산 또는 관심 단백질의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.
일 구현예에 있어서, 검출 및/또는 정량 단계는 상기 정의된 항-HERV-K 항체로 수행될 수 있다.
[실시예]
실시예 1: GN_mAb_Env_K01 항체의 개발 및 특성
1. 물질 및 방법
1.1. 단일클론 항체 개발
1.1.1. 면역과 면역세포 회복
암컷 마우스 3마리 (Charles River)는 바이오템사의 기밀 RAD (Rapid Antibody development) 프로토콜에 따라 Mybiosource (MBS1391552)가 제공한 대장균(Ecoli)으로부터 his-SUMO가 HERV-K-엔벨로프 단백질 (75kDa)을 태그하여 면역화되었다.
간략히하면, 면역 마우스의 10일째 (D+10) 혈액 시료를 HERV-K-엔벨로프 단백질 (MyBiosource, MBS1391552) 또는 대장균(Escherichia coli) 용해물(lysate)에서 직접 ELISA를 이용하여 분석하였다. 13일째 면역화 마우스를 희생하고 림프절로부터 면역세포를 수거하여 244g에서 7분간 원심분리 후 45ml의 Dulbecco's Modified Eagle 배지 (DMEM, SIGMA, D5671)로 세척하고 20ml DMEM (SIGMA, D5671)에서 재부유시켰다. 면역화 마우스 (420 x 106 세포)의 면역세포를 1:3.9 비율로 성장기의 골수종 세포 (107 x 106 세포)와 혼합하였다. 세포를 244g에서 7분 동안 원심분리하였고, 펠릿(pellet)은 혼합제 (SIGMA, P7181)로 사용한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 1ml에서 재부유되었다. 108g에서 12분 동안 원심분리를 포함하는 세척 단계 이후 DMEM의 10ml (SIGMA, D5671), 하이포잔틴 아미놉테린 티미딘(hypoxanthine aminopterine thymidine) (HAT, SIGMA, H0262-10VL), 태아 송아지 혈청 20% (FCS, PAA, A15-251), 4mM L-글루타민에서 세포를 재부유하고 L-글루타민 (SIGMA, G7513)을 244g에서 7분간 원심분리하였다. 세포는 DMEM (SIGMA, D5671), 1X HAT (SIGMA, H0262-10VL), 20% FCS (PAA, A15-251), 4mM L-글루타민 (SIGMA, G7513)을 재부유하여 실온에서 2시간 동안 저장하였다.
1.1.2. 융합(fusion)
D-1에서, 면역결핍 누드 마우스 (BIOTEM)에 20% FCS (PAA, A15-251)를 함유한 DMEM (SIGMA, D5671) 5ml를 주입하고 2+/-1 분 후에, 복막액으로부터 대식세포를 수거하여 DMEM 배지 (SIGMA, D5671)에서 배양하였다.
P3X63Ag8 골수종과 융합된 양(sheep) 적혈구로 면역화된 마우스의 BALB/c 비장 세포는 이미 BIOTEM에 의해 선택되고 특정되었으며 저장되었다. D-10에서, 이러한 골수종은 DMEM (SIGMA, D5671) -8-Azaguanine (AZA, SIGMA, A5284) - 10% FCS (PAA, A15-251)에서 해동되고 배양되었다.
누드 마우스로부터 얻은 대식세포를 DMEM (SIGMA, D5671), 1X HAT (SIGMA, H0262-10VL), 20% FCS (PAA, A15-251), 4mM L-글루타민 (SIGMA, G7513), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (SIGMA, P0781)에서 104 대식세포/ml에서 측정하고 재부유하였다. 그 후 성장인자로 사용되는 대식세포 현탁액 (500 대식세포에 해당) 50μl을 하이브리도마(hybridomas) 세포 현탁액 50μl을 함유한 96-웰스 플레이트에 도말하였다. 이들 세포는 37℃, 5% CO2에서 21일 동안 배양하였다.
1.1.3. 클로닝(cloning)
하이브리드종 세포를 해동하여 DMEM (SIGMA, D5671), HT (하이포잔틴 100μM, 티미딘 16μM - SIGMA H0137), 20% FCS (PAA, A15-251), 2% 하이브리도마 증진 부형제 (HES, SIGMA, H6020), 4mM L-글루타민 (SIGMA, G7513), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (SIGMA, P0781)을 37℃, 5% C02에서 일주일 동안 24-웰스 플레이트에서 배양였다. 클로닝 하루 전에, 하이브리도마 세포를 분리하였다.
D0에서, 배양 배지 하이브리도마 현탁액에서 104, 50, 25, 5 및 2.5세포/ml를 연속 희석 후 5, 1 및 0.5 세포/200μl을 96-웰스 플레이트의 웰에 도말하였다. D+6에서, 웰 함유 세포(광학 현미경으로 스크리닝하여 선별)로부터 얻은 100μl의 상등액을 신선한 DMEM (SIGMA, D5671), HT (하이포잔틴 100μM, 티미딘 16μM - SIGMA H0137), 20% FCS (PAA, A15-251), 2% HES (SIGMA, H6020), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (SIGMA, P0781)으로 대체하였다.
D+10에 상응하는 첫 번째 ELISA 스크리닝 후, 24-웰스 플레이트 (0.5ml/웰)에서 항-HERV-K-엔벨로프 양성 하이브리도마를 배양하였다.
D+14에 상응하는 2차 ELISA 스크리닝 후, 항-HERV-K 엔벨로프 양성 하이브리도마를 플레이트 또는 배양 플라스크 (Corning)에서 배양하였고, 5 x 106 세포에서 4 세포를 포함하는 5개의 바이알을 DMEM (SIGMA, D5671), 15% FCS (PAA, A15-251), 4mM L-글루타민 (SIGMA, G7513), 1% HES (SIGMA, H6020), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (SIGMA, P0781), 20% 디메틸설폭시드 (DMSO,Sigma, D2650) 배지에서 -196℃에서 동결시켰다 (액화질소).
1.2. 항-HERV-K-엔벨로프 ELISA
Maxisorp 96 원뿔형 하부 웰 플레이트 (NUNC, 449824)는 1μg/ml HERV-K 엔벨로프 단백질 (Mybiosource, MBS1391552), 대장균 용해물 (XL1-Blue MRF, Stratagene), HEK 세포 용해물 (HEK cell lysate)의 50μl를 1X Phosphate Buffered Saline (PBS, BIO)에 실온에서 하룻밤 코팅하였다. 플레이트는 [1X PBS + 0.05% Tween20 (VWR, 28829.296)] 세척 버퍼 (300μl/웰)로 세척되었다. 비-특이적 결합 부위는 [1X PBS + 0.05% Tween20 + 2.5% 우유 (Regilait)] 블로킹 버퍼 (150μl/웰)로 실온에서 1시간 동안 블로킹되었다. 플레이트는 [1X PBS + 0.05% Tween20] 세척 버퍼 (300μl/well)로 세척되었다.
항체 시료는 [1X PBS + 0.05% Tween20 + 0.5% BSA (VWR, 1.12018.0100 희석 버퍼)에서 희석되었다. AMSBIO (1μg/ml) (50μl/웰)로부터 항체 시료 또는 정제된 항-HERV-K-엔벨로프를 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 플레이트는 [1X PBS + 0.05% Tween20] 세척 버퍼 (300μl/웰)로 세 번 세척하고, 실온에서 1시간 동안 다클론 퍼옥시다제-컨쥬게이트 affiniPure F(ab)'2 단편 염소(goat) 항-마우스 lgG + lgM (Jackson, 115-036-068) (1X PBS + 0.05% Tween20 + 0.5% BSA에서 1/10000)의 50μl/웰로 배양되었다. 플레이트는 3회 세척되고 실온에서 10분 동안 테트라메틸벤지딘 (TMB, Eurobio, 52-00-01) 기질 용액 (50μl/웰)으로 발현(revelation)이 수행되었다. 반응은 0.1M H2SO4 (Merck, 1.12080.1000) (50μl/well)로 블로킹되었다. 광밀도 (OD)는 광밀도 (OD) 측정기 (Dynex)를 이용하여 450nm에서 측정하였다.
1.3. 생산, 정제, 투석(production, purification, dialysis)
GN_mAb_Env_K01 하이브리도마 세포를 해동하여 T75cm2에서 배양한 후 T300cm2 조직 배양 플라스크에서 배양하였다. 마지막으로, DMEM (SIGMA, D5671), FCS (PAA, A15-251), 4mM L-글루타민 (SIGMA, G7513), HES (SIGMA H6020), 페니실린/스트렙토마이신 (SIGMA, P0781)의 500ml의 하이퍼플라스크 (Corning, 10030) 배지에서 37℃, 5% CO2에서 10+/-1 이내로 12 x 106 세포에서 10세포가 배양되었다.
배양 상등액을 244g에서 7분 동안 원심분리한 후 11μm 나일론 네트 필터 (SIGMA, NY1104700)를 통해 여과하였다. 단백질 A 크로마토그래피 칼럼 (GE Healthcare, Mab Select Xtra)을 탈염수로 2회 세척하고 1X PBS(Biotem)의 5 체적으로 평형화하였다. 그다음 세포가 없는 배양 상등액 0.5L를 넣었다. 칼럼은 1X PBS 5 체적으로 세척하였다. 면역글로불린 용출은 아세트산 (SIGMA, A6283) 3.5+/-0.5 체적을 사용하여 산성 pH에서 수행되었다. 면역글로불린을 함유한 용출 분획물을 1M Tris pH 8.8 버퍼 (Biotem)의 100μl로 중화시키고 4℃에서 저장하였다.
IgG 정제 분획물을 10kDa SnakeSkin 투석관과 함께 0.5ml micro dialysis capsule Quixsep (Roth, H448-1)에 2회 투석하였고, 1X PBS에서 22mm (Thermofischer, 68100)를 4℃에서 2시간 동안 투석하였으며, 4℃에서 Vivaspin 20 (30Kda) (Sar)으로 원심분리하여 농축하였다. 항체는 0.22μm Minisart® 필터 (Sartorius, ref)로 여과하였고 단백질 농도는 280nm에서 분광광도법(spectrophotometry)으로 측정하였다.
1.4. SDS PAGE 겔 전기영동에 의한 순도 분석
Laemmli buffer (Biotem)에서 희석된 항체 (0.2μg/μl에서 5μl)를 95℃에서 5분간 가열하고 5% SDS-PAGE의 적층 겔을 포함하는 13.5% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 분리하였다. 겔을 90V에서 30분 동안 그다음 120V에서 2시간 동안 작동시켰다. 단백질 검출은 1시간 동안 교반을 통해 유색 용액 (Biotem)을 이용하여 수행하였다. 겔은 탈색 용액 (Biotem)으로 1시간 동안 교반하여 세척하였다.
1.5. 아이소타이핑(isotyping)
1.5.1. ELISA에 의한 아이소타이핑
maxisorp 96 원뿔형 하부 웰 플레이트 (NUNC, 449824)는 50μl의 1μg/ml 항-뮤린 면역글로불린 (Clinisciences, 1010-01)로 실온에서 하룻밤 동안 코팅되었다. 플레이트는 [1X PBS + 0.05% Tween20] 세척 버퍼 (300μl/웰)로 세척하였다. 비-특이적 결합 부위는 [1X PBS + 0.05% Tween20 + 2.5% 우유] 블로킹 버퍼 (150μl/웰)로 실온에서 1시간 동안 블로킹되었다. 플레이트는 [1X PBS + 0.05% Tween20] 세척 버퍼 (300μl/웰)로 세척되었다. 하이브리도마 상등액은 [1X PBS + 0.05% Tween20 + 0.5% BSA] 희석 버퍼에서 1:10으로 희석되었다. 시료는 실온에서 2시간 동안 배양되었다. 플레이트는 [1X PBS + 0.05% Tween20] 세척 버퍼 (300μl/well)으로 1회 세척되고 50μl/웰의 과산화효소 컨쥬게이트 염소 항-마우스 중쇄 (IgA, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM) (Cliniciencesciences, 5300-05) (1X PBS + 0.05% Tween20 + 0.5% BSA에서 1/2000)로 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 플레이트를 1회 세척하고 실온에서 10분 동안 TMB (Eurobio, 52-00-01) 기질 용액 (50μl/well)을 사용하여 발현이 수행되었다. 반응은 0.1M H2SO4 (Merck, 1.12080.1000) 정지 용액 (50μl/well)으로 블로킹되었다. 광밀도 (OD) 측정은 광밀도 (OD) 측정기를 이용하여 450nm에서 측정하였다.
1.5.2. 측면-유동 면역분석법에 의한 아이소타이핑
경쇄 (kappa 또는 람다)는 측면-유동 면역분석법 (LFIA) (ThermoFisher, 26179)으로 특정되었다.
1.6. HEK 형질주입
인간 배아세포 (1.106세포/mL)는 플라스미드를 발현하는 1μg의 HERV-K-엔벨로프 (기탁번호 AY037928.1)로 형질주입되었다. 형질주입된 세포는 37℃, 8% CO2, 120 rpm 교반으로 배양되었다.
1.7. 웨스턴 블롯 분석
12.5ng/μl의 재조합 HERV-K-엔벨로프 단백질 (Mybiosource)과 1.5ng/μl의 HEK 형질주입 세포로부터 단백질 용해물을 2X Laemmli 버퍼 (SIGMA, S3401)에 희석 (1:1)하고 90℃에서 5분간 가열하였다. 그 다음, 32μl의 시료를 8-16% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE, Novex, EC60452BOX)에 넣었다. 겔은 1X Tris-Glycine SDS 구동 버퍼 (Novex, LC2675)에서 1시간 동안 160mA으로 작동시켰다. 단백질이 0.2μm의 니트로셀룰로오스 멤브레인 (Biorad, 162-0146)으로 1X Tris-Glycine 이동 버퍼 (Novex, LC3675)에 전달된 후, 멤브레인은 [1X PBS + 5% 우유 (La Vie Claire)] 회전 플랫폼의 블로킹 버퍼로 1시간 동안 블로킹되었다. GN_mAb_Env_K01 하이브리도마의 세포 상등액은 [1X PBS+ 1% 우유] 항체 희석액으로 1:5 희석하고 1시간 동안 배양하여 1차 항체로 사용되었다. 그 다음 멤브레인을 [1X PBS +0.05% Tween20 (SIGMA, P7949)] 세척 버퍼에서 5분 동안 3회 세척하고 1:1000으로 희석된 HRP-컨쥬게이트 염소 항-마우스 IgG 항체 (Jackson, 115035-146)로 30분 동안 배양하였다. 멤브레인을 3회 세척하고 제공된 프로토콜에 따라 비색 분석 반응(Opti 4-CN, Biorad, 170-8235)으로 단백질이 검출되었다.
1.8. 에피토프 매핑(epitope mapping)
에피토프 매핑은 Pepscan Presto BV, (Zuidersluisweg 2, 8243RC Lelystad, The Netherlands)에서 수행되었다.
1.8.1. 펩타이드 라이브러리 합성
표적 분자의 에피토프를 재구성하기 위해 펩타이드 라이브러리가 합성되었다. 아미노 작용기화된 폴리프로필렌 지지체는 독점적인 친수성 폴리머 제형으로 이식됨으로써 획득되고, 뒤이어 N하이드록시벤조트리아졸 (HOBt)으로 디사이클로헥실카보디이미드 (DCC)을 사용하여 t-부틸옥시카보닐-헥사메틸렌다이아핀 (BocHMDA)과 반응하고 그 다음 트리플루오로아세트산 (TFA)를 사용하여 Boc-그룹을 절단하였다. 표준 Fmoc-펩타이드 합성은 아미노 작용기 고체 지지체에서 펩타이드를 합성하기 위해 맞춤형으로 변성된 JANUS 액체 처리 스테이션 (Perkin Elmer)에 의해 사용되었다. 구조적인 모방의 합성은 펩스칸(Pepscan)의 소유인 스캐폴드 상에서 화학적으로 연결된 펩타이드 (CLIPS) 기술로 수행되었다. CLIPS 기술은 펩타이드를 단일 루프, 이중 루프, 삼중 루프, 시트-유사 폴드, 헬릭스-유사 폴드 및 이들의 조합으로 구조화하도록 한다. CLIPS 템플릿은 시스테인 잔기에 결합된다. 펩타이드 내에 다수의 시스테인 측-쇄는 하나 또는 두 개의 CLIPS 템플릿에 결합된다. 예를 들어, P2 CLIPS (2,6-비스(브로모메틸)피리미딘)의 0.5Mm 용액은 암모늄 바이카보네이트 (20 mM, pH 7.8)/아세토나이트릴 (1:3(v/v))에 용해된다. 이 용액은 펩타이드 배열(array)에 첨가된다. CLIPS 템플릿은 펩타이드-배열 (3μl 웰의 455 웰 플레이트)의 펩타이드에 결합된 고체-상에 존재하는 두 개의 시스테인 측-쇄에 결합할 것이다. 펩타이드 배열은 용액에 완전히 잠긴 상태로 30 내지 60분 동안 용액에서 부드럽게 흔들린다. 마지막으로, 펩타이드 배열은 과잉 H2O로 광범위하게 세척되고 PBS (pH 7.2)에서 1% SDS/0.1% 베타-메르캅토에탄올을 포함하는 방해-버퍼에서 70℃에서 30분 동안 초음파처리하고, 뒤이어 또 45분 동안 H20에서 초음파처리한다. 펩타이드를 운반하는 T3 CLIPS는 유사한 방식으로 만들어졌지만 현재는 세 개의 시스테인으로 만들어졌다.
1.8.2. ELISA 스크리닝
합성된 펩타이드 각각에 대한 항체의 결합은 펩스칸-베이스 ELISA에서 시험되었다. 펩타이드 배열은 1차 항체 용액 (펩스칸 버퍼 1μg/ml에서 GN_mAb_Env_K01)으로 4℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 세척 후에, 펩타이드 배열은 토끼 항-마우스 IgG(H+L) HRP 컨쥬게이트 항체 (Southern Biotech; 표 4)의 1/1000 희석액으로 25℃에서 1시간 동안 배양되었다. 세척 후에, 퍼옥시다아제 기질 ABTS (2,2'-azino-di-3-ethylbenzthiazoline sulfonate)와 20 μl/ml의 3% H2O2를 첨가하였다. 1시간 후에, 발색현상을 측정하였다. 발색현상은 전하결합소자 (CCD) - 카메라와 영상 처리 시스템으로 정량화하였다. CCD 카메라에서 얻은 값은, 표준 96-웰 플레이트 ELISA-측정기와 유사한 0 내지 3000 mAU 범위이다.
1.9. 시퀀싱
PureLink RNA Mini Kit (Life technology, 12183018A)를 이용하여 하이브리도마 세포로부터 고품질 RNA를 추출하고 정제한 후 아가로스 겔에서 조절하였다. 정제된 전체 RNA로부터 시작하여, Superscript 효소 (Invitrogen, 18064022)를 사용하여 1차-가닥에 상보적인 DNA (cDNA)를 합성하고 그 다음 HotStar HiFidelity Polymerase Kit (Qiagen, 202602) 및 뮤린 항체 중쇄 및 경쇄를 특이적으로 코딩하는 cDNA를 표적으로하는 퇴행 프라이머 (Biotem 디자인)를 사용하여 중합효소연쇄반응 (PCR)한다. PCR 산물은 아가로스 겔에서 조절되고 시퀀싱 (이중가닥 시퀀싱)되었다. 결과 서열을 전용 생물정보학 도구 (Blast-ClustalW)를 사용하여 조립 및 품질 관리를 위해 분석하고 펩타이드서열로 번역하였다.
1.10. [표 3] Biotem 버퍼 조성물
2. 결과
단일클론 항체의 다른 중쇄와 경쇄를 검출할 수 있는 특정 항-면역글로불린 항체를 사용하여 GN_mAb_Env_K01이 항-카파 경쇄 항체 (도 1A)와 항-IgG2b 중쇄 (도 1B)에 의해 검출되었음을 도시하였다.
GN_mAb_Env_K01 중쇄와 경쇄를 시퀀싱하여, 3개의 CDR 영역 (도 2)을 나타내고 IgG2b의 중쇄와 카파 경쇄 모두를 확인하였다.
2.1. GN_mAb_Env_K01은 HERV-K-엔벨로프 표면 유닛으로부터 선형 에피토프 SLDKHKHKKLQSFYP를 인식한다.
높은 엄격 조건 하에서 Mybiosource (무신호 및 끝이 잘린 트랜스멤브레인 도메인) 에피토프 매핑 시험에서 끝이 잘린 HERV-K-엔벨로프 단백질 서열 중 529 펩타이드의 패널을 사용하여 GN-mAb-Env_K01 항체가 SLDKHKHKKLQSFYP 코어 서열과 선형 펩타이드에 결합됨을 확인하였다 (도 3, 왼쪽 패널) 이 에피토프는 HERV-K-엔벨로프 단백질 (도 3 오른쪽 패널)의 세포외 도메인 내에 포함되어 있고, Dewannieux 등에 의해 기재된 HERV-K-엔벨로프 단백질의 298-312 영역에 해당한다 (Dewannieux, Blaise, 및 Heidmann 2005). 이 에피토프를 Blastp으로 국립생명공학정보센터(NCBI)로부터 블라스트하는 것은 HERV-K-엔벨로프 서열에 해당하는 상위 100 블라스트 내에서 100% 상동성을 가진 고도로 보존된 에피토프임을 보여준다 (데이터는 도시되지 않음).
2.2. GN_mAb_Env_K01은 자연적 상태에서 글리코실화 및 비-글리코실화 HERV-K-엔벨로프 단백질을 인식한다.
우리는 글리코실화 HERV-K-엔벨로프를 인식하는 GN_mAb_Env_K01의 능력을 더 분석했다. 이 목적을 위해, 인간 배아 신장 (HEK) 세포는 HERV-K-엔벨로프 단백질을 인코딩하는 플라스미드로 형질주입되었다. 다양한 버퍼로 몇번의 시도에도 불구하고, 우리는 용해성 HERV-K-엔벨로프 단백질을 추출하지 못했다 (데이터는 도시되지 않음). 그러나 형질주입된 HEK 세포 용해물로부터 글리코실화 HERV-K-엔벨로프 단백질의 이러한 불용해성 분획물은 GN_mAb_Env_K01이 ELISA에 의해 글리코실화 HERV-K-엔벨로프 항원을 특이적으로 인식한다는 것을 볼 수 있다. 반대로, AMSBIO (도 4, 오른쪽 패널)의 고전적인 상업적 항-HERV-K-엔벨로프 mAb (HERM-1821-5, IgG2b)는 당화된 HERV-K-엔벨로프를 검출하지 못했다.
본 결과는 GN_mAb_Env_K01이 ELISA에서 생물학적 활성을 나타내고 SLDKHKHKKLQSFYP 에피토프가 자연적 상태에서 접근 가능함을 나타낸다.
AMSBIO로부터 GN_mAb_Env_K01과 항-HERV-K-Env mAb (HERM-1821-5, IgG2b) 모두 EColi (도 5)로부터 자연적 his-SUMO로 태그된 재조합 HERV-K-엔벨로프를 인식했지만, 항-HERV-K-엔벨로프 단일클론 항체와 비교하여 모두 동일한 농도 (1μg/ml)로 시험했을 때 GN_mAb_Env_K01은 AMSBIO (도 5)로부터 훨씬 더 높은 검출을 나타냈다. 이것은 HERV-K 엔벨로프에 대한 GN_mAb_Env_K01의 친화력이 더 높다는 증거이다.
도 6에서 도시한 것 같이, 75kDa 신호에서 관찰된 것 처럼 AMSBIO로부터 GN_mAb_Env_K01과 항-HERV-K-엔벨로프 mAb (HERM-1821-5, IgG2b) 모두 EColi로부터 변성된 his-SUMO가 태그된 재조합 HERV-K-엔벨로프를 인식하였다.
중요한 것은, 90kDa 신호에서 관찰된 것 처럼 GN_mAb_Env_K01은 HEK 형질주입된 세포로부터 변성된 HERV-K엔벨로프 글리코실화 단백질을 또한 검출하는 반면, AMSBIO의 항-HERV-K-엔벨로프 항체는 검출되지 않았다. 변성되지 않은 단백질을 사용한 이전의 ELISA 결과에 더하여, GN_mAb_Env_K01은 웨스턴 블롯에서 생물학적 활성이다. 따라서 SLDKHKHKKLQSFYP 에피토프는 변성 상태에서도 또한 접근할 수 있다.
4. 결론
본 연구는, 마우스 면역 항체 스크리닝 및 단일클론 하이브리도마 선택 후, HERV-K-엔벨로프 SLDKHKHKKLQSFYP 에피토프를 인식하는 뮤린 단일클론 항체 (GN_mAb_EnvK-01로 명명)가 개발되어 예기치 않은 특성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
AMSBIO와 다른 항-HERV-K 엔벨로프 mAb (HERM-1821-5, IgG2b)의 생물학적 비교는, 그들의 유사한 기원 (뮤린), 아이소타입 (IgG2b, 카파) 및 단백질 표적 (HERV-W-Env 단백질)에도 불구하고, 자연 및 변성 상태 모두에서 높은 친화력을 보여주는 동안, GN_mAb_EnvK-01은 글리코실화 및 비-글리코실화 단백질 모두를 인식하기 때문에 유리하다는 것을 확인시켜 준다. 게다가, GN_mAb_EnvK-01 항체는 데이터베이스에 기재된 수많은 다양한 사본으로부터 HERV-K 엔벨로프 서열 중 안정하고 보존된 에피토프를 표적으로 한다.
따라서 GN_mAb_EnvK-01은, 면역분석뿐만 아니라, 예를 들어, ALS에서 치료 표적과 같이 치료 표적으로서 HERV-K 엔벨로프 단백질에 대한 치료 목적에도 유용한 도구다. HERV-K 사본들 사이의 안정적인 에피토프 서열, 높은 친화력 및 자연적으로 글리코실화 구조에 대한 효율적인 결합은, 예를 들어 다른 HERV-K 사본이 현저하게 발현되는 것으로 보이는 ALS, 환자에서 가치있는 치료에 대한 중요한 요구 사항을 충족시킨다.
실시예 2: GN_mAb_Env_K01 (GN K01) 항체는 인간 뉴런 세포의 HERV-K 엔벨로프 신경독성을 효율적으로 중화시킨다.
1. 물질 및 방법
1.1. 인간 뉴런 세포
인간 신경줄기세포 (NSC)-유래의 뉴런 배양물은 기재된 바와 같이 제조되었다 (Efthymiou, Shaltouki 등. 2014) 간략하게, NSCs는 0.002% 폴리-L-오르티닌 (Sigma, St Louis, MO)과 10 μg/mL 라미닌 (Life Technologies)을 7500 내지 10,000 세포/cm2로 코팅한 96-웰 플레이트로 분리하였고, 뉴런 분화 배지는 플레이팅 후 24시간에 첨가하였다. 분화 배지는 GlutaMax의 DMEM/F12, 1.8% 소 혈청 알부민 (BSA), 1× StemPro hESC 부형제 (모두 Life Technologies), 10 ng/mL 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF) 및 신경세포주-유래 신경영양 인자 (GDNF; R&D Systems, Minneapolis, MN)를 포함하고, 세포는 격일로 신선한 배지와 성장 인자를 받았다. in vitro 뉴런은 신경독성 분석에 7 내지 12일 활용되었다.
1.2. 신경독성 분석
1.2.1. 뉴런의 형태와 생존율
Td-Tomato 형광 단백질을 안정적으로 발현하여 세포와 과정을 표지(label)하는, 인간 뉴런 배양물 (15 내지 220,000 웰당 세포)은 상기 기재된 96 웰 플레이트에 플레이팅되고 5% CO2으로 가습된 조직 배양 인큐베이터에서 37℃로 유지되었다. 뉴런 배양물은 분화 배지 (상기 기재된)와 IgG 시료 GN K01 또는 비-면역 IgG (Thermo Product #MA 1-10418)를 3 ug/mL의 최종 농도로 처리했다. 전-배양(pre-incubation) 60분 후, 재조합 HERV-K 엔벨로프 단백질 (My BioSource, 아미노산 90-632, Cat # MBS1391552)은 100 nM의 최종 농도로 첨가되었다. GN K01 Ig의 한 시료는 HERV-K 엔벨로프와 30분 동안 전-배양하고, 그다음 인간 뉴런에 함께 첨가되었다. 뉴런 배양물은 각 웰 (웰당 4개의 이미지)의 영상을 24, 48, 72시간 후 처리하고, 다양한 시점에서 획득하기 위해 GE INCell Analyzer 2000 BioImager를 이용하여 관찰되었다. 이러한 배양물에 대한 고함량 영상/분석은 GE Investigator 1.93 분석 소프트웨어를 사용하여 획득하였다. 뉴런 생존력, 신경돌기 길이 및 다른 형태학적 파라미터는 각 시료에 대해 정량화되었다. 데이터는 Graph Pad Prism 7.02으로 묘사되었다.
1.2.2. 전기생리학적 분석
Axion Maestro microelectrode array (MEA) 분석을 이용한 전기생리학적 분석
48-웰 t-MEA 웰은 인간 뉴런 배양물 플레이트를 분석하기 위해 활용되었다. 이러한 플레이트들은 웰당 16개 활성 기록 전극을 갖는다. 20,000개 뉴런은 t-MEA 플레이드의 각 웰에 적용되었고 배양물은 5% CO2로 가습된 조직 배양 인큐베이터에서 37℃로 유지되었다. 웰에서 증가된 스파이크 비율에 의해 나타난, 전기생리학적 활성은, in vitro에서 21일 까지 현저하게 증가되었고 모든 웰에서 하루에 5분 동안 자발적 전기 활성을 기록함으로써 모니터링되었다. 이 시점에서, 인간 뉴런 배양물은 분화 배지 (상기 기재된)와 IgG 시료 GN K01 또는 대조군 비-면역 IgG (Thermo Product #MA 1-10418)를 3 ug/mL의 최종 농도로 처리했다. 전-배양 60분 후에, 재조합 HERV-K 엔벨로프 단백질 (My BioSource)은 100 nM의 최종 농도로 첨가되었다. 이러한 조건에서, 항체는 먼저 엔벨로프 없이 세포에 첨가되었고, 따라서 환자의 뇌 조직에 확산된 치료 항체의 존재로 치료된 환자의 상태를 재현하였다. 그 후 활성 엔벨로프 단백질 (항체로 전-배양되지 않고, 전-중화되지 않고 불활성 단백질로 첨가되지 않은)이 첨가되고, 이로써 세포외 공간에서 세포의 분비를 갖는 병원성 단백질의 발현을 재현하였다. GN K01 Ig의 한 시료는 HERV-K 엔벨로프와 30분 동안 전-배양하고, 그 다음 인간 뉴런에 함께 첨가되었다. 후 처리 24시간 초반부터, 매일 자발적 전기 활성이 기록되었다. 전기적 활성의 정량은 Axion Axis 소프트웨어로 완료하였다. 각 처리에 대해 스파이크 수, 평균 발사 속도 및 버스트 수와 같은 파라미터가 결정되었다.
2. 결과
2.1. 세포외 HERV-K 외엽 단백질은 인간 뉴런 세포에 독성이 있으며, GN_mAb_Env_K01 (GN K01) 항체에 의해 그 독성이 특이적으로 억제된다
2.1.1. 뉴런 생존율
100 nM의 재조합 HERV-K 엔벨로프 단백질로 처리한 인간 뉴런 배양물은 상당한 신경독성을 나타내어, 그 결과로 다음 날에 중요한 뉴런 손실을 초래했다. HERV-K 엔벨로프 단백질에 노출된 후 5일째에 HERV-K 엔벨로프의 효과를 정량하였다. 우리는 엔벨로프 + GN K01 Ig (3μg/mL) 처리된 뉴런이 엔벨로프 처리된 뉴런에 비해 생존율이 증가됨을 관찰하였다. HERV-K 엔벨로프 단백질이 배지에 첨가된 후 5일째에 분석하였을 때, 엔벨로프와 3μg/mL의 비-면역 IgG 대조군 항체를 처리한 세포에서도 유사한 독성을 보였다. HERV-K 엔벨로프 또는 엔벨로프로 전-배양되기 전에, 3μg/mL의 GN K01로 처리된 다음 뉴런 배양물에 적용된 뉴런은 현저하게 더 생존가능한 뉴런으로 보였고, 이로써 HERV-K 엔벨로프 단백질의 독성을 중화시키는 GN K01 항체의 효능을 확인하였다 (도 7).
2.1.2. 뉴런 신경돌기 길이
평균 신경돌기 길이에 미치는 HERV-K 엔벨로프의 영향을 병렬적으로 분석하였고, 뉴런에 노출된 엔벨로프에 GN K01 (3μg/mL)를 첨가하는 것은 엔벨로프 또는 엔벨로프 + 뉴런으로 처리된 대조군 비-면역 Ig에 비해 신경돌기 길이를 현저하게 증가시켰다 (도 8).
2.1.3. 뉴런 기능 활성
정상 뉴런 활성의 주용한 특징인, 자발적 전기 활성에 HERV-K 엔벨로프 처리가 기능적 변화를 초래하는지 아닌지 평가하기 위해 Axion Maestro MEA 시스템으로 전기생리학적 연구가 수행되었다. 48 웰 MEA 플레이트에서 인간 뉴런 배양물을 21일 동안 플레이팅한 후, 배양물은 분화 배지 (상기 기재된)와 GN K01 또는 대조군 비-면역 lgG (Thermo Product # MA 1-10418)의 최종 농도 3μg/mL에서 배양되었다. 전-배양 60분 후, 재조합 HERV-K 엔벨로프 단백질 (My BioSource, Cat # MBS1391552)은 100 nM의 최종 농도에 첨가되었다. GN K01 Ig의 한 시료는 HERV-K Env와 30분 동안 전-배양하고, 그다음 인간 뉴런에 함께 첨가되었다. 후 처리 24시간 초반부터 매일 자발적 전기 활성이 기록되었다. HERV-K 후 처리 24시간째, 엔벨로프 처리로 스파이크 수와 평균 연소율이 40%까지 감소되었다. HERV-K 엔벨로프와 대조군 비면역 IgG 처리에 노출된 뉴런은 스파이크 수와 평균 연소율이 약 30% 감소하였다. 매우 놀랍게도, HERV-K 엔벨로프와 GN K01에 노출된 뉴런은 대조군 배지에서만 배양된 웰과 유사한 스파이크 수 및 평균 연소율을 나타냈고, 이로써 HERV-K 엔벨로프 병원성이 글로벌 뉴런 기능 활성에 미치는 영향의 완전한 억제를 보았다 (도 9).
3. 결론
따라서 GN K01 항체의 효능은 특이적이며 HERV_K Env 단백질에 대한 뉴런 노출의 병원성 결과에 대한 이로운 효과는 (i) 세포 사멸의 유의성, (ii) 뉴런 형태 및 신경돌기 길이의 유지 및 (iii) HERV-K Env 단백질의 병원성 존재 하에서 전기 생리학적 활성에 의해 측정된 뉴런 기능 활성의 완전한 회복에 의해 입증되었고, HERV-K Env는 무관한 제어 항체를 가지고 있거나 항체가 없다.
따라서 (i) 산발적 ALS 환자의 뇌실질(brain parenchyma) 내에서 변화된 뉴런에서 HERV-K 엔벨로프 단백질의 특이적 검출이 도시된 후에 그리고 (ii) 이러한 특이적 단백질을 코딩하는 HERV-K 엔벨로프 유전자를 발현하는 유전자 이식된 마우스에서 재발된 산발적 ALS의 임상적 및 조직학적 징후에 의해 이러한 HERV-K 엔벨로프 단백질만이 병원성을 유도한다는 개념의 증명 후에 (Li, Lee 등. 2015), 관련 인간 뉴런 및 기능적 양태가 발명가들에 의해 입증된, GN K01 항체의 특이적 효능은 ALS, 특히 산발적 ALS에서 치료적 가치를 입증하고 있다.
이러한 항체의 특이적 활성은 HERV-K 엔벨로프 (Env) 단백질의 병원성 효과를 중화 (즉: 치료)시키는 것으로 나타나고, 이는 그것 스스로 산발적 ALS를 가진 환자의 뇌에서 ALS 병변성 뉴런 병소와 관련되어 있고 배양된 뉴런에 첨가될 때, 또는 ALS와 동일한 임상적 징후와 함께 마우스에서 단일 이식유전자로 발현될때 동일한 뉴런 변화를 재발하는 것으로 보인다. 더욱이, HERV-K 엔벨로프 병원성 단백질이 있는 GN K01 항체를 첨가하는 것은 in vitro에서 HERV-K 엔벨로프 재조합 단백질과 GN K01을 전-배양하는 더욱 현저한 효능을 보이고, 이는 생리적 조건, 따라서 치료적 적용에서 그것의 최적의 효능을 보여준다.
HERV_K 단백질 독성은 형질주입된 표적 세포에서 또는 이전 지식으로부터의 유전자 이식된 동물로부터의 뉴런에서의 세포내 발현을 수반할뿐만 아니라, 자연적 (비-HERV-K 형질주입된 또는 과발현되는) 뉴런으로 세포외 HERV-K 단백질 병원성을 분비되는 것을 수반한다. 따라서, 본 발명의 항체는 또한 분비된 및/또는 세포외 HERV_K 엔벨로프 단백질에 대한 뉴런 노출에 의해 유도된 세포독성의 측분비(paracrine) 확산으로부터 인간 뉴런을 보호한다. 암묵적으로, 이것은 또한 HERV-K 엔벨로프 코딩 유전자들을 발현하거나 과발현하는 뉴런에서 생산된 HERV_K 엔벨로프 단백질에 의한 자가분비(autocrine) 세포독성에도 적용된다.
결론적으로, 본 발명에 따른 HERV-K 엔벨로프 단백질을 특이적으로 표적화하는 항체는 ALS, 특히 산발적 ALS에서 관찰되는 것과 같이, 또는 ALS 특징을 재현하는 HERV-K 엔벨로프 마우스 유전자 이식된 모델에서 그의 병태생리적 특성을 중화시킬 수 있다.
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Claims (12)

  1. 인간 내인성 레트로바이러스 K (HERV-K) 엔벨로프 단백질을 인식하는 항체로서, 상기 항체는 서열번호: 9로 표시되는 에피토프에 결합하고, 및
    - 3개의 상보성 결정 영역(CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)을 포함하는 경 쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 경쇄, 및
    - 3개의 상보성 결정 영역(CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 중쇄를 포함하며,
    여기서 상기 CDR-L1은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L2는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하며, CDR-L3은 서열번호: 3의 아미노산 서열을 포함하고, CDR-H1은 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하며, CDR-H2는 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  2. 제1항에 있어서:
    - 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL); 및
    - 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 것인 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 단일클론 항체인 항체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 단일클론 항체는 뮤린 단일클론 항체, 키메라 단일클론 항체 또는 인간화 단일클론 항체인 항체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 치료에서 사용하기 위한 항체.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 근위축성 측삭 경화증을 치료하기 위한 제제.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 근위축성 측삭 경화증은 산발적 근위축성 측삭 경화증인 제제.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 근위축성 측상 경화증을 치료하기 위한 약학 조성물.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 정의된 항-HERV-K 엔벨로프 항체와 생물학적 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는 상기 생물학적 시료에서 HERV-K 엔벨로프 단백질을 검출하는 생체외(in vitro) 방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 정의된 항-HERV-K 엔벨로프 항체와 환자로부터의 생물학적 시료를 접촉하는 단계를 포함하는 환자에서 근위축성 측상 경화증을 진단하기 위한 생체외(in vitro) 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
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