KR102591643B1 - 희귀 진세노사이드 Rh2, Rh3 또는 Rk2 제조 방법 - Google Patents

희귀 진세노사이드 Rh2, Rh3 또는 Rk2 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Rh2, Rh3 및 Rk2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 진세노사이드 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법은 Rb1, Rb2, Rb3, Rc 및 Rd로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 진세노사이드를 포함하는 원료를 준비하는 단계; 산 및 열처리 단계; 및 아스퍼질러스 나이거 C2-2(Aspergillus niger C2-2) 균주 유래의 효소처리 단계를 포함한다.

Description

희귀 진세노사이드 Rh2, Rh3 또는 Rk2 제조 방법{Manufacturing method for rare ginsenoside Rh2, Rh3 or Rk2}
본 발명은 희귀 진세노사이드 Rh2, Rh3 또는 Rk2 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 Rb1, Rb2, Rb3, Rc 및 Rd와 같은 인삼의 주요 진세노사이드로부터 희귀 진세노사이드 Rh2, Rh3 또는 Rk2를 제조할 수 있는 방법에 관한 것이다.
인삼은 두릅나무과의 여러해살이풀로서, 주로 약재로 사용되어 왔다. 인삼에는 다른 식물에서 발견되는 것과는 화학 구조가 상이한 특유의 사포닌이 함유되어 있으며, 이를 진세노사이드(ginsenoside)라고 부른다.
진세노사이드는 아글리콘(aglycone)의 구조에 따라 프로토파낙사이다이올계(protopanaxadiol-type, PPD 타입) 진세노사이드, 프로토파낙사트라이올계 (protopanaxatriol-type, PPT 타입) 진세노사이드 및 올레아놀린산계(oleanolic acid 타입) 진세노사이드의 세 가지로 분류될 수 있다.
현재 40여종 이상의 진세노사이드들이 분리되었고, 이들 대부분은 PPD 타입의 진세노사이드이다. PPD 타입의 진세노사이드에는 Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, 지페노사이드 XVII(gypenoside XVII), 컴파운드 오(compound O), 컴파운드 엠씨원(compound Mc1), F2, 컴파운드 와이(compound Y), 컴파운드 엠씨(compound Mc), Rg3, Rh2, 컴파운드 케이(compound K, C-K)가 포함된다. PPT 타입의 진세노사이드에는 Re, Rg1, Rf, Rg2, Rh1 등이 포함된다.
인삼 그리고 이의 가공물로서 대표적인 홍삼 등에 함유된 전체 진세노사이드의 90% 이상이 Rg1, Re, Rb1, Rb2, Rc 등과 같은 주요 진세노사이드(major ginsenoside)이며, Rd, F2, Rg3, Rh1, Rh2, 지페노사이드 XVII, 지페노사이드 LXXV 및 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨, 컴파운드 엠씨원 등과 같은 희귀 진세노사이드(마이너 진세노사이드로도 불림)는 아주 적은 양만이 함유되어 있다. 주요 진세노사이드는 큰 분자량으로 인해 생체 내 흡수율이 매우 낮은 반면 희귀 진세노사이드는 상대적으로 흡수도 잘 되며 약효도 더 뛰어난 것으로 알려져 있다. 이에 주요 진세노사이드로부터 희귀 진세노사이드를 제조하기 위한 다양한 연구가 이루어지고 있다.
본 발명자 또한 주요 진세노사이드로부터 희귀 진세노사이드를 제조할 수 있는 방법을 개발하기 위해 지속적으로 연구해왔으며, 이와 관련하여 인삼 PPD 타입의 주요 진세노사이드를 컴파운드 케이로 효율적으로 전환할 수 있는 효소를 생산하는 신규 누룩균 아스퍼질러스 나이거 C2-2 균주를 발굴한 바 있다(한국등록특허 제10-2258788호).
본 발명자는 여기서 멈추지 않고 상기 균주를 활용하여 다른 희귀 진세노사이드를 생산할 수 있는 가능성에 대해 연구하였으며, 이의 결과 상기 균주를 활용하여 Rh2, Rh3 및 Rk2와 같은 희귀 진세노사이드를 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
한국등록특허 제10-2258788호
따라서 본 발명의 주된 목적은 인삼의 주요 진세노사이드로부터 희귀 진세노사이드 Rh2, Rh3 또는 Rk2를 효율적으로 제조할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 일 양상에 따르면, 본 발명은 Rb1, Rb2, Rb3, Rc 및 Rd로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 진세노사이드를 포함하는 원료를 준비하는 단계; 상기 원료에 산을 첨가하고 열처리하는 산 및 열처리 단계; 및 상기 산 및 열처리 단계에서 생성되는 중간 산물을 아스퍼질러스 나이거 C2-2(Aspergillus niger C2-2) 균주 유래의 효소와 반응시키는 효소처리 단계를 포함하는 Rh2, Rh3 및 Rk2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 진세노사이드 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양상에 따르면, 본 발명은 Rb1, Rb2, Rb3, Rc 및 Rd로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 진세노사이드를 포함하는 원료를 준비하는 단계; 상기 원료를 아스퍼질러스 나이거 C2-2(Aspergillus niger C2-2) 균주 유래의 효소와 반응시키는 효소처리 단계; 및 상기 효소처리 단계에서 생성되는 중간 산물에 산을 첨가하고 열처리하는 산 및 열처리 단계를 포함하는 Rh2, Rh3 및 Rk2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 진세노사이드 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면 Rb1, Rb2, Rb3, Rc 및 Rd와 같은 인삼의 주요 진세노사이드로부터 희귀 진세노사이드 Rh2, Rh3 또는 Rk2를 효율적으로 제조할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시형태에 따른 희귀 진세노사이드 제조 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시형태에 따른 원료(1) 및 이 원료의 산 및 열처리 중간 산물(2)의 TLC 분석 결과를 나타낸 것이다. S: 표준 진세노사이드인 Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Rg3, F2, Rk1 및 Rg5를 섞은 혼합물(대조군).
도 3은 본 발명의 일 실시형태에 따른 산 및 열처리 이후의 효소처리를 거쳐 수득된 최종 산물(Rh2-mix)의 TLC 분석 결과를 나타낸 것이다. S: 표준 진세노사이드인 Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Rg3, F2, Rk1 및 Rg5를 섞은 혼합물(대조군).
도 4는 산 및 열처리 이후에 효소처리하는 본 발명의 일 실시형태에 따른 원료(A), 이 원료의 산 및 열처리 중간 산물(B) 및 최종 산물(C)의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 효소처리 이후에 산 및 열처리하는 본 발명의 일 실시형태에 따른 원료(A), 이 원료의 효소처리 중간 산물(B) 및 최종 산물(C)의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 방법은 Rb1, Rb2, Rb3, Rc 및 Rd와 같은 주요 진세노사이드로부터 Rh2(S형 또는 R형), Rh3 및 Rk2와 같은 희귀 진세노사이드를 제조하는 방법으로서, 산(acid) 및 열처리 단계와 아스퍼질러스 나이거 C2-2(Aspergillus niger C2-2) 균주 유래 효소처리 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
일 양상에서, 본 발명의 방법은 Rb1, Rb2, Rb3, Rc 및 Rd로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 진세노사이드를 포함하는 원료를 준비하는 단계; 상기 원료에 산을 첨가하고 열처리하는 산 및 열처리 단계; 및 상기 산 및 열처리 단계에서 생성되는 중간 산물을 아스퍼질러스 나이거 C2-2(Aspergillus niger C2-2) 균주 유래의 효소와 반응시키는 효소처리 단계를 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명의 방법은 Rb1, Rb2, Rb3, Rc 및 Rd로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 진세노사이드를 포함하는 원료를 준비하는 단계; 상기 원료를 아스퍼질러스 나이거 C2-2(Aspergillus niger C2-2) 균주 유래의 효소와 반응시키는 효소처리 단계; 및 상기 효소처리 단계에서 생성되는 중간 산물에 산을 첨가하고 열처리하는 산 및 열처리 단계를 포함한다.
상기 원료, 즉 Rb1, Rb2, Rb3, Rc 및 Rd로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 진세노사이드를 포함하는 원료는 인삼 또는 이의 추출물 또는 이의 정제물일 수 있다. 일 실시형태에서, 원료는 인삼의 추출물로부터 PPD 타입의 진세노사이드를 정제하는 공정을 통해 수득된 것이다. 인삼은 예를 들어 화기삼, 삼칠삼 또는 고려인삼일 수 있다. 인삼은 말리지 않은 것(수삼), 말린 것(건삼) 또는 쪄서 말린 것(예를 들어, 홍삼)일 수 있다. 인삼으로부터 상기와 같은 PPD 타입의 진세노사이드가 함유된 추출물을 수득하는 방법 및 이러한 추출물로부터 PPD 타입의 진세노사이드를 정제하는 공정은 이 분야의 기술자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 40 내지 60%(v/v)의 에탄올 수용액을 용매로 사용하여 추출할 수 있으며, 다공성 소수성 수지를 사용한 흡착을 통해 정제할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 원료는 Rb1, Rb2, Rb3, Rc 및 Rd가 모두 포함된 것이다.
상기 산 및 열처리 단계는 원료(Rb1, Rb2, Rb3, Rc 및 Rd로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 진세노사이드를 포함하는 원료) 또는 중간 산물(효소처리 단계에서 생성되는 중간 산물)에 산을 첨가하고 가열하는 방식으로 이루어질 수 있다. 일 실시형태에서, 산 및 열처리 단계는 원료 또는 중간 산물에 산을 첨가하여 pH 1.9 내지 2.5로 조절하고 70 내지 90℃로 10시간 이상 열처리하는 단계이다. 이에 따르면 원하는 희귀 진세노사이드, 즉 Rh2, Rh3 및 Rk2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 진세노사이드를 보다 효율적으로 제조할 수 있다. 이를 위해 보다 바람직하게는 pH를 2.0 내지 2.3으로 조절하고 75 내지 85℃로 12시간 이상 열처리한다. 열처리 시간은 바람직하게는 24시간 이하로 하며, 보다 바람직하게는 20시간 이하, 보다 바람직하게는 15시간 이하로 한다. 열처리 시간이 상기 시간을 초과할 경우 경과된 시간에 비해 원하는 중간 산물(본 발명의 효소처리에 의해 원하는 최종 희귀 진세노사이드로 전환될 수 있는 중간 산물) 또는 원하는 최종 희귀 진세노사이드의 양의 증가 정도가 감소할 수 있어 결과적으로 효율이 떨어질 수 있다.
일 실시형태에서, 산은 유기산이며, 바람직하게는 구연산(citric acid), 프로피온산(propionic acid), 락트산(lactic acid), 타르타르산(tartaric acid), 아세트산(acetic acid) 및 이들의 혼합물이다. 이에 따르면 원하는 희귀 진세노사이드를 보다 효율적으로 제조할 수 있다. 이를 위해 보다 바람직하게는 구연산을 사용한다.
상기 효소처리 단계는 원료(Rb1, Rb2, Rb3, Rc 및 Rd로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 진세노사이드를 포함하는 원료) 또는 중간 산물(산 및 열처리 단계에서 생성되는 중간 산물)에 아스퍼질러스 나이거 C2-2 균주 유래의 효소를 첨가하고 항온 처리하는 방식으로 이루어질 수 있다. 산 및 열처리 단계 이후에 효소처리 단계가 이루어지는 일 실시형태에서, 효소처리 단계는 원료 또는 중간 산물에 아스퍼질러스 나이거 C2-2 균주 유래의 효소를 첨가하고 40 내지 60℃에서 1일 이상 반응시키는 단계이다. 이에 따르면 원하는 희귀 진세노사이드를 보다 효율적으로 제조할 수 있다. 이를 위해 보다 바람직하게는 아스퍼질러스 나이거 C2-2 균주 유래의 효소를 첨가하고 45 내지 55℃에서 2일 이상 반응시킨다. 항온 처리 기간은 바람직하게는 5일 이하로 하며, 보다 바람직하게는 4일 이하, 보다 바람직하게는 3일 이하로 한다. 항온 처리 기간이 상기 기간을 초과할 경우 경과된 기간에 비해 최종적으로 생성되는 원하는 희귀 진세노사이드의 양의 증가 정도가 감소할 수 있어 결과적으로 효율이 떨어질 수 있다. 효소처리 단계 이후에 산 및 열처리 단계가 이루어지는 일 실시형태에서, 효소처리 단계는 원료 또는 중간 산물에 아스퍼질러스 나이거 C2-2 균주 유래의 효소를 첨가하고 40 내지 60℃에서 10 내지 20시간 동안 반응시키는 단계이다. 이에 따르면 원하는 희귀 진세노사이드를 보다 효율적으로 제조할 수 있다. 반면, 상기 온도 조건 및 항온 처리 시간을 벗어날 경우, 원하는 중간 산물(본 발명의 산 및 열처리에 의해 원하는 최종 희귀 진세노사이드로 전환될 수 있는 중간 산물)의 생성량이 감소하거나, 심지어는 원하는 중간 산물이 생성되지 않거나, 원치않는 중간 산물의 생성량이 증가하여 원하는 희귀 진세노사이드의 제조 효율이 떨어질 수 있다. 이를 위해 보다 바람직하게는 아스퍼질러스 나이거 C2-2 균주 유래의 효소를 첨가하고 45 내지 55℃에서 12 내지 15시간 동안 반응시킨다.
아스퍼질러스 나이거 C2-2 균주는 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 수탁번호 KACC 93333P로 기탁되어 있으며, 구체적인 사항에 대해 한국등록특허 제10-2258788호(이의 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)에 개시되어 있다. 이 균주는 예를 들어 맥아 추출물 또는 밀기울이 포함된 배지를 사용하여 25 내지 33℃의 온도조건으로 배양할 수 있으며, 액상 및 고상으로 배양할 수 있다.
상기 아스퍼질러스 나이거 C2-2 균주 유래의 효소는 아스퍼질러스 나이거 C2-2 균주로부터 통상적인 효소 정제 방법으로 수득될 수 있다. 일 실시형태에서, 아스퍼질러스 나이거 C2-2 균주 유래의 효소는 아스퍼질러스 나이거 C2-2 균주의 배양물로부터 수득되는 조효소액이다. 조효소액은 예를 들어 아스퍼질러스 나이거 C2-2 균주 배양물로부터 통상적인 효소 정제 방법, 바람직하게는 세포외 효소(extracellular enzyme)를 정제하는 방법으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 아스퍼질러스 나이거 C2-2 균주 배양물에 완충액을 첨가하고 균체 및 고형물을 제거한 다음 주정을 첨가하여 효소를 침전시키는 방법으로 수득될 수 있다. 바람직하게는 밀기울이 함유된 고형배지에서 아스퍼질러스 나이거 C2-2 균주를 배양하여 배양물을 수득하고, 이 배양물에 아세트산 완충액을 첨가하여 혼합한 다음 원심분리 또는 막분리를 통해 균체 및 고형분을 제거하고, 주정을 첨가하여 효소를 침전시키는 방법으로 수득한다. 바람직하게는 pH 4.0 내지 6.0의 10 내지 100mM의 아세트산 완충액을 사용하며, 아세트산 완충액을 첨가하고 5 내지 15℃에서 1 내지 10시간 혼합하여 효소가 완충액에 잘 혼합될 수 있도록 한 다음 균체 및 고형분을 제거하는 과정을 수행한다. 또한 바람직하게는 알코올 함량 80 내지 100%(v/v)의 주정을 사용하며, 주정을 첨가하고 1 내지 10℃에서 10 내지 20시간 정치하여 침전시키는 방법을 사용한다. 이러한 방법으로 수득되는 조효소액을 사용하면 원하는 희귀 진세노사이드를 보다 효율적으로 제조할 수 있다.
본 발명의 산 및 열처리 단계 및/또는 효소처리 단계 이후에 중간 산물 또는 최종 산물을 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 정제는 통상의 PPD 타입 진세노사이드 정제 공정, 예를 들어, 다공성 소수성 수지를 사용한 정제 공정을 통해 이루어질 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 아래의 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 산 및 열처리 다음 효소처리를 적용한 희귀 진세노사이드 제조
1-1. 원료 준비
화기삼으로부터 PPD 타입의 진세노사이드를 정제하고 분말화하여 PPD 타입 조사포닌을 수득하고 이를 희귀 진세노사이드 제조를 위한 원료로 사용하였다.
PPD 타입 조사포닌 분말은 다음의 방법으로 수득하였다.
먼저, 약 50% 에탄올 약 10ℓ에 분말 형태의 화기삼 약 1㎏을 첨가하여 약 50℃에서 약 24시간씩 3회 추출(추출 잔사에 약 50% 에탄올 약 10ℓ를 첨가하여 그 다음 회의 추출을 진행하는 방식을 사용함)하였다. 이후, 3회의 각 추출액을 모은 다음 감압농축기를 사용하여 에탄올 함량이 5% 이하의 수준이 되도록 약 1/2 부피로 농축하였다. 추출 농축액을 HP20 다공성 수지 칼럼(column)에 통과시키고, 칼럼에 약 40ℓ 이상의 증류수를 흘려주어 불순물 제거하고, 약 29% 에탄올 약 32ℓ를 흘려주어 PPT 타입의 진세노사이드를 먼저 용출시켜 제거한 다음, 약 80% 에탄올 20ℓ를 흘려주어 PPD 타입의 진세노사이드를 용출하여 수득하였다. 수득된 PPD 타입의 진세노사이드를 포함하는 용출액을 분말화하였다.
1-2. 조효소액 준비
먼저, 아스퍼질러스 나이거 C2-2 균주(KACC 93333P)를 맥아 추출물 액체배지(malt extract broth)(BD Difco, cat. 218630)에 접종하고 약 30℃에서 약 3일간 배양하여 배양액을 수득하였다.
다음으로, 트레이(80x100x320㎜)에 밀기울 약 250g을 넣고 함수율을 약 20%로 맞춘 뒤, 고압멸균하고, 최종 함수율이 약 50%가 되도록 상기 배양액 약 75㎖를 첨가하여 고상 배양하였다. 이때 고상 배양은 항온항습기에서 약 30℃, 습도 약 90%의 조건으로 약 8일간 수행하였다.
상기 고상 배양을 통해 수득한 고상배양물에 약 10배 부피의 아세트산 완충용액(pH 5.0, 50mM)을 첨가하고, 진탕배양기에서 약 10℃로 약 3시간 동안 진탕하여 혼합한 다음 원심분리 또는 막분리를 통해 균체를 제거한 추출액을 수득하였다. 이 추출액에 약 3배 부피의 주정(알코올 함량 약 95%(v/v))을 혼합한 다음 약 4℃에서 밤새 정치하여 효소 침전을 수행하였다. 침전 후 원심분리하여 상등액을 제거하고 효소 침전물에 아세트산 완충용액을 첨가하여 약 10배 농축된 조효소액(crude enzyme solution)을 제조하였다.
1-3. 산 및 열처리
상기 1-1의 PPD 타입 조사포닌 분말 20g에 20배(v/w)의 물을 혼합하고, 구연산을 약 2%(w/v) 비율로 첨가하여 pH 약 2.0이 되도록 맞춘 다음, 약 80℃로 약 12시간 동안 열처리하였다.
1-4. 효소처리
상기 1-3에서 산 및 열처리가 완료된 반응액 400㎖에 아세트산 완충용액(pH 5.0, 50mM) 1,400㎖ 및 상기 1-2에서 제조된 조효소액 200㎖를 첨가하고 NaOH로 pH를 5.0으로 조절한 다음 약 50℃에서 48 내지 72시간 동안 진탕하여 효소 반응시켰다.
효소 반응이 완료된 후, HP20 다공성 수지 칼럼을 이용한 정제 과정을 거쳐 분말화하고, 이를 실험에 사용하였다. 구체적으로, 효소 반응이 완료된 반응액을 HP20 다공성 수지 칼럼에 통과시키고, 칼럼 부피의 약 10배 이상 부피의 증류수를 칼럼에 흘려주어 불순물 제거하고, 칼럼 부피의 약 5배 부피의 약 100% 에탄올을 흘려주어 용출액을 수득하고, 이를 분말화하였다.
실시예 2. 효소처리 다음 산 및 열처리를 적용한 희귀 진세노사이드 제조
상기 실시예 1과 같은 방법을 사용하되, 효소처리 이후에 산 및 열처리하는 순서로 희귀 진세노사이드를 제조하였다.
2-1. 효소처리
아세트산 완충용액(pH 5.0, 50mM)에 상기 실시예 1의 1-1의 PPD 타입 조사포닌 분말 및 상기 실시예 1의 1-2에서 제조된 조효소액을 첨가하고 진탕배양기에서 약 50℃에서 12 내지 15시간 동안 진탕하여 효소 반응시켰다.
이때, PPD 타입 조사포닌 분말은 반응 용액의 총 부피를 기준으로 약 10,000ppm(10㎎/㎖)의 농도가 되도록 하였고, 조효소액은 반응 용액의 총 부피를 기준으로 약 1/10의 부피가 되도록 하였다.
2-2. 산 및 열처리
상기 2-1에서 효소처리가 완료된 반응액에 구연산을 약 2%(w/v) 비율로 첨가하여 pH 약 2.0이 되도록 맞춘 다음, 약 80℃로 약 12시간 동안 열처리하였다.
산 및 열처리 반응이 완료된 후, HP20 다공성 수지 칼럼을 이용한 정제 과정을 거쳐 분말화하고, 이를 실험에 사용하였다. 구체적으로, 효소 반응이 완료된 반응액을 HP20 다공성 수지 칼럼에 통과시키고, 칼럼 부피의 약 10배 이상 부피의 증류수를 칼럼에 흘려주어 불순물 제거하고, 칼럼 부피의 약 5배 부피의 약 100% 에탄올을 흘려주어 용출액을 수득하고, 이를 분말화하였다.
실험예 1. TLC 분석
박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)를 사용하여 원료(상기 실시예 1의 1-1의 PPD 타입 조사포닌 분말), 중간 산물(상기 실시예 1의 1-3에서 산 및 열처리가 완료된 반응액) 및 최종 산물(상기 실시예 1의 1-4에서 효소처리 완료 후 정제한 분말)의 진세노사이드를 분석하였다.
원료 및 최종 산물은 메탄올에 용해하여 실험에 사용하였으며, 중간 산물은 부탄올로 추출하여 실험에 사용하였다.
TLC는 실리카겔 60F254 플레이트를 사용하였고, 클로로포름, 메탄올 및 물(65:35:10, v/v/v) 혼합액의 하층을 전개용매로 사용하였다. 전개 후, 0.2% p-아니스알데하이드(p-anisaldehyde)를 분무한 뒤 가열을 통해 발색시켜 전개된 스팟(spot)을 확인하였다. 대조군으로는 표준 진세노사이드인 Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Rg3, F2, Rk1 및 Rg5를 섞은 혼합물을 사용하였다.
이의 결과, 실시예 1의 원료에는 Rb1, Rb2, Rb3, Rc 및 Rd 등의 주요 진세노사이드가 함유되어 있고(도 2), 이의 산 및 열처리를 통해 Rg3, Rg5 및 Rk1 등의 진세노사이드가 생성되고(도 2), 산 및 열처리 이후의 효소처리를 통해 Rh2, Rh3 및 Rk2가 생성되는 것으로 나타났다(도 3).
실험예 2. HPLC 분석
고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 사용하여 원료(상기 실시예 1의 1-1의 PPD 타입 조사포닌 분말), 중간 산물(상기 실시예 1의 1-3에서 산 및 열처리가 완료된 반응액; 및 상기 실시예 2의 2-1에서 효소처리가 완료된 반응액) 및 최종 산물(상기 실시예 1의 1-4에서 효소처리 완료 후 정제한 분말; 및 상기 실시예 2의 2-2에서 산 및 열처리 완료 후 정제한 분말)의 진세노사이드를 분석하였다.
원료 및 최종 산물은 메탄올에 용해하여 실험에 사용하였으며, 중간 산물은 메탄올로 희석하여 실험에 사용하였다. 실험 전 각 시료는 멤브레인 필터(0.45㎛)로 여과하여 사용하였다.
칼럼은 Prodigy ODS(2) C18 칼럼(5㎛, 150x4.6㎜ i.d.; Phenomenex)을 사용하였고, 이동상은 아세토니트릴(acetonitrile)과 증류수를 사용하였으며, 시료 주입량은 10㎕으로, 유속은 1㎖/분, 온도는 30℃로 하여 UV 검출기로 203㎚에서 흡광도를 측정하였다. 보다 구체적인 HPLC 분석 조건은 다음 표 1과 같다.
이의 결과, 실시예 1의 경우, 원료에는 Rb1, Rb2, Rb3, Rc 및 Rd 등의 주요 진세노사이드가 함유되어 있고(도 4의 A), 이의 산 및 열처리를 통해 Rg3, Rg5 및 Rk1 등의 진세노사이드가 생성되고(도 4의 B), 산 및 열처리 이후의 효소처리를 통해 Rh2, Rh3 및 Rk2가 생성되는 것으로 나타났고(도 4의 C), 실시예 2의 경우, 원료에는 Rb1, Rb2, Rb3, Rc 및 Rd 등의 주요 진세노사이드가 함유되어 있고(도 5의 A), 이의 효소처리를 통해 진세노사이드 F2가 생성되고(도 5의 B), 효소처리 이후의 산 및 열처리를 통해 Rh2, Rh3 및 Rk2가 생성되는 것으로 나타났다(도 5의 C).

Claims (4)

  1. Rb1, Rb2, Rb3, Rc 및 Rd로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 진세노사이드를 포함하는 원료를 준비하는 단계;
    상기 원료에 산을 첨가하여 pH 2.0 내지 2.3으로 조절하고 75 내지 85℃로 12 내지 24시간 동안 열처리하는 산 및 열처리 단계; 및
    상기 산 및 열처리 단계에서 생성되는 중간 산물에 아스퍼질러스 나이거 C2-2(Aspergillus niger C2-2) 균주의 배양물로부터 수득되는 조효소액을 첨가하고 45 내지 55℃에서 2 내지 5일 동안 반응시키는 효소처리 단계
    를 포함하는 Rh2, Rh3 및 Rk2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 진세노사이드 제조 방법.
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  3. 삭제
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