KR102588988B1 - 병풀 추출물로 발아된 호랑이콩 추출물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항염 효과 및 피부 장벽 관련 인자의 발현 증가 효과가 우수한 병풀 추출물로 발아된 호랑이콩 추출물 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 항염 효과 및 피부 장벽 관련 인자의 발현 증가 효과가 우수한 병풀 추출물로 발아된 호랑이콩 추출물 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
인간의 피부, 특히 표피의 각질층은 혹독한 날씨나 유해 환경 등 각종 외부 스트레스로부터 인체를 보호하는 동시에, 인체 내 수분이 증발하는 것을 차단하여 피부가 건조해지는 것을 방지해준다. 특히, 각질층을 구성하는 성분 중 세라마이드와 같은 지질 성분은 각질층 내에서 층상 구조로 배열되고, 그 사이에 수분을 유지할 수 있어, 피부 장벽을 튼튼하게 유지시키는 물질로 알려져 있다. 노화에 의해 세라마이드의 생산이 감소될 경우, 각질층의 보호 장벽 기능이 감소되어 피부가 건조되기 쉽고, 그 결과 피부의 노화가 더욱 가속화될 뿐 아니라 아토피 피부염이나 건선 등의 피부 트러블이 유발되기도 한다.
이러한 문제를 해결하기 위해, 항염 효과가 우수하고 피부 장벽 관련 인자의 발현을 증가시키는 물질을 포함하는 다양한 화장료가 제안되고 있다. 일례로, 대한민국 등록특허 제10-2066384호는 세라마이드, 콜레스테롤, 지방산, 아카시아 꽃가루 추출물 및 식물성 오일 불검화물을 포함하는 피부 장벽 개선 및 필라그린 활성 효과가 우수한 화장료 조성물을 개시하고 있다. 그러나, 종래의 화장료 조성물은 충분한 항염 효과 및 피부 장벽 개선 효과를 제공하지 못하고 있다.
이에, 낮은 세포 독성을 나타내는 동시에, 항염 효과 및 피부 장벽 관련 인자의 발현 증가 효과가 우수한 물질 및 이를 포함하는 화장료가 요구된다.
본 발명은 낮은 세포 독성을 나타내는 동시에, 항염 효과 및 피부 장벽 관련 인자의 발현 증가 효과가 우수한 물질 및 이를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 병풀 추출물로 발아된 호랑이콩 추출물 및 이를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 병풀 추출물로 발아된 호랑이콩 추출물은 낮은 세포 독성을 나타내는 동시에, 우수한 항염 효과 및 피부 장벽 관련 인자의 발현 증가 효과를 제공한다.
도 1은 제조예 1-4의 호랑이콩을 촬영한 사진이다.
도 2는 제조예 1-4의 호랑이콩 추출물에 대한 HPLC 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 제조예 1, 2, 4의 호랑이콩 추출물의 항염 세포 독성 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 제조예 1, 2, 4의 호랑이콩 추출물의 항염 효능 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 제조예 1, 2, 4의 호랑이콩 추출물의 장벽 세포 독성 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 제조예 1, 2, 4의 호랑이콩 추출물의 장벽 효능 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 제조예 1-4의 호랑이콩 추출물에 대한 HPLC 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 제조예 1, 2, 4의 호랑이콩 추출물의 항염 세포 독성 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 제조예 1, 2, 4의 호랑이콩 추출물의 항염 효능 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 제조예 1, 2, 4의 호랑이콩 추출물의 장벽 세포 독성 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 제조예 1, 2, 4의 호랑이콩 추출물의 장벽 효능 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명에 대하여 설명한다. 그러나, 하기 내용에 의해서만 한정되는 것은 아니며, 필요에 따라 각 구성요소가 다양하게 변형되거나 선택적으로 혼용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 사상 및 기술범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
<호랑이콩 추출물>
본 발명은 병풀 추출물로 발아된 호랑이콩 추출물을 제공한다. 본 발명에 따른 병풀 추출물로 발아된 호랑이콩 추출물은 낮은 세포 독성을 나타내는 동시에, 우수한 항염 효과 및 피부 장벽 관련 인자의 발현 증가 효과를 제공한다.
본 발명의 호랑이콩 추출물은 병풀을 추출하고, 상기 병풀 추출물로 호랑이콩을 발아시키고, 상기 발아된 호랑이콩을 추출하여 제조될 수 있다.
상기 병풀 추출에 사용되는 추출 용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 에틸에테르, 헥산 및 1,3-부틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다. 일례로, 상기 추출 용매는 물 또는 에탄올, 예를 들어 60 내지 80 %(v/v) 에탄올일 수 있다.
상기 추출은 고압멸균기(autoclave)를 사용하여 수행될 수 있다. 일례로, 병풀에 추출 용매를 가한 후, 고압멸균기에서 110 내지 130 ℃에서 10 내지 20분 동안 추출할 수 있다. 전술한 조건으로 추출하는 경우, 병풀 성분을 높은 효율로 추출할 수 있다. 상기 추출은 1 내지 5회, 예를 들어, 3회 수행될 수 있다.
상기 추출 후, 필요에 따라, 상기 추출물을 여과하고, 농축하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여과 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 0.2 내지 150 ㎛, 예를 들어 0.4 내지 0.5 ㎛ 필터(filter)를 사용하여 여과할 수 있다. 농축 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 감압 농축기를 사용하여 농축할 수 있다.
상기 제조된 병풀 추출물로 호랑이콩을 발아시킨다. 일례로, 솜 위에 호랑이콩을 올리고 얇은 솜으로 그 위를 덮고, 전술한 병풀 추출물로 솜을 충분히 적신 후 배양할 수 있다. 배양은 5 내지 10일, 예를 들어 1주일간 수행될 수 있다. 필요 시, 배양 중 호랑이콩을 덮은 솜이 충분히 적셔지도록, 솜 위에 병풀 추출물을 수회 추가할 수 있다.
병풀 추출물의 농도는 0.1 % 이상 2 % 미만, 예를 들어 0.7 내지 1.3 %일 수 있다. 병풀 추출물의 농도가 전술한 범위 미만인 경우 항염 효과 및 피부 장벽 관련 인자의 발현 증가 효과가 충분히 발휘되지 않을 수 있고, 전술한 범위를 초과하는 경우 호랑이콩이 발아되지 않을 수 있다.
상기 발아된 호랑이콩을 추출한다. 일례로, 상기 발아된 호랑이콩을 건조하고, 분쇄한 후 추출할 수 있다. 예를 들어, 발아된 호랑이콩을 50 ℃에서 48시간 건조한 후, 막자 사발로 분쇄한 후 추출할 수 있다.
상기 호랑이콩 추출에 사용되는 추출 용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 에틸에테르, 헥산 및 1,3-부틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다. 일례로, 상기 추출 용매는 물 또는 에탄올, 예를 들어 60 내지 80 %(v/v) 에탄올일 수 있다.
호랑이콩과 추출 용매의 혼합비는 1 : 1 내지 30 중량비, 예를 들어 1 : 1 내지 10 중량비일 수 있다. 호랑이콩에 대한 추출 용매의 혼합비가 전술한 범위 미만인 경우 호랑이콩 성분이 충분히 추출되지 않을 수 있고, 전술한 범위를 초과하는 경우 사용되는 용매 량에 비해 적은 수율을 얻게 되어 비효율적이다.
상기 추출은 20 내지 40 ℃, 예를 들어 상온에서, 1 내지 5일, 예를 들어 2 내지 4일동안 인큐베이션(incubation)하여 수행될 수 있다. 전술한 조건으로 추출하는 경우, 호랑이콩 성분을 높은 효율로 추출할 수 있다. 상기 추출은 1 내지 5회, 예를 들어, 3회 수행될 수 있다.
상기 추출 후, 필요에 따라, 상기 추출물을 여과하고, 농축하고, 동결 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여과 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 0.2 내지 150 ㎛, 예를 들어 0.4 내지 0.5 ㎛ 필터(filter)를 사용하여 여과할 수 있다. 농축 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 감압농축기를 사용하여 농축할 수 있다.
<화장료 조성물>
본 발명의 화장료 조성물은 전술한 호랑이콩 추출물을 포함한다. 화장료 조성물 총 중량을 기준으로, 상기 호랑이콩 추출물을 0.001 내지 20 중량%, 예를 들어 0.005 내지 1 중량% 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 탈크, 색소 등을 더 포함할 수 있고, 산화 방지제, 방부제 등 해당 기술분야에서 통상 사용되는 첨가제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 해당 기술분야에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 스프레이 등의 제형으로 제조될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 어떠한 의미로든 본 발명의 범위가 실시예로 한정되는 것은 아니다.
[제조예 1: 호랑이콩 추출물의 제조]
병풀 2 g에 증류수 200 ml를 가하고 고압멸균기(autoclave)를 이용하여 121 ℃에서 15분 동안 추출하여 1 % 농도의 병풀 추출물을 제조하였다.
호랑이콩(평균 무게: 0.75 g) 3 알을 솜 위에 올리고, 얇은 솜으로 그 위를 덮은 후, 상기 제조된 멸균 병풀 추출물을 1일차에 15 ml, 2일차부터 매일 5 ml씩 솜 위에 부어 일주일 동안 배양하여(즉, 7일간 총 45 ml로 처리), 호랑이콩을 발아시켰다.
상기 발아된 호랑이콩을 50 ℃에서 48 시간 건조한 후, 막자 사발로 분쇄하였다. 상기 분쇄된 호랑이콩을 70 % 에탄올(w/w, 1:10)로 4일동안 추출한 후, 농축, 동결건조하여 제조예 1의 호랑이콩 추출물 파우더를 제조하였다.
[제조예 2: 호랑이콩 추출물의 제조]
병풀 4 g을 사용하여 제조된 2 % 농도의 병풀 추출물을 사용한 것을 제외하고는, 제조예 1과 동일한 방법으로 제조예 2의 호랑이콩 추출물 파우더를 제조하였다.
[제조예 3: 호랑이콩 추출물의 제조]
병풀 10 g을 사용하여 제조된 5 % 농도의 병풀 추출물을 사용한 것을 제외하고는, 제조예 1과 동일한 방법으로 제조예 3의 호랑이콩 추출물 파우더를 제조하였다.
[제조예 4: 호랑이콩 추출물의 제조]
병풀 추출물로 발아시키지 않은 일반 호랑이콩을 사용한 것을 제외하고는, 제조예 1과 동일한 방법으로 제조예 4의 호랑이콩 추출물 파우더를 제조하였다.
[실험예 1: 외관 관찰]
상기 제조예 1-4의 호랑이콩을 관찰하였고, 외관을 촬영한 사진을 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, 1 % 농도의 병풀 추출물로 발아된 제조예 1의 호랑이콩은 발아시키지 않은 제조예 4의 호랑이콩과 달리 겉 껍질이 갈색으로 변화하였다. 반면, 2 % 농도의 병풀 추출물 및 5 % 농도의 병풀 추출물로 각각 발아시킨 제조예 2, 3의 호랑이콩은 발아되지 않았다.
[실험예 2: 성분 분석]
제조예 1-4의 호랑이콩 추출물 파우더를 각각 사용하여 하기 조건으로 HPLC 측정하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 1 % 농도의 병풀 추출물로 발아된 제조예 1의 호랑이콩 추출물은 발아시키지 않은 제조예 4의 호랑이콩 추출물 대비, 유효 성분(Peak 1, 2, 3, 4)의 총 면적이 1.6배 증가함을 확인할 수 있다. 반면, 2 % 농도의 병풀 추출물 및 5 % 농도의 병풀 추출물로 각각 처리된 제조예 2, 3의 호랑이콩 추출물의 경우 제조예 4의 호랑이콩 추출물보다도 유효 성분(Peak 1, 2, 3, 4)의 총 면적이 작게 나타났다.
<HPLC 분석 조건>
Column: Phenomenon Luna C18 250 x 4.6 mm
Sol A: 0.1 % phosphoric acid in 3DW
Sol B: ACN
PDA: 210 nm, 300 nm
Injection volume: 10 ul
Flow rate: 1 mL/min
Oven: 35 ℃
샘플: 5,000 ppm으로 희석
[실험예 3: 항염 세포 독성 평가, Raw264.7 MTT assay]
호랑이콩 추출물의 세포 독성을 확인하기 위해, MTT assay를 실시하였다. 구체적으로 RAW264.7 세포주를 96 well plate에 well 당 적정 농도로 100 μL 분주하고 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터 조건 하에 24 시간 배양하였다. 배양된 세포에 샘플을 농도 별로 처리한 후 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터 조건 하에 24 시간 배양하였다. 배양 완료 3시간 전 5 mg/mL MTT 10 μL 처리 후 3 시간 동일 조건으로 배양하였다. 배양 완료 후 배양액을 버리고 DMSO 100 μL 분주 후 상온에서 10 분 교반하였다. Microplate reader(Thermo, UV/Vis)를 이용하여 570 nm 에서 흡광도 측정하였다. 하기 식으로 세포 생존율을 계산하였고, 세포 생존율이 80 % 이상인 경우, 세포 독성이 없는 것으로 판단하였다.
세포 생존율(%) = 100 X (실험군 흡광도 / 대조군 흡광도)
도 3에 나타난 바와 같이, 1 % 농도의 병풀 추출물로 발아된 제조예 1의 호랑이콩 추출물 및 2 % 농도의 병풀 추출물로 처리된 제조예 2의 호랑이콩 추출물은 각각 50 μg/mL 및 100 μg/mL 농도 이하에서 무독성임을 확인할 수 있다.
[실험예 4: 항염 효능 평가(Raw264.7 NO assay)]
호랑이콩 추출물의 항염 효능을 확인하기 위해, NO assay를 실시하였다. 구체적으로RAW264.7 세포주를 96 well plate에 well 당 적정 농도로 100 μL 분주하고 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터 조건 하에 24 시간 배양하였다. 배양된 세포에 샘플을 농도 별로 처리한 후, 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터 조건 하에 30 분 배양한 다음 리포다당류(Lipopolysaccharide, LPS) 1 μg/mL 적정량 처리 후 동일 조건으로 24 시간 배양하였다. 배양 완료 후 상등액을 새 96 well plate에 옮긴 후, Griess reagent system Kit(Promega)와 반응하고 Microplate reader(Thermo, UV/Vis)를 이용하여540 nm에서 흡광도 측정하였다. NO 생성량은 Sodium Nitrite standard의 추세선(y = Ax + B) 과 비교하여 NO생성량 = (처리구 흡광도 - B) / A 식으로 도출하였다. NO는 염증 반응을 유발시키므로, 억제 활성이 높게 측정될수록 항염 효능이 높은 것으로 평가될 수 있다.
도 4에 나타난 바와 같이, 1 % 농도의 병풀 추출물로 발아된 제조예 1의 호랑이콩 추출물은 발아시키지 않은 제조예 4의 호랑이콩 추출물에 비해 우수한 항염 효과를 나타내었다. 한편, 2 % 농도의 병풀 추출물로 처리된 제조예 2의 호랑이콩 추출물은 제조예 1의 호랑이콩 추출물과 동등 수준의 항염 효과를 나타내었으나, 실험예 6에서 후술하는 바와 같이 피부 장벽 효과를 나타내지 못하였다.
[실험예 5: 장벽 세포 독성 평가, HaCat MTT assay]
호랑이콩 추출물의 세포 독성을 확인하기 위해, MTT assay를 실시하였다. 구체적으로 HaCaT 세포주를 96 well plate에 well 당 적정 농도로 200 μL 분주하고 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터 조건 하에 24 시간 배양하였다. 배양된 세포에 샘플을 농도 별로 처리한 후, 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터 조건 하에 24 시간 배양하였다. 배양 완료 3시간 전 5 mg/mL MTT 20 μL 처리 후 3 시간 동일 조건으로 배양하였다. 배양 완료 후 배양액을 버리고 DMSO 150 μL 분주 후 상온에서 10 분 교반하였다. Microplate reader(Thermo, UV/Vis)를 이용하여 570 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 하기 식으로 세포 생존율을 계산하였고, 세포 생존율이 80 % 이상인 경우, 세포 독성이 없는 것으로 판단하였다.
세포 생존율(%) = 100 X (실험군 흡광도 / 대조군 흡광도)
도 5에 나타난 바와 같이, 1 % 농도의 병풀 추출물로 발아된 제조예 1의 호랑이콩 추출물 및 2 % 농도의 병풀 추출물로 처리된 제조예 2의 호랑이콩 추출물은 각각 50 μg/mL 및 25 μg/mL 농도 이하에서 무독성임을 확인할 수 있다.
[실험예 6: 장벽 효능 평가(HaCaT RT-qPCR)]
호랑이콩 추출물의 피부 장벽 효능을 확인하기 위해, RT-qPCR을 실시하였다. 구체적으로 HaCaT 세포주를 60 mm dish에 well 당 적정 농도로 4 mL 분주하고 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터에서 24 시간 배양하였다. 배양된 세포에 Serum starvation 24 시간 진행 후 샘플을 농도 별로 처리하고, 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터 조건 하에 24 시간 배양하였다. 배양 완료 후 Trizol(Invitrogen) 1 mL 처리하여 RNA 추출하고, 클로로포름, 2-프로판올, 75% EtOH 및 원심분리기를 사용하여 RNA 응축 및 워싱 진행하였다. RNA 건조 후 Nuclease free water를 적정량 넣고 Nano drop(ALLSHENG)을 이용하여 정량하였다. 각 RNA를 동일 농도가 되도록 제조한 후, cDNA Synthesis Kit(PhileKorea)를 이용하여Reverse transcription 하였다. 합성된 cDNA 및 Primer(LOR Oligonucleotide), SYBR green, Nuclease free wate를 적정 비율로 혼합한 후 Real time PCR 장비(Applied Biosystem, Quantstudio 5)를 사용하여 RT-qPCR 실행하였다. PCR 결과 분석은 △△Ct값을 산출하여 유전자의 발현을 비교하였다. 효능 평가 시 사용한 인자(LOR)는 장벽 기능을 보유한 인자이므로, 음성 대조군 대비 샘플의 mRNA 발현이 높게 측정될수록 장벽 효능이 높은 것으로 평가될 수 있다.
도 6에 나타난 바와 같이, 1 % 농도의 병풀 추출물로 발아된 제조예 1의 호랑이콩 추출물은 우수한 장벽 효과를 나타내었다. 반면, 2 % 농도의 병풀 추출물로 처리된 제조예 2 및 발아시키지 않은 제조예 4의 호랑이콩 추출물은 장벽 효과를 나타내지 못하였다.
Claims (5)
- 병풀 추출물로 발아된 호랑이콩 추출물로서,
상기 병풀 추출물의 농도가 0.1 % 이상 2 % 미만인 호랑이콩 추출물. - 삭제
- 제1항에 있어서, 호랑이콩 발아는 5 내지 10일동안 배양하여 수행되는 호랑이콩 추출물.
- 제1항 또는 제3항의 호랑이콩 추출물을 포함하는 화장료 조성물.
- 제4항에 있어서, 항염 효과 및 피부 장벽 관련 인자의 발현 증가 효과가 우수한 화장료 조성물.
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| KR1020230041818A KR102588988B1 (ko) | 2023-03-30 | 2023-03-30 | 병풀 추출물로 발아된 호랑이콩 추출물 |
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Citations (3)
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| KR20080018624A (ko) * | 2006-08-25 | 2008-02-28 | 제노마인(주) | 유기 셀레늄이 강화된 발아콩 추출물의 용도 |
| KR102066384B1 (ko) | 2018-09-27 | 2020-01-15 | 주식회사 고운세상코스메틱 | 피부장벽 개선 및 필라그린 활성 효과가 우수한 화장료 조성물 |
| KR102495397B1 (ko) * | 2022-03-14 | 2023-02-21 | 코스맥스 주식회사 | 당 확산 추출공법으로 추출한 생병풀 추출물을 포함하는 항염, 장벽 효능을 가지는 화장료 조성물 및 이의 용도 |
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