KR102057091B1

KR102057091B1 - Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제용 피이지프리 가용화제, 이를 포함하는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제, 이를 포함하는 화장품 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102057091B1
Application number: KR1020190040259A
Authority: KR
Inventors: 이충근
Original assignee: 이충근
Priority date: 2019-04-05
Filing date: 2019-04-05
Publication date: 2019-12-18

Abstract

본 발명은 활성산소 소거 활성도가 높을 뿐만 아니라, NO 활성 억제 및 피부 미백 효과가 있는 Nrf2 활성화 복합제를 이용하여 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제시 사용되는 가용화제, 이를 이용하여 제조한 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제, 화장품, 세럼 타입(마스크팩 포함)의 화장품 및 이를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 피부 표피층 내 분포되어 있는 Nrf2의 활성을 도와서 피부 내 활성산소 제거성능을 크게 향상시켜서 피부탄력향상 및 항산화 효과가 우수하고, 피부 염증 예방 및 피부 미백 효과가 우수한 화장품을 제공할 수 있는 발명에 관한 것이다.

Description

Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제용 피이지프리 가용화제, 이를 포함하는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제, 이를 포함하는 화장품 및 이의 제조방법{PEG free solubilizer for Nrf2 induction revitalizing agent, Nrf2 induction revitalizing agent, Revitalizing cosmetics containing the same and Manufacturing method thereof}

본 발명은 활성산소 소거 활성도가 높으면서 피부 미백 효과가 있는 Nrf2 활성화 복합제를 포함하는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제를 제조하는데 사용되는 PEG 프리 가용화제 및 이를 이용하여 제조한 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제,화장품, 세럼 타입의 화장품(마스크팩 포함), 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

선복화는 뿌리줄기로서 원반상, 원주상 등으로 그 형태가 고르지 않으며, 원반상의 것은 지름 3 ~ 10cm, 두께 0.5 ~ 3cm이고 가는 것은 거의 원주상이며, 지름 1 ~ 3cm, 길이 5 ~ 8cm이나 때로 세로로 쪼개진 것도 있다. 횡단면은 회갈색 내지 황갈색이고, 형성층 부근은 갈색을 띤 환층이 명확한 특징이 있다. 그리고, 측면은 어두운 갈색이며, 가로 주름이 있고 껍질을 벗긴 것은 황갈색이며, 목부의 지름은 피부의 약 3 ~ 4배이고, 바깥 면은 매우 단단하나 섬유성이 아니다. 그리고, 특유한 냄새가 약간 있고 맛은 떫고 쓰며 씹으면 가는 모래를 씹는 것 같고 침을 노랗게 물들이는 특징이 있는 약재이다. 이러한 선복화의 추출물을 이용한 당뇨병 예방, 치료용 조성물(대한민국 공개번호 2005-0003669호), 식물병해 방제 활성제(대한민국 공개번호 2010-0048351호), 변비치료(대한민국 등록번호 1286467호) 등으로 이용된 기술이 공지된 바 있으나, 선복화 추출물을 이용한 피부개선제에 대한 기술은 공지된 바가 없다.

활성산소는 정상적인 인체의 대사과정에서 끊임없이 만들어지는 물질로, 통상 우리가 호흡하는 산소의 2 ~ 5% 정도는 활성산소로 바뀐다. 이러한 활성산소가 위험한 이유는 강력한 산화작용 때문이다. 몸 안의 과량의 유해활성 산소는세포와 단백질, DNA를 손상시켜 세포구조나 기능, 신호전달체계에 이상을 일으키게 되어 최종적으로는 체내에서 염증을 일으키거나 노화를 유도하기도 한다. 이러한 활성산소의 생성 원인 중 하나인 태양의 자외선은 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 유발하여 홍반, 수종, 자외선화상, 광노화 및 피부암 같은 질병을 일으킨다.

과산화물 음이온(Superoxide anion,O₂·^-), H₂O₂(hydrogen peroxide), 그리고 ·OH(hydroxy radical) 등을 포함하는 ROS는 호흡 및 대사과정을 통해 지속적으로 생성되는 것으로, 체내에서는 SOD(superoxide dismutase), Gpxes(glutathione peroxidase), 카타라제(catalase)와 같은 효소를 이용하여 ROS에 의한 손상을 막는다. 그러나, 태양 광선에 의한 과량의 ROS 발생은 생체 내의 항산화적 방어 능력을 초과하게 되어 산화적 스트레스가 발생한다. 즉, DNA, 세포막 및 단백질 등과 반응하여 세포나 조직에 손상을 유발하고, 이는 각종 염증질환, 파킨슨병, 광노화, 암 발생 등을 촉진하는 것으로 알려져 있다.

따라서, 피부의 표피층에 분포하고 있는 Nrf2는 인체 내 및 외부로부터 발생한 활성산소 제거에 작용하는 전사인자인데, 이를 활성화시키면 피부 노화, 피부 세포, 피부 조직의 손상을 방지할 수 있다.

[선행문헌]

[특허문헌]

대한민국 등록특허번호 10-1857526호(공고일 2018.05.14.)

본 발명자들은 끊임없이 연구한 결과, 선복화 추출물이 피부 노화를 유발시키는 활성산소를 제거하는 Nrf2의 활성을 촉진시킴으로서, 피부를 보호하고 개선할 수 있는데, 상기 선복화 추출물과 함께 담배잎산말 추출물의 발효물 및 특정 화합물을 혼합하여 사용하면 Nrf2 활성 촉진 효과가 크게 증가하면서 NO 생성 억제 및 피부 미백 효과도 있음을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다. 즉, 본 발명은 선복화 추출물 등 3종 물질을 유효성분으로 포함하는 Nrf2 활성화 복합제, 이를 포함하는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제, 이를 이용한 화장품, 세럼(마스크팩 포함), 이를 제조하는 방법을 제공하고자 한다.

또한, 상기 Nrf2 활성화 복합제를 이용하여 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제 제조시, 유상액, 수상액 및 Nrf2 활성화 복합제간 가용화가 잘 되지 않는 문제점이 있는데, 이에 특정 가용화제를 사용하면 가용화가 잘 되어 효과가 우수한 rf2 인덕션 리바이탈라이징 제제가 가능함을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명은 선복화 추출물, 담배잎산말(Desmarestia tabacoides) 추출물 및 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 Nrf2의 활성화 복합제를 제공하고자 한다.

[화학식 1]

화학식 1의 A는 C₂ ~ C₄의 알킬렌기이고, R¹ 및 R² 각각은 독립적으로 수소원자, -OH, -COOH 또는 -COH이다.

또한, 본 발명은 상기 Nrf2의 활성화 복합제를 포함하는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 Nrf2의 활성화 복합제를 이용한 rf2 인덕션 리바이탈라이징 제제의 제조에 사용되는 PEG 프리(free) 가용화제를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 포함하는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제를 포함하는 화장품, 바람직하게는 세럼 타입의 화장품(마스크팩 포함)을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제를 제조하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제는 피부 표피층 내 분포되어 있는 Nrf2의 활성을 도와서 피부 내 활성산소 제거성능을 크게 향상시킴으로써, 피부탄력향상과 뛰어난 항산화 효과가 우수하여, 거칠고 칙칙한 피부의 생기를 되찾아 피부에 은은한 광택과 윤기를 부여할 수 있으며, 또한 피부 세포 내 NO 활성 억제 및 피부 미백 효과도 우수하며, 본 발명의 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제를 도입한 화장품은 사용시간에 구애 없이 피부에 언제든지 적용이 가능하다.

도 1은 실험예 1의 루시퍼라아제 활성도 측정 결과이다.
도 2는 실험예 2의 웨스턴 블랏 측정 결과이다.
도 3은 담배잎산말 추출물의 Raw264.7세포에 대한 산화적 스트레스 방어 측정 결과이다.
도 4는 실험예 7에서 실시한 양성대조군 Trolox 농도별 RFU 변화 그래프이다.
도 5는 실험예 7에서 실시한 양성대조군 Trolox 농도별 netAUC 스탠다드 커브 그래프이다.

이하, 본 발명에 대하여 더욱 자세하게 설명을 하겠다.

본 발명의 Nrf2의 활성화 복합제는 선복화 추출물을 포함하며, 이는 정제수 100 중량부에 대하여 선복화 4 ~ 10 중량부를 혼합하여 원료를 준비하는 단계; 상기 원료를 90 ~ 100℃ 하에서, 4 ~ 8시간 동안 열수추출을 수행하여 추출하여 추출물을 얻는 단계; 상기 추출물을 1차 필터링(filtering)하여 얻은 1차 여과액을 제조하는 단계; 상기 1차 여과액에 1,2-헥산디올 및 에틸헥실글리세린을 첨가 및 교반한 후, 2차 필터링하여 선복화 추출물을 제조하는 단계;의 공정을 수행하여 제조한 것을 사용할 수 있다.

상기 선복화 추출물 제조시, 상기 1차 필터링은 평균기공 20 ~ 30㎛ 필터막으로 필터링을 수행할 수 있고, 바람직하게는 평균기공 23 ~ 27㎛ 인 필터막으로 필터링을 수행할 수 있다.

그리고, 상기 2차 필터링은 평균기공 8 ~ 15㎛ 필터막으로, 바람직하게는 8 ~ 12㎛ 필터막으로 필터링을 수행할 수 있다.

선복화 추출물의 루시퍼라아제 활성 효과, 활성산소 소거 활성 효과, 산화적 스트레스 방어 효과는 등록특허번호 10-1857526호에 개시되어 있다.

본 발명의 Nrf2의 활성화 복합제는 대한민국 등록특허번호 10-1857526호의 선복화 추출물을 유효성분으로 하는 Nrf2 활성화제의 Nrf2 활성화 효과를 증대시키면서, NO 활성 억제 및 피부 미백 효과를 부여한 복합제에 관한 것으로서, 하기 2종의 유효성분을 더 포함한다.

본 발명의 Nrf2의 활성화 복합제는 담배잎산말 추출물을 포함하며, 선복화 추출물의 Nrf2의 활성화를 증대시키면서, 피부 내 NO 활성 억제 효과를 부여하는 역할을 한다. 담배잎산말은 학명이 Desmarestia tabacoides인 해조류로서, 일명 Tabakogusa로도 불리는 해조류이다. 일본, 국내 방어진, 추자도, 제주도 등지에 분포하며, 형태적 특징은 몸이 매우 큰 엽상이며, 짧은 줄기가 있고, 넓은 난원형의 엽편을 가진다. 잎은 대체로 엇비슷하게 째어지고 단엽이며 중륵이 있다. 엽편은 열편을 펼치면 큰 난원형으로 되고 담배잎과도 비슷하다. 중륵은 하부에서는 좀 융기하나 차차 윗쪽으로 갈수록 희미하게 되고 대생하는 측맥이 있다. 측맥은 거의 그 기점에서 다수의 작은 세맥으로 된다. 담배잎산말의 색은 밤색이며 공기 중에서는 청록색으로 변하는 특징이 있다. Desmarestia에 속하는 해조류들은 산을 함유하고 있으며, Desmarestia에 속하는 해조류 추출액에는 능금산, 황산염 구연산 등이 함유되어 있는 것으로 알려져 있고 이들 산의 상승작용에 의해 산성도가 높은 걸로 알려져 있다.

본 발명에서 상기 담배잎산말 추출물은 정제수 100 중량부에 대하여 담배잎산말 20 ~ 30 중량부를, 바람직하게는 22 ~ 30 중량부를, 더욱 바람직하게는 22 ~ 28 중량부를, 더 더욱 바람직하게는 24 ~ 26.5 중량부를 혼합하여 원료를 준비하는 단계; 상기 원료를 110℃ 하에서, 4 ~ 6시간 동안 증류추출을 수행하여 추출하여 추출물을 얻는 단계; 상기 추출물을 1차 필터링(filtering)하여 얻은 1차 여과액을 제조하는 단계; 상기 1차 여과액에 1,2-헥산디올을 첨가 및 교반한 후, 2차 필터링하여 담배잎산말 추출물을 제조하는 단계;의 공정을 수행하여 제조한 것을 사용할 수 있다.

상기 담배잎산말 추출물 제조시, 상기 1차 필터링은 평균기공 20 ~ 30㎛ 필터막으로 필터링을 수행할 수 있고, 바람직하게는 평균기공 23 ~ 27㎛ 인 필터막으로 필터링을 수행할 수 있다.

이렇게 제조한 본 발명의 담배잎산말 추출물은 농도가 30 중량% 이하로 포함하는 수용액일 때, RAW264.7 세포 생존율이 100% 이상일 수 있으며, 바람직하게는 담배잎산말 추출물을 20 ~ 30 중량%로 포함할 때, RAW264.7 세포 생존율이 99.8 ~ 105%일 수 있다.

또한, 본 발명의 담배잎산말 추출물을 200ppm 이하로 포함할 때, RAW264.7 세포 생존율이 100% 이상일 수 있다.

또한, 본 발명의 담배잎산말 추출물의 농도가 10 ~ 200ppm일 때, 하기 수학식 1에 의거하여 측정시, RAW264.7 세포에서의 일산화질소 생성 억제율이 10 ~ 45%일 수 있으며, 바람직하게는 RAW264.7 세포에서의 일산화질소 생성 억제율이 25 ~ 45%일 수 있다.

[수학식 1]

NO 생성 억제율(%) = (A-B)/Aⅹ100%

상기 수학식 1에서 A는 NO 활성 억제제 내 담배잎산말 추출물 농도가 0ppm일 때 RAW264.7 세포에서의 NO 생성량(100%)이고, B는 NO 활성 억제제 내 담배잎산말 추출물의 특정 농도에서의 RAW264.7 세포에서의 NO 생성량(%) 측정 값이다.

담배잎산말 추출물을 포함하는 본 발명의 Nrf2 활성화 복합제는 iNOS(유도형 NO synthas), COX-2(cyclooxygenase-2), 및/또는 인터류킨수용체인 IL2, IL6의 활성을 억제하여, NO 활성억제 효과 및/또는 항염 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 Nrf2의 활성화 복합제는 피부 미백 효과 부여와 함께 선복화 추출물의 Nrf2 활성 효과 증대를 위해 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1의 A는 C₂ ~ C₄의 알킬렌기이고, 바람직하게는 C₂ ~ C₄의 알킬렌기, 더욱 바람직하게는 에틸렌기이다. 또한, 화학식 1의 R¹ 및 R² 각각은 독립적으로 수소원자, -OH, -COOH 또는 -COH이며, 바람직하게는 R¹ 및 R² 각각은 독립적으로 -OH, 또는 -COOH이고, 더욱 바람직하게는 R¹ 및 R²은 -OH이다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 90 ~ 95 부피% 농도의 에탄올 수용액 100 중량부에 대하여, 호장근 뿌리 5 ~ 10 중량부를 혼합한 후, 5 ~ 7일간 20 ~ 35℃, 바람직하게는 6 ~ 7일간 20 ~ 30℃ 하에서 환류 냉각 추출을 수행한 후, 냉각 추출물을 감압 농축 및 건조하여 조출물을 제조하는 1 단계; 물 100 중량부에 대하여, 상기 조추출물 3 ~ 10 중량부를, 바람직하게는 4 ~ 8 중량부를 혼합하여 혼합용액을 제조한 후, 혼합용액에 상기 물 100 중량부에 대하여 메틸렌클로라이드 80 ~ 120 중량부를, 바람직하게는 90 ~ 105 중량부를 투입한 다음 진탕 추출 및 물층과 유기 용매층으로 분획한 후, 유기 용매층을 제거하여 물층의 분획용액을 수득하는 2 단계; 상기 분획용액과 에틸 아세테이트를 1 : 8 ~ 10 부피비로 혼합한 후, 진탕 추출하여 분획하여 유기용매층을 감압 농축하여 에틸아세테이트 추출물을 수득하는 3 단계; 상기 에틸아세테이트 추출물을 실리카겔이 충진된 컬럼에서 클로로포름 및 메탄올을 5 ~ 20 : 1 부피비로, 바람직하게는 15 ~ 16 : 1 부피비로 포함하는 혼합 용매로 분획하여 수득한 5개의 분획물을 수득하는 4 단계; 및 4 단계의 3번째 분획물을 컬럼을 사용하여 세미-프렙(semi-prep) 분리하여 5개의 분획물을 수득한 후, 이를 메탄올을 재결정시키는 5 단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조할 수 있다.

4 단계의 수득한 분획물은 5개의 분획물 중 3번째 분획물을 5 단계에서 럼을 사용하여 세미-프렙(semi-prep) 분리할 수 있으며, 5 단계의 메탄올 재결정은 세미-프렙 분리하여 얻은 5개의 분획물 중 2번째 분획물을 메탄올로 재결정시킨 것일 수 있다.

본 발명의 Nrf2 활성화 복합제는 선복화 추출물, 담배잎산말 추출물 및 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 1 : 0.8 ~ 2.0 : 0.05 ~ 0.2 중량비로 중량비로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 1 : 0.8 ~ 1.5 : 0.08 ~ 0.15 중량비로 포함하는 것이 피부 내 Nrf2 활성화, NO 활성 억제 및 미백 효과를 적절하게 발휘하는 측면에서 유리하다.

다음으로, 본 발명의 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제는 상기 선복화 추출물, 상기 담배잎산말 추출물 및 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 Nrf2 활성화 복합제를 이용하며, 수상액; 유상액; 상기 Nrf2 활성화 복합제; 향료; 및 정제수;를 포함한다. 이때, 상기 Nrf2 활성화 복합제는 앞서 설명한 상기 선복화 추출물, 상기 담배잎산말 추출물 및 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 혼합한 혼합물을 정제수와 35 ~ 50 : 50 ~ 15 부피% 비율로, 바람직하게는 40 ~ 50 : 50 ~ 60 부피% 비율로 포함할 수 있다.

그리고, 본 발명의 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제는 상기 수상액 15 ~ 20 중량%, 상기 유상액 18 ~ 25 중량%, 상기 Nrf2의 활성화 복합제 1 ~ 10 중량%, 상기 향료 0.05 ~ 1 중량% 및 잔량의 정제수를 포함하며, 바람직하게는 상기 수상액 16 ~ 19.5 중량%, 상기 유상액 18.5 ~ 23 중량%, 상기 Nrf2의 활성화 복합제 6.0 ~ 9.0 중량%, 상기 향료 0.1 ~ 0.5 중량% 및 잔량의 정제수를 포함한다.

그리고, 상기 유상액이 18 중량% 미만이면 유분 미달로 피부 보습 유지에 문제가 있을 수 있고, 25 중량%를 초과하면 과도한 오일 성분이 함유되어 피부호흡 방해나 지성피부의 뽀루지 등의 문제를 일으킬 수 있다. 또한, Nrf2의 활성화 복합제가 1 중량% 미만이면 그 함량이 너무 적어서 활성산소 제거, NO 활성 억제 및 미백 효과를 볼 수 없을 수 있고, 10 중량%를 초과하면 과다 사용으로 인핸 다른 성분들과의 상용성이 떨어져서 제품의 질이 오히려 떨어질 수 있으며, 과다 사용으로 인한 NO 활성 억제 효과 증대가 거의 미비하므로 비경제적이다.

Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제 성분 중 상기 향료는 당업계에서 사용하는 일반적인 것을 사용할 수 있으며, 구체적인 일례를 들면, Perfume 85147, Perfume 25399 등을 사용할 수 있다.

[수상액]

본 발명의 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제 성분 중 상기 수상액은 피부컨디셔닝제, 금속이온봉쇄제, 증점제, 보습제, 점도감소제, 살균보존제 및 용제를 포함한다.

수상액 성분 중 상기 피부컨디셔닝제로는 소듐하이알루로네이트, 히알루론산, 감초가루 및 하이드롤라이트 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 히알루론산(hyaluronic acid), 감초가루 및 하이드롤라이트(hydrolite) 중에서 선택된 2종 이상을, 더욱 바람직하게는 히알루론산, 감초가루 및 하이드롤라이트를 혼합하여 사용할 수 있다. 그리고, 히알루론산, 감초가루 및 하이드롤라이트를 혼합하여 사용시 히알루론산, 감초가루 및 하이드롤라이트를 1 : 0.01 ~ 0.2 : 1 ~ 3 중량비로, 바람직하게는 하이드롤라이트를 1 : 0.02 ~ 0.15 : 1.2 ~ 2.7 중량비로 혼합하여 사용하는 것이 좋다.

수상액 성분 중 상기 금속이온봉쇄제는 제제에 함유할 수 있는 금속이온에 의해 변질을 방지하는 역할을 하는 것으로서, 그 사용량은 상기 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 0.1 ~ 2 중량부를, 바람직하게는 0.2 ~ 1.5 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 금속이온봉쇄제의 사용량이 0.1 중량부 미만이면 금속이온 봉쇄 효과가 떨어질 수 있고, 2 중량부를 초과하여 사용하면 금속이온 봉쇄 증대 효과가 없으므로 비경제적인 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다. 상기 금속이온봉쇄제는 당업계에서 사용하는 일반적인 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 디소듐이디티에이(disodium EDTA), 디포타슘이디티에이(dipotassium EDTA), 트리소듐이디티에이, 테트라소듐이디티에이 및 라이스피테이트(rice phytate) 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

다음으로, 수상액 성분 중 상기 증점제는 제제에 적절한 점성과 끈적임을 부여하여 피부 밀착성을 증가시키 역할을 하는 것으로서, 증점제 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 0.5 ~ 2 중량부를, 바람직하게는 0.5 ~ 1.7 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 잔탄검의 사용량이 0.5 중량부 미만이면 그 사용량이 너무 적어서 이를 사용하는 효과가 미비하고, 2 중량부를 초과하여 사용하면 제제의 점도가 너무 높아져서 피부에 대한 끈쩍임이 너무 증가하여 상품성이 떨어지는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다. 증점제로는 당업계에서 사용하는 일반적인 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 잔탐검, 구아하이드록시 트리모니움 클로라이드 및 하이드록시 에틸 셀룰로오스 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

다음으로, 수상액 성분 중 상기 보습제는 유상액의 수분증발차단제와 함께 피부 보습을 증대시키는 역할을 하는 것으로서, 이의 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 40 ~ 80 중량부를, 바람직하게는 42 ~ 70 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 보습제의 사용량이 40 중량부 미만이면 피부 보습 효과가 떨어질 수 있고, 80 중량부를 초과하여 사용하더라도 보습 증대 효과가 없으므로 비경제적인 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다. 그리고, 보습제로는 메틸프로판디올 및 글리세린 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

다음으로, 수상액 성분 중 상기 점도감소제는 적정 점도를 유지하여 피부와의 점착력, 피부 흡수력을 증대시키기 위해 사용하는 것으로서, 이의 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 45 ~ 90 중량부를, 바람직하게는 50 ~ 85 중량부를, 더욱 바람직하게는 52 ~ 80 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 점도감소제 사용량이 45 중량부 미만이거나 90 중량부를 초과하면 제제의 점도가 너무 높거나 낮아져서 피부와의 점착력이 너무 낮거나 끈적임이 너무 증대하여 사용감이 떨어지는 문제가 있을 수 있다. 그리고, 상기 점도감소제로는 당업계에서 사용하는 일반적인 점도감소제를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 디(C2 ~ C5 알킬렌)글라이콜을, 더욱 바람직하게는 디프로필렌글라이콜을 사용할 수 있다.

다음으로, 수상액 성분 중 상기 살균보존제는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제가 미생물 등에 의해 오염되는 것을 방지하기 위해 사용하는 것으로서 화장품 소재로서 사용이 금지되지 않은 살균보존제라면 특별히 한정 없이 사용이 가능하며, 구체적인 일례로 클로페네신 등을 사용할 수 있다. 그리고, 이의 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 2 ~ 10 중량부를, 바람직하게는 4 ~ 8 중량부를 사용할 수 있으며, 그 사용량이 2 중량부 미만이면 미생물에 의한 오염 방지 효과가 미비할 수 있고, 10 중량부를 초과하여 사용하는 것은 과도한 사용으로서 피부 트러블을 유발할 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

다음으로, 수상액 성분 중 상기 용제로는 헥산디올, 프로필렌글라이콜, 부틸렌글라이콜 및 펜틸렌 클라이콜 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 헥산디올 및 부틸렌글라이콜을 혼합하여 사용하거나, 더욱 바람직하게는 1,2-헥산디올 및 1,3-부틸렌글라이콜을 혼합하여 사용할 수 있다. 그리고, 용제 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 30 ~ 60 중량부를, 바람직하게는 35 ~ 50 중량부를 사용할 수 있으며, 30 중량부 미만으로 사용시 수상액 성분간 용해 및 혼합이 잘 되지 않을 수 있고, 60 중량부를 초과하여 사용하는 것은 비경제적이다.

[유상액]

본 발명의 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제 성분 중 상기 유상액은 수분증발차단제, 토코페릴아세테이트, 피부컨디셔닝제, 유화제, 피부유연화제, 비이온계면활성제 및 피막형성제를 포함한다.

유상액 성분 중 수분증발차단제는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제 제조 중 적정 수분 유지 및 제조된 제제를 피부에 적용시, 보습제와 함께 적정 수분 함량을 유지시키는 역할을 하는 것으로서, 당업계에서 사용하는 일반적인 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 오일(Caprylic/Capric Triglyceride oil), MCT 오일 및 스쿠알란 중에서 선택된 1종 또는 2종을 혼합하여 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 MCT 오일 및 스쿠알란을 5 ~ 10 : 1 중량비로 혼합하여 사용하는 것이 좋다.

다음으로 유상액 성분 중 상기 토코페릴아세테이트는 제제가 시간이 지남에 따라 산화하여 변질되는 것을 막는 역할을 하는 것으로서, 그 사용량은 수분증발차단제 100 중량부에 대하여, 0.1 ~ 5 중량부를, 바람직하게는 0.4 ~ 2 중량부를 사용할 수 있다. 이때, 토코페릴아세테이트 사용량이 0.1 중량부 미만이면 그 사용량이 너무 적어서 산화방지 효과를 볼 수 없을 수 있고, 그 함량이 5 중량부를 초과하면 피부에 자극을 초래하는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

다음으로 유상액 성분 중 상기 피부컨디셔닝제는 피부에 영양분을 공급하는 역할을 하는 것으로서, 쉐어지방(shea butter) 및 코코넛 오일, 마카다미아넛 오일, 호호바 오일 중에서 선택된 단종 또는 2종을 혼합하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 쉐어지방 및 코코넛 오일을 1 : 0.4 ~ 0.8 중량비로 혼합하여 사용할 수 있다. 피부컨디셔닝제의 사용량은 수분증발차단제 100 중량부에 대하여, 10 ~ 35 중량부를, 바람직하게는 13 ~ 30 중량부를 사용하는 것이 좋으며, 이때, 피부컨디셔닝제 함량이 10 중량부 미만이면 피부 영양공급 효과가 미미할 수 있는 문제가 있을 수 있고, 그 함량이 35 중량부를 초과하면 그 사용량이 너무 과하여 일정부분 피부흡수 후 피부표면에 남아 번들거리게 하는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

다음으로 유상액 성분 중 상기 유화제는 유상액 조성물들간 상용성 향상 및 유화력을 증대시키기 위한 것으로서, 당업계에서 사용하는 일반적인 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 세테아릴 글루코사이드-세테아릴 알코올(cetearyl glucoside and cetearyl alcohol), 세테아릴알코올, 글리세릴스테아레이트, 피이지-6 소르비탄스테아레이트, 피이지-20 스테아레이트, 피이지-40 스테아레이트 및 피이지-100 스테아레이트 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 세테아릴 글루코사이드-세테아릴 알코올 및 세테아릴알코올 중에서 선택된 종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 그리고, 유화제의 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 30 ~ 60 중량부를, 바람직하게는 40 ~ 55 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 유화제 사용량이 30 중량부 미만이면 유상액 간 혼합, 용해가 잘 되지 않을 수 있으며, 60 중량부를 초과하여 사용하는 것은 비경제적이다.

다음으로 유상액 성분 중 상기 피부유연화제는 거친 피부를 부드럽게 하는 역할을 하는 것으로서, 그 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 2 ~ 10 중량부를, 바람직하게는 3 ~ 7.5 중량부를 사용하는 것이 좋으며, 이때, 피부유연화제 사용량이 2 중량부 미만이면 효과가 미미 할 수 있는 문제가 있을 수 있고, 그 함량이 10 중량부를 초과하면 그 사용량이 너무 과하여 사용시 끈적거림이 심할 수 있는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다. 그리고, 피부유연화제는 하나 이상의 중간사슬 모노글리세라이드 함유한 유상제, 글리세릴카프레이트, 폴리글리세릴-2-라우레이트 및 폴리글리세릴-10-라우레이트 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 하나 이상의 중간사슬 모노글리세라이드 함유한 유상제 및 폴리글리세릴-10-라우레이트 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 그리고, 하나 이상의 중간사슬 모노글리세라이드 함유한 상기 유상제의 구체적인 일례로는 알콜라인 MCM(AKOLINE MCM) 등이 있다.

다음으로 유상액 성분 중 상기 비이온계면활성제는 유화제와 함께 조성물들에 대한 용해 보조제 역할을 하는 것으로서, 당업계에서 사용하는 일반적인 비이온 계면활성제를 사용할 수 있으며, 구체적인 일례로는 Tween 20, Tween 40 및 Tween 60 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 그리고, 비이온계면활성제의 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 7 ~ 20 중량부를, 바람직하게는 10 ~ 15 중량부를 사용할 수 있다.

다음으로, 유상액 성분 중 피막형성제는 제제가 피부에 적용 후, 외부의 불필요한 오염 물질 등으로부터 피부를 보호하는 역할을 하는 것으로서, 당업계에서 사용하는 일반적인 것을 사용할 수 있으며, 구체적인 일례로는 세피플러스 400(sepiplus 400) 등을 사용할 수 있다. 그리고, 피막형성제의 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 피막형성제 1.5 ~ 8 중량부를, 바람직하게는 2.5 ~ 7 중량부를 사용할 수 있으며, 그 사용량이 1.5 중량부 미만이면 그 사용량이 너무 적어서 이를 사용하는 효과를 볼 수 없고, 8 중량부를 초과하여 사용하면 유상액 성분 내 고형분이 발생할 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

또한, 유상액은 증점안정제를 더 포함할 수 있다. 그 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 1 ~ 10 중량부를, 바람직하게는 2 ~ 8 중량부를 사용할 수 있으며, 10 중량부를 초과하면 그 사용량이 너무 과하여 이루고자 하는 점도를 초과하여 사용하기에 불편할 수 있는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다. 그리고, 상기 증점안정화제로는 소듐폴리아크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리이소부텐, 카보머, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 50, 폴리소르베이트 60 및 폴리소르베이트 80 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 폴리아크릴레이트, 폴리이소부텐 및 폴리소르베이트 80 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

[가용화제]

본 발명의 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제 성분 중 가용화제는 PEG 프리 가용화제로서, 디움 설포석시네이트(sodium sulfosuccinate), 글리콜 및 물을 포함하는 설포석시네이트계 용액을 제조하는 1 단계; 및 상기 설포석시네이트계 용액에 폴리글리세릴계 화합물을 용해시키는 2 단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조할 수 있다.

1 단계의 상기 소디움 설포석시네이트는 하기 화학식 2로 표시되는 소디움 설포석시네이트를 사용할 수 있다.

[화학식 2]

화학식 2에서, R¹및 R²는 서로 같거나 다른 것으로서, R¹및 R²는 C4 ~ C10의 직쇄형 알킬기, C5 ~ C10의 분쇄형 알킬기 또는 알킬페닐기이며, 바람직하게는 R¹및 R²C5 ~ C8의 분쇄형 알킬기이며, 더욱 바람직하게는 2-메틸헥실기. 2-에틸헥실기 또는 2-프로필렌헥실기, 2-메틸헵틸기, 또는 2-에틸헵틸기이다.

그리고, 1 단계의 상기 글리콜은 당업계에서 일반적으로 사용하는 글리콜을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 1,3-부틸렌 글리콜, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜 및 메칠프로페인디올 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1,3-부틸렌 글리콜, 프로필렌글리콜 및 디프로필렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상을, 더 더욱 바람직하게는 디프로필렌글리콜을 사용할 수 있다.

또한, 1 단계의 상기 설포석시네이트계 용액은 상기 화학식 1로 표시되는 소디움 설포석시네이트 100 중량부에 대하여, 상기 글리콜 15 ~ 35 중량부 및 물 10 ~ 30 중량부를, 바람직하게는 글리콜 20 ~ 30 중량부 및 물 15 ~ 26 중량부를 혼합 및 교반하여 제조할 수 있다. 이때, 글리콜을 15 중량부 미만으로 사용하면 설포석시네이트계 용액의 점성이 높아지는 문제가 있을 수 있다. 그리고, 물의 사용량은 글리콜 사용량에 따른 상대적인 것으로서, 물을 10 중량부 미만으로 사용시 소디움 설포석시네이트가 잘 용해되지 않을 수 있고, 30 중량부를 초과하여 사용하면 상대적으로 글리콜 함량이 줄게 되는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내로 사용하는 것이 좋다.

2 단계는 1 단계에서 제조한 설포석시네이트계 용액에 폴리글리세릴계 화합물을 혼합 및 교반시켜서 폴리글리세릴계 화합물이 설포석시네이트계 용액에 용해된 가용화제를 제조하는 공정이다. 제조된 가용화제는 폴리글리세릴계 화합물 91 ~ 99 중량% 및 상기 설포석시네이트계 용액 1 ~ 9 중량%를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 폴리글리세릴계 화합물 94 ~ 98.5 중량% 및 상기 설포석시네이트계 용액 1.5 ~ 6 중량%를, 더욱 바람직하게는 폴리글리세릴계 화합물 96 ~ 98 중량% 및 상기 설포석시네이트계 용액 2 ~ 4 중량%를 포함할 수 있다. 이때, 설포석시네이트계 용액 함량이 1 중량% 미만이면 가용화제가 효과 범위 pH가 줄어드는 문제가 있을 수 있고, 설포석시네이트계 용액 함량이 9 중량%를 초과하면 오히려 폴리글리세릴계 화합물 함량이 줄게 되어, 가용대상물질을 가용화시키기 위해 투입되는 가용화제 사용량을 증가시켜야 하는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내로 사용하는 것이 좋다.

2 단계의 상기 폴리글리세릴계 화합물로는 폴리글리세릴-8라우레이트(polyglyceryl-8 laurate), 폴리글리세릴-9라우레이트(polyglyceryl-9 laurate), 폴리글리세릴-10라우레이트(polyglyceryl-10 laurate), 폴리글리세릴-10 미리스테이트(polyglyceryl-10 Myristate) 및 폴리글리세릴-10 스테아레이트(polyglyceryl-10 stearate) 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 폴리글리세릴-10라우레이트(polyglyceryl-10 laurate), 폴리글리세릴-10 미리스테이트(polyglyceryl-10 Myristate) 및 폴리글리세릴-10 스테아레이트(polyglyceryl-10 stearate) 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 폴리글리세릴-10라우레이트 및 폴리글리세릴-10 미리스테이트 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

이렇게 제조한 본 발명의 피이지 프리 가용화제는 가용대상물질 대상에 따라 그 사용량에 차이가 있지만, 선복화 추출물, 담배잎산말(Desmarestia tabacoides) 추출물 및 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 Nrf2 활성화 복합제를 이용한 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제 제조 시에는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제 전체 중량 중 0.1 ~ 2 중량%, 바람직하게는 0.2 ~ 1.2 중량%, 더욱 바람직하게는 0.3 ~ 0.6 중량%를 사용하는 것이 좋다.

이하에서는 앞서 설명한 본 발명의 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제를 제조하는 방법에 대하여 설명을 한다.

본 발명의 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제는 유상액 및 수상액을 각각 제조한 후, 이들을 특정 조건 온도 하에서 유화시켜 제조한 것으로서, 수상액 및 유상액을 각각 제조하는 1 단계; 상기 유상액에 수상액을 첨가한 다음 교반시켜서 혼합물을 제조하는 2 단계; 40 ~ 50℃ 하에서 상기 혼합물, Nrf2 활성화 복합제, 피이지 프리 가용화제, 향료 및 정제수를 혼합 및 2,000 ~ 3,000rpm의 교반속도로 교반시키는 3 단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조할 수 있다.

그리고, 상기 1 단계의 유상액은 피부컨디셔닝제, 토코페릴아세테이트, 유화제, 피부유연화제, 수분증발차단제 및 비이온계면활성제를 혼합한 후, 60 ~ 75℃, 바람직하게는 65 ~ 72℃의 온도가 되도록 가열 및 교반시켜서 용해액을 제조한 다음, 상기 용액에 피막형성제를 분산 및 교반시켜서 제조할 수 있다.

또한, 1 단계의 수상액은 피부컨디셔닝제, 금속이온봉쇄제, 증점제, 보습제, 점도감소제, 살균보존제 및 용제를 혼합한 후, 50 ~ 60℃가 되도록 가열 및 교반시켜서 제조할 수 있다.

상기 유상액 및 수상액에 사용되는 성분 및 이의 사용량은 앞서 설명한 바와 동일하다.

2 단계는 유상액에 수상액을 첨가한 다음 70 ~ 80℃ 하에서 2,000 ~ 3,000rpm의 교반 속도로 1 ~ 4분간 유화를 수행하여 혼합물을 제조할 수 있다.

그리고, 3 단계의 선복화 추출물은 앞서 설명한 방법으로 제조한 것일 수 있다.

이렇게 제조된 본 발명의 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제는 pH 6.0 ~ 7.5, 바람직하게는 pH 6.2 ~ 7.2, 더욱 바람직하게는 pH 6.5 ~ 7.1 일 수 있다. 이대, pH가 6.0 미만이면 담배잎산말 추출물에 의한 NO 활성 억제 효과가 미비할 수 있고, pH가 7.5를 초과하면 선복화 추출물에 의한 Nrf2 활성화 효과가 다소 감소하는 문제가 있을 수 있으므로, 상기 범위 내의 pH를 가지는 것이 좋다.

앞서 설명한 본 발명의 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제를 사용하여 다양한 타입의 화장품을 제조할 수 있으며, 일례를 들면, 크림 타입, 세럼 타입(마스크팩 포함) 등의 화장품을 제조할 수 있다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 더욱 자세하게 설명을 한다. 그러나, 하기 실시예에 의해 본 발명의 권리범위를 한정하여 해석해서는 안된다.

[실시예]

준비예 1 : 선복화 추출물의 제조

정제수 100 중량부에 대하여 선복화 5 중량부를 혼합하여 원료를 준비하는 준비하였다.

다음으로, 상기 원료를 90 ~ 100에서 4 ~ 8시간 동안 열수 추출하여 추출물을 얻었다.

다음으로, 상기 추출물을 평균기공 25㎛인 필터막으로 필터링하여 1차 여과액을 얻었다.

다음으로 상기 여과액 여과액 94.9ml에 1,2-헥산디올 5ml 및 에틸헥실글리세린 0.1ml을 첨가한 다음 충분하게 교반한 후, 교반액을 평균기공 10㎛인 필터막으로 2차 필터링을 수행하여 선복화 추출물을 제조하였다.

선복화 추출물의 루시퍼라아제 활성 효과, 활성산소 소거 활성 효과, 산화적 스트레스 방어 효과는 등록특허번호 10-1857526호에 개시되어 있으며, 본 발명은 이를 인용한다.

준비예 2 : 담배잎산말 추출물의 제조

정제수 100 중량부에 대하여 건조 및 분말화시킨 담배잎산말 20 ~ 30 중량부를 혼합하여 원료를 준비하는 준비하였다. 다음으로, 상기 원료를 110℃에서 4시간 동안 증류 추출하여 추출물을 얻었다. 다음으로, 상기 추출물을 평균기공 25㎛인 필터막으로 필터링하여 1차 여과액을 얻었다. 다음으로 상기 여과액 94.9ml에 1,2-헥산디올 2ml 을 첨가한 다음 충분하게 교반한 후, 교반액을 평균기공 10㎛인 필터막으로 2차 필터링을 수행하여 담배잎산말 추출물을 제조하였다.

실험예 1 : 담배잎산말 추출물의 루시퍼라아제 활성도 측정

(1) 준비예 2의 담배잎산말 추출물을 증류수와 혼합하여, 20ppm(pH 1.7), 200ppm(pH 1.7), 2,000ppm(pH 1.7), 20ppm(pH 4.8), 200ppm(pH 4.8), 2,000ppm(pH 4.8), 20ppm(pH 6), 200ppm(pH 6), 2,000ppm(pH 6), 20ppm(pH 7), 200ppm(pH 7), 2,000ppm(pH 7)인 담배잎산말 추출물을 각각 준비하였다. 이때 pH는 1M NaOH를 적가하여 조절하였다.

또한, 준비예 1의 담배잎산말 추출물을 80% 에탄올 수용액과 혼합하여 10ppm, 20ppm, 50ppm, 100ppm, 200ppm, 1,000ppm 및 2,000ppm을 각각 준비하였다.

(2) 인간피부 세포주인 HaCaT 세포에 ARE(antioxidant response element)로 루시퍼라아제를 삽입하여 HaCaT 리포터 세포(HaCaT reporter cell, HaCaT-ARE-GFP-luciferase cell)을 만들었고, 이 세포주는 이용하여 루시퍼라아제 활성도를 측정하였다. 이 세포주는 Nrf2에 의하여 ARE가 활성화되면 GFP 또는 루시퍼라아제(luciferase)가 발현되므로 Nrf2의 활성을 빠르게 감지할 수 있는 측정이다.

루시퍼라아제 활성도 측정은 HaCaT 리포터 세포(HaCaT-ARE-GFP-luciferase cell)에 RPMI1640 미디아(media) 0ug/ml(control), 상기 담배잎산말 추출물 20ppm(pH 1.7), 200ppm(pH 1.7), 2,000ppm(pH 1.7), 20ppm(pH 4.8), 200ppm(pH 4.8), 2,000ppm(pH 4.8), 증류 20 ~ 2,000ppm, 80% 에탄올 수용액 20 ~ 2,000ppm 및 브로콜리 추출물인 설포라페인(sulforaphane, SFN, Positive Control)으로 각각 10Um의 농도로 처리 한 후, 24시간 동안 인큐베이션시킨 후 세포(cell)의 용해물(Lysate)를 단백질 정량한 값과 루시퍼라아제 활성도(Luciferase activity)의 값을 측정하여 데이터 처리하였다.

측정 결과, 설포라페인(SFN) 보다 루시퍼라아제 활성도가 작지만, 항산화 반응을 보이는 것을 확인할 수 있었다(하기 표 1참조). 구체적으로, pH 7의 200ppm에서의 활성이 항산화 반응이 가장 우수했으며, pH 7의 2,000의 경우, pH7의 200ppm에 비해 큰 증대 효과가 없었다. 다만 pH 1.7의 2000ppm의 경우, 낮은 산도 때문에 루시퍼라아제 값이 튄 것으로 사료되며, 2,000ppm(pH 1.7)이 항산화 반응이 있다고 단정 짓기는 모호한 문제가 있다. 하기 표 1의 값은 대조군 값 1을 기준으로 수치화한 것이다. 즉 대조군에 대한 배율이다.

구분	Fold induction of Luciferase activity
대조군	1.00
설포라페인(SFN)	5.22
pH 1.7-20ppm	0.68
pH 1.7-200ppm	0.78
pH 1.7-2000ppm	1.63
pH 4.8-20ppm	0.72
pH 4.8-200ppm	0.79
pH 4.8-2000ppm	0.96
pH 6.0-20ppm	1.21
pH 6.0-200ppm	1.25
pH 6.0-2000ppm	1.35
pH 7.0-20ppm	1.63
pH 7.0-200ppm	3.09
pH 7.0-2000ppm	3.11

(3) 상기 루시퍼라아제 활성도 측정과 동일한 방법으로 상기 대조군, 상기 설포라페인, 80% 에탄올 수용액 10ppm, 20ppm, 50ppm, 100ppm, 200ppm 및 1,000ppm의 루시퍼라아제 활성 측정을 수행하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 80% 에탄올 수용액에 6개의 농도로 담배잎산말 추출물을 용해 및 나누어 루시퍼라아제 활성도를 측정한 것인데, 80% 에탄올-200ppm에서 가장 우수한 항산화 반응이 확인되었다.

실험예 2 : 웨스턴 블랏 측정

HaCaT 세포에 대조군(LPS, lipopolysaccharide), 담배잎산말 추출물, 80% 에탄올 수용액 20ppm, 80% 에탄올 수용액 200ppm 을 처리한 후, 1시간 후에 염증반응을 유발하기 위해 2㎍/㎖ 농도의 LPS 를 처리한 다음, 24시간 배양한 후, 웨스턴 블랏(Western blot)을 이용하여 단백질 양을 정량하였으며, 그 결과를 도 2의 A 및 B에 나타내었다. 이때, 담배잎산말 추출물은 상기 실험예 2의 (1)과 동일한 방법으로 20ppm(pH 1.7), 200ppm(pH 1.7), 20ppm(pH 4.8), 200ppm(pH 4.8), 20ppm(pH 6), 200ppm(pH 6), 20ppm(pH 7), 200ppm(pH 7)의 담배잎산말 추출물을 제조하고, 이를 이용하여 측정하였다.

도 2의 A는 루시퍼라아제 활성을 통해 항산화 반응을 보인 것 중에서 염증반응에도 반응하는지 여부를 확인하기 위해 염증마커인 COX-2와 cJun 항체를 이용하여 웨스턴블럿을 측정한 것인데, pH 1.7-200ppm 에서 항산화 반응은 있었으나 산도로 인한 것으로 사료되었듯이 cJun의 활성을 보아 염증에는 효과가 없었고, pH7 200ppm은 COX-2와 cJun 모두 감소시켰고, 80% 에탄올 수용액-200ppm은 cJun에서 반응하였기에 이 결과로 pH 7-200ppm이 가장 적합하다고 결정하였습니다.

다음으로, 도 2의 B는 20ppm(pH 7)과 200ppm(pH 7)의 COX-2 뿐만 아니라 iNOS 염증마커를 이용하여 염증에 대한 반응을 보이는 것을 다시 확인한 결과이다.

실험예 3 : 담배잎산말 추출물에 대한 세포 생존율 측정

담배잎산말 추출물의 세포 독성을 확인하기 위해서 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 염증유발 모델로 측정하였다.

(1) 세포 배양

마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, Thermo사의 SH30406.02) 및 1% 페니실린/스테렙토마이신(penicillin/streptomycin, Thermo사의 SV30010)이 함유된 DMEM 배지(high glucose, Thermo사의 SH30243.01)를 이용하여 100mm 세포배양접시(cell culture dish)를 사용하여 5% CO₂배양기에 배양했다. 컨플루언스(confluence)에 도달한 세포는 스크래퍼(Scraper, SPL사의 90030)를 사용하여 계대 배양하여 유지했다.

(2) 세포 생존율 실험

살아있는 세포 내의 미토콘드리아에 존재하는 탈수소효소는 WST(Tetrazolium Salt)에서 포르마잔(formazan)이라는 발색물질을 생성한다. 따라서 이를 측정하여 살아있는 세포의 수를 측정할 수 있다. 96 웰세포 배양기(well cell culture plate, 코닝사의 3595)에 1×10⁴cells/well농도의 RAW 264.7 세포를 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 페니실린/스테렙토마이신이 첨가된 DMEM 배양액으로 24시간 배양한다. 그 후 시료가 담배잎산말 추출물(10ppm, 20ppm, 50ppm, 100ppm, 200ppm, 1,000ppm)의 농도별로 포함된 DMEM 배지로 교체하여 48시간 배양한다. 배양이 끝난 세포에 EZ-CYTOX 시약(Daeilab의 EZ-1000)을 이용하고 570nm에서 흡광도를 측정하여 하기 수학식 2 에 의거하여, 농도별 세포 생존율을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

그리고, 대조군(control)은 담배잎산말을 처리하지 않은 Raw 264.7 세포를 이용하여 측정한 것이다.

[수학식 2]

세포생존율(Cell viability)=(시료 첨가군의 흡광도/무처리군 흡광도)×100

구분	세포생존율(대조군 기준 %)
대조군(0 중량%)	100
10ppm	120
20ppm	120
50ppm	105
100ppm	100
200ppm	97
1000ppm	95
3000ppm	53

상기 표 2의 실험결과를 살펴보면, 담배잎산말 추출물을 200ppm 이하의 농도로 처리한 시험군은 대조군과 대비하여 통계적으로 유의한 세포 생존율의 차이를 나타내지 않았으나, 2,000ppm 농도에서는 생포 생존율이 급격하게 감소함을 확인할 수 있었다. 즉, 1000ppm 이하의 농도에서는 RAW264.7 세포에 대한 세포 독성을 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 4 : real time RT PCR 측정

인터류킨수용체인 IL2, IL6, 염증마커인iNOS 및 COX-2에 대해 mRNA 레벨을 감소시키지 확인하기 위해 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time RT PCR)으로 측정하였다.

준비예 2의 담배잎산말 추출물을 20ppm(pH 7), 200ppm(pH 7) 및 1000ppm(pH 7)을 준비하였다. 또한, 대조군(control)로서, Raw264.7세포를 준비하였고, LPS(lipopolysaccharide) 준비하였다.

Raw264.7세포에 대조군, 담배잎산말 추출물을 각각 처리한 후, 1시간 후에 염증반응을 유발하기 위해 2㎍/㎖ 농도의 LPS 를 처리(18시간 인큐베이션함)하여 RNA를 뽑고, 뽑아낸 RNA를 다시 cDNA로 합성한 후에 실시간 중합효소 연쇄반응으로 mRNA 레벨을 측정하였고, 그 결과를 표 3(IL2, iL6, iNOS, COX-2)에 각각 나타내었다.

구분(Relative mRNA Level)	IL2	IL6	iNOS	COX-2
대조군	1	1	1	1
LPS	2.67	9.65	3.77	4.84
pH 7-담배잎산말 추출물 20ppm	1.28	3.32	2.52	3.14
pH 7-담배잎산말 추출물 200ppm	0.76	1.80	1.63	0.94
pH 7-담배잎산말 추출물 1000ppm	0.68	1.51	1.38	0.90

표 3 을 보면, 담배잎산말 추출물을 처리한 경우, IL2, IL6, iNOS 및 COX-2의 Phase II mRNA 레벨이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이에 반해, LPS만 처리한 경우, Phase II mRNA 레벨이 증가하는 결과를 보였다. 이를 통하여, 담배잎산말 추출물이 iNOS, COX-2, IL2및 IL6 인자를 감소시킴을 확인할 수 있었다.

실험예 5 : 담배잎산말 추출물의 산화적 스트레스 방어 테스트 측정

(1) Raw264.7세포에 대한 산화적 스트레스 방어 테스트

Raw264.7세포 (대조군, control), Raw264.7세포에 2㎍/㎖ 농도의 LPS(lipopolysaccharide)만 처리한 경우 및 RAW 264.7 세포에 상기 LPS(2㎍/㎖)와 담배잎산말 추출물(200ppm)를 함께 처리한 경우의 Raw264.7 세포내 방어 여부를 측정하였고, 그 결과를 하기 도 3에 나타내었다.

도 3의 대조군(control)은 산화적 스트레스에 의하여 DNA 손실(damage)이 일어나는지를 알아보기 위해 RAW 264.7 세포 에 DNA 염색을 하여 세포 내 DAPI, 8-OH-dG(8-hydroxy deoxyguanosine) 및 MERGE 레벨을 측정한 것이다.

도 3을 살펴보면, LPS만으로 처리한 것과 LPS와 함께 담배잎산말 추출물로 처리한 경우가 산화적 스트레스 방어를 하고 있음을 확인할 수 있다.

실험예 6 : 담배잎산말 추출물의 NO 생성억제 측정

(1) 시험 물질 처리

RAW 264.7 세포를 4×10⁴cells/dishdensity로 96well 플레이트(plate)에 분주하여 24시간 동안 플레이트에 부착시켰다. 담배잎산말 추출물을 각각 처리한 1시간 후에 염증반응을 유발하기 위해 2㎍/㎖ 농도의 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하여 18시간 배양하였다.

(2) 일산화질소(NO) 생성량 측정 실험

RAW 264.7 세포에서 생성되어 배양액에 존재하는 NO 수준을 그리스(Griess) 반응을 기본으로 하는 NO 디텍션키트(detection kit, intron사의 21021)를 사용하여 측정하였다. NO가 존재한다고 추정되는 배양액을 96 well-플레이트(well plate)에 100㎕씩 분주한 후 N1 버퍼(sulfanilamide) 50㎕를 넣어 10분간 실온에서 반응시킨다. 이어서 N2 버퍼(naphthylethylenediamine) 50㎕를 넣고 10분간 실온에서 반응시킨 후 540nm에서 흡광도 측정하였으며, 각 NO 생성량은 아질산염 기준(nitrite standard)를 이용하여 얻은 표준검량곡선을 이용하여 산출하였다. 양성대조군(Positive control)은 L-NMMA 50μM(N^G-Methyl-L-arginineacetatesalt,시그마사의 M7033)을 사용하였다.

각각의 결과는 마이크로소프트사의 오피스 엑셀 2007(Office Excel 2007)의 t-테스트(Paired t-test, 양측검증) 기능을 이용하여 시험결과의 통계적 유의성을 확인한 것이며, 그 결과는 하기 표 4와 같다. 그리고, 표 4의 NO 생성 억제율은 하기 수학식 1에 의거하여 계산하였다.

[수학식 1]

NO 생성 억제율(%) = (A-B)/A * 100%

수학식 1에서 A는 NO 활성 억제제 내 담배잎산말 추출물 농도가 0%일 때 RAW264.7 세포에서의 NO 생성량(100%)이고, B는 NO 활성 억제제 내 담배잎산말 추출물의 특정 농도에서의 RAW264.7 세포에서의 NO 생성량(%) 측정 값이다.

구분	NO 생성 저해율(대조군 기준%)
대조군(0 중량%)	100
양성대조군	45.2%
pH7-10ppm	10.3%
pH7-100ppm	18.5%
pH7-200ppm	35.2%
pH7-1500ppm	43.8%
pH7-3000ppm	40.5%

상기 표 4의 측정결과를 살펴보면, 양성 대조군인 L-NMMA는 50μM 농도 범위에서 RAW264.7 세포의 NO 생성을 약 45% 정도 저해시켰다. 그리고, 담배잎산말 추출물은 10ppm, 100ppm, 200ppm 및 1500ppm 농도 범위에서 통계적으로 유의한 수준으로 RAW264.7 세포의 Nitirc oxide(NO) 생성을 저해하는 것을 확인할 수 있다. 200ppm 이하로 처리시 약 10 ~ 44%의 NO 생성을 저해하는 것을 확인할 수 있었으며, 3000ppm 농도에서는 오히려 NO 생성 저해율이 저하되는 문제가 있었다.

준비예 3 : 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조

92 부피% 농도의 에탄올 수용액 100 중량부에 대하여, 건조된 호장근 뿌리 15 중량부를 넣고, 7일간 25℃ 하에서 환류 냉각 추출을 수행하여 냉각 추출액을 얻은 후, 이를 감압농축기로 강압 농축하여 조추출물을 제조하였다.

다음으로, 증류수 100 중량부에 대하여 상기 조추출물을 10 중량부를 혼합하여 혼합용액을 제조한 후, 혼합용액 100 중량부에 대하여, 메틸렌클로라이드 100 중량부를 투입한 다음 진탕 추출한 후, 물층과 유기용매층으로 분획하고, 유기 용매층을 제거한 후, 물층의 분획용액을 수득하였다.

다음으로, 상기 분획용액 및 에틸아세테이트를 1 : 5 중량비로 혼합한 후, 이를 진탕 추출하여 유기용매층을 분획한 다음, 유기용매층의 용액을 감압농축기로 감압 농축하여 에틸아세테이트 추출물을 수득하였다.

다음으로, 상기 에틸아세테이트 추출물을 실리카겔로 충진된 컬럼에서 로로포름 및 메탄올을 15 : 1 부피비로 포함하는 혼합 용매로 분획하여 5개의 분획물을 수득하였으며, 3번째 분획물을 캅셀팍 컬럼을 사용하여 세미-프렙(semi-prep)으로 분리하여 다시 5개의 분획물을 수득하였다. 이때, 전개용매로는 아세토나이트릴을 사용하였다.

이 중 2번째 분획물을 메탄올로 재결정하여 하기 화학식 1-1로 표시되는 호합물을 최종 수득하였다.

[화학식 1-1]

화학식 1-1의 A는 에틸렌기이고, R¹ 및 R²은 독립적으로 -OH이다.

¹H-NMR (500MHz, Acetone-d6): δppm 6.14 (t, 1H, H-4), 6.43 (d, 2H, H-2, 6), 6.75 (d, 2H, H-3′, 5′), 6.79 (d, 1H, H-α), 6.94 (d, 1H, H-β), 7.33 (d, 2H, H-2′, 6′);

¹³C-NMR (125MHz, Acetone-d6): δppm 102.64 (C-4), 105.76 (C-2), 108.20 (C-6), 115.84 (C-3′), 116.48(C-5′), 127.02 (C-α), 128.79 (C-6′), 129.38 (C-2′), 130.42 (C-β), 131.40 (C-1′), 141.31 (C-1), 158.37 (C-4′), 159.37 (C-3, 5)

실시예 1 : Nrf2 활성화 복합제의 제조

준비예 1의 선복화 추출물, 준비예 2의 담배잎산말 추출물 및 준비예 3의 화학식 1-1로 표시되는 화합물을 1 : 1 : 0.1 중량비로 혼합한 혼합물을 제조한 다음, 물과 혼합한 후, pH를 7로 조절하였다.

실시예 2 ~ 3 및 비교예 1 ~ 4

상기 실시예 1과 동일하게 제조하되, 선복화 추출물, 담배잎산말 추출물 및 화학식 1-1로 표시되는 화합물을 하기 표 5와 같은 중량비가 되도록 하여 pH7의 Nrf2 활성화 복합제를 제조하였다.

구분(중량비)	선복화추출물	담배잎산말 추출물	화학식 1-1로 표시되는 화합물
실시예 1	1	1	0.10
실시예 2	1	1.5	0.12
실시예 3	1	1	0.18
비교예 1	1	0.5	0.10
비교예 2	1	2.2	0.10
비교예 3	1	1	0
비교예 4	1	1	0.25

실험예 7 : 항산화 및 산소라디칼 소거활성 측정

항산화 활성(ORAC-FL assay, Oxygen Radical Antioxidant Capacity) 시험방법은 플루오레세인(Fluoresein), 시험물질과 페록시라디칼(peroxyl radical)인 AAPH를 반응시켜 형광 세기를 측정했다(Excitation:485nm, Emmision:525nm). 구체적으로는 시료인 대조군 1인 선복화 추출물, 실시예 1 ~ 3 및 비교예 1 ~ 3의 복합제 각각을 농도 0.1 부피%로 희석하여 진행하였으며, 양성대조군으로 Trolox(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)를 사용하였다.

그리고, 각 시험 물질을 black 96well plate에 25㎕씩 분주한 다음, Fluoresein 150㎕를 넣고 30분간 37℃에서 반응시켰다. 다음으로 AAPH(2,2'-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride)를 25㎕씩 각 well에 분주하고 Excitation 485, Emission 528nm 조건에서 형광도를 측정하였다(60분, 간격 3분).

결과 계산은 시간에 따른 형광도를 모두 더한 값에서 blank 형광도를 뺀 값으로 blank와 시료 그래프 사이 면적에 해당하는 net AUC로 나타내었다. 그리고, Trolox 당량(mM TE/g)은 Trolox standard curve를 이용하여 해당 농도의 Trolox 당량(net AUC값)을 계산하였다.

양성대조군인 Trolox를 대상으로 5 ~ 50uM 농도 범위에서 net AUC(area under the curve)를 측정하였으며(도 4 참조), 농도별 net AUC 표준 곡선을 작성하였다(도 5 참조).

그리고, 선복화 추출물, 실시예 1 ~ 3 및 비교예 1 ~ 4의 산소라디칼 소거 활성 측정 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 하기 표 6은 3회 측정한 평균값을 나타낸 것이다.

선복화 추출물 처리농도(%)	처리농도(부피%)	Trolox 당량(mM TE/g)
대조군(선복화 추출물)	0.1	65.43
실시예 1		83.85
실시예 2		89.93
실시예 3		85.36
비교예 1		70.98
비교예 2		86.02
비교예 3		76.63
비교예 4		85.40

상기 표 6의 측정 결과를 살펴보면, 선복화 추출물만으로 0.1% 농도처리시 65.43mM TE/g의 Trolox 당량을 나타내는데 반해, 동일 처리 농도에서 담배잎산말 추출물 및 화학식 1-1로 표시되는 화합물을 사용한 실시예 1 ~ 3이 더 우수한 산소라디칼 소거 활성이 있음을 확인할 수 있었다.

그리고, 담배잎산말 추출물을 0.8 중량비 미만으로 사용한 비교예 1의 경우, 실시예 1과 비교할 때, Trolox 당량 수치가 크게 낮은 문제가 있었으며, 또한, 화학식 1-1로 표시되는 화합물을 사용하지 않은 비교예 3 역시 Trolox 당량 수치가 크게 낮은 문제가 있었다.

또한, 담배잎산말 추출물을 2.0 중량비 초과 사용한 비교예 2의 경우, 담배잎산말 추출물을 1.5 중량비로 사용한 실시예 2와 비교할 때, 오히려 Trolox 당량 수치가 낮아지는 문제가 있었으며, 화학식 1-1로 표시되는 화합물을 0.2 중량비 초과하여 사용한 비교예 4의 경우, 실시예 3과 비교할 때, Trolox 당량 수치 증가가 없었다.

실험예 8 : real time RT PCR 측정

활성산소가 발생하였을 때 Phase II대사 시스템에 관련된 효소들이 이 활성산소에 반응하여 그 레벨이 급격히 증가하는 것으로 알려져 있다. 이때 이 Phase II 대사 조절에 관련된 단백질의 증가는 전사단계에서 조절되고, 이를 조절하는 전사인자들은 Nrf2, HO-1, NQO-1등이 있다.

이에 mRNA 레벨이 증가되는지 확인하기 위해 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time RT PCR)으로 측정하였다.

HaCaT cell에 대조군인 준비예 1의 선복화 추출물, 실시예 1 ~ 3 및 비교예 1 ~ 4의 Nrf2 활성화 복합제 각각을 20ug/ml로 처리하여 RNA를 뽑고, 뽑아낸 RNA를 다시 cDNA로 합성한 후에 Real Time RT PCR로 mRNA 레벨을 측정하였고, 그 결과를 하기 표7(Nrf2, HO-1, NQ01)에 나타내었다. 표 7은 4시간 후, Nrf2, HO-1, NQO-1의 Phase II mRNA 레벨을 측정한 것이다.

구분 (Relative mRNA Level)	Nrf2		HO-1		NQ01
구분 (Relative mRNA Level)	0시간	4시간	0시간	4시간	0시간	4시간
대조군 (선복화 추출물)	1.0	1.08	1.0	2.22	1.0	1.37
실시예 1	1.0	1.24	1.0	2.58	1.0	1.69
실시예 2	1.0	1.39	1.0	2.75	1.0	1.79
실시예 3	1.0	1.35	1.0	2.64	1.0	1.85
비교예 1	1.0	1.11	1.0	2.34	1.0	1.40
비교예 2	1.0	1.30	1.0	2.80	1.0	1.75
비교예 3	1.0	1.15	1.0	2.46	1.0	1.42
비교예 4	1.0	1.36	1.0	2.66	1.0	1.84

비교예 1의 경우, 대조군 보다 Nrf2, HO-1, NQO1의 Phase II mRNA 레벨은 우수하나, 실시예 1과 비교할 때, 크게 낮은 결과를 보였다. 그리고, 비교예 2의 경우, 실시예 2와 비교할 때, HO-1 레벨은 높아지나, NQ01 및 Nrf2 레벨이 다소 낮아지는 결과를 보였다. 그리고, 비교예 3의 경우, 실시예 1과 비교할 때, Nrf2, HO-1 레벨이 낮고, 특히, NQ01 레벨이 크게 낮은 결과를 보였다. 그리고, 비교예 4의 경우, 실시예 3과 비교할 때, 큰 차이가 없었다.

상기 실험예를 통하여 본 발명의 Nrf2 활성화 복합제가 선복화 추출물 단독으로 사용하는 것보다 선복화 추출물과 담배잎산말 추출물 및 화학식 1-1로 표시되는 화합물을 함께 사용하고 또한 적정 비율로 사용시 항산화 활성이 우수함을 확인할 수 있었다.

실험예 9 : 피부 멜라노사이트에서 멜라닌 생합성 억제 효과

사람의 피부조직을 채취한 다음 미세한 절편으로 피부조직을 자른 후, 항생제(50mg/ml gentamicin, 50mg/ml amphotericin, 50U/ml penicillin, 50㎍/streptomycin)을 함유하는 인산완충용액 (PhosphateBufferedSaline)으로 세척하고 0.25% Trypsin/EDTA를 5분 동안 처리하여 멜라노사이트 선택배지인 M2 배지 (Promocell)에서 5% CO₂ 및 37℃ 조건의 배양기에서 15일 동안 배양한 후에, 멜라노사이트 세포를 다시 0.25% Trypsin/EDTA로 떼어내어 혈구계수기로 세포수를 세어 M2 배지(Promocell)가 들어 있는 24-well 에 well당 1×10⁴개로 접종한 후 37℃에서 포가 well 닥에 80% 이상 부착될 때까지 배양했다.

1일 배양 후 멜라닌 색소의 전구체인 도파를 0.08mM 되게 첨가한 다음 실시예 1 ~ 3 및 비교예 3 ~ 4을 각각 0.1 중량%의 시험 농도로 첨가하고 3일 동안 배양하여 대조군에는 식염수를 넣었다. 배지를 제거한 세포를 인산완충용액(PBS, Phosphate Buffered Saline)으로 세척하고, 이것을 트립신으로 처리하여 세포를 회수한다. 회수된세포는 헤마토사이토메터(Hematocytometer)를 이용하여 세포수를 측정한 후 10분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하여 침전물을 얻었다.

이 세포침전물은 60℃에서 건조한 후 10%가 함유된 1M의 수산화나트륨액 100㎕를 넣어 60℃ 항온조에서 세포내 멜라닌을 얻었다. 이 액을 가지고 마이크로프레이트(Microplate)로 490nm에서 흡광도를 측정하여 세포수당 멜라닌 함량을 Nrf2 활성화 복합제로 처리하지 않은 대조군과 실험군(실시예 1 ~ 3 및 비교예 3 ~ 4)을 비교하여, 대조군 100%를 기준으로 %로 표시하였고, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

구분	세포수당 멜라닌 함량
대조군	100%
실시예 1	66.3%
실시예 2	55.2%
실시예 3	46.8%
비교예 1	68.5%
비교예 2	64.4%
비교예 3	98.2%
비교예 4	40.6%

상기 표 8의 측정결과를 살펴보면, 대조군과 비교할 때, 실시예 1 ~ 3이 멜라닌 함량이 크게 감소하는 결과를 보였으며, 특히 실시예 1 ~ 3을 비교해보면, 화학식 1-1로 표시되는 화합물이 증가할수록 멜라닌 함량 감소하는 경향을 보였다. 특히, 화학식 1-1로 표시되는 화합물을 사용하지 않은 비교예 3의 경우, 멜라닌 감소 효과가 미비하였다. 그리고, 실시예 1과 비교예 2를 비교해보면 담배잎산말 추출물 함량이 증가하면 멜라닌 감소 효과가 다소 증가하는 경향을 보였다.

상기 실험을 통해여 본 발명의 Nrf2 활성화 복합제가 멜라닌 감소를 통한 미백 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

제조예 1 : Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제의 제조

(1) 수상액의 제조

하기 표 9의 성분들을 용제에 완전 분산시킨 후, 정제수를 투입한 다음, 56 ~ 57℃로 가열 및 교반하여 완전 용해시켜서 수상액을 제조하였다.

수상액	구분	종류	중량부
	피부컨디셔닝	히알루론산(1% 농도)	39.2
		감초분말	2
		하이드롤라이트-5	58.8
	금속이온봉쇄제	EDTA-2NA	0.39
	증점제	잔탄검(Keltrol F)	0.98
	보습제	글리세린	49.06
	점도감소제	디프로필렌 글라이콜	58.83
	용제	1,2-헥산디올	19.61
	용제	1,3-부틸렌글라이콜	19.61
	살균보존제	클로페네신	5.88

(2) 유상액의 제조

하기 표 10의 성분들을 혼합한 후, 68℃ 에서 아지믹서로 저어주면서 혼합 및 용해시킨 다음, 피막형성제를 투입하여 골고루 분산 및 혼합하여 유상액을 제조하였다.

유상액	구분	종류	사용량(중량부)
	피부증발차단제	MCT 오일	87.5
	피부증발차단제	스쿠알란	12.5
	토코페릴아세테이트	Vit-E Acetate	0.625
	피부컨디셔닝	쉐어버터	12.50
	피부컨디셔닝	코코넛 오일	6.25
	유화제	세테아릴글루코시드 및 세테아릴알코올(Emulgade PL 68/50)	18.75
	유화제	세테아릴알코올(KALCOL 6850)	25
	피부유연화제	하나 이상의 중간사슬 모노글리세라이드 포함 유상(AKOLINE MCM)	5
	비이온계면활성제	Tween 60	12.5
	피막형성제	SEPIPLUS 400	3.75

(3) 피이지 프리 가용화제의 제조

(3-1) 하기 화학식 2-1로 표시되는 소디움 설포석시네이트 100 중량부에 대하여, 디프로필렌글리콜 27.5 중량부 및 물 18 중량부를 혼합 및 교반하여 소디움 설포석시네이트 용액을 준비하였다.

[화학식 2-1]

화학식 2-1에서, R¹및 R²는 모두 2-에틸헥실기이다.

(3-2) 폴리글리세릴-10 라우레이트 98.0 중량% 및 상기 소디움 설포석시네이트 2.0 중량%를 혼합 및 충분히 교반하여 피이지 프리 가용화제를 제조하였다.

(4) 앞서 제조한 유상액에 수상액을 천천히 첨가한 후, 호모믹서를 이용하여 이들의 혼합물을 74~75℃ 하에서 2,500rpm의 교반 속도로 2분간 교반한 후, 45℃에서 Nrf2 활성화 복합제(실시예 1의 Nrf2 활성화 복합제 : 정제수 = 45.5 : 64.5 부피%), 상기 피이지 프리 가용화제 및 향료(Perfume 85147)를 첨가하고, 천천히 교반시켜서 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제 제조하였으며, 제조된 제제는 세럼 타입(마스크팩 포함)이다.

그리고, 제조된 제제는 전체 중량 중 수상액 17.90 중량%, 유상액 20.70 중량%, Nrf2 활성화 복합제 6.54 중량%, 피이지 프리 가용화제 0.75 중량%, 향료 0.28 중량% 및 잔량의 물을 포함하도록 제조하였다.

제조예 2 ~ 3 및 비교제조예 1 ~ 2

상기 제조예 1과 동일하게 실시하되, 하기 표 11과 같이 피이지 프리 가용화제 함량을 달리하여 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제를 각각 제조하였다.

구분(중량%)	제조예 1	제조예 2	제조예 3	비교제조예 1	비교제조예 2
수상액	17.90
유상액	20.70
Nrf2 활성화 복합제	6.54
피이지 프리 가용화제	0.75	1.20	0.50	0.01	2.5
향료	0.28
물	나머지 잔량(총 100 중량%)

피이지 프리 가용화제의 함량을 달리하여 제조한 제조예 1 ~ 3 및 비교제조예 2의 경우, Nrf2 활성화 복합제, 수상액 및 유상액이 잘 용해 및 혼합되어 적정 점도 및 pH 약 6.7 ~ 6.8를 가지는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제가 제조되었다.

이에 반해 비교제조예 1의 경우, 유상액이 Nrf2 활성화 복합제 및 수상액과 잘 용해되지 않아서, 제제 내 다수의 미세 기포가 발생하는 문제가 있었다. 그리고, 비교제조예 2는 제조예 3과 큰 차이가 없었다.

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수상액 15 ~ 20 중량%, 유상액 18 ~ 25 중량%, Nrf2의 활성화 복합제 1 ~ 10 중량%, 피이지 프리 가용화제 0.1 ~ 2 중량%, 향료 0.05 ~ 1 중량% 및 잔량의 정제수를 포함하며,
상기 수상액은 피부컨디셔닝제, 금속이온봉쇄제, 증점제, 보습제, 점도감소제, 살균보존제 및 용제를 포함하고,
상기 유상액은 수분증발차단제, 토코페릴아세테이트, 피부컨디셔닝제, 유화제, 피부유연화제, 비이온계면활성제 및 피막형성제를 포함하며,
상기 Nrf2 활성화 복합제는 선복화 추출물, 담배잎산말(Desmarestia tabacoides) 추출물 및 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 1 : 0.8 ~ 2.0 : 0.05 ~ 0.2 중량비로 포함하며,
상기 담배잎산말 추출물은 담배잎산말 추출물의 농도가 10 ~ 200ppm일 때, 하기 수학식 1에 의거하여 측정시, RAW264.7 세포에서의 일산화질소 생성 억제율이 10 ~ 45%이고,
상기 피이지 프리 가용화제는
폴리글리세릴-8라우레이트(polyglyceryl-8 laurate), 폴리글리세릴-9라우레이트(polyglyceryl-9 laurate), 폴리글리세릴-10라우레이트(polyglyceryl-10 laurate), 폴리글리세릴-10 미리스테이트(polyglyceryl-10 Myristate) 및 폴리글리세릴-10 스테아레이트(polyglyceryl-10 stearate) 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 폴리글리세릴계 화합물; 및 하기 화학식 2로 표시되는 소디움 설포석시네이트(sodium sulfosuccinate) 100 중량부에 대하여, 글리콜 15 ~ 35 중량부 및 물 10 ~ 30 중량부를 포함하는 설포석시네이트계 용액;을 포함하며,
상기 피이지 프리 가용화제는 폴리글리세릴계 화합물 96 ~ 98.5 중량% 및 상기 설포석시네이트계 용액을 잔량으로 포함하며,
상기 글리콜은 1,3-부틸렌 글리콜, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜 및 메칠프로페인디올 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제;
[화학식 1]

화학식 1의 A는 C₂ ~ C₄의 알킬렌기이고, R¹ 및 R² 각각은 독립적으로 수소원자, -OH, -COOH 또는 -COH이다.
[화학식 2]

화학식 2에서, R¹및 R²는 서로 같거나 다른 것으로서, R¹및 R²는 C4 ~ C10의 직쇄형 알킬기, C5 ~ C10의 분쇄형 알킬기 또는 알킬페닐기이다.
[수학식 1]
NO 생성 억제율(%) = (A-B)/Aⅹ100%
상기 수학식 1에서 A는 NO 활성 억제제 내 담배잎산말 추출물 농도가 0ppm일 때 RAW264.7 세포에서의 NO 생성량(100%)이고, B는 NO 활성 억제제 내 담배잎산말 추출물의 특정 농도에서의 RAW264.7 세포에서의 NO 생성량(%) 측정 값이다.
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제3항에 있어서, 상기 수상액은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 금속이온봉쇄제 0.1 ~ 2 중량부, 증점제 0.5 ~ 2 중량부, 보습제 40 ~ 80 중량부, 점도감소제 45 ~ 90 중량부, 살균보존제 2 ~ 10 중량부 및 용제 30 ~ 60 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제.
제3항에 있어서,
상기 유상액은 수분증발차단제 100 중량부에 대하여, 토코페릴아세테이트 0.1 ~ 5 중량부, 피부컨디셔닝제 10 ~ 35 중량부, 유화제 30 ~ 60 중량부, 피부유연화제 2 ~ 10 중량부, 비이온계면활성제 7 ~ 20 중량부 및 피막형성제 1.5 ~ 8 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제.
제3항의 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장품.
제3항의 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 세럼(serum).
수상액 및 유상액을 각각 제조하는 1 단계;
상기 유상액에 수상액을 첨가한 다음 교반시켜서 혼합물을 제조하는 2 단계;
40 ~ 50℃ 하에서 상기 혼합물, Nrf2 활성화 복합제, 피이지 프리 가용화제, 향료 및 정제수를 혼합 및 2,000 ~ 3,000rpm의 교반 속도로 교반시키는 3 단계;를 포함하는 공정을 수행하며,
상기 Nrf2 활성화 복합제는 선복화 추출물, 담배잎산말(Desmarestia tabacoides) 추출물 및 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 1 : 0.8 ~ 2.0 : 0.05 ~ 0.2 중량비로 포함하며,
상기 담배잎산말 추출물은 담배잎산말 추출물의 농도가 10 ~ 200ppm일 때, 하기 수학식 1에 의거하여 측정시, RAW264.7 세포에서의 일산화질소 생성 억제율이 10 ~ 45%이고,
상기 피이지 프리 가용화제는
폴리글리세릴-8라우레이트(polyglyceryl-8 laurate), 폴리글리세릴-9라우레이트(polyglyceryl-9 laurate), 폴리글리세릴-10라우레이트(polyglyceryl-10 laurate), 폴리글리세릴-10 미리스테이트(polyglyceryl-10 Myristate) 및 폴리글리세릴-10 스테아레이트(polyglyceryl-10 stearate) 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 폴리글리세릴계 화합물; 및 하기 화학식 2로 표시되는 소디움 설포석시네이트(sodium sulfosuccinate) 100 중량부에 대하여, 글리콜 15 ~ 35 중량부 및 물 10 ~ 30 중량부를 포함하는 설포석시네이트계 용액;을 포함하며,
상기 피이지 프리 가용화제는 폴리글리세릴계 화합물 96 ~ 98.5 중량% 및 상기 설포석시네이트계 용액을 잔량으로 포함하며,
상기 글리콜은 1,3-부틸렌 글리콜, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜 및 메칠프로페인디올 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제의 제조방법;
[화학식 1]

화학식 1의 A는 C₂ ~ C₄의 알킬렌기이고, R¹ 및 R² 각각은 독립적으로 수소원자, -OH, -COOH 또는 -COH이다.
[화학식 2]

화학식 2에서, R¹및 R²는 서로 같거나 다른 것으로서, R¹및 R²는 C4 ~ C10의 직쇄형 알킬기, C5 ~ C10의 분쇄형 알킬기 또는 알킬페닐기이다.
[수학식 1]
NO 생성 억제율(%) = (A-B)/Aⅹ100%
상기 수학식 1에서 A는 NO 활성 억제제 내 담배잎산말 추출물 농도가 0ppm일 때 RAW264.7 세포에서의 NO 생성량(100%)이고, B는 NO 활성 억제제 내 담배잎산말 추출물의 특정 농도에서의 RAW264.7 세포에서의 NO 생성량(%) 측정 값이다.
제9항에 있어서, 상기 담배잎산말 추출물은
정제수 100 중량부에 대하여, 담배잎산말 추출물 20 ~ 30 중량부를 혼합하여 원료를 준비하는 1 단계;
상기 원료를 100 ~ 110℃ 하에서, 4 ~ 6시간 동안 증류추출을 수행하여 추출하여 추출물을 얻는 2 단계;
상기 추출물을 1차 필터링(filtering)하여 얻은 1차 여과액을 제조하는 3 단계; 및
상기 1차 여과액에 1,2-헥산디올을 첨가 및 교반한 후, 2차 필터링하여 담배잎산말 추출물을 제조하는 4 단계;를 포함하는 공정을 수행하는 것을 특징으로 하는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제의 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은
90 ~ 95 부피% 농도의 에탄올 수용액 100 중량부에 대하여, 호장근 뿌리 5 ~ 20 중량부를 혼합한 후, 5 ~ 7일간 20 ~ 35℃ 하에서 환류 냉각 추출을 수행한 후, 냉각 추출물을 감압 농축 및 건조하여 조추출물을 제조하는 1 단계;
물 100 중량부에 대하여, 상기 조추출물 3 ~ 10 중량부를 혼합하여 혼합용액을 제조한 후, 혼합용액에 메틸렌클로라이드 80 ~ 120 중량부를 투입한 다음 진탕 추출 및 물층과 유기 용매층으로 분획한 후, 유기 용매층을 제거하여 물층의 분획용액을 수득하는 2 단계;
상기 분획용액과 에틸 아세테이트를 혼합한 후, 진탕 추출하여 분획하여 유기용매층을 감압 농축하여 에틸아세테이트 추출물을 수득하는 3 단계;
상기 에틸아세테이트 추출물을 실리카겔이 충진된 컬럼에서 클로로포름 및 메탄올을 5 ~ 20 : 1 부피비로 포함하는 혼합 용매로 분획하여 수득한 5개의 분획물을 수득하는 4 단계; 및
4 단계의 분획물을 컬럼을 사용하여 세미-프렙(semi-prep)분리하여 5개의 분획물을 수득한 후, 이를 메탄올을 재결정시키는 5 단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조하는 것을 특징으로 하는 Nrf2 인덕션 리바이탈라이징 제제의 제조방법.