JP5710311B2 - 添加培地の添加制御方法、及び当該方法を用いた細胞培養装置 - Google Patents

Description

本発明は、例えば医薬品等の主原料となる物質を生産する細胞の培養に係り、その際に適用される添加培地の添加制御方法、及び当該方法を用いた細胞培養装置に関する。

抗体医薬をはじめとする医薬品の中には、細胞が産生する物質を主成分として含有しているものがある。このような物質は、例えば動物細胞により分泌生産されるため、動物細胞を培養し、培養液中に分泌された目的物質を分離精製することで取得できる。細胞を培養する工程では、細胞は***を繰り返すことにより増殖するが、培養環境が悪化すると細胞死を起こす細胞が増大し、培養環境の悪化が持続すると最終的には全ての細胞が死滅してしまう。培養環境の悪化の要因には、攪拌による力学的な破砕、栄養素の枯渇、細胞によって分泌されるアンモニアや乳酸といった老廃物の蓄積等が挙げられる。

細胞の培養方法は、培養液の置換方法の違いに応じて、回分培養（batch culture）、連続培養（灌流培養、continuous culture）、流加培養（半回分培養、semibatch culture、fed batch culture）に分類される。

回分培養は、一回毎に新たな培地を用意し、そこに株を植えてからは収穫まで新たな培地を加えない方法である。この回分培養では、個々の培養の品質はバラつくが、コンタミネーションのリスクを分散・低減できるという特徴がある。

連続培養は、一定の速度で培養系に培地を供給し、同時に生成物を含む同量の培養液を抜き取っていく培養法である。この連続培養では、培養環境を常に一定に保ちやすく、生産性が安定するという特徴がある。その反面、一度コンタミネーションが起きると汚染も持続するのが欠点である。

流加培養は、培養中に、培地自体や培地中の特定の成分を添加し、培養終了時まで生成物を含む培養液を抜き取らない培養方法である。この流加培養は、細胞密度を調節することによって増殖性を最適化する、培養中に蓄積した有害物質を希釈して生産性を維持する等の目的で行われる。

特に、流加培養や連続培養では、添加培地の流加方法、すなわち添加方法を工夫することにより栄養源の枯渇をなくし、また、エネルギー源の一つである炭素源（グルコース）の利用と、主として乳酸代謝からＴＣＡサイクル(tricarboxylic acid cycle)による完全酸化を利用したＡＴＰ(Adenosine Triphosphate)へのシフトとにより、エネルギー源を効率的に利用させ、有害代謝産物の蓄積を防いで細胞の高密度化を達成させる流加方法が開発され、高細胞濃度が達成可能となっている。

特開２００７−２４４３４１号公報 特表昭６２−５０３１４６号公報

ところで、上述したような如何なる培養方法においても、添加培地における成分組成比の精度の悪さより、培養が経過するにつれて１種類以上の栄養成分濃度が目標濃度（制御値）から逸脱して栄養バランスが崩れ、栄養枯渇によるアポトーシス等の細胞死や、過剰栄養濃度における非効率な代謝によってアンモニア，乳酸といった有害物質の蓄積増大が生じ、目的生産物の生産効率を下げるといった問題があった。

そのため、流加培養では、有害物質の蓄積を効果的に抑えるために、グルコース及びグルタミンをはじめとする各種栄養成分を低濃度に設定し、培養対象の細胞が増殖できる最低限の栄養濃度を維持しながら培養することが考えられている。しかしながら、この場合、各種栄養成分は、細胞が増殖できる最低限の栄養濃度に維持されるだけなので、細胞の高密度化が効率的に行えず、目的生産物の生産効率の低下は防げてもそれ以上の向上は望めない。

そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、添加培地の成分組成比の精度を上げ、培養液中の各栄養成分濃度が制御値を維持する制御を行うことで、目的生産物を優れた収率で生産することができる添加培地の添加制御方法、及び当該方法を用いた細胞培養装置を提供することを目的とする。

本発明は、上記課題を解決するために、細胞の消費する各栄養成分量の比を添加培地の成分組成比とし、細胞内代謝解析を利用して計算される添加培地の成分組成比の精度を向上させ、培養液の各栄養成分について制御値となるような添加培地を供給する。各栄養成分を一定に維持する場合は、上記設計した添加培地を加えることで、培養途中で特定の栄養成分の濃度を変化させる場合には、上記設計した添加培地を供給した上で、さらに濃度を変化させる栄養成分に関し、制御値の差分量を添加することで、培養液中の各成分濃度を制御することを特徴とする。具体的には、次の通りである。

（１） 添加培地の成分組成比を細胞の栄養消費量の比として添加培地を供給制御する。
（２） 添加培地の供給及び供給量を細胞の増殖速度に合わせて決定し、培養液中の栄養成分を一定濃度に維持する。
（３） 培養途中で１種類以上の特定の栄養成分の濃度を変化させる場合には、上記で設計した添加培地を供給した上で、さらに濃度を変化させる栄養成分に関し、制御値との差分量を添加することで、培養液中の各成分濃度を制御する。
（４） 細胞の増殖速度の測定が細胞数の計数で行われる。
（５） 細胞の増殖速度の測定が、グルコース消費量、乳酸分泌量、及びグルコース，乳酸の添加量を指標として行われる。
（６） 細胞内代謝フラックス解析においてＧＣ−ＭＳ／ＭＳ（ガスクロマトグラフィータンデム質量分析計）を用いることで、添加培地の成分組成比を決定する。
（７） ２種類以上の同位体標識基質を利用した細胞内代謝フラックス解析により添加培地の成分組成比を決定する。

本発明に係る添加培地の添加制御方法、及び当該方法を用いた細胞培養装置によれば、培地成分の過不足を防ぐことで、栄養過剰による非効率な代謝や、栄養枯渇による細胞死を防ぐことができ、品質のよい細胞を優れた収率で効率的に生産することができる。

本発明に係る細胞培養装置の一実施の形態としての、流加培養装置の概略構成図である。 細胞内代謝フラックスの推定システムの一実施の形態の構成を示した概念図である。 細胞内代謝フラックスの推定システムで実行される、細胞内代謝フラックスの比の推定方法のアルゴリズムを示したフローチャートである。 細胞内代謝経路モデルに係る基質、代謝物、及び生成物それぞれの炭素原子骨格の変化を示した図である。 基質の炭素原子骨格においてその炭素位置及び個数に着目して立てた代謝反応式の実施例を示した図である。 反応経路を基に導出された代謝反応式に基づく連立方程式を示す図である。 同位体標識されたチロシンを添加した場合の炭素原子骨格の変化についての説明図である。 代謝フラックスの推定値の信頼区間を求めるに当たり、その信頼区間の上限値の決定方法の一実施例を示したフローチャートである。 代謝経路それぞれの代謝フラックスの値の信頼区間を示した図である。 生細胞数の増殖曲線を示した図である。 グルタミン消費量と生細胞数の時間積分との関係を示す図である。 グルコース消費量と乳酸消費量との合計と生細胞数の時間積分との関係を示す図である。

本発明の一実施の形態に係る、添加培地の添加制御方法、及び当該方法を用いた細胞培養装置について、図面を基に説明する。なお、説明に当たって、培養対象の細胞としては、動物細胞，植物細胞，昆虫細胞，細菌，酵母，真菌，藻類等、何ら限定されるものではないが、以下では、抗体や酵素等のタンパク質を生産する動物細胞を例に説明する。

＜１．細胞培養装置＞
図１は、本発明に係る細胞培養装置の一実施の形態としての、流加培養装置の概略構成図である。

なお、図１に示した流加培養装置１では、その構成理解を容易にするため、培養細胞の栄養成分として一の添加培地３を一の添加培地供給槽５６から培養槽１０に供給制御する装置システムを例に説明するが、その装置システムはこれに限定されるものではなく、栄養成分及び／又は成分比が互いに異なる複数の添加培地３，・・・をそれぞれ対応する複数の添加培地供給槽５６，・・・から培養槽１０に供給制御する装置システムにも適用可能である。また、機器の具体的な構成も、図示の機器構成に限られるものではなく、同様な機能を備えた別の機器を用いて、同様な装置システムを実現することを妨げるものではない。

図１において、流加培養装置１は、培養槽１０と、フィード培地システム５０とを有して構成されている。フィード培地システム５０は、培養液分析計５２，制御コントローラ５４，添加培地供給槽５６，ポンプ５８を有する構成となっている。

培養槽１０には、培養の開始に際して、培養細胞が接種された培養液２、すなわち初期培地が貯留されている。初期培地は、培養対象の細胞の種類に応じて適宜選択され、例えば、アミノ酸成分，炭素源成分，ミネラル，ビタミン，血清代替成分等を含むものを挙げることができる。ここで、アミノ酸成分としては、例えば、天然タンパク質を構成する２０種類のアミノ酸や、シスチン，ヒドロキシリジン，ヒドロキシプロリン，チロキシン，Ｏ−ホスホセリン，デスモシン等を挙げることができ、炭素源成分としては、例えば、グルコース，ラクトース，ガラクトース等の糖類や、アルコールを挙げることができる。

槽内には、培養液２を攪拌する攪拌機構２１の攪拌翼２２が設けられている。攪拌翼２２の軸部は、培養槽１０の気密性を保って、槽外に配置された駆動部２３に連結されている。攪拌翼２２は、駆動部２３の作動に応動して、槽内で回転可能になっている。駆動部２３は、その作動がフィード培地システム５０の制御コントローラ５４によって制御される。

また、培養槽１０には、槽内に貯留されている培養液２を採取するサンプリングノズル２４や、図示省略した温度測定電極，ｐＨ電極，ＤＯ電極といった検出機器や、槽内に貯留されている培養液２を加熱又は冷却して培養液２の温度（培養温度）を調整するヒーター等の温調機器２６が付設されている。

培養液２の温度は温度測定電極により、培養液２のｐＨはｐＨ電極により、培養液２の溶存酸素濃度はＤＯ電極により、それぞれモニタリングされる。これらモニタリングされた値は、制御コントローラ５４に供給され、制御コントローラ５４による、培養液２の培養温度制御，ｐＨ制御，溶存酸素濃度制御等に利用される。例えば、培養液の培養温度制御では、温度測定電極から供給される培養液２の温度を基に、制御コントローラ５４が温調機器２６を作動制御することによって、培養液２の温度を目的の温度に制御する。

サンプリングノズル２４は、本実施例では三方弁を備えた構成になっている。三方弁は、第１の接続開口部が培養槽１０の槽内と、第２の接続開口部がサンプリング管３４を介して培養液分析計５２と、第３の接続開口部が高圧スチーム発生装置（ＰＳ発生装置、Pure Steam Generator）２５と連通されている。サンプリングノズル２４は、この三方弁の弁制御により、槽内の培養液２の採取や、サンプリング管３４の滅菌等を行う。具体的には、三方弁は、培養槽１０の槽内とサンプリング管３４を介し培養液分析計５２との間を連通させることにより、培養液分析計５２が、培養槽１０の槽内の培養液２を必要量だけ吸引して取り出せるようにする。また、三方弁は、高圧スチーム発生装置２５とサンプリング管３４を介し培養液分析計５２との間を連通させることにより、高圧スチーム発生装置２５により生成されたスチームをサンプリング管３４及び培養液分析計５２に流通させることができる。そして、このスチームを予め定めた滅菌条件で流通させた後、スチームの流通を停止させて各部を乾燥させることにより、サンプリングノズル２４、サンプリング管３４、及び培養液分析計５２の流路を滅菌できる。滅菌条件としては、例えば、１２１℃、２０ｍｉｎといったスチーム流通条件が採用されている。一方、培養液分析計５２によるサンプリング時を除く、培養槽１０での細胞培養中にあっては、三方弁は、高圧スチーム発生装置２５と培養液分析計５２との間をサンプリング管３４を介して連通させた状態になっており、培養槽１０の槽内は、その槽外に対して遮断状態に保たれる。サンプリングノズル２４の三方弁や高圧スチーム発生装置２５からのスチームの供給は、培養液分析計５２の分析作動、すなわちサンプリングに合わせて、培養液分析計５２若しくは制御コントローラ５４により作動制御される。

さらに、培養槽１０には、サンプリングノズル２４を介して接続されたサンプリング管３４に加えて、液中通気用ガス供給管３１，気相用ガス供給管３２，及び添加培地供給管３３が、培養槽１０の気密性を保って、槽外から槽内に連通されて設けられている。この他にも、培養槽１０には、排気流通用，培養液排出用，ｐＨ調節用薬剤の注入用等といった配管が、培養槽１０の気密性を保って、槽外から槽内に連通されて設けられているが、図１では図示省略してある。

液中通気用ガス供給管３１は、培養槽１０の槽内の底部側に配置された散気装置としての、焼結金属製の液中通気散気管（焼結スパーチャージャー）３５に連通されている。液中通気散気管３５は、図示せぬ通気用ガス調節装置から供給される通気用ガスを、槽内の培養液中に気泡化して放出する。バルブ３６は、通気用ガス調節装置とともに、培養液の溶存酸素濃度制御を行う制御コントローラ５４によって作動制御され、通気用ガスの供給又は供給停止、その供給時における供給量を制御する。

培養液２の溶存酸素濃度制御は、制御コントローラ５４が、培養液中の溶存酸素濃度をモニタリングするＤＯ電極の測定出力を基に、通気用ガス調節装置及びバルブ３６を作動制御し、液中通気用ガス供給管３１を介して液中通気散気管３５から培養中に消費した酸素を適量補うことによって行われる。制御コントローラ５４は、培養液中の溶存酸素濃度を上げる場合は、通気用ガス調節装置から液中通気散気管３５に酸素含有ガスを供給することにより、また、培養液中の溶存酸素濃度を下げる場合は、通気用ガス調節装置から液中通気散気管３５に窒素含有ガスを供給することにより、培養液中の溶存酸素濃度を目的の値に制御する。

気相用ガス供給管３２は、培養槽１０の槽内の天井部側に連通されて設けられている。気相用ガス供給管３２は、図示せぬ気相用ガス調節装置から供給される気相用ガスを、槽内の気相部に放出する。バルブ３７は、気相用ガス調節装置とともに、培養液のｐＨ制御を行う制御コントローラ５４によって作動制御され、気相用ガスの供給又は供給停止、その供給時における供給量を制御する。

培養液のｐＨ制御は、制御コントローラ５４が、培養液中のｐＨをモニタリングするｐＨ電極の測定出力を基に、気相用ガス調節装置からの気相用ガス中の炭酸ガス濃度及びバルブ３７を制御し、気相用ガス供給管３２から槽内の気相に気相用ガスを供給することによって行われる。また、制御コントローラ５４は、培養液中のｐＨが細胞の増殖により細胞数密度が高くなって酸性側に移り、培養液のｐＨの調整がこの気相用ガスの供給制御だけでは対応できない場合には、図示せぬｐＨ調節用薬剤の注入用配管を介して水酸化ナトリウム等のアルカリ溶液を適量添加して、培養液２のｐＨの調整を行う。

添加培地供給管３３は、管途中にポンプ５８を介して、フィード培地システム５０の添加培地供給槽５６に連通接続されている。ポンプ５８は、培地供給制御を行う制御コントローラ５４により作動制御され、添加培地供給槽５６から培養槽１０の槽内への添加培地の供給又は供給停止、並びにその供給時における供給量を制御する。

一方、フィード培地システム５０において、培養液分析計５２は、サンプリングノズル２４からサンプリング管３４を介して、培養槽１０の槽内の培養液を必要量だけ吸引して取り出し、この採取した培養液の状態を分析する。培養液分析計５２は、このサンプリングにより培養槽１０から採取した細胞培養中の、例えば、グルコース，グルタミン，乳酸，アンモニア等の濃度や、産生物の濃度や、生細胞数等の測定を行う。培養液の状態を分析するためのサンプリングは、細胞培養中、予め設定された所定間隔で複数回行われる。この培養液分析計５２による１回のサンプリング測定工程には、例えば、少なくとも２０分以上、好ましくは４０分以上、より好ましくは６０分以上といった分析時間を要する。この培養液分析計５２は、１つの機器とは限らず、測定対象に応じた専用の分析器を複数組み合わせた構成としてもよい。培養液分析計５２は、制御コントローラ５４により作動制御され、サンプリング測定したグルコース等の濃度や生細胞数等のデータは、制御コントローラ５４に供給される。これらデータは、制御コントローラ５４において、培養液成分濃度制御等に利用される。

添加培地供給槽５６には、培養槽１０に供給するための添加培養液、すなわち添加培地３が貯留されている。添加培地供給槽５６も、培養槽１０と同様、攪拌機構２１やヒーター２６等が設けられ、添加培地３の培養管理が制御コントローラ５４により行われる。

添加培地供給槽５６に貯留されている添加培地３は、ポンプ５８の作動によって、添加培地供給管３３を介して培養槽１０に供給される。添加培地供給槽５６から培養槽１０への添加培地３の添加（供給）は、制御コントローラ５４が行う培養液成分濃度制御、すなわち添加培地の添加制御の下で行われる。その際、制御コントローラ５４は、添加培地供給槽５６に設けられた図示せぬ液面測定センサーの液面測定出力をモニタリングしながら、ポンプ５８を駆動制御して、添加培地３の送液量すなわち添加量（供給量）を管理する。また、ポンプ５８が定量送液可能な定量ポンプである場合には、液面測定センサーに依らずとも、制御コントローラ５４は直接、ポンプ５８を管理駆動することにより、添加培地３の送液量すなわち添加量（供給量）を制御する構成とすることもできる。

培養液成分濃度制御では、制御コントローラ５４は、培養槽１０の培養液２のサンプリング毎に、培養液分析計５２から供給される培養液２の状態の分析結果に基づいて、次のサンプリングまでに必要な、添加培地３の添加量を演算して決定する。そして、制御コントローラ５４は、この決定された添加量を基にポンプ５８の駆動制御を行い、次のサンプリングまでの間に、この演算された添加量分の添加培地３を培養槽１０の培養液２に添加（送液）する。

なお、複数の添加培地をそれぞれ対応する複数の添加培地供給槽５６からに供給制御する構成の流加培養装置１にあっては、例えば、添加培地供給槽５６，ポンプ５８，添加培地供給管３３を、添加培地毎に設けることによって対応可能である。例えば、添加培地３を用いての培養途中で、添加培地３の中の１種類以上の特定の栄養成分の濃度を培養途中で変化させる必要がある場合には、図１に示したように、これら特定の栄養成分の濃度が高められている添加培地４に係る添加培地供給槽５６，ポンプ５８，添加培地供給管３３を、添加培地３に係る添加培地供給槽５６，ポンプ５８，添加培地供給管３３とは別途に備えた構成にする。加えて、制御コントローラ５４は、添加培地３の中の１種類以上の特定の栄養成分の濃度を培養途中で変化させる必要がある場合には、上述したようにして添加培地３を添加培地供給槽５６から培養槽１０に供給した上で、これら特定の栄養成分に関し、制御値との差分量に応じて添加培地４を添加培地供給槽５６から添加することで、培養槽１０における培養液２の各成分濃度を制御することになる。

制御コントローラ５４は、図示せぬ入・出力装置を備えたコンピュータ装置により構成され、フィード培地システム５０における培養液分析計５２，ポンプ５８等や、培養槽１０に設けられた駆動部２３，ヒーター２６，検出機器，ガス供給管３１・３２のバルブ３６・３７等とそれぞれ接続されている。制御コントローラ５４は、これら各部を作動制御して、上述した培養温度制御，ｐＨ制御，溶存酸素濃度制御，培養液成分濃度制御等の各種制御を実行する。

＜２. 培養液成分濃度制御＞
次に、制御コントローラ５４によって行われる培養液成分濃度制御について詳述する。培養液成分の濃度制御は、添加培地供給槽５６に貯留されている添加培地３を用い、培養槽１０における培養液２の培養液栄養濃度が一定になるように、添加培地３を添加制御することによって行われる。この添加培地３の添加は、例えば、サンプリング測定工程間においてフィード培地を複数回に分けて所定の添加量及び添加タイミングで行う。その際、添加培地供給槽５６に貯留される添加培地３には、シミュレーションと培養実験とを基に、その成分組成比が決定された添加培地を用いる。
そこで、まず、添加培地供給槽５６に貯留される添加培地３の成分組成比の決定方法について説明する。

＜２-１. 細胞内代謝フラックスの推定システム＞
添加培地供給槽５６に貯留される添加培地３の成分組成比は、培養細胞が消費する各栄養成分の量の比となるように決定される。添加培地３の成分組成比は、細胞内代謝フラックス解析における各栄養成分に関する代謝フラックス（細胞内代謝ネットワーク中の物質の流れ）を推定し、この推定した各栄養成分同士の代謝フラックスの比をとることによって求める。添加培地３の成分組成比の決定は、細胞内代謝フラックスの推定システムを用いて推定された細胞内代謝フラックスを基にして行われる。

図２は、細胞内代謝フラックスの推定システムの一実施例の構成を示した概念図である。
本実施例の細胞内代謝フラックスの推定システム１００では、推定処理装置１１０が、細胞内代謝経路データベース１２０と培養実験分析装置１３０とにデータ接続された構成になっている。また、推定処理装置１１０には、信頼区間決定装置１６０がデータ接続され、この信頼区間決定装置１６０には、成分組成比設定装置１７０が付設されている。推定処理装置１１０、信頼区間決定装置１６０、及び成分組成比設定装置１７０は、図示せぬ入・出力装置を備えた同一のコンピュータ装置により構成される。

推定処理装置１１０は、乱数部１１２と、順計算処理部１１４と、同位体比率分布処理部１１６と、ＱＰ(Quadratic Programming）部分問題法処理部１１８とを含む構成になっている。

細胞内代謝経路データベース１２０には、細胞毎の、所定の基質毎に係る細胞内代謝経路が記憶されている。

培養実験分析装置１３０は、同位体標識を用いた所定の基質に係る細胞の培養実験１４０により得られた細胞内代謝物について、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー質量分析計）、ＧＣ−ＭＳ／ＭＳ（ガスクロマトグラフィータンデム質量分析計）を用いた分析を行い、細胞内の代謝物測定を行う。

細胞内代謝フラックスの推定システム１００は、培養液成分の濃度制御に先立って添加培地供給槽５６に貯留する添加培地３の成分組成比を決定するために、推定処理装置１１０によるシミュレーションと、培養実験分析装置１３０により取得された、培養実験１４０を基にしたＧＣ−ＭＳ及びＧＣ−ＭＳ／ＭＳの分析結果による細胞内の代謝物測定結果とにより、細胞内の代謝フラックスを推定する。

なお、推定処理装置１１０は、同じく入・出力装置を備えたコンピュータ装置により構成されたフィード培地システム５０の制御コントローラ５４が兼ねる構成であってもよい。

次に、細胞内代謝フラックスの推定システム１００により行われる、解析対象となる細胞の細胞内代謝フラックスの推定方法について、図面を基に説明する。

図３は、図２に示した細胞内代謝フラックスの推定システム１００において、推定処理装置１１０が実行する、細胞内代謝フラックスの推定のためのアルゴリズムを示したフローチャートである。

推定処理装置１１０によるシミュレーションでは、まず、解析対象となる培養細胞、さらに、この培養細胞が消費する各栄養成分、すなわち添加培地を形成する各基質を、図示せぬ入・出力装置によって、推定処理装置１１０に設定する。

推定処理装置１１０は、解析対象の細胞及び基質が設定入力されると、この解析対象の細胞及び基質に対応する細胞内代謝経路を細胞内代謝経路データベース１２０から検索して、入・出力装置に表示する。今回のシミュレーションで用いる細胞内代謝経路モデル１５０の設定は、この検索された細胞内代謝経路の中から所望の細胞内代謝経路を入・出力装置により決定することによって行われる。推定処理装置１１０は、このようにして、今回のシミュレーションで用いる細胞内代謝経路モデル１５０を決定し、細胞内代謝経路データベース１２０から取得することになる。

例えば、解析対象の細胞に対応する細胞として、抗体医薬等のバイオ医薬品の製造でよく使用されるチャイニーズハムスターの卵巣細胞（Chinese Hamster Ovary (ＣＨＯ)細胞）が入力された場合は、Provostの研究（A. Provost et al., Metabolic Design of Macroscopic Models: Application to Chinese Hamster Ovary cells, Bioprocess Biosyst Eng, 2006, 29:349-366）に示される代謝経路や、ＫＥＧＧ(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)データベースで公開されている代謝経路マップの情報が検索され、推定処理装置１１０では、これら検索された代謝経路を解析対象となるＣＨＯ細胞の細胞内代謝経路モデル１５０として利用することができる。

その上で、推定処理装置１１０は、このようにして決定された、今回のシミュレーションで用いる細胞内代謝経路モデル１５０に係り、解析対象の細胞の、解析対象の基質について細胞内代謝フラックスの推定処理を行う。

ここで、例えば、解析対象の細胞の、基質Ａについて、今回のシミュレーションで用いる細胞内代謝経路モデルとして、図２に示すような細胞内代謝経路モデル１５０が決定されたものとする。

図２において、解析対象となる細胞の、今回のシミュレーションで用いる、基質Ａについて決定された細胞内代謝経路モデル１５０では、細胞は、基質Ａが与えられると、代謝経路Ｒ１を経て、この基質Ａを代謝物Ｂとして細胞内に取り込む。そして、細胞は、代謝物Ｂから代謝経路Ｒ２を経て代謝物Ｄを生成するとともに、同じく代謝物Ｂから代謝経路Ｒ４を経て代謝物Ｃ及び代謝物Ｅを生成する。この場合の代謝物Ｅは、代謝物Ｃの生成に当たっての副産生物に該当する。さらに、細胞は、この中の生成した代謝物Ｃについては、代謝経路Ｒ５を経て代謝物Ｄを生成する。すなわち、この細胞内代謝経路モデル１５０では、細胞は、代謝経路Ｒ２と、代謝経路Ｒ４及びＲ５との２通りの代謝経路により、代謝物Ｂから代謝物Ｄを生成するようになっている。その上で、細胞は、この生成した代謝物Ｄから代謝経路Ｒ６を経て生成物Ｆを生成し、この生成物Ｆを細胞外に排出するようになっている。

その際、余剰の代謝物Ｄについては、細胞は、代謝経路Ｒ３を経て代謝物Ｂに戻すようになっている。細胞は、その一方で、代謝経路Ｒ１を経て取り込んだ及び／又は代謝経路Ｒ３を経て戻された代謝物Ｂが余剰になると、代謝経路Ｒ４による代謝物Ｃの副産生物として生成された代謝物Ｅとは別に、代謝物Ｅを生成する。図示の例では、代謝物Ｂの量Ｂｍを同量とすると、余剰の代謝物Ｂから生成される代謝物Ｅの量Ｅｍは、代謝経路Ｒ４による代謝物Ｃの副産生物として生成される代謝物Ｅの量Ｅｍの２倍の量に相当する。

推定処理装置１１０は、このようにして解析対象となる細胞、基質Ａに係り、今回のシミュレーションで用いる細胞内代謝経路モデル１５０が決定されると、この取得した細胞内代謝経路モデル１５０を基に、基質Ａ，細胞内代謝物Ｂ〜Ｄ，生成物Ｆそれぞれの炭素原子骨格の各炭素位置及び個数に注目し、反応経路（すなわち、代謝経路）を立てる（図３、ステップＳ０１０）。

図４は、図２に示した細胞内代謝経路モデル１５０に係る基質Ａ、代謝物Ｂ〜Ｅ、及び生成物Ｆそれぞれの炭素原子骨格の変化を示した図である。

図４に示すように、細胞内代謝経路モデル１５０によれば、基質Ａ、代謝物Ｂ，Ｄ、及び生成物Ｆそれぞれが３つの炭素原子をその炭素原子骨格に有し、代謝物Ｃは２つの炭素原子をその炭素原子骨格に有し、代謝物Ｅは１つの炭素原子をその炭素原子骨格に有する物質構造になっていることを、推定処理装置１１０は理解することができる。

図５は、図２に示した細胞内代謝モデル１５０に係り、基質Ａの炭素原子骨格においてその炭素位置及び個数に着目して、推定処理装置１１０が立てた代謝反応式の実施例を示した図である。

図５（ａ）は、基質Ａの炭素原子骨格において１つの炭素位置に着目して、細胞内代謝モデル１５０から導出された代謝反応式の例である。図示の場合は、基質Ａの３つの炭素原子からなる炭素原子骨格の２位又は３位のそれぞれ１つの炭素原子Ａ_２，Ａ_３に着目して取得した代謝反応式の例である。

図示の例では、基質Ａの炭素骨格の２位の炭素原子Ａ_２は、代謝経路Ｒ１を経て代謝物Ｂの炭素骨格の２位の炭素Ｂ_２となり、代謝物Ｂの炭素骨格の２位の炭素Ｂ_２は、代謝経路Ｒ２を経て代謝物Ｄの炭素骨格の２位の炭素Ｄ_２や、代謝経路Ｒ４を経て生成された代謝物Ｃの炭素骨格の１位の炭素Ｃ_１になることが理解できる。また、代謝物Ｄの炭素骨格の２位の炭素Ｄ_２は、代謝経路Ｒ３を経て代謝物Ｂの炭素骨格の２位の炭素Ｂ_２になることも理解できる。

その一方で、基質Ａの炭素骨格の３位の炭素原子Ａ_３は、代謝経路Ｒ１を経て代謝物Ｂの炭素骨格の３位の炭素Ｂ_３となり、代謝物Ｂの炭素骨格の３位の炭素Ｂ_３は、代謝経路Ｒ２を経て代謝物Ｄの炭素骨格の３位の炭素Ｄ_３や、代謝経路Ｒ５を経て代謝物Ｄの炭素骨格の２位の炭素Ｄ_２になることが理解できる。また、代謝物Ｄの炭素骨格の３位の炭素Ｄ_３は、代謝経路Ｒ３を経て代謝物Ｂの炭素骨格の３位の炭素Ｂ_３になることも理解できる。

図５（ｂ）は、基質Ａの炭素原子骨格において２つのそれぞれ炭素位置に着目して、細胞内代謝モデル１５０から導出された代謝反応式である。図示の場合は、基質Ａの３つの炭素原子からなる炭素原子骨格の２位及び３位の２つの炭素原子Ａ_２３に着目して取得した代謝反応式の例である。

図示の例では、基質Ａの３つの炭素原子からなる炭素原子骨格の２位及び３位の２つの炭素原子Ａ_２３は、代謝経路Ｒ１を経て代謝物Ｂの炭素骨格の２位及び３位の２つの炭素原子Ｂ_２３となり、代謝物Ｂの炭素骨格の２位及び３位の２つの炭素原子Ｂ_２３は、代謝経路Ｒ２を経て代謝物Ｄの炭素骨格の２位及び３位の２つの炭素原子Ｄ_２３になることが理解できる。また、代謝物Ｄの炭素骨格の２位及び３位の２つの炭素原子Ｄ_２３は、代謝経路Ｒ３を経て代謝物Ｂの炭素骨格の２位及び３位の２つの炭素原子Ｂ_２３になることも理解できる。

その一方で、代謝物Ｂの３つの炭素原子からなる炭素原子骨格の中、炭素骨格の３位の１つの炭素原子Ｂ_３と代謝物Ｃの炭素骨格の１位の炭素Ｃ_１とは、代謝経路Ｒ５を経て代謝物Ｄの炭素骨格の２位及び３位の２つの炭素原子Ｄ_２３になることが理解できる。

図５（ｃ）は、基質Ａの炭素原子骨格において３つのそれぞれ炭素位置に着目して、細胞内代謝モデル１５０から導出された代謝反応式の例である。図示の場合は、基質Ａの３つの炭素原子からなる炭素原子骨格の１位から３位の３つの炭素原子Ａ_１２３に着目して取得した代謝反応式の例である。

図示の例では、基質Ａの３つの炭素原子からなる炭素原子骨格の１位から３位の３つの炭素原子Ａ_１２３は、代謝経路Ｒ１を経て代謝物Ｂの炭素骨格の１位から３位の３つの炭素原子Ｂ_１２３になることが理解できる。そして、代謝物Ｂの１位から３位の３つの炭素原子Ｂ_１２３は、代謝経路Ｒ２を経て代謝物Ｄの１位から３位の３つの炭素原子Ｄ_１２３になることが理解できる。また、代謝物Ｄの１位から３位の３つの炭素原子Ｄ_１２３は、代謝経路Ｒ６を経て生成物Ｆの１位から３位の３つの炭素原子Ｆ_１２３になり、代謝経路Ｒ３を経て代謝物Ｂの１位から３位の３つの炭素原子Ｂ_１２３になることも理解できる。

その一方で、代謝物Ｂの３つの炭素原子からなる炭素原子骨格の中、２位及び３位の２つの炭素原子Ｂ_２３と代謝物Ｃの炭素骨格の１位の炭素Ｃ_１とは、代謝経路Ｒ５を経て代謝物Ｄの炭素骨格の１位から３位の３つの炭素原子Ｄ_１２３になることが理解できる。

したがって、このようにして、分析対象の基質Ａについての細胞内代謝経路モデル１５０の決定が行われれば、推定処理装置１１０では、解析対象の細胞について、基質Ａ、代謝物Ｂ〜Ｄ、生成物Ｆそれぞれの炭素原子骨格における炭素原子位置及び炭素原子個数に注目して、図５に示すような反応経路を立てることができる（図３、ステップＳ０１０）。

そして、推定処理装置１１０は、図５に示すような反応経路を立てると、この反応経路を基に、基質Ａの炭素原子骨格における２位，３位それぞれの炭素原子の個数量をＭ(Ａ_２) ，Ｍ(Ａ_３) 、代謝物Ｂの炭素原子骨格における２位，３位それぞれの炭素原子の個数量をＭ(Ｂ_２) ，Ｍ(Ｂ_３) 、代謝物Ｃの炭素原子骨格における１位の炭素原子の個数量をＭ(Ｃ_１) 、代謝物Ｄの炭素原子骨格における２位，３位それぞれの炭素原子の個数量をＭ(Ｄ_２) ，Ｍ(Ｄ_３) 、・・・といった具合に表わし、反応経路Ｒ１〜Ｒ６それぞれのフラックスの値ｒ_１〜ｒ_６を変数とした連立方程式を立てる（図３、ステップＳ０２０）。

図６は、反応経路を基に導出された、解析対象の細胞の分析対象の基質Ａに係る代謝反応式に基づく連立方程式を示した図である。

図６に示す連立方程式を立てるに当たって、推定処理装置１１０は、細胞内に代謝物Ｂ，Ｄの余剰が蓄積しないように、代謝物毎に、他の代謝物からの炭素の供給個数と他の代謝物への炭素の供給個数とが一致することを前提にしている。

そこで、細胞の基質Ａに対応して決定された細胞内代謝経路モデル１５０では、代謝経路Ｒ４による代謝物Ｃの副産生物として生成された代謝物Ｅとは別に、代謝物Ｄ及び代謝物Ｂが余剰になった場合に生成される代謝物Ｅを少なくすることが、栄養過剰による非効率な代謝を防ぎ、品質のよい細胞を優れた収率で効率的に生産する上で重要となる。

このように、図５に示した、基質Ａ、代謝物Ｂ〜Ｅ、及び生成物Ｆそれぞれの炭素原子骨格の変化では、代謝物Ｃの炭素骨格の１位の炭素Ｃ_１が代謝物Ｄの炭素骨格の３位の炭素Ｄ_３になるのに伴い、代謝物Ｃの生成の基になった代謝物Ｂの炭素骨格の３位の炭素Ｂ_３が代謝物Ｄの炭素骨格の２位の炭素Ｄ_２となることが、生成物Ｆについての優れた収率での生産になる。

図６（ａ）は、基質Ａの炭素原子骨格において１つの炭素位置に着目した場合の、図５（ａ）に示す代謝反応式に基づく連立方程式である。

具体的には、代謝物Ｃに関して、その炭素原子骨格の１位の炭素原子Ｃ_１に係り、代謝経路Ｒ４，Ｒ５を介しての入・出の平衡に基づき、
ｒ_４・Ｍ(Ｂ_２)＝ｒ_５・Ｍ(Ｃ_１)
であるから、
(−ｒ_５)・Ｍ(Ｃ_１)＋ｒ_４・Ｍ(Ｂ_２)＋０・Ｍ(Ｄ_２)＋０・Ｍ(Ｂ_３)＋０・Ｍ(Ｄ_３)＝０・Ｍ(Ａ_２)＋０・Ｍ(Ａ_３)
との平衡式が得られる。

同様に、代謝物Ｂに関して、その炭素原子骨格の２位の炭素原子Ｂ_２に係り、代謝経路Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４を介しての入・出の平衡に基づき、
ｒ_１・Ｍ(Ａ_２)＋ｒ_３・Ｍ(Ｄ_２)＝ｒ_２・Ｍ(Ｂ_２)＋ｒ_４・Ｍ(Ｂ_２)
であるから、
０・Ｍ(Ｃ_１)＋(−ｒ_２−ｒ_４)・Ｍ(Ｂ_２)＋ｒ_３・Ｍ(Ｄ_２)＋０・Ｍ(Ｂ_３)＋０・Ｍ(Ｄ_３)＝−ｒ_１・Ｍ(Ａ_２)＋０・Ｍ(Ａ_３)
との平衡式が得られる。

同様に、代謝物Ｂに関して、その炭素原子骨格の３位の炭素原子Ｂ_３に係り、代謝経路Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ５を介しての入・出の平衡に基づき、
ｒ_１・Ｍ(Ａ_３)＋ｒ_３・Ｍ(Ｄ_３)＝ｒ_２・Ｍ(Ｂ_３)＋ｒ_５・Ｍ(Ｂ_３)
であるから、
０・Ｍ(Ｃ_１)＋０・Ｍ(Ｂ_２)＋０・Ｍ(Ｄ_２)＋(−ｒ_２−ｒ_５)・Ｍ(Ｂ_３)＋ｒ_３・Ｍ(Ｄ_３)＝０・Ｍ(Ａ_２)＋(−ｒ_１)・Ｍ(Ａ_３)
との平衡式が得られる。

同様に、代謝物Ｄに関しては、その炭素原子骨格の２位の炭素原子Ｄ_２に係り、代謝経路Ｒ２，Ｒ３，Ｒ５それぞれを介しての入・出の平衡に基づき、
ｒ_２・Ｍ(Ｂ_２)＋ｒ_５・Ｍ(Ｂ_３)＝ｒ_３・Ｍ(Ｄ_２)
であるから、
０・Ｍ(Ｃ_１)＋ｒ_２・Ｍ(Ｂ_２)＋(−ｒ_３)・Ｍ(Ｄ_２)＋ｒ_５・Ｍ(Ｂ_３)＋０・Ｍ(Ｄ_３)＝０・Ｍ(Ａ_２)＋０・Ｍ(Ａ_３)
との平衡式が得られる。

同様に、代謝物Ｄに関しては、その炭素原子骨格の３位の炭素原子Ｄ_３に係り、代謝経路Ｒ２，Ｒ３，Ｒ５それぞれを介しての入・出の平衡に基づき、
ｒ_２・Ｍ(Ｂ_３)＋ｒ_５・Ｍ(Ｃ_１)＝ｒ_３・Ｍ(Ｄ_３)
であるから、
ｒ_５・Ｍ(Ｃ_１)＋０・Ｍ(Ｂ_２)＋０・Ｍ(Ｄ_２)＋ｒ_２・Ｍ(Ｂ_３)＋(−ｒ_３)・Ｍ(Ｄ_３)＝０・Ｍ(Ａ_２)＋０・Ｍ(Ａ_３)
との平衡式が得られる。
これらの平衡式を、行列式による連立方程式として表わすと、図６（ａ）になる。

また、図６（ｂ）は、基質Ａの炭素原子骨格において２つの炭素位置に着目した場合の、図５（ｂ）に示す代謝反応式に基づく連立方程式である。

具体的には、代謝物Ｄに関して、その炭素原子骨格の２位及び３位の炭素原子Ｄ_２３に係り、代謝経路Ｒ２，Ｒ３，Ｒ５を介しての入・出の平衡に基づき、
ｒ_２・Ｍ(Ｂ_２３)＋ｒ_５・Ｍ(Ｂ_３×Ｃ_１)＝ｒ_３・Ｍ(Ｄ_２３)
であるから、
(−ｒ_３)・Ｍ(Ｄ_２３)＋ｒ_２・Ｍ(Ｂ_２３)＝(−ｒ_５)・Ｍ(Ｂ_３×Ｃ_１)＋０・Ｍ(Ａ_２３)
になる。なお、上式で、Ｍ(Ｂ_３×Ｃ_１)は、代謝経路Ｒ５を経て代謝物Ｄの炭素原子骨格の２，３位の炭素原子Ｄ_２３になる、代謝物Ｂの炭素原子骨格の３位の炭素原子Ｂ_３，代謝物Ｃの炭素原子骨格の１位の炭素原子Ｃ_１それぞれの個数量を表わす。

同様に、代謝物Ｂに関しては、その炭素原子骨格の２位及び３位の炭素原子Ｂ_２３に係り、代謝経路Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３を介しての流入・出の平衡に基づき、
ｒ_１・Ｍ(Ａ_２３)＋ｒ_３・Ｍ(Ｄ_２３)＝ｒ_２・Ｍ(Ｂ_２３)
であるから、
ｒ_３・Ｍ(Ｄ_２３)＋(−ｒ_２)・Ｍ(Ｂ_２３)＝０・Ｍ(Ｂ_３×Ｃ_１)＋(−ｒ_１)・Ｍ(Ａ_２３)
になる。
これら式を、行列式による連立方程式として表わすと、図６（ｂ）になる。

また、図６（ｃ）は、基質Ａの炭素原子骨格において３つの炭素位置に着目した場合の、図５（ｃ）に示す代謝反応式に基づく連立方程式である。

具体的には、代謝物Ｂに関して、その炭素原子骨格の１位、２位及び３位の炭素原子Ｂ_１２３に係り、代謝経路Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３を介しての入・出の平衡に基づき、
ｒ_２・Ｍ(Ｂ_１２３)＝ｒ_３・Ｍ(Ｄ_１２３)＋ｒ_１・Ｍ(Ａ_１２３)
であるから、
０・Ｍ(Ｆ_１２３)＋ｒ_３・Ｍ(Ｄ_１２３)＋(−ｒ_２)・Ｍ(Ｂ_１２３)＝０・Ｍ(Ｂ_２３×Ｃ_１)＋(−ｒ_１)・Ｍ(Ａ_１２３)
になる。なお、上式で、Ｍ(Ｂ_２３×Ｃ_１)は、代謝経路Ｒ５を経て代謝物Ｄの炭素原子骨格の１，２，３位の炭素原子Ｄ_１２３になる、代謝物Ｂの炭素原子骨格の２，３位の炭素原子Ｂ_２３，代謝物Ｃの炭素原子骨格の１位の炭素原子Ｃ_１それぞれの個数量を表わす。

代謝物Ｄに関して、その炭素原子骨格の１位、２位及び３位の炭素原子Ｄ_１２３に係り、代謝経路Ｒ２，Ｒ３，Ｒ５，Ｒ６を介しての入・出の平衡に基づき、
ｒ_５・Ｍ(Ｂ_２３×Ｃ_１)＋ｒ_２・Ｍ(Ｂ_１２３)＝ｒ_３・Ｍ(Ｄ_１２３)＋ｒ_６・Ｍ(Ｄ_１２３)
であるから、
０・Ｍ(Ｆ_１２３)＋(−ｒ_３−ｒ_６) ・Ｍ(Ｄ_１２３)＋ｒ_２・Ｍ(Ｂ_１２３)＝０・Ｍ(Ｂ_２３×Ｃ_１) ＋０・Ｍ(Ａ_１２３)
になる。

代謝物Ｆに関して、その炭素原子骨格の１位、２位及び３位の炭素原子Ｆ_１２３に係り、代謝経路Ｒ６を介しての入・出の平衡に基づき、
Ｍ(Ｆ_１２３)＝ｒ_６・Ｍ(Ｄ_１２３)
であるから、
１・Ｍ(Ｆ_１２３)＋ｒ_６・Ｍ(Ｄ_１２３)＋０・Ｍ(Ｂ_１２３)＝０・Ｍ(Ｂ_２３×Ｃ_１) ＋１・Ｍ(Ａ_１２３)
になる。

このようにして、推定処理装置１１０は、解析対象となる細胞内の各代謝物Ａ〜Ｄ中の各炭素位置及び個数に注目して同位体炭素の反応経路（代謝経路）Ｒ１〜Ｒ６を設定し（図３、ステップＳ０１０）、この取得した反応経路Ｒ１〜Ｒ６それぞれを基に、基質Ａ、代謝物Ｂ〜Ｅ、及び生成物Ｆそれぞれの個数量を、Ｍ(Ａ)、Ｍ(Ｂ)〜Ｍ(Ｅ)及びＭ(Ｆ)とし、反応経路Ｒ１〜Ｒ６それぞれのフラックスの値ｒ_１〜ｒ_６を変数とした、図６に示すような連立方程式を立てる（図３、ステップＳ０２０）。

その上で、推定処理装置１１０は、上述の決定した細胞内代謝経路モデル１５０の反応経路Ｒ１〜Ｒ６を基に導出された代謝反応式に基づく連立方程式を、その順計算処理部１１４に設定する。その上で、基質Ａの個数量Ｍ(Ａ_２)，Ｍ(Ａ_３) ，Ｍ(Ａ_２３) ，Ｍ(Ａ_１２３)については既知とできることから、順計算処理部１１４では、連立方程式の代謝フラックスの値ｒ_１〜ｒ_６に最初は乱数部１１２から供給されるランダムな代謝フラックスｒ_１〜ｒ_６の値（乱数）を代入し、代謝物Ｂ〜Ｅ、及び生成物Ｆそれぞれの個数量Ｍ(Ｂ_２)，Ｍ(Ｂ_３) ，Ｍ(Ｂ_２３) ，Ｍ(Ｂ_１２３)、Ｍ(Ｃ_１) 、Ｍ(Ｄ_２)，Ｍ(Ｄ_３) ，Ｍ(Ｄ_２３) ，Ｍ(Ｄ_１２３) 、Ｍ(Ｆ_１２３)をそれぞれ計算により求める。

そして、推定処理装置１１０は、この計算シミュレーションによって得た細胞内代謝物Ｂ〜Ｅ、及び生成物Ｆそれぞれの個数量Ｍ(Ｂ_２)，Ｍ(Ｂ_３) ，Ｍ(Ｂ_２３) ，Ｍ(Ｂ_１２３)、Ｍ(Ｃ_１) 、Ｍ(Ｄ_２)，Ｍ(Ｄ_３) ，Ｍ(Ｄ_２３) ，Ｍ(Ｄ_１２３) 、Ｍ(Ｆ_１２３)を基に、シミュレーションによる細胞内代謝物Ｂ〜Ｅ，生成物Ｆそれぞれの同位体炭素数比ｋ_Ｂ〜ｋ_Ｄ，ｋ_Ｆを演算する（図３、ステップＳ０３０）。

なお、この場合における、同位体炭素数比ｋ_Ｂ〜ｋ_Ｄ，ｋ_Ｆは、例えば、図２に示すような細胞内代謝経路モデル１５０において、代謝経路Ｒ１を介して細胞内に代謝物Ｂとして取り込まれた基質Ａの２位，３位の炭素原子Ａ_２，Ａ_３が、今回想定した代謝フラックスの値ｒ_１〜ｒ_６により、細胞内代謝物Ｂ〜Ｅ、及び生成物Ｆにどのような比で分布しているかを示すパラメータの値である。

また、この細胞内代謝フラックスの推定では、推定処理装置１１０によるシミュレーションによって得た代謝フラックスの値ｒ_１〜ｒ_６を、基質Ａについての細胞内代謝経路モデル１５０の代謝フラックスの値として決定できるか否かを確認するために、培養実験による観測パラメータ（細胞内の各代謝物それぞれの同位体炭素数比）を必要とする。

そこで、推定処理装置１１０は、順計算処理部１１４による乱数部１１２の乱数を用いた計算シミュレーションに基づく代謝物中の同位体炭素数比ｋ_Ｂ〜ｋ_Ｄ，ｋ_Ｆの演算の一方で、培養実験分析装置１３０から、基質Ａの炭素原子骨格の所定の骨格位置の炭素原子を同位体標識した同位体標識基質Ａで培養実験１４０を行って測定した細胞内代謝物Ｂ〜Ｄ中，生成物Ｆ中それぞれの個数量Ｍを基にした、培養実験の結果による細胞内代謝物Ｂ〜Ｄ中，生成物Ｆ中それぞれの同位体炭素数比Ｋ_Ｂ〜Ｋ_Ｄ，Ｋ_Ｆを取得する。

ここで、培養実験による観測パラメータの測定について、説明しておく。
培養実験分析装置１３０による培養実験は、同位体標識をした栄養基質（例えばグルコース）を培養細胞に取り込ませ、ＧＣ−ＭＳ及びＧＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて、細胞内代謝物（例えばグルコース、グリセロール、アセテート、シトレート、ピルビン酸等）の分析を行い、観測パラメータの値を求めることにより行われる。

上述したシミュレーションでは、各代謝物の同位体標識の炭素位置が解析の上で重要となるが、通常の培養実験では、細胞内代謝物の測定には、ＮＭＲ（Nuclear Magnetic Resonance：核磁気共鳴装置）やＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー質量分析計）を用いているため、各細胞内代謝物の炭素原子骨格における同位体標識された炭素位置が不明確となり、代謝フラックスの値の推定精度を悪くしている。その具体例を、図７に示す。

図７は、培養細胞に栄養基質として同位体標識されたチロシン（tyrosine）を添加した場合の炭素原子骨格の変化についての説明図である。図７（ａ）は、細胞内代謝における炭素原子骨格の変化を、図７（ｂ）は、ＧＣ−ＭＳ及びＧＣ−ＭＳ／ＭＳそれぞれによる分析時の炭素原子骨格の様子を示した図である。なお、同図中において、基質Ａの塗り潰した黒丸記号（●記号）は、同位体標識された炭素１３（^１３Ｃ）を示し、塗り潰していない白丸記号（○記号）は標識されていない炭素１２（^１２Ｃ）を示すものとする。

図７（ａ）に示す代謝経路では、４つの炭素原子をその炭素原子骨格に有するチロシンは、その４つの炭素原子を有する炭素原子骨格が分かれて、それぞれの代謝経路を経て、２つの炭素原子を炭素原子骨格に有するグリシンとアセチルコエンザイムＡとが生成される。この場合、チロシンがその炭素原子骨格の２位のみが炭素１３（^１３Ｃ）で同位体標識されているとすると、その際、標識炭素（^１３Ｃ）は、グリシンの炭素原子骨格の２位に移動することになる。

ここで、例えば、ＧＣ−ＭＳでチロシンを測定した場合、その炭素原子骨格に幾つの同位体炭素原子（^１３Ｃ）があるかは判明するが、その炭素原子骨格における位置は不明であるため、代謝経路中の同位体標識の流れの把握が不明瞭になる。一方、ＧＣ−ＭＳ／ＭＳでチロシンを測定した場合、２度目の励起電圧でエネルギーが加えられ、チロシンの炭素原子骨格が２つに分解される。ＧＣ−ＭＳ／ＭＳでは、この分解物を測定することにより、チロシンの炭素原子骨格内におけるどの炭素位置に同位体があったかを大略知ることができる。すなわち、図７（ｂ）に示すように、ＧＣ−ＭＳでは、炭素原子骨格の１位若しくは２位が炭素１３（^１３Ｃ）で同位体標識されているチロシンと、炭素原子骨格の３位若しくは４位が炭素１３（^１３Ｃ）で同位体標識されているチロシンとを、それぞれ区別して把握することはできないが、ＧＣ−ＭＳ／ＭＳでは、それが可能になる。これにより、チロシンの代謝物であるグリシンとアセチルコエンザイムＡとの区別も可能になり、それぞれの代謝経路も明確に把握することができる。培養実験分析装置１３０では、ＧＣ−ＭＳに加えて、ＧＣ−ＭＳ／ＭＳを含むことにより、細胞内代謝での同位体炭素の位置情報が増え、実験に基づく代謝フラックスの推定精度を向上させることができる。

したがって、培養実験分析装置１３０による培養実験では、図２に示した、解析対象となる細胞に栄養基質Ａを与える場合、図４において、塗り潰した黒丸記号（●記号）で示すような、例えば、図４に示すように、炭素骨格の２位のみが標識の炭素１３（^１３Ｃ）で標識されている同位体標識基質Ａ_２＝ [２−^１３Ｃ]Ａとすれば、図５（ａ）に示したような、代謝物Ａ_２から代謝経路Ｒ１を経て生成された代謝物Ｂ_２＝ [２−^１３Ｃ]Ｂや、この代謝物Ｂ_２から代謝経路Ｒ２を経て生成された代謝物Ｄ_２＝ [２−^１３Ｃ]Ｄ及び代謝経路Ｒ４を経て生成された代謝物Ｃ_１＝ [１−^１３Ｃ]Ｃや、この代謝物Ｃ_１から代謝経路Ｒ５を生成された代謝物Ｄ_３＝ [３−^１３Ｃ]Ｄや、このＤ_３から代謝経路Ｒ３を生成された代謝物Ｂ_３＝ [３−^１３Ｃ]Ｂを把握できるようになる。同様に、炭素骨格の３位のみが標識の炭素１３（^１３Ｃ）で標識されている同位体標識基質Ａ_３＝ [３−^１３Ｃ]Ａとすれば、同様にして、代謝物Ａ_３から代謝経路Ｒ１を生成された代謝物Ｂ_３＝ [３−^１３Ｃ]Ｂや、この代謝物Ｂ_３から代謝経路Ｒ２を経て生成された代謝物Ｄ_３＝ [３−^１３Ｃ]Ｄ及び代謝経路Ｒ５を経て生成された代謝物Ｄ_２＝ [２−^１３Ｃ]Ｄを把握できるようになる。また、炭素骨格の２，３位が互いに異なる標識で標識されている同位体標識基質Ａ_２３とすれば、図５（ｂ），（ｃ）に示したような代謝物Ｂ_２３，Ｂ_１２３，Ｄ_２３，Ｄ_１２３を把握できるようになる。

したがって、上述したように、解析対象の細胞に係り、同位体標識基質Ａによる培養実験を行うことにより、培養実験分析装置１３０でも、ＧＣ−ＭＳ及びＧＣ−ＭＳ／ＭＳによる観測パラメータの値を基に、細胞内代謝物Ｂ〜Ｄ、及び生成物Ｆそれぞれの個数量Ｍを基にして、培養実験の結果に基づく細胞内代謝物Ｂ〜Ｄ中、及び生成物Ｆ中の同位体炭素数比Ｋ_Ａ〜Ｋ_Ｄ，Ｋ_Ｆを演算して求めることができる。

図３に示したフローチャートに戻り、細胞内代謝フラックスの推定方法のアルゴリズムに基づき、推定処理装置１１０は、順計算処理部１１４がシミュレーションによる細胞内代謝物Ｂ〜Ｄ，生成物Ｆそれぞれの同位体炭素数比ｋ_Ｂ〜ｋ_Ｄ，ｋ_Ｆを求めると（ステップＳ030）、解析対象の細胞に関しての上述した培養実験の結果に基づく細胞内代謝物Ｂ〜Ｄ中，生成物Ｆ中それぞれの同位体炭素数比Ｋ_Ｂ〜Ｋ_Ｄ，Ｋ_Ｆを取得し、シミュレーションによる代謝物中の同位体炭素数比ｋ_Ｂ〜ｋ_Ｄ，ｋ_Ｆと、実験による代謝物Ｂ〜Ｄ中，生成物Ｆ中それぞれの同位体炭素数比Ｋ_Ｂ〜Ｋ_Ｄ，Ｋ_Ｆとの比較を行う。その際、推定処理装置１１０では、同位体比率分布処理部１１６が、シミュレーションによる代謝物中の同位体炭素数比の値ｋ_Ｂ〜ｋ_Ｄ，ｋ_Ｆと実験による代謝物中の同位体炭素数比の値Ｋ_Ｂ〜Ｋ_Ｄ，Ｋ_Ｆとの間の平均自乗誤差が予め設定された所定範囲よりも大きいか否かを判別し、両者間に統計学的な有意差が生じているか否かを判別する（ステップＳ０４０）。なお、この同位体炭素数比を比較する細胞内代謝物の数は、代謝経路Ｒ１〜Ｒ６が独立な代謝フラックスの数以上であればよい。

そして、同位体比率分布処理部１１６による判別の結果、シミュレーションによる代謝物中の同位体炭素数比の値ｋ_Ｂ〜ｋ_Ｄ，ｋ_Ｆと、代謝物中の対応する同位体炭素数比の値Ｋ_Ｂ〜Ｋ_Ｄ，Ｋ_Ｆとの間の平均自乗誤差が所定範囲よりも大きくなり、両者間に統計学的な有意差が生じる場合には、推定処理装置１１０では、ＱＰ部分問題法処理部１１８が、この両者間（ｋ_Ｂ〜ｋ_Ｄ，ｋ_ＦとＫ_Ｂ〜Ｋ_Ｄ，Ｋ_Ｆとの間）の平均自乗誤差が予め設定された所定範囲内に収まり、最小となるように、先にシミュレーションにより得た代謝経路Ｒ１〜Ｒ６それぞれの代謝フラックスの値ｒ１〜ｒ６の中、当該誤差に関係する代謝経路Ｒ１〜Ｒ６の代謝フラックスの値ｒ１〜ｒ６を修正する（ステップＳ０５０）。

その上で、推定処理装置１１０では、順計算処理部１１４が、このＱＰ部分問題法処理部１１８により修正された代謝経路Ｒ１〜Ｒ６の代謝フラックスの値ｒ_１〜ｒ_６を、ステップＳ０２０で得た連立方程式に代入し直して、再び代謝物Ｂ〜Ｅ、及び生成物Ｆそれぞれの炭素原子の個数量Ｍ(Ｂ_２)，Ｍ(Ｂ_３) ，Ｍ(Ｂ_２３) ，Ｍ(Ｂ_１２３)、Ｍ(Ｃ_１) 、Ｍ(Ｄ_２)，Ｍ(Ｄ_３) ，Ｍ(Ｄ_２３) ，Ｍ(Ｄ_１２３) 、Ｍ(Ｆ_１２３)を計算により求め、シミュレーションによる細胞内代謝物Ｂ〜Ｅ，生成物Ｆそれぞれの同位体炭素数比ｋ_Ｂ〜ｋ_Ｄ，ｋ_Ｆを演算する（ステップＳ０６０）。

そして、推定処理装置１１０では、このシミュレーションによる代謝物中の同位体炭素数比ｋ_Ｂ〜ｋ_Ｄ，ｋ_Ｆと、先に取得した実験による代謝物Ｂ〜Ｄ中，生成物Ｆ中それぞれの同位体炭素数比Ｋ_Ｂ〜Ｋ_Ｄ，Ｋ_Ｆとの比較を行う。その際、推定処理装置１１０では、同位体比率分布処理部１１６が、シミュレーションによる代謝物中の同位体炭素数比の値ｋ_Ｂ〜ｋ_Ｄ，ｋ_Ｆと実験による代謝物中の同位体炭素数比の値Ｋ_Ｂ〜Ｋ_Ｄ，Ｋ_Ｆとの間の平均自乗誤差が予め設定された所定範囲よりも大きいか否かを判別し、両者間に統計学的な有意差が生じているか否かを判別する（ステップＳ０７０）。

一方、これらステップＳ０４０，Ｓ０７０の同位体比率分布処理部１１６による判別処理で、シミュレーションによる代謝物中の同位体炭素数比の値ｋ_Ｂ〜ｋ_Ｄ，ｋ_Ｆと実験による代謝物中の同位体炭素数比の値Ｋ_Ｂ〜Ｋ_Ｄ，Ｋ_Ｆとの間の平均自乗誤差が予め設定された所定範囲であり、両者間に統計学的な有意差が生じない場合には、推定処理装置１１０は、その際における比較判別対象の代謝フラックスの値ｒ_１〜ｒ_６を、代謝経路（反応経路）Ｒ１〜Ｒ６それぞれの代謝フラックスの推定値ｒ_１〜ｒ_６として決定する（ステップＳ０８０）。

通常は、推定処理装置１１０は、２，３回のＱＰ部分問題法処理部１１８での代謝フラックスの値ｒ_１〜ｒ_６の修正による、順計算処理部１１４による修正毎の繰り返し計算で、設定した代謝経路モデル１５０の代謝フラックスの推定値ｒ_１〜ｒ_６を推定できるが、何度、修正を繰り返しても、シミュレーションによる代謝物中の同位体炭素数比の値ｋ_Ａ〜ｋ_Ｅと、実験による代謝物中の同位体炭素数比の値Ｋ_Ａ〜Ｋ_Ｅとの間に、統計学的な有意差が生じる場合には、予め設定した代謝経路モデル１００が間違っているか、実験データの値Ｋ_Ａ〜Ｋ_Ｅが適切に測定されていない、と判断する。そのような場合には、推定処理装置１１０は、その旨を図示せぬ入・出力装置から報知するとともに、再びステップＳ０１０に戻り、代謝経路（反応経路）を設定し直して、細胞内代謝フラックスを推定し直すことになる。

本実施例の細胞内代謝フラックスの推定システム１００では、推定処理装置１１０は、解析対象の細胞について、解析対象の基質毎に、図３にアルゴリズムをフローチャートで示した細胞内代謝フラックスの推定方法に基づき、細胞内代謝フラックスの推定を行う構成になっている。

さらに、本実施例の細胞内代謝フラックスの推定システム１００では、図２に示したように、推定処理装置１１０には、信頼区間決定装置１６０が付設されている。

推定処理装置１１０が、解析対象の細胞の、解析対象の基質それぞれの各代謝経路（各反応経路）の代謝フラックスの推定値を、同位体比率分布処理部１１６による判別結果を基に決定すると、信頼区間決定装置１６０は、この決定した各代謝経路（各反応経路）の推定値の分布や、信頼区間を求める。信頼区間決定装置１６０は、例えば、推定処理装置１１０が基質Ａに係る代謝経路（反応経路）Ｒ１〜Ｒ６それぞれについて決定した代謝フラックスの推定値ｒ_１〜ｒ_６、その際に用いた図６に示した方程式、及び培養実験による細胞内代謝物Ｂ〜Ｄ中及び生成物Ｆ中それぞれの同位体炭素数比Ｋ_Ｂ〜Ｋ_Ｄ，Ｋ_Ｆを、推定処理装置１１０から取得すると、その信頼区間を、Antoniewiczの方法(Maciek R. Antoniewicz et al., Determination of confidence intervals of metabolic fluxes estimated from stable isotope measurements, Metabolic Engineering, 8(2006) 324-337) を用いて、統計学的な手法により求める構成になっている。

図８は、信頼区間決定装置１６０が代謝フラックスの推定値ｒ_１〜ｒ_６の信頼区間を求めるに当たり、その信頼区間の上限値の決定方法の一実施例を示したフローチャートである。

図８において、信頼区間決定装置１６０は、例えば、推定処理装置１１０が解析対象の細胞の基質Ａに係る代謝経路Ｒ１〜Ｒ６それぞれの代謝フラックスの推定値ｒ_１〜ｒ_６を算出して決定すると（ステップＳ１１０）、その推定値ｒ_１〜ｒ_６や、その推定に用いた実験による代謝物中の同位体炭素数比の値Ｋ_Ｂ〜Ｋ_Ｄ，Ｋ_Ｆ等のデータを取得して、その中の１つの代謝経路、例えば代謝経路Ｒ１の代謝フラックスの決定した推定値ｒ_１に着目し、その推定値ｒ_１に所定量ΔＮを加算して値ｒ_１’を更新変更する（ステップＳ１２０）。したがって、信頼区間決定装置１６０では、ステップＳ１２０に示した更新変更処理が実行される度に、その代謝フラックスの更新値ｒ_１’は、当初の推定値ｒ_１に対して所定量ΔＮずつ大きくなっていく。

その上で、信頼区間決定装置１６０は、基質Ａは既知であることから、図６に示した方程式における代謝経路Ｒ１〜Ｒ６それぞれの代謝フラックスの値ｒ_１〜ｒ_６の中、値ｒ_１のみを更新値ｒ_１’に変更し、残りの代謝経路Ｒ２〜Ｒ６それぞれの代謝フラックスの値ｒ_２〜ｒ_６については推定処理装置１１０が決定した推定値ｒ_２〜ｒ_６のままにして、代謝物Ｂ〜Ｅ、及び生成物Ｆそれぞれの個数量Ｍ(Ｂ_２)，Ｍ(Ｂ_３) ，Ｍ(Ｂ_２３) ，Ｍ(Ｂ_１２３)、Ｍ(Ｃ_１) 、Ｍ(Ｄ_２)，Ｍ(Ｄ_３) ，Ｍ(Ｄ_２３) ，Ｍ(Ｄ_１２３) 、Ｍ(Ｆ_１２３)を計算により求め、この推定値ｒ_１の更新変更に応じた細胞内代謝物Ｂ〜Ｅ，生成物Ｆそれぞれの同位体炭素数比ｋ_Ｂ〜ｋ_Ｄ，ｋ_Ｆを演算する（ステップＳ１３０）。

その上で、信頼区間決定装置１６０は、この更新値ｒ_１’に応じて算出した代謝物中の同位体炭素数比の値ｋ_Ｂ〜ｋ_Ｄ，ｋ_Ｆと、実験による代謝物中の同位体炭素数比の値Ｋ_Ｂ〜Ｋ_Ｄ，Ｋ_Ｆとの比較を行う。そして、信頼区間決定装置１６０は、更新値ｒ_１’に応じた代謝物中の同位体炭素数比の値ｋ_Ａ〜ｋ_Ｅと、実験による代謝物中の同位体炭素数比の値Ｋ_Ａ〜Ｋ_Ｅとの平均自乗誤差が予め設定された所定範囲よりも大きいか否かを判別し、両者間に統計学的な有意差が生じているか否かを判別する（ステップＳ１４０）。

この判別により、信頼区間決定装置１６０は、平均自乗誤差が所定範囲よりも小さく、両者間に統計学的な有意差が生じていない場合には、ステップＳ１２０で増加させた推定フラックスの値ｒ_１’を再び所定量ΔＮだけ増加させて更新値ｒ_１’を更新し（ステップＳ１２０）、上述したステップＳ１３０，Ｓ１４０の処理を繰り返す。一方、信頼区間決定装置１６０は、平均自乗誤差が所定範囲よりも小さく、両者間に統計学的な有意差が生じる場合には、代謝経路Ｒ１の代謝フラックスの推定値ｒ_１が上限値に達していると判断して、現在の更新値ｒ_１’から所定量ΔＮを減算してなる前回の更新値ｒ_１’を、代謝経路Ｒ１の代謝フラックスの推定値ｒ_１の上限値に決定する（ステップＳ１５０）。

また、信頼区間決定装置１６０は、代謝経路Ｒ１の代謝フラックスの推定値ｒ_１の下限値についても、上述した上限値の決定と同様にして決定する。この場合は、ステップＳ１２０において、代謝フラックスの推定値ｒ_１から所定量ΔＮを減算して値ｒ_１’を更新変更することと、ステップＳ１５０において、代謝経路Ｒ１の代謝フラックスの推定値ｒ_１の下限値を決定するときには、現在の更新値ｒ_１’から所定量ΔＮを加算してなる前回の更新値ｒ_１’を、代謝経路Ｒ１の代謝フラックスの推定値ｒ_１の下限値に決定することとが、上限値を決定する場合と異なる。

このようにして、信頼区間決定装置１６０は、全ての代謝経路Ｒ１〜Ｒ６の代謝フラックスの推定値ｒ_１〜ｒ_６について、図８に示したようにして、上限値及び下限値を設定し、代謝経路Ｒ１〜Ｒ６それぞれの代謝フラックスの推定値ｒ_１〜ｒ_６の分布並びに信頼区間を求め、入・出力装置に表示する。

図９は、このようにして求めた代謝経路それぞれの代謝フラックスの値の信頼区間を示した図である。
図中、棒グラフ部分９Ａは、ＧＣ−ＭＳ／ＭＳを用いず、ＧＣ−ＭＳだけを用いた細胞内代謝フラックス解析結果により求めた代謝経路Ｒ１〜Ｒ６それぞれの代謝フラックスの推定値の信頼区間である。一方、線分部分９Ｂは、ＧＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた細胞内代謝フラックス解析結果により求めた代謝経路Ｒ１〜Ｒ６それぞれの代謝フラックスの推定値の信頼区間である。

すなわち、図３に示したような細胞内代謝フラックスの推定アルゴリズムを実行する推定処理装置１１０と、図８に示したような信頼区間の決定方法（代謝フラックスの推定値の上限値及び下限値の決定方法）を備えた信頼区間決定装置１６０と含む本実施例の細胞内代謝フラックスの推定システム１００によれば、代謝経路Ｒ１〜Ｒ６それぞれの代謝フラックスの推定値ｒ_１〜ｒ_６の信頼区間を格段に縮めて決定することが可能になる。

また、添加培地を形成する実際の個別の基質によっては、細胞内に取り込まれるための代謝物Ｂは問題ないものの、目的の生成物Ｆを代謝するための代謝物Ｄについては、この代謝物Ｄに到達するまでに細胞内で様々な代謝経路を辿り、他の様々な代謝物として代謝されるため、代謝物Ｄ中での標識同位体が少なくなり、その検出が困難となる場合がある。そこで、このような基質については、代謝経路として近い標識基質を添加することで、生成物Ｆを代謝するための代謝物Ｄ周辺の代謝経路の代謝フラックスの推定値の精度を向上させることができる。

具体的に、このような基質の例として、グルコースを挙げることができる。そこで、グルコースを基質とする場合には、培養実験分析装置１３０による培養実験における観測パラメータの測定では、グルコースの代わりに、添加する代謝経路が近い標識基質として例えばグルタミンを添加することで、生成物Ｆを代謝するための代謝物Ｄ周辺の代謝経路の代謝フラックスの推定値の精度を向上させることができる。

他にも炭素骨格内の炭素位置の流れに着目し、同位体標識位置が異なる基質（例えば、全ての炭素原子が標識された[Ｕ−^１３Ｃ]グルコースと、１位及び２位の炭素原子が標識された[１,２−^１３Ｃ]グルコース）を混ぜて解析することで、細胞内代謝フラックスの推定システム１００の推定精度を上げることが可能になる。

さらに、本実施例の細胞内代謝フラックスの推定システム１００では、図２に示したように、信頼区間決定装置１６０には、成分組成比設定装置１７０が付設されている。成分組成比設定装置１７０は、上述のようにして得られた、培養細胞が消費する各栄養成分、すなわち添加培地を形成する基質それぞれの代謝経路毎のフラックスの推定値及びその信頼区間を基にして、添加培地の成分組成比を、この細胞内代謝フラックス解析における各栄養成分に関する代謝フラックスの比をとることで求める。

以上のように、上述した細胞内代謝フラックスの推定システム１００によれば、細胞内代謝経路のフラックス推定値を精度よく決めることができ、その結果、添加培地の成分組成比の精度も精度よく決定することができる。

＜２-２. 添加培地の添加制御方法＞
図１に示した流加培養装置１においては、成分組成比設定装置１７０により設定すなわち決定された成分組成比を有する添加培地３を用い、培養液２の栄養濃度が培養槽１０内の生細胞数の増加に係わらず個別の細胞に対しては一定になるように、制御コントローラ５４が添加培地３の添加制御を行う。

添加培地供給槽５６からの添加培地３の添加量及び/又は添加タイミングは、培養液分析計５２による培養液２のサンプリング毎に制御コントローラ５４で算出される培養細胞の比増殖速度μを基に、制御コントローラ５４により次のようにして決定される。
まず、細胞の増殖は、次の式（１）に従う。

培養液分析計５２が培養液２中の生細胞数を測定可能な場合は、制御コントローラ５４は、予め設定されている所定のサンプリング間隔で培養液分析計５２に培養槽１０内の生細胞数Ｘ_ｖの測定を行わせ、その測定結果を基に、今回（ｎ回目）のサンプリング時点における生細胞の比増殖速度μ_ｎを、式（１）を積分してなる式（２）を用いて算出する。

制御コントローラ５４は、この算出した今回（ｎ回目）のサンプリング時点における生細胞の比増殖速度μ_ｎの値を用いて、今回（ｎ回目）のサンプリング時点から次（(ｎ＋１)回目）のサンプリング時点までの間における細胞の増殖の経時変化を予測する。

すなわち、制御コントローラ５４は、現時点ｔ_ｎから次の（(ｎ＋１)回目）のサンプリング時点ｔ_ｎ＋１までのサンプリング間隔内における、現時点ｔ_ｎから△ｔ時間後の時刻ｔでの生細胞数Ｘ_ｖ（ｔ）を、式（２）を基にした式（３）により求める。

なお、上記式（３）では、培養槽１０に貯留された培養液２の液量に対してサンプリングされる液量は十分小さいため、培養液２中の生細胞数Ｘ_ｖ(ｔ)については、サンプリング前後での影響変化は無視できるものとした。サンプリングの液量が培養液２の量に対して無視できない場合は、その影響を考慮して、上記式（３）に、サンプリングの液量分に含まれて減少する生細胞数分の補正項を追加しても構わない。

図１０は、式（３）で表わした生細胞数Ｘ_ｖ(ｔ)の増殖曲線を示した図である。
式（３）に示すように、今回（ｎ回目）のサンプリング時ｔ_ｎにおける生細胞数をＸ_ｖｎとすると、その後の生細胞数Ｘ_ｖ(ｔ)は、自然対数ｅを底とし、指数を比増殖速度μとサンプリング時ｔ_ｎからの経過時間（ｔ−ｔ_ｎ）との積とした指数関数に比例して増加する。

したがって、今回（ｎ回目）のサンプリング時ｔ_ｎからそのサンプリング間隔よりも短い△ｔ時間後までの間の培養対象となる生細胞延べ総数Ｘ_{Ｔｏｔａｌ}は、式（４）に示すように、生細胞数Ｘ_ｖの時間積分値に該当する。

このように、制御コントローラ５４は、今回（ｎ回目）のサンプリングでの生細胞数Ｘ_ｖを取得できれば、今回（ｎ回目）のサンプリング時ｔ_ｎから△ｔ時間後までの間の培養対象となる生細胞延べ総数Ｘ_{Ｔｏｔａｌ}を取得することができる。そして、添加培地供給槽５６から培養槽１０に添加する添加培地３の成分組成比が細胞内代謝フラックスの推定システム１００の細胞内代謝フラックス解析に基づいた各栄養成分に関する代謝フラックスの比になっていることから、この生細胞延べ総数Ｘ_{Ｔｏｔａｌ}は、今回（ｎ回目）のサンプリング時ｔ_ｎから△ｔ時間後までの間の添加培地３の添加量に対応する。

これにより、制御コントローラ５４は、今回（ｎ回目）のサンプリング時ｔ_ｎから次回（(ｎ＋１)回目）のサンプリング時ｔ_ｎ＋１までのサンプリング間隔をさらに△ｔ時間毎に複数に時分割して、この各時分割したタイミング毎の添加培地３の添加量を、個別タイミング間それぞれの生細胞延べ総数Ｘ_{Ｔｏｔａｌ}を基にして決定する。

したがって、制御コントローラ５４は、時分割したタイミング毎に次のタイミングまでの添加培地３の添加量を、この生細胞延べ総数Ｘ_{Ｔｏｔａｌｌ}の変動分に合わせて決定することができ、この変動分の生細胞数に対応する量の添加培地３を添加培地供給槽５６から培養槽１０に添加するようにポンプ５８を作動制御する。

次に、この各時分割したタイミング毎の添加培地３の添加量の決定について、グルタミンを例に説明する。
図１１は、グルタミン消費量と生細胞数の時間積分との関係を示す図である。

なお、図中において、時間目盛のプロットの間隔は１２時間である。グルタミン消費量と生細胞数Ｘ_ｖの時間積分との間における比例定数（傾き）ｋは、培養時間ｔの増加に伴う生細胞数Ｘ_ｖの増加により変化するが、サンプリング間隔△ｔが１時間程度の場合は、このサンプリング間隔△ｔ内での比例定数ｋの時間変化は小さく、その値の変化は無視できる。

したがって、グルタミン消費量Ｖは、サンプリング間隔△ｔが１時間程度の場合は、その間のグルタミン消費量Ｖの増加分△Ｖｔ_ｎは生細胞数の時間積分値∫(生細胞数)ｄｔとの関係で、次の式（５）に従うことになる。

したがって、制御コントローラ５４は、サンプリング毎に培養液分析計５２により測定される培養液２中の生細胞数とグルタミンの量とを用いて、サンプリング時点ｔ_ｎから△ｔ時間後までの間の生細胞数Ｘ_ｖの時間積分値とグルタミン消費量Ｖの増加分△Ｖｔ_ｎとの関係を規定する比例定数ｋを算出し、この算出した比例定数ｋと、サンプリング時点ｔ_ｎの生細胞数Ｘ_ｖを基に算出される△ｔ時間後までの間の生細胞数Ｘ_ｖ時間積分値とを用いて、今回（ｎ回目）のサンプリング時ｔ_ｎから△ｔ時間後までの間に培養液２中の生細胞により消費されるグルタミン消費量△Ｖｔ_ｎを算出する。そして、制御コントローラ５４は、この算出されたグルタミン消費量△Ｖｔ_ｎに対応して低下する培養液２中のグルタミン濃度を予測し、培養液２中のグルタミン濃度が低下しないように、今回（ｎ回目）のサンプリング時ｔ_ｎから△ｔ時間後までの間に添加すべき添加培地３の培地量を決定する。

そして、制御コントローラ５４は、この培養液２中のグルタミン濃度を基に決定した添加培地量でポンプ５８を作動制御して、添加培地３を培養槽１０の培養液２に供給制御する。これにより、添加培地３の成分組成比が細胞内代謝フラックスの推定システム１００の細胞内代謝フラックス解析に基づいた各栄養成分に関する代謝フラックスの比になっていることから、グルタミン以外の各栄養成分に関しても一定濃度を維持しながら、添加培地３を添加制御する。

なお、培養途中で１種類以上の特定栄養の成分の濃度を現状と異なる高い濃度に変更する制御を行うには、成分組成比が細胞内代謝フラックス解析に基づいた各栄養成分に関する代謝フラックスの比となっている添加培地３の添加制御に加えて、図１で示したように、今回、濃度変更する成分のみを高濃度にした添加培地４を別途添加することで、培養途中に濃度変化を必要とする添加培地３，４の添加制御にも対応可能になっている。

例えば、流加培養装置１を、図１において破線で示したような複数の添加培地供給槽５６，５６を有する構成とし、一方の添加培地供給槽５６には、所定の成分組成比の添加培地３が、他方の添加培地供給槽５６には、この添加培地３の栄養成分の中の特定の変更する栄養成分だけが高濃度になっている添加培地４が貯留されている構成とする。この場合、制御コントローラ５４は、培養途中の所定のタイミングで、特定の成分濃度変更後の制御値から変更前の添加培地３による制御値の差分だけ、添加培地供給槽５６から添加培地４を培養槽１０に供給させる。このように、流加培養装置１によれば、所定の成分組成比の添加培地３の中の特定の栄養成分の成分濃度を、現状と異なる高い濃度に変更することが可能になる。

一方、添加培地３を添加した培養槽１０の培養液２において、各栄養成分が制御値を満たしているかを確認する場合においては、制御コントローラ５４は、添加培地の全ての栄養成分を培養液分析計５２によってモニタリングできればよいが、全ての栄養成分をモニタリングできない場合であっても、制御コントローラ５４は、最も信頼区間の狭い（精度が高い）栄養成分を基に添加培地３の添加制御を行い、信頼区間の広い（精度が悪い）栄養成分を優先してモニタリングし、その制御値からのずれを調べることにより、流加培養装置１での培養細胞の培養制御の評価を行うことも可能になる。

一方、培養液分析計５２が培養液中の生細胞数を直接測定できない場合には、制御コントローラ５４は、溶存酸素濃度又は培地成分濃度を指標として、以下のようにして、培養槽１０内の生細胞数Ｘ_ｖを算出する。

例えば、溶存酸素を指標とする場合は、制御コントローラ５４は、ＤＯ電極の測定出力を基に培養液中の溶存酸素濃度を測定し、酸素量の時間変動量を導く。酸素消費速度と生細胞数は非常に高い相関関係を有するため、制御コントローラ５４では、測定した酸素量の時間変動量と、相関式より、培養液２中の生細胞数Ｘ_ｖを導出することができる。生細胞数Ｘ_ｖが求まれば、その後は、同様にして培養液２中の今回（ｎ回目）のサンプリング時ｔ_ｎから△ｔ時間後までの間の培養対象となる生細胞延べ総数Ｘ_{Ｔｏｔａｌ}、すなわち生細胞数Ｘ_ｖの時間積分値∫(生細胞数)ｄｔを算出することで、添加すべき添加培地３の量を予測することができる。

また、溶存酸素濃度に代え、培地成分濃度を指標とする場合は、グルコース等の炭素源を指標として、培養液２中の生細胞数を予測することができる。

その具体例として、培養液分析計５２によって培養液２中のグルコース濃度、乳酸濃度を測定することで、培養液２中の生細胞数を導出する場合について、まず説明する。

この場合、時刻ｔ_ｎ（ｎ回目のサンプリング）におけるグルコース消費量ＱＧｌｃ_ｎ及び乳酸消費量ＱＬａｃ_ｎは、次の式（６），式（７）により算出できる。

上記式（６），式（７）では、培養槽１０に貯留された培養液２の液量に対してサンプリングされる液量は十分小さいため、培養液２中の生細胞数Ｘ_ｖ（ｔ）については、サンプリング前後での影響変化は無視できるものとした。サンプリングの液量が培養液２の量に対して無視できない場合は、その影響を考慮して、上記式（６），式（７）に、サンプリングの液量分に含まれて減少する生細胞数分の補正項を追加しても構わない。

図１２は、グルコース消費量と乳酸消費量との合計と生細胞数の時間積分との関係を示す図である。
生細胞数の時間積分と、グルコースの消費量と乳酸の消費量との合計との間には、図１２に示すような比例関係が成り立つ。この比例関係の傾きｋを予め実験で求めておくか、若しくは、前述したサンプリング時点ｔ_ｎから△ｔ時間後までの間の生細胞数Ｘ_ｖの時間積分値とグルタミン消費量Ｖの増加分△Ｖｔ_ｎとの関係を規定する比例定数ｋを求める場合と同様にして、サンプリング毎に培養液分析計５２により測定される培養液２中のグルコースの量と乳酸の量とを、培養液分析計５２によってモニタリングしながら、比例関係の傾きｋを求める。制御コントローラ５４は、比例定数（傾き）ｋの値が決まれば、時刻ｔ_ｎにおける生細胞数Ｘ_ｖを算出することができる。制御コントローラ５４は、生細胞数がわかれば、次のサンプリングまでの間の生細胞数Ｘ_ｖの増殖を予測することができ、上述したグルタミンの場合と同様な方法で、グルコースの消費量と乳酸の消費量とを基に添加培地３の供給量を予測して制御することができる。

以上のような添加制御方法を用いる流加培養装置１によれば、その添加培地３は、細胞内代謝フラックスの推定システム１００により成分組成比が細胞内代謝フラックス解析に基づいた各栄養成分に関する代謝フラックスの比となっているため、培地成分の過不足を防ぐことができ、栄養過剰による非効率な代謝や、栄養枯渇による細胞死を防ぐことができ、品質のよい細胞を優れた収率で効率的に生産することができる。

１ 流加培養装置、 ２ 培養液、 ３，４ 添加培地、 １０ 培養槽、
２１ 攪拌機構、 ２２ 攪拌翼、 ２３ 駆動部、 ２４ サンプリングノズル、
２５ 高圧スチーム発生装置、 ２６ 温調機器、
３１ 液中通気用ガス供給管、 ３２ 気相用ガス供給管、
３３ 添加培地供給管、 ３４ サンプリング管、 ３５ 液中通気散気管、
３６ バルブ、 ３７ バルブ、 ５０ フィード培地システム、
５２ 培養液分析計、 ５４ 制御コントローラ、 ５６ 添加培地供給槽、
５８ ポンプ、 １００ 細胞内代謝フラックスの推定システム、
１１０ 推定処理装置、 １１２ 乱数部、 １１４ 順計算処理部、
１１６ 同位体比率分布処理部、 １１８ ＱＰ部分問題法処理部、
１２０ 細胞内代謝経路データベース、 １３０ 培養実験分析装置、
１４０ 培養実験、 １５０ 代謝経路モデル、 １６０ 信頼区間決定装置、
１７０ 成分組成比設定装置、 ２００ 細胞内代謝経路モデル。

Claims (8)

1. 添加培地の成分組成比を培養細胞の栄養消費量の比とし、当該栄養消費量の比は、２種類以上の同位体標識基質を利用した細胞内代謝フラックス解析により推定した当該培養細胞の各栄養成分に関する代謝フラックスの比をとることによって求められている
   ことを特徴とする添加培地の添加制御方法。
2. 前記２種類以上の同位体標識基質は、栄養成分毎に、当該栄養成分による細胞内代謝物，生成物それぞれの炭素原子骨格における炭素原子位置及び炭素原子個数に注目して設定される
   ことを特徴とする請求項１に記載の添加培地の添加制御方法。
3. 前記２種類以上の同位体標識基質を利用した細胞内代謝フラックス解析では、各栄養成分に関する代謝フラックスを、当該同位体標識基質毎のシミュレーションにより得た細胞内代謝物それぞれの同位体炭素数比と、当該同位体標識基質毎のＧＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた実験により取得した細胞内代謝物それぞれの同位体炭素数比との比較結果に基づいて推定する
   ことを特徴とする請求項１に記載の添加培地の添加制御方法。
4. さらに、推定した各栄養成分に関する代謝フラックスの精度を、当該推定した代謝フラックスの値の信頼区間として取得する
   ことを特徴とする請求項３に記載の添加培地の添加制御方法。
5. 添加培地の供給量を培養細胞の増殖速度に合わせて決定し、
   培養細胞が接種された培養液の栄養成分を一定濃度に維持する
   ことを特徴とする請求項１〜４いずれかに記載の添加培地の添加制御方法。
6. 培養細胞の増殖速度の測定を、グルコース消費量、乳酸分泌量、又はグルコース若しくは乳酸の添加量を指標として行う
   ことを特徴とする請求項５に記載の添加培地の添加制御方法。
7. 添加培地における最も信頼区間の狭い（精度が高い）栄養成分を基に添加培地の供給制御を行い、添加培地における信頼区間の広い（精度が悪い）成分を優先してモニタリングして、添加培地の供給制御値からのずれを調べる
   ことを特徴とする請求項４に記載の添加培地の添加制御方法。
8. 成分組成比を、２種類以上の同位体標識基質を利用した細胞内代謝フラックス解析により推定した当該培養細胞の各栄養成分に関する代謝フラックスの比をとることによって求められた培養細胞の栄養消費量の比とする添加培地を、培養細胞が接種された培養槽の培養液中における生細胞の増殖速度を指標にして当該培養槽に供給制御するフィード培地システム
   を備えていることを特徴とする細胞培養装置。

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