KR102555193B1 - 음이온 전하를 가진 키토산 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 pH 7.5에서 측정된, -20mV 이하인 제타 전위를 갖는 카르복시알킬 키토산, 이를 포함하는 조성물, 이를 제조하는 방법, 및 특히 치료의 분야에서, 류마티스학, 안과학, 미용 의학, 성형 수술, 내과 수술, 피부학 또는 화장품에서 그의 다양한 적용에 관한 것이다.
Description
본 발명은 카르복시알킬 키토산, 이를 포함하는 조성물, 이를 제조하는 제조 방법 및 특히 치료의 분야에서, 류마티스학, 안과학, 미용 의학, 성형 수술, 내과 수술, 피부학 또는 화장품에서 그의 다양한 적용에 관한 것이다.
키토산 유도체는 이미 공지되어 있으며, 특히 WO 2016/016463 및 WO 2016/016464호로 공개된 Kiomed Pharma의 특허 출원 및 상응하는 특허에 개시되어있다. 이들 특허 출원은 키토산 유도체의 물리적, 화학적 또는 물리화학적 특성에 중점을 둔다. 그러나, 특히 이러한 조성물을 사용해야 하는 환자에게 최적화된 치료 이점을 제공하기 위해, 및 특히 이익/위험 비율을 증가시키기 위한 방식으로 치료법의 맥락에서 이러한 조성물이 개선될 필요성이 남아 있다.
진균 키토산의 재아세틸화에 의해 아세틸화도(DA)를 증가시킴으로써 가용성 키토산을 얻을 수 있다. 진균 키토산의 재아세틸화에 의해 생리학적 pH에서 가용성인 제형을 얻는 것이 사실상 가능하지만, 다음과 같은 현상이 발생하는 것을 유의한다:
- 생체 내 또는 유사한 조건 하에서 매우 빠른 분해;
- 예를 들어 주사 또는 관절내 이식에 의해, 이 키토산이 주사되거나 이식되는 대상에서, 면역 반응이 나타남;
- 키토산은 표적화된 적용에 적합하지 않으므로, 특히 주사 또는 관절내 이식에 의해 키토산의 충분히 만족스러운 치료적 사용을 확보하기 위한 역할을 하지 않음.
필수적으로 키토산의 가용화를 목적으로, 키토산의 카르복시알킬화, 및 특히 키토산의 카르복시메틸화에 관련된 다양한 공보가 존재한다. 이론적으로, 키토산은 N-아세틸-글루코사민 단위가 없는 화학식을 가지지만, 실제로 키토산은 키틴으로부터 유래되며, 키틴의 일부는 N-아세틸-글루코사민 단위를 포함하고, 키토산은 키토산에서 N-아세틸-글루코사민 단위의 부분에서 특정한 아세틸화도(DA)를 가진다. 키토산의 DA는 일반적으로 낮다. 그보다 높은 것은, 특히 30% 초과는 일반적으로 재아세틸화된 키토산이다.
또한, 중국 특허 출원 CN1431229A는 카르복시메틸화된 키토산 유도체, 보다 상세하게는 그의 수화 능력에 관한 것이지만, 이 특유의 특징으로 제한된다.
동물 공급원, 특히 갑각류 기원에서 유래된 키틴의 카르복시메틸화가 또한 종래 기술에서 예상되었다. 그러나 갑각류 기원의 키틴은 치환하기 어렵고; 특히, 그것을 치환할 수 있기 위해서는, 그것을 동결시키고 알칼리화할 필요가 있다(예를 들어, 중국 특허 출원 CN106474569 참조). 공정은 구현하기가 어렵고 특히 산업 규모로 운영하기가 어렵다. 한편, 갑각류 기원의 키틴에 기초한 이러한 치환 공정은 에너지면에서 비용이 많이 들고, 재현성이 낮으며, 중합체를 분해하고 N-아세틸-글루코사민 단위의 아세틸기를 상당히 가수분해하기 쉬운 반면에, 제어하기는 어렵다.
본 발명의 목적은 특히 치료의 분야에서, 류마티스학, 안과학, 미용 의학, 성형 수술, 내과 수술, 피부학 또는 화장품에서 인간 또는 동물에서 사용하기에 적합한 적절한 키토산 유도체를 제공하는 기술적 문제를 해결하는 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 목적은 치료 분야에서 인간 또는 동물에 사용하기에 적합하고, 특히 점성보충제로서 사용할 수 있고, 특히 활액 내로 주사되거나 혼합될 수 있는 능력을 갖는, 적절한 키토산 유도체를 제공하는 기술적 문제를 해결하는 것이다.
본 발명의 목적은 특히 재구성된 활액, 다시 말하면, 예를 들어 연골의 표면을 윤활하는 능력을 제공함으로써 관절의 특성을 복구시키는 조성물을 제공하는 기술적 문제를 해결하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 특히 예를 들어 관절 또는 관절 병리 또는 해당 활액의 악화를 치료하기 위해, 활액 및 인간 또는 동물 대상의 활액과의 혼합물에서, 우수한 특성 및 상용성을 나타내는 키토산 유도체, 또는 이를 포함하는 조성물을 제공하는 기술적 문제를 해결하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한 키토산 유도체 또는 이를 포함하는 조성물의 투여를 주사에 의해 받는 대상, 및 특히 예를 들어 이러한 투여를 받는 인간 또는 동물 대상에서 면역 반응을 제한하는 키토산 유도체, 또는 이를 포함하는 조성물을 제공하는 기술적 문제를 해결하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 또한 pH에 기반한 낮은 변동성(variability)을 갖는 특성을 나타내는 키토산 유도체, 또는 이를 포함하는 조성물을 제공하는 기술적 문제를 해결하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한 인간 또는 동물 대상의 조직과의 접촉에 적합한 삼투압 농도(osmolality) 및 그의 사용에 적합한 것으로 간주되는 pH 값을 갖고, 표적화된 치료적 지시, 특히 재생 의학의 맥락에서, 제 자리에서(in situ) 수명, 면역학적 반응 및/또는 이물질 반응 및 생체역학적 특성의 관점에서 허용가능한, 키토산 유도체 또는 이를 포함하는 조성물을 제공하는 기술적 문제를 해결하는 것이다.
본 발명에 따른 키토산 유도체가 상술된 기술적 문제 중 적어도 하나, 바람직하게는 전부를 해결할 수 있다는 사실이 놀라운 방식으로 발견되었다.
본 명세서에 포함되어 있음.
특정 값보다 낮은, 투여되는 매질의 pH 주위의 pH 범위에 걸쳐, 특히 7.5와 동등한 pH에서, (제타 전위로 특성화되는) 정전기 전하를 나타내는 키토산 유도체는 기술되거나 제안된 기술적 문제 중 적어도 하나, 바람직하게 전부를 해결할 수 있게 한다는 사실이 놀라운 방식으로 발견되었다. 특히, 이러한 키토산 유도체는 키토산 유도체 또는 이를 포함하는 조성물이 전형적으로 주사 또는 이식에 의해 투여된 대상의 면역 반응을 제한하는 수단을 제공한다.
본 발명은, 제 2 양태에 따라, 글루코사민 단위, N-아세틸-글루코사민 단위 및 카르복시알킬기로 치환된 글루코사민 단위를 갖는 키토산 유도체에 관한 것으로, 상기 카르복시알킬 키토산은 pH 7.5에서 측정된 제타 전위를 가지며, 이는 -10mV 이하, 바람직하게는 -15mV 이하이다.
특히, 진균 기원의 키토산 유도체는 기술되거나 제안된 기술적 문제 중 적어도 하나, 바람직하게는 전부를 해결할 수 있다는 것이 발견되었다. 특히, 진균 기원의 키토산 유도체는 키토산 유도체 또는 이를 포함하는 조성물이 전형적으로 주사 또는 이식에 의해 투여된 대상의 면역 반응을 제한하는 수단을 제공한다.
본 발명은, 제 1 양태에 따라, 글루코사민 단위, N-아세틸 글루코사민 단위 및 카르복시알킬기로 치환된 글루코사민 단위를 갖는 진균 기원의 카르복시알킬 키토산에 관한 것으로, 상기 카르복시알킬 키토산은 바람직하게는, 전체 단위의 몰수에 대한 치환기의 몰수로 표시되는, 20%보다 큰 카르복시알킬기에 의한 치환도를 가진다.
키토산 유도체 또는 치환된 키토산 유도체가 또한 참조된다.
키토산은, 예를 들어 Chemical Abstracts Service Registry Number(CAS 번호) 9012-76-4로 참조된다.
본 발명에 사용된 키토산은 유리하게는 진균 기원이며, 바람직하게는 유형 Ascomycetes의 진균의 균사체, 특히 Aspergillus niger, 및/또는 진균류 Basidiomycetes, 및 특히 Lentinula edodes(표고 버섯) 및/또는 Agaricus bisporus(버튼 버섯)로부터 유래된다. 바람직하게는, 키토산은 Agaricus bisporus로부터 유래된다. 키토산은 바람직하게는 매우 순수한, 즉 진균 기원 또는 제조 공정으로부터 유래된 극히 낮은 불순물 함량이고, 임플란트 또는 약학 조성물로서의 그의 용도와 상용성인 미생물학적 품질을 갖는 것이 바람직하다. 키토산을 제조하기 위한 하나의 제조 방법은 특허 WO 03/068824(EP 1483299; US 7 556 946)에 기재된 방법이다.
일반적으로, 키틴을 수산화 나트륨의 존재하에 수성 현탁액에 넣은 후, 매질을 원하는 분자 질량에 따라 변하는 가변 지속 시간 동안 고온으로 만든다. 이어서 키토산을 산성 매질에서 가용화하여 정제하고, 알칼리 매질에서 침전시킨 다음, 세척 및 건조시킨다.
바람직하게는, 키토산은 약학적 용도에 적합한 충분히 순수한 등급이다.
키토산은 유리하게는 정제되고, 이어서 바람직하게는 건조된다. 정제 후, 본 발명의 방법은 카르복시알킬 키토산을 건조시키는 단계, 이어서 분말을 얻기 위해 선택적으로 분쇄하는 단계를 포함할 수 있다. 카르복시알킬 키토산은, 예를 들어 물의 증발, 예를 들어 분무-건조 공정, 유동층 공정, 또는 진공 또는 대기압 하에서 열 건조, 또는 심지어 동결건조에 의해 건조될 수 있다.
카르복시알킬 키토산은, 수용액, 예를 들어 신체, 특히 인체에 주사 또는 이식하기에 적합한 약학적으로 허용가능한 품질의 물에 용해될 수 있다.
제조된 키토산은 다양한 상이한 분자 질량일 수 있으며, 일반적으로 10,000 내지 500,000의 범위일 수 있다.
한 변형에 따르면, 평균 분자 질량은 20,000 내지 60,000에 포함된다.
다른 변형에 따르면, 평균 분자 질량은 60,000 내지 100,000에 포함된다.
다른 변형에 따르면, 평균 분자 질량은 100,000 내지 120,000에 포함된다.
다른 변형에 따르면, 평균 분자 질량은 120,000 내지 150,000에 포함된다.
다른 변형에 따르면, 평균 분자 질량은 150,000 내지 220,000로 구성된다.
다른 변형에 따르면, 평균 분자 질량은 220,000 내지 300,000에 포함된다.
다른 변형에 따르면, 평균 분자 질량은 300,000 내지 500,000에 포함된다.
키토산이 가교될 때, 가교된 중합체의 분자량은 실제로 훨씬 높을 수 있다.
분자 질량을 감소시키기 위해 키토산을 가수분해하는 것이 가능하다.
바람직하게는, 평균 분자 질량은 Mark-Houwink 방정식에 따라 고유 점도에 기초하여 계산된, 점도(Mv)의 평균 분자 질량이다. 고유 점도는 유럽 약전의 모노그래프 2.2.9의 방법에 따라 우벨로데(Ubbelohde) 유형의 모세관 점도계로 모세관 점도계에 의해 측정된다. 용액이 적합한 모세관(Lauda, 예를 들어 직경이 0.53mm인 Ubbelohde 510 01 모세관)을 통해 흐르는 유동 시간의 측정은, 예를 들어 모노그래프 2.2.9의 권장 사항에 따라, 자동 점도계 I-Visc(Lauda)에 의해, 먼저 초기 키토산 농도에서, 이어서 여러 희석액에 대해 수행된다. 감소된 고유 점도가 각각의 농도에 대해 이로부터 추론된다. 감소된 점도는 온도의 함수로서 플로팅되고, 농도 0에서의 값이 고유 점도를 그로부터 추론하기 위해 외삽된다. 예를 들어, 화학식 5에 따라, i 희석액의 농도 C(g/mL)의 함수로 i 희석액의 감소된 점도(hred, mL/g)를 플로팅할 필요가 있다.
화학식 2. [hred] = (t1-t0)-(1-C).
평균 점도 질량을 계산하기 위해, Mark-Houwink 방정식이 키토산의 아세틸화도(DA)에 따라, 하기 세 가지 화학식 중 하나에 따라, 상수 k 및 Rinaudo 등의 논문(in: Jt Biol Macromol, 15, 281, 1993)에 의해 추천된 알파로 적용된다.
화학식 3.mV = ([h]/0.082)(1/0,76), 2%의 DA에 대해;
화학식 4.mV = ([h]/0.076)(1/0,76), 10%의 DA에 대해(예를 들어 11.5%);
화학식 5.mV = ([h]/0.074)(1/0,76), 20%의 DA에 대해(예를 들어 21%).
중간 DA 값에 대해, 평균 점도 질량(Mv)을 계산하기 위해 선형 보간이 수행된다.
바람직하게는, 사용된 키토산은 120,000 내지 150,000, 또는 150,000 내지 220,000, 또는 실제로는 220,000 내지 300,000, 또는 심지어 300,000 초과, 및 일반적으로 최대 500,000에 포함되는 평균 분자 질량을 가진다.
카르복시알킬 키토산의 최종 분자 질량을 측정하는 것도 가능하다: 예를 들어 모세관 점도에 의해 고유 점도를 측정할 수 있고, (사전에 카르복시알킬 키토산의 파라미터 K 및 알파를 미리 결정함으로써) 또는 크로마토그래피 방법, 예를 들어 겔 투과 크로마토그래피에 의해, 그로부터 평균 분자 질량(Mw)을 추론할 수 있다.
전형적으로, 본 발명에 따른 카르복시알킬 키토산에서, 글루코사민 단위는 D-글루코사민 단위(D-글루코사민 단위, N-아세틸-D-글루코사민 단위, 및 D-글루코사민 단위 및 N-아세틸-D-글루코사민 단위 중의 적어도 하나가 치환됨)이다.
한 변형에 따르면, 치환된 키토산은 D-글루코사민 단위의 치환만을 가진다.
다른 변형에 따르면, 치환된 키토산은 D-글루코사민 및 N-아세틸-D-글루코사민 단위의 동시 치환을 가지며, 여기서 카르복시알킬기는 키토산의 아민기에 대한 하나의 변형에 따라, 또는 동시적인 키토산의 아민기 및 하이드록실기에 대한 또 다른 변형에 따라 공유적으로 결합된다.
치환은 일반적으로 단지 부분적인 것이며, 모든 단위가 반드시 치환되는 것은 아니다.
일 실시양태에 따르면, 치환된 키토산의 총 단위(치환되거나 비치환된 D-글루코사민 및 N-아세틸-D-글루코사민 단위)의 몰수에 대한 D-글루코사민 단위의 몰수로 표시되는 D-글루코사민 단위의 치환도는 30% 내지 250%의 범위이다.
일 실시양태에 따르면, 총 단위의 몰수에 대한 치환기의 몰수로 표시되는 카르복시알킬기에 의한 치환도는 50%보다 크다.
일 실시양태에 따르면, 치환된 키토산의 총 단위(치환되거나 비치환된 D-글루코사민 및 N-아세틸-D-글루코사민 단위)의 몰수에 대한 D-글루코사민 단위의 몰수로 표시되는 D-글루코사민 단위의 치환도는 50% 내지 200%의 범위이고, 더욱 바람직하게는 70%보다 크다.
일 실시양태에 따르면, 총 단위의 몰수에 대한 치환기의 몰수로 표시된, 카르복시알킬기에 의한 치환도는 80%보다 작다.
전형적으로, 치환은 공유 결합에 의해 이루어진다.
한 변형에 따르면, 카르복시알킬 키토산은 N,O-카르복시알킬 키토산이다. O-위치(글루코사민 및/또는 N-아세틸-글루코사민 단위의 O3 또는 O6) 및/또는 N 위치(글루코사민 단위의)에서 카르복시알킬기로 치환된 단위의 비율은 달라진다. 그러므로 치환도는 100%보다 클 수 있다.
유리하게는, 카르복시알킬 키토산의 치환도(DS) 및 아세틸화도(DA)는 PH MAS VTN 400SB BL4 NP/H 프로브가 장착된, 브루커 분광계(Avance III HD 400 MHz)를 사용하여 고체-상태 탄소-13 핵자기공명(NMR) 분광법에 의해 측정된다. 예를 들어, 스펙트럼은 주위 온도에서 1 내지 8초 범위의 이완 시간 및 64 내지 512 범위의 스캔의 수로 기록된다. 탄소 신호의 영역은 디컨볼루션(deconvolution) 후에 결정된다. 고려된 탄소는 다음과 같다: "아세틸 CH3"(치환되거나 비치환된 N-아세틸-글루코사민 단위의 아세틸기의 메틸 탄소), "C1"(글루코사민 및 N-아세틸-글루코사민 단위의 위치 1에 있는 탄소) 및 "C=O"(치환되거나 비치환된 카르복시메틸 치환기의 카보닐 탄소 및 N-아세틸-글루코사민 단위의 아세틸기의 카보닐 탄소 C=O). 주어진 카르복시알킬 키토산의 DS를 결정하기 위해, 이 카르복시알킬 키토산의 전구체 키토산의 탄소 13 NMR 스펙트럼을 기록할 필요가 있다. 전구체 키토산 스펙트럼에 기초하여, "CSU 비", 즉 "아세틸 CH3" 기(N-아세틸-글루코사민 단위의 아세틸기의 메틸 탄소)의 신호의 면적 및 "C=O"(N-아세틸-D-글루코사민 단위의 아세틸기의 카보닐 탄소)의 신호의 면적 사이의 비가 계산된다. 카르복시알킬 키토산의 DA는 식 1에 따라 계산되고, DS는 식 2에 따라 계산되며, 여기서 I는 고려된 탄소의 신호의 면적을 나타낸다.
식 1 :
식 2 :
DA 및 DS는 카르복시알킬 키토산에 대한 다른 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어 분석 전에 중수소화된 염산의 농축 용액을 첨가함으로써 카르복시알킬 키토산의 사전 가수분해와 함께, 예를 들어 Liu 등의 문헌(in: Carb Polym 137, 600, 2016)에 의해 기술된 방법에 따라, 자기공명 분광계를 사용하여 수성 매질에서 양성자 NMR에 의해 측정될 수 있다.
신뢰할 수 있는 방식으로 치환도를 추정하는데 더 유리한 다른 NMR 방법이 있다면, 그 대체 방법이 사용되어야 한다. 상기 방법은 샘플의 제조 및 통합될 신호, 특히 치환도 계산에 사용될 신호의 분해능, 견고성 및 양성자의 위치의 함수로서 당업자에 의해 조정되어야 한다.
키토산의 카르복시알킬화도는 유리하게는 전체 단위의 몰수에 대하여 카르복시알킬의 몰수로 표시되며, 20 내지 250%, 바람직하게는 50 내지 200%, 및 예를 들어 70 내지 170% 범위에서 다양할 수 있다.
한 변형에 따르면, 키토산의 카르복시알킬화도는 전체 단위의 몰수에 대하여 카르복시알킬의 몰수로 표시되며, 유리하게는 40 내지 130%, 예를 들어 70 내지 130% 범위에서 다양할 수 있다.
키토산의 치환도는 전형적으로 반응 시작시 키토산에 대한 출발 시약의 질량비와 상관관계가 있다. 카르복시알킬화제로, 예를 들어 하나 이상의 카르복시메틸, 카르복시에틸, 카르복시프로필, 카르복시부틸기를 갖는 것들과 같이, 산 클로라이드(또는 그의 염, 예를 들어 나트륨 모노클로로아세테이트)가 언급될 수 있다.
한 변형에 따르면, 본 발명은 카르복시알킬의 알킬 부분이 선형 또는 분지형의 C1-C5 알킬기인 카르복시알킬 키토산에 관한 것이다.
한 변형에 따르면, 본 발명은 카르복시메틸 키토산에 관한 것이다.
이 변형에 따르면, 치환된 키토산은 N-카르복시알킬화된 키토산이다.
이 변형에 따르면, 치환된 키토산은 O-카르복시알킬화된 키토산이다.
이 변형에 따르면, 치환된 키토산은 N-카르복시알킬화된 및 O-카르복시알킬화된 키토산이다.
유리하게는, pH 7.5에서 측정된 제타 전위는 -18mV 이하이다.
유리하게는, 카르복시알킬 키토산은 pH 7.5에서 측정된 -22mV 이하, 및 바람직하게는 -24mV 이하의 제타 전위를 가진다.
하나의 특정 변형에 따르면, 치환된 키토산은 바람직하게는 150,000 내지 220,000의 평균 분자 질량, 및 50 내지 200% 범위의 치환도를 가지고, 분자 질량은 바람직하게는 치환 전에 표시된다.
다른 특정 변형에 따르면, 치환된 키토산은 120,000 내지 150,000의 평균 분자 질량, 및 70 내지 200% 범위의 치환도를 가지고, 분자 질량은 바람직하게는 치환 전에 표시된다.
하나의 특정 변형에 따르면, 치환된 키토산은 바람직하게는 220,000 내지 300,000의 평균 분자 질량, 및 70 내지 200% 범위의 치환도를 가지고, 분자 질량은 바람직하게는 치환 전에 표시된다.
다른 특정 변형에 따르면, 치환된 키토산은 220,000 내지 300,000의 평균 분자 질량, 및 50 내지 200% 범위의 치환도를 가지고, 분자 질량은 바람직하게는 치환 전에 표시된다.
다른 특정 변형에 따르면, 치환된 키토산은 300,000 내지 500,000의 평균 분자 질량, 및 50 내지 200% 범위의 치환도를 가지고, 분자 질량은 바람직하게는 치환 전에 표시된다.
다른 특정 변형에 따르면, 치환된 키토산은 300,000 내지 500,000의 평균 분자 질량, 및 70 내지 200% 범위의 치환도를 가지고, 분자 질량은 바람직하게는 치환 전에 표시된다.
하나의 특정 변형에 따르면, 치환된 키토산은 바람직하게는 120,000 내지 150,000의 평균 분자 질량, 및 20 내지 50% 범위의 치환도를 가지고, 분자 질량은 바람직하게는 치환 전에 표시된다.
다른 특정 변형에 따르면, 치환된 키토산은 220,000 내지 300,000의 평균 분자 질량, 및 20 내지 50% 범위의 치환도를 가지고, 분자 질량은 바람직하게는 치환 전에 표시된다.
다른 특정 변형에 따르면, 치환된 키토산은 300,000 내지 500,000의 평균 분자 질량, 및 20 내지 50% 범위의 치환도를 가지고, 분자 질량은 바람직하게는 치환 전에 표시된다.
하나의 특정 변형에 따르면, 치환된 키토산은 20 내지 80%, 바람직하게는 40 내지 60% 범위의 치환도, 및 20 내지 80%, 바람직하게는 30 내지 75% 범위의 아세틸화도를 가진다.
하나의 특정 변형에 따르면, 치환된 키토산은 50 내지 200%, 바람직하게는 70 내지 200% 범위의 치환도, 및 20 내지 80%, 바람직하게는 30 내지 75% 범위의 아세틸화도를 가진다.
하나의 특정 변형에 따르면, 치환된 키토산은 50 내지 200%, 바람직하게는 70 내지 200% 범위의 치환도, 및 20 내지 50%, 바람직하게는 20 내지 40% 범위의 아세틸화도를 가진다.
하나의 특정 변형에 따르면, 치환된 키토산은 50 내지 200%, 바람직하게는 70 내지 200% 범위의 치환도, 및 50 내지 75% 범위의 아세틸화도를 가진다.
다른 특정 변형에 따르면, 치환된 키토산은 90 내지 200% 범위, 바람직하게는 90 내지 150% 범위의 치환도, 및 20 내지 80% 범위의 아세틸화도를 가지며, 분자 질량은 바람직하게는 치환 전에 표시된다.
하나의 특정 변형에 따르면, 치환된 키토산은 90 내지 200%, 바람직하게는 90 내지 150% 범위의 치환도, 및 20 내지 50%, 바람직하게는 20 내지 40% 범위의 아세틸화도를 가진다.
하나의 특정 변형에 따르면, 치환된 키토산은 90 내지 200%, 바람직하게는 90 내지 150% 범위의 치환도, 및 50 내지 75% 범위의 아세틸화도를 가진다.
하나의 특정 변형에 따르면, 치환된 키토산은 바람직하게는 220,000 내지 300,000의 평균 분자 질량, 90 내지 200%, 바람직하게는 90 내지 150% 범위의 치환도, 및 50 내지 75% 범위의 아세틸화도를 가지고, 분자 질량은 바람직하게는 치환 전에 표시된다.
한 변형에 따르면, 카르복시알킬 키토산은 가교된다. 따라서, 예를 들어 제니핀, 부틸 바이글리시딜 에테르, 글루타르알데하이드, 에피클로로하이드린, 1-브로모-3,4-에폭시부탄, 1-브로모-4,5-에폭시펜탄, 1-클로로-2,3-에피티오-프로판, 1-브로모-2,3-에피티오프로판, 1-브로모-3,4-에피티오-부탄, 1-브로모-4,5-에피티오펜탄, 2,3-디브로모프로판올, 2,4-디브로모부탄올, 2,5-디브로모펜탄올, 2,3-디브로모프로판티올, 2,4-디브로모부탄티올 및 2,5-디브로모펜탄-티올 에피클로로하이드린, 2,3-디브로모프로판올, 1-클로로-2,3-에피티오프로판, 디메틸아미노프로필카르보디이미드, 산화 덱스트란, 갈산, 에피갈로카테킨 갈레이트, 커큐민, 탄닌산, 또는 심지어 헥사메틸렌 디이소시아네이트 또는 톨루엔 디이소시아네이트와 같은 디이소시아네이트 화합물과 같은 폴리사카라이드의 가교를 위해 사용된 가교제와 같은 가교제와의 반응에 의해, 여러 키토산 사슬이 가교될 수 있다.
가교된 카르복시알킬 키토산은 분자 질량이 매우 높을 수 있다.
키토산을 치환함으로써 넓은 범위에 걸쳐 pH가 변하는 수용액에 가용성인 카르복시알킬 키토산 용액을 제조할 수 있었으나, 반면에 비치환된 키토산은 5.5 내지 6.5 미만의 pH에서만 가용성이다. 카르복시알킬 키토산은 따라서 그의 용해도 프로파일을 변형시키는 카르복시알킬기의 존재 덕분에 다양한 상이한 pH 값에서, 및 특히 생리학적 pH 또는 병리, 예를 들어 염증성 병리에 의해 변형된 생리학적 유체의 pH에서, 가용화되는 능력을 가진다. 관절의 활액, 수양액, 유리체 및 눈물과 같은 생리학적 유체의 pH는 연령, 병리 등과 같은 다양한 요인으로 인해 개인마다 유의미한 방식으로 변할 수 있음이 알려져 있다. 따라서, 카르복시알킬 키토산은 넓은 pH 범위, 예를 들어 6.0 내지 8.5, 또는 심지어 5.0 내지 8.5, 또는 심지어는 4.5 내지 8.5에 걸쳐 가용성으로 유지될 수 있는 것이 유리하다.
일 실시양태에 따르면, 치환된 키토산 제형은 100 내지 700 mosm/kg, 바람직하게는 200 내지 500 mosm/kg의 삼투압을 가진다.
유리하게는, 치환된 키토산 제형의 삼투압은 250 내지 400 mosm/kg, 바람직하게는 275 내지 325 mosm/kg에 포함된다.
한 변형에 따르면, 치환된 키토산 제형은 관절과 상용성인 삼투압을 가진다.
한 변형에 따르면, 치환된 키토산 제형은 안구 또는 안구 내 표면과 상용성인 삼투압을 가진다.
치환된 키토산 제형의 삼투압은 250 내지 400, 보다 구체적으로 250 내지 380 mosm/kg에 포함되는 것이 바람직하다.
용어 "물에 가용성"은 카르복시알킬 키토산이 수용액에 배치될 때 육안으로 볼 수 있는 임의의 탁도를 나타내지 않는 것으로 이해된다. 보다 구체적으로, 치환된 키토산은 없이 측정된 샘플에 사용된 수성 용매만을 포함하는 기준 탱크를 기준으로, 500 nm의 파장에서 UV-가시 광선 분광법에 의해 측정될 때, 0.5 미만, 및 바람직하게는 0.2 미만의 광학 밀도로, 물 또는 버퍼에, 예를 들어 포스페이트 버퍼 중 1% 농도(m/m)의 카르복시알킬 키토산 용액의 용해도, 즉 탁도의 부재를 확인할 수 있다. 다른 방법은 유럽 약전 모노그래프 2.9.20에 따른 시각 검사로 구성된다. 키토산이 충분히 치환되지 않은 경우, 조성물은 주위 온도에서 만족스러운 pH 범위, 예를 들어 pH 6.0 내지 pH 8.5 범위에서 용해되지 않는다.
키토산의 아세틸화도(DA)는 예를 들어 전위차 적정법에 의해 특허 출원 WO 2017009335 및 WO 2017009346에 기재된 바와 같이 결정된다. DA는 대안적으로 양성자 핵자기공명(NMR) 분광법, 고체-상태 탄소-13 NMR, 적외선 분광법과 같은 키토산에 대해 알려진 다른 방법에 의해 측정될 수 있다.
유리하게는, 카르복시알킬 키토산은 총 단위의 몰수에 대하여 N-아세틸-글루코사민 단위의 몰수로 표시된, 5 내지 80% 범위에 포함된 아세틸화도를 가진다. 아세틸화도는 존재하는 총 N-아세틸-D-글루코사민 및 D-글루코사민 단위의 수에 대하여 N-아세틸-D-글루코사민 단위의 수로 표시된다.
유리하게는, 카르복시알킬 키토산은 총 단위의 몰수에 대하여 N-아세틸-글루코사민 단위의 몰수로 표시되는 40 내지 80% 범위에 포함된 아세틸화도를 가진다.
한 변형에 따르면, 아세틸화도는 5 내지 20% 범위이다.
한 변형에 따르면, 아세틸화도는 15 내지 25% 범위이다.
한 변형에 따르면, 아세틸화도는 20 내지 45% 범위이다.
한 변형에 따르면, 아세틸화도는 20 내지 30% 범위이다.
한 변형에 따르면, 아세틸화도는 25 내지 40% 범위이다.
한 변형에 따르면, 아세틸화도는 40 내지 50% 범위이다.
한 변형에 따르면, 아세틸화도는 50 내지 60% 범위이다.
한 변형에 따르면, 아세틸화도는 60 내지 75% 범위이다.
아세틸화도는 DS의 측정과 동일한 방법에 따라 13 탄소 NMR 또는 양성자 NMR에 의해 결정된다. 카르복시알킬 키토산은 유리하게는 제어된 아세틸화도를 가진다. 용어 "제어된 아세틸화도를 갖는 키토산"은 아세틸화도, 즉 N-아세틸-글루코사민 단위의 비율이, 제어된 방식으로, 특히 아세틸화 반응에 의해, 조정될 수 있는 제품을 의미하는 것으로 이해된다.
한 변형에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 용액의 형태일 수 있고 온도의 변화에 의해 겔화될 수 없다(열 겔화될 수 없음).
한 변형에 따르면, 본 발명에 따른 용액의 유동학적 특성은 온도에 따라 변할 수 있지만, 졸-겔 전이를 거치지 않고 변할 수 있다. 본 발명에 따른 용액의 유동학적 특성은 특히 탄성 계수(G') 및/또는 손실 계수(G''), 또는 심지어 복합 계수 G*에 의해 입증될 수 있다.
한 변형에 따르면, 본 발명에 따른 용액의 유동학적 특성은 온도에 상관 없이 실질적으로 일정하다.
한 변형에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 용액 형태일 수 있고 열 겔화할 수 있다.
한 변형에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 겔 형태일 수 있고 열 겔화할 수 없다.
따라서, 본 발명은, 하나의 변형에 따르면, 사용 온도 미만의 온도, 전형적으로 생리학적 온도, 예를 들어 37℃보다 낮은 온도에서 유체이지만, 구상된 사용에 적합한 삼투압 농도로 중성 pH(pH 7) 또는 생리적 pH, 및 예를 들어 7 내지 8.5에서 사용 온도, 전형적으로 생리학적 온도, 예를 들어 37℃에서, 겔 형태인 열 겔화가 가능한 조성물을 제조할 수 있게 한다. 예를 들어 생리적 삼투압이다.
한 변형에 따르면, 열 겔화할 수 있는 조성물은 열가역적 졸-겔 전이를 가진다.
유리하게는, 본 발명은 저농도의 치환된 키토산을 갖는 조성물을 제공할 수 있게 한다.
유리하게는, 카르복시알킬 키토산의 농도는 조성물의 총 질량에 대하여 10 질량% 미만, 예를 들어 5 질량% 이하이다(m/m).
한 변형에 따르면, 키토산의 농도는 조성물의 총 질량에 대하여 4질량% 미만, 예를 들어 3질량% 이하, 또는 심지어 예를 들어 2질량% 이하이다(m/m).
유리하게는, 본 발명의 조성물은 또한 치환된 키토산 이외의 생체폴리머를 포함할 수 있다. 하나의 유리한 변형에 따르면, 생체폴리머는, 예를 들어 히알루론산 또는 히알루론산 나트륨과 같이, 공유 결합에 의해 가교되거나 가교되지 않은, 산화되거나 산화되지 않은 다당류이다.
히알루론산은 최대 5백만 Da의 분자 질량을 가질 수 있다. 히알루론산의 분자 질량은 용액에서 고유 점도 또는 동적 점도에 의해 반영될 수 있다. 히알루론산은 1 내지 4 m3/kg 범위의 밀도를 가질 수 있고, 예를 들어 낮거나(예를 들어, 대략 1 내지 2 m3/kg), 또는 높은(예를 들어, 대략 2 내지 4 m3/kg) 분자 질량을 가진 것을 특징으로 한다.
유리하게는, 히알루론산의 농도는 조성물의 총 질량에 대하여 4질량% 미만, 예를 들어 3질량% 이하, 또는 심지어 예를 들어 2질량% 이하이다(m/m).
하나의 특정 변형에 따르면, 히알루론산의 농도는 최종 조성물의 질량에 대하여 질량으로 표시된 1.9%(m/m) 미만이다. 유리하게는, 히알루론산의 농도는 최종 조성물의 질량에 대하여 질량으로 표시된 0.5 내지 1.5%(m/m) 사이에 포함된다. 하나의 특정 변형에 따르면, 히알루론산의 농도는 최종 조성물의 질량에 대하여 질량으로 표시된 대략 0.9%, 1.0%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.5%(m/m)이다.
키토산과 히알루론산의 비는, 각각 예를 들어 치환된 키토산의 5 내지 95%, 예를 들어 10 내지 90%, 및 심지어 예를 들어 30 내지 70%, 및 히알루론산의 5 내지 95%, 예를 들어 10 내지 90%, 심지어 예를 들어 30 내지 70%에서 변할 수 있고, 백분율은 치환된 키토산의 건조 질량/히알루론산의 건조 질량으로 표시된다. 한 변형에 따르면, 키토산과 히알루론산 사이의 이 비는 1/1(즉 키토산의 50% 및 히알루론산의 50%)이다. 다른 변형에 따르면, 키토산과 히알루론산의 비는 1.5/0.5 (즉 키토산의 75% 및 히알루론산의 25%)이다.
한 변형에 따르면, 히알루론산은 히알루론산의 상이한 사슬 사이에서 가교될 수 있다.
본 발명은 또한 카르복시알킬 키토산을 제조하기 위한 제조 방법에 관한 것이다.
한 변형에 따르면, 본 발명에 따른 카르복시알킬 키토산을 제조하기 위한 제조 방법은 진균 기원의 키토산의 제조, 키토산의 재아세틸화 및 재아세틸화된 키토산의 카르복시알킬화를 포함한다. 따라서, 본 발명은 재아세틸화된 키토산 또는 재아세틸화된 카르복시알킬 키토산에 관한 것이다.
일 실시양태에 따르면, 키토산을 수성 매질, 바람직하게는 약간 산성화된(예를 들어 pH 6) 수성 매질에 용해시킬 수 있다. 아세트산 무수물은 키토산 용액에 1 회 이상 첨가될 수 있다. 이어서, 예를 들어 수산화 나트륨 및/또는 우레아와 같은 염기제가 첨가된다. 그 후, 예를 들어 나트륨 모노클로로아세테이트(즉, 클로로아세트산의 나트륨 염) 또는 클로로아세트산과 같은 알킬화제가 첨가된다. 이어서, 치환된 키토산은 정제, 회수 및 건조된다.
한 변형에 따르면, 본 발명에 따른 카르복시알킬 키토산을 제조하기 위한 제조 방법은 키토산의 제조, 키토산의 카르복시알킬화, 이어서 카르복시알킬화된 키토산의 재아세틸화를 포함한다. 유리하게는, 이러한 방법은 최종 카르복시알킬 키토산의 아세틸화도의 정확한 제어를 가능하게 하고, 특히 40% 초과의 높은 아세틸화도를 얻는 역할을 한다. 따라서, 본 발명은 재아세틸화되고 카르복시알킬화된 키토산 또는 재아세틸화된 카르복시알킬 키토산에 관한 것이다.
한 변형에 따르면, 본 발명에 따른 카르복시알킬 키토산을 제조하기 위한 제조 방법은 본 발명에 따른 카르복실알킬 키토산을 수득하기 위하여 진균 기원의 키틴의 제조, 키틴의 카르복시알킬화, 및 선택적으로 카르복시알킬화된 키틴의 재아세틸화를 포함한다.
한 변형에 따르면, 본 발명에 따른 카르복시알킬화된 키토산을 제조하기 위한 제조 방법은 본 발명에 따른 카르복시알킬 키토산을 수득하기 위하여 진균 기원의 키틴의 제조, 키틴의 탈아세틸화, 키틴의 카르복시알킬화, 및 선택적으로 카르복시알킬화된 키틴의 재아세틸화를 포함한다.
일 실시양태에 따르면, 카르복시알킬화 단계는 높은 치환도를 촉진하기 위해, 및 예를 들어 글루코사민 단위의 N-위치 및 글루코사민 및 N-아세틸-글루코사민 단위의 O-위치 둘 모두에서 키토산의 하이드록실기의 알칼리화를 위한 알칼리화 단계를 포함한다.
일 실시양태에 따르면, 본 발명의 방법은 염기제, 예를 들어 수산화 나트륨의 존재하에서, 이소프로판올과 같은 알코올 용액에서, 키토산의 분산, 및 최소 -32℃, 및 바람직하게는 최대 15℃의 온도에서 적어도 1시간의 기간 동안 교반을 포함하는 알칼리화 단계를 포함한다. 이 현탁액에, 예를 들어 모노클로로아세트산과 같은 알킬화제가 첨가된다. 그 후, 치환된 키토산이 정제, 회수 및 건조된다.
한 변형에 따르면, 본 발명에 따른 카르복시알킬화된 키토산을 제조하기 위한 제조 방법은 키토산의 제조, 키토산의 카르복시알킬화 및 이어서 카르복시알킬화된 키토산의 재아세틸화를 포함한다.
일 실시양태에 따르면, 카르복시알킬화 단계는 알칼리화 단계를 포함하지 않는다.
카르복시알킬 키토산의 재아세틸화 단계는, 예를 들어 카르복시알킬 키토산 용액에 아세트산 무수물의 1회 이상의 첨가를 포함할 수 있다.
정제된 카르복시알킬 키토산을 수집하기 위한 정제, 여과 및 건조의 최종 단계는 원하는 순도에 따르는 카르복시알킬 키토산을 수득하기 위해 공지된 방법에 따라 수행되며, 이는 예를 들어 침전 및 가용화 사이클에 의해, 또는 투석에 의해 일반적으로 예상되는 용도에 따라 달라진다.
한 변형에 따르면, 아세틸 무수물/키토산(부피/질량)의 비는 재아세틸화 단계 동안 0.1 내지 10, 바람직하게는 0.1 내지 2 사이에서 변한다.
한 변형에 따르면, 카르복시알킬화제/키토산의 질량비는 카르복시알킬화 단계 동안 1 내지 50, 바람직하게는 2.5 내지 25 사이에서 변한다.
한 변형에 따르면, 원하는 치환도를 얻기 위해 필요하고 충분한 염기제에 대해 카르복시알킬기를 제공하는 시약(즉, 알킬화제)의 질량비가 사용된다. 예를 들어, 알킬화제 대 염기제의 질량비는 1 초과 및 10 미만, 바람직하게는 1.4 내지 3.3의 범위이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 조성물을 제조하기 위한 제조 방법에 관한 것이다.
한 변형에 따르면, 상기 방법은 전형적으로 다음을 포함한다:
- 수용액, 바람직하게는 6.2 내지 8.5, 바람직하게는 6.5 내지 7.5 범위에 포함된 pH를 바람직하게 갖는 완충 용액에서, 치환된 키토산의 용해;
- 원하는 pH로, 예를 들어 완충제, 산 또는 염기를 첨가함으로써, 목적하는 적용을 위한 일반적으로 생리학적 pH로, pH의 선택적인 조정;
- 예를 들어 환원당, 예를 들어 소르비톨 또는 만니톨과 같은 다른 부형제의 선택적인 첨가;
- 조성물의 최종 삼투압의 선택적인 조정.
유리하게는, 상기 방법은 또한 카르복시알킬 키토산 또는 이를 포함하는 조성물로 주사 또는 이식 장치, 예를 들어 주사기를 충전하기 위한 추가 충전 단계를 포함한다. 유리하게는, 예를 들어 주사기와 같은 주사 장치는 이어서 증기 멸균 공정에 적용될 수 있다. 이 장치, 예를 들어 주사기는 이어서 바람직하게는 멸균 방식으로 포장될 수 있다. 카르복시알킬 키토산 용액의 적하를 가능하게 하는 역할을 하는 파우치, 바이알 또는 병일 수도 있다.
의도된 적용을 위해 충분한 순도를 갖는 키토산을 사용하는 것이 유리하다.
유리하게는, 상기 방법은 또한 본 발명에 따른 조성물로 예컨대 주사기와 같은 주사, 이식 또는 적하 장치를 충전하기 위한 추가 충전 단계를 포함한다. 유리하게는, 예를 들어 주사기와 같은 적하 장치는 이어서 증기 멸균 공정에 적용될 수 있다. 이 장치, 예를 들어 주사기는 이어서 바람직하게는 멸균 방식으로 포장될 수 있다.
한 변형에 따르면, 본 발명에 따른 카르복시알킬 키토산은, 예를 들어 주사기 또는 바이알과 같은 주사, 이식 또는 적하 장치의 충전 전에, 여과 및/또는 증기 멸균에 의해 멸균된다.
의도된 적용을 위해 충분한 순도를 갖는 키토산을 사용하는 것이 유리하다.
본 발명은, 더 구체적으로, 본 발명에 따른 카르복시알킬 키토산을 포함하는 주사가능한 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따라 정의된 적어도 하나의 카르복시알킬 키토산을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
한 변형에 따르면, 카르복시알킬 키토산 또는 이를 포함하는 조성물은 주사가능하거나, 이식가능하거나 또는 적하에 적합한 약학적 조성물, 또는 주사가능하거나, 이식가능하거나 또는 적하에 적합한 의료 장치로서 사용된다.
본 발명은 또한 카르복시알킬 키토산 또는 이를 건조 형태, 특히 동결 건조 형태로 포함하는 조성물을 포함한다. 특히 사용 전에 동결 건조된 제품을 (재)분산시키고, 바람직하게는 용해시킬 수 있다.
본 발명은, 보다 구체적으로, 예를 들어 회복 또는 충전이 필요한 적어도 하나의 신체 조직의 회복, 재생 또는 충전을 위한, 예를 들어 피하, 피내, 안구 내, 또는 관절내 경로를 통해, 예를 들어 상기 조성물의 주사를 포함하는 치료학적 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.
바람직하게는, 일 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 카르복시알킬 키토산은, 주사 후 24 시간에서, 마우스 에어-파우치 모델의 사용으로 진균 기원 카르복시메틸 키토산의 제형의 면역적합성을 나타내고, 및 10x106 세포/mL 미만, 및 바람직하게는 8x106 세포/mL 미만인 백혈구의 수로 표시된다.
유리하게는, 일 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 카르복시알킬 키토산은 주사 후 24 시간에서, 마우스 에어-파우치 모델을 사용하여 진균 기원 카르복시메틸 키토산의 제형의 면역적합성을 나타내고, 및 10x10-9 g/mL 미만, 및 바람직하게는 5x10-9 g/mL 미만의 인터루킨 1 베타(IL1-베타)의 농도로 표시된다.
유리하게는, 일 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 카르복시알킬 키토산은 주사 후 24 시간에서, 마우스 에어-파우치 모델을 사용하여 진균 기원 카르복시메틸 키토산의 제형의 면역적합성을 나타내고, 및 50x10-9 g/mL 미만, 및 바람직하게는 30x10-9 g/mL 미만의 케모카인 C-X-C 모티프 리간드 1(KC/CXCL1)의 농도로 표시된다.
유리하게는, 일 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 카르복시알킬 키토산은 주사 후 24 시간에서, 마우스 에어-파우치 모델을 사용하여 진균 기원 카르복시메틸 키토산의 제형의 면역적합성을 나타내고, 및 150x10-9 g/mL 미만, 및 바람직하게는 125x10-9 g/mL 미만의 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파)의 농도로 표시된다.
유리하게는, 일 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 카르복시알킬 키토산은 주사 후 24 시간에서, 마우스 에어-파우치 모델을 사용하여 진균 기원 카르복시메틸 키토산의 제형의 면역적합성을 나타내고, 및 50x10-9 g/mL 미만, 및 바람직하게는 30x10-9 g/mL 미만의 케모카인 C-X-C 모티프 리간드 1(KC/CXCL1)의 농도로 표시된다.
유리하게는, 일 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 카르복시알킬 키토산은 주사 후 24 시간에서, 마우스 에어-파우치 모델을 사용하여 진균 기원 카르복시메틸 키토산의 제형의 면역적합성을 나타내고, 동시에 백혈구 수 및 IL1-베타, KC/CXCL1 및 TNF-알파의 농도 측면에서 상기 표시된 최대 한계를 만족시킨다.
백혈구 수 및 IL1-베타, KC/CXCL1 및 TNF-알파의 농도의 측정은 실시예에 표시된 프로토콜에 따라 수행된다.
유리하게는, 한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 카르복시알킬 키토산은 실시예 6의 측정 프로토콜에 따라 37℃에서 효소 리소자임 및 히알루로니다아제의 혼합물의 존재에서 500분보다 큰 반감기를 가진다.
유리하게는, 한 실시양태에 따라, 특히 관절내 적용에서, 본 발명에 따른 카르복시알킬 키토산은 (실시예 9의 프로토콜에 따라) 5 미만, 및 바람직하게는 4 미만의 마찰 계수(COF0)를 가진다.
본 발명은 특히 류마티스학, 안과학, 미용 의학, 성형 수술, 예를 들어 수술 후 조직 유착 방지를 위한 내부 수술의 분야에서 치료에서, 미용에서 또는 피부과 수술에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.
한 변형에 따르면, 신체 조직은 성대, 근육, 인대, 힘줄, 연골, 성기, 뼈, 관절, 눈, 진피, 표피, 피부의 하나 이상의 층, 중배엽 또는 이들의 조합 중 임의의 하나에 속하는 조직으로부터 선택되고, 특히 눈, 진피 및 관절에 속한다.
본 발명은 또한 안구 건조증, 각막 손상 또는 상처 또는 관절 염증의 치료 적 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 각막 손상 또는 상처, 또는 안구 건조증을 예방하거나 방지하기 위해, 특히 안구 표면을 윤활 또는 재생하는 관점으로, 안구 표면 상에 적하에 의한 본 발명에 따른 조성물의 적용에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따라 정의된 카르복시알킬 키토산을 포함하는 점안제의 조성물에 관한 것이다.
한 변형에 따르면, 대상은 염증성 병리(예: 골관절염)에 의해 영향을 받는다.
본 발명은 보다 구체적으로 예를 들어 활강 내로의 주사에 의해 또는 연골 결함의 부위에서 이식에 의해, 관절증(골관절염), 관절염의 치료를 위한, 또는 연골 결함의 회복을 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 보다 구체적으로 본 발명에 따른 조성물을 포함하거나 구성되는 것을 특징으로 하는 의료 장치, 예를 들어 의료 임플란트에 관한 것이다.
따라서, 하나의 바람직한 변형에 따르면, 본 발명은 건조 형태, 특히 동결 건조 형태의 카르복시알킬 키토산을 함유하는 챔버, 및 선택적으로 하나 이상의 활성 제품, 첨가제 또는 부형제를 함유하는 하나 이상의 다른 챔버를 포함하는 의료 장치에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 또한 그의 특성을 조정할 수 있게 하는 하나 이상의 첨가제 또는 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 예를 들어, 회복 또는 충전을 요구하는 적어도 하나의 신체 조직의 회복 또는 충전을 위해, 예를 들어 피하, 피내, 안구, 안구 내 또는 관절내 경로를 통해 상기 조성물의 적하 또는 주사를 포함하는 치료학적 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 예를 들어 활액에 주사함으로써, 또는 혈액과 혼합하고 연골에 인식한 후, 골관절염을 치료하기 위한 치료 방법에서, 또는 연골 결함의 회복에 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 진피를 충전("진피 충전")함으로써 제공되는 치료 방법 또는 미용 관리 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다. 이것은 특히 예를 들어 본 발명에 따른 조성물을 피하 또는 피내 주사하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 피내 경로를 통한 다중 주사에 의한 피부의 표면 처리를 위한 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 전형적으로 미용적 목적을 위해 의도된 치료로서 피부과에서 사용될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 주름진 외관을 잃도록 피부를 팽팽하게 하는 목적으로 사용된다(주름 및/또는 잔주름 치료). 이러한 치료는 회춘된 모습으로 그들의 피부 외관을 향상시키고자 하는 대상에게 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한 조성물이 점성보강제인 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다. 이 경우, 예를 들어 특히 관절의 연골 표면의 마찰을 제한하기 위해 관절내 부위에 본 발명의 조성물을 주사하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 세포 유형, 및/또는 하나 이상의 활성제에 대한 세포 벡터로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다. 이들은 약학적 또는 생물학적 관점에서 활성제일 수 있다. 본 발명의 조성물은 실제로 세포, 바람직하게는 살아있는 세포의 존재와 상용성일 수 있다. 관심의 대상인 살아있는 세포 중에서, 예를 들어 연골 세포(관절 연골), 섬유 연골 세포(반월연골), 인대 섬유모세포(인대), 피부 섬유모세포(피부), 힘줄 세포(힘줄), 근육 섬유모세포(근육), 중간엽 줄기세포, 적혈구(혈액), 및 각질 세포(피부)에 대한 언급이 있을 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 적어도 하나의 치료제의 표적화된 전달 및/또는 제어된 방출을 위한 치료 벡터로서 예상될 수 있다.
한 변형에 따르면, 본 발명의 조성물과 혈액 또는 혈장, 혈소판 용해물, 혈소판 풍부 혈장 또는 임의의 생물학적 유체의 첨가는, 예를 들어 제품의 성능 측면을 향상시키는 것을 가능하게 한다.
한 변형에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 고체 형태(예를 들어 필름 또는 다공성 폼)로 제형화되고, 일단 이식되면 용해된다.
한 변형에 따르면, 조성물은 분무성(스프레이) 조성물의 형태로 제형화된다.
본 발명은 또한 화상의 경우와 같이 과도한 온도에 의해 영향을 받는 하나 이상의 조직 또는 기관의 치료 방법 또는 미용적 관리 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (예를 들어, 연골의 재생을 촉진하기 위해 연골 결함에 이식함으로써) 연골을 회복하기 위한 연골 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 수술 후 조직 유착의 방지를 위한 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다: 제품은 수술, 예를 들어 부인과 수술, 복부 수술 등 종료시 조직에 적용된다 .
본 발명은 또한 본 발명에 따른 카르복시알킬 키토산을 포함하는 인공 활액으로 의도된 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은, 예를 들어 관절의 마찰, 및/또는 충격 흡수 특성(탄성 계수 G'에 의해 식별될 수 있음)을 감소시키기 위해 윤활 능력을 개선시키려고 시도함으로써 건강한 활액을 모방하거나, 또는 건강하거나 결함이 있거나 퇴행성 활액을 개선하는 한편, 예를 들어 주사기를 충전하기 위해 또는 인간 또는 동물 신체에 주사되기 위해 쉽게 주사될 수 있는 능력을 제공한다. 단지 설명의 목적으로, 건강한 활액의 탄성 계수 G'는 40 내지 100Pa 범위에 포함되고, 손실 계수 G''는 1 내지 10Pa 범위에 포함된다.
한 변형에 따르면, 카르복시알킬 키토산 또는 이를 포함하는 조성물은 용액 형태로 주사된다. 유리하게는, 이 변형에 따르면, 카르복시알킬 키토산 또는 이를 포함하는 조성물은 주위 온도에서 미세 바늘, 예를 들어 21 게이지 직경을 갖는 바늘을 통해 용이하게 주사될 수 있다. 용어 "쉬운" 주사는 바람직하게는 본 발명에 따른 조성물이 21 게이지 바늘을 통해 흐르게 하기 위해 이러한 주사기에 가해지는 힘이 50 뉴턴 미만, 바람직하게는 20 뉴턴보다 작은 힘을 나타내는 것으로 이해된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 카르복시알킬 키토산을 포함하는 인공 눈물로서의 적용을 위한 조성물에 관한 것이다.
일반적으로, 생의학 적용 분야에서 추구하는 삼투압 농도 및 pH 값의 범위는 다음 범위에 가깝다.
삼투압 농도:
- 혈장을 갖는 등삼투압: 285 내지 295 mosm/kg;
- 활액이 갖는 등삼투압: 404 ± 57 mosml/kg, 문헌 "Clin Orthop Relat Res, 235, 289-95, 1988" 및 문헌 "Biochem Biophys Res Comm, 422, 455-461, 2012"에 따름;
- 280 내지 350 mosm/kg.
-pH:
일반적으로 생리학적 pH는 6.8 초과, 특히 7.0 초과, 및 (혈장 또는 활액의 경우) 특히 7.4이다.
일반적으로 혈장의 pH는 7.4이다. 일반적으로 활액의 pH는 문헌 "J Bone Joint Surg Br, 41-B (2), 388-400, 1959"에 따라 7.768 +/- 0.044이고; 또는 문헌 "Acta Orthop Scaned 634-641, 1969", 또는 문헌 "Clin Rheumatol 25, 886-888, 2006"에 따라 7.3이다.
일반적으로 골관절염 또는 관절염의 경우 활액 pH는 건강한 활액보다 낮은 것으로 간주된다.
따라서, 본 발명은 예를 들어 (i) 카르복시알킬 키토산 또는 이를 포함하는 조성물, 및 (ii) 활액의 부피비를 기준으로, 20/80 내지 80/20(v/v) 범위, 예를 들어 50/50(v/v)인, 본 발명에 따른 조성물과 활액의 혼합물에 관한 것이다.
유리하게는, 본 발명에 따른 조성물은 멸균성이다. 매우 유리하게는, 본 발명에 따른 조성물은, 바람직하게는 오토클레이브에서, 온도를 상승시킴으로써 멸균된다.
한 변형에 따르면, 본 발명의 조성물은 투명하거나 반투명하다.
용어 "반투명"은 조성물이 관찰자의 눈과 물체 사이에 배치될 때 물체가 구별될 수 있음을 나타내는 것으로 이해된다. "투명"이라는 용어는 조성물이 관찰자의 눈과 관찰된 문자 사이에 배치될 때 영숫자 문자를 구별할 수 있음을 나타내는 것으로 이해된다. 일반적으로, 이 평가는 대략 1cm 두께의 조성물로 수행된다. 시각 검사를 위해 유럽 약전의 모노그래프 2.9.20의 방법을 따르는 것도 가능하다. 예를 들어 500nm에서 UV-가시 광선 분광법에 의해 조성물의 광학 밀도를 측정하고 광학 밀도가 기준 용매와 비교하여 0.5 미만, 바람직하게는 0.2임을 보장할 수 있다.
한 변형에 따르면, 본 발명의 조성물은 유백색이 아니거나 또는 매우 약간 유백색이다.
용어 "유백색"은 예를 들어 유럽 약전의 모노그래프 2.9.20에서와 같은 방법에 의한 시각 검사 및 유럽 약전과 상이한 수준의 유백색이 있는 기준 용액과의 비교에 의해, 용액이 육안으로 볼 수 있는 빛의 회절을 초래하는 것을 나타나는 것으로 이해된다. 한 변형에 따르면, 본 발명의 조성물은 무색이고, 즉 육안으로 관찰하는 관찰자가 조성물에 어떤 특정한 색도 묘사하지 않는다. 한 변형에 따르면, 유 백색은 의도된 적용에 대한 최대 허용 수준보다 낮다.
본 발명은 특히 본 발명에 따른 조성물로 미리 충전된 하나 이상의 적하 또는 주사 장치를 포함하는, 바람직하게는 멸균된 물품 또는 포장에 관한 것이다. 이들은 전형적으로 제품을 드롭 형태 또는 미리 채워진 주사기로 적하되게 할 수 있는 장치이다.
본 발명의 조성물은 유리하게 멸균될 수 있다. 따라서, 본 발명은 멸균된 카르복시알킬 키토산에 관한 것이다. 따라서, 카르복시알킬 키토산은 특히 이를 필요로 하는 적용에 대해 멸균성이다.
한 변형에 따르면, 본 발명의 조성물은 예를 들어 멸균에 충분한 시간, 예를 들어 일반적으로 15 내지 20분 동안 오토클레이브에서 온도를 100℃ 초과, 바람직하게는 120℃ 초과, 예를 들어 121℃ 내지 138℃로 승온시킴으로써 증기 멸균된다. 다른 변형에 따르면, 조성물은 이러한 목적에 적합한 여과기, 예를 들어 0.2μm 이하의 다공성을 갖는 여과기를 사용하여 여과에 의해 멸균될 수 있다.
유리하게는, 하나의 바람직한 실시양태에 따르면, 증기 멸균 공정 동안 카르복시알킬 키토산의 고유 점도 손실은 40% 미만이다.
본 발명은 또한 건조 형태, 특히 동결건조 형태의 본 발명의 조성물을 포함한다.
사용 전에 이 동결건조된 조성물을 특히 (재)분산시킬 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 조성물의 주사를 포함하는 치료적인 치료 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 예를 들어 본 발명에 의해 보다 구체적으로 정의된 바와 같이, 약학적 조성물의 제조를 위한, 특히 치료적 치료를 위한 본 발명에 따른 조성물의 사용을 포함한다.
본 발명은 또한 미용적 관리 방법, 즉 본 발명에 따른 조성물의 주사를 포함하는 비-치료적 방법을 포함한다. 이는 예를 들어 미용적 목적을 위해, 예를 들어 주름의 충전물 또는 사고 또는 외과적 개입 후에 손상된 보이는 조직의 하나 이상의 영역의 충전물을 포함한다.
조직은 기능적 단위로서 함께 그룹화되는, 즉 동일한 주어진 기능에 기여하는 유사하고 동일한 기원을 갖는 일련의 세포이다. 조직 중에서, 상피 조직, 결합 조직, 근육 조직 및 신경 조직이 언급될 수 있다.
용어 "본 발명에 따른 조성물" 또는 등가의 용어는, 바람직한 특징적인 특징에 따른 것을 포함하여, 변형 중 임의의 하나, 특정한 또는 구체적인 실시양태, 그의 임의의 조합과 독립적으로 또는 그의 임의의 조합에 따라, 본 발명에서 정의된 조성물을 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명의 다른 목적, 특징적인 특징 및 장점은 단지 설명의 방식으로 주어지고 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한할 수 없는 실시예를 참조한 설명을 읽은 후 당업자에게 명백해질 것이다.
실시예는 본 발명의 불가분의 일부를 형성하고, 실시예를 포함하여 전체적으로 고려된 설명에 기초하여 임의의 선행 기술 문헌과 비교하여 신규한 것으로 보이는 임의의 특징적인 특징은 그 기능과 일반성에 관하여 본 발명의 불가분의 일부를 형성한다.
따라서 각 실시예는 일반적인 범위이다.
한편, 실시예에서, 달리 지시되지 않는 한, 모든 백분율은 질량에 의해 주어지고, 달리 지시되지 않는 한 온도는 섭씨 온도로 나타내며, 달리 지시되지 않는 한 압력은 대기압이다.
실시예
본 발명에 따른 치환된 키토산의 전구체 키토산은 표 1에 범위에 포함된 점도(모세관 점도 측정법에 의해 결정됨)에서 평균 분자 질량 및 아세틸화도(DA, 전위차 적정에 의해 측정된 N-아세틸-D-글루코사민 단위의 비율)를 가진다. 키토산의 분자 질량은 또한 표 1에 기재된 바와 같이 회전 스핀들 점도계, 예를 들어 브룩필드 점도계(Brookfield viscometer)에 의해 측정된, 1%의 농도(v/v)를 가진 아세트산에서 키토산의 1%(m/m)의 농도를 가진 용액의 동적 점도에 의해 정의될 수 있다.
[표 1]
달리 언급되지 않는 한, 다음 방법이 본 발명에서 사용된다:
제타 전위를 측정하는 방법
분석될 제형은 0.05%의 최종 중합체 농도를 얻기 위해 포스페이트 버퍼에 희석된 후, 균질화가 달성될 때까지 약간 교반된다. 이어서, 용액은 상이한 분획으로 분리되고, 각각의 분획의 pH는 0.1N의 수산화 나트륨을 첨가하거나 또는 0.1N의 염산을 첨가함으로써 pH 4 내지 8 사이에서 원하는 값으로 조정된다. 각 분획의 제타 전위는 "Nano-Z" 장치(Zeta-Sizer 범위, Malvern Instruments)를 사용하여 측정된다.
키토산 중합체의 용해도 범위를 측정하는 방법
용해도 범위는 1%의 농도 및 pH 9에서 시험될 중합체의 용액을 제조하여, 이를 pH 9 내지 pH 1의 범위에 걸쳐 상이한 pH 값으로 조정되는 몇 개의 분획으로 나눔으로써 확립된다. 각각의 분획에 대해, 유럽 약전의 모노그래프 2.9.20의 시각 검사 방법에 따라, 가용성인지, 즉 어떠한 탁도도 형성하지 않는지 확인하기 위해 중합체가 검사된다. 중합체가 가용성 또는 불용성인 pH 범위가 주목된다.
마우스 피하 에어-파우치 모델
진균 기원의 키토산으로부터 유도된 다양한 상이한 중합체의 이물질 반응 및 면역적합성을 평가하기 위해 마우스 피하 에어-파우치 모델이 사용되었다. 이 모델에서, 에어-파우치 공동은 마우스의 등에 멸균 공기의 반복적 피하 주사에 의해 생성된다. Segwick 등의 문헌(in: J Pathol 141, 483, 1983) 및 Sin 등의 문헌(in: Ann Rheum Dis 45, 873, 1986)에 설명된 바와 같이, 공기에 의한 팽창에 의해 생성된 파우치는 활막 공동을 모방함으로써, 에어-파우치 및 주변 조직으로부터 인출된 유체에서 염증 반응의 자극을 연구할 수 있는 국소화된 환경을 제공한다. 에어-파우치의 공동은 약 30g 무게의 동물에게 최대 1mL의 제품을 주사하는 수단을 제공한다. Dawson 등의 문헌(int J Tiss Reac 8, 171, 1991)에 따르면, 에어-파우치는 5mL 및 이어서 3mL의 멸균 공기의 반복적인 주사에 의해 타임라인에서 0일 및 4일에 비-동족 수컷 CD-1 스위스 알비노 마우스(병원체가 없고, 수령시 체중 25-35g)에 정착된다. 7일째에, 1mL의 제품의 단일 피하 주사가 에어-파우치 공동으로 직접 투여된다. 식염수 1mL와 카라기난 1% 용액의 주사가 각각 음성 대조군 및 양성 대조군으로 역할한다. 전신 또는 국소 독성의 가능한 임상 징후를 검출하기 위해 주사 후 수 시간에 동물이 정기적으로 모니터링되고, 주사 및 희생 시 체중 및 온도의 증가를 초래한다. 동물은 제품과 24시간 접촉한 후에 안락사된다(제품 당 3마리의 동물). 파우치로부터 회수된 세척 유체의 면역학적 평가는 지침에 따라 수행된 'ELISA' 키트(AbCam) 사용한 세포학적 분석(백혈구 및 적혈구의 계수 및 분포) 및 주요 염증 매개체(IL-1-베타, TNF-알파 및 KC/CXCL1)의 정량화를 포함한다. 주변 피부 조직의 헤마톡실린/에오신 염색에 의한 육안 분석 및 조직 병리학이 수행된다. 주변 조직에서 제품의 국소화와 유체에서의 그의 재흡수에 특히 주의를 기울인다.
양 모델에서 관절내 투여의 국소 내성을 평가하기 위한 모델
국제 골관절염 연구 학회(OARSI, Osteoarthritis Research Society International)의 문헌과 권고에 따르면, 양은 혁신적인 치료의 관절내 주사 효과를 평가하기 위한 잘 특성화된 모델로 인식된다(Little 등 In: Osteoarthritis Cartilage 18 , S80, 2010; Edouard 등 In: Phys Ther Sport 14, 116, 2013; McCoy 등 In: Vet Pathol 52, 803, 2015). 양 모델은 인간에서 점성보충의 임상적 사용을 시뮬레이션하는 한 부피의 제형의 관절내 경로를 통한 주사 수단을 제공한다(Fraser 등 In: Semin Arthritis Rheum 22, 9, 1993). 국소 내약성의 측정에는 Shafford 등의 문헌(in: Vet Anaesth Analg 31, 20, 2004) 및 Kaler 등의 문헌(in: Vet J 180, 189, 2009)에 의해 설명된, 인증된 반-정량적 임상 척도를 사용함으로써 활액 염증(삼출, 절뚝거림, 편안함)의 임상 징후, 및 활액의 세포학적 평가를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 분석은 주사된 사지의 해부학적 및 조직학적 평가에 의해 보충될 수 있다. 2mL 부피의 제형이 건강한 양(2-6세; 체중 60-80kg)의 관절(슬개)에 주사된다. 주사 후, 동물의 임상 징후는 (슬개의 촉진에 의해) 삼출 및 절뚝거림에 대해 0 내지 4의 반-정량적 척도에 기초하여 15일 동안 매일 기록된다. 전체 관찰 기간 동안 각 점수에 대해 발생한 징후의 수가 보고된다. 동일한 주어진 제형의 반복 주사의 효과를 평가하기 위해, 동일한 동물의 관절에서 1개월 후에 제 2 주사가 투여되고, 동물은 제 1 주사와 동일한 프로토콜에 따라 모니터링된다. 또한, 활액의 천공은 15일에 수행되고, 육안(색상, 점도), 세포학적(백혈구 및 적혈구의 계수 및 분포) 파라미터, 뿐만 아니라 총 혈청 단백질의 양이 통상적인 방법에 따라 측정된다. 활액은 외관이 투명하고 점성이 있으며 약간 황색인 경우 정상으로 간주되며, 세포학적 분석은 백혈구 수가 1x105 세포/mL 미만이고, 총 단백질의 농도가 약 25 mg/mL임을 나타냅니다.
실시예 1: N-석시닐-키토산
상이한 분자 질량 및 분자 구조(아세틸화도(DA), 및 석시닐기에 의한 치환도(DS))를 갖는 N-석시닐 키토산은 특허 출원 WO 2016/016463 또는 WO 2016/016464(특허 EP 3016663)에 기재된 일반적인 방법에 따라 제조되고 특성화되었다. 중합체 CSS-1을 제외하고 아세틸화도를 증가시키기 위해 아세트산 무수물의 첨가에 의한 제 1 아세틸화 단계가 수행되었다(표 1a).
제형은 생리학적 pH 및 삼투압에서 2%의 농도로 이들 N-석시닐 키토산(CSS)으로 제조되고, 유리 주사기에 포장되었다. 주사기는 표준 사이클(121℃에서 15 분)로 오토클레이브에 의해 멸균된다. 제형은 방법 EP 2.9.20에 따른 시각 검사에 의해, 생리학적 pH(pH 6.5 내지 7.5) 주위의 넓은 pH 범위에 걸쳐 어떠한 불용성 물질 또는 탁도를 나타내지 않는지 확인하기 위해 점검된다. 생체 내에서 면역적합성을 평가하기 전에, 제형에서 박테리아 내독소의 수준이 유럽 약전의 모노그래프 2.6.14(D)의 방법에 따라 20EU/mL 미만이고, 미생물학적 부하가 유럽 약전의 방법 2.6.12에 따라 100cfu/g 미만인지 점검된다.
[표 1a]
* 표 1에 따른 전구체 키토산의 분자 질량;
** DA 및 DS는 특허 EP 3016663에 기재된 방법에 따라 양성자 NMR에 의해 측정됨.
CSS 제형의 면역적합성은 마우스 피하 에어-파우치 모델에 의해 평가된다(표 1b). 관찰된 반응은 식염수(음성 대조군), 매우 반응성인 양성 대조군(카라기난의 1% 용액), 및 부분적으로 가교된 히알루론산(Synvisc® Sanofi)인 Hylan GF-20에 기초한 상업적으로 이용가능한 제품의 주사 후 관찰된 반응과 비교된다.
[표 1b]
* 3마리 이상의 동물에 대한 평균값;
** 검출 한계: IL1-베타의 경우 3.10-9 g/mL 및 TNF-알파의 경우 125.10-9 g/mL.
일반적으로, 이러한 CSS-기반 제형은 세포 침윤에서 백혈구 수가 음성 대조군보다는 높지만, 양성 대조군(1% 카라기난)만큼 높지 않다는 사실에 의해 입증되는 바와 같이, 이물질 반응 유형의 면역학적 반응을 유발하는 것으로 보인다. 제형에 의해 유도된 반응은, 음성 대조군 및 Synvisc® 제품에 대한 것보다 더 높은 농도의 마커 KC/CXCL1에 의해 입증되는 바와 같이 호중구의 활성화를 특징으로 한다. 마커 IL1-베타 및 TNF-알파에 대하여, 그들의 수준은 낮다.
CSS의 DA 및/또는 DS를 변형시키거나 실제로 그의 분자 질량을 변형시키는 것은 면역 반응에 어떠한 차이도 초래하지 않는다. CSS 제형이 조직에 국소적으로 어떠한 해로운 영향을 미치지는 않지만, 예를 들어 안구 건조증, 각막 손상 또는 관절 병리와 관련된 염증과 같은 관심의 대상이 되는 기저 병리에 의해 약화되는 조직을 표적으로 하는 치료적 적용의 경우에서 높은 수준의 면역적합성을 얻을 수 있어야 한다.
실시예 2: 동물 기원의 카르복시메틸 키토산
이식가능한 또는 주사가능한 약학적 또는 의학적 용도를 위해 동물 기원의 2개의 카르복시메틸 키토산을 얻을 수 있었다(표 2a에서 CC-1 및 CC-2).
2개의 다른 카르복시메틸 키토산이 시험되었다:
- 동물 기원의 키틴의 카르복시메틸화에 의해 수득된 하나의 CC(CC-3),
- 동물 기원의 키토산의 카르복시메틸화에 의해 수득된 하나의 CC(CC-4)로서, 키토산은 동물 기원의 키틴의 탈아세틸화에 의해 제조되었다.
카르복시메틸 키토산(CC)은 그들의 동일성을 확인하고, DA(아세틸화도) 및 DS(카르복시메틸기로 치환도)의 값을 결정하기 위해 탄소 13 NMR로 특성화되었으며, 추정된 오차 범위는 대략 ±10%이었다(표 2a). 중합체의 정전기 전하는 pH 8에서 pH 4까지의 pH 범위에서 0.05%(m/m)의 농도에서 제타 전위를 측정함으로써 특성화하고, pH 7.5에서의 제타 전위의 값이 보고된다(표 2a). pH 7.5에서의 제타 전위의 값은 탄소 13 NMR에 의해 결정된 DS의 값과 비교적 매우 상관관계가 있는 것으로 관찰된다. 예를 들어, 중합체 CC-3은 음이온성 카르복시메틸기(pH 7.5에서 카르복실레이트 형태)에 의해 중합체 CC-4보다 훨씬 더 치환되고, 유사한 DA를 가지므로, 전체 음전하가 더 크다(pH 7.5에서 -28mV 대 -11mV).
중합체 CC-1 및 CC-2는 생리학적 pH 범위(pH 6.5 내지 7.5)에서 잘 용해되지 않는 것으로 관찰된다. 마우스 피하 에어-파우치 모델을 사용하여 면역적합성을 평가하는 것은 불가능하다. 중합체 CC-3 및 CC-4는 실제로 pH 1 내지 pH 9의 전체 넓은 pH 범위에 걸쳐 가용성이다.
[표 2a]
* 카르복시메틸 키토산 중합체의 DA 및 DS 값은 고체-상태 탄소-13 핵자기공명(NMR) 분광법에 의해 결정된다.
이어서, CC-3(2%) 및 CC-4(1.5%) 제형이 실시예 1과 동일한 방법에 따라 제조되고, 유리 주사기에 포장된 다음, 121℃에서 15분의 표준 사이클에 따라 오토클레이브에 의해 멸균되었다(표 2a). 중합체 CC-3의 2% 제형은 중합체의 가수분해를 반영한 대략 60%의 고유 점도에서 손실에 의해, 뿐만 아니라 저장 계수 G'에서 98% 손실에 의해 입증되는 바와 같이, 오토클레이브에 의한 최종 멸균을 견디지 못한다는 것이 밝혀졌다. 최종 오토클레이브 멸균에 대한 대안으로서, 이어서 마우스 에어-파우치 모델을 사용함으로써 평가될 수 있는 제형을 생성하기 위해 주사기에 포장하기 전에 제형 CC-3이 여과된다.
내독소의 수준 및 미생물학적 부하가 20 EU/mL 및 100 cfu/g 보다 낮음을 확인하기 위해, CC-3(2%, 여과됨) 및 CC-4(1.5%, 오토클레이브에 의해 멸균됨)의 제형이 점검되고, 그 후 마우스 피하 에어-파우치 모델을 사용하여 면역적합성이 평가된다(표 2b).
[표 2b]
* 3 이상의 대상에 대한 평균값;
** 검출 한계: IL1-베타의 경우 3.10-9 g/mL 및 TNF-알파의 경우 125.10-9 g/mL.
CC-4의 제형은 침윤액에서 동시에 2개의 마커 KC/CXCL1(호중구의 활성화) 및 TNF-알파의 고농도를 특징으로 하는 상당한 반응을 유발한다. 마커 TNF-알파는 실시예 2에 기재된 CSS 제형 또는 Synvisc®(Hylan GF-20)의 주사 후 검출되지 않았다. 그러나, 마커 TNF-알파를 특징으로 하는 반응을 유도하는 것은 바람직하지 않다. 제형이 예를 들어 안구 건조증, 각막 손상 또는 상처, 또는 관절 염증과 같은 기저 병리에 의해 약화된 조직과 접촉하고, 호중구 및 TNF-알파의 활성화를 피하는 것이 예상되는 치료적 적용의 경우에 우수한 면역적합성을 갖는 것이 요구되기 때문에, 동물 기원의 카르복시메틸 키토산 CC-4는 적합하지 않다.
제형 CC-3은 비교제 제품 Synvisc®의 수준과 유사하지만 음성 대조군(염수)의 수준보다 높은, 다수의 백혈구 및 적당한 농도의 마커 KC/CXCL1을 특징으로 하는 더 낮은 반응을 유도한다. 따라서 CC-3 제형은 CSS 제형 및 CC-4 제형보다 면역반응성이 덜한 것으로 보인다. 그러나, CC-3 제형은 대상이 매우 우수한 면역적합성을 필요로 하는 치료적 치료 방법에 부적합한 것으로 증명될 수 있고, 열의 영향 하에서 거대 분자 사슬의 매우 상당한 가수분해가 진행되는 농도의 마커 KC/CXCL1을 갖는 단점을 나타내고, 따라서 생산 공정의 마지막에서 최종 단계 동안, 즉 주사기를 제형으로 충전한 후 오토클레이브에 의한 그에 의한 멸균을 불가능하게 한다.
실시예 3: 진균 기원의 카르복시메틸 키토산
진균 기원의 키틴 또는 키토산으로부터 출발하여 표 3a 및 3b의 카르복시메틸 키토산을 수득하기 위해, 하기 반응이 수행된다:
- 매우 높은("Ultra-high") 분자 질량을 갖는 진균 키토산의 재아세틸화에 이어 카르복시메틸화(표 3a의 CC-5);
- 매우 높은("Ultra-high") 분자 질량을 갖는 진균 키토산의 카르복시메틸화에 이어 재아세틸화(CC-5 내지 CC-9);
- 매우 높은("Ultra-high") 분자 질량을 갖는 진균 키토산의 카르복시메틸화(CC-11);
- 진균 키틴의 카르복시메틸화(CC-10).
예를 들어, CC-8의 제조는 다음과 같은 방식으로 수행된다: 매우 높은("Ultra-high") 키토산 10g은 이소프로판올 220ml 및 40% 수산화 나트륨(m/v) 68ml에 분산된다. 알킬화제 모노클로로아세트산(MCA) 45g이 이소프로판올 45ml에 용해되고 키토산의 현탁액에 첨가된다. 25℃에서 16시간 동안 반응이 계속된다. 중합체가 에탄올에서 침전에 의해 회수된 후, 에탄올에서 가용화/침전의 사이클에 의해 정제된다. 침전물은 통풍 오븐에서 건조된다. 침전물 15g이 물에 분산되고, 무수 아세트산 3.75ml이 그에 첨가된다. 주위 온도에서 30분 동안 교반된 후, 매질의 pH가 6으로 조정되고, 산 무수물(AC) 3.75ml이 그에 첨가된다. 주위 온도에서 30분 동안 교반된 후, 매질은 중화되고 에탄올에 침전된다. 이와 같이 수득된 침전물은 재용해된 후 다시 침전된다. 카르복시메틸 키토산(CC-8)의 최종 침전물이 통풍 오븐에서 건조된다.
다른 CC를 준비하기 위해 적용되는 합성의 파라미터는 표 3a 및 3b에 기술된다.
[표 3a]
* MCA: 모노클로로아세트산; SCA: 모노클로로아세트산의 나트륨 염.
[표 3b]
수득된 진균 기원의 카르복시메틸 키토산(CC)은, 그 구조를 확인하고 DA 및 DS의 값을 결정하기 위해 탄소 13 NMR에 의해 특성화된다(표 3c). 탄소 13 NMR 분광법에 내재된 표준 편차(약 ±10%)를 고려하면, pH 7.5에서의 제타 전위 값은 분자 구조, 특히 DS와 상관관계가 있는 것으로 관찰된다.
[표 3c]
* 13C-NMR에 의해 측정된 DA 및 DS;
** 멸균 전/후 고유 점도의 손실이 40% 미만인 경우 멸균 가능한 것으로 간주됨.
수득된 CC는 유백색 없이 넓은 pH 범위, 특히 4.0 내지 8.5의 pH 범위에 걸쳐 모두 가용성이다.
제형은 1.5 또는 2%의 CC 농도로 제조되고, 유리 주사기에 포장된 다음 121℃에서 표준 15분 사이클에 따라 오토클레이브에 의해 멸균된다. 오토클레이브에 의해 제형을 멸균할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 포스페이트 버퍼로 25배로 희석한 후 모세관 점도계에 의해 오토클레이브 전 및 후에 중합체의 고유 점도를 측정한다. CC의 고유 점도의 손실은 40% 미만이며, 이는 실시예 2에 기재된 CC-3 제형(고유 점도에서 약 60%의 손실을 겪음)과 달리, 허용되는 저항성을 나타낸다.
표 3c에 포함된 멸균 제형의 시각 검사는 이들이 투명하고 유백색이 아님을 나타낸다. 그 다음, 그들은 내독소 수준 및 미생물학적 부하가 20 EU/mL 및 100 cfu/g 미만인지 확인하기 위해 점검되고, 이어서 면역적합성이 마우스 피하 에어-파우치 모델을 사용하여 평가된다.
[표 3d]
* 3 이상의 대상의 평균값;
** 검출 한계: IL1-베타의 경우 3.10-9g/mL 및 TNF-알파의 경우 125.10-9g/mL.
일반적으로, 실시예 1에 기재된 N-석시닐 키토산의 제형 및 실시예 2에 기재된 동물 기원의 카르복시메틸 키토산의 제형과 비교할 때, 진균 기원의 CC 제형의 우수한 면역적합성이 면역 반응의 약화 또는 심지어 억제와 함께 존재함에 주목한다.
낮은 농도의 마커 KC/CXCL1은 음성 대조군(염수)과 동일한 수준 및 제품 Synvisc®에 대한 것보다 낮은 수준에서 진균 기원의 CC의 제형에 의해 유도된다는 점에 주목해야 한다. 이는 CSS(실시예 1) 및 동물 기원 CC(실시예 2)의 제형의 주사 후 보고된 수준과는 달리, 호중구 활성화가 무시하거나 심지어 없을 정도임을 반영한다.
더욱이, 진균 기원의 CC의 특정 제형(즉, CC-8 및 CC-10)의 경우, 면역 반응의 4개의 파라미터, 즉 총 백혈구의 수, 마커 IL1-베타, 마커 KC-CXCL1 및 마커 TNF-알파가 동시에 약화되거나 억제된다는 점에 주목해야 한다. 이것은 CSS 제형이나 동물 기원 CC 제형에서는 발생하지 않는다.
진균 기원의 CC에 대해, 4개의 파라미터의 이러한 동시 약화를 나타내는 제형은 가장 높은 음전하(예를 들어, pH 7.5에서 CC-8에 대해 -26mV, CC-10에 대해 -24.5mV)를 갖는 제형인 것으로 보인다.
카르복시알킬기에 의해 약하게 치환된, 실시예 2에 기재된 동물 기원의 CC-4 및 진균 기원의 CC-5의 제형은, 마커 TNF-알파의 특정 활성화를 야기하고, 한편 동물 기원의 CC-4의 제형만 마커 KC/CXCL1의 상당한 분비를 초래하는 것으로 관찰된다. 또한 CC-10의 제형(진균 기원)은, 실시예 2에 기재된 동물 기원 CC-3의 제형과는 달리, 호중구의 활성화를 초래하지 않는 것으로 관찰된다.
실시예 4: 양 모델을 사용한 진균 기원 카르복시메틸 키토산 제형의 관절내 투여의 국소 내성의 평가
실시예 3에 기술된 진균 기원의 2개의 카르복시메틸 키토산(CC-8 및 CC-10)의 2%를 갖는 제형이 양(양) 모델에 의한 관절내 주사를 통한 가능성을 평가하기 위해 제조된다. 두 제형은 부피 2mL씩 양에게 투여되고, 관절내 주사에 의해 유도된 국소 반응이 2주에 걸쳐 평가된다. 제 1 주사일로부터 1개월 후, 동일한 관절에서 CC-8 제형의 제 2 주사의 효과가 또한 평가되었다. 제품 Synvisc®은 동일한 방식으로 1mL 또는 2mL의 부피로 투여된다.
임상 징후는 15일 동안 관절의 촉진 및 절뚝거림 관찰에 의해 매일 모니터링되며, 0점(신호 없음)에서 삼출에 대해 최대 점수 3점 및 절뚝거림에 대해 5점의 반-정량적 점수를 기준으로 판단된다. 15일 동안의 전체 임상 결과는 점수에 의한 발생률(표 4), 뿐만 아니라 15일째에 생성된 활액의 특성화로 보고된다.
[표 4]
실시예 5: 토끼에서 피내 주사 후 진균 기원 카르복시메틸 키토산의 제형의 국소 내성의 평가
토끼 모델을 사용하여 피내 투여를 위한 가능성을 평가하기 위해 생리학적 pH 및 삼투압에서 진균 기원의 3개의 카르복시메틸 키토산의 제형이 제조된다(표 5a). 진균 기원의 CC-12, CC-13, CC-14 및 CC-15는 카르복시메틸화에 이어, DA와 DS를 다양하게 만들기 위해 합성 파라미터를 조절하면서 CC-8에 대한 실시예 3에 기재된 일반적인 방법에 따라 재아세틸화에 의해 제조된다(표 5a). CC-13과 CC-14는 각각 41%와 51%의 낮은 DS와 74%와 69%의 높은 DA를 나타낸다.
제형은 1ml 유리 주사기에 포장된 다음, 표준 사이클(121℃에서 15분)에 따라 오토클레이브에 의해 멸균된다. 3개의 제형은 오토클레이브 멸균에 저항성이 있으며, 고유 점도의 손실은 40% 미만이다. 마지막으로, 박테리아 내독소의 수준이 40 EU/mL 미만이고, 미생물학적 부하가 100 cfu/mL 미만인지 확인하기 위해 제형이 점검된다.
피내 임플란트에 의해 유발된 일차 자극의 평가를 위해 표준 ISO10993(파트 10)을 준수하는 프로토콜에 따라, 200μL의 부피의 제형이 27게이지 직경을 가진 바늘(매우 작은 직경의 바늘)을 통해 피내 주사에 의해 토끼에게 투여된다. 각각의 6마리의 토끼는 각각의 제형의 3회 주사를 받는다. 가교 히알루론산을 기본으로 하는 상업적으로 이용가능한 피부 필러 제품, Juvederm® Voluma(Allergan)이 또한 27게이지 직경 바늘을 통해 주사된다. 피부 자극의 육안 신호는, 0점(신호 없음) 내지 4점(최대 신호)의 점수를 기준으로 반-정량적 척도로, 홍반, 딱지, 부종 및 경화(induration)의 가능한 외관을 평가함으로써, 일차 자극 점수를 결정하기 위해 12, 24 및 48시간에 주사된 모든 동물 및 부위에 대해 보고된다. 각 제품에 대한 일차 자극 점수는 다음과 같은 방식으로 결정된다: 24, 48 및 72시간에 주사된 18개 부위의 홍반 점수의 평균이 추가된다. 부종 점수의 평균의 합은 동일한 방식으로 계산된다. 2개의 합(홍반 및 부종)을 더한 다음, 평균 일차 자극 점수를 얻기 위해 54로 나눈다. 동일한 절차적 접근법이 비교 제품으로 이어진다. 자극 점수는 표 5b에 보고된다. CC 제형은 모든 경우에서 Juvederm® Voluma에 의해 유도된 것보다 낮은 점수로, 홍반의 징후가 없고 부종의 징후가 거의 없는 것으로 관찰되었다. 제형은 자극을 일으키지 않고, Juvederm® Voluma보다 덜 자극적이라고 결론지어진다.
[표 5a]
* 13C-NMR에 의해 결정됨;
** 오토클레이브에 의한 멸균 전/후의 고유 점도 손실이 40% 이하인 경우 멸균가능한 것으로 간주됨;
*** DS의 함수로 pH 7.5에서 제타 전위 곡선의 다항 회귀로부터 추정된 값(± 20%).
[표 5b]
관찰 기간은 주사 후 2주로 연장되고, 5, 7, 9, 11 및 14일에 임상 징후가 평가된다. 가능한 조직학적 분석을 수행하기 위해, 주사 후 3일, 7일 및 14일에, 2마리의 동물이 희생된다. 총 점수는 표 5c에 보고된다. 4개의 제형은 피내 주사 후 2주에 걸쳐 우수한 국소 내성을 나타내며, 모든 총 또는 육안 징후에 대해 Juvederm® Voluma 제품에서 관찰된 것보다 점수가 낮고, 딱지 또는 부종의 징후가 없다. CC-12 및 CC-13 제형은 낮은 점수(최대 1점)의 홍반의 징후를 보여주고, 이는 11일째에 사라진다. CC-13 제형은 9일째에 33%의 발병률과 함께, 최대 2점인 일부 홍반의 징후를 보여주고, 11일째에 사라졌고, 조직에 해로운 영향을 미치지 않았다.
[표 5c]
* 주사 후 각 시간대에 육안으로 평가된 부위의 수. 또한, 4개의 조성물(CC-12, CC-13, CC-14 및 CC-15)은 피내 투여에 적합한 미세 27게이지 바늘을 통해 쉽게 주사될 수 있다.
실시예 6: 시험관 내에서(
In Vitro
) 효소 분해에 대한 감수성
이 실시예에서, 생물학적 유체(예를 들어, 활액, 눈물 또는 결합 조직의 간질액)에 존재하는 두 효소인 리소자임 및 히알루로니다제의 혼합물의 존재 하에서 제형이 분해되는 속도를 비교한다. 효소 리소자임은 일반적으로 키토산계 생체물질을 가수분해하는 능력으로 인식된다.
진균 카르복시메틸 키토산 CC-16은, DA 및 DS를 조정하기 위해 합성 파라미터를 조절함으로써, 실시예 3에 나타낸 CC-8과 동일한 방식으로 제조된다. CC-16, CC-8(실시예 3) 및 CC-10(실시예 3)의 2% 제형은 3.5% 소르비톨과 함께 포스페이트 버퍼에서 제조된다. 동물 기원의 CC-3의 2% 제형(실시예 2) 및 비-가교 히알루론산 (HA-1 및 HA-2)에 기초한 2개의 상업적으로 이용가능한 점성보충 제품에 대한 평가가 또한 수행된다.
제형은 포스페이트 버퍼에서 25배로 희석된다. 이어서, 용액은 12시간 동안 교반되고 효소 리소자임 및 히알루로니다제의 혼합물을 각각 184 단위/mL 및 2.6 단위/mL의 용량으로 희석된 용액에 첨가된다. 고유 점도의 측정은 Ubbelohde 타입 모세관(모델 0a)이 장착된 자동 모세관 점도계 I-Visc(Lauda)에 의해 일정한 간격으로 수행된다. 이어서, 각 제형의 반감기, 즉 중합체의 고유 점도가 그의 초기 값의 절반에 도달하는데 필요한 시간이 계산된다(표 6).
[표 6]
* 고체 탄소-13 핵자기공명(NMR) 분광법에 의해 결정됨.
카르복시메틸 키토산의 제형은 리소자임/히알루로니다제 혼합물에 의해 가수분해되고, 가수분해의 동역학은 카르복시메틸 키토산의 분자 구조를 통해 조절될 수 있는 것으로 이해된다. 이는 표적화된 치료적 적용에 따라 제품의 체류 기간을 조정하는 것을 가능하게 한다. 이로부터 진균 기원의 카르복시메틸 키토산은 동물 기원의 카르복시메틸 키토산(CC-3) 및 히알루론산을 기본으로 하는 2개의 상업적으로 이용가능한 제품보다 덜 빠르게 분해되는 것으로도 추론된다.
실시예 7: 열의 영향
이 실시예에서, 제형을 함유하는 주사기는 11일 동안 60℃로 제어된 온도에서 오븐에 배치되어, 일반적인 저장 온도보다 높은 온도에서 열에 대한 내성을 평가할 수 있게 한다. 각각의 시간대에서, 주사기는 빼내지고, 실시예 6에 기재된 방법에 따라 중합체의 고유 점도가 측정된다. 주어진 시간대에서의 점도와 초기 점도 사이의 비(초기 점도의 %)가 보고된다.
진균 기원의 2개의 카르복시메틸 키토산인 CC-17 및 CC-18은 DA 및 DS를 조정하기 위해 합성 파라미터를 조절함으로써 실시예 3의 CC-8과 동일한 방식으로 제조되고, 탄소 13 NMR에 의해 특성화된다(표 7). 이들은 각각 환원당인, 소르비톨 또는 만니톨의 존재 하에서 2%의 농도로 제형화된다. 또한, 실시예 2에 지시된 동물 기원의 CC-3의 2% 제형(소르비톨 3.5%) 및 실시예 6에 지시된 비-가교 히알루론산에 기반한 상업적으로 이용가능한 점성보강 제품에 대한 평가가 수행된다(HA-2).
[표 7]
* 고체 탄소-13 핵자기공명(NMR) 분광법에 의해 결정됨
진균 기원 카르복시메틸 키토산의 제형은 열에 저항성이 있으며, 상업적으로 이용가능한 히알루론산계 제품뿐만 아니라 동물 기원(CC-3)의 제형 둘 다에 비해 덜 민감하다고 결론지었다.
실시예 8: 카르복시메틸 키토산의 미생물학적 부하를 감소시키는 방법
진균 유래의 카르복시메틸 키토산인 CC-19는 "매우 높은"("Ultra high") 키토산으로부터 시작하여 실시예 3의 CC-8을 제조하는데 사용된 방법에 따라 제조된다. 그 특성은 다음과 같다: DA 67% 및 DS 115%(탄소 13 NMR에 의해 측정됨), 모든 pH에서 가용성, 투명, 비-유백색. 제형의 pH 7.5에서의 제타 전위는 (DS의 함수로서 제타 전위 곡선의 다항 회귀로부터) -27mV로 추정된다. 3.5% 소르비톨을 갖는 포스페이트 버퍼 중의 2% CC-19 제형은 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된다. 그 특성은 다음과 같다: pH 7.3 및 삼투압 농도 279 mOsm/kg. 타당성 및 제형의 최종 특성에 대한 영향을 시험하기 위해, 수성 제형의 미생물학적 부하를 감소시키기 위해 2개의 공지된 방법이 효과적으로 구현되고, 제형의 고유 점도(25배로 희석됨)가 I-Visc 모세관 점도계(Lauda, capillary 0a)의 사용에 의해 비교되고, 굴절률이 공정 전후에 HI88713 굴절계(Hanna)의 사용에 의해 측정된다(표 8). 두 개의 방법은 다음과 같다.
- 오토클레이브: 제형은 유리 주사기에 위치되고, 이어서 주사기는 표준 공정(121℃에서 15분)에 따라 오토클레이브된다;
- 여과: 0.2㎛ 다공성 여과기(Preflow 캡슐 여과기, Pall)를 사용하여 300mL의 제형이 여과된다.
0.2㎛ 여과기에서의 여과 공정은 2bar의 일정한 압력 및 시간당 대략 6리터의 일정한 유속으로 적절한 방식으로 수행된다.
[표 8]
우리는 두 개의 방법이 물질의 감소(굴절률)와 중합체의 분해(고유 점도) 측면에서 영향이 적다고 결론내린다. 따라서 이들은 카르복시메틸 키토산 제형에 기반한 의료 장치 및 약학 제품을 얻기 위해 산업적으로 적용가능하다.
실시예 9: 시험관 내에서 진균 유래 카르복시메틸 키토산의 제형의 윤활 능력
이 실시예는 관절-내 점성보충제 또는 안구 표면을 위한 안과용 드롭으로서의 가능한 용도의 관점에서, 진균 기원의 2개의 카르복시메틸 키토산인 실시예 3에 표시된 CC-8(2% 및 1%) 및 실시예 8에 표시된 CC-19(2%)의 제형의 윤활 능력을 설명하고자 한다. 윤활 능력은 시험관 내 모델을 사용하여 평가되어, 두 표면 사이의 마찰에서 감소를 평가할 수 있다. 실시예 2에 나타낸 동물 기원의 CC-3(2%)의 제형 및 히알루론산을 기반한 상업적으로 이용가능한 제품도 다음과 같이 특성화된다:
- 관절내 점성보충제: Synvisc®(Sanofi) 및 비-가교 히알루론산인 실시예 6 및 7에 나타낸 HA-2 및 HA-3에 기반한 2개의 점성보충제.
- 눈 드롭: 비-가교 히알루론산(HA-4 및 HA-5)을 기반한 두 개의 제품.
또한, 활액 샘플은 무릎 보철물의 배치를 위한 수술 절차 전에 골관절염을 앓고 있는 환자의 무릎으로부터 채취된다. 유체는 -20℃에서 저장되고, 마찰 계수의 분석 전에 25℃가 된다.
마찰 계수는 다음 방법에 따라 측정된다. 직경 16.15mm인 (특허 EP 1830898에 기술된 바와 같이) 소수성 안내 렌즈의 제조에 사용되는 폴리아크릴레이트 형 생체물질로 제조된 2개의 디스크는 60℃에서 약 2시간 동안 물에 침지됨으로써 미리 수화된 후, DHR-2(Discovery Hybrid Rheometer-2)(TA Instruments)의 상단 및 하단 형상에 고정된다. 약 100 μL의 실험될 유체가 하단 디스크 상에 위치된 후, 상단 형상은 5뉴턴의 부과된 수직력까지 두 개의 디스크 사이에 접촉이 일어날 때까지 낮춰진다. 마찰 계수의 측정은 Waller 등의 문헌(in: J Rheumatol 39, 7, 1473, 2012)에 기재된 프로토콜로부터 조정된 프로토콜에 따라, 일정한 수직력(5N), 1.256rad/s의 진동 주파수 및 약 0.05라디안의 변형 각도에서, 150초 동안 25℃에서 수행된다. "진동 운동 시작의 0점 준수" 옵션이 활성화된다. 각 측정 지점에서 토크 값이 기록된 다음, COF = 토크/(1/3 x 디스크의 직경 x 수직력) 공식에 따라 마찰 계수(COF)가 계산된다. 각 제형에 대해, 측정은 5회 반복된다. 마찰 계수의 값은 시간의 함수로서 각 COF 곡선의 시작에서 절편을 외삽하여 보고된다(COF0, 표 7).
[표 9]
2% 및 1% 카르복시메틸 키토산의 제형이 존재하는 경우, 마찰 계수는 동일한 척도의 정도로 낮거나, 또는 관절내 및 안과용으로 상업적으로 이용가능한 제품보다 훨씬 낮으며, 측정 조건 하에서 관절염 활액의 마찰 계수보다 상당히 약하다. 이로부터 카르복시메틸 키토산 제형은 두 표면, 예를 들어 관절내 주사 후 관절의 연골 표면 또는 드롭 형태의 적하 후 안구 표면 사이의 마찰을 감소시킴으로써 윤활제로서 작용할 가능성이 있는 것으로 추론된다. 진균 기원 CC의 제형은 동물 기원 CC-3의 제형보다 마찰을 감소시키는데 더 효과적이다.
실시예 10: 피내 경로를 통한 진균 기원 카르복시메틸 키토산의 제형의 투여를 위한 미세 바늘의 사용
이 실시예는 2%의 진균 기원 카르복시메틸 키토산의 제형이 특히 진피의 표면층으로 주사되도록 설계된 매우 미세한 바늘을 사용함으로써 진피 내로 용이하게 주사될 수 있음을 보여주고자 한다. 시험은 압축 시험대에 의해 주어진 배출 속도에서 바늘이 장착된 주사기에서 제품을 배출하는데 필요한 힘을 측정하는 것으로 구성된다. 이 시험에 의해 측정된 배출력이 50뉴턴 미만이고 배출이 규칙적이고 매끄러운 방식으로 일어날 때, 제품의 주사가 의사와 환자에게 쉽고 편안하다고 경험적으로 간주된다. 주사시 통증 및 출혈 뿐만 아니라 이후에 혈종 및 피부 발적의 위험을 최소화하기 위해 0.3mm(30G) 미만의 직경을 갖는 바늘을 사용하여 제품을 투여할 수 있는 것이 유리하다.
기준 진균 기원 카르복시메틸 키토산 CC-20은 다음과 같은 변형과 함께 "매우 높은"("Ultra high") 형태의 키토산에서 출발하여, 실시예 3에 나타낸 CC-8의 일반적인 방법에 따라 제조된다: 키토산 10g에 대해, 228ml의 이소프로판올, 57ml의 40% 수산화나트륨 및 47g의 MCA가 사용된다. 반응은 35℃에서 23시간 동안 수행된다. 중간체 카르복시메틸 키토산 15g에 대하여, 각 첨가마다 7.5ml의 아세트산 무수물이 사용되며, 최종 카르복시메틸 키토산의 건조 및 회수 전에 3회의 추가 정제 사이클이 적용된다. CC-20의 특성은 다음과 같다: (탄소 13 NMR에 의해 결정된) DA 53% 및 DS 85%, (상기 기재된 방법에 따라) 임의의 pH에서 물에 가용성이고, 투명하고 비-유백색 용액을 형성하고, (DS의 함수로서 제타 전위 곡선의 다항 회귀로부터) pH 7.5에서의 제타 전위는 -24mV로 추정되었다.
2%(m/m) CC-20 제형은 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조된다. 제형은 바늘이 조정되는 1ml 유리 주사기(BD-Medical)에 포장된다. 100N 압축 셀이 장착된 MultiTest 2.5-i 압축 시험대(Mecmesin)를 사용하여 80mm/min의 일정한 배출 속도를 적용하여 제품을 배출하는데 필요한 힘이 측정된다. 장비가 허용하는 최대 힘은 약 70뉴턴이다. 30G, 32G, 33G 및 Invisible NeedleTM(TSK Laboratory)의 바늘이 시험되었으며, 그 치수(외경 x 길이)가 표 10에 보고되어 있다.
비교 목적으로, 피내 경로를 통한 피부 회춘에 대해 지시된, 비-가교 히알루론산(HA-6, HA-7 참조) 및 가교 히알루론산(HA-8)을 기반한 상업적으로 이용가능한 제품이 원래 주사기로 동일한 방법으로 평가된다. 결과는 표 10에 보고되어 있다.
실시예 11: 안과용 드롭으로서 적응증에 대한 관점으로 진균 기원 카르복시메틸 키토산의 저농도 제형
이 실시예는 안구 표면의 장애의 증상을 감소시키거나 안구 표면을 보호하기 위해 사용이 의도되는 안과용 드롭의 제조에 진균 기원 카르복시메틸 키토산의 저농도 용액이 적용될 수 있음을 보여주고자 한다. 생리학적 특성, 즉 바람직하게는 약 7.2의 pH 및 약 200mOsm/kg의 삼투압에 이외에도, 안과용 드롭은 바람직하게는 다음과 같은 물리화학적 특성을 가져야 한다: (1.33에 가까운) 낮은 굴절률 및 안구 표면 및 결막 및 눈꺼풀 사이의 마찰을 최소화하는 능력(윤활 능력). 마지막으로, 유동학적 프로파일은 제품이 눈에 증착될 수 있을 정도로 지나치게 유동적이지 않으며, 오히려 균질한 방식으로 퍼지고 끈적거리지 않는 것이다. 그의 유동학적 프로파일은 또한 눈꺼풀의 흔들림 또는 깜박임이 축적없이 쉽게, 즉 높은 전단 속도에서 낮은 점도를 나타내도록 해야 한다. 특히, Orobia 등은 (눈꺼풀의 흔들림을 제외한) 안구 운동 동안의 점도는 유리하게는 10mPa.s보다 크고, 예를 들어 약 20mPa.s인 것으로 간주한다(in: Clinical Ophthalmology 12, 453, 2018). 여기서 점도의 값은 측정 방법, 특히 장비, 측정 모드 및 파라미터, 온도 및 시험된 제품에 적용되는 전단 속도에 따라 달라지기 쉽다는 것에 유의해야 한다.
기준 진균 기원 카르복시메틸 키토산 CC-21은 실시예 10에 나타낸 CC-20과 동일한 방법에 따라 제조된다. Chen 등의 문헌(Carbohydrate Polymers 53, 355, 2003)에 의해 기술된 방법에 따라 ID7-ATR(Thermo Scientifics)이 장착된 Nicolet iS5 분광계를 사용하는 푸리에(Fourrier) 변환 적외선 분광기를 이용하여 산 형태의 CC-20 및 CC-21의 분자 구조를 비교한다. 그들의 분자 구조는 1200 내지 1800 cm-1의 파장 영역에서 99% 동일하며, 결과적으로 그들의 DA 및 DS는 유사하다는 것이 결정된다.
글리세롤을 갖는 포스페이트 버퍼 중 0.7% 및 0.4%(m/m) 농도의 카르복시메틸 키토산 CC-21의 2개의 제형이 제조된다. pH는 7.2 ± 0.2로 조정되고 삼투압은 200 ± 20 mOsm/kg으로 조정된 후, 제형은 여과되고, 이어서 그의 윤활 능력 및 점도 프로파일이 하기 기재된 방법에 따라 특성화된다. 가변 조성물의 히알루론산 (HA) 기반 안과용 드롭은 동일한 방법(HA-5 내지 HA-9)에 따라 특성화된다. 결과는 표 11b에 보고된다.
마찰 계수의 측정 방법(안과용 드롭에 적합)
접촉하는 두 표면 사이의 마찰을 감소시키는 윤활 능력은, 실시예 9에 나타낸 것과 동일한 폴리아크릴레이트 생체물질로 제조된 2개의 디스크 사이의 마찰 계수를 측정함으로써 평가된다. 2개의 디스크는 DHR-2 유동계(TA Instruments)의 상부 및 하부 형상에 고정되고, 약 100μL의 부피의 시험될 제품이 하부 디스크에 놓인 다음, 부과된 수직력 5뉴턴까지 2개의 디스크 사이에 접촉될 때까지 상부 형상이 낮춰진다. 마찰 계수의 측정은, Waller 등의 문헌(J Rheumatol 39, 7, 1473, 2012)으로부터 조정된 프로토콜 및 Kwon 등의 문헌(J Royal Society Interface 10, 2, 2013)에 의해 기술된 눈꺼풀의 깜박임의 운동학적 조건을 모방하는 파라미터에 따라, 일정한 수직력(5N), 6rad/s의 진동 주파수 및 약 1.71라디안의 변형 각도에서, 60초 동안 25℃에서 수행된다. "진동 운동의 시작의 0점 준수" 옵션이 활성화된다. 각 측정 지점에서, 토크 값이 기록된 다음, COF = 토크/(1/3 x 디스크의 직경 x 수직력) 공식에 따라 마찰 계수(COF)가 계산된다. 평균 COF 값은 0과 60초 사이에서 결정된다. 따라서 5회 연속 측정의 표준 편차뿐만 아니라 평균 마찰 계수가 계산된다. 두 표면이 접촉하지 않은 경우 COF의 최소값은 52이다. COF의 상한은 두 디스크가 더 이상 서로 움직이지 않는 경우에 해당한다.
COF 값이 시리즈마다 다를 수 있기 때문에 동일한 디스크를 사용하여 임의의 순서로 동일한 주어진 시리즈에서 비교할 제품을 특성화할 필요가 있다. 그 다음, 표 11a의 기준에 따라 가장 효과적인 것(1점)에서 가장 덜 효과적인 것(3점)까지 동일한 시리즈인 테스트된 제품을 분류하기 위해 상대 점수의 척도를 사용한다. "COFA" 및 "COFB" 한계는 각 시리즈에 대해 기준으로서 2개의 상업적으로 이용가능한 안과용 드롭의 COF에 의해 정의된다: 드롭 A(0.15% HA 및 0.25% 카보머로 구성됨) 및 드롭 B(0.15% HA). 이 척도에 따르면, 안구 표면을 윤활하기 위한 윤활 드롭로서 사용하기 위해 마찰 감소에 대한 점수가 1점 또는 2점, 바람직하게는 1점인 것이 유리하다. 점수가 3점인 제품의 경우 윤활 능력이 만족스럽지 않으며 측정에 대한 편차가 상당하다.
[표 11a]
전단의 함수로서 점도의 측정 방법
Simmons 등은 눈을 뜨고 움직이는 동안의 전단 속도는 약 10초-1이고 눈꺼풀이 흔들리는 동안의 전단 속도는 약 10000초-1인 것으로 결정하였다(in: Clinical Ophthalmology 11, 1637, 2017). 유동 측정 방법은 연구할 전단 속도의 범위에 따라 선택되며 제품이 저점도 유체 용액임을 고려한다:
- 안구 운동에 해당하는 전단 범위. 점도는 펠티에 플레이트 및 직경 60mm의 "콘(cone)" 유형 형상 및 절단 각도 2°가 장착된 응력-제어된 DHR-2 유동계(TA Instruments)에 의해 유량 스위프 테스트로 회전 모드에서 측정된다. 생성물은 1분동안 37℃로 평형화되고, 온도는 펠티에(Peltier)에 의해 제어된다. 증발을 피하기 위해, 시스템은 용매 트랩과 금속 덮개가 장착된다. 그 다음, 유량 스위프 테스트가 시작되고, 점도는 0.001초-1에서 100초-1까지 전단 속도의 함수로 측정된다. 10초-1에서의 점도 값이 보고된다.
- 눈꺼풀 흔들림에 해당하는 전단 범위. 점도는 "이중 간극 쿠에트(couette)(원통형)" 형태의 형상과 펠티에(Peltier) 동심원 실린더가 장착되고, 및 용매 트랩 및 금속 덮개가 장착된 응력-제어된 DHR-2 유동계(TA Instruments)에 의해 유량 스위프 테스트를 통해 회전 모드에서 측정된다. 생성물은 1분 동안 37℃로 평형화된 다음 0.001초-1 내지 10000초-1의 가변 전단 속도가 적용된다. 10000초-1에서의 점도 값은 10초-1에서의 값과 비교된다.
[표 11b]
결과는 진균 카르복시메틸 키토산 CC-21의 두 개의 제형이 안과용 드롭에 대한 기술 사양을 충족한다는 것을 확인한다: 이는 낮은 굴절률, 만족스러운 마찰 계수(1점, 즉 가장 윤활성인 상업적으로 입수가능한 드롭만큼 효과적임) 안구 운동 상태에서 10 내지 30 mPa.s의 점도 및 눈꺼풀의 흔들림 상태에서 낮은 점도를 가진다. 카르복시메틸 키토산이 없으면, 글리세롤이 보충된 포스페이트 버퍼는 안과용 드롭에 대한 기술적 사양을 충족시키는 수단을 제공하지 못한다. 마지막으로, 마찰 감소 능력을 반대로 변경하지 않으면서(1점), 카르복시메틸 키토산의 농도(예를 들어 0.7 내지 0.4%)를 감소시킴으로써 점도가 감소될 수 있음에 유의한다.
Claims (28)
- 글루코사민 단위, N-아세틸-글루코사민 단위 및 카르복시알킬기로 치환된 글루코사민 단위를 갖는 카르복시알킬 키토산으로, 상기 카르복시알킬 키토산은 pH 7.5에서 측정된 -18mV 이하의 제타 전위를 가지고, 상기 카르복시알킬 키토산은 총 단위의 몰수에 대하여 N-아세틸-글루코사민 단위의 몰수로 표시된, 40% 내지 80%에 포함되는 아세틸화도를 가지고, 상기 카르복시알킬 키토산은, 총 단위의 몰수에 대하여 치환기의 몰수로 표시된, 50% 초과의 카르복시알킬기에 의한 치환도를 가지는 것인 카르복시알킬 키토산.
- 제 1 항에 있어서,
상기 카르복시알킬 키토산은 pH 7.5에서 측정된 -20mV 이하의 제타 전위를 가지는 것을 특징으로 하는 카르복시알킬 키토산. - 제 1 항에 있어서,
상기 카르복시알킬 키토산은, 총 단위의 몰수에 대하여 치환기의 몰수로 표시된, 70% 초과의 카르복시알킬기에 의한 치환도를 갖는 카르복시알킬 키토산. - 제 1 항에 있어서,
키토산은 유형 Ascomycetes의 진균의 균사체, 또는 진균류 Basidiomycetes의 균사체로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 카르복시알킬 키토산. - 제 1 항에 있어서,
키토산은 Aspergillus niger, Lentinula edodes(표고 버섯) 또는 Agaricus bisporus의 균사체로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 카르복시알킬 키토산. - 제 1 항에 있어서,
카르복시알킬 키토산은 N-카르복시알킬화된 및 O-카르복시알킬화된 키토산인 것을 특징으로 하는 카르복시알킬 키토산. - 제 1 항에 있어서,
카르복시알킬 키토산이 재아세틸화되는 것을 특징으로 하는 카르복시알킬 키토산. - 제 1 항에 있어서,
멸균되는 것을 특징으로 하는 카르복시알킬 키토산. - 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따라 정의된 적어도 하나의 카르복시알킬 키토산을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 9 항에 있어서,
조성물은 또한, 공유 결합에 의해 가교되거나 가교되지 않은 히알루론산 또는 히알루론산 나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물. - 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따라 정의된 적어도 하나의 카르복시알킬 키토산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 류마티스 질환 또는 안과 질환을 치료하기 위한, 또는 질환이 있는 조직의 성형 수술, 내과 수술 또는 피부학(dermatology)을 수행하기 위한 약학적 조성물.
- 제 11 항에 있어서,
약학적 조성물은 또한, 공유 결합에 의해 가교되거나 가교되지 않은 히알루론산 또는 히알루론산 나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물. - 제 11 항에 있어서,
약학적 조성물은 주사가능한 약학적 조성물, 이식가능한 약학적 조성물, 또는 적하(instillation)에 적합한 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물. - 제 13 항에 있어서,
조성물은 회복 또는 충전이 필요한 적어도 하나의 신체 조직을 회복 또는 충전을 위해, 피하, 피내, 눈, 안내, 또는 관절내 경로를 통해 적하되거나 주사되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물. - 제 14 항에 있어서,
신체 조직은 성대, 근육, 인대, 힘줄, 연골, 성기, 뼈, 관절, 눈, 진피 또는 이들의 조합 중 하나에 속하는 조직으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물. - 제 13 항에 있어서,
선택적으로 활액에 주사하거나 혈액과 혼합하여 연골에 이식함으로써 골관절염을 치료하기 위한 치료 방법에, 또는 연골 결함의 회복에 사용하기 위한 약학적 조성물. - 제 12 항에 있어서,
환원당을 더 포함하는 약학적 조성물. - 제 9 항에 따라 정의된 조성물을 포함하거나 이로 구성되는 것을 특징으로 하는 의학 장치.
- 제 18 항에서 있어서,
상기 의학 장치는 미용 의학, 성형 수술, 피부학 또는 화장품의 방법에서 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 의학 장치. - 제 18 항에서 있어서,
상기 조성물은 또한, 공유 결합에 의해 가교되거나 가교되지 않은 히알루론산 또는 히알루론산 나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 의학 장치. - 제 18 항에서 있어서,
상기 의학 장치는 주사가능한 의학 장치, 이식가능한 의학 장치 또는 적하에 적합한 의학 장치인 것을 특징으로 하는 의학 장치. - 제 18 항에 있어서,
조성물은 회복 또는 충전이 필요한 적어도 하나의 신체 조직을 회복 또는 충전을 위해, 피하, 피내, 눈, 안내, 또는 관절내 경로를 통해 적하되거나 주사되는 것을 특징으로 하는 의학 장치. - 제 18 항에 있어서,
신체 조직은 성대, 근육, 인대, 힘줄, 연골, 성기, 뼈, 관절, 눈, 진피 또는 이들의 조합 중 하나에 속하는 조직으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 의학 장치. - 제 18 항에 있어서,
선택적으로 활액에 주사하거나 혈액과 혼합하여 연골에 이식함으로써 골관절염을 치료하기 위한 치료 방법에, 또는 연골 결함의 회복에 사용하기 위한 의학 장치. - 제 18 항에 있어서,
환원당을 더 포함하는 의학 장치. - 제 9 항에 따라 정의된 카르복시알킬 키토산을 포함하는 조성물을 제조하기 위한 제조 방법으로서,
상기 방법은:
- 선택적으로 완충된 수용액에 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따라 정의된 카르복시알킬 키토산의 용해;
- 원하는 pH로의 pH의 선택적인 조정;
- 다른 부형제의 선택적인 첨가;
- 조성물의 최종 삼투압의 선택적인 조정
을 포함하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 카르복시알킬 키토산은 류마티스 질환 또는 안과 질환을 치료하기 위한, 또는 질환이 있는 조직의 성형 수술, 내과 수술 또는 피부학(dermatology)을 수행하기 위한 조성물에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 카르복시알킬 키토산. - 제 1 항에서 있어서,
상기 카르복시알킬 키토산은 미용 의학, 성형 수술, 피부학 또는 화장품의 방법에서 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 카르복시알킬 키토산.
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