KR20230109093A - 키토산 기반 비드, 및 이의 제조, 조성물 및 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 글루코사민 단위, N-아세틸-글루코사민 단위 및 카복시알킬기로 치환된 글루코사민 단위를 갖는 적어도 하나의 카복시알킬 키토산을 포함하는 하이드로겔 매트릭스를 포함하거나 이로 이루어진 복수의 비드를 포함하는 수성상을 포함하는 비드 및 조성물에 관한 것이며, 카복시알킬 키토산은 카복시알킬 키토산 사슬 사이의 공유 결합에 의해 가교되고/되거나 하나 이상의 다른 폴리머와 공유 결합에 의해 공동 가교된다.
본 발명은 또한 이의 제조 방법 및 적용에 관한 것이다.

Description

키토산 기반 비드, 및 이의 제조, 조성물 및 용도

본 발명은 적어도 하나의 가교된 카복시알킬 키토산을 포함하는 하이드로겔 기질을 포함하거나 이로 이루어진 인간 또는 동물에 투여가능하고, 특히 주사가능하고, 이식가능하거나 점적가능한 비드에 관한 것이다. 본 발명은 비드를 포함하거나 적어도 하나의 가교된 카복시알킬 키토산을 포함하는 하이드로겔 매트릭스로 이루어진 인간 또는 동물에 투여가능한, 특히 주사가능한, 이식가능한 또는 점적가능한 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 이들 비드, 조성물, 특히 이들을 포함하는 현탁액 또는 분산액 형태의 제조 방법, 뿐만 아니라 이의 적용, 특히 인간 또는 동물에서의 투여, 특히 주사 또는 내시경 시스템을 위한 바늘을 통한 주사, 이식, 점적 또는 표적 적응증(target indication)에 적합한 기타 경로에 의한 이의 적용에 관한 것이다.

본 발명은 보다 구체적으로 공유 결합에 의해 가교된 적어도 하나의 카복시알킬 키토산을 포함하는 하이드로겔 매트릭스를 포함하거나 이로 이루어진 인간 또는 동물에게 투여가능한 비드, 이를 포함하는 조성물, 이의 제조 방법 및 이의 상이한 응용분야, 특히 치료, 류마티스, 정형외과, 안과, 미용 의학, 성형외과, 내과, 피부과, 부인과 또는 미용 분야에 관한 것이다.

생체 흡수성 폴리머 입자로 만들어진 사람이나 동물에게 투여 가능한 제품은 이미 시판되고 있으며, 특히 미용 목적의 피부 조직의 볼륨화(volumisation) 적응증 및 주사에 의한 약물 전달 적응증용으로 판매되고 있다. 그러나 이러한 제품은 특히 내성, 생체 통합 및 볼륨화 효과 측면에서 개선이 필요하다.

조직에 투여되는 입자 시스템에 직면하는 신체의 반응은 특히 구성, 모양, 크기, 생분해성, 표면과 같은 여러 매개변수에 의존한다는 것이 인식되었다.

따라서, 하이드로겔 형태가 아니지만 이물 및 육아종에 대한 반응을 유발할 위험이 있는 생체흡수성 비드를 기반으로 하는 시판 제품이 있다. 따라서, 이들은 깊은 조직 층에 국한된 용도로 제한되며, 예를 들어 진피에는 투여될 수 없다. 이러한 미소구체는 안내 경로에 의해 주사될 수 있다(Sustained treatment of retinal vascular diseases with self-aggregating sunitinib microparticles, Nature Comm 11, 694, 2020).

또한, 본 발명에 따른 비드는 특히 응집성, 안전성, 면역적합성, 생체흡수성, 생체역학적 특성, 투여 용이성 및 수명 또는 활동 시간의 측면에서 인간 또는 동물에서 사용하기에 적합해야 한다. 그러나 최신 조성물은 이러한 특성을 만족스럽게 제공하지 않으며 따라서 본 발명에 따르지 않을 것이다.

가교된 히알루론산(HA)의 매트릭스에 의해 형성된 하이드로겔의 압출에 의해 얻어지는 특정 충전 제품이 있다. 그러나, 압출에 의해 얻은 모양은 구형이 아니고 불규칙하며, 이는 다른 것 중에서 렘페를(Biocompatibility of injectable microspheres, Biomed J Sci Tech Res 2, 1, 2018)에 의해 기술된 바와 같이, 일반적으로 구형보다 더 높은 이물 및 육아종에 대한 반응의 위험을 초래한다. 압출에 의해 얻어진 하이드로겔 비드는 구형 하이드로겔 비드보다 가는 바늘을 통한 주사에 더 큰 힘이 필요한 것으로 알려져 있다. 적절한 장단기 내성과 얇은 바늘을 통한 쉬운 주사를 위해 구형 하이드로겔 비드를 사용하는 것이 권장된다.

문헌 및 특히 특허 출원에 비공유 결합을 통한 가교에 의해 형성된 생체흡수성 폴리머(들)의 구형 하이드로겔 비드가 있다. 예를 들어, 국제출원 WO 2011089173(Biopharmex)은 연조직의 조직 충전용 주사가능한 조성물을 기술한다. 보다 구체적으로, 본 출원은 5 내지 50 마이크로미터 사이의 평균 부피 직경을 갖는 미소구체의 현탁액을 기술하고, 상기 미소구체는 미소구체의 총 중량에 대해 50 내지 90중량%의 적어도 하나의 생체흡수성 다당류를 포함하고, 상기 미소구체는 조직 유도에 의한 제 2 충전을 유도하고 적어도 하나의 제 2 생체흡수성 폴리머를 함유한다. 이러한 하이드로겔 미소구체는 공유 결합이 없기 때문에 나쁜 안정성을 제공하며; 따라서 초기 모양 및 크기 하에서의 무결성은 주사 또는 이식 후에 단축될 것이다. 이들의 현탁액 저장 안정성도 짧은 시간이어야 한다.

예를 들어 탈수된 비드 형태의 카복시메틸 키토산에 관한 것인 루오 등에 의한 공개공보(Development of carboxymethyl chitosan hydrogel beads in alcohol-aqueous binary solvent for nutrient delivery applications, Food Hydrocolloids 31, 332, 2013)와 같이 공유 결합을 통한 가교에 의해 얻은 생흡수성 폴리머 하이드로겔 비드의 제조를 기술하는 다른 문헌이 있다. 그러나 루오 등은 인간이나 동물에 주사할 수 없는 가교제인 글루타르알데하이드를 사용하였다. 보다 구체적으로, 루오 등은 다음 특성: 기계적 강도, 탄성, 볼륨화, 면역적합성, 바늘을 통한 주사가능성, 비드 손상 없이 세척 단계에서 잔류물(염 및 가교제)을 제거하는 능력 중 어느 것도 기술하지 않는다. 그러나 무엇보다도, 본 발명자들은 루오 등의 방법이 강하게 치환 및/또는 아세틸화된 키토산 유도체와 가교제 BDDE(바람직하게는 글루타르알데하이드)로 시작하는 하이드로겔 비드의 제조에는 적합하지 않다는 것을 발견하였다. 또한, 루오 등에 의해 사용된 키토산 유도체는 허용가능한 면역반응성을 제공할 수 없는 정도의 아세틸화도 및 치환도를 갖는다. 따라서 당업자가 본 발명에 따른 비드를 개발하기 위해 이 문서로부터 만족스럽게 학습하는 것은 불가능하다.

따라서, 본 발명자들이 설정한 목표를 만족스럽게 충족시키는 주사가능한 비드는 존재하지 않는다. 특히 주사에 의해 쉽게 투여할 수 있고 완벽하게 용인되는 구형의 생체흡수성 폴리머 기반 하이드로겔 비드의 제조 분야는 복잡하며 이 문제에 대한 연구는 아직 미개발 상태이다. 따라서 본 발명자들은 이 기술을 개발하기 위해 노력했지만 제대로 탐구되지 않았다.

본 발명의 한 목적은 인간 또는 동물, 특히 주사 또는 이식에 의한 투여 후, 보다 구체적으로 치료, 외과 및 미용 분야에서 표적 적응증에 대한 적절한 내성을 갖는 주사가능한 비드를 제공하는 기술적 문제를 해결하는 것이다.

본 발명의 한 목적은 볼륨화 적응증(예를 들어, 미용 의학에서 얼굴/몸체 윤곽의 볼륨화/리모델링 효과 또는 지방 위축증 치료) 또는 약물 전달을 위한 주사가능한 비드를 제공하는 기술적 문제를 해결하는 것이다.

특히, 본 발명의 한 목적은 생체역학적 특성, 수명 또는 제자리 활성, 허용 가능한 단기 및 장기 면역학적 반응 및/또는 이물질에 대한 반응을 포함하는 적절한 건강 안전에 대한 연구 면에서 허용 가능한 인간 또는 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 생체 흡수성 비드를 제공하고 유익한 효과, 특히 특히 재생 또는 노화 방지 의학의 맥락에서, 예를 들어, 치료, 류마티스, 정형외과, 부인과, 안과, 미용 의학, 성형외과, 내과, 피부과 또는 미용 분야에서 유익한 효과를 제공하는 기술적 문제를 해결하는 것이다.

본 발명의 한 목적은 저장 동안 만족스러운 안정성을 제공하고 표적 적응증에 적절한 주사용 비드를 제공하는 기술적 문제를 해결하는 것이다.

특히, 본 발명의 한 목적은 만족스러운 내약성, 물리화학적 특성 및 볼륨화 효과를 피하 이식 후 충분한 지속 시간 동안 제공하는 주사용 비드를 제공하는 기술적 문제를 해결하는 것이다.

본 발명의 한 목적은 표적 적응증에 따라 모듈식 특성을 갖는 비드를 제공하는 기술적 문제를 해결하는 것이다.

특히, 본 발명의 한 목적은 공정에서 바람직하지 않은 잔류물을 제거하고 비드의 pH 및 삼투질 농도와 생리학적 매질의 pH 및 삼투질 농도를 균형을 잡기 위해 수성 환경에서 세척함으로써 정제 단계에 저항하는 비드를 제공하는 기술적 문제를 해결하는 것이다.

본 발명의 한 목적은 또한 특히 볼륨화 효과 및/또는 표적 적응증에 대한 적어도 하나의 관심 화합물(치료 활성 성분, 영양소 등)의 전달 측면에서 시간 경과에 따른 지속적인 효과를 갖는 생체흡수성 주사가능한 비드를 제공하는 기술적 문제를 해결하는 것이다.

본 발명의 한 목적은 또한 본질적으로 구형이고 매끄럽고 거칠지 않은 표면을 갖는 (주사가능한) 비드를 제공하는 기술적 문제를 해결하는 것이다.

특히, 본 발명의 한 목적은 주사 시스템의 출구에서 비드의 무결성을 변경하지 않으면서 주사에 의한 전달을 의도할 때 만족스러운 주사 설비를 갖는 이러한 비드를 제공하는 기술적 문제를 해결하는 것이다.

본 발명의 한 목적은 또한 수성상에 현탁 가능하고 그러한 현탁액에 저장하는 동안 완전하게 남아 있는 비드를 제공하는 기술적 문제를 해결하는 것이다.

본 발명의 한 목적은 또한 특히 습열 멸균 공정에 의해 수성상에 현탁될 수 있고 이러한 현탁액에서 이들의 멸균 동안 완전하게 남아 있는 비드를 제공하는 기술적 문제를 해결하는 것이다.

본 발명의 하나의 목적은 키토산 유도체 비드를 제공함으로써 상술한 기술적 문제를 해결하는 것이다.

인간이나 동물에 주사할 수 있는 비드를 제공하기 위해, 이들은 주사되거나 이식되는 조직과 생체적합성이어야 한다. 바람직하게는, 생체적합성 비드를 제공하기 위해, 무독성 및 비면역반응성인 폴리머, 바람직하게는 생체폴리머 매트릭스를 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 비드 매트릭스의 폴리머는 유리하게는 생체흡수성이고 독성도 면역반응성도 아니다. KIOMED PHARMA에 대한 PCT/EP2018/080763 및 PCT/EP2018/080767 출원에 기술된 카복시알킬 키토산 유도체가 선호되는데, 이는 매트릭스가 독성이 없거나 면역반응성이 없다는 것을 잘 견디기 때문이다. 실제로, 임의의 키토산 유도체는 특히 면역적합성(또는 면역반응성) 면에서 인간이나 동물에서 사용하기에 허용되는 하이드로겔을 형성하는 데 사용될 수 없다. 면역적합성이란, 항원에 대한 특이적 면역 반응을 초래하는 세포 또는 면역계를 자극하지 않는 인체 또는 기타 살아있는 유기체에 이질적인 물질을 의미한다. PCT/EP2020/064159 출원은 이러한 키토산 유도체를 가교결합함으로써 제조된 하이드로겔 매트릭스의 사용에 관한 것이다. PCT/EP2020/064159 국제출원에 따라 가교된 키토산 유도체의 매트릭스를 사용하여 본 발명의 목적을 충족시키는 비드를 제조하는 것이 얼마 동안 고려되었다. 그러나, 이들 가교된 키토산 유도체 매트릭스로부터 비드를 제조하기 위해, 예를 들어 하이드로겔을 압출하거나 제분하는 것이 필요하다. 그러나, 본 발명자들은 이러한 비드가 형상이 비구형이고 불규칙한(즉, 각진 부분, 약간의 표면 거칠기, 제대로 제어되지 않은 크기 분포가 있는) 비구형이기 때문에 만족스럽지 못하며, 이는 일단 인간 또는 동물의 조직에 주사 또는 이식된 이물질에 대한 반응의 위험을 증가시킨다는 것을 발견하였다(Lemperle 2018, Biocompatibility of injectionable microspheres, Biomed J Sci Tech Res 2, 1, 2018)). 마찬가지로, 비드는 불규칙한 모양으로 인해 주사가 쉽지 않다.

이러한 관찰을 기초로, 본 발명자들은 연구 프로그램을 고안하였다. 보다 구체적으로 이들은 카복시알킬화 키토산 유도체에 대한 문헌에 기술된 다양한 방법에 따라 PCT/EP2018/080763 및 PCT/EP2018/080767에 따라 카복시알킬 키토산을 기반으로 하는 구형 하이드로겔 비드를 제조하는 것을 고려하였다.

따라서, 예를 들어 아니타 등(Synthesis, characterisation, cytotoxicity and antibacterial studies of chitosan, O-carboxymethyl and N,O-carboxymethyl chitosan nanoparticles, Carbohydrate Polymers 78, 672, 2009), 아니타 등(Curcumin-loaded N,O-carboxymethyl chitosan nanoparticles for cancer drug delivery, J Biomater Sci 23, 1381, 2012), 린 및 린(Preparation of N,O-carboxymethyl chitosan nanoparticles as an insulin carrier, 2009), 칼리올라 등(The pH-sensitive properties of carboxymethyl chitosan nanoparticles crosslinked with calcium ions, Colloids Surfaces B, 153, 229, 2017) 및 펭 등(Chitosan/O-carboxymethyl chitosan nanoparticles for efficient and safe oral anticancer drug delivery, Int J Pharma 457, 158, 2013)에 의해 기술된 다전자 착물을 이온 가교 또는 형성하는 방법은 만족스러운 결과를 제공하지 않았다. 실제로, 대부분의 경우, 하이드로겔 비드가 형성되지 않는데, 즉, 폴리머가 구형으로 침전되지만 안정화되지 않고 하이드로겔 비드와 같이 점탄성 및 수화되지 않거나, 형성되는 경우, 연속된 상으로 일단 통합된 상태로 유지되지 않으며, 안정적이지 않다.

본 발명이 만족스럽고 본 발명의 목적을 충족시키는 비드를 제공할 수 있다는 것이 본 발명자들에 의해 이루어진 많은 개발의 결과로서 놀랍게도 발견되었다.

본 발명은 보다 구체적으로 복수의 비드를 포함하는 수성상을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 비드는 글루코사민 단위, N-아세틸-글루코사민 단위 및 카복시알킬기로 치환된 글루코사민 단위를 갖는 적어도 하나의 카복시알킬 키토산을 포함하는 하이드로겔 매트릭스를 포함하거나 이로 구성되며, 카복시알킬 키토산은 카복시알킬 키토산 사슬 사이의 공유 결합에 의해 가교되고/되거나 하나 이상의 다른 폴리머와의 공유 결합에 의해 공동 가교된다.

본 발명은 또한 인간 또는 동물의 하나 이상의 주사용 비드에 관한 것이며, 비드는 글루코사민 단위, N-아세틸-글루코사민 단위 및 카복시알킬기로 치환된 글루코사민 단위를 갖는 적어도 하나의 카복시알킬 키토산을 포함하는 하이드로겔 매트릭스를 포함하거나 이로 구성되며, 상기 카복시알킬 키토산은 총 글루코사민 단위의 몰수에 대한 N-아세틸기의 몰수로 표현되는 30% 초과 및 80% 이하의 아세틸화도를 가지며, 상기 카복시알킬 키토산은 카복시알킬 키토산 사슬 사이의 공유 결합에 의해 가교되고/되거나 하나 이상의 다른 폴리머와의 공유 결합에 의해 공동 가교된다.

본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.

카복시알킬 키토산

카복시알킬 키토산과 같은 유리한 키토산 유도체는 PCT/EP2018/080763 및 PCT/EP2018/080767로 출원된 키오메드 파마 특허 출원 및 내용이 참고로 본 발명에 포함되는 이들의 패밀리에 기술된 것으로 알려져 있다. 또한, 내용이 본 발명에 참고로 포함된 키오메드 파마의 국제 출원 PCT/EP2020/064159는, 예를 들어, 히알루로난으로서 단독으로 가교결합된 또는 다른 폴리머와 가교결합된 카복시알킬 키토산을 기술한다.

본 발명에 따른 매트릭스는 본 발명에 따른 매트릭스를 형성하기 위해 하나 이상의 폴리머와 가교 및/또는 공동 가교되는 출발 카복시알킬 키토산을 특징으로 할 수 있다.

제 1 양태에 따르면, 글루코사민 단위, N-아세틸-글루코사민 단위 및 카복시알킬기로 치환된 글루코사민 단위를 갖는 카복시알킬 키토산(진균 기원)이 사용되며, 상기 카복시알킬 키토산은 바람직하게는 전체 단위의 몰수에 대한 치환기의 몰수로 표시된 20% 초과의 카복시알킬기에 의한 치환도를 갖는다.

이를 키토산 또는 치환된 키토산 유도체라고도 한다.

카복시알킬 키토산은 키토산 치환에 의해 제조된다. 일반적으로, 카복시알킬 키토산은 보다 구체적으로 카복시알킬 키토산의 제조를 설명하기 위해 참조로 포함된 PCT/EP2018/080763 및 이의 패밀리(특히 FR 17 61314 및 EP 18799772.1) 및 PCT/EP2018/080767 및 FR13217(특히 및 EP 18799773.9), 및 PCT/EP2020/064159 및 이의 패밀리(특히 FR 19 05504)를 참조한다.

예를 들어 키토산은 CAS 번호 9012-76-4로 참조된다.

본 발명에 사용되는 키토산은 유리하게는 진균 기원이며, 바람직하게는 자낭균류 균사체, 특히 아스퍼길루스 니거(Aspergillus niger) 및/또는 담자균류 균사체, 특히 렌티눌라 에도데스(Lentinula edodes)(표고버섯) 및/또는 아가리쿠스 비스포루스(Agaricus bisporus)(재배 버섯)이다. 바람직하게는, 키토산은 아가리쿠스 비스포루스에서 유래한다. 키토산은 바람직하게는 매우 순수한데 즉 진균 기원 또는 제조 공정에서 유래하는 불순물을 거의 함유하지 않고 임플란트 또는 약학적 조성물로서 사용하기에 적합한 미생물학적 품질을 갖는다. 키토산 제조 방법은 특허 WO 03/068824(EP 1483299; US 7 556 946)에 기술된 방법이다.

일반적으로, 키틴은 수산화나트륨의 존재하에서 수성 현탁액에 넣어지고 매질은 원하는 분자량에 따라 시간 가변으로 고온에서 가열된다. 그런 다음 키토산은 산성 매질에서 정제되고 알칼리성 매질에서 침전되고 세척되고 건조된다.

바람직하게는, 키토산은 약학적 용도에 충분히 순수한 등급이다.

키토산은 유리하게는 정제된 다음 바람직하게는 건조된다. 정제 후, 본 발명의 방법은 카복시알킬 키토산을 건조하고, 이어서 이를 분쇄하여 분말을 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키토산은 수분 증발, 예를 들어 분무 건조(분무), 유동층, 또는 진공 또는 대기압 열 건조 공정 또는 동결 건조에 의해 건조될 수 있다.

그런 다음 이 키토산은 예를 들어 본 발명에 기술된 바와 같이 카복시알킬 키토산을 생성하기 위해 치환될 수 있다.

그런 다음 이러한 카복시알킬 키토산을 사용하여 본 발명에 따른 비드를 제조한다.

단순화하기 위해, DA 및 DS는 비드 형성 전 카복시알킬 키토산에 따라 표현된다.

키토산의 아세틸화 정도(DA)는 예를 들어 특허 출원 WO 2017009335 및 WO 2017009346에 기술된 바와 같이 전위차 적정에 의해 결정된다. 키토산 및 카복시알킬화 키토산의 DA는 액체상 양성자 NMR, 고체상 탄소-13 NMR, 적외선 분광법, UV-가시광선 분광법과 같은 공지된 키토산 방법에 의해 측정될 수 있다.

한 대안에 따르면, 카복시알킬 키토산은 총 단위 몰에 대한 N-아세틸-글루코사민 단위의 몰수로 표현되는 30% 미만, 예를 들어 5% 내지 30%의 아세틸화도를 갖는다.

유리하게는, 카복시알킬 키토산은 총 단위 몰에 대한 N-아세틸-글루코사민 단위의 몰수로 표현되는 30 내지 80% 사이의 아세틸화도를 갖는다. 아세틸화도는 키토산(N-아세틸-D-글루코사민, 치환된 N-아세틸-D-글루코사민, D-글루코사민 및 치환된 D-글루코사민)에 존재하는 글루코사민의 총 단위 수에 대한 N-아세틸기(D-글루코사민 단위의)의 수로 표현된다.

유리하게는, 카복시알킬 키토산은 글루코사민 단위의 총 수에 대한 N-아세틸 기의 수로 표현되는 30 내지 75%의 아세틸화도를 갖는다.

한 대안에 따르면, 아세틸화 정도는 35 내지 50% 범위이다.

한 대안에 따르면, 아세틸화 정도는 40 내지 60% 범위이다.

한 대안에 따르면, 아세틸화 정도는 50 내지 75% 범위이다.

카복시알킬 키토산의 아세틸화도는 고체상 탄소-13 NMR 또는 액체상 양성자 NMR에 의해 결정될 수 있다. 카복시알킬 키토산은 유리하게는 제어된 아세틸화도를 갖는다. ≪제어된 아세틸화도를 갖는 키토산≫은 아세틸화도, 즉 N-아세틸-글루코사민 단위의 비율을 갖는 생성물이 제어된 방식으로, 특히 아세틸화 반응에 의해 조절될 수 있다는 것을 의미한다.

바람직하게는, 카복시알킬 키토산은 재아세틸화된다.

한 대안에 따르면, 본 발명에 따른 카복시알킬 키토산 제조 방법은 진균 기원의 키토산을 제조하는 단계, 키토산을 재아세틸화하는 단계 및 재아세틸화된 키토산을 카복시알킬화하는 단계를 포함한다. 따라서, 본 발명은 재아세틸화된 카복시알킬 키토산에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 음이온성 카복시알킬 키토산에 관한 것이다.

한 실시태양에 따르면, 따라서 키토산은 수성 매질, 바람직하게는 약간 산성화된(예를 들어, pH 6) 수성 매질에 용해될 수 있다. 아세트산 무수물은 하나 이상의 작업에서 키토산 용액에 첨가될 수 있다. 그런 다음, 나트륨 화합물 및/또는 요소와 같은 염기성 물질이 첨가된다. 그런 다음, 예를 들어 모노클로로아세트산나트륨(즉, 클로로아세트산의 나트륨염) 또는 클로로아세트산과 같은 알킬화제가 첨가된다. 그런 다음 치환된 키토산이 정제, 회수 및 건조된다.

한 대안에 따르면, 본 발명에 따른 카복시알킬 키토산 제조 방법은 키토산을 제조하는 단계, 키토산을 카복시알킬화하는 단계, 및 카복시알킬화 키토산을 재아세틸화하는 단계를 포함한다. 유리하게는, 이러한 방법은 최종 카복시알킬 키토산의 아세틸화도의 정밀한 제어를 허용하며, 보다 구체적으로 높은 아세틸화도, 예를 들어 40% 초과가 얻어지도록 허용한다. 따라서, 본 발명은 재아세틸화된 후 카복시알킬화 또는 재아세틸화된 카복시알킬 키토산에 관한 것이다.

한 대안에 따르면, 본 발명에 따른 카복시알킬 키토산의 제조 방법은 진균 기원의 키틴을 제조하는 단계, 키틴을 카복시알킬화하는 단계, 및 가능하게는 카복시알킬화된 키틴을 재아세틸화하여 본 발명에 따른 카복시알킬 키토산을 얻는 단계를 포함한다.

한 대안에 따르면, 본 발명에 따른 카복시알킬화 키토산의 제조 방법은 진균 기원의 키틴을 제조하는 단계, 키틴을 탈아세틸화하는 단계, 키틴을 카복시알킬화하는 단계, 및 가능하게는 카복시알킬화 키틴을 재아세틸화하여 본 발명에 따른 카복시알킬 키토산을 얻는 단계를 포함한다.

한 대안에 따르면, 카복시알킬 키토산은 500,000 미만의 평균 분자량을 갖는다.

한 구체적인 대안에 따르면, 치환된 키토산은 바람직하게는 50,000 내지 400,000의 평균 분자량을 갖는다.

평균 분자량은 비드 형성 및 가교 전의 카복시알킬 키토산의 분자량이다. 바람직하게는 여기서 평균 분자량은 고유 점도로부터 계산된 점도의 평균 분자량(Mv)이다. 이 표현은 숙련된 사람에게 일반적이다. 고유 점도(η)는 유럽 약전의 모노그래피 2.2.9 방법에 따라 Ubbelohde 유형의 모세관 점도계를 사용하여 모세관 점도계에 의해 측정된다. 개조된 모세관을 통한 용액의 흐름 시간은 자동 점도계 I-Visc(Lauda)를 사용하여 측정된다(Lauda, 예를 들어 직경 0.53mm의 모세관 Ubbelohde 510 01). 카복시알킬 키토산의 평균 점도계 질량을 계산하기 위해 마크-하윈크(Mark-Houwink) 방정식(η= K * Mv ^α )이 적용되며, 여기서:

- Mv는 카복시알킬 키토산의 점도에서 평균 분자량이고,

- η는 카복시알킬키토산 고유 점도이고,

- 상수 K 및 α는 각각 MALLS 검출기를 사용한 입체 배제 크로마토그래피에 의해 (비치환) 키토산에 대해 미리 결정된 0.0686 및 0.7638의 값을 가진다.

카복실알킬 키토산의 고유 점도는 일반적으로 평균 분자량을 평가하도록 표현될 수 있다.

키토산은 분자 질량을 줄이기 위해 가수분해될 수 있다.

일반적으로, 비가교 카복시알킬 키토산에서, 글루코사민 단위는 D-글루코사민 단위(D-글루코사민 단위, N-아세틸-D-글루코사민 단위 및 D-글루코사민 단위 및 N-아세틸-D-글루코사민 단위 중 적어도 하나가 치환된다).

한 대안에 따르면, 치환된 키토산은 D-글루코사민 단위의 치환만을 갖는다.

다른 대안에 따르면, 치환된 키토산은 D-글루코사민 및 N-아세틸-D-글루코사민 단위의 동시 치환을 가지며, 키토산의 아민기에 대한 하나의 대안에 따라 또는 키토산의 아민 및 하이드록실기에 대한 다른 대안에 따라 동시에 카복시알킬기가 공유 결합된다.

치환은 일반적으로 부분적으로만 이루어지며 모든 단위가 반드시 치환되는 것은 아니다.

한 실시태양에 따르면, 치환된 키토산의 총 단위(D-글루코사민 및 N-아세틸-D-글루코사민 단위, 치환되거나 치환되지 않음)의 몰수에 대한 D-글루코사민 단위의 몰수로 표현된 D-글루코사민 단위의 치환도는 30% 내지 250% 범위이다.

한 실시태양에 따르면, 상기 카복시알킬 키토산은 총 단위의 몰수에 대한 치환기의 몰수로 표현되는 20% 초과, 예를 들어 50% 초과, 예를 들어 200% 미만의 카복시알킬기에 의한 치환도를 갖는다.

한 실시태양에 따르면, 50% 초과의 카복시알킬기에 의한 치환도는 총 단위의 몰수에 대한 치환기의 몰수로 표현된다.

한 실시태양에 따르면, 치환된 키토산의 총 단위(D-글루코사민 및 N-아세틸-D-글루코사민 단위, 치환되거나 치환되지 않음)의 몰수에 대한 D-글루코사민 단위의 몰수로 표현된 D-글루코사민 단위의 치환도는 50% 내지 200% 범위이고 추가로 바람직하게는 70% 초과이다.

한 실시태양에 따르면, 80% 초과의 카복시알킬기에 의한 치환도는 총 단위의 몰수에 대한 치환기의 몰수로 표현된다.

전형적으로, 치환은 공유 결합에 의해 이루어진다.

한 대안에 따르면, 카복시알킬 키토산은 N,O-카복시알킬 키토산이다. O 위치(글루코사민 및/또는 N-아세틸-글루코사민 단위의 O3 및/또는 O6) 및/또는 N 위치(글루코사민 단위)에서 카복시알킬기로 치환된 단위의 비율은 다양하다. 따라서 치환도는 100%보다 높을 수 있다. 유리하게는, 카복시알킬 키토산의 치환도(DS) 및 아세틸화도(DA)는 Bruker 분광계(PH MAS VTN 400SB BL4 N-P/H 프로브가 장착된 Avance III HD 400MHz)를 사용하여 고체상 탄소-13 자기공명분광법(NMR)에 의해 측정된다. 예를 들어, 스펙트럼은 실온, 시간 1 내지 8초의 이완, 64 내지 512의 스캔 횟수에서 기록된다. 탄소 신호 영역은 디콘볼루션 후에 결정된다. 고려되는 탄소는 다음과 같다: ≪아세틸 CH3≫(N-아세틸-글루코사민 단위의 아세틸기의 메틸 탄소, 치환되거나 치환되지 않음), ≪Cx≫(글루코사민 및 N-아세틸-글루코사민 단위의 x 위치에 있는 탄소, x는 1 내지 6 범위이다) 및 ≪C=O≫(카복시알킬 치환기의 카보닐의 탄소 및 N-아세틸-글루코사민 단위의 아세틸기의 카보닐 C=O의 탄소, 치환되거나 치환되지 않음). 주어진 카복시알킬 키토산의 DS를 결정하기 위해, 이 카복시알킬 키토산의 전구체 키토산의 탄소 13의 NMR 스펙트럼도 기록해야 한다. 전구체 키토산의 스펙트럼에서, ≪CSU 비율≫, 즉 ≪CH3 아세틸≫ 그룹(N-아세틸-글루코사민 단위의 아세틸기의 메틸 탄소)의 신호 면적 대 ≪C=0≫(N-아세틸-D-글루코사민 단위의 아세틸기의 카보닐 탄소)의 신호 면적의 비율이 계산된다. 카복시알킬 키토산의 DA는 식 1에 따라 계산되고 DS는 식 2에 따라 계산되며, 여기서 I는 고려한 탄소의 신호 면적을 나타낸다.

식 1:

[Math 1]

식 2:

[Math 2]

바람직하게는, 치환도(DS)의 범위는 구현하기 쉽기 때문에, 본 명세서에서 고체상 탄소-13 NMR 분석의 결과와 관련하여 표현된다.

DA 및 DS는 또한 예를 들어 리우 등(Carb Polym 137, 600, 2016)에 의해 기술된 방법에 따라, 예를 들어 여기에 중수소화 염산 용액을 첨가함으로써 자기 공명 분광기를 사용하는 수성 매질 양성자 NMR에 의해 카복시알킬 키토산에 대한 다른 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있다.

다른 NMR 방법이 신뢰할 수 있는 방식으로 DA 및/또는 DS를 추정하는 데 더 유리하다면, 그런 방법이 사용돼야 한다. 상기 방법은 샘플 제조와 특히 분해도, 견고성 및 치환도를 계산하는 데 사용할 신호의 양성자의 위치에 따른 통합될 신호 면에서 당업자에 의해 조정되어야 한다.

키토산의 카복시알킬화도(DS)는 유리하게는 총 단위의 몰수에 대한 카복시알킬 몰수로 표현되는 20 내지 250%, 바람직하게는 50 내지 200%, 및 예를 들어 70 내지 170%의 범위일 수 있다.

한 대안에 따르면, 키토산의 카복시알킬화도(DS)는 유리하게는 총 단위의 몰수에 대한 카복시알킬 몰수로 표현되는 40 내지 130%, 및 예를 들어 70 내지 130%의 범위일 수 있다.

키토산의 치환도는 전형적으로 반응을 시작하는 키토산에 대한 시약의 양과 상관관계가 있다. 카복시알킬화제로서, 예를 들어 하나 이상의 카복시메틸, 카복시에틸, 카복시프로필, 카복시부틸기 등을 보유하는 것들과 같은 산 염화물(또는 이의 염, 예를 들어 나트륨 모노클로로아세테이트)이 언급될 수 있다.

한 대안에 따르면, 본 발명은 카복시알킬의 알킬 부분이 선형 또는 분지형 C1-C5인 카복시알킬 키토산에 관한 것이다.

한 대안에 따르면, 본 발명은 카복시메틸 키토산에 관한 것이다.

이 대안에 따르면, 치환된 키토산은 N-카복시알킬화 키토산이다.

이 대안에 따르면, 치환된 키토산은 O-카복시알킬화 키토산이다.

이 대안에 따르면, 치환된 키토산은 N-카복시알킬화 및 O-카복시알킬화 키토산이다.

제 2 양태에 따른 본 발명은 글루코사민 단위, N-아세틸-글루코사민 단위 및 카복시알킬기로 치환된 글루코사민 단위를 가진 키토산 유도체에 관한 것으로, 상기 카복시알킬 키토산은 -10mV 이하, 및 바람직하게는 -15mV 이하의 pH 7.5에서 측정된 제타 전위를 가진다. 보다 구체적으로, 이러한 키토산 유도체는 전형적으로 점적, 주사 또는 이식에 의해 키토산 유도체 또는 이를 갖는 조성물이 투여된 대상의 면역 반응을 제한할 수 있게 한다.

유리하게는, pH 7.5에서 측정된 제타 전위는 -18mV 이하이다.

유리하게는, 카복시알킬 키토산은 pH 7.5에서 측정된 -22 mV 이하, 바람직하게는 -24 mV 이하의 제타 전위를 갖는다.

한 구체적인 대안에 따르면, 치환된 키토산은 20 내지 80%, 바람직하게는 40 내지 60%의 치환도(DS) 및 30 내지 80%, 바람직하게는 30 내지 75%의 아세틸화도(DA)를 갖는다.

한 구체적인 대안에 따르면, 치환된 키토산은 50 내지 200%, 바람직하게는 70 내지 200%, 및 30 내지 80%, 바람직하게는 30 내지 75%의 치환도를 갖는다.

다른 구체적인 대안에 따르면, 치환된 키토산은 90 내지 200%, 바람직하게는 90 내지 150%, 및 30 내지 80%의 아세틸화도를 갖는다.

한 구체적인 대안에 따르면, 치환된 키토산은 90 내지 200%, 바람직하게는 90 내지 150%, 및 30 내지 60%의 아세틸화도를 갖는다.

한 구체적인 대안에 따르면, 치환된 키토산은 90 내지 200%, 바람직하게는 90 내지 150%, 및 40 내지 75%의 아세틸화도를 갖는다.

키토산을 치환함으로써, 넓은 범위에 걸쳐 변화하는 pH를 갖는 수용액에 가용성인 하나의 카복시알킬 키토산 용액을 제조할 수 있는 반면, 비치환 키토산은 pH 약 6 미만의 pH에서만 가용성이다. 카복시알킬 키토산은 용해도 프로파일을 수정하는 카복시알킬 그룹의 존재로 인해 다른 pH 및 특히 생리학적 체액이 병리학, 예를 들어 염증성 병리학에 의해 수정될 때 생리학적 pH 또는 기타 pH에서 가용화될 수 있는 능력이 있다.

≪수용성≫은 카복시알킬 키토산이 수용액에 넣어졌을 때 육안으로 볼 수 있는 탁함을 나타내지 않음을 의미한다. 보다 구체적으로, 예를 들어 물 또는 완충 용액, 예를 들어 포스페이트 완충액에서 1%(m/m) 농도의 카복시알킬 키토산 용액의 용해도, 즉 탁함의 결여는 측정된 샘플에 사용된 수성 용매만을 포함하지만 치환된 키토산이 없는 기준 탱크를 참조하여 500 nm의 파장에서 UV-가시광선 분광법에 의해 측정된 0.5 미만, 및 바람직하게는 0.2 미만의 광학 밀도에 의해 확인될 수 있다. 다른 방법은 유럽 약전의 모노그래피 2.9.20에 따른 육안 검사로 구성된다. 키토산이 충분히 치환되지 않은 경우, 조성물은 실온에서 만족할만한 pH 범위, 예를 들어 pH 5.5 내지 pH 8.5에서 용해되지 않는다.

한 대안에 따르면, 카복시알킬 키토산은 무균 상태이다.

≪카복시알킬 키토산 사슬 사이의 공유 결합에 의해 가교된≫은 주요 키토산 사슬(키토산 골격이라고도 함)이 하나 이상의 주요 키토산 사슬과 공유 결합되어 있음을 의미한다. 따라서 키토산 분자의 3차원 네트워크가 유리하게 얻어진다. 본 발명은 특정한 공유 가교 방법에 제한되지 않지만, 바람직한 방법은 가교제로도 불리는 가교제로서 사용되는 화학 분자를 사용한다. ≪카복시알킬 키토산 사슬 사이의 공유 결합에 의해 가교된≫의 개념은 보다 특히 카복시알킬 키토산 분자를 결합하는 가교제를 포함하는 공유 결합에 관한 것이다. 그러나 이들은 원자 사슬(일반적으로 반응성 기능 사이에 위치한 가교제의 일부)에 의한 카복시알킬 키토산 사슬 사이의 공유 결합이다.

본 발명에 따르면, 카복시알킬 키토산은 가교된다.

비드

유리하게는, 본 발명에 따르면, 비드는 하이드로겔 형태의 수화된 매트릭스를 포함하거나 이로 구성된다.

하이드로겔은, 이 단어의 통상적인 의미, 특히 물에 팽윤할 수 있고 상당한 양의 물을 보유하면서 폴리머(들)의 개별 사슬의 가교로 인해 구조를 보존할 수 있는 적어도 하나의 친수성 폴리머의 3차원(3D) 네트워크를 의미한다. 하이드로겔 비드는 총 습윤 질량에 대해 적어도 70% 물 질량을 함유하는 수화된 비드이다. 일반적으로, 하이드로겔 비드는 주변 조건에서 또는 조직에 투여한 후 이 물을 덩어리로 유지할 수 있다.

한 대안에 따르면, 매트릭스는 가능한 공유 결합에 의해 자체 가교 및/또는 카복시알킬 키토산과의 공유 결합에 의해 가교되는 적어도 하나의 폴리머, 예를 들어 적어도 하나의 히알루로난을 포함한다.

≪자체 가교된≫ 또는 ≪자체에≫는 분자가 사슬내 및/또는 사슬간 분자 가교의 공유 결합을 포함할 수 있음을 의미한다.

유리하게는, 하이드로겔 본 발명에 따른 매트릭스는 적어도 하나의 카복시알킬 키토산을 포함하는 하나 이상의 생체흡수성 폴리머를 포함하거나 이로 구성된다.

한 대안에 따르면, 하이드로겔을 형성하는 본 발명에 따른 매트릭스는 카복시알킬 키토산으로 제조된다.

한 대안에 따르면, 하이드로겔을 형성하는 본 발명에 따른 매트릭스는 그 자체로 가교되고/되거나 다른 폴리머와 공동 가교된 카복시알킬 키토산 및 카복시알킬 키토산과 가교되거나 공동 가교된 하나 이상의 다른 생체폴리머를 포함하거나 이로 구성된다.

따라서 본 발명은 다음을 포함하는 여러 대안을 포함한다.

하이드로겔 매트릭스가 그 자체로 가교된 카복시알킬 키토산을 포함하거나 이로 구성되고 하이드로겔 매트릭스에서 임의의 다른 폴리머가 없는 대안.

하이드로겔 매트릭스가 그 자체로 가교된 카복시알킬 키토산 및 하이드로겔 매트릭스에서 그 자체로 가교되거나 가교되지 않은 하나 이상의 폴리머를 포함하거나 이로 구성되는 대안.

하이드로겔 매트릭스가 하나 이상의 다른 폴리머와 공동 가교된 하나의 카복시알킬 키토산을 포함하거나 이로 구성되고, 카복시알킬 키토산 및/또는 다른 폴리머가 자체적으로 가교될 수 있는 대안.

따라서, 한 대안에 따르면, 상기 카복시알킬 키토산은 다른 폴리머와 공동 가교된다.

한 대안에 따르면, 본 발명에 따른 생체흡수성 폴리머는 천연 생체폴리머이며, 예를 들어 인간 또는 동물 조직에서 자연적으로 발생하며, 예를 들어 이들은 다당류, 단백질 및 조직, 세포 수준에 존재하는 임의의 다른 폴리머일 수 있다. 한 실시태양에 따르면, 카복시알킬 키토산 이외의 생체폴리머는 다당류 또는 단백질로부터 선택되고, 바람직하게는 하기 생체폴리머 또는 이들의 조합 중 임의의 것을 따라 선택된다: 엘라스틴, 히알루로난, 콘드로이틴, 피브린, 콜라겐, 덱스트란, 셀룰로오스, 카복시알킬 셀룰로오스, 루브리신, 뮤신, 실크, 알부민 및 이들의 유도체.

생체폴리머는 변형된 고유 구조를 갖도록 고유할 수 있다.

한 대안에 따르면, 다른 생체폴리머는 공유 또는 비공유 결합에 의해 가교결합되거나 산화되거나 되지 않는 다당류, 예를 들어 글리코사미노글리칸, 및 보다 특히 히알루로난, 예를 들어 히알루론산, 나트륨 히알루로네이트 또는 이들의 임의의 염 또는 유도체.

한 대안에 따르면, 생체흡수성 폴리머는 합성 폴리머이다.

한 대안에 따르면, 하이드로겔 비드를 구성하는 본 발명에 따른 매트릭스는 카복시알킬 키토산 및 히알루로난을 포함하거나 이로 구성되며, 카복시알킬 키토산은 그 자체로 가교되고/되거나 히알루로난과 공동 가교된다. 이들 2개의 폴리머는 유리하게 그 자체로 가교되고/되거나 함께 공동 가교된다.

본 발명의 바람직한 목적 중 하나는 예를 들어 비드의 수분 함량, 생체역학적 특성 및/또는 생체흡수성 동역학을 조절하기 위해, 비드의 의도된 특성을 조정할 수 있도록 이들 2개의 폴리머를 결합시키는 것이다.

한 대안에 따르면, 비드 제조에 사용되는 히알루로난은 모세관 점도측정법 또는 입체 배제 크로마토그래피에 의해 측정시 5,000,000 미만의 평균 분자량을 갖는다. 히알루로난의 분자 질량은 때때로 마크-하윈크 관계를 통해 분자 질량과 적절하게 상관된 모세관 점도계에 의한 고유 점도를 통해 표현된다. 따라서, 비드 제조에 사용되는 히알루로난은 비드의 의도된 특성에 따라, 한 대안에 따르면 ≪높음≫(약 3 내지 4.25m³/kg), 다른 대안에 따르면 ≪중간≫(1.5 내지 3m³/kg) 또는 다른 대안에 따르면 ≪낮음≫(0.1 내지 1.5m³/kg)인 고유 점도를 나타낼 수 있다.

한 대안에 따르면, 히알루로난은 예를 들어 스트렙토코커스 에퀴이(Streptococcus equii)를 사용한 발효에 의해 얻어진다. 다른 대안에 따르면, 수탉의 빗에서 초기 추출에 의해 생산된다.

한 대안에 따르면, 매트릭스는 공유 결합에 의해 가교된 적어도 하나의 히알루로난을 포함한다.

따라서, 가교된 히알루로난은 상이한 히알루로난 사슬 사이에 공유 결합을 포함한다.

상이한 분자 질량 또는 상이한 히알루로난 염을 갖는 히알루로난과 같이 상이한 유형의 히알루로난이 함께 가교될 수 있다.

따라서, 본 발명은 카복시알킬 키토산과 공유 결합에 의해 공동 가교된 적어도 하나의 히알루로난을 포함하는 매트릭스를 포함하거나 이로 구성된 비드 형태의 하이드로겔에 관한 것이다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 비드는 비드의 총 질량에 대해 질량으로 80% 초과, 바람직하게는 85% 이상, 예를 들어 90% 초과의 수분 함량을 갖는다.

유리하게는, 본 발명에 따른 비드는 인간 또는 동물에게 독성이 없으며; 즉 예를 들어 경구 또는 전신 투여 후 만성 독성의 결여를 확인하기 위해, 예를 들어, 시험관 세포독성 모델 및/또는 동물 모델을 사용하여 의료기기, 의약품 또는 동물의약품인지 여부에 따라 제품 및 표적 적응증에 적용되는 기준에 따라 확인된 것과 같은 독성 성분이 없거나 독성 성분으로 분해되지 않는다.

유리하게는, 비드는 생체적합성이며, 비드가 내부에 또는 표면에 투여되는 조직에 대한 표적 적응증에 대해 국소 내성 문제 또는 허용되지 않는 면역반응성을 갖지 않는다.

한 유리한 대안에 따르면, 본 발명에 따른 비드는 동물 기원의 임의의 화합물을 포함하지 않는다.

한 유리한 대안에 따르면, 본 발명에 따른 비드는 임의의 알기네이트, 젤라틴, 카라기난 또는 키토산 유도체가 아닌 천연 키토산을 포함하지 않는다.

한 유리한 대안에 따르면, 본 발명에 따른 비드는 적어도 하나의 카복시알킬 키토산 및 가능하게는 히알루로난을 포함한다. 히알루로난 명칭은 히알루론산 및 이의 염을 포함한다.

유리하게는, 본 발명에 따른 비드는 바람직하게는 긴 잔류 시간에 의해 생체흡수성이거나 표적 적응증에 적응할 수 있다. ≪생체흡수성≫은 자연적인 생물학적/생리학적 현상에 의해 점진적으로, 그리고 일반적으로 며칠에 걸쳐, 바람직하게는 몇 주 또는 몇 달에 걸쳐(표적 적응증에 따라 최대 시간) 온혈 동물이나 사람의 몸에 피하 또는 피내 주사했을 때 제거될 수 있는 저분자량 화합물로 분해/흡수되는 폴리머를 의미한다.

유리하게는, 본 발명에 따른 비드는 바람직하게는 습열 멸균에 의해 멸균 가능하다. 유리하게는, 본 발명에 따른 비드는 멸균 후, 특히 습열 또는 여과에 의해 본질적으로 그의 특징 및 특성을 유지한다. 비드는 바람직하게는 최종 단계 동안 현탁액에서 1회 멸균된다.

유리하게는, 본 발명에 따른 비드는 적응증에 맞게 조정된 바늘을 통해 주사할 수 있으며, 즉 주사에 가해지는 힘이 허용 가능해야 하고 주사 작용이 경련을 일으키지 않아야 하며 배출된 비드에 어떠한 변경도 일으키지 않아야 한다. 주사력은 간단하고 정확하며 잘 통제된 의료 행위를 보장한다. 주사는 규칙적이고 원활하게 이루어져야 하며; 따라서 비드 또는 조성물의 ≪쉬운≫ 주사가 본 발명에 따라 바람직하다. ≪쉬운≫ 주사는 주사기에 가하는 힘이 50뉴턴 미만, 바람직하게는 40뉴턴 미만이고 표적 응용분야를 위해 정의된 바늘을 통해 적절한 피스톤 배출 속도(예를 들어 10mm/min의 속도로)로 본 발명에 따른 조성물을 흐르게 함을 나타낸다. 예를 들어, 피부과 응용의 경우, 25G에서 34G 사이의 직경 범위에서 바늘을 통해 주사할 수 있는 비드가 선호된다. 예를 들어, 안과 응용의 경우, 27G에서 34G 범위의 바늘을 통해 쉽게 주사할 수 있는 비드가 선호된다. 예를 들어, 류마티스학 응용의 경우, 18G에서 25G 범위의 바늘을 통해 쉽게 주사할 수 있는 비드가 선호된다.

유리하게는, 본 발명에 따른 비드는 사용된 투여 장치를 통한 주사, 이식 또는 점적에 요구되는 특징을 갖는다.

한 대안에 따르면, 본 발명에 따른 하이드로겔 비드는 수화된 형태하에서 20㎛ 내지 450㎛의 평균 직경을 갖는다. 비드의 평균 직경은 입자 크기 분석 방법, 예를 들어 레이저 회절법(평균 부피 직경), 또는 현미경 기술(숫자 평균 직경)에 의해 기록된 이미지 분석, 예를 들어 광학, 주사 전자, 스윕, 원자력 또는 공초점 주사 현미경에 따라 측정된다. 이러한 기술은 또한 탈수된 형태에서 비드의 직경을 측정할 수 있다.

한 대안에 따르면, 본 발명에 따른 비드는 특히 이물질에 대한 반응을 최소화하고 비드가 조직에서 이동하는 것을 방지하기 위해 수화된 형태하에서 25㎛ 내지 250㎛의 평균 부피 직경을 갖는다.

한 대안에 따르면, 본 발명에 따른 하이드로겔 비드는 수화된 형태하에서 1㎛ 내지 20㎛의 평균 부피 직경을 갖는다.

한 대안에 따르면, 본 발명에 따른 하이드로겔 비드는 1000nm 미만, 바람직하게는 500nm 미만의 평균 부피 직경을 갖는다. 이들은 나노비드, 하이드로겔의 나노입자 또는 나노겔이다.

일반적으로, 비드 크기 분포는 표적 응용분야에 따라 다르다.

비드는 주사 또는 이식 후 이물질에 대한 반응을 최소화하고 표적 적응증에 적합한 방식으로 구형이다.

유리하게는, 본 발명에 따른 비드는 이들의 수화된 형태에서 거칠기가 거의 없고 바람직하게는 매끄러운 표면 형태를 나타낸다.

유리하게는, 매끄럽거나 거칠지 않은 표면은 이물질에 대한 반응을 최소화한다.

유리하게는, 본 발명에 따른 비드는 특히 제타 전위를 측정함으로써 음성 또는 중성 표면 전하를 갖는다. 유리하게는, 음성 또는 중성 표면 전하는 이물질에 대한 반응을 최소화한다.

비드의 많은 응용분야를 위해, 균질한 하이드로겔 비드가 바람직하며, 즉 부서지지 않고 비드 표면 내부 또는 표면 상에 고체 성분이 없다.

유리하게는, 비드는 투명하다.

최종 상(배지), 예를 들어 수성상 및 최종 포장, 예를 들어 주사기에 포함될 때 뿐만 아니라 저장 시간 내내 완전하고 균질하게 유지되는 하이드로겔의 비드는 또한 많은 응용분야에서 선호된다. 이들은 ≪완전한≫ 및 ≪균질한≫ 비드라고 불린다.

기계적 특성

유리하게는, 본 발명에 따른 비드는 수화된 형태하에서 가요성이며, 즉 이들의 형태는 파손 없이 일부 변형력(예를 들어 압축 또는 전단)을 받을 때 변형될 수 있고 일단 비드가 변형력으로부터 해제될 때 초기 형태로 돌아갈 수 있다.

유리하게는, 본 발명에 따른 비드는 이식 부위에 의해 부과된 기계적 응력에 대한 적절한 저항성을 나타낸다.

유리하게는, 따라서 본 발명에 따른 비드는 이들이 주사되거나 이식되는 조직을 증가, 충전 및/또는 리모델링하는 적절한 능력을 갖는다.

생리적 특성

유리하게는, 본 발명에 따른 비드는 특히 안전성, 면역적합성, 생체흡수성, 생체역학적 특성 및 수명 또는 활동 시간의 면에서 인간 또는 동물에서 사용하기에 적합하다. 그러나 최신 기술의 조성물은 이러한 특성을 만족스럽게 제공하지 않으며 따라서 본 발명에 따르지 않을 것이다.

제조 과정

본 발명은 또한 본 발명에 따른 비드 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명은 보다 구체적으로 본 발명에 따라 정의된 바와 같은 복수의 비드를 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 다음을 포함한다:

적어도 하나의 다른 폴리머의 존재하에서 또는 부존재하에서, 바람직하게는 알칼리성 pH에서 제조된 적어도 하나의 가교제를 사용하여 카복시알킬 키토산의 수용액을 제조하는 단계;

이 용액의 액적을 복수의 비드 형태로 형성하는 단계;

가교제에 의해 카복시알킬 키토산, 및 가능하게는 존재하는 경우 적어도 다른 폴리머를 가교결합시키는 단계; 및

본 발명에 따라 정의된 복수의 비드를 얻는 단계.

특히, 본 발명에 따른 방법은 생체흡수성 폴리머에 기초한 액적을 형성한 다음 폴리머의 공유 가교결합에 의해 이를 안정화시키는 단계를 포함한다.

전형적으로, 본 발명에 따른 방법은 카복시알킬 키토산 및 가능하게는 다른 폴리머를 용해하고 이 용액의 액적을 형성한 다음, 하이드로겔 비드의 형태로 공유 가교결합하고, 원하는 비드의 치수를 선택하기 위해 가능하게 분류하는 단계를 포함한다.

바람직한 대안에 따르면, 비드는 아마도 하나 이상의 다른 폴리머를 포함하는 수성상에 혼입된다.

한 실시태양에 따르면, 하나 이상의 활성제가 액적의 형성 전에 카복시알킬 키토산, 및 가능하게는 하나 이상의 다른 폴리머를 포함하는 수용액에 첨가된다. 따라서 활성제가 각각 이 수용액에 가용성인지 불용성인지에 관계없이 적어도 하나의 활성제를 포함하는 용액 또는 현탁액이 제조될 수 있으며 본 발명에 따른 비드는 비드에 하나 이상의 활성제를 캡슐화하기 위해 형성될 수 있다.

용해

바람직한 실시태양에 따르면, 카복시알킬 키토산, 및 가능하게는 하나 이상의 다른 폴리머가 바람직하게는 알칼리성 pH를 갖는 가교제를 함유하는 수용액에 용해된다. 유리하게는, 수용액은 또한 하나 이상의 가교제를 포함한다.

알칼리제는 일반적으로 예를 들어 0.1 내지 5% 질량 농도의 나트륨 화합물이다.

한 실시태양에 따르면, 이 용해 단계에서 카복시알킬 키토산은 다른 수용성 폴리머, 예를 들어 생체폴리머, 예를 들어 다당류, 예를 들어 히알루로난과 혼합될 수 있다.

액적의 형성

한 실시태양에 따르면, 액적은 유기 용매, 예를 들어 알코올, 예를 들어 에탄올을 가능하게 포함하는 수성상의 존재하에 위치된다.

한 실시태양에 따르면, 방법은 가교 전에 복수의 비드 형태로 액적을 적어도 하나의 응고제의 존재하에서 응고시키는 단계를 포함한다.

유리하게는, 방법은 카복시알킬 키토산 액적 및 가능하게 존재하는 경우 하나 이상의 다른 폴리머를 형성하고, 가능하게는 예를 들어 이온 겔화(비공유 결합)에 의해 액적을 응고시키는 단계를 포함한다.

통상적인 방법이 용액 또는 폴리머의 액적을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 폴리머 액적은 수분 지질, 수중유 또는 유중수 매체에서의 유화에 의해 형성될 수 있다.

액적은 적절한 유속으로 의도한 비드 직경에 적합한 직경의 임의의 튜브를 통해 용액을 통과시켜 형성될 수 있다.

이것은 또한 예를 들어 이원 노즐을 사용하여 유량 및/또는 압력을 제어함으로써 주어진 직경을 갖는 스프레이(분무기라고도 함)를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 직경이 대부분 400μm(D0.9)보다 작은 비드를 얻기 위해, 직경 2.8mm(Buchi)의 이원 노즐이 사용된다. 액적의 직경을 변경하기 위해, 본 발명자들은 액적 형성 시스템, 예를 들어, 노즐의 내부 직경을 조정한다. 한 대안에 따르면, 액적 형성 시스템 또는 이의 매개변수는 폴리머 용액의 점도에 따라 조정된다. 예를 들어, 층류 제트 전자기(예를 들어, Nisco에서 판매하는 VAR-D 연속 장비 사용) 또는 정전기, 동축 공기 흐름, 동적 공기 흐름, 초음파 또는 회전 도구(예를 들어, Jetcutter, Genialab)를 사용하는 용액 제트 절단에 의한 연속 압출과 같은 다른 방법도 존재한다.

한 실시태양에 따르면, 액적의 응고는 응고제를 포함하는 ≪응고 배스(coagulation bath)≫로 지정된 용액에서 수행된다. 한 대안에 따르면, 응고제는 알칼리 토금속의 염화물, 일반적으로 염화칼슘이며, 이는 카복시알킬 키토산과의 이온 상호작용에 의해 겔화를 유도한다.

한 실시태양에 따르면, 응고 배스는 알코올 유형의 용매, 예를 들어 에탄올의 존재하에서의 수용액이다.

바람직하게는, 응고 배스는 90/10 내지 10/90, 일반적으로 30/70, 20/80 또는 80/20의 물/용매 부피비로 제조된다.

바람직하게는, 응고 배스에서 염화칼슘의 농도는 10 내지 200mg/mL이다.

바람직하게는, 응고는 실온, 즉 가열하지 않고, 바람직하게는 20 내지 25℃의 온도에서 달성된다.

한 실시태양에 따르면, 응고된 비드를 분류하여 이들의 분포를 제어하는 단계를 포함한다.

가교

한 대안에 따르면, 가교 후에 얻은 복수의 비드는 세척하고 생리학적으로 허용되는 매질에서 pH 및 삼투질농도의 균형을 유지함으로써 정제 단계를 거친다.

유리하게는, 방법은 액적 형태로 성형된, 가능하게는 응고된 폴리머(들)를 바람직하게는 제 1 단계 초기에 폴리머 용액에 존재하는 가교제를 통해 가교하는 단계를 포함한다.

한 대안에 따르면, 가교는 상기 공유 결합을 형성하는 가교제에 의해 형성된다.

따라서 여러 키토산 사슬은, 예를 들어 생체폴리머, 특히 다당류를 가교하는 데 사용된 가교제, 예를 들어 1,4 부테인다이올 다이글리시딜 에터, 1-브로모-3,4-에폭시부테인, 1-브로모-4,5-에폭시펜테인, 1-클로로-2,3-에피티오프로페인, 1-브로모-2,3-에피티오프로페인, 1-브로모-3,4-에피티오부테인, 1-브로모-4,5-에피티오펜테인, 2,3-다이브로모프로판올, 2,4-다이브로모부탄올, 2,5-다이브로모펜탄올, 2,3-다이브로모프로페인티올, 2,4-다이브로모부테인티올, 및 2,5-다이브로모펜테인티올 에피클로로하이드린, 2,3-다이브로모프로판올, 1-클로로-2,3-에피티오프로페인, 다이메틸아미노프로필카보다이이미드, 갈산, 에피갈로카테킨 갈레이트, 커큐민, 탄닌산, 게니핀, 또는 다이이소시아네이트 화합물, 예를 들어 헥사메틸렌 다이아이소시아네이트 또는 톨루엔 다이아이소시아네이트 또는 다이바이닐 설폰으로부터 선택된 것과 같은 하나 이상의 가교제(들)과의 반응에 의해 가교될 수 있다.

제니핀은 다당류, 특히 카복시메틸 키토산을 가교하는 데 사용된 천연 유래 가교제이다(Yang et al. Ophthalmic drug-loaded N,O-carboxymethyl chitosan hydrogels, Acta Pharmacol Sin 31, 1625, 2010). 제니핀은 하이드로겔을 진한 파란색에서 검은색으로 착색하므로 일부 적응증에서 유용할 수 있다.

바람직하게는, 가교제는 폴리에폭사이드 유형의 제제, 예를 들어 이관능성이다. 바람직하게는, 1,4-부테인다이올 다이글리시딜 에터(BDDE) 또는 에틸렌 글리콜 다이글리시딜 에터(EGDE)는 이미 인간에 적용되는 생체 물질, 특히 피내, 관절내 또는 안구내 투여용 히알루로난 하이드로겔의 제조에 사용되기 때문에 가교제로 사용된다. 한 대안에 따르면, 가교제는 다이바이닐 설폰이다.

일반적으로, 가교는 가교제 및 고려되는 결합 유형에 따라 적절한 pH에서 발생한다.

한 대안에 따르면, 가교는 예를 들어 수산화나트륨(NaOH) 용액의 존재하에서 알칼리성 수성상에서 수행된다. 유리하게는, 수성상에 초기에 존재하는 카복시알킬 키토산의 농도는 알칼리성 수성상의 부피에 대해 카복시알킬 키토산의 질량으로 1 내지 30% 범위 및 바람직하게는 5 내지 20%(m/v)이다.

유리하게는, 가교제의 양은 폴리머(들) 그램당 0.001mol 내지 0.1mol BDDE이다.

바람직하게는, 가교제의 양은 BDDE를 사용할 때 폴리머 그램당 0.005 내지 0.02몰이다.

통상적으로, 가교는 원하는 가교제, 폴리머 및 생체역학적 특성에 따라 각 경우에 적합한 온도 및 지속시간에서 발생한다.

일반적으로, 가교는 예를 들어 산을 첨가하고, 예를 들어 아세트산 또는 염산을 첨가함으로써 매질을 중화시키는 것으로 이어진다.

정제

유리하게는, 방법은 가교된 비드를 정제하는 단계를 포함한다. 정제는 한편으로는 과량의 응고제 및 미반응 가교제를 상당히 제거할 수 있고, 다른 한편으로는 비드의 하이드로겔을 pH 및 삼투질농도 면에서 선택된 매질, 예를 들어 완충 용액과 같은 생리학적으로 허용 가능한 매질과 균형을 맞출 수 있다.

한 실시태양에 따르면, 정제는 완충제, 바람직하게는 식염 인산염 완충액(종종 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline)를 나타내는 PBS로 약칭) 또는 비드가 표적 제품에 따라 포함될 배지를 포함하는 용액을 사용한 1회 이상의 세척을 포함한다.

바람직하게는, 정제는 약학적 등급의 물로 1회 이상 세척한 다음 생리학적 용액, 즉 1회 주사 또는 조직 이식에 적합한 pH 및 삼투질농도를 갖는 용액으로 1회 이상 세척하는 것을 포함한다.

유리하게는, 정제는 여과막에 대한 일련의 여과/세척 단계에 의해 또는 선택된 용액 및 적절한 차단 투석막을 사용하는 투석에 의해 수행된다.

한 실시태양에 따르면, 하이드로겔 비드는 먼저 염산을 첨가함으로써 중화되고; 그런 다음 진공하에서 여과막에 수집된다. 이 작업은 여러 번 반복될 수 있다. 그런 다음 비드는 (적응증에 따라 선택된 조성물, 삼투질농도 및 pH의) 완충 용액에 현탁될 수 있고, 통상적인 기술에 따라 여과에 의해 수집될 수 있다. 이 단계는 원하는 완충액의 삼투질 농도 및 pH 및 전달된 양과 적응증과 관련하여 표적 제품에 대해 사전에 지정된 한계보다 낮은 비드 내 잔류물 함량을 갖는 하이드로겔 비드의 현탁액을 얻을 때까지 재개된다. 따라서 비드 내 응고제 함량 및 가교제의 잔류 함량이 지정된 한계보다 낮은지 확인한다. 응고제의 함량은 염화칼슘의 경우 유럽약전의 총회분법에 따라 결정된다. 가교제의 함량은 피달고 등(Detection of a new reaction by-product in BDE crosslinked autoclaved hyaluronic acid hydrogels by LC-MS analysis, Medical Devices: Evidence Res 11, 367, 2018)에 기술된 방법을 기초로 하여 BDDE의 경우 LC-MS에 의해 결정된다.

구분/분류

한 대안에 따르면, 복수의 비드가 그 치수에 따라 비드를 선택하도록 분류된다.

선택적으로, 더 작은 비드는 더 큰 크기의 비드가 침전되도록 하여 제거된다. 그런 다음, 하이드로겔 비드는 크기에 따라 예를 들어 기존의 분류 방법(≪체질≫에 의해)에 따라, 초음파에 의해 교반되는 적절한 다공성이 있는 체에 놓고, 감소되는 다공성 필터에 의한 진공 여과 또는 다른 정렬 방법에 의해 분류될 수 있다.

보존

한 실시태양에 따르면, 수득된 하이드로겔 비드는 최종 제제화, 멸균 및 포장될 때까지 수용액, 예를 들어 인산염 완충액 또는 임의의 다른 수용액과 같은 완충 용액에 이들을 혼입함으로써 보존된다.

한 실시태양에 따르면, 수득된 하이드로겔 비드는 예를 들어 동결 건조 또는 진공 오븐에서의 건조에 의해 탈수되고 건조 상태로 보존된다.

한 특정 실시태양에 따르면, 본 발명에 따른 비드 제조 방법은 다음을 포함한다:

- 카복시알킬 키토산 혼합물, 다른 폴리머, 및 바람직하게는 히알루로난, 및 적어도 하나의 가교제의 혼합물을 알칼리 상에서 가용화하는 단계;

- 카복시알킬 키토산 및 다른 폴리머, 및 바람직하게는 히알루로난의 액적을 형성한 다음, 가능하게는 예를 들어 이온 겔화를 통해 응고제를 포함하는 응고 배스에서 이들을 응고시키는 단계;

- 액적에 가교 반응을 수행하는 단계;

- 카복시알킬 키토산과 다른 폴리머, 및 바람직하게는 히알루로난의 공동 가교 매트릭스의 비드를 얻는 단계.

따라서, 예를 들어 본 발명에 따른 방법은 다음을 포함한다:

- NaOH를 함유하는 염기성 용액에서 카복시알킬 키토산(및 가능하게는 다른 폴리머, 및 바람직하게는 히알루로난) 및 1,4 부테인다이올 다이글리시딜 에터(BDDE)의 용액을 제조하는 단계; 및

- 용액은 실온에서 응고제, 일반적으로 물/에탄올 혼합물에 염화칼슘을 포함하는 응고 배스에서 액적으로 분산되어 구형 비드 형태로 응고된다; 및

- BDDE에 의해 카복시알킬 키토산(및 가능하게는 다른 폴리머)을 가교하여 가교된 카복시알킬 키토산의 하이드로겔 비드를 제공하는 단계;

- 과량의 응고제 및 BDDE를 제거하고 원하는 pH 및 삼투질농도에서 비드의 하이드로겔 균형을 맞추기 위해 가교된 카복시알킬 키토산의 하이드로겔 비드를 중화 및 세척하는 단계;

- 선택적으로, 하이드로겔 비드를 크기에 따라 분류하는 단계.

따라서, 본 발명에 따른 매트릭스를 포함하는 하이드로겔 형태의 비드가 얻어진다.

한 대안에 따르면, 본 발명에 따른 매트릭스는 무균이다.

이 방법에 따라 본 발명에 따른 매트릭스로부터 비드 형태의 하이드로겔을 제공하는 것이 유리하다.

조성물

유리하게는, 본 발명의 조성물은 또한 특히 비드와 회합된 상에서 가교된 카복시알킬 키토산 이외의 폴리머를 포함할 수 있다. 따라서, 조성물이 수성상을 포함하는 경우, 한 대안에 따르면, 수성상 및/또는 비드는 하나 이상의 폴리머를 포함한다.

한 유리한 대안에 따르면, (회합된 상 및/또는 비드의) 폴리머는 생체폴리머, 예를 들어, 산화되거나 되지 않은, 공유 또는 비공유 결합에 의해 가교된 다당류, 예를 들어, 및 보다 특히 히알루로난, 예를 들어 히알루론산 나트륨 또는 이의 유도체 중 하나이다. 한 대안에 따르면, 하이드로겔 비드와 결합된 상은 또한 가교되거나 되지 않은 카복시알킬 키토산을 포함한다.

카복시알킬 키토산을 일부 다른 폴리머와의 결합 또는 가교의 한 가지 이점은 특성을 추가하거나 시너지 효과를 생성할 수 있다는 것이다.

한 대안에 따르면, 복수의 비드는 가능하게는 하나 이상의 폴리머, 예를 들어 카복시알킬 키토산, 히알루로난 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 수성상, 친유성상, 친수지질상, 또는 다른 고체상과 회합된다.

한 유리한 대안에 따르면, 수성상 조성물 및/또는 비드는 생리학적 매질과 균형을 이루는 pH 및 삼투질농도를 갖는 하이드로겔 형태이다.

한 대안에 따르면, 비드가 회합되는 상은 인간 또는 동물 신체 내로의 주사에 특이적이다.

한 유리한 대안에 따르면, 수성상 및/또는 비드는 인간 또는 동물 신체 내로의 주사에 특이적인 형태이다.

본 발명은 또한 인간 또는 동물에게 투여가능한 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 본 발명에 따라 정의된 바와 같은 복수의 비드를 포함한다.

한 바람직한 대안에 따르면, 본 발명에 따른 하이드로겔 비드는 인간 또는 동물에서 주사가능한 수성 매질(가능하게는 약간 점성)에서 분산액 또는 현탁액의 형태로 제제화된다. 이것은 일반적으로 본 발명에 따른 조성물로 지칭된다.

한 대안에 따르면, 조성물은 주사가능한 현탁액으로서 제제화되고, 인간 또는 동물에 점적용으로 준비되거나 이식될 수 있다.

한 유리한 대안에 따르면, 특히 피부 주사용으로 의도된 제품의 경우, 구분되거나 되지 않은 비드가 하나 이상의 친수성 생체폴리머, 바람직하게는 히알루로난의 용액에 혼입된다.

한 대안에 따르면, 비드의 제제는 전달에 적합한 장치, 예를 들어 주사기에서 컨디셔닝된 다음, 적절한 멸균은 멸균을 보장하도록 의도된 주기를 적용함으로써 예를 들어 오토클레이브에 의해 수행된다. 한 대안에 따르면, 따라서 본 발명은 주사에 의해 전달될 준비가 된 가교된 카복시알킬 키토산에 기초한 하이드로겔 비드 제제를 함유하는 멸균 주사기에 관한 것이다.

질량비[카복시알킬 키토산/히알루로난]은 예를 들어 5/95 내지 95/5, 예를 들어 10/90 내지 90/10, 예를 들어 20/80 내지 80/20 및 다시 예를 들어 30/70 내지 70/30이다. 한 대안에 따르면, 질량비[카복시알킬 키토산/히알루로난]은 1/1(즉, 50% 키토산 및 50% 히알루로난)이다.

수성 매질은 물, 수용액일 수 있고, pH와 삼투질 농도는 예를 들어 염 및/또는 가능하게는 폴리올, 예를 들어, 소르비톨, 만니톨, 글리세롤 및/또는 트레할로스의 첨가에 의해 완충 용액을 사용하여 조정된다.

한 실시태양에 따르면, 매트릭스의 조성물은 100 내지 700mOsm/kg, 바람직하게는 120 내지 500mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는다.

한 실시태양에 따르면, 매트릭스의 조성물은 100 내지 500mOsm/kg, 바람직하게는 120 내지 270mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는다.

유리하게는, 매트릭스 조성물의 삼투질농도는 250 내지 400mOsm/kg, 바람직하게는 280 내지 350mOsm/kg에 포함된다.

한 대안에 따르면, 매트릭스의 조성물은 관절에 적절한 삼투질농도를 갖는다.

한 대안에 따르면, 매트릭스의 조성물은 안구 또는 안내 표면과 양립할 수 있는 삼투질농도를 갖는다.

한 대안에 따르면, 매트릭스의 조성물은 진피 및 피하조직과 양립할 수 있는 삼투질농도를 갖는다.

한 대안에 따르면, 매트릭스 조성물의 삼투질농도는 100 내지 400, 보다 구체적으로 120 내지 350mOsm/kg 범위인 것이 바람직하다.

한 대안에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 무균이다.

유리하게는, 본 발명에 따른 조성물은 주사, 이식 또는 점적 장치, 예를 들어 주사기 또는 바이알에 함유된다. 유리하게는, 예를 들어 주사기와 같은 주사 장치는 증기 멸균을 거칠 수 있다. 그런 다음 이 장치, 예를 들어 주사기는 바람직하게는 무균 또는 멸균 방식으로 포장될 수 있다. 이것은 또한 제제의 멸균 후 무균 방식으로 충전되거나 충전 직후 멸균된 본 발명에 따른 조성물의 점적을 허용하는 파우치, 캡슐 또는 바이알일 수 있다.

한 대안에 따르면, 본 발명에 따른 조성물, 보다 구체적으로 본 발명에 따른 하이드로겔 비드를 포함하는 조성물은 예를 들어 주사기 또는 바이알과 같은 주사, 이식 또는 점적 장치를 충전하기 전에 여과 및/또는 증기 멸균에 의해 멸균된다.

당업자는 원하는 멸균 하이드로겔을 얻기 위한 하이드로겔의 멸균 기술을 알고 있다. 당업자는 열이나 증기로 멸균할 수 있는 여러 유형의 장비를 사용할 수 있으며 미생물 전하를 제거하는 여러 유형의 사이클을 사용할 수 있다.

본 발명은 보다 구체적으로 본 발명에 따른 하이드로겔 비드를 포함하는 주사가능한 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 적어도 본 발명에 따른 하이드로겔 비드를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

한 대안에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 주사가능하거나 이식가능하거나 점적용으로 준비된 약학적 조성물, 또는 주사가능하거나 이식가능하거나 점적용으로 준비된 의료 기기로서 사용된다.

본 발명은 또한 건조 형태, 특히 동결 건조 형태의 본 발명에 따른 조성물을 포함한다. 동결 건조된 제품은 사용 전에 보다 구체적으로 (재)분산될 수 있다.

본 발명은 보다 구체적으로, 예를 들어, 회복 또는 충전이 필요한 적어도 하나의 신체 조직/액체를 회복, 재생 또는 충전하기 위해, 예를 들어, 피하, 피내, 안내 또는 관절내, 점막내, 복강내, 근육내 주사에 의한 주사를 포함하는 치료적 치료를 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.

고려되는 응용분야에 대해 충분한 정도의 순도를 갖는 키토산을 사용하는 것이 유리하다.

고려되는 응용분야에 대해 충분한 정도의 순도를 갖는 히알루로난을 사용하는 것이 유리하다.

본 발명에 따른 조성물이 추구하는 생체기계적 특성은 적응증, 예를 들어 하이드로겔이 통합되어야 하는 조직, 작용 메커니즘 또는 환자에게 이점을 제공하도록 의도된 효과 및 효과의 지속시간에 따라 성질 및 크기가 다양할 수 있다.

유리하게는, 본 발명에 따른 조성물, 보다 구체적으로 본 발명에 따른 하이드로겔 비드의 특성이 적응증에 적합하다. 이러한 특성을 적용하기 위해, 폴리머(카복시알킬 키토산 및/또는 히알루로난과 같은 기타 폴리머)의 최종 농도 및/또는 가교 속도는 예를 들어 특히 가교제/폴리머 질량비 및/또는 성질 및/또는 이온의 양, 및/또는 폴리머(들)의 초기 분자량 및/또는 폴리머 액적의 제조 방법을 통해 조절된다.

특히, 본 발명은 특히 피부, 하피(피하) 또는 골막 수준에서 지속적인 부피 증가가 필요한 경우 탄성이 있는 본 발명에 따른 하이드로겔 비드에 관한 것이다. 본 발명은 보다 구체적으로 연속상의 현탁액 중의 비드에 관한 것이다. 이 상은 또한 목표 제품에 대한 가변 점탄성 또는 기타 유리한 특성, 예를 들어 윤활 효과를 제공할 수 있다. 특히 관절 내 사용 제품의 경우, 충격을 흡수하고 연골이 윤활 효과를 얻을 수 있다. 본 발명의 조성물은 적응증에 따라 조정된 가변 수준의 탄성을 가질 수 있으며, 이는 유동 측정법에 의한 탄성 계수의 측정을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 복수의 하이드로겔 비드를 포함하는 상을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 비드가 이 상에 혼입되어 있다고 말할 수 있다.

한 대안에 따르면, 비드를 포함하는 상은 수성상이다.

한 대안에 따르면, 비드를 포함하는 상은 친유성상이다.

한 대안에 따르면, 비드를 포함하는 상은 친수지질상, 보다 특히 에멀젼, 예를 들어 직접, 역, 단일, 다중 등이다.

한 대안에 따르면, 비드를 포함하는 상은 고체상이다.

한 특정 대안에 따르면, 비드를 포함하는 상은 연속 수성상이다.

본 발명은 본 발명에 따른 하이드로겔 비드 및 비드가 혼입된 하나의 상을 포함하는 것을 특징으로 하는 주사가능한 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명에 따른 하이드로겔 비드를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

한 대안에 따르면, 조성물은 치료적 치료 방법에서 실행하기 위한 약학적 조성물 또는 조성물로서 제제화된다.

한 대안에 따르면, 조성물은, 예를 들어, 회복 또는 충전이 필요한 적어도 하나의 신체 조직을 회복 또는 충전하기 위해, 예를 들어, 상기 조성물의 점적 또는 국소 전달 또는 피하, 피내, 점막, 안구, 안내, 또는 관절내 경로에 의한 주사를 포함하는 치료적 치료 방법에 사용하기 위한 주사가능, 이식가능 또는 점적용으로 준비된 또는 국소 전달을 위한 약학적 조성물, 또는 주사가능, 이식가능 또는 점적용으로 준비된, 또는 국소 전달을 위한 의료 기기로서 사용된다.

한 대안에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 회복 또는 충전을 필요로 하는 적어도 하나의 신체 액체 또는 조직, 및 예를 들어 성대, 근육, 인대, 힘줄, 점막, 성기, 뼈, 관절, 눈, 진피 또는 조합 중 어느 하나, 보다 구체적으로 진피, 연골, 활막, 피부 상처 또는 안구 표면에 속하는 조직으로부터 선택되는 신체 조직의 치료, 회복 또는 충전 방법에 사용된다.

본 발명은 예를 들어 생물학적 유체, 예를 들어 활액 내로의 주사에 의해, 또는 생물학적 유체, 예를 들어 혈액과 혼합 후 관절증의 치료 방법, 또는 연골 결핍의 회복 및 및 연골 이식에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다. 생물학적 유체는 조성물을 변형하는 처리를 받았거나 받지 않은 신체 기원의 유체이다.

본 발명은 본 발명에 따라 정의된 바와 같은 조성물을 포함하거나 이로 이루어지는 것을 특징으로 하는 의료 장치, 예를 들어 의료 임플란트에 관한 것이다.

본 발명은 보다 구체적으로 류마티스과, 안과, 부인과, 미용 의학, 성형 외과, 내과 외과, 정형외과, 부인과 외과에서의 치료, 피부과에서 수술 후 조직 유착 예방을 포함하는 치료, 수술 또는 미용 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 예를 들어 안구 건조 증후군, 각막 병변의 치료적 치료에서 안과적 사용, 또는 임의의 다른 안구 조직에서의 안내 전달을 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 안구 표면 상에 점적하여 각막 병변 또는 안구 건조 증후군을 예방 또는 치료하기 위한, 보다 구체적으로 안구 표면을 윤활 또는 재생시키기 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.

실제로, 본 발명은 또한 본 발명에 따라 정의된 카복시알킬 키토산을 포함하는 점안제의 조성물에 관한 것이다.

한 대안에 따르면, 대상은 관절의 염증성 병리(예를 들어, 골관절증, 관절염 등)에 의해 영향을 받는다.

본 발명은 보다 구체적으로 예를 들어 활액강에 주사하거나 연골이 없는 수준에 이식함으로써 관절증, 관절염 또는 연골 결핍의 치료를 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 보다 구체적으로 의료 장치, 예를 들어 본 발명에 따른 조성물을 포함하거나 구성되는 것을 특징으로 하는 의료 임플란트에 관한 것이다.

한 바람직한 대안에 따르면, 따라서 본 발명은 건조 형태, 특히 동결 건조 형태의 본 발명에 따른 조성물을 함유하는 챔버, 및 가능하게는 하나 이상의 활성 물질, 첨가제 또는 부형제 제품을 함유하는 하나 이상의 다른 챔버를 포함하는 의료 장치에 관한 것이다.

본 발명에 따른 조성물은 또한 원하는 적응증을 위한 하나 이상의 활성제, 및/또는 본 발명에 따른 조성물의 특성을 조절하도록 허용하는 하나 이상의 첨가제 또는 부형제를 포함할 수 있다.

한 대안에 따르면, 본 발명에 따른 비드는 원하는 적응증을 위한 하나 이상의 활성제, 및/또는 본 발명에 따른 조성물의 특성을 조절하도록 허용하는 하나 이상의 첨가제 또는 부형제를 포함하거나 다른 용어로 캡슐화한다. 예를 들어, 이들은 전달 구역, 및 특히 주사, 점적 또는 이식 구역을 위한 약학적 활성 성분 또는 영양소일 수 있다.

본 발명은 또한 약학적 조성물 또는 치료적 치료 방법의 실행을 위한 조성물로서 제제화된 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 약학적 조성물 또는 의료 장치의 제조를 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 예를 들어 활막 주머니에 주사하거나 생물학적 유체, 예를 들어 혈액과 혼합한 후 관절증의 치료 방법 또는 연골 결핍의 회복 및 연골/뼈의 이식에 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 피부 조직을 충전함으로써 치료 또는 미용 관리 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다. 보다 특히 예를 들어 이것은 본 발명에 따른 조성물을 피하, 피내, 점막내, 근육내 주사하는 것을 의미한다.

본 발명은 또한 피내 경로 또는 기타 조직에 의한 다중 주입에 의한 피부 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 일반적으로 미용 목적을 위한 치료제로서 피부과에서 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이며 조성물은 점성보충제이다. 이것은 예를 들어 관절내 수준에 본 발명의 조성물을 주사하여 특히 관절의 연골 표면의 마찰을 제한하는 것을 의미한다.

본 발명은 또한 하나 이상의 세포 유형의 세포 벡터, 및/또는 하나 이상의 활성제의 벡터로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다. 이들은 약학적 또는 생물학적 용어로 활성인 제제이다. 본 발명의 조성물은 실제로 세포, 바람직하게는 살아있는 세포의 존재와 양립할 수 있다. 관심 살아있는 세포 중에서, 예를 들어 연골세포(관절 연골), 섬유연골세포(반월판), 인대 섬유아세포(인대), 피부 섬유아세포(피부), 건세포(힘줄), 근섬유아세포(근육), 중간엽 줄기 세포, 적혈구(혈액) 및 각질세포(피부)가 언급될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 적어도 하나의 치료제의 표적화된 국소 전달 및/또는 제어 방출을 위한 치료 벡터로서 사용될 수 있다.

한 대안에 따르면, 본 발명에 따른 비드는 하나 이상의 활성제, 예를 들어 수용성 분자(전체적으로 또는 부분적으로) 및/또는 비수용성 분자를 포함한다. 한 대안에 따르면, 본 발명에 따른 비드는 하나 이상의 항염증 분자, 예를 들어 코르티코스테로이드, 특히 글루코코르티코이드를 포함한다. 여러 수용성 모듈 중 한 예는 아스코르브산이다. 수용성 활성제의 다른 예는 항염증제인 덱사메타손이다. 비수용성 활성제의 다른 예는 항염증제이기도 한 트라이암시놀론이다. 한 대안에 따르면, 비드에 캡슐화된 활성제는 고분자량(예를 들어 10kDa 초과)의 수용성 생체분자 및 예를 들어 단백질이다.

활성제의 메커니즘 및 방출은 수용성인 경우 확산에 의해 또는 비드의 분해, 예를 들어, 가수분해 또는 기계적 분해에 의해 용해도 프로파일에 따라 달라질 것이다.

유리하게는, 본 발명에 따른 조성물 및 비드는 하나 이상의 활성제의 국소 및 제어 방출을 갖는 시스템을 제공한다. 유리하게는, 본 발명에 따른 비드 폴리머의 조성물은 표적 방출 프로파일(이는 적응증 및 분자에 따라 다름)에 적응될 수 있고, 따라서 실제 다용성이 상이한 활성제의 캡슐화 및 방출에 적응하도록 허용할 수 있다.

한 대안에 따르면, 혈액, 또는 혈장, 또는 혈소판 용해물, 또는 혈소판이 풍부한 혈장, 또는 임의의 다른 생물학적 유체가 예를 들어 제품의 성능을 증가시키는 것을 허용하는 본 발명의 조성물과 함께 첨가된다.

한 대안에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 일단 전달되면 비드를 방출할 수 있는 고체 형태, 예를 들어 필름, 튜브 또는 다공성 발포체로 제제화된다.

한 대안에 따르면, 조성물은 스프레이 형태로 제제화된다.

본 발명은 또한 화상의 경우와 같이 과도한 온도에 의해 영향을 받은 하나 이상의 조직 또는 기관의 미용적 치료 또는 관리 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 연골 회복의 치료 방법(예를 들어, 연골 결함의 재생을 지원하기 위해 연골 결함에 이식함으로써)에 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 예를 들어 산화 스트레스를 받는 하나 이상의 생체 조직과 접촉하도록 의도된 주사, 점적 또는 이식에 의해 국소 방식으로 전달되는 생리학적으로 허용 가능한 조성물에 관한 것이다:

- 골관절증 치료를 위한 관절 내 주사(활액 보충, 연골 윤활, 관절 수준의 충격 흡수, 활막 재생을 통해); 연골 결함의 복구를 강화하기 위한 관절 내 이식;

- 골 회복을 강화하기 위한 골내 이식(골유도/골전도);

- 지방 위축의 경우 부피 증가를 위해 피부 또는 모낭을 채우거나 재생하기 위한 피하, 피하 및/또는 골막 주사, 또는 활성 성분 전달;

- 예를 들어 안구 건조 및 각막 병변의 치료 및 활성 성분 전달을 위한 안구 표면의 증상을 완화하거나 변형을 방지하기 위한 안구 점적;

- 안구 전방 또는 후방 조직의 재생 및/또는 활성 성분의 안내 전달를 위한 안과 수술에 대한 보조제로서, 예를 들어 녹내장 수술 또는 유리체 보충의 효과를 최적화하기 위한 안구내 주사;

- 수술 후 유착을 예방하기 위해 내부 조직 및 장기에 투여;

- 회복 또는 재생을 강화하기 위해 피부, 뼈, 연골, 각막, 힘줄, 반월상 연골 등과 같은 조직 및 기관의 상처, 틈, 찢어진 부분, 공동에 투여;

- 외음부 통증 치료를 위한 외음부 점액 수준의 주사;

- 세포 배양을 위해, 예를 들어 조직 공학 또는 재건 또는 세포에 의한 관심 물질의 생산을 위해 특히 생물반응기에서 세포를 위한 지지체 또는 스캐폴드.

본 발명은 또한 관절내 점성보충제를 형성하는 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.

일반적으로, 조성물의 삼투압 및 pH 값의 범위는 적응되고 일반적으로 본 발명에 따른 조성물과 접촉하는 조직의 삼투압 및 pH 값에 가깝다.

유리하게는, 본 발명에 따른 조성물은 무균이다. 매우 유리하게는, 본 발명에 따른 조성물은 습열로 멸균된다.

한 대안에 따르면, 본 발명의 조성물은 투명하거나 반투명하다.

보다 구체적으로, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물, 보다 구체적으로 하이드로겔 형태로 미리 충전된 하나 이상의 점적 또는 주사 장치를 포함하는, 바람직하게는 멸균된 품목 또는 포장에 관한 것이다. 이러한 장치가 일반적으로 제품을 점적 또는 미리 채워진 주사기 형태로 주사되게 할 수 있다.

유리하게는, 본 발명의 하나의 조성물은 바람직하게는 그 적응증에 적합한 품목 또는 포장으로, 바람직하게는 수개월 동안 저장될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물 및 비드는 유리하게는 멸균될 수 있다. 따라서, 본 발명은 멸균 가교된 카복시알킬 키토산에 관한 것이다. 따라서 가교된 카복시알킬 키토산은 특히 필요로 하는 응용분야를 위해 멸균이다.

한 대안에 따르면, 본 발명의 비드 또는 조성물은 숙련자에게 공지되어 있고/있거나 유럽 약전에 의해 권장되는 방법에 기초하여 증기로 멸균된다.

다른 대안에 따르면, 조성물은 적절한 필터, 예를 들어 0.2㎛ 이하의 다공성을 갖는 필터를 사용하는 여과에 의해 멸균될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 조성물을 주입하는 단계를 포함하는 치료적 치료 방법을 포함한다.

본 발명은 또한, 예를 들어 본 발명에 의해 보다 구체적으로 정의된 바와 같은 치료적 치료를 위한, 약학적 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 조성물의 용도를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 조성물을 주입하는 단계를 포함하는 미용적 관리, 즉 비치료적 방법을 포함한다. 예를 들어, 이것은 예를 들어 사고나 외과적 절차에 따라 미용 목적으로 눈에 보이는 손상된 조직의 지방 위축증 치료 또는 충전 또는 하나 이상의 영역의 치료일 수 있다.

조직은 동일한 기능에 참여하는 기능적 세트로 그룹화된 동일한 기원의 유사한 세포 세트이다. 조직 중에서 진피 조직(예를 들어, 상피 조직), 결막 조직, 근육 조직, 지방 조직, 신경 조직 등을 언급할 수 있다.

≪본 발명에 따른 조성물≫ 또는 등가 용어는, 바람직한 특징에 따른 것을 포함하여 독립적으로 또는 이들의 임의의 조합에 따른 대안, 특정 또는 특정 실시태양 중 어느 하나에 따른 것을 포함하는 본 발명에서 정의된 조성물을 의미한다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 단지 예시 목적으로 제공된 실시예를 참조하고 본 발명의 범위를 제한하지 않아야 하는 설명적인 설명을 읽으면 당업자에게 명확하게 나타날 것이다.

실시예는 본 발명의 완전한 일부이며 실시예를 포함하여 전체적으로 취해진 설명으로부터 임의의 선행 기술의 상태와 관련하여 새로운 것으로 보이는 임의의 특징은 그 기능 및 일반성에 있어서 본 발명의 완전한 일부이다.

따라서 각 실시예는 일반적인 범위를 가진다.

한편, 달리 명시되지 않는 한, 실시예에서 달리 명시되지 않는 한 모든 백분율은 질량으로 제공되고 온도는 섭씨도로 표시되며, 압력은 달리 명시되지 않는 한 대기압이다.

실시예:

얇은 바늘을 통한 사출력과 사출 후 비드의 무결성

로드 셀(Instron 500N, Mecmesin)이 장착된 압축 벤치(Inston 5566, Mecmesin) 및 주사기에 적합한 샘플 홀더를 사용하여 측정을 수행한다. 테스트할 제제가 들어 있는 1mL BD 유리의 주사기를 실온으로 설정한다. 27G 바늘(길이 ½ '', TSK)을 주사기에 연결하고 주사기를 샘플 홀더에 배치한다. 압축 셀을 1분 동안 10mm/min의 속도로 낮추고 균질한 겔/상 혼합물을 시계 유리에 수집한다. 사출력은 일정한 속도에서 힘 곡선 변위의 안정기의 평균값으로 결정한다. 비드의 무결성은 광학 현미경(모양, 표면)으로 사출 후 확인한다.

광학 현미경(크기, 구형도 및 육안 검사)

비드의 이미지는 올림푸스 SC-50 카메라와 올림푸스 스트림 이미지 캡처 소프트웨어가 장착된 올림푸스 CKX-41 현미경을 사용하여 기록된 다음 셀센스 디멘젼 데스크탑 소프트웨어를 사용하여 처리한다. 이를 위해, 비드 현탁액의 한두 방울을 붕규산 유리 슬라이드에 놓고 물체 덮개로 덮는다. 슬라이드는 즉시 현미경 판에 놓는다.

비드의 치수와 구형도를 결정하기 위해, 4배 배율을 선택하여 최소 이미지당 20개의 비드를 본다. 10개의 이미지를 저장한 다음 셀센스 소프트웨어로 분석하여 비드의 치수(폭, 길이, 직경)를 결정한다.

비드의 구형도는 길이에 대한 너비의 제곱 몫과 같다. 보고된 최종 값은 10개 이미지(총 최소 200개 비드)를 분석한 후 각 샘플에 대한 측정값의 평균이다. 완전한 구형 비드는 1의 구형도를 갖는다.

심장 또는 비드 표면에 바람직하지 않은 불용성 종의 부족을 확인하기 위한 육안 검사를 수행하기 위해, 비드 현탁액 한두 방울을 두 개의 슬라이드에 놓고 4x, 10x 및 40x 확대에서 비드를 관찰한다.

수분 함량

약 500mg의 수화 비드를 종이에 올려 과량의 연결되지 않은 물을 제거한다. 유럽 약전 2.2.32의 방법에 따라 비드를 수분 분석기 MA37(Sartorius) 수분 스케일 플레이트에 놓고 건조한다. 수분 함량은 습식 질량과 건식 질량의 차이로 계산된다.

회분 함량

회분 함량은 세척 단계에서 과잉 미네랄 물질, 주로 응고 단계에서 염화칼슘을 제거하는 능력을 반영한다. 측정은 진공하에서 수분 함량을 측정한 후 배양기에서 사전에 탈수된 비드에 대해 유럽 약전 방법 2.4.16(총 회분)에 따라 600℃에서 하소하여 수행된다. 회분 함량은 건조 비드 질량에 상대적이다.

BDDE 함량 및 잔류 BDDE 부산물

미반응 BDDE 가교제는 천연 형태 또는 부산물의 형태로 발견될 가능성이 높다. BDDE 또는 이의 잔류 부산물의 농도는 피달고 등(Detection of a new reaction by-production BDDE crosslinked autoclaved hyaluronic acid hydrogels by LC-MS analysis, Medical Devices: Evidence Res 11, 367, 2018)의 방법에 적합한 방법에 따라 LC-MS에 측정된다. 피부 주사용 CC 하이드로겔 비드 기반 제품의 경우, 2ppm BDDE 및 이의 부산물(총 함량)의 최대 제한이 부과된다(De Boulle et al. A review of the metabolism of 1,4-butanediol diglycidyl ether-crosslinked hyaluronic acid dermal fillers, Dermatol Surg 39, 1758, 2013).

레이저 회절법에 의한 비드 크기(직경) 측정

레이저 회절 측정은 ≪하이드로-유닛≫(Hydro 2000SM)이 장착된 마스터사이저(Mastersizer) 2000(Malvern)을 사용하여 수행된다. 테스트할 비드 현탁액의 부피를 피펫을 사용하여 약학적 등급의 물을 함유하는 하이드로-유닛에 도입하고, 3% 내지 10%의 암색 수준이 얻어질 때까지, 최적의 암색 수준을 결정하기 위해 사전에 암색화 적정을 수행하였다. 하이드로 유닛은 샘플의 균질한 분산과 시스템의 기포 부족을 보장하는 속도로 교반된다. 사용된 광학 매개변수(굴절 지수)는 샘플(비드 현탁액)의 경우 1.52이고 물의 경우 1.33이다. 각 측정은 3회 수행된다. 비드 크기 분포(직경)는 장비에서 계산 및 제공된다(3회 측정의 평균). 장비는 비드 크기 분포를 계산하고 소프트웨어는 다음 데이터를 얻도록 설정된다: 평균 부피 직경, 부피 분포의 10%(D0,1), 50%(D0,5) 및 90%(D0,9)에서 직경.

유동 측정법에 의한 생체역학적 특성(탄성계수)

연속상의 비드 현탁액의 생체역학적 프로파일은 37℃의 온도, 0.7Hz의 주파수 및 1000%에서 0.1의 변형 진폭에서 펠티어(Peltier)로 700μm 간격으로 20mm의 평면 형상이 장착된 DHR-2 하이브리드 유동 측정기(TA Instrument)를 사용하여 특징화된다. 장비는 탄성 계수(G') 값을 제공한다. 각 측정이 3회 반복되므로, G'의 평균값은 3회의 측정에 대해 계산된다.

공초점 레이저 스캐닝 현미경에 의한 비드 표면 거칠기

지지대는 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 분석하는 동안 비드의 현탁액을 잠글 수 있도록 특별히 설계되었다. 이것은 비드가 놓여 있는 웰을 포함하는 수화된 폴리아크릴레이트 유형(특허 WO 2006063994에 기술됨)의 생체 재료를 기반으로 하는 디스크이다. 비드는 생리 인산염 완충액 현탁액에서 분석된다. 비드 현탁액을 한두 방울 떨어뜨린 다음 VK-X(Keyence) 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 20배의 배율로 측정한다. 비드의 상대적 거칠기를 확인하기 위해, 비드 이미지는 ≪매우 매끄러운≫ 대조군으로 찍은 '거울 연마된' 폴리아크릴레이트 슬라이드의 표면 이미지 및 ≪매우 거친≫ 대조군으로 동결 건조된 비드의 이미지와 비교하였다.

비드의 압축 강도의 정성 평가

3개의 비드를 평평하게 삼각형으로 놓고 유리 슬라이드로 덮고 그 위에 질량이 10g에서 50g까지 증가하는 추를 올려 놓다. 비드가 10g 질량에 저항하는 경우, 기계적 압축 강도는 ≪좋음≫으로 간주된다; 비드가 50g에 저항하면, ≪매우 좋음≫으로 간주된다. 10g 미만이면, 강도가 허용되지 않는 것으로 간주된다.

카복시알킬 키토산 제조 방법(번호 PCT/EP2020/064159로 출원된 국제 출원에 따름)

실시예의 카복시메틸 키토산(CC) 참조 CC1, CC2 및 CC3의 경우, 키토산의 카복시메틸화 반응은 하기 방법에 따라 수행된다. 아가리쿠스 비스포러스 유래 키토산 30g을 아이소프로판올 600mL, 물 41mL 및 수산화나트륨 163mL에 50%(m/v)로 분산시킨다. 135g의 모노클로로아세트산(MCA) 덩어리를 아이소프로판올에 용해시키고 용액을 키토산 현탁액에 첨가한다. 반응 후, 폴리머를 에탄올에서 침전에 의해 회수하고, 그 다음 물에서 용해 사이클과 에탄올에서 침전에 의해 정제된다. CC는 건조 후 수집한다.

CC1 및 CC2 참조의 CC의 경우, 다음 방법에 따라 한 단계가 추가된다. 단계 1의 CC 21g 질량을 물 570mL에 분산시키고 용액의 pH를 약 8의 pH로 조정한다. 10mL 부피의 아세트산 무수물을 첨가하고 용액을 실온에서 교반한다. 용액의 pH를 조정한 다음 10mL의 산무수물을 첨가한다. pH는 약 7.0 - 7.5로 조정한다. CC는 건조 후 수집한다.

실시예 1 내지 5의 경우, 사용된 폴리머는 표 1 및 2의 폴리머이다.

표 1 - 카복시메틸 키토산의 특징(CC) a
참조	CC1	CC2	CC3
모세관 점도계에 의한 분자량
최초 키토산의 Mv(k)	230k	222k	225k
CC의 고유 점도	1086 mL/g	1029 mL/g	ND
CC의 측정된 Mv(k)b	315k	293k	ND
고체상 탄소-13 NMR에 의한 분자 구조
DA(아세틸화도) mol%	ND	56%	27% c
DS(치환도) mol%	ND	82%	87% d

a) 기원: 균류(Agaricus bisporus); 제조사: KiOmed Pharma; b) Mark-Houwink log Mv = (log visco - log K) / alpha의 공식을 통해 고유 점도로부터 추정된 CC의 평균 분자량, K=0.0686 및 알파=0.7638(고유 키토산에 대해 결정된 상수); c) 원래 키토산의 DA에서 추정된 DA 값(전위차 적정으로 측정); d) CC3의 아세틸화에 의해 얻어진 카복시메틸 키토산의 DS로부터 추정된 DS 값.

표 2 - 히알루론산(HA) a 의 특징
참조	HA1	HA2	HA3
공급업체	Contipro	HTL-Javenech	HTL-Javenech
고유 점도 c	2.49 m3/kg	3.07 m3/kg	3.00 m3/kg
평균 분자량(k)	1840k b	3300k c	3200k c

a) 공급업체가 제공한 값 b) 공급업체의 MALLS 검출과 함께 입체 배제 크로마토그래피 방법에 따라; c) 공급업체의 모세관 점도 측정 방법 따름.

실시예 1 - 이온 겔화 및 BDDE와의 공유 가교에 의해 형성된 비드의 제조

본 실시예에서, 먼저 폴리머 액적을 염화칼슘으로 응고시킨 후 이온 겔화하여 가교제인 1,4 부테인다이올 다이글리시딜 에터(BDDE, Alfa Aesar, CAS [2425-79-8])를 첨가하여 공유 가교함으로써 안정화시키는 것으로 이루어진 방법을 사용하여 CC 비드를 형성한다. 방법의 성공은 수성 매질 세척 단계를 견디는 비드의 능력을 평가한 다음 세척을 견딜 때 약간의 수동 압축을 견디는 능력을 평가하여 결정한다.

3개의 용액 CC 참조 CC2(표 1)를 40mg/mL의 농도로 물에 준비한다. 염산 1N 및/또는 수산화나트륨 1N을 원하는 pH까지 첨가하여 용액의 pH를 3, 6 또는 13으로 조정하고, 물을 첨가하여 30mg/mL로 희석하고 1mL 주사기에 채운다. 동시에, 30mg/mL 농도의 염화칼슘 용액을 에탄올/물 혼합물 30/70(v/v)에 준비한다.

CC 용액 각각에 대해, 27G 바늘(2mL)을 통해 CC를 천천히 방출하여 액적을 형성한다. 액적을 염화칼슘 용액(10mL)에 떨어뜨리면 젤리 비드 형태로 응고된다. 비드를 염화칼슘 용액에 1시간 동안 현탁액으로 방치한 후 80μL BDDE(BDDE/CC 비율 1.33μL/mg)를 첨가한다. 1시간 동안 교반한 다음 비드를 여과막에 수집한다. 비드를 물에 재현탁하고 여과하여 반응하지 않은 과잉 염화칼슘 및 BDDE를 제거함으로써 비드를 세척한다. 이 단계를 3회 더 반복한 다음 비드를 물 속 현탁액에 1시간 동안 방치한다.

염화칼슘 용액에서 가교 및 세척 단계 동안 젤리화된 비드의 형성이 관찰된다. 그러나, 마지막 수용액에서 15분 후(4단계 세척 후), 초기 용액의 pH에 관계없이 모든 비드가 가용화된다. 이것은 BDDE의 CC 사슬의 공유 가교가 일어나지 않았음을 나타낸다.

실시예 2 - 카복시메틸 키토산(CC) 기반 하이드로겔 비드

이 실시예는 구형(0.70보다 높은 구형도)이고, 매끄럽고, 압축 저항성이 있고, 직경이 약 20㎛ 내지 400㎛이고 질량 수분 함량이 85%를 초과하는 본 발명에 따른 가교된 CC 하이드로겔의 비드를 제공한다. 비드를 수성 매질에서 세척하여 정제하고 pH 및 삼투질농도의 균형을 맞출 수 있는지 평가한다. 또한 직경에 따라 비드를 분류하려고 한다.

비드는 표 3에 표시된 특수 조건 및 매개변수를 사용하여 다음 일반적인 방법에 따라 생산한다. 그런 다음 비드는 연속상으로 분산될 수 있고 혼합물은 예를 들어 실시예 3에 기술된 바와 같이 대상 제품의 사양 시트에 따라 포장되고 가능하면 멸균된다. 대안적으로, 비드는 예를 들어 동결-건조 또는 임의의 다른 적절한 건조 방법에 의해 건조될 수 있고, 건조 형태로 컨디셔닝될 수 있다.

이 실시예에서, CC1(표 1)의 용액(30mg/mL)은 1% NaOH 용액에서 준비되고 BDDE는 CC mg당 3μL(0.0162mmol)의 비율로 첨가된다. 이 용액은 0.3bar의 공기압에서 직경 2.8mm의 바이너리 노즐을 통해 스프레이(mini-Buchi)를 사용하여 액적으로 분산된다. 액적은 실온에서 물/에탄올 30/70(v/v)의 혼합물에서 염화칼슘(50mg/mL)을 기반으로 하는 응고 배스에 떨어져 구형 비드로 응고된다. 그런 다음 온도와 시간을 제어하면서 BDDE에 의한 CC의 가교 단계를 수행한다.

그런 다음 현탁액을 1N 염산용액을 첨가하여 중화하고, 비드를 진공하에서 여과막에 모으고, 다시 염산에 현탁시킨 다음 여과막에 모은다. 이들은 생리 인산염 완충액에 현탁되고 여과에 의해 수집된 다음 이 단계는 삼투질 농도 및 완충액 pH에서 겔 비드 현탁액을 얻을 때까지 갱신된다.

더 큰 크기의 비드가 침전되도록 하여 더 작은 비드를 제거한다. 마지막으로, 겔 비드를 다공성 400μm의 체에 놓고 다공성 필터가 감소하는 진공하에서 여과하여 크기를 분류한다. 따라서 참조 SB2-A, B 및 C가 있는 3개의 하이드로겔 비드 분획이 얻어지며, 이는 생리 인산염 완충액에서 현탁액으로 보존된다.

표 3 - 참조 SB2 - A, B 및 C를 사용한 CC 하이드로겔 비드의 제조
단계	매개변수
단계 1	CC 및 BDDE 용액: 부피: 1리터 [NaOH] = 1% [CC1] = 30mg/mL [BDDE] = 폴리머 mg당 3μL(0.016mmol)	노즐: 바이너리(직경 2.8mm, Buchi) 유속: 약 156mL/h 기압: 0.3bar
	응고 배스: 부피: 5리터 [CaCl2] = 50mg/mL 물/에탄올 30/70 v/v	온도: 실온 교반: 30분
단계 2	가교	온도 및 지속 시간: 131℃(5분) 다음 20℃에서 48시간
단계 3	현탁액의 중화: [HCl] = 1N	분리: 여과막 횟수: 2
	비드의 현탁액 완충액: 인산염 - pH 7.4	분리: 여과막 횟수: 완충액의 최대 pH 및 삼투질농도
	침전에 의한 더 작은 직경의 비드 제거	상층액 제거, 침전된 고형물 수집
단계 4	크기별 분류 a) 체질에 의한 직경 400μm* 미만의 비드 수집	초음파로 체질 체: 스테인리스 스틸 R60.106.000400(Retsch) 다공성: 400μm 교반: 초음파
	b) 단계 4a에서 발생된 비드의 여과 - 분획 >200μm* 수집(참조 SB2-C)	진공 여과 필터: 나일론 200μm(148147, Spectrum Labs)
	b) 단계 4b에서 발행된 비드의 여과 < 400μm - 분획 100-200μm* 수집(참조 SB2-B)	진공 여과 필터: 나일론 100μm(148145, Spectrum Labs)
	d) 단계 4c에서 발행된 비드의 여과 - 분획 30-100μm* 수집(참조 SB2-A)	진공 여과 필터: 나일론 30μm(148136, Spectrum Labs)
단계 5	인산염 완충 현탁액(완충 pH 및 삼투질농도: 7.4 및 275 mOsm/kg)	온도: 2 - 8℃

^*발표된 필터 다공성에 해당하는 이론상 직경

세척, 분류 및 현탁 단계를 거쳐 실제로 안정적인 비드가 얻어진다. 3개의 비드 분획은 상술된 방법에 따라 특징화된다: 레이저 회절법에 의한 크기 분포(Mastersizer 2000, Malvern); 습도 척도를 사용한 수분 함량(Moisture Analyzer MA37, Sartorius); 정성적 방법에 의한 압축 강도(중량 50g); 광학 현미경에 의한 구형도 및 육안 검사; 공초점 현미경을 스캔하여 표면 거칠기. 결과는 표 4에 보고된다.

표 4 - CC 하이드로겔 비드 참조 SB2-A, B 및 C의 특징
참조	SB2-A	SB2-B	SB2-C
크기 분포(직경)	Daverage=91μm D(0.1)=23μm D(0.5)=87μm D(0.9)=175μm	Daverage=197μm D(0.1)=97μm D(0.5)=194μm D(0.9)=310μm	Daverage=373μm D(0.1)= 219μm D(0.5)=363μm D(0.9)=561μm
수분 함량 % 습식 질량	90%	90%	90%
육안 검사	균질한 하이드로겔	균질한 하이드로겔	균질한 하이드로겔
회분 함량(% 건식 질량)	ND	ND	17%
압축 강도	예	예	예
구형도	0.88	0.88	ND*
거칠기	매끄러움	매끄러움	매끄러움
불용성	없음	없음	없음

^*ND: 측정되지 않음

이 비드 제조 방법은 CC 하이드로겔 비드가 본 발명에서 추구하는 특징에 따라 수득되게 한다. 또한, 이러한 하이드로겔 비드는 실시예 3에서 이들 비드의 제제로부터 확인된 바와 같이 과량의 물질, 특히 염화칼슘 및 BDDE를 제거하고 pH 및 삼투질농도 측면에서 매질의 균형을 맞추는 수성 매질 세척 단계를 견딘다.

실시예 3 - CC 하이드로겔 비드에 기초한 멸균 제제의 제조

실시예 2에서 CC 하이드로겔 비드 기준 SB2-A 또는 SB2-B의 분획을 수집한 다음, 생리 인산염 완충제 속 2%(m/m)에서 히알루론산 나트륨(표 2의 기준 HA2) 용액과 혼합하여 70/30의 질량 비율로 분리된 제제를 얻는다. 최종 pH 목표는 7.2 ± 0.2이고 최종 삼투질농도는 315 ± 35 mOsm/kg이다.

제제를 실온에서 약 12시간 동안 천천히 교반한다. 그런 다음 1mL 유리 주사기(Hypak, BD)에 포장하고 마개(Hypak, BD)로 닫는다. 주사기를 오토클레이브(Systec, DX65)로 옮긴다. 그런 다음 주사에 의해 전달될 준비가 된 CC 하이드로겔 비드의 두 가지 제제로 멸균 주사기를 얻는다(참조 FSB1-A 및 FSB1-B).

최종 제제는 특징화된다(pH, 삼투질농도, 잔류 BDDE 함량, 탄성 계수 G', 27G 가는 바늘(TSK, ½")을 통한 조성물의 배출 용이성). 그런 다음 비드를 수집하여 방법에 의해 변경(모양, 표면, 압축 강도)되지 않았음을 확인한다.

비드 및 조성물의 특징은 표 5에 나와 있다. 정보를 위해, 두 가지 상용 제품의 특징이 미용 목적의 피부 볼륨화 적응증에 보고되어 있다: Restylane LYFT(Galderma) 및 Ellanse-M(Sinclair Pharma).

표 5 - CC 하이드로겔 비드 및 피부 볼륨화 적응증에 대한 두 가지 상용 제품을 기반으로 한 멸균 제제의 특징화
참조	FSB2-A	FSB2-B	Restylane LYFT	Ellanse-M
비드(평균 부피 직경)	SB1-A (90μm)	SB1-B (200μm)	약 750-1000μm*	약 25-50μm*
LC-MS에 의한 BDDE 함량 및 BDDE 부산물	< 2ppm	< 2ppm	NA	NA
pH	7.15	7.25	ND	ND
삼투질농도 mOsm/kg	320	316	ND	ND
육안 검사	균질	균질	ND	ND
비드 형상(광학 현미경)	구형	구형	비구형	구형
표면 거칠기	매끄러움	매끄러움	거침	매끄러움
비드의 수동 강도	저항성	저항성	NA	NA
탄성 계수 G'	6.2 kPa	7.0 kPa	0.7 kPa	1.1 kPa
27G 바늘을 통한 평균 사출력(N)	9 N	11 N	10 N	14 N
27G 바늘을 통한 사출 후 비드의 육안 검사(광학 현미경)	완전한	완전한	NA	완전한

ND: 측정되지 않음; NA: 해당 없음; ^*문헌에 따름.

이 실시예로부터, 본 발명에 따른 CC 하이드로겔 비드는 HA 용액과 함께 제제화될 수 있고, 그런 다음 균질성, 구형 형태, 매끄러운 표면 및 압축 강도를 유지하기 때문에 변경 없이 1mL 주사기에 포장 및 멸균될 수 있다고 결론지었다.

두 가지 제제 FSB2-A 및 B는 pH 균형 및 사용된 수성상과의 삼투질농도 측면에서 적합하다. BDDE의 잔류 함량 및 BDDE의 부산물(<2ppm) 측면에서 준수한다.

이 제제는 27G 바늘을 통해 쉽게 주사할 수 있으며 공기 중에서 사출하기 위해 9 내지 10N의 힘이 필요하며 특히 피하 주사에 완전히 만족스럽다. 비드는 광학 현미경을 사용하여 육안 검사로 확인한 대로 사출 후 무결성을 유지한다. 따라서 제제는 미용 목적, 특히 피하 주사에 의한 피부 볼륨화의 적응증에 적합할 것이다.

이 두 비드 제제 SB2-a 및 B의 탄성 계수는 기준 상용 제품의 탄성 계수보다 상당히 높으며 이는 현탁된 상이 아니라 비드 자체에 기인한다. 실제로, 비드가 없는 비가교 HA 용액은 G' 값이 현저히 낮은 것으로 알려져 있다. 비드의 이러한 높은 탄성은 조직의 볼륨화 적응증에 유리한데, 그 이유는 비드가 압축되거나 볼륨화 용량을 잃지 않고 조직 이동 중에 변형될 수 있기 때문이다.

실시예 4 - 다양한 조성물의 CC 및 HA 하이드로겔 비드

이 실시예에서, 수동 압축 강도, 매끄러운 표면 및 구형도를 유지하면서 CC 하이드로겔 비드의 특성을 조절하려고 한다. 이를 달성하기 위해, 히알루로난이 나트륨 히알루로네이트(표 2의 참조 HA1) 형태로 CC 용액(표 1의 참조 CC2) 및 BDDE에 첨가된다. 40mg/mL의 폴리머 내 동일한 총 농도에 대해 두 가지 다른 CC/HA 질량 비율(50/50 및 75/25)이 사용된다. 대략 10μm 내지 400μm의 직경을 갖는 비드를 형성하고자 한다. 실시예 2와 동일한 일반적인 방법이 적용되며, 표 6에 기술된 대로 매개변수가 조정된다.

표 6 - CC 및 HA 하이드로겔 비드 참조 SB4-A 및 B의 제조를 위한 매개변수
단계	매개변수
단계 1	폴리머 및 BDDE 용액: [CC2] + [HA1] = 40mg/mL 참조 SB4-A: CC2/HA1 = 50/50(m/m) 참조 SB4-B: CC2/HA1 = 75/25(m/m) [NaOH] = 1% [BDDE] = 폴리머 mg당 3μL(0.016mmol)	노즐: 바이너리(직경 1.5mm, Buchi) 용액 수준의 압력: 1 bar 기압: 1 bar
	응고 배스: 부피: 4리터 [CaCl2] = 50mg/mL 물/에탄올 30/70 v/v	온도: 실온 교반: 30분
단계 2	가교	온도: 실온 지속기간: 72 h
단계 3	현탁액의 중화: [HCl] = 1N	분리: 여과막
	정제: 염수 인산염 완충액(pH 7.4, 삼투질농도 275mOs/kg)으로 세척하고 완충액의 pH 및 삼투질농도까지 진공에서 여과	여과막 30μm
단계 4	분획의 수집 >30μm	여과막 30μm
단계 5	70/30(m/m)의 비드/용액 비율로 염수 인산염 완충액에서 2% m/m의 HA(표 2의 참조 HA3) 용액에 현탁액. 1mL 주사기에 채우고 오토클레이브에 의해 살균.

정제, 제제화 및 멸균 단계가 끝나면 저항성 비즈가 얻어진다. 비드의 특징과 최종 멸균 제제의 특징은 표 7에 나와 있다.

표 7 - CC 및 HA 하이드로겔 비드 및 비드 제제의 특징
비드	SB4-A	SB4-B
CC/HA 비율 (m/m)	50:50	75:25
크기 분포*(직경)	Daverage = 212μm D(0,1) = 10μm D(0,5) = 198μm D(0,9) = 440μm	ND (광학 현미경에 의한 관찰은 SB2-A와 유사한 크기 분포를 나타 낸다)
수분 함량 % (m/m)	97%	93%
회분 함량 (% 건식 질량)	16%	ND
육안 검사	균질	균질
구형도	ND (광학 현미경에 의한 관찰은 구슬이 둥글다는 것을 확인시킨다)	ND (광학 현미경에 의한 관찰은 구슬이 둥글다는 것을 확인시킨다)
거칠기	매끄러움	매끄러움
수동 강도	저항성(비드는 실시예 2의 비드보다 가역적으로 변형 가능하고 끈적인다)	저항성(비드는 실시예 2의 비드보다 가역적으로 변형 가능하고 끈적인다)
제제	FSB4-A	FSB4-B
탄성 계수 G'	0.27 kPa	0.64 kPa
27G 바늘을 통한 사출력	3 N	4 N
배출 후 비드의 무결성	예	예

^*광학 현미경에 의한 크기 측정(배율 4의 3개 이미지)

ND: 측정되지 않음

실시예 1(90%)에서만 CC 비드에 비해 수분 함량(93% 및 97%)이 증가된 CC 및 HA 비드가 수득된다. 이들은 실시예 1의 비드보다 더 변형 가능하고, 더 탄력 있고, 더 끈적인다.

CC 하이드로겔 비드의 특징은 예를 들어 HA를 다양한 비율로 첨가함으로써 폴리머 용액의 조성을 변경함으로써 조절될 수 있다고 결론지었다. 일부 매개변수를 조정하여 동일한 일반 방법을 적용할 수 있다.

실시예 5 - 가변 분자 구조를 갖는 CC 기반 하이드로겔 비드

이 실시예에서, 매개변수를 조정하여 실시예 2에서와 동일한 일반적인 방법에 따라 30% 미만의 DA(표 1의 참조 CC3)를 갖는 아가리쿠스 비스포러스 기원의 CC로부터 하이드로겔 비드를 형성하고자 한다(표 8).

설비에 의해, 실시예 2 내지 3의 스프레이 방식이 아닌 30G 바늘에 고분자 용액을 통과시켜 액적을 형성한다. 따라서, 비드는 실시예 1 내지 3보다 더 큰 직경(약 1mm)을 갖게 된다. 그럼에도 불구하고, 이 방법은 구형도, 매끄러운 표면 및 세척 단계 후 수동 압축에 대한 적절한 저항 측면에서 비드의 순응도를 판단할 수 있다.

표 8 - 30% 미만의 DA를 갖는 CC 하이드로겔 비드의 제조
단계	매개변수
단계 1	폴리머와 BDDE의 용액: 용량: 2mL [NaOH] = 1% [CC3] = 20mg/mL [BDDE] = 폴리머 mg당 1μL(0.0054mmol)	액적 형성: 바늘 30G (1/2, TSK) 사출 속도: 약 1mL/분
	응고 배스: 용량: 100mL [CaCl2] = 50mg/mL 물/에탄올 = 80/20 v/v	온도: 실온 교반: 30분
단계 2	가교	온도 및 시간 : 실온에서 30분
단계 3	현탁액 중화: [HCl] = 1N 세탁: 물 진공 여과 분수 수집 >30μm	분리: 여과막 30μm 횟수: 완충액의 최대 pH 및 삼투질농도
단계 4	물 속 비드의 현탁액

완충 용액에서 세척 및 현탁 단계에 저항한 비드가 실제로 얻어진다. 이들의 특징은 표 9에 보고되어 있다.

표 9 - 30% 미만의 DA를 갖는 CC 하이드로겔 비드의 특징
참조	SB5
CC(mol%)의 DA 및 DS	27%로 추정된 DA; 131%로 추정된 DS
육안 검사	ND (육안 관찰은 비드가 균질한 것을 확인시킨다)
구형도	ND (육안 관찰은 비드가 둥글다는 것을 확인시킨다)
거칠기	매끄러움(육안 관찰)
압축 강도	저항성

ND: 측정되지 않음

30% 미만의 DA를 갖는 카복시메틸 키토산으로부터 구형이고 매끄럽고 수동 압축에 내성이 있는 비드가 일반적인 방법에 따라 형성될 수 있다고 결론지었다.

실시예 6 - 쥐에서 피부 조직의 볼륨화를 위한 CC 하이드로겔 비드

이 실시예에서, CC 하이드로겔 비드의 국소 내성 및 볼륨화 용량은 3개월 동안 쥐의 하피(피하)에 주사한 후 평가된다. 주사 준비가 된 실시예 3의 CC 하이드로겔 비드를 기반으로 하는 두 가지 제제: FSB2-A(90μm 부피의 평균 직경) 및 FSB2-B(200μm 부피의 평균 직경)가 사용된다.

비교로서, 미용 목적의 피부 볼륨화를 목적으로 하는 두 가지 상업용 주사가능한 제품이 동시에 연구되었다. 카복시메틸 셀룰로오스 겔에서 폴리카프로락톤의 고체 및 비수화 미소구체 기반 Ellanse-M(Sinclair Pharma); 히알루론산의 하이드로겔이 가교되어 비구형 입자 형태로 압출된 Restylane® LYFT(Galderma).

이 실시예에서 일반적인 용어 ≪입자≫는 CC 하이드로겔 비드, 폴리카프로락톤의 고체 미소구체 및 압출된 가교 히알루론산 입자의 입자를 동시에 나타내기 위해 사용된다.

프로토콜. 위스타 암컷 쥐 각각에 바늘 크기 27G를 사용하여 각 제품의 200μL(동물당 총 4개의 주사 부위, 왼쪽 옆구리에 2개, 오른쪽 옆구리에 2개)을 피하 주사한다. 3개월의 기간에 걸쳐 정기적으로, 테스트한 제품으로 인한 반응 또는 피부 자극(홍반, 부종)의 징후가 평가되고 점수가 할당된다. 매번 수준에 생성된 완화의 치수는 각 이식 부위의 피부 조직인 경우 측정되고 부피가 추론된다(높이 x 너비 x 길이, mm³ 단위). 각 제품 및 각 시간에 대해, 6개 이식 부위의 평균 부피를 계산한다. 표 10은 연구의 단기, 중기 및 장기를 대표하는 시점의 평균 볼륨을 나타낸다.

국소 내성 평가. 홍반과 부종의 점수는 테스트한 4개의 제품에 대해 첫 주 내내 0이다. 3개월 관찰 기간 동안 0으로 유지된다. 따라서 테스트한 4개 제품 중 어느 것에도 피부 자극 반응의 임상 징후가 관찰되지 않았으며 내성이 우수한 것으로 간주된다.

볼륨화 효과 평가. CC 하이드로겔 비드를 기반으로 하는 두 제품을 주입하면 즉각적인 피부 완화가 나타나며, 첫날 동안 부피가 약간 증가한다. 부피는 7일째부터 안정화되어 약 3개월(85일째)의 추적관찰 기간 동안 거의 안정적인 수준을 유지한다. 따라서 이러한 제품은 피부 볼륨화 효과에 대해 예상대로 작용한다. 두 제품 사이에 부피의 차이는 발견되지 않는다.

Ellanse-M 상용 제품의 볼륨화 효과는 처음 2주 동안 많은 부피 완화를 특징으로 하며, 이후 연구 종료 시까지 CC 하이드로겔 비드를 가진 두 기본 제품과 동일한 수준으로 안정화된다.

Restylane® LYFT 상용 제품에 의해 생성된 완화의 평균 부피는 처음 2주 동안 다른 제품과 동일한 크기이다. 그리고 14일째부터 연구 종료(85일째)까지 점진적인 감소로 인해 내내 현저히 낮다.

표 10 - 쥐에서 입자를 기반으로 한 제품의 피하 주사로 생성된 완화 부피(시간당 평균 6 및 표준 편차, mm3)
참조	2일	7일	14일	29일	57일	85일
FSB2-A	1340 ± 374	1657 ± 132	1571 ± 322	1740 ± 468	1559 ± 416	1770 ± 537
FSB2-B	1265 ± 125	1701 ± 138	1717 ± 191	1809 ± 418	1753 ± 346	1679 ± 382
Ellanse-M	1394 ± 218	1794 ± 404	1980 ± 327	1742 ± 345	1573 ± 210	1624 ± 155
Restylane® LYFT	926 ± 212	1437 ± 138	1723 ± 255	1508 ± 255	1205 ± 81	1103 ± 192

이 예에서는 평균 직경이 90μm 및 200μm인 CC 하이드로겔 비드를 기반으로 하는 두 제품이 피하 주입이 용이하고 내약성이 우수하여 미용 목적을 위한 피부 볼륨화의 적응증에 대해 예상된 대로, 연구 3개월 동안 임상적으로 가시적인 자극이나 염증 반응을 일으키지 않는다는 결론을 내렸다. 이들의 피하 주사는 추구하는 바에 따라 일정하고 확장된 국소적인 방식으로 피부 조직의 완화를 가능하게 한다.

동등한 주입량으로, 생성된 완화는 시간이 지남에 따라 안정적인 부피 완화를 가지며 Ellanse-M 제품에서 생성된 것과 유사한 수준이다. 시간이 지남에 따라 점차 감소하는 Restylane® LYFT 제품에 의해 생성된 것보다 높다. 따라서 CC 하이드로겔 비드는 조직, 특히 피부 볼륨화 제품으로서의 안전성과 유효성을 확인한다.

실시예 7 - 쥐에 CC 하이드로겔 비드 주사 후 국소 반응 평가: 1개월 및 3개월에 조직병리학적 분석

이 실시예에서, 주사 후 1개월과 3개월 시점에서 실시예 6의 연구의 주사 부위 수준에 대한 피부 조직의 조직병리학적 분석에 따라 2개의 제제 FSB2-A 및 B의 염증 및 이물질을 포함하는 국소 반응을 특징으로 한다. 두 참조 상용 제품의 주사 부위의 조직은 동일하게 작동된다.

유리판에 장착되고 헤마톡실린으로 착색된 조직 섹션을 현미경으로 관찰하여, ISO 10993 표준 - Part 6(2016)에 기술된 반정량적 평가 시스템에 따라 국소 반응의 다양한 양태를 평가한다. 각 매개변수에 대해 각 부위에 응답 점수를 부여한 다음 모든 부위에 대한 평균 점수를 계산한다. 표 11은 1개월과 3개월의 2회에 걸쳐 얻은 결과를 나타낸다.

표 11 - 쥐의 피하 주사 후 국소 반응의 반정량적 평가(ISO 10993-6에 따른 점수, N = 제품/시간당 6개 부위)
	FSB2-A 30-100μm	FSB2-B 100-200μm	Ellanse-M	Restylane® LYFT
1개월
세포
- 다형핵	0	0	0	0
- 림프구	0.4 ± 0.5	0	0.7 ± 0.5	0
- 형질 세포	0	0	0	0
- 대식 세포	1 ± 0	1 ± 0	2.8 ± 0.4	1 ± 0
- 거대 세포	1 ± 0	1 ± 0	1.8 ± 0.4	0
괴사	0	0	0.3 ± 0.8	0
섬유증	1 ± 0	1 ± 0	2.0 ± 0.0	1
혈관신생	1 ± 0	1 ± 0	1 ± 0	1
캡슐화	0	0	0.3 ± 0.8	1.2 ± 0.4
이식된 재료에서 세포/섬유의 침범	콜라겐 섬유	콜라겐 섬유	없음	없음
3개월
세포
- 다형핵	0	0.2 ± 0.4	0	0
- 림프구	0.2 ± 0.4	0	0.7 ± 0.5	0
- 형질 세포	0	0	0	0
- 대식 세포	1.0 ± 0.0	1.0 ± 0.0	2.2 ± 0.4	1.0 ± 0.0
- 거대 세포	0.3 ± 0.5	0.5 ± 0.0	1.2 ± 0.4	0
괴사	0	0	0	0
섬유증	1	1.0 ± 0.0	1.8 ± 0.4	1.0 ± 0.0
혈관신생	1	1.0 ± 0.0	1.0 ± 0.0	1.0 ± 0.0
캡슐화	0	0	0	1.0 ± 0.0
이식된 재료에서 세포/섬유의 침범	콜라겐 섬유	콜라겐 섬유	없음	없음

점수: 0 = 응답 없음; 1 = 낮음; 2 = 중간; 3 = 현저

1개월에, 국소 반응은 하이드로겔 입자 기반 제품(CC 비드 및 Restylane® LYFT)에 대해 적절한 방식으로 발생하며, 모든 매개변수에 대해 ≪없음 내지 낮음≫ 점수의 응답이 나타난다. 3개월에, 세포 반응은 증가하거나 감소하지 않았으며 CC 하이드로겔 비드(그러나 Restylane 입자는 없음) 내의 조직 침습이 관찰되었다. Ellanse-M 제품의 경우, 1개월째에 더 높은 세포 반응이 관찰되며, 대식세포의 경우 ≪중간 내지 현저한≫ 점수 및 림프구 및 거대 세포에 대해 다른 제품보다 높은 점수를 가진다. 부위 중 하나에서 괴사의 존재가 관찰된다. 반응은 림프구, 대식세포(≪중간 내지 현저한≫ 점수) 및 거대 세포의 지속성을 특징으로 하는 재발성 염증 반응의 결과로 3개월 후에도 여전히 중요하며, 다른 제품보다 항상 높은 점수를 받는다.

본 실시예로부터 본 발명에 따른 CC 하이드로겔 비드를 기반으로 하는 두 제품이 피하 주사 후 1개월 및 3개월에 적절한 국소 반응을 일으킨다는 결론을 내렸다. 세포 또는 섬유 조직에 의한 비드의 캡슐화는 전혀 또는 거의 관찰되지 않고, 본 발명에서 추구하는 바와 같이, 오히려 물질에 콜라겐 섬유의 존재, 양호한 생체 통합의 징후 및 장기간의 육아종의 최소 위험이 관찰된다.

실시예 8 - CC 하이드로겔 비드에 아스코르브산 혼입

이 실시예에서 모델 분자(여기서는 수용성)인 아스코르브산은 미리 형성된 CC 하이드로겔 비드에 혼입되어 활성 성분, 영양소 등과 같은 물질의 탱크 역할을 하는 능력을 보여준다. 수화된 형태로 미리 수집된 실시예 2의 비드 참조 SB2-C(평균 부피 직경 373㎛)가 사용된다. 비드를 염수 완충액에 50mg/ml 농도의 아스코르브산 용액에 현탁시킨 다음 실온에서 12시간 동안 약간의 교반을 적용한다. 그런 다음, 비드를 막 상에서 진공하에서 여과하여 용액으로부터 분리하고, 7일 동안 생리 인산염 완충액 속 현탁액에 두었다. 비드의 일부는 완충액으로 세척하여 헹구고 동결 건조하여 탈수한 후 FTIR에 의해 특징화한다.

아스코르브산이 없는 동일한 완충액 속 현탁액에 놓인 SB2-C 비드에 동일한 방법을 적용하고 FTIR 스펙트럼을 기록한다. 아스코르브산 용액 속 현탁액에 놓인 비드의 FTIR 스펙트럼은 완충액 단독 속 현탁액에 놓인 비드의 스펙트럼과 관련하여 862cm^-1 및 530cm^-1에서 두 개의 추가 밴드를 가지며, 이는 CC 비드에서 아스코르브산의 존재를 확인시키다.

이 실시예에서 CC 하이드로겔 비드는 아스코르브산의 간단한 확산 과정을 통해 미리 형성된 비드에 혼입함으로써 아스코르브산과 같은 수용성 분자의 탱크 역할을 할 수 있다고 결론지었다. 인산염 완충액 및 세척 후 7일 후에도 아스코르브산이 여전히 존재한다는 사실은 혼입이 실제로 표면뿐만 아니라 비드의 중심부에서 발생한다는 것을 확인시킨다.

실시예 9 - 하이드로겔 비드로의 트라이암시놀론 헥사세토나이드의 캡슐화

코르티코스테로이드 유형의 항염증제인 트라이암시놀론의 국소적이고 점진적인 전달의 관점에서, 이를 하이드로겔 비드에 캡슐화하는 것이 추구된다. 조직이나 장기에 비드를 이식하거나 주입할 수 있어야 한다.

캡슐화 공정은 트리암시놀론을 변경하지 않고 캡슐화할 수 있다. 비드는 적어도 80% 수분을 함유하고 구형이며 압축에 강하다. 비수용성이므로, 트라이암시놀론은 비드의 하이드로겔에 분산된다. 트라이암시놀론 분말은 육안으로 볼 수 있고 매끄러운 표면으로 허용 가능한 1μm 내지 10μm에 포함된 직경의 입자로 존재하며 비드의 투명도는 국소 전달 응용분야에 필요하지 않다.

트라이암시놀론은 첫 번째 비드 준비 단계에서 폴리머(들)의 초기 용액(표 1 및 2의 CC1 및 HA1 참조)과 함께 현탁된다. 그런 다음, 폴리머(들), 트라이암시놀론 및 가교제(BDDE)를 포함하는 용액의 시작에서, 실시예 2 및 4의 일반적인 방법에 따라 비드를 형성한다. 비드는 크기에 따라 분류하지 않고 수집된다. 비드는 이전 실시예에 기술된 방법에 따라 특징화한다(표 12).

비드의 트라이암시놀론 함량은 다음 방법을 사용하여 평가한다: 일정량의 비드를 원심분리 튜브에 도입하고 에탄올/물 용액(30:20, v/v)의 현탁액에 넣어 비드 외부로 트라이암시놀론의 용해 및 확산을 확인한다. 24시간 후, 현탁액을 2,500rpm에서 10분 동안 원심분리한다. 그런 다음 상등액의 흡광도는 분광 광도계(Multiskan Sky High, Thermo Scientific)를 사용하여 242nm에서 측정한다. 검량선은 0 내지 0.5mg/mL의 트라이암시놀론 용액과 동일한 조건에서 생성한다. 트라이암시놀론 함량은 습한 비드의 질량당 트라이암시놀론의 질량으로 표시된다(표 12).

표 12 - 하이드로겔 및 트리암시놀론 비드의 특징
참조	SB8-1	SB8-2	SB8-3
폴리머(참조) CC/HA 비율(m/m)	CC1(100%)	CC1 / HA1 (50:50)	CC1 / HA1 (75:25)
습식 비드의 평균 직경(μm)	305μm	443μm	207μm
수분 함량 % (m/m)	91%	94%	91%
트라이암시놀론 함량(mg/g 습식 비드)	15 mg	7 mg	15 mg
육안 검사	비드의 하이드로겔에 분산된 트라이암시놀론 입자가 보인다
구형도(광학 현미경을 통해)	OK	OK	OK
표면 거칠기	약간 거침	약간 거침	약간 거침
압축 강도	예	예	예

따라서, 비드의 CC 및 HA 조성물에 따라 6 내지 15mg의 상당한 양의 트라이암시놀론을 캡슐화하는 것이 성공적으로 수행되었다. FTIR에 의해 트라이암시놀론의 구조가 변경되지 않은 것으로 확인되었다. 다음 2가지 관찰 결과가 보고되었다: 트라이암시놀론은 비드의 하이드로겔 내에 분산된 입자 형태로 혼입되어 비드를 불투명하게 만든다. 또한 이러한 입자의 존재 때문에 비드가 매끄럽지 않고 약간 거칠다는 점에 유의해야 한다. 이 두 가지 관찰은 트라이암시놀론의 용해도 프로파일과 일치한다. 또한, 비드는 수분 함량, 구형도 및 압축 저항성 면에서 본 발명에 부합한다.

실시예 10 - 멸균된 하이드로겔 비드로부터 트라이암시놀론의 캡슐화

멸균 제제를 실시예 9의 3가지 유형의 하이드로겔 및 트라이암시놀론 비드를 사용하여 제조하였다. 이를 위해, 비드를 실시예 3과 동일한 일반적인 방법에 따라 히알루로난 용액(표 2의 참조 HA2)에 현탁시켰다. 제제를 3mL 주사기(Hypak, BD)에 포장하고 오토클레이브에 의해 멸균한다.

그런 다음 교반하여 기계적 응력을 가하여 비드에서 트라이암시놀론이 방출될 수 있는지 확인할 수 있다. 이 평가는 멸균 현탁액에서 분리되고 헹궈진 비드에 대해 수행된다. 최대 27일까지 연구할 때마다, 원심분리 튜브를 예약하고 1g 습식 비드, 8mL의 PBS 및 4.5mm 직경의 3개의 스테인리스 강 비드를 배치한다. 튜브를 실온에서 궤도 교반(190rpm)하여, 이는 예를 들어 무릎과 같은 관절의 움직임을 모방하는 움직임을 통해 기계적 성능 저하를 유발한다.

각 시간에 상청액에서 방출된 트라이암시놀론 농도를 평가하기 위해 비드를 5분 동안 600rpm에서 원심분리하여 침전시킨다. 0.4mL 상층액을 수집하고 0.6mL 에탄올을 첨가한다. 그런 다음 분광 광도계(Multiskan Sky High, Thermo Scientific)를 사용하여 242nm 파장에서 용액의 흡광도를 측정한다. 교정 곡선은 트라이암시놀론 전용 용액을 사용하여 동일한 작동 조건에서 병렬로 생성된다. 그런 다음 상층액의 트라이암시놀론 농도를 각 시간(각 튜브)에 대해 계산한다. 마지막으로, 습식 비드 g당 mg으로 표시되는 방출된 트라이암시놀론의 총량을 계산한다(표 13).

표 13 - 비드에서 트라이암시놀론의 방출 역학
지속기간	SB8-1	SB8-2	SB8-3
(일)	방출된 트라이암시놀론의 질량(습식 비드 g당 mg, 총)
0	0.0	0.0	0.0
0.5	0.1	0.0	0.0
1	0.2	0.1	0.1
2	2.3	2.5	0.1
4	4.4	2.4	1.0
7	5.6	4.4	1.8
10	9.4	4.6	3.3
11	9.9	4.9	3.8
17	10.5	5.4	9.0
22	11.2	5.6	12.4
27	12.0	5.9	15.0

트라이암시놀론은 실제로 비드에서 상층액에서 일정 시간이 지나면서 점차적으로 연구 전반에 걸쳐 방출된다. 이 테스트의 조건에서, 방출은 SB8-1 및 SB8-2 비드의 두 번째 날에 시작된다. SB8-3 비드의 경우, 7일째부터 시작된다. 초기 트라이암시놀론 함량의 대부분은 3가지 유형의 비드에 대한 테스트 마지막 날에 방출되며, 이는 비드가 기계적 스트레스를 받을 때 수성 매질에서 방출이 차단되지 않음을 나타낸다.

트라이암시놀론은 기계적 스트레스 하에서 설정된 CC 또는 CC/HA의 하이드로겔 비드에서 점차적으로 방출될 수 있다고 결론지었다. 또한, 비드의 폴리머 조성물을 변경하여, 방출 및 방출 역학을 유발하는 시간을 조정할 수 있다. 비드의 폴리머 조성물은 사용된 활성제의 방출 프로파일과 표적 적응증에 따라 조정될 수 있다.

Claims (25)

1. 글루코사민 단위, N-아세틸-글루코사민 단위 및 카복시알킬기로 치환된 글루코사민 단위를 갖는 적어도 하나의 카복시알킬 키토산을 포함하는 하이드로겔 매트릭스를 포함하거나 이로 이루어진 복수의 비드를 포함하는 수성상을 포함하는 조성물로서, 카복시알킬 키토산은 카복시알킬 키토산 사슬 사이의 공유 결합에 의해 가교되고/되거나 하나 이상의 다른 폴리머와 공유 결합에 의해 공동 가교되는 것인 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,
   수성상은 하나 이상의 폴리머를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   비드에서 상기 카복시알킬 키토산은 다른 폴리머와 공동 가교되는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
   수성상 및/또는 비드는 생리학적 매질과 균형을 이루는 pH 및 삼투질농도를 갖는 하이드로겔 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   수성상 및/또는 비드는 인간 또는 동물의 주사에 특이적인 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 글루코사민 단위, N-아세틸-글루코사민 단위 및 카복시알킬기로 치환된 글루코사민 단위를 갖는 적어도 하나의 카복시알킬 키토산을 포함하는 하이드로겔 매트릭스를 포함하거나 이로 이루어진 인간 또는 동물에 주사가능한 비드로서, 상기 카복시알킬 키토산은 총 글루코사민 단위의 몰수에 대한 N-아세틸기의 몰수로 표현되는 30% 초과 및 80% 이하의 아세틸화도를 가지며, 상기 카복시알킬 키토산은 카복시알킬 키토산 사슬 사이의 공유 결합에 의해 가교되고/되거나 하나 이상의 다른 폴리머와 공유 결합에 의해 공동 가교되는 것인 비드.
7. 제 6 항에 있어서,
   상기 카복시알킬 키토산은 총 단위의 몰 수에 대한 치환기의 몰수로 표현된 20% 초과, 예를 들어 50% 초과, 예를 들어 200% 미만의 카복시알킬기에 의한 치환도를 갖는 것을 특징으로 하는 비드.
8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
   매트릭스는 공유 결합에 의해 자체적으로 가교되거나 카복시알킬 키토산과 공유 결합에 의해 가교될 수 있는 적어도 하나의 폴리머, 예를 들어 적어도 하나의 히알루로난을 포함하는 것을 특징으로 하는 비드.
9. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
   가교는 상기 공유 결합을 형성하는 가교제에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 비드.
10. 제 9 항에 있어서,
    가교제는 생체폴리머, 특히 다당류를 가교하는 데 사용된 가교제, 예를 들어 1,4 부테인다이올 다이글리시딜 에터, 1-브로모-3,4-에폭시부테인, 1-브로모-4,5-에폭시펜테인, 1-클로로-2,3-에피티오프로페인, 1-브로모-2,3-에피티오프로페인, 1-브로모-3,4-에피티오부테인, 1-브로모-4,5-에피티오펜테인, 2,3-다이브로모프로판올, 2,4-다이브로모부탄올, 2,5-다이브로모펜탄올, 2,3-다이브로모프로페인티올, 2,4-다이브로모부테인티올, 및 2,5-다이브로모펜테인티올 에피클로로하이드린, 2,3-다이브로모프로판올, 1-클로로-2,3-에피티오프로페인, 다이메틸아미노프로필카보다이이미드, 갈산, 에피갈로카테킨 갈레이트, 커큐민, 탄닌산, 게니핀, 또는 다이이소시아네이트 화합물, 예를 들어 헥사메틸렌 다이아이소시아네이트 또는 톨루엔 다이아이소시아네이트 또는 다이바이닐 설폰으로부터 선택된 것과 같은 하나 이상의 가교제로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 비드.
11. 제 6 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따라 정의된 복수의 비드를 포함하는 인간 또는 동물에게 투여 가능한 조성물.
12. 제 1 항 내지 제 5 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 또는 동물에 주사가능한 현탁액, 점적용으로 준비된 또는 이식가능한 것으로 제제화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
13. 제 1 항 내지 제 5 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    약학적 조성물 또는 치료적 치료 방법에 사용하기 위한 조성물로 제제화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
14. 제 13 항에 있어서,
    비드는 하나 이상의 활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
15. 제 11 항 내지 제 14 중 어느 한 항에 있어서,
    주사가능, 이식가능 또는 점적용으로 준비된 또는 국소 전달을 위한 약학적 조성물, 또는 주사가능, 이식가능 또는 점적용으로 준비된, 또는 국소 전달을 위한 의료 기기로서 사용하기 위한, 예를 들어, 회복 또는 충전이 필요한 적어도 하나의 신체 조직을 회복 또는 충전하기 위해, 상기 조성물의 점적 또는 국소 투여 또는 피하, 피내, 점막, 안구, 안내, 또는 관절내 경로에 의한 주사를 포함하는 치료적 치료 방법에 사용하기 위한 조성물.
16. 제 15 항에 있어서,
    회복 또는 충전을 필요로 하는 적어도 하나의 신체 액체 또는 조직, 및 예를 들어 성대, 근육, 인대, 힘줄, 점막, 성기, 뼈, 관절, 눈, 진피 또는 조합 중 어느 하나, 보다 구체적으로 진피, 연골, 활막, 피부 상처 또는 안구 표면에 속하는 조직으로부터 선택되는 신체 조직의 치료, 회복 또는 충전 방법에 사용하기 위한 조성물.
17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
    생물학적 유체, 예를 들어 활액 내로의 주사에 의해, 또는 생물학적 유체, 예를 들어 혈액과 혼합 후 관절증의 치료 방법, 또는 연골 결핍의 회복 및 및 연골 이식에 사용하기 위한 조성물.
18. 제 11 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조성물을 포함하거나 이로 이루어지는 것을 특징으로 하는 의료 장치, 예를 들어 의료용 임플란트.
19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 정의된 복수의 비드를 제조하는 방법으로서,
    적어도 하나의 다른 폴리머의 존재하에서 또는 부존재하에서 및 바람직하게는 알칼리성 pH에서 제조된 적어도 하나의 가교제의 존재하에서 카복시알킬 키토산의 수용액을 제조하는 단계;
    이 용액의 액적을 복수의 비드 형태로 형성하는 단계;
    가교제에 의해 카복시알킬 키토산, 및 가능하게는 존재하는 경우 적어도 다른 폴리머를 가교결합시키는 단계; 및
    제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 정의된 복수의 비드를 얻는 단계를 포함하는 복수의 비드를 제조하는 방법.
20. 제 19 항에 있어서,
    액적은 유기 용매, 예를 들어 알코올, 예를 들어 에탄올을 포함할 수 있는 수성상의 존재하에 놓이는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서,
    액적을 가교시키기 전에 복수의 비드 형태로 적어도 하나의 응고제의 존재 하에서 액적을 응고시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    가교 후에 수득된 복수의 비드는 생리학적으로 허용 가능한 매질에서 세척 및 pH 및 삼투질농도의 균형을 유지함으로써 정제 단계를 거치는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    복수의 비드는 그 치수에 따라 비드를 선택하도록 분류되는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제 19 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    복수의 비드는 가능하게는 하나 이상의 폴리머, 예를 들어 카복시알킬 키토산, 히알루로난 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 수성상, 친유성상, 친수지질상, 또는 다른 고체상과 회합되는 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제 24 항에 있어서,
    상은 인간 또는 동물 신체의 주사에 특이적인 것을 특징으로 하는 방법.