KR102554775B1 - 히알루로니다제의 안정화제 및 이를 포함하는 히알루로니다제 제형 - Google Patents

히알루로니다제의 안정화제 및 이를 포함하는 히알루로니다제 제형 Download PDF

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Abstract

본 발명은 히알루로니다제의 안정화제 및 이를 포함하는 히알루로니다제 제형에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명에서는 히알루로니다제를 액상 제형으로 제조 시 장기간 효소 활성을 안정하게 유지할 수 있는 안정화제를 최적화하였고, 상기 최적화한 히알루로니다제 안정화제 및 고순도의 히알루로니다제를 포함하는 액상 제형에서 히알루로니다제의 안정성이 우수함을 확인하였으므로, 본 발명에 따른 히알루로니다제의 안정화제 및 이를 포함하는 히알루로니다제 액상 제형은 임상에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

히알루로니다제의 안정화제 및 이를 포함하는 히알루로니다제 제형{Hyaluronidase formulation and which contains stabilizer for hyaluronidase}
본 발명은 히알루로니다제의 안정화제 및 이를 포함하는 히알루로니다제 제형에 관한 것으로, 보다 상세하게는 장시간 동안 히알루로니다제의 효소 활성을 안정적으로 유지시키는 히알루로니다제의 안정화제 및 이를 포함하는 안정성이 우수한 히알루로니다제 액상 제형에 관한 것이다.
히알루로니다제(hyaluronidase, HAdase)는 히알루론산(hyaluronic acid, HA)을 저분자화하는 효소의 총칭이다. 히알루로니다제는 히알루론산을 가수분해하는 기작에 따라 포유류 형 히알루로니다제(Mammalian type, EC 3.2.1.35, hyaluronoglucosaminidase), 거머리 형 히알루로니다제(Leeches type, EC 3.2.1.36, hyaluronoglucuronidase) 및 박테리아 형 히알루로니다제 (Bacterial type, EC 4.2.2.1, hyaluronate lyase)로 구분된다.
포유류 형 히알루로니다제는 인체 내의 고환, 피부, 간, 태반 체액 등에 존재하여 히알루론산의 구성성분인 글루쿠론산과 글루코사민 사이의 β-1, 4 배당체 결합을 가수분해하여 사당류(tetrasaccharide)를 생성하거나, 우리 몸의 관절에 있는 활액 및 연골의 성분인 콘드로이틴, 콘드로이틴-4-황산, 콘드로이틴-6-황산을 가수분해하는 특징이 있다. 특히, 고환에서의 히알루로니다아제(PH-20)는 정자의 첨체 부분의 글리코실포스파티딜이노시톨 고정부위(Glycosylphosphatidylinositol, GPI anchor)에 부착되어 있어, 난자 외부의 두꺼운 외벽층을 분해하여 수정을 일으키는 중요한 효소이다.
히알루로니다제는 정형외과, 안과, 성형외과, 치과, 구강외과, 부인과 및 이비인후과의 수술에서 국소 마취제 및 스테로이드의 확산을 증가시키기 위하여 침윤 및 차단 마취에 사용되고, 혈종과 같이 체액이 모인 것을 분산, 복막 유착의 방지, 결석 생성 방지 및 불임의 치료 등에도 사용되고 있다.
현재 시판되고 있는 히알루로니다아제는 양(ovine)의 고환에서 추출한 후 동결건조하여 원료로 사용하고 있다. 이러한 가공되지 않은 히알루로니다아제를 적정농도로 녹여 바이알에 충전하여 동결건조하는 방법으로 제품화하고 있다. 따라서, 제품화된 동결건조 히알루로니다아제는 불순물이 다량 포함되어 있고 순도가 낮으며 액상 제형으로 제조할 때 안정성이 좋지 않다. 또한, 동결건조 제형은 사용하기 전에 액체 형태로 준비해야 하며 이에 임상 사용 시 불편하고 의료 비용이 증가하는 문제점이 있다.
한편, 본 발명자들은 특허 출원번호 제10-2022-0143706호에서 경제적이고 간단하면서도 불순물이 제거된 고순도의 히알루로니다제를 정제할 수 있는 방법을 개발하였고, 이를 통해 경제적이고 효율적으로 고순도의 히알루로니다제를 수득할 수 있음을 확인하였다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 임상적 사용이 용이하고 안정성이 우수한 히알루로니다제 액상 제형을 개발하기 위해 노력한 결과, 히알루로니다제를 액상 제형으로 제조 시 장기간 효소 활성을 안정하게 유지할 수 있는 안정화제 조성을 최적화하였다. 또한, 상기 최적 조성의 안정화제를 이용하여 고순도의 히알루로니다제를 포함하는 액상 제형을 제조하였고, 상기 액상 제형 내 히알루로니다제의 안정성이 우수함을 확인하였다. 이에 본 발명에 따른 히알루로니다제의 안정화제는 안정성이 우수한 히알루로니다제 액상 제형의 제조에 유용하게 이용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 출원에 이르게 되었다.
대한민국 등록특허 제10-1454646호 대한민국 공개특허 제10-2019-0078572호
Guo X, Shi Y, Sheng J, Wang F (2014) A Novel Hyaluronidase Produced by Bacillus sp. A50. PLoS ONE 9(4): e94156 S D Gorham, A H Olavesen, K S Dodgson (1974) Effect of Ionic Strength and pH on the Properties of Purified Bovine Testicular Hyaluronidase. Connect Tissue Res. 1975;3(1):17-25
종래 히알루로니다제(hyaluronidase)는 동결건조 제형으로 불순물이 많고, 임상 사용을 위해 액상 제형으로 제조해야 하는 불편함이 있으며, 액상 제형으로 제조하는 경우 안정성이 저하되어 생리활성이 감소하는 문제점이 있다.
이에 본 발명의 목적은 히알루로니다제 액상 제형으로 장기간 보관 시에도 히알루로니다제의 효소 활성을 안정적으로 유지시키는 히알루로니다제의 안정화제 및 이를 포함하는 안정성이 우수한 히알루로니다제 액상 제형을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1 내지 20 mM의 히스티딘(histidine) 완충액; 70 내지 250 mM의 NaCl; 0.01 내지 1 % (중량/부피, w/v)의 비이온성 계면활성제; 및 1 내지 100 mM의 아미노산 또는 당을 포함하고, pH가 4.0 내지 7.0인, 히알루로니다제(hyaluronidase)의 안정화제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 히알루로니다제의 안정화제 및 히알루로니다제를 포함하는, 액상 제형을 제공한다.
본 발명에서는 히알루로니다제를 액상 제형으로 제조 시 장기간 효소 활성을 안정하게 유지할 수 있는 안정화제를 최적화하였으므로, 본 발명에 따른 히알루로니다제의 안정화제는 안정성이 향상된 히알루로니다제 제형의 제조에 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 상기 최적화된 안정화제를 이용하여 고순도의 히알루로니다제를 포함하는 액상 제형을 제조하였고, 상기 액상 제형 내 히알루로니다제의 안정성이 우수함을 확인하였으므로, 본 발명에 따른 히알루로니다제 액상 제형은 임상에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 완충액, NaCl 및 pH 조건을 달리한 히알루로니다제의 안정화제를 이용하여 제조한 히알루로니다제 액상 제형의 안정성을 확인한 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 히스티딘(Histidine) 완충액 및 NaCl를 포함하고, NaCl 농도를 달리한 히알루로니다제의 안정화제를 이용하여 히알루로니다제 액상 제형을 제조한 후, 이의 안정성을 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 히스티딘 완충액, NaCl 및 비이온성 계면활성제를 포함하고, 비이온성 계면활성제 농도를 달리한 히알루로니다제의 안정화제를 이용하여 히알루로니다제 액상 제형을 제조한 후, 이의 안정성을 확인한 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 히스티딘 완충액, NaCl, 비이온성 계면활성제 및 아미노산을 포함하고, 아미노산 조건을 달리한 히알루로니다제의 안정화제를 이용하여 히알루로니다제 액상 제형을 제조한 후, 이의 안정성을 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 히스티딘 완충액, NaCl, 비이온성 계면활성제 및 당을 포함하고, 당 조건을 달리한 히알루로니다제의 안정화제를 이용하여 히알루로니다제 액상 제형을 제조한 후, 이의 안정성을 확인한 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 히스티딘 완충액, NaCl, 비이온성 계면활성제를 포함하고, 아미노산을 글리신(Glycine) 또는 당으로 수크로스(Sucrose)를 포함하는 히알루로니다제의 안정화제를 이용하여 히알루로니다제 액상 제형을 제조한 후, 이의 안정성을 확인한 도이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시형태를 들어 상세히 설명한다. 본 발명의 실시형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 장기간 보관 시 히알루로니다제의 효소 활성을 안정적으로 유지시키는 히알루로니다제(hyaluronidase)의 안정화제로서, 히스티딘(histidine) 완충액; NaCl; 비이온성 계면활성제; 및 아미노산 또는 당을 포함하는, 히알루로니다제(hyaluronidase)의 안정화제를 제공한다.
본 발명에서, 상기 히알루로니다제의 안정화제는 pH 4.0 내지 7.0일 수 있고, 구체적으로 pH 4.5 내지 6.5일 수 있으며, 보다 구체적으로 pH 5.0 내지 6.0일 수 있다. 상기 pH는 당해 분야에 공지된 산 또는 염기를 사용한 조정에 의해, 또는 상기 완충액 및 NaCl에 의해, 또는 둘 다에 의해 조정될 수 있다. 본 발명에 따른 히알루로니다제의 안정화제는 상기 pH 범위를 제공하여 히알루로니다제의 효소 활성을 장기간 안정하게 유지할 수 있다.
본 발명에서, 상기 히알루로니다제의 안정화제는 1 내지 20 mM의 히스티딘 완충액을 포함할 수 있고, 구체적으로 5 내지 15 mM의 히스티딘 완충액을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 7 내지 13 mM의 히스티딘 완충액을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 히알루로니다제의 안정화제는 상기 농도 범위의 히스티딘 완충액을 포함하여 히알루로니다제의 효소 활성을 장기간 안정하게 유지할 수 있다.
본 발명에서, 상기 히알루로니다제의 안정화제는 70 내지 250 mM의 NaCl을 포함할 수 있고, 구체적으로 75 내지 225 mM의 NaCl을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 90 내지 200 mM의 NaCl을 포함할 수 있고, 보다 더 구체적으로 130 내지 170 mM의 NaCl을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 히알루로니다제의 안정화제는 상기 농도 범위의 NaCl을 포함하여 히알루로니다제의 효소 활성을 장기간 안정하게 유지할 수 있다.
본 발명에서, 상기 히알루로니다제의 안정화제는 0.01 내지 1 % (중량/부피, w/v)의 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있고, 구체적으로 0.01 내지 0.08% (중량/부피, w/v)의 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 0.02 내지 0.06% (중량/부피, w/v)의 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 또한, 상기 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 20(Polysorbate 20), 폴리소르베이트 80(Polysorbate 80) 또는 트리톤-X-100(Triton-X-100)일 수 있고, 구체적으로 폴리소르베이트 80일 수 있다. 본 발명에 따른 히알루로니다제의 안정화제는 상기 농도 범위의 비이온성 계면활성제를 포함하여 히알루로니다제의 안정성을 보다 향상시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 히알루로니다제의 안정화제는 1 내지 100 mM의 아미노산 또는 당을 포함할 수 있고, 구체적으로 10 내지 90 mM의 아미노산 또는 당을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 30 내지 70 mM의 아미노산 또는 당을 포함할 수 있고, 40 내지 60 mM의 아미노산 또는 당을 포함할 수 있다.
또한, 상기 아미노산은 글리신(Glycine), 메티오닌(Methionine) 또는 프롤린(Proline)일 수 있고, 구체적으로 글리신일 수 있다. 본 발명에 따른 히알루로니다제의 안정화제는 상기 아미노산, 구체적으로 글리신을 포함하여 히알루로니다제의 안정성을 보다 향상시킬 수 있다.
또한, 상기 당은 수크로스(Sucrose), 만니톨(Mannitol) 또는 트레할로스(Trehalose)일 수 있고, 구체적으로 수크로스일 수 있다. 본 발명에 따른 히알루로니다제의 안정화제는 상기 당, 구체적으로 수크로스를 포함하여 히알루로니다제의 안정성을 보다 향상시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 히알루로니다제의 안정화제는 2 내지 30℃ 온도조건에서 히알루로니다제의 활성을 최초 효소활성 100 기준 대비 90% 이상 유지시킬 수 있고, 구체적으로 2 내지 30℃ 온도조건에서 히알루로니다제의 활성을 최초 효소활성 100 기준 대비 90% 이상으로 6개월 이상 유지시킬 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 히알루로니다제 액상 제형으로 제조 시 히알루로니다제의 효소 활성을 안정하게 유지할 수 있는 안정화제로서 완충액, NaCl 및 pH 조건을 확인한 결과, 히알루로니다제의 안정화제로 pH는 5.0 ~ 6.0으로 하고, 완충액으로 히스티딘 완충액을 포함하며, NaCl을 포함하는 경우 4℃ 및 25℃ 보관 조건에서 장기간 히알루로니다제의 안정성이 우수하게 나타났다.
또한, 본 발명자들은 히알루로니다제의 안정화제로 히스티딘 완충액 및 NaCl를 포함하는 안정화제에 비이온성 계면활성제를 추가하고 히알루로니다제의 안정성을 확인한 결과, 비이온성 계면활성제를 포함하지 않은 경우에 비해 비이온성 계면활성제를 포함한 경우 4℃ 및 25℃ 보관 조건에서 장기간 히알루로니다제의 안정성이 향상되었다.
또한, 본 발명자들은 히알루로니다제의 안정화제로 히스티딘 완충액, NaCl 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 안정화제에 아미노산으로 글리신, 메티오닌 또는 프롤린을 추가하고 히알루로니다제의 안정성을 확인한 결과, 아미노산으로 글리신을 포함하는 경우 4℃ 및 25℃ 보관 조건에서 장기간 히알루로니다제의 안정성이 가장 우수함을 확인하였다.
아울러, 본 발명자들은 히알루로니다제의 안정화제로 히스티딘 완충액, NaCl 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 안정화제에 당으로 수크로스, 만니톨 또는 트레할로스를 추가하고 히알루로니다제의 안정성을 확인한 결과, 당으로 수크로스를 포함하는 경우 4℃ 및 25℃ 보관 조건에서 장기간 히알루로니다제의 안정성이 가장 우수함을 확인하였다.
따라서, 본 발명자들은 고순도의 히알루로니다제를 액상 제형으로 제조 시 장기간 효소 활성을 안정하게 유지할 수 있는 안정화제를 최적화하였으므로, 본 발명에 따른 히알루로니다제의 안정화제는 안정성이 향상된 히알루로니다제 제형의 제조에 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 안정화제를 포함하는 안정성이 우수한 히알루로니다제 액상 제형으로, 히스티딘(histidine) 완충액; NaCl; 비이온성 계면활성제; 및 아미노산 또는 당을 포함하는 히알루로니다제의 안정화제; 및 히알루로니다제를 포함하는, 액상 제형을 제공한다.
본 발명에서, 상기 히알루로니다제의 안정화제에 대한 내용은 전술한 내용과 동일하므로, 구체적인 설명은 상기 내용을 원용한다.
본 발명에서, 상기 히알루로니다제는 순도 98% 이상, 98.5% 이상, 99% 이상 또는 100%일 수 있다.
또한, 상기 히알루로니다제는 통상 포유류 동물 유래, 예를 들면 사람, 소, 양, 돼지 등의 고환에서 유래된 효소이거나, 포유류 유래 히알루로니다제를 미생물 또는 동물세포 또는 식물세포에 도입하여 발현된 재조합 히알루로니다제일 수 있다. 상기 포유류의 고환에서 유래된 히알루로니다제는 포유류의 고환을 1회 또는 2회 염석처리 후 동결건조하거나, 염석처리 후 발열물질을 제거한 후 동결건조하여 수득할 수 있다. 상기 재조합 히알루로니다제의 생산방법은 통상의 포유류 유전자의 재조합 방법에 따라 미생물 또는 동물세포 또는 식물세포에서 생산하는 방법과 동일하며, 예시적인 방법은 Frost et al., Biochem Biophys Res Commun. 1997 Jul 9;236(1):10-5; Reitinger et al., Protein Expression and Purification, 14 Oct 2007, 57(2):226-233; Kordowicz et al., WO2000/077221 등에 기술되어 있다.
또한, 상기 히알루로니다제는 정제되지 않은 히알루로니다제 또는 정제된 히알루로니다제일 수 있다.
상기 정제된 히알루로니다제는 히알루로니다제-함유 원료를, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환크로마토그래피 및/또는 겔여과법으로 정제할 수 있다. 상기 친화성 크로마토그래피는 블루 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피 또는 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피를 예로 들 수 있고, 상기 이온 교환 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 예로 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 순도 98% 이상, 98.5% 이상, 99% 이상 또는 100%의 히알루로니다제는 히알루로니다제-함유 원료를 순차적으로 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피로 1차 정제하고, 양이온 교환 크로마토그래피로 2차 정제하여 수득할 수 있다.
상기 1차 정제의 친화성 크로마토그래피의 컬럼 완충액으로는 인산나트륨(Na2HPO4) 완충액을 사용할 수 있고, 구체적으로 1 내지 50 mM의 인산나트륨을 포함하고, pH 4.0 내지 8.0을 갖는 평형화 완충액을 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로 10 내지 50 mM의 인산나트륨을 포함하고 pH 5.0 내지 7.0을 갖는 완충액을 사용할 수 있다. 또한, 상기 완충액을 이용해 시료주입, 평형, 세척 및 용출 중 어느 하나 이상을 추가로 수행할 수 있고, 상기 완충액을 이용해 1차 정제 이전에 컬럼을 평형화(equilibration)할 수 있다.
상기 2차 정제의 양이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기는 메틸설포네이트(S), 설포프로필(SP), 카르복시메틸(CM), 폴리아스파르트산(Poly aspartic acid), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 또는 설포네이트(S)일 수 있다. 또한, 상기 양이온 교환 크로마토그래피에 사용할 수 있는 컬럼은 캡토 설포프로필(Capto SP), 모노메틸설포네이트(Mono S), 설포프로필 세파로스(SP sepharose), 설포프로필 하이 퍼포먼스(SP HP; SP High performance) 또는 카르복시메틸 세파로스(CM sepharose)일 수 있고, 구체적으로 설포프로필 세파로스(SP sepharose)일 수 있으나, 목적하는 히알루로니다제를 분리할 수 있는 것이면 제한되지 않는다.
또한, 상기 양이온 교환 크로마토그래피의 컬럼 완충액으로는 시트르산삼나트륨(Na3C6H5O7) 또는 인산나트륨(Na2HPO4) 완충액을 사용할 수 있고, 구체적으로 1 내지 50 mM의 시트르산삼나트륨 또는 인산나트륨을 포함하고 pH 4.0 내지 8.0을 갖는 완충액을 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로 10 내지 50 mM의 시트르산삼나트륨 또는 인산나트륨을 포함하고 pH 5.0 내지 7.0을 갖는 완충액을 사용할 수 있고, 보다 더 구체적으로 10 내지 50 mM의 시트르산삼나트륨 또는 인산나트륨을 포함하고 pH 5.0을 갖는 완충액을 사용할 수 있다. 또한, 상기 완충액을 이용해 시료주입, 평형, 세척 및 용출 중 어느 하나 이상을 추가로 수행할 수 있고, 상기 완충액을 이용해 2차 정제 이전에 컬럼을 평형화할 수 있다.
상기 1차 정제 및 2차 정제는 농도구배(concentration gradient)를 이용할 수 있다. 예를 들어 단계식 염 구배(stepwise salt gradient) 또는 연속식 염 구배 (continuous salt gradient)로 히알루로니다제를 용출시킬 수 있다.
상기 1차 정제 및 2차 정제는 1회 수행하고, 추가로 동일하거나 다른 크로마토그래피를 수행하지 않는 것일 수 있다.
상기 1차 정제 및 2차 정제는 이후에 농축 및 투석 공정, 여과(filtration) 공정 중 어느 하나의 공정을 추가로 실시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 여과 공정은 종래의 공지된 미세여과, 한외여과, 정밀여과, 심층여과 등의 공정으로 진행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 액상 제형은 본 발명에 따른 히알루로니다제의 안정화제를 포함하여 2 내지 30℃ 온도조건에서 히알루로니다제의 활성이 최초 효소활성 100 기준 대비 90% 이상 유지될 수 있고, 구체적으로 2 내지 30℃ 온도조건에서 히알루로니다제의 활성을 최초 효소활성 100 기준 대비 90% 이상으로 6개월 이상 유지될 수 있다.
본 발명에 따른 액상 제형은 비경구 투여경로로 투여될 수 있으며, 예를 들면 주사제로서 비경구로 투여될 수 있다.
또한, 상기 액상 제형에는 히알루로니다아제 외에 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명자들은 본 발명에 따라 최적화된 안정화제를 이용하여 고순도의 히알루로니다제를 포함하는 액상 제형을 제조하였고, 장기간 상기 액상 제형 내 히알루로니다제의 안정성이 우수함을 확인하였으므로, 본 발명에 따른 히알루로니다제 액상 제형은 장시간 동안 안정성을 확보할 수 있고, 투여에 용이하다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 히알루로니다제(Hyaluronidase, HAdase)의 안정화제로 완충액, NaCl 및 pH 조건 확인
종래 제품화된 히알루로니다제(Hyaluronidase, HAdase)는 동결건조 제형으로 불순물이 많고, 이를 액상화 할 경우 안정성에 문제가 있을 뿐 아니라, 시간에 따른 안정성의 저하로 생리활성이 감소하는 문제점이 있다. 이에, 히알루로니다제 액상 제형으로 제조 시 히알루로니다제의 효소 활성을 안정하게 유지할 수 있는 안정화제로서 완충액, NaCl 및 pH 조건을 확인하였다.
구체적으로, 고순도 정제 히알루로니다제를 1,500 IU/mL로 하고, 하기 [표 1]의 조성의 안정화제를 사용하여 히알루로니다제 액상 제형을 제조한 후 히알루로니다제의 안정성을 확인하였다. 이때 고순도 정제 히알루로니다제는 특허 출원번호 제10-2022-0143706호에 기재된 방법으로 정제한 순도 100%의 히알루로니다제를 사용하였다.
안정화제 조성
1 2 3 4 5 6



완충액		 아세트산 나트륨
(sodium acetate)		 20 mM 20 mM - - - -
시트르산염
(citrate)		 - - 20 mM 20mM - -
히스티딘
(histidine)		 - - - - 10 mM 10 mM
NaCl - 150 mM - 150 mM - 150 mM
pH 5.0 5.0 5.5 5.5 6.0 6.0
안정성 확인을 위해 각 시료를 일정량으로 분주하여 4℃ 또는 25℃에서 보관하고, 각 시점에서 히알루로니다제의 효소 활성을 확인하였다. 각 시점에서 히알루로니다제의 효소 활성은 United States Pharmacopoeia "USP assay for Hyaluronidase"의 Assay에 따라 시험하였다. 각 시험 조건에서 효소 활성은 다음의 식을 이용하여 계산하였다: 효소 활성(%) = [측정 시점의 효소 활성 (IU/mL)/0일차 효소 활성 (IU/mL)]×100.
그 결과, 표 2 및 도 1에 나타낸 바와 같이, 히알루로니다제의 효소 활성을 일주일 간격으로 분석한 결과 안정화제 조건으로 pH 5.0 ~ 6.0에서 완충액과 함께 NaCl을 포함하는 경우 4℃ 및 25℃ 보관 조건에서 히알루로니다제의 안정성이 우수하게 나타났다. 또한, NaCl을 포함하고, 완충액으로 히스티딘 완충액을 포함할 경우(조성 6) 4℃ 및 25℃ 보관 조건에서 28일 후 히알루로니다제의 효소 활성이 각각 84%, 74%로 가장 높게 유지되는 것을 확인하였다.
조성 보관 조건 효소 활성(%)
0일 7일 후 14일 후 21일 후 28일 후
1 4℃ 100 53 37 23 21
25℃ 100 48 35 27 23
2 4℃ 100 92 89 81 78
25℃ 100 79 81 86 71
3 4℃ 100 51 42 27 28
25℃ 100 43 37 31 38
4 4℃ 100 98 91 88 76
25℃ 100 83 75 84 73
5 4℃ 100 61 51 42 48
25℃ 100 55 47 37 29
6 4℃ 100 95 101 87 84
25℃ 100 87 81 86 74
상기 결과를 통해 히알루로니다제의 안정화제로 pH는 5.0 ~ 6.0으로 하고, 히스티딘 완충액 및 NaCl을 포함하는 것이 적절함을 알 수 있다.
실시예 2. 히알루로니다제의 안정화제로 NaCl 농도 조건 확인
히알루로니다제 액상 제형으로 제조 시 히알루로니다제의 효소 활성을 안정하게 유지할 수 있는 안정화제로서 NaCl 농도 조건을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 고순도 정제 히알루로니다제를 포함하는 액상 제형을 제조하되, 히알루로니다제의 안정화제로 완충액 및 pH 조건을 실시예 1에서 우수한 안정성을 확인한 조성 6과 동일하게 하고, NaCl의 농도는 하기 [표 3]과 같이 달리하여 제조하였다. 또한, 상기 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 4℃ 또는 25℃에서 보관하고, 각 시점에서 히알루로니다제의 효소 활성을 확인하였다.
안정화제 조성
7 8 9
완충액 히스티딘
(histidine)		 10 mM 10 mM 10 mM
NaCl 75 mM 150 mM 225 mM
pH 6.0 6.0 6.0
그 결과, 표 4 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 75 mM ~ 225 mM의 NaCl 농도 범위에서 NaCl 농도가 높을수록 히알루로니다제 안정성이 우수하게 나타났다고, 4℃ 및 25℃ 보관 조건에서 28일 후 히알루로니다제의 효소 활성이 각각 최대 85%, 79%로 유지되었다.
조성 보관 조건 효소 활성(%)
0일 7일 후 14일 후 21일 후 28일 후
7 4℃ 100 89 76 81 73
25℃ 100 92 83 78 69
8 4℃ 100 97 89 79 82
25℃ 100 86 85 83 76
9 4℃ 100 101 95 89 85
25℃ 100 96 81 86 79
실시예 3. 히알루로니다제의 안정화제로 비이온성 계면활성제 조건 확인
상기 실시예 1 및 2에서 확인한 최적의 히알루로니다제의 안정화제의 효능을 보다 향상하기 위하여, 히스티딘 완충액 및 NaCl를 포함하는 히알루로니다제의 안정화제에 농도를 달리한 비이온성 계면활성제를 추가하고 히알루로니다제의 안정성을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 고순도 정제 히알루로니다제를 포함하는 액상 제형을 제조하되, 히알루로니다제의 안정화제로 완충액, NaCl 및 pH 조건을 실시예 1에서 우수한 안정성을 확인한 조성 6과 동일하게 하고, 하기 [표 5]와 같이 비이온성 계면활성제로 폴리소르베이트 80(polysorbate 80)를 농도를 달리하여 제조하였다. 또한, 상기 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 4℃ 또는 25℃에서 보관하고, 각 시점에서 히알루로니다제의 효소 활성을 확인하였다.
안정화제 조성
10 11 12 13
완충액 히스티딘
(histidine)		 10 mM 10 mM 10 mM 10 mM
NaCl 150 mM 150 mM 150 mM 150 mM
폴리소르베이트 80
(polysorbate 80)		 - 0.02% 0.04% 0.06%
pH 6.0 6.0 6.0 6.0
그 결과, 표 6 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 히알루로니다제의 안정화제로 폴리소르베이트 80을 포함하는 경우(조성 11 ~ 13) 히알루로니다제의 안정성이 보다 우수한 것으로 나타났다.
조성 보관 조건 효소 활성(%)
0일 7일 후 14일 후 21일 후 28일 후
10 4℃ 100 93 95 89 81
25℃ 100 89 75 79 73
11 4℃ 100 103 99 94 92
25℃ 100 93 81 78 85
12 4℃ 100 97 87 96 93
25℃ 100 91 82 93 84
13 4℃ 100 98 93 89 81
25℃ 100 95 88 84 87
상기 결과를 통해 히알루로니다제의 안정화제로 pH는 5.0 ~ 6.0으로 하고, 히스티딘 완충액, NaCl 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 것이 적절함을 알 수 있다.
실시예 4. 히알루로니다제의 안정화제로 아미노산 조건 확인
상기 실시예 3에서 확인한 최적의 히알루로니다제의 안정화제의 효능을 보다 향상하기 위하여, 히스티딘 완충액, NaCl 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 안정화제에 3종의 아미노산을 각각 추가하고 히알루로니다제의 안정성을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3에 기재된 방법과 동일한 방법으로 고순도 정제 히알루로니다제를 포함하는 액상 제형을 제조하되, 히알루로니다제의 안정화제로 완충액, NaCl, 비이온성 계면활성제 및 pH 조건을 실시예 3에서 우수한 안정성을 확인한 조성 12와 동일하게 하고, 하기 [표 7]과 같이 아미노산으로 글리신(Glycine), 메티오닌(Methionine) 또는 프롤린(Proline)을 추가하여 제조하였다. 또한, 상기 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 4℃ 또는 25℃에서 보관하고, 각 시점에서 히알루로니다제의 효소 활성을 확인하였다.
안정화제 조성
14 15 16 17
완충액 히스티딘
(histidine)		 10 mM 10 mM 10 mM 10 mM
NaCl 150 mM 150 mM 150 mM 150 mM
폴리소르베이트 80
(polysorbate 80)		 0.04% 0.04% 0.04% 0.04%
아미노산 글리신
(Glycine)		 - 50 mM - -
메티오닌
(Methionine)		 - - 50 mM -
프롤린
(Proline)		 - - - 50 mM
pH 6.0 6.0 6.0 6.0
그 결과, 표 8 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 히알루로니다제의 안정화제로서 아미노산 중 글리신을 포함하는 경우(조성 15) 히알루로니다제의 안정성이 가장 우수한 것으로 나타났다. 또한, 히알루로니다제의 안정화제로 아미노산을 포함하지 않는 경우(조성 14)보다 아미노산 중 메티오닌 또는 프롤린을 포함하는 경우(조성 16 또는 조성 17) 3개월 후 히알루로니다제의 효소 활성이 떨어지는 것을 확인하였다.
조성 보관 조건 효소 활성(%)
0일 7일 후 14일 후 21일 후 1개월 후 2개월 후 3개월 후
14 4℃ 100 98 93 86 95 91 89
25℃ 100 105 89 83 75 79 83
15 4℃ 100 103 106 97 104 101 102
25℃ 100 99 102 94 95 99 106
16 4℃ 100 95 91 89 81 73 69
25℃ 100 88 82 85 79 69 75
17 4℃ 100 102 91 81 84 83 71
25℃ 100 91 86 78 72 76 67
상기 결과를 통해 히알루로니다제의 안정화제로 pH는 5.0 ~ 6.0으로 하고, 히스티딘 완충액, NaCl, 비이온성 계면활성제 및 아미노산으로 글리신을 포함하는 것이 적절함을 알 수 있다.
실시예 5. 히알루로니다제의 안정화제로 당 조건 확인
상기 실시예 3에서 확인한 최적의 히알루로니다제의 안정화제의 효능을 보다 향상하기 위하여, 히스티딘 완충액, NaCl 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 안정화제에 3종의 당을 각각 추가하고 히알루로니다제의 안정성을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3에 기재된 방법과 동일한 방법으로 고순도 정제 히알루로니다제를 포함하는 액상 제형을 제조하되, 히알루로니다제의 안정화제로 완충액, NaCl, 비이온성 계면활성제 및 pH 조건을 실시예 3에서 우수한 안정성을 확인한 조성 12와 동일하게 하고, 하기 [표 9]와 같이 당으로 수크로스(Sucrose), 만니톨(Mannitol) 또는 트레할로스(Trehalose)를 추가하여 제조하였다. 또한, 상기 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 4℃ 또는 25℃에서 보관하고, 각 시점에서 히알루로니다제의 효소 활성을 확인하였다.
안정화제 조성
18 19 20 21
완충액 히스티딘
(histidine)		 10 mM 10 mM 10 mM 10 mM
NaCl 150 mM 150 mM 150 mM 150 mM
폴리소르베이트 80
(polysorbate 80)		 0.04% 0.04% 0.04% 0.04%
당 수크로스
(Sucrose)		 - 50 mM - -
만니톨
(Mannitol)		 - - 50 mM -
트레할로스
(Trehalose)		 - - - 50 mM
pH 6.0 6.0 6.0 6.0
그 결과, 표 10 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 히알루로니다제의 안정화제로서 당 중 수크로스를 포함하는 경우(조성 19) 히알루로니다제의 안정성이 가장 우수한 것으로 나타났다. 또한, 히알루로니다제의 안정화제로 당을 포함하지 않는 경우(조성 18)보다 당 중 만니톨 또는 트레할로스를 포함하는 경우(조성 20 또는 조성 21) 3개월 후 히알루로니다제의 효소 활성이 떨어지는 것을 확인하였다.
조성 보관 조건 효소 활성(%)
0일 7일 후 14일 후 21일 후 1개월 후 2개월 후 3개월 후
18 4℃ 100 98 95 99 103 97 101
25℃ 100 94 87 93 85 84 87
19 4℃ 100 97 101 105 99 97 104
25℃ 100 99 94 95 97 101 98
20 4℃ 100 93 97 88 84 81 71
25℃ 100 85 88 81 83 76 69
21 4℃ 100 92 85 94 91 87 92
25℃ 100 89 91 86 95 88 86
상기 결과를 통해 히알루로니다제의 안정화제로 pH는 5.0 ~ 6.0으로 하고, 히스티딘 완충액, NaCl, 비이온성 계면활성제 및 당으로 수크로스를 포함하는 것이 적절함을 알 수 있다.
실시예 6. 최적의 히알루로니다제 안정화제를 포함하는 히알루로니다제 액상 제형의 안정성 확인
상기 실시예 4 및 5에서 확인한 최적 조성의 히알루로니다제 안정화제를 이용하여 히알루로니다제 액상 제형을 제조한 후 히알루로니다제의 안정성을 확인하였다.
구체적으로, 하기 [표 11]과 같이 상기 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 고순도 정제 히알루로니다제를 포함하는 액상 제형을 제조하되, 하기 [표 11]과 같이 상기 실시예 3에서 우수한 안정성을 확인한 조성 12, 상기 실시예 4에서 안정성을 보다 향상하는 조성 15 또는 상기 실시예에서 안정성을 보다 향상하는 조성 19와 동일한 조성의 안정화제를 이용하여 히알루로니다제 액상 제형을 제조하였다. 또한, 상기 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 4℃ 또는 25℃에서 보관하고, 각 시점에서 히알루로니다제의 효소 활성을 확인하였다.
안정화제 조성
22 23 24
완충액 히스티딘
(histidine)		 10 mM 10 mM 10 mM
NaCl 150 mM 150 mM 150 mM
폴리소르베이트 80
(polysorbate 80)		 0.04% 0.04% 0.04%
아미노산 글리신
(Glycine)		 - 50 mM -
당 수크로스
(Sucrose)		 - - 50 mM
pH 6.0 6.0 6.0
그 결과, 표 12 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 히알루로니다제의 안정화제로 pH는 5.0 ~ 6.0으로 하고, 히스티딘 완충액, NaCl 및 비이온성 계면활성제를 포함하고, 아미노산으로 글리신(조성 23) 또는 당으로 수크로스(조성 24)을 포함하는 경우 글리신 또는 수크로스를 포함하지 않는 경우(조성 22)에 비해 4℃ 또는 25℃ 조건 모두에서 6개월 후에도 히알루로니다제의 효소 활성이 초기와 유사하게 안정적으로 유지되는 것을 확인하였다.
조성 보관 조건 효소 활성(%)
0일 7일 후 14일 후 21일 후 28일 후 2개월 후 4개월 후 6개월 후
22 4℃ 100 103 93 95 101 97 93 89
25℃ 100 102 97 85 77 78 83 86
23 4℃ 100 106 102 98 103 105 97 102
25℃ 100 101 99 103 99 98 101 97
24 4℃ 100 108 104 108 106 95 98 101
25℃ 100 99 101 93 106 96 105 99
상기 결과를 통해 히알루로니다제 액상 제형 제조 시 pH는 5.0 ~ 6.0으로 하고, 히스티딘 완충액, NaCl, 비이온성 계면활성제를 포함하고, 아미노산으로 글리신 또는 당으로 수크로스를 포함하는 히알루로니다제의 안정화제를 이용할 경우 4℃ 또는 25℃ 조건에서 히알루로니다제의 안정성이 6개월 이상 유지됨을 알 수 있다.

Claims (19)

1 내지 20 mM의 히스티딘(histidine) 완충액; 70 내지 250 mM의 NaCl; 0.01 내지 1 % (중량/부피, w/v)의 비이온성 계면활성제; 및 1 내지 100 mM의 글리신(Glycine) 또는 수크로스(Sucrose)를 포함하고, pH가 4.0 내지 7.0인, 히알루로니다제(hyaluronidase)의 안정화제.
제 1항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 20(Polysorbate 20), 폴리소르베이트 80(Polysorbate 80) 및 트리톤-X-100(Triton-X-100)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 히알루로니다제의 안정화제.
삭제
삭제
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 히알루로니다제의 안정화제는 2 내지 30℃ 온도조건에서 히알루로니다제의 활성을 최초 효소 활성 100 기준 대비 90% 이상 유지시키는 것인, 히알루로니다제의 안정화제.
제 7항에 있어서, 상기 히알루로니다제의 안정화제는 히알루로니다제의 활성을 6개월 이상 유지시키는 것인, 히알루로니다제의 안정화제.
제 1항, 제 2항, 제 7항 및 제 8항 중 어느 한 항의 히알루로니다제의 안정화제; 및 히알루로니다제를 포함하는, 액상 제형.
제 9항에 있어서, 상기 히알루로니다제는 순도 98% 이상인, 액상 제형.
제 9항에 있어서, 상기 히알루로니다제는 양, 소, 돼지 또는 사람 유래인, 액상 제형.
제 9항에 있어서, 상기 히알루로니다제는 포유류 히알루로니다제 유전자를 미생물 또는 동물세포 또는 식물세포에 도입하여 생산되는 재조합 히알루로니다제인, 액상 제형.
제 9항에 있어서, 상기 히알루로니다제는 미정제 효소 또는 정제된 효소인, 액상 제형.
제 13항에 있어서, 상기 정제된 효소는 히알루로니다제-함유 원료를, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환크로마토그래피 및 겔여과법으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 정제된 것인, 액상 제형.
제 14항에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피는 블루 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피 또는 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피인, 액상 제형.
제 14항에 있어서, 상기 이온 교환크로마토그래피는 양이온교환 크로마토그래피 또는 음이온교환 크로마토그래피인, 액상 제형.
제 14항에 있어서, 상기 히알루로니다제는 순차적으로 헤파린 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피 및 양이온교환 크로마토그래피로 정제된 것인, 액상 제형.
제 9항에 있어서, 상기 액상 제형은 2 내지 30℃ 온도조건에서 히알루로니다제의 활성이 최초 효소 활성 100 기준 대비 90% 이상 유지되는 안정성을 갖는, 액상 제형.
제 18항에 있어서, 상기 액상 제형은 히알루로니다제의 활성이 6개월 이상 유지되는 것인, 액상 제형.
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