ES2258976T3 - Hialuronidasa de la hirudinaria manillensis, aislamiento, purificacion y metodo recombinante de produccion. - Google Patents
Hialuronidasa de la hirudinaria manillensis, aislamiento, purificacion y metodo recombinante de produccion.Info
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Abstract
Una proteína purificada aislada de la especie de sanguijuela Hirudinaria manillensis que tiene la actividad biológica de una hialuronidasa que no está inhibida por heparina, la proteína tiene las siguientes propiedades: (a) un peso molecular de 53-60 kDa dependiente de la glicosilación, (b) un óptimo de actividad enzimática a pH 6,0-7,0, (c) un punto isoeléctrico de 7,2-8,0, (d) una actividad de retención de 60% a 37ºC después de 7 días y de 100% después de 7 días en presencia de suero de perro, y (e) una actividad enzimática específica de más de 100 kU/mg de proteína.
Description
Hialuronidasa de la Hirudinaria
manillensis, aislamiento, purificación y método recombinante de
producción.
La presente invención se refiere al aislamiento,
la purificación y la caracterización de una nueva hialuronidasa que
deriva de la sanguijuela tropical Hirudinaria manillensis.
Por lo tanto, de acuerdo con esta invención la nueva enzima se
denomina "manilasa". Además, la invención trata del método
recombinante de producción de manilasa que incluye la descripción
de secuencias de DNA y aminoácidos así como de vectores de expresión
y sistemas huésped. Finalmente, la invención se refiere al uso de
manilasa con propósitos terapéuticos, por ejemplo, para el
tratamiento de enfermedades del miocardio, episodios trombóticos y
tumores.
El ácido hialurónico o hialuronano (HA) es un
glicosaminoglicano lineal no ramificado de alto peso molecular
(2-6 x 10^{6}), compuesto por una estructura de
disacárido repetida
GlcNAc(\beta1-4)GlcUA. Sus grupos
carboxilo están completamente ionizados en el pH imperante de los
fluidos extracelulares, ya sea normal o patológico. El HA pertenece
junto con los sulfatos de condroitina, los sulfatos de queratano y
las heparinas al grupo de glicosaminoglicanos (Jeanloz R. W.,
Arthr Rheum., 1960, 3, 233-237). En contraste
con otros glicosaminoglicanos (GAG) no modificados, no tiene
substitución de sulfato o péptido enlazado covalentemente, y
habitualmente su longitud de cadena y peso molecular son mucho
mayores. El HA está ubicuamente distribuido en tejidos conectivos y
se ha encontrado virtualmente en todas las partes del cuerpo después
de la introducción de un método de fijación mejorado (Hellström S.
y otros, 1990, Histochem. J., 22, 677-682) y
el método histoquímico específico con el uso de péptidos que se
unen a hialuronano (HABP). Asimismo, está presente durante el
desarrollo y la madurez en tejidos de origen neuroectodérmico.
El termino hialuronidasa se refiere generalmente
y de acuerdo con esta invención a una enzima, que actúa sobre el
ácido hialurónico, independientemente de la actividad hacia otros
sustratos.
La hialuronidasa se aisló en primer lugar de
microorganismos y más tarde de testículo de mamífero que es ahora
su fuente principal (Meyer K. en The Enzyme, 1971, 307).
De acuerdo con el mecanismo de reacción, las
hialuronidasas se dividieron en tres grupos principales.
En el primer grupo se combinan enzimas
microbianas que actúan sobre sus sustratos mediante
\beta-eliminación produciendo disacáridos
\Delta-4,5-insaturados. Por lo
tanto, la enzima debe denominarse hialuronato liasa, EC
4.2.99.1.
El segundo grupo, hialuronoglucosaminidasa o
hialuronidasa de tipo testicular (EC 3.2.1.35), actúa como una
endo-N-acetil-\beta-D-hexosaminidasa
que degrada el HA hasta fragmentos menores, en primer lugar un
tretrasacárido con el resto de hexosamina en el extremo reductor
libre. Enzimas con propiedades similares a la hialuronidasa de
testículo se han obtenido de renacuajos, veneno de serpiente, veneno
de abeja, numerosos tejidos animales, suero humano y otras fuentes.
Se sabe que la hialuronidasa de testículo también tiene actividad de
transglicosilasa (Weissman B. y otros, J. Biol. Chem., 1954,
208, 417-429). Las enzimas pertenecientes a este
grupo de hialuronidasa exhiben actividad enzimática no solo hacia
el hialuronato sino también hacia el 4-sulfato de
condroitina, el 6-sulfato de condroitina, la
condroitina y el sulfato de dermatano.
El tercer grupo consiste en hialuroglucuronidasa
(EC 3.2.1.36), que actúa como
endo-\beta-glucuronidasa. Esta
enzima se aisló de las sanguijuelas Hirudo medicinalis (Yuki
H. y Fishman W.H.; J. Biol. Chem. 1963, 238,
1877-79) y es absolutamente específica para el HA.
El sulfato de condroitina, el dermatano y la heparina no son
sustratos para esta hialuronidasa. Degrada solo el ácido hialurónico
hasta un tetrasacárido con el ácido glucurónico en el extremo
reductor libre (Linker A. y otros, J. Biol. Chem, 1960, 235,
924-27). En oposición a las
endo-\beta-glucosaminidasas de
mamífero, la heparina no tiene influencia sobre la actividad de esta
hialuronidasa de sanguijuela. Por lo tanto, puede coadministrarse a
un paciente junto con una heparina y sus derivados usarse
extensamente como anticoagulantes. Una
endo-beta-glucuronidasa específica
para ácido hialurónico (denominada "orgelasa") procedente de
especies (Poecilobdella granulosa) de la subfamilia Hirudinariinae
(incluyendo los géneros Hirudinaria, Illebdella, Poecilodbella,
Sanguisoga) de sanguijuelas del búfalo se describió en EP 0193 330,
teniendo un peso molecular de aproximadamente 28,5.
Las hialuronidasas tienen muchas aplicaciones
prácticas in vivo e in vitro. La administración
intravenosa de hialuronidasa se ha propuesto para el tratamiento
del infarto de miocardio (Kloner R.A. y otros, Circulation,
1978, 58, 220-226; Wolf R.A. y otros, Am. J.
Cardiol., 1984, 53, 941-944; Taira A. y otros,
Angiology, 1990, 41, 1029-1036). El infarto
de miocardio representa una forma común de lesión no mecánica; a
saber daño celular grave y muerte, provocados en este caso por una
hipoxia celular repentina. En un infarto de miocardio experimental
inducido en ratas (Waldenström A. y otros, 1991, J. Clin.
Invest., 88, 1622-1628), el contenido de HA del
músculo cardíaco lesionado (área infartada) se incrementaba en 24 h
para alcanzar casi tres veces el normal después de 3 días, y estaba
acompañado por edema intersticial. El contenido de agua relativo de
las áreas infartadas también se incrementaba progresivamente
alcanzando un valor máximo alrededor del día 3 y se correlacionaba
fuertemente con la acumulación de HA. La misma asociación de
contenido de HA incrementado con edema se ha observado en el
rechazo de trasplantes renales y cardíacos experimental (Hällgren R.
y otros, J. Clin. Invest., 1990, 85,
668-673; Hällgren R. y otros, J. Exp. Med.,
1990, 171, 2063-2076), en el rechazo de trasplantes
renales humanos (Wells A. y otros, Transplantation, 1990, 50,
240-243), enfermedades pulmonares (Bjermer A. y
otros, Brit. Med. J., 1987, 295, 801-806) y
en fibrosis intersticial idiopática (Bjermer A. y otros,
Thorax, 1989, 44, 126-131). Todos estos
estudios proporcionan no solo evidencia de HA incrementado en la
inflamación aguda, sino que demuestran su participación en la
retención local de fluido principalmente responsable del
hinchamiento de tejidos y que influye en las funciones tanto
mecánicas como electrofisiológicas del corazón.
Estos resultados pueden explicar el mecanismo de
la acción de las hialuronidasas usadas en experimentos clínicos. Se
presentó que el tratamiento con hialuronidasas limitaba el daño
celular durante la isquemia de miocardio en ratas, perros y hombres
(Maclean D. y otros, Science, 1976, 194, 199). La degradación
del HA puede estar seguida por la reducción de la acumulación de
agua en los tejidos, la reducción de la presión tisular y
finalmente una mejor perfusión.
Se ha mostrado que las hialuronidasas, así como
extractos que contienen hialuronidasa procedentes de sanguijuelas,
pueden usarse con otros propósitos terapéuticos. Así, la terapia con
hiasas, sola o combinada con ciclosporina, daba como resultado una
supervivencia prolongada de los injertos (Johnson C. y otros,
Transplant Inter. en prensa). Las hiasas ("factor de
extensión") en el sentido más amplio se usan para incrementar la
permeabilidad de los tejidos para mejorar la difusión de otros
agentes farmacológicos (por ejemplo, en combinación con citostáticos
en el tratamiento de tumores cancerosos). Por otra parte, podría
demostrarse que las hialuronidasas son útiles en la terapia de
tumores actuando como un inhibidor de la angiogénesis y como un
adyuvante para el aporte de fármacos local en el tratamiento de
tumores, para el tratamiento del glaucoma y otros trastornos
oculares y como auxiliar de otros agentes terapéuticos tales como
anestésicos locales y antibióticos. Una vista general del uso
terapéutico y la relevancia se da en el artículo de revisión de Farr
y otros (1997, Wiener Medizinische Wochenschrift, 15, p. 347) y la
literatura citada allí. Por lo tanto, existe una necesidad de un
compuesto activo tal como hialuronidasa. Sin embargo, las
hialuronidasas conocidas y disponibles no son estables
(hialuronidasa de Hirudo medicinalis, Linker y otros, 1960,
J. Biol. Chem. 235, p. 924 ; Yuki y Fishman, 1963, J. Biol. Chem.
238, p. 1877) o muestran una actividad específica bastante baja (EP
0193 330, Budds y otros, 1987, Comp. Biochem. Physiol., 87B, 3, p.
497). Por otra parte, ninguna de las hialuronidasas conocidas está
disponible en forma recombinante, lo que es un requisito previo
esencial para el uso comercial intensivo.
La invención describe ahora por primera vez una
nueva hialuronidasa que se aisló y purificó de Hirudonaria
manillensis, así como una versión recombinante de dicha enzima
obtenida mediante técnicas de bioingeniería.
Así, un objetivo de esta invención es
proporcionar una proteína purificada aislada de la especie de
sanguijuela Hirudinaria manillensis que tiene la actividad
biológica de una hialuronidasa que no está influida en su actividad
por heparina y se caracteriza porque tiene un peso molecular de
53-60 kD dependiente de la glicosilación. La nueva
proteína, que se denomina "manilasa", está glicosilada en su
forma natural, teniendo un peso molecular de alrededor de 58 kD
(\pm2 kD) y cuatro glicoformas. Sin embargo, la proteína no
glicosilada también es el objetivo de la invención, obtenible
mediante segmentación enzimática o química de los residuos de azúcar
de acuerdo con técnicas estándar. La enzima no glicosilada de la
invención tiene un peso molecular de aproximadamente 54 (\pm2)
según se mide mediante SDS-PAGE.
La comparación directa muestra que la
hialuronidasa descrita en EP 0 193 330 ("orgelasa") tiene bajo
las mismas condiciones un peso molecular de aproximadamente 28 y
contiene una gran cantidad de impurezas tales como hemoglobina.
La manilasa natural de acuerdo con esta
invención tiene un óptimo de pH de 6,0-7,0, un punto
isoeléctrico de 7,2-8,0 y tiene la secuencia de
aminoácidos representada en la Fig. 7.
Sorprendentemente, la manilasa obtenida mediante
un procedimiento de purificación preparativa (véase posteriormente)
tiene una actividad específica extremadamente alta de
100-150, preferiblemente de 110-140
(WHO) kU/mg de proteína, mientras que la actividad específica de la
orgelasa es aproximadamente solo 1,2 kU/mg. Por otra parte, la
orgelasa tiene un óptimo de pH inferior (5,2-6,0) en
comparación con la manilasa. La manilasa no está influida, como la
orgelasa, por la heparina.
Por otra parte, un objetivo de la invención es
proporcionar un procedimiento para aislar y purificar manilasa, que
comprende las siguientes etapas
- (i)
- homogeneización de cabezas de sanguijuelas de la especie Hirudinaria manillensis con un tampón ácido y centrifugación,
- (ii)
- precipitación con sulfato amónico del sobrenadante de la etapa (i),
- (iii)
- cromatografía de intercambio catiónico,
- (iv)
- cromatografía de afinidad con concanavalina A,
- (v)
- cromatografía de interacción hidrófoba,
- (vi)
- cromatografía de afinidad sobre matrices revestidas con fragmentos de ácido hialurónico,
- (vii)
- cromatografía de penetración en gel, y opcionalmente
- (viii)
- desglicosilación enzimática o química de la proteína purificada.
Las etapas del procedimiento descritas
anteriormente garantizan que la proteína de acuerdo con la invención
puede obtenerse con tal actividad enzimática biológica alta. Por lo
tanto, un objetivo adicional de esta invención es proporcionar una
proteína que tiene la actividad biológica de una hialuronidasa que
no está influida en su actividad por heparina y que tiene un peso
molecular de 53-60 dependiente de la glicosilación,
que puede obtenerse mediante las etapas de procedimiento indicadas
anteriormente y en las reivindicaciones y que tienen
preferiblemente una actividad enzimática específica de > 100
kU/mg de proteína. El término "unidad" se refiere
posteriormente y anteriormente a "unidades internacionales"
(UI).
La invención describe un procedimiento para
elaborar manilasa recombinante que incluye moléculas de DNA,
vectores y células huésped transformadas respectivos.
Por lo tanto, un objetivo de esta invención es
proporcionar una secuencia de DNA que codifica para una proteína
que tiene las propiedades de la manilasa natural.
También podría mostrarse que podrían
seleccionarse al menos tres clones adicionales con secuencias de DNA
ligeramente diferentes que son codificados por proteínas con
propiedades de manilasa (hialuronidasa) que tienen secuencias de
aminoácidos ligeramente diferentes.
Los clones especificados tienen las secuencias
de DNA representadas en las Figs. 8, 9 y 10 (secuencia superior)
que son un objetivo de esta invención, así como vectores de
expresión que contienen dichas secuencias y células huésped que
estaban transformadas con dichos vectores.
Además, un objetivo de esta invención es
proporcionar una proteína recombinante con la actividad biológica
de una hialuronidasa y un peso molecular de 55-59 kD
dependiente de la glicosilación, que tiene cualquier secuencia de
aminoácidos representada en las Figs. 8, 9 y 10 (secuencia inferior)
o una secuencia que tiene una homología con dichas secuencias de al
menos 80%. El término "manilasa" incluye todas estas proteínas
que tienen las propiedades especificadas anteriormente.
La proteína o las proteínas naturales así como
las recombinantes pueden usarse como un medicamento que puede
aplicarse a pacientes directamente o dentro de composiciones
farmacéuticas. Así, un aspecto adicional de esta invención es
proporcionar una proteína recombinante natural como la definida
anteriormente y posteriormente aplicable como un medicamento y una
composición farmacéutica respectiva que comprende dicha proteína y
un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable
para la misma.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
pueden contener adicionalmente otros compuestos farmacéuticos
activos de una gran diversidad. Agentes preferidos son
anticoagulantes que no inhiben o influyen en la actividad biológica
y farmacológica de la proteína de acuerdo con la invención. Tales
anticoagulantes pueden ser, por ejemplo, heparina, hirudina o
dicumarina, preferiblemente heparina. Así, un objetivo de la
presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que
comprende adicionalmente un compuesto farmacológicamente activo,
preferiblemente heparina.
En relación con el uso en terapia humana o
veterinaria, la proteína de acuerdo con esta invención actúa
preferiblemente como agente dispersante (factor de
"extensión") o apoya la penetración a través del tejido y la
piel. Así, la manilasa puede usarse como un adyuvante de otras
substancias (tales como un anestésico local), por ejemplo en el
campo de la quimioterapia de tumores, para el tratamiento de
trastornos y enfermedades con respecto a isquemia o infarto de
miocardio agudos, para el tratamiento del glaucoma u otros
trastornos oculares, por ejemplo para mejorar la circulación de
fluidos fisiológicos en el ojo, para el tratamiento de injertos de
piel y tejido para eliminar la congestión y mejorar la circulación,
como sistema de aporte de fármacos a través de la piel, las
membranas u otro tejido, como un agente para retirar la cápsula de
ácido hialurónico que rodea ciertos microorganismos patógenos o
ciertos tumores y tejidos cancerosos, y como un inhibidor de la
angiogénesis que puede usarse como agente antitrombótico y
antitumoral.
Por lo tanto, el uso de manilasa, según se
define anteriormente y posteriormente, en la fabricación de un
medicamento para tratar especialmente trastornos de miocardio,
cardiovasculares y trombóticos y tumores es un objetivo de esta
invención.
Según se usa aquí, el término "portador
farmacéuticamente aceptable" significa una carga, un diluyente o
un material encapsulante, sólidos o líquidos, atóxicos, inertes,
que no reaccionan adversamente con el compuesto o con el paciente.
Portadores preferiblemente líquidos adecuados son bien conocidos en
la especialidad, tales como agua estéril, solución salina, dextrosa
acuosa, soluciones de azúcar, etanol, glicoles y aceites, incluyendo
los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, por ejemplo
aceite de cacahuete, aceite de soja y aceite mineral.
Las formulaciones de acuerdo con la invención
pueden administrarse como dosis unitarias que contienen portadores,
diluyentes, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente atóxicos
convencionales, que son típicos para la administración
parenteral.
El término "parenteral" incluye aquí
técnicas de inyección e infusión subcutáneas, intravenosas,
intraarticulares e intratraqueales. Además, son adecuadas otras
administraciones tales como la administración oral y la aplicación
tópica. Las composiciones y combinaciones parenterales se
administran lo más preferiblemente intravenosamente en una forma de
bolo o como una fusión constante de acuerdo con procedimientos
conocidos. Las tabletas y las cápsulas para administración oral
contienen excipientes convencionales tales como agentes de unión,
cargas, diluyentes, agentes de formación de tabletas, lubricantes,
desintegrantes y agentes humectantes. Las tabletas pueden
revestirse de acuerdo con métodos bien conocidos en la
especialidad.
Otras preparaciones líquidas pueden estar en
forma de suspensiones, soluciones, emulsiones, jarabes o elixires
acuosos u oleosos, o pueden estar presentes como un producto seco
para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de
usar. Tales preparaciones líquidas pueden contener aditivos
convencionales como agentes de suspensión, agentes emulsionantes,
vehículos no acuosos y conservantes. Las aplicaciones tópicas pueden
estar en forma de suspensiones, soluciones, emulsiones, gelatinas o
preferiblemente pomadas en emulsión, acuosas u oleosas.
Las dosis unitarias de acuerdo con la invención
pueden contener cantidades requeridas diariamente de la proteína de
acuerdo con la invención, o submúltiplos de las mismas para formar
la dosis deseada. La dosificación y el grado de dosis
terapéuticamente aceptables óptimos para un paciente dado
(mamíferos, incluyendo seres humanos) depende de una variedad de
factores, tales como la actividad del material activo específico
empleado, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la
dieta, el momento y la ruta de administración, la velocidad de
depuración, la actividad enzimática (unidades/mg de proteína), el
objetivo del tratamiento, es decir la terapia o la profilaxis, y la
naturaleza de la enfermedad que ha de tratarse.
Por lo tanto, en composiciones y combinaciones,
tales como con anticoagulantes como heparina en un paciente tratado
(in vivo), una dosis farmacéutica diaria eficaz de la
proteína de esta invención (manilasa) está entre aproximadamente
0,01 y 100 mg/kg de peso corporal (basado en una actividad
específica de 100 kU/mg), preferiblemente entre 0,1 y 10 mg/kg de
peso corporal. De acuerdo con la forma de aplicación, una dosis
simple puede contener entre 0,5 y 10 mg de manilasa.
La concentración de, por ejemplo, heparina
cuando se administra junto con manilasa es típicamente
500-4000 U (UI) a lo largo de un día, sin embargo,
puede incrementarse o disminuirse si es necesario.
La purificación de la manilasa de la invención
se alcanzó como se describe con detalle en los ejemplos. La Tabla 1
representa un esquema de purificación preparativa de manilasa. La
Tabla 2 muestra el procedimiento de enriquecimiento de la proteína
de acuerdo con la invención y la Tabla 3 indica la comparación de
manilasa con hialuronidasas de sanguijuela conocidas.
Una enzima, denominada manilasa, que segmenta el
ácido hialurónico se ha aislado de las cabezas de sanguijuelas
Hirudinaria manillensis y se ha purificado hasta la
homogeneidad. Esta hialuronidasa se purificó usando extracción con
ácido, precipitación con sulfato amónico, seguido por cromatografía
sucesiva en columnas de intercambiador catiónico, concanavalina
A-Sepharose, Propyl-Fractogel,
fragmentos de hialuronano-Sepharose y
diol-LiChrospher. Los fragmentos de hialuronano se
prepararon mediante la segmentación del hialuronano natural con la
ayuda de hialuronidasa de testículo bovino. Después de la
purificación y la caracterización de los fragmentos, las matrices
de afinidad se prepararon como se indica posteriormente. Tales
matrices de afinidad se aplicaron por primera vez para la
purificación de la hialuronidasa. Esta cromatografía de alta
resolución es una técnica para la purificación rápida y eficaz de
proteínas que se unen a hialuronano. La recuperación de la actividad
enzimática después de cada etapa de purificación era razonablemente
alta. Los resultados de las tres purificaciones preparativas
independientes eran comparables. Daban como resultado muestras
altamente activas que poseían entre 20 y 160 kU/mg dependiendo del
grado de purificación. En experimentos de comparación, se aislaron
hialuronidasas conocidas según se indica en la especialidad
anterior y sus propiedades se compararon con la proteína de acuerdo
con esta invención
(Tabla 3).
(Tabla 3).
La hialuronidasa purificada de acuerdo con el
esquema de la Tabla 1 difiere de otras hialuronidasas de sanguijuela
descritas por otros autores. Se obtuvo un peso molecular similar
bajo condiciones no disociativas (cualquier
\beta-mercaptoetanol), indicando que la manilasa
es una enzima de una sola subunidad en común con una amplia gama de
preparaciones de hialuronidasa procedentes de fuentes de mamífero.
Esta preparación final es una enzima de una sola subunidad (Fig. 1)
de peso molecular aparente 58 \pm 2 determinado con la ayuda de
MALDI, con un punto isoeléctrico de 7,2 a 8,0.
Los asteriscos de las tablas significa
información sobre la determinación de la actividad y la
caracterización bioquímica (* - *****).
Los métodos de determinación de la actividad y
caracterización bioquímica usados dependen de la concentración de
manilasa en las muestras analizadas. Por lo tanto, se extendieron
sucesivamente mediante las técnicas apropiadas en las etapas de
purificación sucesivas.
- *
- - Determinación de la actividad - prueba de reducción de la turbidez
- **
- - Determinación de la actividad - prueba de reducción de la turbidez
- \quad
- - Determinación del contenido de proteína (E_{280}, método BCA de Pierce)
- \quad
- - SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS)
- \quad
- - Determinación de hemoglobina
- ***
- - Determinación de la actividad - prueba de reducción de la turbidez
- \quad
- - Determinación del contenido de proteína (E_{280}, método BCA de Pierce)
- \quad
- - SDS-PAGE-Transferencia Western (anticuerpo anti-hemoglobina humana)
- ****
- - Determinación de la actividad - prueba de reducción de la turbidez
- \quad
- - Determinación del contenido de proteína (E_{280}, método BCA de Pierce)
- \quad
- - SDS-PAGE-Transferencia Western, anticuerpo anti-hemoglobina humana
- \quad
- - SDS-PAGE-Transferencia Western, anticuerpo anti-Con A
- \quad
- - SDS-PAGE-Transferencia Western, anticuerpos anti-péptido
- *****
- - MALDI
- \quad
- - Determinación del contenido de proteína (método BCA de Pierce)
- \quad
- - SDS-PAGE-Transferencia Western, anticuerpos anti-péptido
\vskip1.000000\baselineskip
La unión de manilasa a concanavalina A muestra
que esta hialuronidasa es una glicoproteína, cuyos componentes de
azúcar están terminados con
\alpha-D-manopiranosilo o
\alpha-D-glucopiranosilo y
residuos estéricamente relacionados. Las muestras activas para
manilasa mostraban dos bandas con valores de RF casi idénticos en
SDS-PAGE. Se usaron SDS-PAGE más
larga y diferentes condiciones de recorrido para una mejor
separación de las bandas. En estos experimentos, podían detectarse
dos bandas más débiles adicionales (Fig. 2). La parte
N-terminal de todos ellos (30 aminoácidos) se
sometió a secuenciación individualmente y de nuevo mostraba
diferencia en el extremo N. Después de la desglicosilación con la
endo-F-glicosidasa (PNGasa) se
observó que las cuatro bandas daban como resultado una sola banda,
con una reducción en el PM de aproximadamente 3.
Por lo tanto, es bastante probable que las
diferencias observadas en la movilidad electroforética se deban a
diferencias en el patrón de glicosilación de las moléculas de
manilasa. Los tratamientos con neuraminidasa,
O-endo-glicosidasa y neuraminidasa
más O-glicosidasa no tenían influencia sobre el peso
molecular de la enzima purificada (Fig. 3). Estos resultados han
mostrado que la manilasa contiene al menos una cadena de
oligosacárido conectada en N. Las cadenas de carbohidrato
conectadas en O no podrían detectarse con el método usado.
Como la etapa de purificación concluyente, se
llevó a cabo la cromatografía RP. Aunque la actividad enzimática no
podía detectarse ya más, las sales y los inhibidores de proteasa
peptídicos podían retirarse (Fig. 4). Las fracciones que contenían
proteína se caracterizaban adicionalmente con la ayuda de MALDI. El
peso molecular de la manilasa determinado con la ayuda de MALDI era
58,3.
La heparina no tiene influencia sobre la
actividad de esta hialuronidasa (Fig. 5). La manilasa es muchas
veces más estable que la hialuronidasa de Hirudo medicinalis
(Fig. 6). Por otra parte, las muestras de manilasa parcialmente
purificada mostraban una estabilidad muy alta en el plasma de perros
y ratas en el intervalo de -20 a +37.
La preparación de matrices de afinidad para HA
se ha descrito en la literatura (Tengblad A., Biochim. Biophys.
Acta, 1979, 578, 281-289). Esta matriz de
HA se usó para la purificación de las proteínas que se unen a
hialuronato del cartílago o el núcleo de sulfato de queratano de la
proteína de proteoglicanos (Christner J. E., Anal. Biochem.,
1978, 90, 22-32) a partir de la misma fuente.
La proteína que se une a HA (HABP), purificada con la ayuda de esta
matriz de afinidad, se usó adicionalmente en estudios histoquímicos
relativos a la distribución de los receptores de hialuronato (Green
S.J. y otros, J. Cell Science, 1988, 89,
145-156; Chan F.L. y otros, J. Cell.
Biol.,1997, 107, 289-301) o hialuronano
(Waldenström A. y otros, 1991, J. Clin. Invest., 88,
1622-1628; Waldenström A. y otros, Eur. J. Clin.
Invest., 1993, 23, 277-282) en los
tejidos.
Sin embargo, el método de preparación de este
gel desarrollado en el laboratorio por los presentes inventores
permite producir geles de concentración exactamente definida de
fragmentos de HA (de 1 a 15 mg/ml). Así, a su vez, permite usar
tales geles no solo para la purificación de proteínas que se unen a
hialuronano sino también para su separación, beneficiándose de su
diferente afinidad para el hialuronano. Esta separación selectiva
puede controlarse mediante el uso de fragmentos de HA de diferente
longitud. Tal separación permitirá una mejor caracterización de
muchos receptores de importancia biológica (por ejemplo, en
oncología).
Matrices de HA preparadas de acuerdo con el
método descrito pueden aplicarse para la:
1) purificación de proteínas que se unen a HA
conocidas
2) purificación de proteínas que se unen a HA
desconocidas
3) identificación de las nuevas proteínas que se
unen a HA
4) purificación de hialuronidasas
Los fragmentos de HA obtenidos mediante el
método descrito en la presente invención pueden caracterizarse con
el uso de modernos métodos analíticos (NMR,
MALDI-MS) y aplicarse en la búsqueda de
interacciones proteína-proteína. Por otra parte,
estos fragmentos pueden usarse en la búsqueda relacionada con
procesos de angiogénesis y neovascularización.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 1: Electroforesis en gel de
poliacrilamida en presencia de SDS
(SDS-PAGE-tinción con CBB) de la
proteína estándar, muestra de manilasa (después de la cromatografía
en diol-LiChospher).
- 1
- - patrón de proteínas de amplio intervalo
- 2
- - manilasa, 4 \mug
- 3
- - orgelasa, 6 \mug
- 4
- - hemoglobina, 40 \mug
Fig. 2:
- a)
- SDS-PAGE (tinción con CBB) y
- b)
- SDS-PAGE - transferencia Western de cuatro muestras activas para manilasa (líneas 3-6) después de cromatografía de afinidad con HA. Se usó en este experimento anticuerpo policlonal anti-péptido P3-2A de conejo.
Fig. 3: SDS-PAGE
(CBB) de las siguientes muestras:
- 1
- - LW-MM - marcador de bajo peso molecular (BioRad)
- 2
- - Manilasa
- 3
- - N-glicosidasa F (PNGasa F)
- 4
- - Manilasa después del tratamiento con PNGasa F
- 5
- - Manilasa después del tratamiento con O-glicosidasa
- 6
- - Manilasa después del tratamiento con O-glicosidasa y neuraminidasa
- 7
- - O-glicosidasa y neuraminidasa
- 8
- - marcador del peso molecular (BioRad preteñido con MWM)
\newpage
Fig. 4: Cromatografía en fase
inversa de
- a)
- patrón de ribonucleasa
- b)
- muestra de manilasa (actividad específica 140 kU/mg)
Fig. 5: Influencia de la heparina
sobre la actividad en hialuronidasa de manilasa (-\circ-) y
hialuronidasa de testículo bovino (-\bullet-)
eje X: IU de heparina; eje Y: % de actividad
restante
Fig. 6: Medida de estabilidad de
hialuronidasas en tampón y plasma:
- (a)
- manilasa (4ºC), (b) manilasa (-20ºC)
- (c)
- manilasa (37ºC)
- (d)
- hialuronidasa de testículo bovino (Y) y hialuronidasa de Hirudo medicinalis (A)
eje X: días de incubación; eje Y: unidades WHO
(UI)
Fig. 7: Secuencia de aminoácidos de
manilasa natural obtenida sometiendo a secuenciación la proteína
aislada y purificada procedente de Hirudinaria manillensis de
acuerdo con la invención (corresponde al Nº ID SEC 1)
Fig. 8: Secuencia de nucleótidos
(líneas superiores) y aminoácidos de un clon de manilasa
recombinante; (corresponde a los Nº ID SEC 2, 3)
Fig. 9: Secuencia de nucleótidos
(líneas superiores) y aminoácidos de un clon de manilasa
recombinante; (corresponde a los Nº ID SEC 4, 5)
Fig. 10: Secuencia de nucleótidos
(líneas superiores) y aminoácidos de un clon de manilasa
recombinante; (corresponde a los Nº ID SEC 6, 7)
Fig. 11: Vector de expresión de E.
Coli para manilasa
Fig. 12: Plásmido donante de
baculovirus para manilasa
Fig. 13: Vector de expresión de
levadura para manilasa
La invención se describe con detalle mediante
los siguientes ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos no limitan la
invención a los materiales, métodos, parámetros físicos, compuestos,
materiales biológicos, vectores de expresión y huéspedes, etc.
generales usados en los métodos e indicados en los ejemplos. Si no
se menciona otra cosa, se usaron técnicas estándar bien conocidas
en la especialidad anterior y material disponible generalmente.
Se llevó a cabo un número de experimentos
preliminares usando extractos en bruto de Hirudinaria
manillensis para establecer el procedimiento de purificación.
Los siguientes métodos se eligieron y verificaron: procedimiento de
precipitación con sulfato, cromatografía de intercambio catiónico y
aniónico; cromatografía de afinidad con la ayuda de
heparina-Fractogel, Con A-Sepharose,
cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) sobre
octil-Sepharose, propil-, fenil-,
butil-Fractogel, enfoque isoeléctrico preparativo y
electroforesis preparativa. Los resultados muestran que la
precipitación con ácido y amonio, el intercambio catiónico y la
cromatografía con Con A-Sepharose,
propil-Fractogel HIC y
diol-LiChrospher y fragmentos de ácido
hialurónico-Sepharose (HA-Sepharose)
son adecuados para la purificación de la manilasa. La matriz de
HA-Sepharose preparada en el laboratorio se usó
satisfactoriamente para la purificación de esta glicosidasa. Todas
las preparaciones se llevaron a cabo en frío a no ser que se
mencione otra cosa. La purificación se realizó de acuerdo con el
esquema mostrado anteriormente (Tabla 1).
Sanguijuelas Hirudinaria manillensis
recogidas en Bangladesh se congelaron por choque inmediatamente y a
continuación se almacenaron a de -40ºC a -80ºC. Se decapitaron en
estado congelado, dando cuenta el peso de las cabezas de alrededor
de 5% del cuerpo.
En una purificación representativa, 1 kg de
cabezas de sanguijuela congeladas se homogeneizó en un mezclador
Waring con 2500 ml de tampón de ácido acético 0,1 M, pH 4,0, frío
que contenía timerosal al 0,025% y 17 mg/ml de trehalosa (Merck
KGaA, Art. Nº 1.08216). El homogenado se agitó suavemente y se
añadieron inmediatamente los siguientes inhibidores de
proteasa:
1. PMSF | 1,7 ng/ml | 10,0 mM |
2. Leupeptina | 10,0 \mug/ml | 20,0 \muM |
3. Pepstatina A | 0,7 \mug/ml | 1 \muM |
4. EGTA | 380,35 \mug/ml | 1,0 mM |
5. p-APMSF | 40,0 \mug/ml | 20,0 \muM |
La agitación se continuó durante 4 horas en frío
y se centrifugó a 4900 rpm durante 20 minutos. La solución de
sobrenadante (sobrenadante I) se recogió y se combinó con el
sobrenadante II obtenido subsiguientemente extrayendo el nódulo de
tejido.
Los sobrenadantes combinados representan el
material de la Fase I.
El procedimiento se resume en el siguiente
esquema:
\vskip1.000000\baselineskip
* La determinación de la actividad y la
caracterización bioquímica de las muestras se realizó con la ayuda
de una prueba de determinación de
actividad-reducción de turbidez y determinación del
contenido de proteína (E_{280}, método BCA de Pierce,
SDS-PAGE). Era imposible medir la actividad
enzimática en el homogenado de sanguijuelas, debido al contenido
muy alto de hemoglobinas (medido con el estuche de determinación de
hemoglobina Merck KGaA, 13851) y otras proteínas. Por otra parte,
la actividad de hialuronidasa no podía medirse en la fase previa a
la precipitación con ácido. Las actividades específicas finales
(actividad por mg de proteína) de estos extractos eran
aproximadamente 10-30 unidades WHO. De acuerdo con
SDS-PAGE, los extractos en bruto contenían grandes
cantidades de diferentes proteínas, teniendo las principales un peso
molecular de \sim120, 55-60, 45, 31, 28, 22, 15 y
14-10.
A continuación, el procedimiento de
precipitación con sulfato amónico se eligió como la primera etapa de
la purificación de manilasa y daba como resultado un
enriquecimiento de \sim5 veces de esta enzima.
El material enzimáticamente inerte se precipitó
del extracto en bruto de la Fase I añadiendo lentamente sulfato
amónico sólido (Merck KGaA) hasta 36% p/v a +4ºC. Esta mezcla se
agitó durante 1 hora y se centrifugó. El precipitado se descartó.
El sobrenadante se dializó contra agua desionizada corriente durante
la noche y 24 horas contra tampón de fosfato 20 mM, pH 6,0. Las
actividades específicas finales de estos extractos eran
aproximadamente 40-150 unidades WHO. De acuerdo con
SDS-PAGE, el extracto de la Fase II contiene grandes
cantidades de diferentes proteínas.
El intercambiador catiónico se usó en un modo de
adsorción discontinuo. Una muestra dializada rica en enzima (fase
II) se incubó durante la noche con 1 l de intercambiador catiónico
Fractogel EMD SO_{3}^{-} 650 (S), Merck KGaA, Art. Nº 16882.
Después de que la incubación se terminara mediante centrifugación,
el intercambiador catiónico se lavó con el tampón, se centrifugó de
nuevo y la columna de HPLC Superformace se rellenó con el gel.
Después de lavar la columna con tampón de fosfato 20 mM, pH 4,9, las
proteínas unidas se eluyeron de la columna con el mismo tampón de
fosfato sódico, pH 6,0, que contenía un gradiente lineal de 0 a 1 M
de NaCl. Las fracciones se recogieron cada 3 minutos (9 ml) y se
controló la absorbancia a 280 nm. La manilasa se eluyó a
concentraciones de NaCl de 0,15 a 0,18 M. Las actividades y los
contenidos de proteína de todas las fracciones se midieron y las
fracciones se combinaron y se dializaron durante la noche contra
tampón de fosfato 20 mM, pH 6,0, que contenía azida sódica y 17
mg/ml de trehalosa.
Se llevaron a cabo la determinación de la
concentración de proteínas, las actividades específicas de los
"combinados" y el análisis de SDS-PAGE. A
pesar de los rendimientos muy buenos (actividad) y la alta actividad
específica (unidades de actividad WHO por mg de proteína,
corresponde a UI), todavía se observaba una mezcla de muchas
proteínas mediante los resultados del análisis por
SDS-PAGE de las muestras. La cromatografía de
intercambio catiónico con la ayuda de Fractogel EMD SO_{3}^{-}
650 (S)® (Merck KGaA, Alemania) daba como resultado un factor de
purificación muy alto de \sim10 a 50. Esta etapa es muy eficaz
para reducir las impurezas de hemoglobina. Por otra parte, se ha
encontrado que el procedimiento discontinuo era una etapa inicial
muy útil para manejar grandes volúmenes de sobrenadante de la fase
II (5-16 l).
La purificación adicional de los combinados
ricos en enzima después del intercambiador catiónico se realizó con
la ayuda de cromatografía de afinidad de Con
A-lectina. Con A-Sepharose®
disponible comercialmente de Pharmacia Biotech, Art.
17-0440-01, se lavó con un tampón
acético 0,1 M + NaCl 0,5 M, pH 8,0; ácido bórico 0,1 M + Triton X
100 al 0,1%, pH 6,0, y finalmente con tampón acético 0,1 M + NaCl
0,5 M, pH 6,0. La muestra se dializó durante la noche contra tampón
acético 20 mM + NaCl 0,5 mM + CaCl_{2} 1 mM + MgCl_{2} 1 mM, pH
6,0 + MnCl_{2} 1 mM, aplicado a temperatura ambiente a una columna
de 1000 l de Con A y se eluyó 2 h con los 510 ml de tampón de ácido
acético 100 mM + NaCl 0,5 M + CaCl_{2} 1 mM + MgCl_{2} 1 mM, pH
6,0 + MnCl_{2} 1 mM.
Esto fue seguido por desorción con la ayuda del
mismo tampón que contenía
metil-\alpha-D-manopiranósido
0,5 M. La elución se controló continuamente a 280 nm. Las
fracciones de 3 ml que se habían recogido se analizaron con
respecto a la actividad de hialuronidasa. Las fracciones activas se
combinaron y se dializaron durante la noche contra tampón de
fosfato 20 mM, pH 6,0, que contenía azida sódica y 17 mg/ml de
trehalosa. Se llevaron a cabo la determinación de la concentración
de proteínas, las actividades específicas de los "combinados"
y el análisis por SDS-PAGE. Esta etapa era muy
eficaz para retirar el resto de la hemoglobina. La cromatografía
con Con A daba como resultado un factor de purificación de
4-10. Este factor difería, dependiendo de la calidad
del material de partida.
Se añadió sulfato amónico a combinados de Con A
activos para hialuronidasa hasta una concentración final de 2 M.
Las muestras se incubaron a continuación 1 h a temperatura ambiente
con 150 ml de propil-Fractogel EMD Propyl 650 (S)®,
Merck KgaA, Alemania, Art. Nº 1.10085, equilibrada con tampón de
fosfato 0,1 M, pH 7,0, que contenía sulfato amónico 2 M. Después de
que la incubación se acabara el gel se lavó dos veces con el mismo
tampón y se preparó la columna de HPLC-Superformance
(2,6 x 60 cm). Las proteínas unidas se eluyeron con tampón de
fosfato 0,1 M, pH 7,0. Las fracciones de 6 ml se recogieron cada 3
minutos, se dializaron directamente contra agua desionizada
(2-3 h) y a continuación contra tampón de fosfato 20
mM, pH 6,0. Las fracciones se ensayaron con respecto a la actividad
de hialuronidasa. Las fracciones activas se combinaron y se
dializaron durante la noche contra tampón de fosfato 20 mM, pH 6,0,
que contenía azida sódica y 17 mg/ml de trehalosa. Se llevaron a
cabo la determinación de las proteínas y la actividad de los
combinados.
El factor de purificación en esta etapa de
cromatografía era de aproximadamente 3 a 5. Una pequeña cantidad de
Con A liberada del gel portador en la etapa previa se retiró junto
con otras impurezas proteínicas.
Se disolvieron 7 g de ácido hialurónico en 1,25
l de tampón de acetato sódico 0,1 M que contenía NaCl 0,15 M y EDTA
0,5 mM, pH 5,2, mezclando durante la noche a 4ºC en presencia de
tolueno. Posteriormente, el pH de la solución que contenía HA se
ajustó hasta 5,2 y, después de calentar hasta 37ºC, se añadió
hialuronidasa de testículo bovino (Merck KGaA; 700 unidades
WHO/mg). Para 7 g de HA, se usaron 210 mg de enzima disuelta
inmediatamente antes de usar en 50 ml del tampón anterior. La
hidrólisis se dejó avanzar durante 30 minutos a 37ºC con agitación
constante y se terminó calentando durante 5 minutos a 100ºC en un
baño de agua a ebullición. La mezcla de reacción se clarificó a
través de centrifugación durante 30 minutos a 10000 g, el
experimento que contenía proteína desnaturalizada se descartó y el
sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum sobre el
cual se colocaba un precinto de fibra de vidrio. La solución
clarificada que contenía HA-oligosacáridos (HAOS)
se fraccionó mediante filtración a través de una membrana de
ultrafiltración Diaflo (Amicon) con valores de separación molecular
diferentes como sigue.
La solución que contenía HAOS procedente de la
etapa previa se filtró a través de una membrana de ultrafiltración
Diaflo 30 YM. El retenido se apartó para otros estudios mientras que
el filtrado se sometía a la segunda ultrafiltración a través de la
membrana de ultrafiltración Diaflo 10 YM. De nuevo, el retenido se
apartó para otros estudios mientras la solución que pasaba a través
de 10 YM se sometía a la última ultrafiltración a través de una
membrana Diaflo 3YM. Posteriormente, el retenido que contenía
HA-OS, aproximadamente 10 ml de la solución, se usó
para la purificación adicional. Esta fracción: HAOS
3-10 se purificó como sigue y se usó adicionalmente
para el acoplamiento a Sepharose.
HA-OS 3-10 se
purificó (desaló) en una columna Biogel P2®. Esta columna (4 cm x
100 cm) se rellenó con Biogel 2 medium®, malla
200-400 (BioRad) y se lavó con 5 volúmenes de
columna de agua (Milli Q, Millipore). La fracción HAOS
3-10 obtenida de la etapa previa (15 ml; 1,5 g de
oligosacáridos) se aplicó a esta columna. La columna se eluyó con
agua; la fracción de 15 ml se recogió y se analizó con respecto a la
presencia de HA-oligosacáridos. Las fracciones que
contenían oligosacáridos eluidas antes de las sales (las últimas
detectadas con AgNO_{3}) se combinaron y se concentraron de nuevo
en una membrana Diaflo 3YM.
Para determinar la eficacia de acoplamiento de
la Sepharose, el gel (la misma partida) se lavó y se suspendió en
agua, para preparar una suspensión al 50%. A partir de la suspensión
de conjugado de Sepharose-HAOS 3-10
y Sepharose usada como un control, partes alícuotas de 100 \mul se
extrajeron por triplicado y se añadieron a 2,5 ml de ácido
trifluoroacético (TFA, Merck KgaA) 2,2 N en tubo con tapón de rosca
de teflón. Para la hidrólisis, la mezcla se barrió con argón y se
incubó a 100ºC durante 16 h. Al final de la hidrólisis, las muestras
se secaron bajo nitrógeno, se resuspendieron en agua y se usaron
para la determinación de glucosamina y ácido urónico. Para
determinar la extensión de la descomposición de ácido urónico y
glucosamina para cada una de las hidrólisis, se incluyeron muestras
de control que contenían cantidades conocidas de UA o GlcNAc y se
incubaron bajo las mismas condiciones.
Bajo las condiciones descritas anteriormente, se
acoplaron 5, 8, 9, 11 y 15 mg de HAOS 3-10 por 1 ml
de gel de Sepharose drenado en dos experimentos independientes.
Estos resultados se basan en los ensayos de UA y glucosamina.
El contenido del ácido urónico en las muestras
analizadas se determinó de acuerdo con Bitter T. y Muir H.M.,
Anal. Biochem., 1962, 4, 330-334.
Las cantidades de hexosamina se analizaron con
el método de Rondle C.J.M. y Morgan W.T.J., Biochem. J.,
1955, 61, 586-593.
Las matrices de cromatografía que contenían de 8
a 10 mg/ml se prepararon como se indica. La muestra que contenía la
enzima se analizó contra tampón acético 20 mM + NaCl 0,15 M, pH 4,0,
y se aplicó a la columna de 25 ml de HA-Sepharose.
Después de lavar con el mismo tampón, la elución se realizó con el
tampón acético 20 mM con un gradiente de 0,15 a 1 M de NaCl.
Las fracciones de 1 ml se probaron en la prueba
de determinación de actividad de hialuronidasa, se combinaron, se
dializaron durante la noche contra tampón de fosfato 20 mM, pH 6,0,
que contenía azida sódica y 17 mg/ml de trehalosa. Se llevaron a
cabo la determinación de la proteína y la actividad de los
combinados. El factor de purificación de esta etapa de
cromatografía era aproximadamente 3.
Una muestra activa de 20 ml dializada contra
Milli-Q-H_{2}O se aplicó en la
columna de diol-LiChrospher. La columna se
equilibró a continuación con 15 ml de
Milli-Q-H_{2}O y se lavó 5 minutos
con 2 ml de agua. La elución de la muestra activa se realizó 15
minutos con tampón acético 20 mM, pH 5,9 (gradiente, NaCl de 0 a 5
mM) y 35 minutos con gradiente de ácido acético 20 mM a 100 mM, pH
5,5, que contenía NaCl 5 mM. Las fracciones se ensayaron con
respecto a la actividad de hialuronidasa. Las fracciones activas se
combinaron y se dializaron durante la noche contra tampón de
fosfato 20 mM, pH 6,0, que contenía azida sódica y 17 mg/ml de
trehalosa. Se llevó a cabo la determinación de proteína y actividad
de los combinados. El factor de purificación: 3.
Esta etapa de purificación puede usarse
solamente como la última y está destinada a obtener la muestra libre
de sales y otras impurezas proteínicas (por ejemplo, inhibidores de
proteasa peptídicos). La actividad de hialuronidasa se perdía
completamente, debido a que la manilasa no es resistente a
disolventes orgánicos usados en esta etapa. La muestra de manilasa
se aplicó a la columna RP 18e. Las fracciones de 0,25 ml/minuto se
recogieron. La elución se realizó en presencia de TFA al 0,1% y se
usó gradiente de agua hasta 99% de acetonitrilo. Las muestras
purificadas por RP pueden usarse directamente para la secuenciación
de aminoácidos, la medida de MALDI, el análisis de la estructura de
carbohidratos y como patrón para la purificación de otras partidas
de manilasa.
La determinación de la actividad de
hialuronidasa se realizó con las medidas de la reducción de la
turbidez. Preparaciones de hialuronano disponibles comercialmente
(aisladas de los diferentes tejidos y fluidos animales, por ejemplo
cordón humano, cresta de gallo) y hialuronidasas
(endo-\beta-glucosaminidasas de
testículo bovino, testículo porcino, veneno de abeja; liasas de
Streptomyces hyalurolyticus) se usaron para establecer
condiciones adecuadas para ensayos de actividad. La
endo-\beta-glucuronidasa de
Hirudo medicinalis se purificó parcialmente en el
laboratorio.
Se preparó solución de reserva de hialuronano
(concentración 2 mg/ml) disolviendo HA en tampón de fosfato 0,3 M,
pH 5,3. Esta solución se diluyó con el mismo tampón hasta una
concentración de 0,2 mg/ml directamente antes de la prueba. Las
muestras que contenían enzima se diluyeron hasta una cantidad
apropiada de enzima (0,5-5 unidades WHO) con tampón
de fosfato 20 mM que contenía 0,01% de albúmina bovina y 77 mM de
NaCl (tampón de dilución de enzima). Se añadieron 0,1 ml de
solución de hialuronano (0,2 mg/ml) a 0,1 ml de estas muestras, se
mezclaron y se incubaron 45 minutos a 37ºC. La prueba se realizó por
duplicado. La reacción se detuvo mediante dilución con 1,0 ml de
reactivo de albúmina (0,1% de albúmina disuelto en ácido acético 80
mM/tampón de acetato sódico 40 mM, pH 3,75). Después de una
incubación de 10 minutos a TA o 37ºC, se leyó la densidad óptica a
60 nm y la actividad se expresó en unidades WHO (UI) mediante
comparación (programa SLT) con un patrón. La preparación WHO de
hialuronidasa testicular bovina (Humphrey J.H., Bull. World Health
Org. 1957, 16, 291-294) se usó como patrón.
El contenido de proteína de los eluyentes de la
columna se determinó midiendo la absorbancia ultravioleta de
soluciones a 280 nm. La concentración de proteína de las fracciones
combinadas se determinó con la ayuda del micrométodo de Pierce. La
solución de BSA se usó como una proteína de referencia.
La electroforesis se realizó de acuerdo con el
procedimiento de Laemmli (Nature, 1970, 227,
680-685). Se usaron los siguientes geles: gradiente
de 4 a 20% o geles de separación al 12,5% con gel de apilamiento al
4%. Las muestras se sometieron a electroforesis en presencia de
dodecilsulfato sódico y \beta-mercaptoetanol. Las
proteínas se visualizaron después de teñir con azul brillante de
Coomassie y/o tinción con plata (de acuerdo con la instrucción
de
Pharmacia).
Pharmacia).
Para llevar a cabo estudios de enfoque
isoeléctrico sobre la preparación de manilasa, se adoptó el
protocolo proporcionado por el suministrador (Pharmacia). Después
del enfoque, el gel se fijó y se tiñó con plata (de acuerdo con el
procedimiento de Pharmacia).
Los sueros de conejo se produjeron con el uso de
los siguientes inmunógenos: concanavalina A-lectina,
mezcla de hemoglobinas y conjugados de péptido-KLH.
La secuencia peptídica era idéntica a la de la parte
N-terminal de 14 aminoácidos de la manilasa
(KEIAVTIDDKNVIA).
Los sueros se purificaron sobre la columna de
proteína A-Sepharose (Pharmacia,
17-0780-01) de acuerdo con la
instrucción de Pharmacia estándar. La pureza de las muestras de IgG
se verificó con la ayuda de SDS-PAGE y la prueba de
ELISA.
Partes alícuotas adecuadas de las muestras y
marcador proteínico preteñido de peso molecular conocido se
sometieron a SDS-PAGE según se describe
anteriormente. Se usó un marcador del peso molecular BioRad
preteñido. La proteína se transfirió electroforéticamente desde
geles de poliacrilamida (0,8 mA/cm^{2}) hasta membranas de
poli(difluoruro de vinilo) (PVDF) inmóviles en presencia de
tampón de transferencia durante 100 minutos. La membrana de PVDF se
incubó con solución de bloqueo (PBS, pH 7,5 + 2% de leche desnatada)
durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, la membrana se
incubó 2 h a temperatura ambiente con el anticuerpo, diluido
apropiadamente con la solución de bloqueo. La membrana se lavó con
TBS + Tween 20 al 0,05%, pH 7,5, y se incubó durante 2 h a
temperatura ambiente con conjugado (un segundo anticuerpo)
anti-conejo caprino-fosfatasa
alcalina, BioRad. La membrana se lavó dos veces con TBS + Tween 20
y se incubó 10 minutos con solución de sustrato de
BCIP-fosfatasa alcalina. Añadir un tampón de parada
terminaba la reacción.
La secuencia de 33 residuos de aminoácido
N-terminal de la manilasa se obtuvo mediante
degradación de Edman. Después de la SDS-PAGE de
muestras activas para manilasa, las bandas se transfirieron sobre
membrana de PDVF, se tiñeron con azul de Coomassie, se cortaron y
se sometieron a secuenciación. La misma secuencia de aminoácidos se
encontró para la muestra obtenida después de la última etapa de
purificación con la ayuda de cromatografía en columna RP.
Las muestras de hialuronidasa usadas en este
experimento se extrajeron de cabezas de sanguijuela Hirudinaria
manillensis o Hirudo medicinales y se purificaron
parcialmente con la ayuda de precipitación con sulfato amónico y
cromatografía de intercambio catiónico. Cada muestra que contenía
500 unidades WHO/ml se incubó a -20ºC, +4ºC y 37ºC a un intervalo
de pHs de 2,6 a 9,0 (ácido acético 20 mM para pH 2,6 a 5; tampón de
fosfato 20 mM para pH 5 a 9). La actividad enzimática se midió
después de períodos de incubación de 1, 2 y 7 días. En los extremos
tanto ácido como alcalino de pH, se observó la inhibición de la
actividad hasta la misma extensión para ambas hialuronidasas. Sin
embargo, durante períodos de incubación más prolongados, la manilasa
era más estable que la hialuronidasa de Hirudo medicinalis:
por ejemplo, después de 7 días de incubación a pH 7,0 a 4ºC y 37ºC
la manilasa retenía 75% y 60% de la actividad de partida,
respectivamente. La hialuronidasa de Hirudo medicinalis
incubada a las mismas condiciones ya era inactiva después de 1
día.
Las muestras de 5 kU/ml de manilasa,
hialuronidasa de Hirudo medicinalis y testículo bovino se
diluyeron con plasma citratado de perro o rata hasta una
concentración final de 250 U/ml. A continuación, estas soluciones
se incubaron a -20ºC, +4ºC y 37ºC durante de 0 a 7 días. Los
controles que contenían las mismas hialuronidasas, diluidos en
tampón, se incluyeron en este experimento. Finalmente, se midió la
actividad de hialuronidasa.
En cada fase del procedimiento de purificación
para hialuronidasa de sanguijuela, la preparación se verificó para
otras enzimas capaces de degradar proteína con la ayuda del sustrato
de proteasa universal (Boehringer Mannheim, cat. Nº 1080 733) de
acuerdo con Twining S.S.(Anal. Biochem., 1984, 143,
30-34).
La segmentación de un hialuronano mediante
hialuronidasas da como resultado la liberación de azúcares
reductores. La cantidad de los azúcares liberados se midió
colorimétricamente mediante el método modificado de Park (Park J.
& Johnson M.; J. Biol. Chem. 1949, 181, 149). Para la medida de
la influencia de la heparina sobre la actividad de manilasa y
hialuronidasa de testículo bovino, se llevaron a cabo dos
determinaciones de la actividad: una en presencia de heparina y la
segunda sin heparina. Muestras de hialuronidasa de 25 \mul (3,2
unidades WHO) se incubaron 30 minutos a 37ºC con 25 \mul de la
solución de heparina (Liquemin, Fa. Hoffmann LaRoche), que contenía
de 0 a 24 unidades de heparina. A continuación, se añadieron 50
\mul de hialuronano (2,5 mg/ml) y la incubación se continuó
durante 30 minutos a 37ºC. La reacción se terminó calentando durante
2 minutos a 100ºC. A continuación, se añadieron al digesto
inactivado 100 \mul de solución de
carbonato-cianuro y 100 \mul de solución de
ferricianuro potásico. Las muestras se calentaron en un baño de agua
a ebullición durante 15 minutos y a continuación se enfriaron en un
baño de hielo. Posteriormente, se añadieron a las mezclas de
reacción 0,75 \mul de solución de sulfato
férrico-amónico. Después de 15 minutos de incubación
a TA, el color desarrollado se midió a 690 nm en un
espectrofotómetro Shimadzu. Blancos y controles sin enzima adecuados
se incluyeron en cada ensayo. El azúcar reductor esperado (ácido
glucurónico o N-acetil-glucosamina,
de 1 a 15 \mug) para el tipo de muestra bajo análisis se usó como
patrón.
Las muestras de manilasa se desglicosilaron con
la ayuda de enzima PNGasa F (BioLabs Art. Nº 701 L) de acuerdo con
la instrucción del suministrador. La desglicosilación se realizó
bajo condiciones desnaturalizantes y naturales. Los tratamientos
con O-glicanasa, neuraminidasa y neuraminidasa +
O-glicanasa se realizaron de acuerdo con
prescripciones estándar de Boehringer Mannheim. Todas las muestras
se caracterizaron con la SDS-PAGE y la prueba de
determinación de la actividad.
Para la expresión en E. coli se usó una
versión modificada del plásmido pASK75, que tiene la región
promotora tet {Skerra, Gene 151, (1994),
pp131-135}. La modificación se realizó clonando un
nuevo conector entre los sitios XbaI y Hind III. El nuevo conector
contiene la secuencia líder ompA, otro sitio de clonación múltiple
y una etiqueta 6xHis en lugar de la etiqueta strep.
\newpage
Secuencia del conector que se clonaba en
pASK75.
Para construir el vector de expresión para
manilasa, era necesario introducir sitios de restricción Cla I 5' y
Eco47III 3' mediante el método de PCR. Por lo tanto, se usaron los
dos cebadores
El producto de PCR se clonó en primer lugar en
el sistema vectorial PCR II (Invitrogen) y se sometió a
secuenciación.
En una segunda etapa el gen de manilasa se clonó
en el vector pASK75 modificado usando los sitios de restricción
ClaI 5' y Eco47III 3'.
Después de expresar y probar la actividad de
esta manilasa recombinante en una segunda reacción de PCR, la
etiqueta His se retiró y el codón de iniciación del gen de manilasa
se fusionó directamente a la secuencia líder omp A. Los cebadores
para esta reacción de PCR eran:
Para la expresión de manilasa en el sistema de
expresión de baculovirus, se usó el
Bac-To-Bac™ Baculovirus Expression
System de Gibco Life Technologies. Para obtener un sistema de
secciones, la secuencia líder de melitina de abeja de miel se
fusionó al gen de manilasa y para introducir los sitios de
restricción BamHI 5' y KpnI 3' se llevó a cabo una sola reacción de
PCR.
El producto de PCR se clonó en el vector PCR II
(Invitrogen) y se sometió a secuenciación. A continuación, la
fusión melitina-manilasa se clonó en el vector
pFastBac usando los sitios de restricción BamHI 5' y KpnI 3' (Fig.
12).
Para la expresión en levadura se usó el sistema
de expresión de múltiples copias de Pichia (Invitrogen). Para
construir el vector de expresión para manilasa se usó el método de
amplificación por PCR del gen de manilasa de tal modo que se
generan extremos de restricción compatibles (EcoR I 5', Not I 3')
para la ligación en el vector apropiado (pPIC9K). Por lo tanto, se
usaron los siguientes cebadores:
Antes de transformar los esferoplastos de
Pichia, el vector de expresión tiene que linealizarse con Sal
I.
En el vector de expresión pRG72, que contiene el
gen estructural de sarastatina fusionado a la secuencia líder ompA,
se transformó en células competentes W3110. Las células se hicieron
crecer hasta una fase semilogarítmica y el promotor se indujo a
continuación añadiendo 200 \mug de aTC/l. Una hora después la
manilasa recombinante podía detectarse claramente.
El plásmido donante pTD13 se transformó en
células competentes DH10Bac que contienen el bácmido con un sitio
de etiqueta mini-attTn7 y el plásmido cooperador. El elemento
mini-Tn7 en el plásmido donante puede transponerse
hasta el sitio diana mini-attTn7 en el bácmido en presencia
de proteínas de transposición proporcionadas por el plásmido
cooperador. Colonias que contienen bácmidos recombinantes se
identificaron mediante ruptura del gen lacZ. DNA
mini-prep de alto peso molecular se preparó a partir
de clones de E. coli seleccionados que contenían el bácmido
recombinante y este DNA se usó a continuación para transfectar
células de insecto.
Una descripción detallada podría encontrarse en
el manual de instrucciones del estuche de expresión.
Para asegurarse de tener integrado el gen de
manilasa las colonias tienen que rastrearse con respecto a los
mutantes His^{+} Mut^{+}.
Usando una sola colonia, se inoculan 100 ml de
medio en un matraz de 1 l. Las condiciones de crecimiento son
28-30ºC, 250 rpm, hasta una DO de
2-6. Para inducir la expresión, en primer lugar se
centrifuga el cultivo, se decanta hasta el sobrenadante y se
resuspende el nódulo celular en nuevo medio usando 1/5 del volumen
de cultivo original. Se añade metanol al 100% hasta una
concentración final de 0,5% cada 24 horas para mantener la
inducción. Después de un máximo de 6 días el sobrenadante se analiza
mediante SDS-PAGE y se ensaya la actividad.
<110> Merck PAten GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Hialuronidasa de la Hirudinaria
manillensis,
\hskip1cmaislamiento, purificación y método
\hskip1cmrecombinante de producción
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Manilasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 488
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sanguijuela
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1464
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sanguijuela
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1464)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (667)..(669)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Tyr o Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 488
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sanguijuela
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1464
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sanguijuela
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1464)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1348)..(1350)
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<220>
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador 5'
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<400> 8
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador 3'
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador 5'
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador 3'
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador 5'
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador 3'
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<223> Descripción de la Secuencia
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador 3'
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<400> 15
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\hfill32
Claims (12)
1. Una proteína purificada aislada de la especie
de sanguijuela Hirudinaria manillensis que tiene la actividad
biológica de una hialuronidasa que no está inhibida por heparina,
la proteína tiene las siguientes propiedades
- (a)
- un peso molecular de 53-60 kDa dependiente de la glicosilación,
- (b)
- un óptimo de actividad enzimática a pH 6,0-7,0,
- (c)
- un punto isoeléctrico de 7,2-8,0,
- (d)
- una actividad de retención de 60% a 37ºC después de 7 días y de 100% después de 7 días en presencia de suero de perro, y
- (e)
- una actividad enzimática específica de más de 100 kU/mg de proteína.
2. Una proteína purificada de acuerdo con la
reivindicación 1, obtenible mediante las siguientes etapas
- (i)
- homogeneizar cabezas de sanguijuelas de dicha especie con un tampón ácido seguido por centrifugación,
- (ii)
- precipitación del sobrenadante de la etapa (i) con sulfato amónico al 36%,
- (iii)
- usar cromatografía de intercambio catiónico para la purificación del sobrenadante de la etapa (i),
- (iv)
- usar cromatografía de afinidad con concanavalina A para la purificación de fracciones combinadas de la etapa (iii),
- (v)
- usar cromatografía de interacción hidrófoba para la purificación de fracciones combinadas de la etapa (iv),
- (vi)
- usar cromatografía de afinidad sobre matrices revestidas con fragmentos de ácido hialurónico para la purificación de fracciones combinadas de la etapa (v), y
- (vii)
- usar cromatografía de penetración en gel para la purificación de fracciones combinadas de la etapa (vi).
3. Una proteína purificada de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, que tiene la secuencia de aminoácidos que se
representa en la Fig. 7 y en Nº ID SEC 1.
4. Una proteína glicosilada de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que tiene un
peso molecular de 58 kDa (\pm2).
5. Una molécula de DNA que codifica para una
proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1-4, que tiene una de las secuencias de nucleótidos
que se representan en la Fig. 8 (Nº ID SEC 2), la Fig. 9 (Nº ID SEC
4) y la Fig. 10 (Nº ID SEC 6).
6. Un vector de expresión que comprende una
secuencia de DNA de acuerdo con la reivindicación 5.
7. Una célula huésped adecuada para la expresión
de la proteína que se especifica en cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, que comprende el vector de
acuerdo con la reivindicación 6.
8. Una composición farmacéutica que comprende
una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1-4 y un diluyente, portador o excipiente
farmacéuticamente aceptable.
9. La composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 8, que comprende adicionalmente un compuesto
farmacológicamente activo.
10. La composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 9, en la que el compuesto farmacológicamente
activo es heparina.
11. El uso de una proteína de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos del
miocardio, cardiovasculares y trombóticos y tumores.
12. Un método para aislar y purificar la
proteína de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las
etapas:
- (i)
- homogeneizar cabezas de sanguijuelas de dicha especie con un tampón ácido seguido por centrifugación,
- (ii)
- precipitar el sobrenadante de la etapa (i) con sulfato amónico,
- (iii)
- usar cromatografía de intercambio catiónico para la purificación del sobrenadante de la etapa (i),
- (iv)
- usar cromatografía de afinidad con concanavalina A para la purificación de fracciones combinadas de la etapa (iii),
- (v)
- usar cromatografía de interacción hidrófoba para la purificación de fracciones combinadas de la etapa (iv),
- (vi)
- usar cromatografía de afinidad sobre matrices revestidas con fragmentos de ácido hialurónico para la purificación de fracciones combinadas de la etapa (v), y
- (vii)
- usar cromatografía de penetración en gel para la purificación de fracciones combinadas de la etapa (vi).
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