ES2258976T3 - Hialuronidasa de la hirudinaria manillensis, aislamiento, purificacion y metodo recombinante de produccion. - Google Patents

Hialuronidasa de la hirudinaria manillensis, aislamiento, purificacion y metodo recombinante de produccion.

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ES2258976T3 ES00947835T ES00947835T ES2258976T3 ES 2258976 T3 ES2258976 T3 ES 2258976T3 ES 00947835 T ES00947835 T ES 00947835T ES 00947835 T ES00947835 T ES 00947835T ES 2258976 T3 ES2258976 T3 ES 2258976T3
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Abstract

Una proteína purificada aislada de la especie de sanguijuela Hirudinaria manillensis que tiene la actividad biológica de una hialuronidasa que no está inhibida por heparina, la proteína tiene las siguientes propiedades: (a) un peso molecular de 53-60 kDa dependiente de la glicosilación, (b) un óptimo de actividad enzimática a pH 6,0-7,0, (c) un punto isoeléctrico de 7,2-8,0, (d) una actividad de retención de 60% a 37ºC después de 7 días y de 100% después de 7 días en presencia de suero de perro, y (e) una actividad enzimática específica de más de 100 kU/mg de proteína.

Description

Hialuronidasa de la Hirudinaria manillensis, aislamiento, purificación y método recombinante de producción.
La presente invención se refiere al aislamiento, la purificación y la caracterización de una nueva hialuronidasa que deriva de la sanguijuela tropical Hirudinaria manillensis. Por lo tanto, de acuerdo con esta invención la nueva enzima se denomina "manilasa". Además, la invención trata del método recombinante de producción de manilasa que incluye la descripción de secuencias de DNA y aminoácidos así como de vectores de expresión y sistemas huésped. Finalmente, la invención se refiere al uso de manilasa con propósitos terapéuticos, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades del miocardio, episodios trombóticos y tumores.
El ácido hialurónico o hialuronano (HA) es un glicosaminoglicano lineal no ramificado de alto peso molecular (2-6 x 10^{6}), compuesto por una estructura de disacárido repetida GlcNAc(\beta1-4)GlcUA. Sus grupos carboxilo están completamente ionizados en el pH imperante de los fluidos extracelulares, ya sea normal o patológico. El HA pertenece junto con los sulfatos de condroitina, los sulfatos de queratano y las heparinas al grupo de glicosaminoglicanos (Jeanloz R. W., Arthr Rheum., 1960, 3, 233-237). En contraste con otros glicosaminoglicanos (GAG) no modificados, no tiene substitución de sulfato o péptido enlazado covalentemente, y habitualmente su longitud de cadena y peso molecular son mucho mayores. El HA está ubicuamente distribuido en tejidos conectivos y se ha encontrado virtualmente en todas las partes del cuerpo después de la introducción de un método de fijación mejorado (Hellström S. y otros, 1990, Histochem. J., 22, 677-682) y el método histoquímico específico con el uso de péptidos que se unen a hialuronano (HABP). Asimismo, está presente durante el desarrollo y la madurez en tejidos de origen neuroectodérmico.
El termino hialuronidasa se refiere generalmente y de acuerdo con esta invención a una enzima, que actúa sobre el ácido hialurónico, independientemente de la actividad hacia otros sustratos.
La hialuronidasa se aisló en primer lugar de microorganismos y más tarde de testículo de mamífero que es ahora su fuente principal (Meyer K. en The Enzyme, 1971, 307).
De acuerdo con el mecanismo de reacción, las hialuronidasas se dividieron en tres grupos principales.
En el primer grupo se combinan enzimas microbianas que actúan sobre sus sustratos mediante \beta-eliminación produciendo disacáridos \Delta-4,5-insaturados. Por lo tanto, la enzima debe denominarse hialuronato liasa, EC 4.2.99.1.
El segundo grupo, hialuronoglucosaminidasa o hialuronidasa de tipo testicular (EC 3.2.1.35), actúa como una endo-N-acetil-\beta-D-hexosaminidasa que degrada el HA hasta fragmentos menores, en primer lugar un tretrasacárido con el resto de hexosamina en el extremo reductor libre. Enzimas con propiedades similares a la hialuronidasa de testículo se han obtenido de renacuajos, veneno de serpiente, veneno de abeja, numerosos tejidos animales, suero humano y otras fuentes. Se sabe que la hialuronidasa de testículo también tiene actividad de transglicosilasa (Weissman B. y otros, J. Biol. Chem., 1954, 208, 417-429). Las enzimas pertenecientes a este grupo de hialuronidasa exhiben actividad enzimática no solo hacia el hialuronato sino también hacia el 4-sulfato de condroitina, el 6-sulfato de condroitina, la condroitina y el sulfato de dermatano.
El tercer grupo consiste en hialuroglucuronidasa (EC 3.2.1.36), que actúa como endo-\beta-glucuronidasa. Esta enzima se aisló de las sanguijuelas Hirudo medicinalis (Yuki H. y Fishman W.H.; J. Biol. Chem. 1963, 238, 1877-79) y es absolutamente específica para el HA. El sulfato de condroitina, el dermatano y la heparina no son sustratos para esta hialuronidasa. Degrada solo el ácido hialurónico hasta un tetrasacárido con el ácido glucurónico en el extremo reductor libre (Linker A. y otros, J. Biol. Chem, 1960, 235, 924-27). En oposición a las endo-\beta-glucosaminidasas de mamífero, la heparina no tiene influencia sobre la actividad de esta hialuronidasa de sanguijuela. Por lo tanto, puede coadministrarse a un paciente junto con una heparina y sus derivados usarse extensamente como anticoagulantes. Una endo-beta-glucuronidasa específica para ácido hialurónico (denominada "orgelasa") procedente de especies (Poecilobdella granulosa) de la subfamilia Hirudinariinae (incluyendo los géneros Hirudinaria, Illebdella, Poecilodbella, Sanguisoga) de sanguijuelas del búfalo se describió en EP 0193 330, teniendo un peso molecular de aproximadamente 28,5.
Las hialuronidasas tienen muchas aplicaciones prácticas in vivo e in vitro. La administración intravenosa de hialuronidasa se ha propuesto para el tratamiento del infarto de miocardio (Kloner R.A. y otros, Circulation, 1978, 58, 220-226; Wolf R.A. y otros, Am. J. Cardiol., 1984, 53, 941-944; Taira A. y otros, Angiology, 1990, 41, 1029-1036). El infarto de miocardio representa una forma común de lesión no mecánica; a saber daño celular grave y muerte, provocados en este caso por una hipoxia celular repentina. En un infarto de miocardio experimental inducido en ratas (Waldenström A. y otros, 1991, J. Clin. Invest., 88, 1622-1628), el contenido de HA del músculo cardíaco lesionado (área infartada) se incrementaba en 24 h para alcanzar casi tres veces el normal después de 3 días, y estaba acompañado por edema intersticial. El contenido de agua relativo de las áreas infartadas también se incrementaba progresivamente alcanzando un valor máximo alrededor del día 3 y se correlacionaba fuertemente con la acumulación de HA. La misma asociación de contenido de HA incrementado con edema se ha observado en el rechazo de trasplantes renales y cardíacos experimental (Hällgren R. y otros, J. Clin. Invest., 1990, 85, 668-673; Hällgren R. y otros, J. Exp. Med., 1990, 171, 2063-2076), en el rechazo de trasplantes renales humanos (Wells A. y otros, Transplantation, 1990, 50, 240-243), enfermedades pulmonares (Bjermer A. y otros, Brit. Med. J., 1987, 295, 801-806) y en fibrosis intersticial idiopática (Bjermer A. y otros, Thorax, 1989, 44, 126-131). Todos estos estudios proporcionan no solo evidencia de HA incrementado en la inflamación aguda, sino que demuestran su participación en la retención local de fluido principalmente responsable del hinchamiento de tejidos y que influye en las funciones tanto mecánicas como electrofisiológicas del corazón.
Estos resultados pueden explicar el mecanismo de la acción de las hialuronidasas usadas en experimentos clínicos. Se presentó que el tratamiento con hialuronidasas limitaba el daño celular durante la isquemia de miocardio en ratas, perros y hombres (Maclean D. y otros, Science, 1976, 194, 199). La degradación del HA puede estar seguida por la reducción de la acumulación de agua en los tejidos, la reducción de la presión tisular y finalmente una mejor perfusión.
Se ha mostrado que las hialuronidasas, así como extractos que contienen hialuronidasa procedentes de sanguijuelas, pueden usarse con otros propósitos terapéuticos. Así, la terapia con hiasas, sola o combinada con ciclosporina, daba como resultado una supervivencia prolongada de los injertos (Johnson C. y otros, Transplant Inter. en prensa). Las hiasas ("factor de extensión") en el sentido más amplio se usan para incrementar la permeabilidad de los tejidos para mejorar la difusión de otros agentes farmacológicos (por ejemplo, en combinación con citostáticos en el tratamiento de tumores cancerosos). Por otra parte, podría demostrarse que las hialuronidasas son útiles en la terapia de tumores actuando como un inhibidor de la angiogénesis y como un adyuvante para el aporte de fármacos local en el tratamiento de tumores, para el tratamiento del glaucoma y otros trastornos oculares y como auxiliar de otros agentes terapéuticos tales como anestésicos locales y antibióticos. Una vista general del uso terapéutico y la relevancia se da en el artículo de revisión de Farr y otros (1997, Wiener Medizinische Wochenschrift, 15, p. 347) y la literatura citada allí. Por lo tanto, existe una necesidad de un compuesto activo tal como hialuronidasa. Sin embargo, las hialuronidasas conocidas y disponibles no son estables (hialuronidasa de Hirudo medicinalis, Linker y otros, 1960, J. Biol. Chem. 235, p. 924 ; Yuki y Fishman, 1963, J. Biol. Chem. 238, p. 1877) o muestran una actividad específica bastante baja (EP 0193 330, Budds y otros, 1987, Comp. Biochem. Physiol., 87B, 3, p. 497). Por otra parte, ninguna de las hialuronidasas conocidas está disponible en forma recombinante, lo que es un requisito previo esencial para el uso comercial intensivo.
La invención describe ahora por primera vez una nueva hialuronidasa que se aisló y purificó de Hirudonaria manillensis, así como una versión recombinante de dicha enzima obtenida mediante técnicas de bioingeniería.
Así, un objetivo de esta invención es proporcionar una proteína purificada aislada de la especie de sanguijuela Hirudinaria manillensis que tiene la actividad biológica de una hialuronidasa que no está influida en su actividad por heparina y se caracteriza porque tiene un peso molecular de 53-60 kD dependiente de la glicosilación. La nueva proteína, que se denomina "manilasa", está glicosilada en su forma natural, teniendo un peso molecular de alrededor de 58 kD (\pm2 kD) y cuatro glicoformas. Sin embargo, la proteína no glicosilada también es el objetivo de la invención, obtenible mediante segmentación enzimática o química de los residuos de azúcar de acuerdo con técnicas estándar. La enzima no glicosilada de la invención tiene un peso molecular de aproximadamente 54 (\pm2) según se mide mediante SDS-PAGE.
La comparación directa muestra que la hialuronidasa descrita en EP 0 193 330 ("orgelasa") tiene bajo las mismas condiciones un peso molecular de aproximadamente 28 y contiene una gran cantidad de impurezas tales como hemoglobina.
La manilasa natural de acuerdo con esta invención tiene un óptimo de pH de 6,0-7,0, un punto isoeléctrico de 7,2-8,0 y tiene la secuencia de aminoácidos representada en la Fig. 7.
Sorprendentemente, la manilasa obtenida mediante un procedimiento de purificación preparativa (véase posteriormente) tiene una actividad específica extremadamente alta de 100-150, preferiblemente de 110-140 (WHO) kU/mg de proteína, mientras que la actividad específica de la orgelasa es aproximadamente solo 1,2 kU/mg. Por otra parte, la orgelasa tiene un óptimo de pH inferior (5,2-6,0) en comparación con la manilasa. La manilasa no está influida, como la orgelasa, por la heparina.
Por otra parte, un objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento para aislar y purificar manilasa, que comprende las siguientes etapas
(i)
homogeneización de cabezas de sanguijuelas de la especie Hirudinaria manillensis con un tampón ácido y centrifugación,
(ii)
precipitación con sulfato amónico del sobrenadante de la etapa (i),
(iii)
cromatografía de intercambio catiónico,
(iv)
cromatografía de afinidad con concanavalina A,
(v)
cromatografía de interacción hidrófoba,
(vi)
cromatografía de afinidad sobre matrices revestidas con fragmentos de ácido hialurónico,
(vii)
cromatografía de penetración en gel, y opcionalmente
(viii)
desglicosilación enzimática o química de la proteína purificada.
Las etapas del procedimiento descritas anteriormente garantizan que la proteína de acuerdo con la invención puede obtenerse con tal actividad enzimática biológica alta. Por lo tanto, un objetivo adicional de esta invención es proporcionar una proteína que tiene la actividad biológica de una hialuronidasa que no está influida en su actividad por heparina y que tiene un peso molecular de 53-60 dependiente de la glicosilación, que puede obtenerse mediante las etapas de procedimiento indicadas anteriormente y en las reivindicaciones y que tienen preferiblemente una actividad enzimática específica de > 100 kU/mg de proteína. El término "unidad" se refiere posteriormente y anteriormente a "unidades internacionales" (UI).
La invención describe un procedimiento para elaborar manilasa recombinante que incluye moléculas de DNA, vectores y células huésped transformadas respectivos.
Por lo tanto, un objetivo de esta invención es proporcionar una secuencia de DNA que codifica para una proteína que tiene las propiedades de la manilasa natural.
También podría mostrarse que podrían seleccionarse al menos tres clones adicionales con secuencias de DNA ligeramente diferentes que son codificados por proteínas con propiedades de manilasa (hialuronidasa) que tienen secuencias de aminoácidos ligeramente diferentes.
Los clones especificados tienen las secuencias de DNA representadas en las Figs. 8, 9 y 10 (secuencia superior) que son un objetivo de esta invención, así como vectores de expresión que contienen dichas secuencias y células huésped que estaban transformadas con dichos vectores.
Además, un objetivo de esta invención es proporcionar una proteína recombinante con la actividad biológica de una hialuronidasa y un peso molecular de 55-59 kD dependiente de la glicosilación, que tiene cualquier secuencia de aminoácidos representada en las Figs. 8, 9 y 10 (secuencia inferior) o una secuencia que tiene una homología con dichas secuencias de al menos 80%. El término "manilasa" incluye todas estas proteínas que tienen las propiedades especificadas anteriormente.
La proteína o las proteínas naturales así como las recombinantes pueden usarse como un medicamento que puede aplicarse a pacientes directamente o dentro de composiciones farmacéuticas. Así, un aspecto adicional de esta invención es proporcionar una proteína recombinante natural como la definida anteriormente y posteriormente aplicable como un medicamento y una composición farmacéutica respectiva que comprende dicha proteína y un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable para la misma.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden contener adicionalmente otros compuestos farmacéuticos activos de una gran diversidad. Agentes preferidos son anticoagulantes que no inhiben o influyen en la actividad biológica y farmacológica de la proteína de acuerdo con la invención. Tales anticoagulantes pueden ser, por ejemplo, heparina, hirudina o dicumarina, preferiblemente heparina. Así, un objetivo de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que comprende adicionalmente un compuesto farmacológicamente activo, preferiblemente heparina.
En relación con el uso en terapia humana o veterinaria, la proteína de acuerdo con esta invención actúa preferiblemente como agente dispersante (factor de "extensión") o apoya la penetración a través del tejido y la piel. Así, la manilasa puede usarse como un adyuvante de otras substancias (tales como un anestésico local), por ejemplo en el campo de la quimioterapia de tumores, para el tratamiento de trastornos y enfermedades con respecto a isquemia o infarto de miocardio agudos, para el tratamiento del glaucoma u otros trastornos oculares, por ejemplo para mejorar la circulación de fluidos fisiológicos en el ojo, para el tratamiento de injertos de piel y tejido para eliminar la congestión y mejorar la circulación, como sistema de aporte de fármacos a través de la piel, las membranas u otro tejido, como un agente para retirar la cápsula de ácido hialurónico que rodea ciertos microorganismos patógenos o ciertos tumores y tejidos cancerosos, y como un inhibidor de la angiogénesis que puede usarse como agente antitrombótico y antitumoral.
Por lo tanto, el uso de manilasa, según se define anteriormente y posteriormente, en la fabricación de un medicamento para tratar especialmente trastornos de miocardio, cardiovasculares y trombóticos y tumores es un objetivo de esta invención.
Según se usa aquí, el término "portador farmacéuticamente aceptable" significa una carga, un diluyente o un material encapsulante, sólidos o líquidos, atóxicos, inertes, que no reaccionan adversamente con el compuesto o con el paciente. Portadores preferiblemente líquidos adecuados son bien conocidos en la especialidad, tales como agua estéril, solución salina, dextrosa acuosa, soluciones de azúcar, etanol, glicoles y aceites, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de soja y aceite mineral.
Las formulaciones de acuerdo con la invención pueden administrarse como dosis unitarias que contienen portadores, diluyentes, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente atóxicos convencionales, que son típicos para la administración parenteral.
El término "parenteral" incluye aquí técnicas de inyección e infusión subcutáneas, intravenosas, intraarticulares e intratraqueales. Además, son adecuadas otras administraciones tales como la administración oral y la aplicación tópica. Las composiciones y combinaciones parenterales se administran lo más preferiblemente intravenosamente en una forma de bolo o como una fusión constante de acuerdo con procedimientos conocidos. Las tabletas y las cápsulas para administración oral contienen excipientes convencionales tales como agentes de unión, cargas, diluyentes, agentes de formación de tabletas, lubricantes, desintegrantes y agentes humectantes. Las tabletas pueden revestirse de acuerdo con métodos bien conocidos en la especialidad.
Otras preparaciones líquidas pueden estar en forma de suspensiones, soluciones, emulsiones, jarabes o elixires acuosos u oleosos, o pueden estar presentes como un producto seco para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de usar. Tales preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales como agentes de suspensión, agentes emulsionantes, vehículos no acuosos y conservantes. Las aplicaciones tópicas pueden estar en forma de suspensiones, soluciones, emulsiones, gelatinas o preferiblemente pomadas en emulsión, acuosas u oleosas.
Las dosis unitarias de acuerdo con la invención pueden contener cantidades requeridas diariamente de la proteína de acuerdo con la invención, o submúltiplos de las mismas para formar la dosis deseada. La dosificación y el grado de dosis terapéuticamente aceptables óptimos para un paciente dado (mamíferos, incluyendo seres humanos) depende de una variedad de factores, tales como la actividad del material activo específico empleado, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el momento y la ruta de administración, la velocidad de depuración, la actividad enzimática (unidades/mg de proteína), el objetivo del tratamiento, es decir la terapia o la profilaxis, y la naturaleza de la enfermedad que ha de tratarse.
Por lo tanto, en composiciones y combinaciones, tales como con anticoagulantes como heparina en un paciente tratado (in vivo), una dosis farmacéutica diaria eficaz de la proteína de esta invención (manilasa) está entre aproximadamente 0,01 y 100 mg/kg de peso corporal (basado en una actividad específica de 100 kU/mg), preferiblemente entre 0,1 y 10 mg/kg de peso corporal. De acuerdo con la forma de aplicación, una dosis simple puede contener entre 0,5 y 10 mg de manilasa.
La concentración de, por ejemplo, heparina cuando se administra junto con manilasa es típicamente 500-4000 U (UI) a lo largo de un día, sin embargo, puede incrementarse o disminuirse si es necesario.
La purificación de la manilasa de la invención se alcanzó como se describe con detalle en los ejemplos. La Tabla 1 representa un esquema de purificación preparativa de manilasa. La Tabla 2 muestra el procedimiento de enriquecimiento de la proteína de acuerdo con la invención y la Tabla 3 indica la comparación de manilasa con hialuronidasas de sanguijuela conocidas.
Una enzima, denominada manilasa, que segmenta el ácido hialurónico se ha aislado de las cabezas de sanguijuelas Hirudinaria manillensis y se ha purificado hasta la homogeneidad. Esta hialuronidasa se purificó usando extracción con ácido, precipitación con sulfato amónico, seguido por cromatografía sucesiva en columnas de intercambiador catiónico, concanavalina A-Sepharose, Propyl-Fractogel, fragmentos de hialuronano-Sepharose y diol-LiChrospher. Los fragmentos de hialuronano se prepararon mediante la segmentación del hialuronano natural con la ayuda de hialuronidasa de testículo bovino. Después de la purificación y la caracterización de los fragmentos, las matrices de afinidad se prepararon como se indica posteriormente. Tales matrices de afinidad se aplicaron por primera vez para la purificación de la hialuronidasa. Esta cromatografía de alta resolución es una técnica para la purificación rápida y eficaz de proteínas que se unen a hialuronano. La recuperación de la actividad enzimática después de cada etapa de purificación era razonablemente alta. Los resultados de las tres purificaciones preparativas independientes eran comparables. Daban como resultado muestras altamente activas que poseían entre 20 y 160 kU/mg dependiendo del grado de purificación. En experimentos de comparación, se aislaron hialuronidasas conocidas según se indica en la especialidad anterior y sus propiedades se compararon con la proteína de acuerdo con esta invención
(Tabla 3).
La hialuronidasa purificada de acuerdo con el esquema de la Tabla 1 difiere de otras hialuronidasas de sanguijuela descritas por otros autores. Se obtuvo un peso molecular similar bajo condiciones no disociativas (cualquier \beta-mercaptoetanol), indicando que la manilasa es una enzima de una sola subunidad en común con una amplia gama de preparaciones de hialuronidasa procedentes de fuentes de mamífero. Esta preparación final es una enzima de una sola subunidad (Fig. 1) de peso molecular aparente 58 \pm 2 determinado con la ayuda de MALDI, con un punto isoeléctrico de 7,2 a 8,0.
TABLA 1 Purificación preparativa de manilasa
1
TABLA 2 Purificación de manilasa (enriquecimiento) a partir de 1kg de cabezas de sanguijuela
2
TABLA 3 Comparación de manilasa con hialuronidasas de sanguijuela conocidas
3
Los asteriscos de las tablas significa información sobre la determinación de la actividad y la caracterización bioquímica (* - *****).
Los métodos de determinación de la actividad y caracterización bioquímica usados dependen de la concentración de manilasa en las muestras analizadas. Por lo tanto, se extendieron sucesivamente mediante las técnicas apropiadas en las etapas de purificación sucesivas.
*
- Determinación de la actividad - prueba de reducción de la turbidez
**
- Determinación de la actividad - prueba de reducción de la turbidez
\quad
- Determinación del contenido de proteína (E_{280}, método BCA de Pierce)
\quad
- SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS)
\quad
- Determinación de hemoglobina
***
- Determinación de la actividad - prueba de reducción de la turbidez
\quad
- Determinación del contenido de proteína (E_{280}, método BCA de Pierce)
\quad
- SDS-PAGE-Transferencia Western (anticuerpo anti-hemoglobina humana)
****
- Determinación de la actividad - prueba de reducción de la turbidez
\quad
- Determinación del contenido de proteína (E_{280}, método BCA de Pierce)
\quad
- SDS-PAGE-Transferencia Western, anticuerpo anti-hemoglobina humana
\quad
- SDS-PAGE-Transferencia Western, anticuerpo anti-Con A
\quad
- SDS-PAGE-Transferencia Western, anticuerpos anti-péptido
*****
- MALDI
\quad
- Determinación del contenido de proteína (método BCA de Pierce)
\quad
- SDS-PAGE-Transferencia Western, anticuerpos anti-péptido
\vskip1.000000\baselineskip
La unión de manilasa a concanavalina A muestra que esta hialuronidasa es una glicoproteína, cuyos componentes de azúcar están terminados con \alpha-D-manopiranosilo o \alpha-D-glucopiranosilo y residuos estéricamente relacionados. Las muestras activas para manilasa mostraban dos bandas con valores de RF casi idénticos en SDS-PAGE. Se usaron SDS-PAGE más larga y diferentes condiciones de recorrido para una mejor separación de las bandas. En estos experimentos, podían detectarse dos bandas más débiles adicionales (Fig. 2). La parte N-terminal de todos ellos (30 aminoácidos) se sometió a secuenciación individualmente y de nuevo mostraba diferencia en el extremo N. Después de la desglicosilación con la endo-F-glicosidasa (PNGasa) se observó que las cuatro bandas daban como resultado una sola banda, con una reducción en el PM de aproximadamente 3.
Por lo tanto, es bastante probable que las diferencias observadas en la movilidad electroforética se deban a diferencias en el patrón de glicosilación de las moléculas de manilasa. Los tratamientos con neuraminidasa, O-endo-glicosidasa y neuraminidasa más O-glicosidasa no tenían influencia sobre el peso molecular de la enzima purificada (Fig. 3). Estos resultados han mostrado que la manilasa contiene al menos una cadena de oligosacárido conectada en N. Las cadenas de carbohidrato conectadas en O no podrían detectarse con el método usado.
Como la etapa de purificación concluyente, se llevó a cabo la cromatografía RP. Aunque la actividad enzimática no podía detectarse ya más, las sales y los inhibidores de proteasa peptídicos podían retirarse (Fig. 4). Las fracciones que contenían proteína se caracterizaban adicionalmente con la ayuda de MALDI. El peso molecular de la manilasa determinado con la ayuda de MALDI era 58,3.
La heparina no tiene influencia sobre la actividad de esta hialuronidasa (Fig. 5). La manilasa es muchas veces más estable que la hialuronidasa de Hirudo medicinalis (Fig. 6). Por otra parte, las muestras de manilasa parcialmente purificada mostraban una estabilidad muy alta en el plasma de perros y ratas en el intervalo de -20 a +37.
La preparación de matrices de afinidad para HA se ha descrito en la literatura (Tengblad A., Biochim. Biophys. Acta, 1979, 578, 281-289). Esta matriz de HA se usó para la purificación de las proteínas que se unen a hialuronato del cartílago o el núcleo de sulfato de queratano de la proteína de proteoglicanos (Christner J. E., Anal. Biochem., 1978, 90, 22-32) a partir de la misma fuente. La proteína que se une a HA (HABP), purificada con la ayuda de esta matriz de afinidad, se usó adicionalmente en estudios histoquímicos relativos a la distribución de los receptores de hialuronato (Green S.J. y otros, J. Cell Science, 1988, 89, 145-156; Chan F.L. y otros, J. Cell. Biol.,1997, 107, 289-301) o hialuronano (Waldenström A. y otros, 1991, J. Clin. Invest., 88, 1622-1628; Waldenström A. y otros, Eur. J. Clin. Invest., 1993, 23, 277-282) en los tejidos.
Sin embargo, el método de preparación de este gel desarrollado en el laboratorio por los presentes inventores permite producir geles de concentración exactamente definida de fragmentos de HA (de 1 a 15 mg/ml). Así, a su vez, permite usar tales geles no solo para la purificación de proteínas que se unen a hialuronano sino también para su separación, beneficiándose de su diferente afinidad para el hialuronano. Esta separación selectiva puede controlarse mediante el uso de fragmentos de HA de diferente longitud. Tal separación permitirá una mejor caracterización de muchos receptores de importancia biológica (por ejemplo, en oncología).
Matrices de HA preparadas de acuerdo con el método descrito pueden aplicarse para la:
1) purificación de proteínas que se unen a HA conocidas
2) purificación de proteínas que se unen a HA desconocidas
3) identificación de las nuevas proteínas que se unen a HA
4) purificación de hialuronidasas
Los fragmentos de HA obtenidos mediante el método descrito en la presente invención pueden caracterizarse con el uso de modernos métodos analíticos (NMR, MALDI-MS) y aplicarse en la búsqueda de interacciones proteína-proteína. Por otra parte, estos fragmentos pueden usarse en la búsqueda relacionada con procesos de angiogénesis y neovascularización.
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Breve descripción de las figuras
Fig. 1: Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE-tinción con CBB) de la proteína estándar, muestra de manilasa (después de la cromatografía en diol-LiChospher).
1
- patrón de proteínas de amplio intervalo
2
- manilasa, 4 \mug
3
- orgelasa, 6 \mug
4
- hemoglobina, 40 \mug
Fig. 2:
a)
SDS-PAGE (tinción con CBB) y
b)
SDS-PAGE - transferencia Western de cuatro muestras activas para manilasa (líneas 3-6) después de cromatografía de afinidad con HA. Se usó en este experimento anticuerpo policlonal anti-péptido P3-2A de conejo.
Fig. 3: SDS-PAGE (CBB) de las siguientes muestras:
1
- LW-MM - marcador de bajo peso molecular (BioRad)
2
- Manilasa
3
- N-glicosidasa F (PNGasa F)
4
- Manilasa después del tratamiento con PNGasa F
5
- Manilasa después del tratamiento con O-glicosidasa
6
- Manilasa después del tratamiento con O-glicosidasa y neuraminidasa
7
- O-glicosidasa y neuraminidasa
8
- marcador del peso molecular (BioRad preteñido con MWM)
\newpage
Fig. 4: Cromatografía en fase inversa de
a)
patrón de ribonucleasa
b)
muestra de manilasa (actividad específica 140 kU/mg)
Fig. 5: Influencia de la heparina sobre la actividad en hialuronidasa de manilasa (-\circ-) y hialuronidasa de testículo bovino (-\bullet-)
eje X: IU de heparina; eje Y: % de actividad restante
Fig. 6: Medida de estabilidad de hialuronidasas en tampón y plasma:
(a)
manilasa (4ºC), (b) manilasa (-20ºC)
(c)
manilasa (37ºC)
(d)
hialuronidasa de testículo bovino (Y) y hialuronidasa de Hirudo medicinalis (A)
eje X: días de incubación; eje Y: unidades WHO (UI)
Fig. 7: Secuencia de aminoácidos de manilasa natural obtenida sometiendo a secuenciación la proteína aislada y purificada procedente de Hirudinaria manillensis de acuerdo con la invención (corresponde al Nº ID SEC 1)
Fig. 8: Secuencia de nucleótidos (líneas superiores) y aminoácidos de un clon de manilasa recombinante; (corresponde a los Nº ID SEC 2, 3)
Fig. 9: Secuencia de nucleótidos (líneas superiores) y aminoácidos de un clon de manilasa recombinante; (corresponde a los Nº ID SEC 4, 5)
Fig. 10: Secuencia de nucleótidos (líneas superiores) y aminoácidos de un clon de manilasa recombinante; (corresponde a los Nº ID SEC 6, 7)
Fig. 11: Vector de expresión de E. Coli para manilasa
Fig. 12: Plásmido donante de baculovirus para manilasa
Fig. 13: Vector de expresión de levadura para manilasa
La invención se describe con detalle mediante los siguientes ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos no limitan la invención a los materiales, métodos, parámetros físicos, compuestos, materiales biológicos, vectores de expresión y huéspedes, etc. generales usados en los métodos e indicados en los ejemplos. Si no se menciona otra cosa, se usaron técnicas estándar bien conocidas en la especialidad anterior y material disponible generalmente.
Ejemplo 1 Notas Generales
Se llevó a cabo un número de experimentos preliminares usando extractos en bruto de Hirudinaria manillensis para establecer el procedimiento de purificación. Los siguientes métodos se eligieron y verificaron: procedimiento de precipitación con sulfato, cromatografía de intercambio catiónico y aniónico; cromatografía de afinidad con la ayuda de heparina-Fractogel, Con A-Sepharose, cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) sobre octil-Sepharose, propil-, fenil-, butil-Fractogel, enfoque isoeléctrico preparativo y electroforesis preparativa. Los resultados muestran que la precipitación con ácido y amonio, el intercambio catiónico y la cromatografía con Con A-Sepharose, propil-Fractogel HIC y diol-LiChrospher y fragmentos de ácido hialurónico-Sepharose (HA-Sepharose) son adecuados para la purificación de la manilasa. La matriz de HA-Sepharose preparada en el laboratorio se usó satisfactoriamente para la purificación de esta glicosidasa. Todas las preparaciones se llevaron a cabo en frío a no ser que se mencione otra cosa. La purificación se realizó de acuerdo con el esquema mostrado anteriormente (Tabla 1).
Ejemplo 2 Preparación del Material de Partida para la Purificación y Preparación de Cabezas de Sanguijuela
Sanguijuelas Hirudinaria manillensis recogidas en Bangladesh se congelaron por choque inmediatamente y a continuación se almacenaron a de -40ºC a -80ºC. Se decapitaron en estado congelado, dando cuenta el peso de las cabezas de alrededor de 5% del cuerpo.
Ejemplo 3 Procedimiento de Extracción de Manilasa de Cabezas de Sanguijuela
En una purificación representativa, 1 kg de cabezas de sanguijuela congeladas se homogeneizó en un mezclador Waring con 2500 ml de tampón de ácido acético 0,1 M, pH 4,0, frío que contenía timerosal al 0,025% y 17 mg/ml de trehalosa (Merck KGaA, Art. Nº 1.08216). El homogenado se agitó suavemente y se añadieron inmediatamente los siguientes inhibidores de proteasa:
1. PMSF 1,7 ng/ml 10,0 mM
2. Leupeptina 10,0 \mug/ml 20,0 \muM
3. Pepstatina A 0,7 \mug/ml 1 \muM
4. EGTA 380,35 \mug/ml 1,0 mM
5. p-APMSF 40,0 \mug/ml 20,0 \muM
La agitación se continuó durante 4 horas en frío y se centrifugó a 4900 rpm durante 20 minutos. La solución de sobrenadante (sobrenadante I) se recogió y se combinó con el sobrenadante II obtenido subsiguientemente extrayendo el nódulo de tejido.
Los sobrenadantes combinados representan el material de la Fase I.
El procedimiento se resume en el siguiente esquema:
4 
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* La determinación de la actividad y la caracterización bioquímica de las muestras se realizó con la ayuda de una prueba de determinación de actividad-reducción de turbidez y determinación del contenido de proteína (E_{280}, método BCA de Pierce, SDS-PAGE). Era imposible medir la actividad enzimática en el homogenado de sanguijuelas, debido al contenido muy alto de hemoglobinas (medido con el estuche de determinación de hemoglobina Merck KGaA, 13851) y otras proteínas. Por otra parte, la actividad de hialuronidasa no podía medirse en la fase previa a la precipitación con ácido. Las actividades específicas finales (actividad por mg de proteína) de estos extractos eran aproximadamente 10-30 unidades WHO. De acuerdo con SDS-PAGE, los extractos en bruto contenían grandes cantidades de diferentes proteínas, teniendo las principales un peso molecular de \sim120, 55-60, 45, 31, 28, 22, 15 y 14-10.
Ejemplo 4 Procedimiento de Precipitación con Sulfato Amónico del Material de la Fase I
A continuación, el procedimiento de precipitación con sulfato amónico se eligió como la primera etapa de la purificación de manilasa y daba como resultado un enriquecimiento de \sim5 veces de esta enzima.
El material enzimáticamente inerte se precipitó del extracto en bruto de la Fase I añadiendo lentamente sulfato amónico sólido (Merck KGaA) hasta 36% p/v a +4ºC. Esta mezcla se agitó durante 1 hora y se centrifugó. El precipitado se descartó. El sobrenadante se dializó contra agua desionizada corriente durante la noche y 24 horas contra tampón de fosfato 20 mM, pH 6,0. Las actividades específicas finales de estos extractos eran aproximadamente 40-150 unidades WHO. De acuerdo con SDS-PAGE, el extracto de la Fase II contiene grandes cantidades de diferentes proteínas.
Ejemplo 5 Cromatografía de Intercambio Catiónico
El intercambiador catiónico se usó en un modo de adsorción discontinuo. Una muestra dializada rica en enzima (fase II) se incubó durante la noche con 1 l de intercambiador catiónico Fractogel EMD SO_{3}^{-} 650 (S), Merck KGaA, Art. Nº 16882. Después de que la incubación se terminara mediante centrifugación, el intercambiador catiónico se lavó con el tampón, se centrifugó de nuevo y la columna de HPLC Superformace se rellenó con el gel. Después de lavar la columna con tampón de fosfato 20 mM, pH 4,9, las proteínas unidas se eluyeron de la columna con el mismo tampón de fosfato sódico, pH 6,0, que contenía un gradiente lineal de 0 a 1 M de NaCl. Las fracciones se recogieron cada 3 minutos (9 ml) y se controló la absorbancia a 280 nm. La manilasa se eluyó a concentraciones de NaCl de 0,15 a 0,18 M. Las actividades y los contenidos de proteína de todas las fracciones se midieron y las fracciones se combinaron y se dializaron durante la noche contra tampón de fosfato 20 mM, pH 6,0, que contenía azida sódica y 17 mg/ml de trehalosa.
Se llevaron a cabo la determinación de la concentración de proteínas, las actividades específicas de los "combinados" y el análisis de SDS-PAGE. A pesar de los rendimientos muy buenos (actividad) y la alta actividad específica (unidades de actividad WHO por mg de proteína, corresponde a UI), todavía se observaba una mezcla de muchas proteínas mediante los resultados del análisis por SDS-PAGE de las muestras. La cromatografía de intercambio catiónico con la ayuda de Fractogel EMD SO_{3}^{-} 650 (S)® (Merck KGaA, Alemania) daba como resultado un factor de purificación muy alto de \sim10 a 50. Esta etapa es muy eficaz para reducir las impurezas de hemoglobina. Por otra parte, se ha encontrado que el procedimiento discontinuo era una etapa inicial muy útil para manejar grandes volúmenes de sobrenadante de la fase II (5-16 l).
Ejemplo 6 Cromatografía de Afinidad con Concanavalina A-Sepharose
La purificación adicional de los combinados ricos en enzima después del intercambiador catiónico se realizó con la ayuda de cromatografía de afinidad de Con A-lectina. Con A-Sepharose® disponible comercialmente de Pharmacia Biotech, Art. 17-0440-01, se lavó con un tampón acético 0,1 M + NaCl 0,5 M, pH 8,0; ácido bórico 0,1 M + Triton X 100 al 0,1%, pH 6,0, y finalmente con tampón acético 0,1 M + NaCl 0,5 M, pH 6,0. La muestra se dializó durante la noche contra tampón acético 20 mM + NaCl 0,5 mM + CaCl_{2} 1 mM + MgCl_{2} 1 mM, pH 6,0 + MnCl_{2} 1 mM, aplicado a temperatura ambiente a una columna de 1000 l de Con A y se eluyó 2 h con los 510 ml de tampón de ácido acético 100 mM + NaCl 0,5 M + CaCl_{2} 1 mM + MgCl_{2} 1 mM, pH 6,0 + MnCl_{2} 1 mM.
Esto fue seguido por desorción con la ayuda del mismo tampón que contenía metil-\alpha-D-manopiranósido 0,5 M. La elución se controló continuamente a 280 nm. Las fracciones de 3 ml que se habían recogido se analizaron con respecto a la actividad de hialuronidasa. Las fracciones activas se combinaron y se dializaron durante la noche contra tampón de fosfato 20 mM, pH 6,0, que contenía azida sódica y 17 mg/ml de trehalosa. Se llevaron a cabo la determinación de la concentración de proteínas, las actividades específicas de los "combinados" y el análisis por SDS-PAGE. Esta etapa era muy eficaz para retirar el resto de la hemoglobina. La cromatografía con Con A daba como resultado un factor de purificación de 4-10. Este factor difería, dependiendo de la calidad del material de partida.
Ejemplo 7 Cromatografía en Interacción Hidrófoba con Propil-Fractogel
Se añadió sulfato amónico a combinados de Con A activos para hialuronidasa hasta una concentración final de 2 M. Las muestras se incubaron a continuación 1 h a temperatura ambiente con 150 ml de propil-Fractogel EMD Propyl 650 (S)®, Merck KgaA, Alemania, Art. Nº 1.10085, equilibrada con tampón de fosfato 0,1 M, pH 7,0, que contenía sulfato amónico 2 M. Después de que la incubación se acabara el gel se lavó dos veces con el mismo tampón y se preparó la columna de HPLC-Superformance (2,6 x 60 cm). Las proteínas unidas se eluyeron con tampón de fosfato 0,1 M, pH 7,0. Las fracciones de 6 ml se recogieron cada 3 minutos, se dializaron directamente contra agua desionizada (2-3 h) y a continuación contra tampón de fosfato 20 mM, pH 6,0. Las fracciones se ensayaron con respecto a la actividad de hialuronidasa. Las fracciones activas se combinaron y se dializaron durante la noche contra tampón de fosfato 20 mM, pH 6,0, que contenía azida sódica y 17 mg/ml de trehalosa. Se llevaron a cabo la determinación de las proteínas y la actividad de los combinados.
El factor de purificación en esta etapa de cromatografía era de aproximadamente 3 a 5. Una pequeña cantidad de Con A liberada del gel portador en la etapa previa se retiró junto con otras impurezas proteínicas.
Ejemplo 8 Preparación de columna de afinidad de ácido hialurónico-oligosacárido (a) Hidrólisis de hialuronano (HA) con hialuronidasa de testículo bovino
Se disolvieron 7 g de ácido hialurónico en 1,25 l de tampón de acetato sódico 0,1 M que contenía NaCl 0,15 M y EDTA 0,5 mM, pH 5,2, mezclando durante la noche a 4ºC en presencia de tolueno. Posteriormente, el pH de la solución que contenía HA se ajustó hasta 5,2 y, después de calentar hasta 37ºC, se añadió hialuronidasa de testículo bovino (Merck KGaA; 700 unidades WHO/mg). Para 7 g de HA, se usaron 210 mg de enzima disuelta inmediatamente antes de usar en 50 ml del tampón anterior. La hidrólisis se dejó avanzar durante 30 minutos a 37ºC con agitación constante y se terminó calentando durante 5 minutos a 100ºC en un baño de agua a ebullición. La mezcla de reacción se clarificó a través de centrifugación durante 30 minutos a 10000 g, el experimento que contenía proteína desnaturalizada se descartó y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum sobre el cual se colocaba un precinto de fibra de vidrio. La solución clarificada que contenía HA-oligosacáridos (HAOS) se fraccionó mediante filtración a través de una membrana de ultrafiltración Diaflo (Amicon) con valores de separación molecular diferentes como sigue.
(b) Fraccionación de HAOS mediante ultrafiltración
La solución que contenía HAOS procedente de la etapa previa se filtró a través de una membrana de ultrafiltración Diaflo 30 YM. El retenido se apartó para otros estudios mientras que el filtrado se sometía a la segunda ultrafiltración a través de la membrana de ultrafiltración Diaflo 10 YM. De nuevo, el retenido se apartó para otros estudios mientras la solución que pasaba a través de 10 YM se sometía a la última ultrafiltración a través de una membrana Diaflo 3YM. Posteriormente, el retenido que contenía HA-OS, aproximadamente 10 ml de la solución, se usó para la purificación adicional. Esta fracción: HAOS 3-10 se purificó como sigue y se usó adicionalmente para el acoplamiento a Sepharose.
(c) Purificación de HAOS 3-10
HA-OS 3-10 se purificó (desaló) en una columna Biogel P2®. Esta columna (4 cm x 100 cm) se rellenó con Biogel 2 medium®, malla 200-400 (BioRad) y se lavó con 5 volúmenes de columna de agua (Milli Q, Millipore). La fracción HAOS 3-10 obtenida de la etapa previa (15 ml; 1,5 g de oligosacáridos) se aplicó a esta columna. La columna se eluyó con agua; la fracción de 15 ml se recogió y se analizó con respecto a la presencia de HA-oligosacáridos. Las fracciones que contenían oligosacáridos eluidas antes de las sales (las últimas detectadas con AgNO_{3}) se combinaron y se concentraron de nuevo en una membrana Diaflo 3YM.
(d) Análisis de HAOS 3-10
Para determinar la eficacia de acoplamiento de la Sepharose, el gel (la misma partida) se lavó y se suspendió en agua, para preparar una suspensión al 50%. A partir de la suspensión de conjugado de Sepharose-HAOS 3-10 y Sepharose usada como un control, partes alícuotas de 100 \mul se extrajeron por triplicado y se añadieron a 2,5 ml de ácido trifluoroacético (TFA, Merck KgaA) 2,2 N en tubo con tapón de rosca de teflón. Para la hidrólisis, la mezcla se barrió con argón y se incubó a 100ºC durante 16 h. Al final de la hidrólisis, las muestras se secaron bajo nitrógeno, se resuspendieron en agua y se usaron para la determinación de glucosamina y ácido urónico. Para determinar la extensión de la descomposición de ácido urónico y glucosamina para cada una de las hidrólisis, se incluyeron muestras de control que contenían cantidades conocidas de UA o GlcNAc y se incubaron bajo las mismas condiciones.
Bajo las condiciones descritas anteriormente, se acoplaron 5, 8, 9, 11 y 15 mg de HAOS 3-10 por 1 ml de gel de Sepharose drenado en dos experimentos independientes. Estos resultados se basan en los ensayos de UA y glucosamina.
(e) Ensayo usado
El contenido del ácido urónico en las muestras analizadas se determinó de acuerdo con Bitter T. y Muir H.M., Anal. Biochem., 1962, 4, 330-334.
Las cantidades de hexosamina se analizaron con el método de Rondle C.J.M. y Morgan W.T.J., Biochem. J., 1955, 61, 586-593.
Ejemplo 9 Cromatografía en Fragmentos de Ácido Hialurónico-Sepharose (Cromatografía en HA-Sepharose)
Las matrices de cromatografía que contenían de 8 a 10 mg/ml se prepararon como se indica. La muestra que contenía la enzima se analizó contra tampón acético 20 mM + NaCl 0,15 M, pH 4,0, y se aplicó a la columna de 25 ml de HA-Sepharose. Después de lavar con el mismo tampón, la elución se realizó con el tampón acético 20 mM con un gradiente de 0,15 a 1 M de NaCl.
Las fracciones de 1 ml se probaron en la prueba de determinación de actividad de hialuronidasa, se combinaron, se dializaron durante la noche contra tampón de fosfato 20 mM, pH 6,0, que contenía azida sódica y 17 mg/ml de trehalosa. Se llevaron a cabo la determinación de la proteína y la actividad de los combinados. El factor de purificación de esta etapa de cromatografía era aproximadamente 3.
Ejemplo 10 Cromatografía en Diol-LiChrospher
Una muestra activa de 20 ml dializada contra Milli-Q-H_{2}O se aplicó en la columna de diol-LiChrospher. La columna se equilibró a continuación con 15 ml de Milli-Q-H_{2}O y se lavó 5 minutos con 2 ml de agua. La elución de la muestra activa se realizó 15 minutos con tampón acético 20 mM, pH 5,9 (gradiente, NaCl de 0 a 5 mM) y 35 minutos con gradiente de ácido acético 20 mM a 100 mM, pH 5,5, que contenía NaCl 5 mM. Las fracciones se ensayaron con respecto a la actividad de hialuronidasa. Las fracciones activas se combinaron y se dializaron durante la noche contra tampón de fosfato 20 mM, pH 6,0, que contenía azida sódica y 17 mg/ml de trehalosa. Se llevó a cabo la determinación de proteína y actividad de los combinados. El factor de purificación: 3.
Ejemplo 11 Cromatografía en RP 18e
Esta etapa de purificación puede usarse solamente como la última y está destinada a obtener la muestra libre de sales y otras impurezas proteínicas (por ejemplo, inhibidores de proteasa peptídicos). La actividad de hialuronidasa se perdía completamente, debido a que la manilasa no es resistente a disolventes orgánicos usados en esta etapa. La muestra de manilasa se aplicó a la columna RP 18e. Las fracciones de 0,25 ml/minuto se recogieron. La elución se realizó en presencia de TFA al 0,1% y se usó gradiente de agua hasta 99% de acetonitrilo. Las muestras purificadas por RP pueden usarse directamente para la secuenciación de aminoácidos, la medida de MALDI, el análisis de la estructura de carbohidratos y como patrón para la purificación de otras partidas de manilasa.
Ejemplo 12 Determinación de Actividad - Prueba de Reducción de la Turbidez
La determinación de la actividad de hialuronidasa se realizó con las medidas de la reducción de la turbidez. Preparaciones de hialuronano disponibles comercialmente (aisladas de los diferentes tejidos y fluidos animales, por ejemplo cordón humano, cresta de gallo) y hialuronidasas (endo-\beta-glucosaminidasas de testículo bovino, testículo porcino, veneno de abeja; liasas de Streptomyces hyalurolyticus) se usaron para establecer condiciones adecuadas para ensayos de actividad. La endo-\beta-glucuronidasa de Hirudo medicinalis se purificó parcialmente en el laboratorio.
Se preparó solución de reserva de hialuronano (concentración 2 mg/ml) disolviendo HA en tampón de fosfato 0,3 M, pH 5,3. Esta solución se diluyó con el mismo tampón hasta una concentración de 0,2 mg/ml directamente antes de la prueba. Las muestras que contenían enzima se diluyeron hasta una cantidad apropiada de enzima (0,5-5 unidades WHO) con tampón de fosfato 20 mM que contenía 0,01% de albúmina bovina y 77 mM de NaCl (tampón de dilución de enzima). Se añadieron 0,1 ml de solución de hialuronano (0,2 mg/ml) a 0,1 ml de estas muestras, se mezclaron y se incubaron 45 minutos a 37ºC. La prueba se realizó por duplicado. La reacción se detuvo mediante dilución con 1,0 ml de reactivo de albúmina (0,1% de albúmina disuelto en ácido acético 80 mM/tampón de acetato sódico 40 mM, pH 3,75). Después de una incubación de 10 minutos a TA o 37ºC, se leyó la densidad óptica a 60 nm y la actividad se expresó en unidades WHO (UI) mediante comparación (programa SLT) con un patrón. La preparación WHO de hialuronidasa testicular bovina (Humphrey J.H., Bull. World Health Org. 1957, 16, 291-294) se usó como patrón.
Ejemplo 13 Estimación de Proteína
El contenido de proteína de los eluyentes de la columna se determinó midiendo la absorbancia ultravioleta de soluciones a 280 nm. La concentración de proteína de las fracciones combinadas se determinó con la ayuda del micrométodo de Pierce. La solución de BSA se usó como una proteína de referencia.
Ejemplo 14 Electroforesis de SDS-PAGE
La electroforesis se realizó de acuerdo con el procedimiento de Laemmli (Nature, 1970, 227, 680-685). Se usaron los siguientes geles: gradiente de 4 a 20% o geles de separación al 12,5% con gel de apilamiento al 4%. Las muestras se sometieron a electroforesis en presencia de dodecilsulfato sódico y \beta-mercaptoetanol. Las proteínas se visualizaron después de teñir con azul brillante de Coomassie y/o tinción con plata (de acuerdo con la instrucción de
Pharmacia).
Ejemplo 15 Enfoque Isoeléctrico
Para llevar a cabo estudios de enfoque isoeléctrico sobre la preparación de manilasa, se adoptó el protocolo proporcionado por el suministrador (Pharmacia). Después del enfoque, el gel se fijó y se tiñó con plata (de acuerdo con el procedimiento de Pharmacia).
Ejemplo 16 Preparación de Inmunoglobina para Sueros Inmunes de Conejos (anticuerpos de conejo anti-Con A, anti-hemoglobina y anti-péptido)
Los sueros de conejo se produjeron con el uso de los siguientes inmunógenos: concanavalina A-lectina, mezcla de hemoglobinas y conjugados de péptido-KLH. La secuencia peptídica era idéntica a la de la parte N-terminal de 14 aminoácidos de la manilasa (KEIAVTIDDKNVIA).
Los sueros se purificaron sobre la columna de proteína A-Sepharose (Pharmacia, 17-0780-01) de acuerdo con la instrucción de Pharmacia estándar. La pureza de las muestras de IgG se verificó con la ayuda de SDS-PAGE y la prueba de ELISA.
Ejemplo 17 Ensayo de Inmunotransferencia Western
Partes alícuotas adecuadas de las muestras y marcador proteínico preteñido de peso molecular conocido se sometieron a SDS-PAGE según se describe anteriormente. Se usó un marcador del peso molecular BioRad preteñido. La proteína se transfirió electroforéticamente desde geles de poliacrilamida (0,8 mA/cm^{2}) hasta membranas de poli(difluoruro de vinilo) (PVDF) inmóviles en presencia de tampón de transferencia durante 100 minutos. La membrana de PVDF se incubó con solución de bloqueo (PBS, pH 7,5 + 2% de leche desnatada) durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, la membrana se incubó 2 h a temperatura ambiente con el anticuerpo, diluido apropiadamente con la solución de bloqueo. La membrana se lavó con TBS + Tween 20 al 0,05%, pH 7,5, y se incubó durante 2 h a temperatura ambiente con conjugado (un segundo anticuerpo) anti-conejo caprino-fosfatasa alcalina, BioRad. La membrana se lavó dos veces con TBS + Tween 20 y se incubó 10 minutos con solución de sustrato de BCIP-fosfatasa alcalina. Añadir un tampón de parada terminaba la reacción.
Ejemplo 18 Secuenciación de Aminoácidos
La secuencia de 33 residuos de aminoácido N-terminal de la manilasa se obtuvo mediante degradación de Edman. Después de la SDS-PAGE de muestras activas para manilasa, las bandas se transfirieron sobre membrana de PDVF, se tiñeron con azul de Coomassie, se cortaron y se sometieron a secuenciación. La misma secuencia de aminoácidos se encontró para la muestra obtenida después de la última etapa de purificación con la ayuda de cromatografía en columna RP.
Ejemplo 19 Dependencia con el pH de la Actividad Enzimática (para hialuronidasa aislada de cabezas de sanguijuelas Hirudinaria manillensis e Hirudo medicinalis)
Las muestras de hialuronidasa usadas en este experimento se extrajeron de cabezas de sanguijuela Hirudinaria manillensis o Hirudo medicinales y se purificaron parcialmente con la ayuda de precipitación con sulfato amónico y cromatografía de intercambio catiónico. Cada muestra que contenía 500 unidades WHO/ml se incubó a -20ºC, +4ºC y 37ºC a un intervalo de pHs de 2,6 a 9,0 (ácido acético 20 mM para pH 2,6 a 5; tampón de fosfato 20 mM para pH 5 a 9). La actividad enzimática se midió después de períodos de incubación de 1, 2 y 7 días. En los extremos tanto ácido como alcalino de pH, se observó la inhibición de la actividad hasta la misma extensión para ambas hialuronidasas. Sin embargo, durante períodos de incubación más prolongados, la manilasa era más estable que la hialuronidasa de Hirudo medicinalis: por ejemplo, después de 7 días de incubación a pH 7,0 a 4ºC y 37ºC la manilasa retenía 75% y 60% de la actividad de partida, respectivamente. La hialuronidasa de Hirudo medicinalis incubada a las mismas condiciones ya era inactiva después de 1 día.
Ejemplo 20 Medida de Estabilidad de Hialuronidasas en Presencia de Suero de Perro (para hialuronidasa aislada de cabezas de sanguijuela Hirudinaria manillensis e Hirudo medicinalis)
Las muestras de 5 kU/ml de manilasa, hialuronidasa de Hirudo medicinalis y testículo bovino se diluyeron con plasma citratado de perro o rata hasta una concentración final de 250 U/ml. A continuación, estas soluciones se incubaron a -20ºC, +4ºC y 37ºC durante de 0 a 7 días. Los controles que contenían las mismas hialuronidasas, diluidos en tampón, se incluyeron en este experimento. Finalmente, se midió la actividad de hialuronidasa.
Ejemplo 21 Actividades de Enzimas Contaminantes
En cada fase del procedimiento de purificación para hialuronidasa de sanguijuela, la preparación se verificó para otras enzimas capaces de degradar proteína con la ayuda del sustrato de proteasa universal (Boehringer Mannheim, cat. Nº 1080 733) de acuerdo con Twining S.S.(Anal. Biochem., 1984, 143, 30-34).
Ejemplo 22 Influencia de la Heparina sobre la Actividad de Hialuronidasa
La segmentación de un hialuronano mediante hialuronidasas da como resultado la liberación de azúcares reductores. La cantidad de los azúcares liberados se midió colorimétricamente mediante el método modificado de Park (Park J. & Johnson M.; J. Biol. Chem. 1949, 181, 149). Para la medida de la influencia de la heparina sobre la actividad de manilasa y hialuronidasa de testículo bovino, se llevaron a cabo dos determinaciones de la actividad: una en presencia de heparina y la segunda sin heparina. Muestras de hialuronidasa de 25 \mul (3,2 unidades WHO) se incubaron 30 minutos a 37ºC con 25 \mul de la solución de heparina (Liquemin, Fa. Hoffmann LaRoche), que contenía de 0 a 24 unidades de heparina. A continuación, se añadieron 50 \mul de hialuronano (2,5 mg/ml) y la incubación se continuó durante 30 minutos a 37ºC. La reacción se terminó calentando durante 2 minutos a 100ºC. A continuación, se añadieron al digesto inactivado 100 \mul de solución de carbonato-cianuro y 100 \mul de solución de ferricianuro potásico. Las muestras se calentaron en un baño de agua a ebullición durante 15 minutos y a continuación se enfriaron en un baño de hielo. Posteriormente, se añadieron a las mezclas de reacción 0,75 \mul de solución de sulfato férrico-amónico. Después de 15 minutos de incubación a TA, el color desarrollado se midió a 690 nm en un espectrofotómetro Shimadzu. Blancos y controles sin enzima adecuados se incluyeron en cada ensayo. El azúcar reductor esperado (ácido glucurónico o N-acetil-glucosamina, de 1 a 15 \mug) para el tipo de muestra bajo análisis se usó como patrón.
Ejemplo 23 Desglicosilación de la Manilasa
Las muestras de manilasa se desglicosilaron con la ayuda de enzima PNGasa F (BioLabs Art. Nº 701 L) de acuerdo con la instrucción del suministrador. La desglicosilación se realizó bajo condiciones desnaturalizantes y naturales. Los tratamientos con O-glicanasa, neuraminidasa y neuraminidasa + O-glicanasa se realizaron de acuerdo con prescripciones estándar de Boehringer Mannheim. Todas las muestras se caracterizaron con la SDS-PAGE y la prueba de determinación de la actividad.
Ejemplo 24 Construcción del Vector de Expresión de E. Coli (Fig. 11)
Para la expresión en E. coli se usó una versión modificada del plásmido pASK75, que tiene la región promotora tet {Skerra, Gene 151, (1994), pp131-135}. La modificación se realizó clonando un nuevo conector entre los sitios XbaI y Hind III. El nuevo conector contiene la secuencia líder ompA, otro sitio de clonación múltiple y una etiqueta 6xHis en lugar de la etiqueta strep.
\newpage
Secuencia del conector que se clonaba en pASK75.
5
Para construir el vector de expresión para manilasa, era necesario introducir sitios de restricción Cla I 5' y Eco47III 3' mediante el método de PCR. Por lo tanto, se usaron los dos cebadores
6
El producto de PCR se clonó en primer lugar en el sistema vectorial PCR II (Invitrogen) y se sometió a secuenciación.
En una segunda etapa el gen de manilasa se clonó en el vector pASK75 modificado usando los sitios de restricción ClaI 5' y Eco47III 3'.
Después de expresar y probar la actividad de esta manilasa recombinante en una segunda reacción de PCR, la etiqueta His se retiró y el codón de iniciación del gen de manilasa se fusionó directamente a la secuencia líder omp A. Los cebadores para esta reacción de PCR eran:
7
Ejemplo 25 Construcción del Plásmido Donante de Baculovirus (Fig. 12)
Para la expresión de manilasa en el sistema de expresión de baculovirus, se usó el Bac-To-Bac™ Baculovirus Expression System de Gibco Life Technologies. Para obtener un sistema de secciones, la secuencia líder de melitina de abeja de miel se fusionó al gen de manilasa y para introducir los sitios de restricción BamHI 5' y KpnI 3' se llevó a cabo una sola reacción de PCR.
8
El producto de PCR se clonó en el vector PCR II (Invitrogen) y se sometió a secuenciación. A continuación, la fusión melitina-manilasa se clonó en el vector pFastBac usando los sitios de restricción BamHI 5' y KpnI 3' (Fig. 12).
Ejemplo 26 Construcción del Vector de Expresión de Levadura (Fig. 13)
Para la expresión en levadura se usó el sistema de expresión de múltiples copias de Pichia (Invitrogen). Para construir el vector de expresión para manilasa se usó el método de amplificación por PCR del gen de manilasa de tal modo que se generan extremos de restricción compatibles (EcoR I 5', Not I 3') para la ligación en el vector apropiado (pPIC9K). Por lo tanto, se usaron los siguientes cebadores:
9
Antes de transformar los esferoplastos de Pichia, el vector de expresión tiene que linealizarse con Sal I.
Ejemplo 26 Expresión en E. coli
En el vector de expresión pRG72, que contiene el gen estructural de sarastatina fusionado a la secuencia líder ompA, se transformó en células competentes W3110. Las células se hicieron crecer hasta una fase semilogarítmica y el promotor se indujo a continuación añadiendo 200 \mug de aTC/l. Una hora después la manilasa recombinante podía detectarse claramente.
Ejemplo 27 Generación de Baculovirus Recombinante y Expresión de Manilasa con el Sistema de Expresión Bac-To-Bac
El plásmido donante pTD13 se transformó en células competentes DH10Bac que contienen el bácmido con un sitio de etiqueta mini-attTn7 y el plásmido cooperador. El elemento mini-Tn7 en el plásmido donante puede transponerse hasta el sitio diana mini-attTn7 en el bácmido en presencia de proteínas de transposición proporcionadas por el plásmido cooperador. Colonias que contienen bácmidos recombinantes se identificaron mediante ruptura del gen lacZ. DNA mini-prep de alto peso molecular se preparó a partir de clones de E. coli seleccionados que contenían el bácmido recombinante y este DNA se usó a continuación para transfectar células de insecto.
Una descripción detallada podría encontrarse en el manual de instrucciones del estuche de expresión.
Ejemplo 28 Expresión en levadura
Para asegurarse de tener integrado el gen de manilasa las colonias tienen que rastrearse con respecto a los mutantes His^{+} Mut^{+}.
Usando una sola colonia, se inoculan 100 ml de medio en un matraz de 1 l. Las condiciones de crecimiento son 28-30ºC, 250 rpm, hasta una DO de 2-6. Para inducir la expresión, en primer lugar se centrifuga el cultivo, se decanta hasta el sobrenadante y se resuspende el nódulo celular en nuevo medio usando 1/5 del volumen de cultivo original. Se añade metanol al 100% hasta una concentración final de 0,5% cada 24 horas para mantener la inducción. Después de un máximo de 6 días el sobrenadante se analiza mediante SDS-PAGE y se ensaya la actividad.
<110> Merck PAten GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Hialuronidasa de la Hirudinaria manillensis,
\hskip1cm
aislamiento, purificación y método 
\hskip1cm
recombinante de producción 
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> Manilasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 488
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<212> PRT
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<213> Sanguijuela
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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10
11 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 1464
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Sanguijuela
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1464)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (667)..(669)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Tyr o Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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12
13
14 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 3
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<211> 488
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sanguijuela
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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15
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 1464
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Sanguijuela
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(1464)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1348)..(1350)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Val o Met
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
17
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 488
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sanguijuela
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
19
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 1464
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<212> DNA
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<213> Sanguijuela
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1464)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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21
22
23 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 488
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sanguijuela
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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24
25
26 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 23
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcgataaag agattgccgt gac 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador 3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gttgtttccg atgctaaagc gct 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accgtagcgc aggccaaaga gattgccgtg 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador 3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacggcaatc tctttggcct gcgctacggt 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 87
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
27 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador 3'
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aatgttgaag cataaggtac c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador 5'
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtagaattca aagagattgc cgtgaca 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador 3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatgctaatg ttgaagcata atgagcggcc gc 
\hfill
32

Claims (12)

1. Una proteína purificada aislada de la especie de sanguijuela Hirudinaria manillensis que tiene la actividad biológica de una hialuronidasa que no está inhibida por heparina, la proteína tiene las siguientes propiedades
(a)
un peso molecular de 53-60 kDa dependiente de la glicosilación,
(b)
un óptimo de actividad enzimática a pH 6,0-7,0,
(c)
un punto isoeléctrico de 7,2-8,0,
(d)
una actividad de retención de 60% a 37ºC después de 7 días y de 100% después de 7 días en presencia de suero de perro, y
(e)
una actividad enzimática específica de más de 100 kU/mg de proteína.
2. Una proteína purificada de acuerdo con la reivindicación 1, obtenible mediante las siguientes etapas
(i)
homogeneizar cabezas de sanguijuelas de dicha especie con un tampón ácido seguido por centrifugación,
(ii)
precipitación del sobrenadante de la etapa (i) con sulfato amónico al 36%,
(iii)
usar cromatografía de intercambio catiónico para la purificación del sobrenadante de la etapa (i),
(iv)
usar cromatografía de afinidad con concanavalina A para la purificación de fracciones combinadas de la etapa (iii),
(v)
usar cromatografía de interacción hidrófoba para la purificación de fracciones combinadas de la etapa (iv),
(vi)
usar cromatografía de afinidad sobre matrices revestidas con fragmentos de ácido hialurónico para la purificación de fracciones combinadas de la etapa (v), y
(vii)
usar cromatografía de penetración en gel para la purificación de fracciones combinadas de la etapa (vi).
3. Una proteína purificada de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que tiene la secuencia de aminoácidos que se representa en la Fig. 7 y en Nº ID SEC 1.
4. Una proteína glicosilada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que tiene un peso molecular de 58 kDa (\pm2).
5. Una molécula de DNA que codifica para una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que tiene una de las secuencias de nucleótidos que se representan en la Fig. 8 (Nº ID SEC 2), la Fig. 9 (Nº ID SEC 4) y la Fig. 10 (Nº ID SEC 6).
6. Un vector de expresión que comprende una secuencia de DNA de acuerdo con la reivindicación 5.
7. Una célula huésped adecuada para la expresión de la proteína que se especifica en cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 6.
8. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
9. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende adicionalmente un compuesto farmacológicamente activo.
10. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, en la que el compuesto farmacológicamente activo es heparina.
11. El uso de una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos del miocardio, cardiovasculares y trombóticos y tumores.
12. Un método para aislar y purificar la proteína de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las etapas:
(i)
homogeneizar cabezas de sanguijuelas de dicha especie con un tampón ácido seguido por centrifugación,
(ii)
precipitar el sobrenadante de la etapa (i) con sulfato amónico,
(iii)
usar cromatografía de intercambio catiónico para la purificación del sobrenadante de la etapa (i),
(iv)
usar cromatografía de afinidad con concanavalina A para la purificación de fracciones combinadas de la etapa (iii),
(v)
usar cromatografía de interacción hidrófoba para la purificación de fracciones combinadas de la etapa (iv),
(vi)
usar cromatografía de afinidad sobre matrices revestidas con fragmentos de ácido hialurónico para la purificación de fracciones combinadas de la etapa (v), y
(vii)
usar cromatografía de penetración en gel para la purificación de fracciones combinadas de la etapa (vi).
ES00947835T 1999-06-12 2000-06-06 Hialuronidasa de la hirudinaria manillensis, aislamiento, purificacion y metodo recombinante de produccion. Expired - Lifetime ES2258976T3 (es)

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EP99111468 1999-06-12

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