KR102553924B1

KR102553924B1 - 3-디옥시사파논 b를 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백 및 항주름효과가 우수한 피부 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102553924B1
Application number: KR1020210010926A
Authority: KR
Inventors: 이한나; 김동희; 강윤환; 유재묘; 박태순
Original assignee: 한국한의약진흥원
Priority date: 2021-01-26
Filing date: 2021-01-26
Publication date: 2023-07-10
Also published as: KR20220107803A

Abstract

본 발명은 3-디옥시사파논 B(3-Deoxysappanone B)를 유효성분으로 함유하는, 항산화, 미백 및 항주름효과가 우수한 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 피부 개선용 화장료 조성물에서 유효성분으로 사용되는 3-디옥시사파논 B는 소목에서 분리된 것으로 DPPH 라디칼 소거능으로 확인된 항산화효과, 티로시나제 저해활성과 멜라닌 내용물 저해활성으로 확인된 미백효과, 및 엘라스타제 저해활성, MMP-1 저해활성, 프로콜라겐 활성능으로 확인된 항주름효과가 우수하므로 3-디옥시사파논 B를 유효성분으로 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물은 항산화활성과 항주름활성에 의한 노화방지와 미백효과가 우수하다.

Description

3-디옥시사파논 B를 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백 및 항주름효과가 우수한 피부 개선용 화장료 조성물 {Cosmetic composition for skin improvement with antioxidizing, whitening and antiwrinkle effect comprising 3-Deoxysappanone B}

본 발명은 3-디옥시사파논 B를 함유하는 항산화, 미백 및 항주름효과가 우수한 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 항산화효과, 미백효과 및 항주름효과가 우수한 3-디옥시사파논 B를 유효성분으로 함유하여 피부를 개선하는 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부는 신체의 가장 바깥 부분으로 직접 외부와 접하는 부분이므로 산화의 직접적인 영향을 지속적으로 받는다.

내적 요인에 의한 노화로는 신진대사를 조절하는 신체의 각종 호르몬의 분비가 감소하고 면역세포와 피부세포의 기능과 활성이 저하되어 몸에 필요한 면역단백질과 필수 단백질들의 생합성이 줄어들어 생기는 내인성 노화가 있고, 외부 요인에 의한 노화로는 공해, 바람, 온도 등의 오염물질과 자외선에 의한 광노화가 있다. 이러한 노화가 나타나면서 피부세포가 손상되고 색소가 침착되며 주름이 증가하고 탄력이 감소하며 피부의 건조상태가 증가할 뿐 아니라 피부의 주요성분들의 직접적인 기능이 손실되어 기미, 주근깨, 검버섯 등으로 이어진다.

최근 식물유래 천연 성분에 대한 인식이 높아짐에 따라 인체에 부작용과 해가 적은 생리활성물질을 다량으로 함유하고 있는 각종 생약 및 식용 식물 추출물에 대한 관심과 연구가 활발해 진행되고 있다. 특히 한방 천연물을 이용한 의약품, 바이오, 화장품 등의 개발이 잇따르고 있다.

소목(Caesalpinia sappan Linne)은 콩과(Leguminosae)에 속하는 상록교목의 나무줄기(심재)를 말린 것이다. 소목은 열대지방인 동남아시아에서 주로 자라는 식물로 높이 5~9m 정도로 자라며 수간에는 작은 가시가 있다. 작은 가시는 회록색이면서 피공(皮孔)이 있고, 잎은 2회우상복엽으로 우편(羽片)은 마주 나고 장원형이다. 5~6월에 황색 꽃이 피며 9~10월에 열매를 맺는다. 소방목, 적목이라고도 불리며, 한의학적으로 맛은 달고 짜며 성질은 평하고, 심경(心經) 및 간경(肝經)에 작용한다. 또한, 혈액 순환을 촉진하고 어혈을 없애며 부기를 가라앉히고 복통을 진정시키는데 사용되어 왔고, 부인들의 심복통(心腹痛), 무월경, 산후 어혈로 배가 아플 때나 이질, 파상풍, 부스럼 등에 사용할 때에는 하루 4~12g을 탕제나 고제형태로 만들어 먹었고, 외용약으로 쓸 때는 가루를 내어 뿌리기도 하였다.

소목 유래의 성분으로는 페놀성 화합물, 플라보노이드계 화합물 등이 알려져 있다. 그 중 소목에 함유된 대표적인 성분은 브라질린(brazilins), 바이페닐(biphenyls), 디벤족소신(dibenzoxocins), 캘콘(chalcones), 호모이소플라보노이드(homoisoflavonoids) 골격 화합물이다. 브라질린, 브라질레인(brazilein)은 소목의 주성분 중 약 2%를 차지하는 것으로, 무색의 플라보노이드 형태를 가진 벤즈(b)-인데노(2, 1-d) 피란{Benz(b)-Indeno(2, 1-d) pyran} 유도체인 브라질린이 공기 중에서 산화되어 브라질레인이 되며, 약리학적으로 사판칼콘(sappanchalcone), 프로토사파닌(protosappanin) C, D, E와 함께 LPS로 유도된 대식세포(J774.1)에서 항염증 효과가 있음이 보고되었다. 그 외에도 소목추출물 또는 분획물이 항산화, 항바이러스, 여드름개선, 혈당강화, 혈관이완, 간보호작용을 나타내는 것으로 확인되었다.

소목 추출물의 효과와 관련하여, 특허공개 제10-2020-0038115호에서는 몰식자, 소목, 대황, 오수유, 오필초, 향춘자 또는 가와 추출물을 유효성분으로 포함하여 항산화, 멜라닌 감소, 항염증, 콜라겐 합성 촉진, 엘라스타제 활성 저해, 세포 증식효과가 우수하여 항산화, 피부보습, 피부 미백, 피부 트러블 개선, 주름 개선, 피부 탄력 증진, 피부 재생용도로 유용하게 사용될 수 있는 피부개선용 조성물을 개시하고 있고, 특허공개 제10-2018-0089151호에서는 소목 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 장벽기능 강화용 화장료 조성물 및 피부보습제를 개시하고 있다.

3-디옥시사파논 B(3-deoxysappanone B)는 소목에 함유되어 있는 호모아이소플라본(homoisoflavone) 골격을 가진 성분 중 하나로 소목에 함유된 성분들 중에서 색소성분을 제외한 활성성분 중 하나이다. 3-디옥시사파논 B는 혈관이완효과, 뇌세포보호효과를 가지는 것으로 알려져 있다.

대한민국 특허공개 제10-2018-0089151호 대한민국 특허공개 제10-2020-0038115호 대한민국 특허공개 제10-2018-0066348호

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본 발명은 혈관이완효과 및 뇌세포보호효과를 가진 것으로 알려진 3-디옥시사파논 B가 항산화효과, 항주름효과 및 미백효과를 가지는 것을 확인하여, 3-디옥시사파논 B를 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백 및 항주름효과가 우수한 피부 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 3-디옥시사파논 B(3-Deoxysappanone B)를 유효성분으로 함유하는, 항산화, 미백 및 항주름효과가 우수한 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 화장료 조성물에서, 상기 3-디옥시사파논 B는 조성물 총 중량에 대하여 0.01~5중량% 함유되는 것이 바람직하다.

상기 화장료 조성물에서, 상기 3-디옥시사파논 B는 소목으로부터 분리된 것임이 바람직하다.

상기 화장료 조성물에서, 상기 3-디옥시사파논 B는 소목에서 분리 및 정제된 형태의 3-디옥시사파논 B, 또는 3-디옥시사파논 B가 다량 함유된 소목 추출물 분획정제물의 형태인 것이 바람직하다.

상기 화장료 조성물에서, 상기 정제된 형태의 3-디옥시사파논 B는,

건조된 소목에 소목 중량의 1.5~3배 부피의 에탄올을 가하여 3~5시간 동안 추출하여 에탄올 추출물을 얻는 단계; 얻어진 에탄올 추출물에 추출물 중량의 20~30배 부피의 증류수를 가하고 진탕하여 현탁액을 얻는 단계; 얻어진 현탁액을 n-헥산, 에틸아세테이트 및 n-부탄올을 용매로 순차적으로 분획하여 에틸아세테이트 분획물을 얻는 단계; 얻어진 에틸아세테이트 분획물을 Prep-HPLC로 분리하여 2개의 소분획물로 나누는 단계; 및 2번째 소분획물을 칼럼 크로마토그래피에 의하여 정제하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조된 것임이 바람직하다.

상기 화장료 조성물에서, 상기 3-디옥시사파논 B가 다량 함유된 소목 추출물 분획정제물은,

건조된 소목에 소목 중량의 1.5~3배 부피의 에탄올을 가하고 40~60℃에서 환류추출법으로 3~5시간 동안 추출하여 소목 조추출물을 얻는 단계; 30% 에탄올을 용매로 사용한 흡착수지를 이용한 칼럼크로마토그래피에 의하여 소목 조추출물에서 색소분획을 제거하는 단계; 50% 에탄올을 용매로 사용한 흡착수지를 이용한 칼럼크로마토그래피에 의하여 3-디옥시사파논 B가 다량 함유된 분획정제물을 얻는 단계; 및 얻어진 3-디옥시사파논 B가 다량 함유된 분획정제물을 35~40℃에서 감압농축하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조된 것임이 바람직하다.

본 발명의 피부 개선용 화장료 조성물에서 유효성분으로 사용되는 3-디옥시사파논 B는 소목에서 분리된 것으로 DPPH 라디칼 소거능으로 확인된 항산화효과, 티로시나제 저해활성과 멜라닌 내용물 저해활성으로 확인된 미백효과, 및 엘라스타제 저해활성, MMP-1 저해활성, 프로콜라겐 활성능으로 확인된 항주름효과가 우수하므로 3-디옥시사파논 B를 유효성분으로 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물은 항산화활성과 항주름활성에 의한 노화방지와 미백효과가 우수하다.

또한 본 발명은 소목 내 함량이 매우 적은 3-디옥시사파논 B를 최대한 추출할 수 있는 방법을 사용하여 3-디옥시사파논 B를 다량 함유하는 분획정제물을 제조하고 이를 사용함으로써 분리 및 정제과정에서 많은 노력과 비용이 소요되는 정제된 형태의 3-디옥시사파논 B를 사용하는 것에 비해 대량 생산이 용이한 효과도 있다.

도 1은 3-디옥시사파논 B의 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.
도 2는 CSE-2 소목 조추출물과 3-디옥시사파논 B의 HPLC 크로마토그램을 비교한 것이다.
도 3은 CSD-1 분획정제물과 CSD-2 분획정제물의 HPLC 크로마토그램을 비교한 것이다.
도 4는 소목 조추출물, 분획정제물 및 3-디옥시사파논 B의 DPPH 라디칼 소거활성을 나타낸 것이다.
도 5는 소목 조추출물, 분획정제물 및 3-디옥시사파논 B의 엘라스타제 저해율을 나타낸 것이다.
도 6은 소목 조추출물, 분획정제물 및 3-디옥시사파논 B의 MMP-1 저해활성을 나타낸 것이다.
도 7은 소목 조추출물, 분획정제물 및 3-디옥시사파논 B로 처리된 사람 섬유아세포의 프로콜라겐 활성을 나타낸 것이다.
도 8은 소목 조추출물, 분획정제물 및 3-디옥시사파논 B의 티로시나제 저해율을 나타낸 것이다.
도 9는 소목 조추출물, 분획정제물 및 3-디옥시사파논 B의 세포내 티로시나제 활성에 대한 효과를 나타낸 것이다.
도 10은 소목 조추출물, 분획정제물 및 3-디옥시사파논 B의 멜라닌 내용물에 대한 효과를 나타낸 것이다.
도 11은 소목 조추출물, 분획정제물 및 3-디옥시사파논 B의 아질산염 생성율에 대한 효과를 나타낸 것이다.
도 4 내지 11에서 CSE-1은 소목의 냉수 추출물, CSE-2는 소목의 환류 추출물, CSD-1은 CSE-1으로부터의 Diaion-HP20 분획, CSD-2는 CSE-2로부터의 Diaion-HP20 분획, 3-DB는 3-디옥시사파논 B이다. 결과는 3회 실험의 평균±S.D.로 나타내었다.

본 발명은 3-디옥시사파논 B(3-Deoxysappanone B)를 유효성분으로 함유하는, 항산화, 미백 및 항주름효과가 우수한 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 항산화, 미백 및 항주름효과가 우수한 피부 개선용 화장료 조성물은 3-디옥시사파논 B를 유효성분으로 함유한다.

3-디옥시사파논 B는 소목에 소량 함유되어 있다. 본 발명에서 3-디옥시사파논 B는 바람직하게는 소목으로부터 분리한다.

3-디옥시사파논 B는 정제된 형태의 3-디옥시사파논 B, 또는 3-디옥시사파논 B가 다량 함유된 소목 추출물 분획정제물의 형태로 사용될 수 있다. 소목에 함유된 3-디옥시사파논 B는 소량이고 이를 분리 및 정제하는 과정에서 많은 노력과 비용이 소모되므로 3-디옥시사파논 B를 다량 함유하는 소목 추출물의 분획정제물의 형태로 사용하는 것이 대량으로 제조하여 사용하기에 바람직하다.

소목으로는 건조된 소목을 사용하는 것이 바람직하며, 건조된 소목의 심재를 사용하는 것이 보다 바람직하다.

정제된 형태의 3-디옥시사파논 B는,

건조된 소목에 소목 중량의 1.5~3배 부피의 에탄올을 가하여 3~5시간 동안 추출하여 에탄올 추출물을 얻는 단계; 얻어진 에탄올 추출물에 추출물 중량의 20~30배 부피의 증류수를 가하고 진탕하여 현탁액을 얻는 단계; 얻어진 현탁액을 n-헥산, 에틸아세테이트 및 n-부탄올을 용매로 순차적으로 분획하여 에틸아세테이트 분획물을 얻는 단계; 얻어진 에틸아세테이트 분획물을 Prep-HPLC로 분리하여 2개의 소분획물로 나누는 단계; 및 2번째 소분획물을 칼럼 크로마토그래피에 의하여 정제하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되는 것이 바람직하다.

먼저, 건조된 소목에 소목 중량의 1.5~3배 부피의 에탄올을 가하여 3~5시간 동안 추출한다. 이때 2배 부피의 에탄올을 사용하는 것이 보다 바람직하며, 4시간 동안 추출하는 것이 보다 바람직하다. 추출은 2회 이상 반복하는 것이 바람직하다.

에탄올 추출물에 에탄올 추출물 중량의 20~30배 부피의 증류수를 가하고 진탕한다. 진탕 후 얻어진 현탁액을 n-헥산(n-Hexane), 에틸아세테이트(EtOAc), n-부탄올(n-BuOH)을 용매로 순차적으로 분획하여 에틸아세테이트 분획물을 얻는다.

에틸아세테이트 분획물을 Prep-HPLC로 분리하여 2개의 소분획으로 나누고, 2번째 소분획물을 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 정제된 형태의 3-디옥시사파논 B를 얻는다.

3-디옥시사파논 B가 다량 함유된 소목 추출물 분획정제물은,

건조된 소목에 소목 중량의 1.5~3배 부피의 에탄올을 가하고 40~60℃에서 환류추출법으로 3~5시간 동안 추출하여 소목 조추출물을 얻는 단계; 30% 에탄올을 용매로 사용한 흡착수지를 이용한 칼럼크로마토그래피에 의하여 소목 조추출물에서 색소분획을 제거하는 단계; 50% 에탄올을 용매로 사용한 흡착수지를 이용한 칼럼크로마토그래피에 의하여 3-디옥시사파논 B가 다량 함유된 분획정제물을 얻는 단계; 및 얻어진 3-디옥시사파논 B가 다량 함유된 분획정제물을 35~40℃에서 감압농축하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되는 것이 바람직하다.

먼저, 건조된 소목에 건조된 소목 중량의 1.5~3배 부피의 에탄올을 가하고 40~60℃에서 환류추출법으로 3~5시간 동안 추출하여 소목 조추출물을 얻는다. 50℃에서 4시간 동안 추출하는 것이 보다 바람직하다.

얻어진 소목 조추출물을 흡착수지를 이용한 칼럼크로마토그래피를 진행하여 소목 조추출물 내에 함유된 색소분획을 제거하고 농축하여 3-디옥시사파논 B가 다량 함유된 소목 추출물 분획정제물을 얻는다.

이때 흡착수지가 충진된 칼럼에 소목 조추출물을 흡착시키고 30% 에탄올을 사용하여 색소분획을 제거하고 50% 에탄올을 사용하여 3-디옥시사파논 B가 다량 함유된 소목 추출물 분획정제물을 얻는 것이 바람직하다.

3-디옥시사파논 B가 다량 함유된 소목 추출물 분획의 농축은 35~40℃에서 감압농축하는 것이 바람직하며, 37℃에서 감압농축하는 것이 바람직하다. 이 과정에서 분획정제물 내에 존재하는 에탄올이 휘발된다.

본 발명의 3-디옥시사파논 B는 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.01~5중량%로 함유되는 것이 바람직하고, 0.05~3중량% 함유되는 것이 보다 바람직하며, 0.1~1중량%로 함유되는 것이 가장 바람직하다.

소목에서 분리된 3-디옥시사파논 B는 DPPH 라디칼 소거능(전자공여능)과 NO 생성억제효과로 확인된 항산화효과, 티로시나제 저해활성, 세포내 티로시나제 저해활성 및 멜라닌 내용물 저해활성으로 확인된 미백효과 및 엘라스타제 저해활성, MMP-1 저해활성 및 프로콜라겐 활성능으로 확인된 항주름효과가 우수하다.

따라서 3-디옥시사파논 B를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은 항산화, 미백 및 항주름효과를 나타내어 피부를 개선하는 효과가 우수하다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기 유효성분 외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예를 들면 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 향료, 담체 등을 포함할 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

3-디옥시사파논 B의 분리 및 정제

건조된 소목의 심재{인도네시아산, ㈜휴먼허브} 1kg을 정밀하게 측정한 후 에탄올 2ℓ를 가하여 4시간 동안 2회에 걸쳐 추출하였다.

에탄올 추출물 40g에 증류수 1ℓ를 가하고 진탕한 후 얻어진 현탁액에 n-헥산, 에틸아세테이트 및 n-부탄올을 용매로 사용하여 순차적으로 분획하여 에틸아세테이트 분획물 27.7g을 얻었다.

에틸아세테이트 분획물(27.7g)을 Prep-HPLC(SPOT Prep Ⅱ, Armen, France, Watchers 120 ODS-AP, 5㎛, 250×20mm, 45% aq. MeOH isocratic)로 분리하여 2개의 소분획으로 나누었다.

2번째 소분획물을 세파덱스 LH-20 칼럼 크로마토그래피(Sephadex LH-20 Column Chromatography)(25×400mm, 전개용매 50% aq. MeOH isocratic)를 실시하여 정제된 3-디옥시사파논 B 112mg을 얻었다.

<실험예 1>

3-디옥시사파논 B의 구조동정

실시예 1에서 정제된 성분을 기존 문헌에 기재된 NMR 데이터를 비교하여 최종적으로 구조동정하여 3-디옥시사파논 B임을 확인하였다. 3-디옥시사파논 B의 화학식은 하기 화학식 1과 같다.

3-디옥시사파논 B를 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 분석한 결과는 다음과 같다.

3-디옥시사파논 B; 무색 분말(Colorless powder)(MeOH); ¹H-NMR(500 MHz, C₃D₆O); δ7.73 (1H, d, J=8.6 Hz, H-5), 6.76 (1H, d, J=8.0 Hz, H-5'), 6.76 (1H, d, J=2.0 Hz, H-2'), 6.59 (1H, dd, J=2.0, 8.0 Hz, H-6'), 6.56 (1H, dd, J=2.3, 8.6 Hz, H-6), 6.37 (1H, d, J=2.3 Hz, H-8), 4.35 (1H, dd, J=4.6, 11.5 Hz, H-2β), 4.14 (dd, J=8.9, 11.5 Hz, H-2α), 3.07 (1H, dd, J=4.6, 14.0 Hz, H-9β), 2.71 (1H, m, H-3), 2.54 (1H, dd, J=10.0, 14.0 Hz, H-9α); ¹³C-NMR (125 MHz, C₃D₆O); δ192.3 (C-4), 165.1 (C-7), 164.5 (C-8a), 146.0 (C-3'), 144.5 (C-4'), 131.3 (C-1'), 130.0 (C-5), 121.3 (C-6'), 116.9 (C-5'), 116.2 (C-2'), 114.9 (C-4a), 111.3 (C-6), 103.4 (C-8), 70.7 (C-2), 48.2 (C-3), 32.5 (C-9).

3-디옥시사파논 B의 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 스펙트럼을 도 1에 나타내었다.

<실시예 2>

소목 조추출물(CSE)의 제조

건조된 소목의 심재{인도네시아산, ㈜휴먼허브} 100g을 정밀하게 측정한 후 추출조건인 추출용매(에탄올 또는 에틸 아세테이트), 추출방법(냉침, 환류 또는 초음파), 추출온도(RT 또는 50℃)를 다르게 하여 추출하여 소목 조추출물을 얻었다.

수득한 소목 조추출물을 하기 표 1의 조건으로 고성능액체크로마토그래피(HPLC, Agilent 1260, USA)를 실시하였다.

고속액체크로마토그래피(HPLC) 분석조건

장치(Instrument)
펌프	Agilent 1260 series, 1260 quart pump
검출기	Agilent 1260 series, 1260 DAD
칼럼	Phenomenex Kinetex 2.6 μM C18 100A 150x4.6 mm
작동조건
UV 흡광도	280nm
칼럼온도	30℃
유속	0.5㎖/min
주입부피	3㎕
이동상
이동상 A	0.1% Trifluoroacetic acid in Water
이동상 B	0.1% Trifluoroacetic acid in Acetonitrile
농도구배	시간	이동상 A(%)	이동상 B(%)
	0.00	98.0	2.0
	3.00	75.0	25.0
	20.00	50.0	50.0
	23.00	0.0	100.0
	25.00	0.0	100.0
	25.10	98.0	2.0
	30.00	98.0	2.0

HPLC 크로마토그램의 머무름 시간(R_t, Retention time)에 따른 면적값(Area)을 바탕으로 하기 수학식 1에 따라 소목 조추출물 중에 함유된 3-디옥시사파논 B의 함량(%)을 분석하였다.

(상기 식에서, A_T는 검액에서의 타겟성분 면적이고, A_S는 표준액에서의 타겟성분 면적이다.)

추출조건별 3-디옥시사파논 B의 함량을 비교한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

코드	CSE-1	CSE-2	CSE-3	CSE-4	CSE-5	CSE-6
추출용매	EtOH	EtOH	EtOH	EtOAc	EtOAc	EtOAc
추출방법	냉침	환류	초음파	냉침	환류	초음파
추출온도	RT	50℃	50℃	RT	50℃	50℃
R_t (분)	12.773	12.771	12.775	12.766	12.769	12.782
함량(중량%)	0.27 (2.72mg/g)	0.71 (7.08mg/g)	0.46 (4.59mg/g)	0.29 (2.88mg/g)	0.58 (5.75mg/g)	0.27 (2.77mg/g)

상기 표 2의 결과에서와 같이, 3-디옥시사파논 B의 함량은 에탄올을 추출용매로 사용하고 50℃에서 환류추출을 진행한 CSE-2의 소목 조추출물이 0.71중량%로 다른 추출조건에서 추출한 소목 조추출물에 비하여 높았다.

<실시예 3>

소목 조추출물의 분획정제물(CSD)의 제조

상기 실시예 2에서 제조된 소목 조추출물 중 3-디옥시사파논 B의 함량이 상대적으로 높은 CSE-2의 소목 조추출물에 대하여 Diaion HP-20 흡착수지(Mitsubishi chemical, 180g)를 이용한 컬럼크로마토그래피(glass column, 3×50cm, Ethanol:Water gradient, Bed volume=0.35ℓ)를 진행하여 색소성분을 제거하였다.

흡착수지가 충진되어 있는 컬럼에 CSE-2 조추출물 1.8g을 흡착시켰다. 이어서 30% 주정용 에탄올(30% 에탄올 수용액)을 사용하여 베드볼륨의 약 10배인 3ℓ를 용출시켜 소목의 주성분 브라질린이 포함되어 있는 색소분획을 제거하고 농축하여 CSD-1 분획정제물을 얻었다.

계속하여 50% 주정용 에탄올(50% 에탄올 수용액)을 사용하여 베드볼륨의 약 10배인 3ℓ를 용출시키고 농축하여 CSD-2 분획정제물을 획득하였다.

각 분획정제물 내에 존재하는 주정용 에탄올을 휘발시키기 위하여 37℃에서 감압농축하였다.

<실험예 2>

HPLC 크로마토그램 비교

상기 실시예 2에서 3-디옥시사파논 B의 함량이 상대적으로 높은 소목 조추출물인 CSE-2의 소목 조추출물과 3-디옥시사파논 B의 HPLC 크로마토그램을 비교하여 도 2에 나타내었다.

또한 상기 실시예 3에서 얻어진 CSD-1 분획정제물과 CSD-2 분획정제물의 HPLC 크로마토그램을 비교하여 도 3에 나타내었다.

<실험예 3>

전자공여능(EDA: electron donating ability) 측정

CSE-1과 CSE-2의 소목 조추출물, CSD-1과 CSD-2의 분획정제물, 및 정제된 3-디옥시사파논 B(3-DB)의 전자공여능을 Blois의 방법을 변형하여 측정하였다.

DPPH는 화학적으로 안정화된 프리 라디칼(free radical)을 가지고 있는 수용성 물질로, 아스코르브산(ascorbic acid), 토코페롤(tocopherol), 폴리하이드록시(polyhydroxy) 방향족 화합물 등에 의해 환원되어 짙은 자색이 탈색되므로 다양한 천연 소재로부터 항산화물질을 검색하는데 많이 이용되고 있다. ROS(reactive oxygen species)는 체내 방어기전에 의해 대부분 제거되지만 제거되지 못할 경우 생체분자들과 신속하게 반응하여 단백질의 변성이나 생체막의 지질 과산화, DNA 손상 등을 일으키며, 세포 내로 확산되거나 혈류를 통해 이동된 지질 과산화물은 새로운 라디칼반응을 촉진시켜 각종 질환의 원인으로 작용한다.

각 시료용액 2㎖에 0.2mM의 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 1㎖를 넣어 교반하고 30분간 방치한 다음 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구로는 비타민 C를 사용하였다. 전자공여능은 하기 수학식 2에서와 같이 계산하여 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4의 결과에서와 같이, 소목 조추출물, 분획정제물 및 3-디옥시사파논 B(3-DB)의 DPPH 라디칼 소거율을 측정한 결과 모두 90% 이상의 소거율을 나타내었으며, 특히 CSD-2 분획정제물의 경우 94%의 소거율을 나타내어 가장 우수한 활성을 나타내었다.

이 결과로부터 CSD-2 분획정제물과 3-디옥시사파논 B(3-DB)이 우수한 라디칼 소거활성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.

<실험예 4>

엘라스타제(Elastase) 저해활성 측정

CSE-1과 CSE-2의 소목 조추출물, CSD-1과 CSD-2의 분획정제물, 및 소목 추출물에서 분리되어 정제된 3-디옥시사파논 B(3-DB)의 엘라스타제 저해활성을 Cannell 등의 방법에 따라 측정하였다.

엘라스타제는 진피 내 피부탄력을 유지하는데 중요한 기질인 엘라스틴을 분해하는 효소이며, 다른 중요한 기질단백질인 콜라겐을 분해할 수 있는 비특이적 가수분해 효소이다. 따라서 엘라스타제 저해제는 피부주름을 개선하는 작용을 나타내며, 우르솔산(ursolic acid) 등이 엘라스타제 저해제로서 이용되고 있다. 피부의 진피조직 속에는 콜라겐과 피부의 탄력성에 관련된 엘라스틴이 그물망 구조를 형성하고 있는데, 엘라스틴이 엘라스타제에 의해 분해되어 그물망 구조가 깨어지면서 피부가 처지고 주름이 생기는 내인성 피부노화가 발생한다. 피부노화의 주원인 중의 하나인 엘라스타제의 활성을 저해함으로써 피부노화를 억제할 수 있다.

기질로서 N-숙시닐-(L-Ala)₃-p-나이트로아닐리드 {N-succinyl- (L-Ala)₃-p-nitroanilide}를 사용하여 37℃에서 20분 동안 기질로부터 생성되는 p-나이트로아닐리드(p-nitroanilide)의 생성량을 445nm에서 측정하였다.

즉, 각 시료용액을 일정농도가 되도록 조제하여 0.5㎖씩 시험관에 취하고, 50mM tris-HCl 버퍼(pH 8.6)에 용해시킨 돼지 췌장 엘라스타제(porcine pancreas elastase)용액 (2.5U/㎖) 0.5㎖를 가한 후 기질로 50mM Tris-HCl 완충액(pH 8.6)에 용해시킨 녹인 N-숙시닐-(L-Ala)₃-p-나이트로아닐리드(0.5㎎/㎖)를 첨가하여 20분 동안 반응시켜 측정하였다. 대조구로는 EGCG를 사용하였다.

엘라스타제 저해활성은 상기 수학식 2에서와 같이 계산하여 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5의 결과에서와 같이, CSE-1 조추출물과 CSD-1 분획정제물의 경우 1000㎍/㎖의 농도에서 35%와 33%의 저해율을 나타내었으며, 3-디옥시사파논 B(3-DB)의 경우 42%의 활성을 나타내었다. CSD-2 분획정제물의 경우 동일한 농도에서 78%의 아주 높은 저해율을 나타내었다.

이 결과로부터 CSD-2 분획정제물과 3-디옥시사파논 B(3-DB)이 우수한 엘라스타제 저해활성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.

<실험예 5>

MMP-1 저해 활성 측정

CSE-1과 CSE-2의 소목 조추출물, CSD-1과 CSD-2의 분획정제물, 및 소목 추출물에서 분리되어 정제된 3-디옥시사파논 B(3-DB)의 MMP-1 저해활성을 다음과 같이 측정하였다.

체내에서 생성되는 여러 종류의 MMPs 중 MMP-1은 콜라겐에 특이적으로 작용하는 프로테아제(protease)로 MMP-1의 활성을 억제하여 콜라겐의 분해를 감소시키면 피부조직의 탄력을 유지하고 주름생성을 예방할 수 있는 것으로 알려져 있다.

실험을 위한 세포로는 휴먼 섬유아세포인 CCD-986sk 세포를 사용하였다. CCD-986sk 세포에 UVB를 조사하여 MMP-1을 과발현시켰다. MMP-1이 과발현된 CCD-986sk 세포를 1×10⁴ cells/well 농도로 96-웰 플레이트에 접종한 후, 각 well에 각 시료를 10㎍/㎖의 농도로 첨가하여 CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 대조구에는 EGCG 화합물을 12.5㎍/㎖의 농도로 처리하였다.

24시간 동안 배양한 후 세포의 배양액을 모아서 Amersham matrix metallproteinase-1, Human, Biotrak ELISA system(GE Healthcare)을 사용하여 MMP-1의 저해활성을 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서와 같이, CSE-2 조추출물과 CSE-2 조추출물의 경우 대조구에 비해 80%에 가까운 발현 저해율을 나타내었으며, CSD-2 분획정제물과 3-디옥시사파논 B(3-DB)의 경우 90%에 가까운 발현 저해율을 나타내어 대조구 물질인 EGCG 보다 더 우수한 MMP-1발현 저해활성을 나타내었다.

이 결과로부터 CSD-2 분획정제물과 3-디옥시사파논 B(3-DB)이 우수한 MMP-1 저해활성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.

<실험예 6>

프로콜라겐(Pro-collagen) 타입 I 활성능 측정

CSE-1과 CSE-2의 소목 조추출물, CSD-1과 CSD-2의 분획정제물, 및 소목 추출물에서 분리되어 정제된 3-디옥시사파논 B(3-DB)의 프로콜라겐 활성능을 다음과 같이 측정하였다.

피부세포의 주름과 관련된 콜라겐은 프로콜라겐이라는 전구물질의 형태로 합성된다. 따라서 프로콜라겐의 양을 측정함으로써 세포내에서의 콜라겐 합성정도를 확인할 수 있다. 프로콜라겐의 합성을 촉진시킬 수 있는 소재는 탄력있는 피부를 만들어 주는 화장품 원료로서 사용가능성이 높다.

사람 섬유아세포인 CCD-986sk 세포를 5×10⁴ cell/well 농도로 6-웰 플레이트에 접종한 후 24시간 동안 안정화시켰다. 24시간 후 UV-B(312nm)를 조사하여 프로콜라겐을 감소시킨 후 시료용액으로 CSE-1, CSE-2, CSD-1과 CSD-2는 10㎍/㎖의 농도로 처리하고 3-디옥시사파논 B(3-DB)은 12.5 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 대조구에는 EGCG 화합물을 12.5 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다.

세포의 배양액을 수거하여 실험에 사용하였으며 PIP(Pro-collagen type-Ⅰ C peptide) EIA 키트(Takara)를 이용하여 플레이트 판독기로 450nm에서 흡광도를 측정하고 표준곡선을 통해 계산식을 구하여 세포 배양액 내 프로콜라겐의 양을 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7의 결과에서와 같이, CSE-2 조추출물과 CSD-1 분획정제물의 경우 20%의 프로콜라겐 활성능을 나타내었으며, CSD-2 분획정제물과 3-디옥시사파논 B(3-DB)의 경우 30% 이상의 프로콜라겐 활성능을 나타내었다.

이 결과로부터 CSD-2 분획정제물과 3-디옥시사파논 B(3-DB)이 우수한 프로콜라겐 활성능을 나타낸다는 것을 알 수 있다.

<실험예 7>

티로시나제(Tyrosinase) 저해활성 측정

CSE-1과 CSE-2의 소목 조추출물, CSD-1과 CSD-2의 분획정제물, 및 소목 추출물에서 분리되어 정제된 3-디옥시사파논 B(3-DB)의 티로시나제 저해활성을 Yagi 등의 방법에 따라 측정하였다.

피부의 색조를 결정하는 주요한 인자인 멜라닌은 표피 기저층의 멜라노사이트라고 불리는 색소세포 내의 멜라노좀에서 생합성된다. 멜라닌 합성의 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)이다. 티로신은 멜라닌세포 내의 티로시나제에 의하여 DOPA(L-3,4-dihydroxyl phenylalanine), DOPA 퀴논(quinone)으로 산화된다. 그 후 DOPA 퀴논이 DOPA 크롬(chrome), 5,6-디하이드록시인돌(5,6-dihydroxyindole), 인돌-5,6-퀴논(indole-5,6-quinone)이 되고, 이어서 인돌-5,6-퀴논으로의 중합에 의해 멜라닌을 생성하는 것으로 알려져 있다.또한 티로시나제는 피부 멜라닌 생성에 있어서 매우 중요한 역할을 하고 있으며, 멜라노좀 내에서 티로신을 산화시켜 DOPA를 만드는 티로신 하이드록실라제(tyrosine hydoxylase)로, DOPA를 산화시켜 DOPA 퀴논을 만드는 DOPA 옥시다제(DOPA oxidase)로서 작용하여 멜라닌 중합체를 합성하는데 중요한 효소로 작용한다. 따라서 티로시나제를 저해하면 피부 내에서 멜라닌 중합체의 생합성을 효과적으로 저해할 수 있다.

티로시나제 저해활성을 측정하기 위하여 버섯 유래의 티로시나제를 사용하였다.

반응구는 0.175M 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer)(pH 6.8) 0.5㎖에 10mM L-DOPA를 용해시킨 기질액 0.2㎖ 및 시료용액 0.1㎖의 혼합액에 버섯 티로시나제(110U/㎖) 0.2㎖을 첨가하고 25℃에서 2분 동안 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA 크롬을 475nm에서 측정하였다. 대조구로는 비타민 C를 사용하였다

티로시나제의 저해활성은 상기 수학식 2에서와 같이 계산하여 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8의 결과에서와 같이, CSE-1 조추출물의 경우 티로시나제 저해활성이 가장 낮았다. CSE-2 조추출물과 CSD-1 분획정제물의 경우 티로시나제 저해율이 각각 11%, 15%이었고, 3-디옥시사파논 B(3-DB)는 27%, CSD-2 분획정제물은 36%의 티로시나제 저해율을 나타내었다.

이 결과로부터 CSD-2 분획정제물과 3-디옥시사파논 B(3-DB)이 우수한 티로시나제 저해활성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.

<실험예 8>

세포내 티로시나제(Cellular tyrosinase) 저해활성 측정

CSE-1과 CSE-2의 소목 조추출물, CSD-1과 CSD-2의 분획정제물, 및 소목 추출물에서 분리되어 정제된 3-디옥시사파논 B(3-DB)의 세포내 티로시나제 저해활성을 다음과 같이 측정하였다.

멜라노마(B16F10) 세포를 각 배양접시에 가득 배양한 후 배지를 제거하고 PBS로 세척하였다.

각 배양접시에 라이시스 버퍼(67mM sodium phosphate buffer, 1% triton X-100, 0.1mM phenylmethyl sulfonyfluoride) 100㎕를 첨가한 후 얼음에 방치하여 세포를 파괴시키고, 세포를 수집하여 초음파처리(ultra sonication)하였다. 이를 1시간 동안 방치한 후 13,200rpm에서 20분 동안 원심분리하여 얻어진 상층액을 효소용액으로 사용하였다.

67mM 인산버퍼(pH6.8)에 용해시킨 8.0mM의 L-DOPA 120㎕와 시료용액 40㎕를 96-웰 플레이트에 넣은 후 67mM 인산버퍼(pH 6.8)에 용해시킨 효소용액 40㎕을 첨가하여 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 배양 후 생성된 DOPA 크롬의 양을 490nm에서 측정하였다. 대조구로는 알부틴(arbutin)을 사용하였다.

세포내 티로시나제의 저해활성은 상기 수학식 2에서와 같이 계산하여 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에서와 같이, CSE-1 조추출물, CSE-2 조추출물, CSD-1 분획정제물, CSD-2 분획정제물의 경우 10㎍/㎖의 농도에서 각각 세포내 티로시나제 활성을 17%, 23%, 23%, 35% 저해하였으며, 3-디옥시사파논 B(3-DB)은 12.5㎍/㎖의 농도에서 세포내 티로시나제 활성을 38% 감소시켰다. 이는 대조구인 알부틴이 50㎍/㎖ 농도에서 티로시나제 활성을 15% 감소시킨 것에 비해 매우 높은 활성인 것으로 확인되었다.

이 결과로부터 CSD-2 분획정제물과 3-디옥시사파논 B(3-DB)이 우수한 세포내 티로시나제 저해활성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.

<실험예 9>

멜라닌 내용물(Melanin contents) 활성 측정

CSE-1과 CSE-2의 소목 조추출물, CSD-1과 CSD-2의 분획정제물, 및 소목 추출물에서 분리되어 정제된 3-디옥시사파논 B(3-DB)가 멜라닌 합성에 미치는 영향을 다음과 같이 측정하였다.

B16F10 멜라노마 세포를 6-웰 플레이트에 5×10⁴ cells/㎖의 농도로 분주한 후 37℃, 5% CO₂에서 24시간 동안 배양하고 각 시료를 처리하여 24시간 동안 재배양하였다. 대조구로는 알부틴을 사용하였다.

재배양한 후 1% Triton-X 100이 들어있는 PBS용액으로 세포를 용해시켜 E-튜브에 옮겨 담고 4℃, 13,000rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리한 상등액을 제거하고 세포 펠렛에 10% DMSO가 들어있는 1N NaOH 수용액을 첨가하여 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에서와 같이, CSD-2 분획정제물의 경우 10㎍/㎖의 농도에서 각각 50% 이상의 멜라닌 내용물 함량을 감소시켰으며, 3-디옥시사파논 B(3-DB)은 12.5㎍/㎖ 농도에서 멜라닌 내용물 함량을 59% 감소시켰다.

이 결과로부터 CSD-2 분획정제물과 3-디옥시사파논 B(3-DB)이 우수한 멜라닌 내용물 함량 감소효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.

<실험예 10>

NO(nitric oxide) 생성억제 측정

CSE-1과 CSE-2의 소목 조추출물, CSD-1과 CSD-2의 분획정제물, 및 소목 추출물에서 분리되어 정제된 3-디옥시사파논 B(3-DB)의 NO 생성억제 정도를 측정하기 위하여 이들 시료를 세포에 처리하여 생성되는 NO의 양을 다음과 같이 측정하였다. 대조구로는 PDTC를 사용하였다.

NO의 농도는 배양액 내의 아질산염(nitrite) 농도를 그리스 시약을 이용하여 측정하였다.

Raw 264.7 세포에 각 시료를 전처리하고 1시간 후 100ng/㎖의 LPS를 처리하여 18시간 동안 배양하였다. 배양액 50㎕와 동량의 그리스 시약을 넣어주고 10분 동안 상온에서 반응시킨 후, ELISA 판독기로 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

아질산나트륨의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액 내의 NO 농도를 결정하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에서와 같이, LPS 처리군은 LPS 무처리군에 비하여 높은 NO 생성양을 나타내었으며 각 시료 모두 NO 생성을 감소시켰다. CSD-2 분획정제물과 3-디옥시사파논 B(3-DB)도 NO 생성을 크게 감소시켰다.

이 결과로부터 CSD-2 분획정제물과 3-디옥시사파논 B(3-DB)이 우수한 NO 생성억제 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.

Claims

3-디옥시사파논 B(3-Deoxysappanone B); 소목으로부터 분리 및 정제하여 얻은 3-디옥시사파논 B; 소목 조추출물로부터 3-디옥시사파논 B를 농축시킨 분획정제물 중 어느 하나를 유효성분으로 함유하는, 항산화, 미백 및 항주름효과가 우수한 피부 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물 총 중량에 대하여 3-디옥시사파논 B가 0.01~5중량% 함유되는 것을 특징으로 하는 피부 개선용 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 소목으로부터 분리 및 정제하여 얻은 3-디옥시사파논 B는,
건조된 소목에 소목 중량의 1.5~3배 부피의 에탄올을 가하여 3~5시간 동안 추출하여 에탄올 추출물을 얻는 단계;
얻어진 에탄올 추출물에 추출물 중량의 20~30배 부피의 증류수를 가하고 진탕하여 현탁액을 얻는 단계;
얻어진 현탁액을 n-헥산, 에틸아세테이트 및 n-부탄올을 용매로 순차적으로 분획하여 에틸아세테이트 분획물을 얻는 단계;
얻어진 에틸아세테이트 분획물을 Prep-HPLC로 분리하여 2개의 소분획물로 나누는 단계; 및
2번째 소분획물을 칼럼 크로마토그래피에 의하여 정제하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조된 것임을 특징으로 하는 피부 개선용 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 소목 조추출물로부터 3-디옥시사파논 B를 농축시킨 분획정제물은,
건조된 소목에 소목 중량의 1.5~3배 부피의 에탄올을 가하고 40~60℃에서 환류추출법으로 3~5시간 동안 추출하여 소목 조추출물을 얻는 단계;
30% 에탄올을 용매로 사용한 흡착수지를 이용한 칼럼크로마토그래피에 의하여 소목 조추출물에서 색소분획을 제거하는 단계;
50% 에탄올을 용매로 사용한 흡착수지를 이용한 칼럼크로마토그래피에 의하여 3-디옥시사파논 B가 다량 함유된 분획정제물을 얻는 단계; 및
얻어진 3-디옥시사파논 B가 다량 함유된 분획정제물을 35~40℃에서 감압농축하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조된 것임을 특징으로 하는 피부 개선용 화장료 조성물.
항산화, 미백 및 항주름효과가 있는 화장료용으로 사용하기 위하여 소목으로부터 3-디옥시사파논 B를 분리 및 정제하는 방법으로,
건조된 소목에 소목 중량의 1.5~3배 부피의 에탄올을 가하여 3~5시간 동안 추출하여 에탄올 추출물을 얻는 단계;
얻어진 에탄올 추출물에 추출물 중량의 20~30배 부피의 증류수를 가하고 진탕하여 현탁액을 얻는 단계;
얻어진 현탁액을 n-헥산, 에틸아세테이트 및 n-부탄올을 용매로 순차적으로 분획하여 에틸아세테이트 분획물을 얻는 단계;
얻어진 에틸아세테이트 분획물을 Prep-HPLC로 분리하여 2개의 소분획물로 나누는 단계; 및
2번째 소분획물을 칼럼 크로마토그래피에 의하여 정제하는 단계를 포함하는,
소목으로부터 3-디옥시사파논 B의 분리 및 정제 방법.
항산화, 미백 및 항주름효과가 있는 화장료용으로 사용하기 위하여 소목 조추출물로부터 3-디옥시사파논 B를 농축시킨 분획정제물을 제조하는 방법으로,
건조된 소목에 소목 중량의 1.5~3배 부피의 에탄올을 가하고 40~60℃에서 환류추출법으로 3~5시간 동안 추출하여 소목 조추출물을 얻는 단계;
30% 에탄올을 용매로 사용한 흡착수지를 이용한 칼럼크로마토그래피에 의하여 소목 조추출물에서 색소분획을 제거하는 단계;
50% 에탄올을 용매로 사용한 흡착수지를 이용한 칼럼크로마토그래피에 의하여 3-디옥시사파논 B가 다량 함유된 분획정제물을 얻는 단계; 및
얻어진 3-디옥시사파논 B가 다량 함유된 분획정제물을 35~40℃에서 감압농축하는 단계를 포함하는,
소목 조추출물로부터 3-디옥시사파논 B를 농축시킨 분획정제물의 제조방법.