KR20110022013A

KR20110022013A - 송악 추출물을 함유하는 미백 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20110022013A
Application number: KR1020110007040A
Authority: KR
Inventors: 김기옥; 한종헌; 고광효; 이정아; 김행범; 강민철; 이주엽; 김봉석; 고영국; 진호경; 안승현; 진희철; 이건국; 이강태
Original assignee: 재단법인 제주테크노파크
Priority date: 2011-01-24
Filing date: 2011-01-24
Publication date: 2011-03-04

Abstract

본 발명은 멜라닌 생성 억제성 및 티로시나제 저해활성을 갖는 송악 추출물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 송악 추출물은 미백 화장료 조성물 및 멜라닌 생성 억제제로 사용할 수 있다.

Description

송악 추출물을 함유하는 미백 화장료 조성물{Cosmetic Composition for Skin Whitening Comprising Extract of Hedera rhombea}

본 발명은 멜라닌 생성 억제성 및 티로시나제 저해활성을 갖는 송악 추출물을 제조하는 방법 및 그를 유효성분으로 하여 미백 화장료 조성물 및 멜라닌 생성 억제제로 사용하는 방법에 관한 것이다.

멜라닌(melanin)은 자외선으로부터 생체를 보호하는 중요한 방어 수단으로서 동물, 식물 및 미생물에 널리 존재하는 고분자의 천연 색소이다(Bell et al., 1986). 그러나 과도한 멜라닌 합성은 인체에 기미, 주근깨 및 피부 반점을 형성하고 피부노화를 촉진하며 피부암 유발에 관여하는 것으로 알려져 있다(Chen et al., 1991; Urabe et al., 1994).

멜라닌 생합성에는 멜라닌 세포에 존재하는 티로시나제(tyrosinase)의 작용이 가장 중요한 것으로 알려져 있다. 티로시나제는 구리를 조효소로 갖는 효소로서, 사람을 포함하여 각종 동물, 식물 및 미생물에 넓게 분포하며, 아미노산 중 L-티로신(tyrosine)을 L-도파(L-DOPA; dihydroxy-phenylalanine)로 히드록실화하고, 다시 L-도파를 멜라닌 중합체의 구성요소인 도파퀴논(dopaquinone)으로 산화시키는 폴리페놀 옥시다제 (polyphenol oxidase)의 일종이다(Korner A. et al ., Science 217: 1163-1165, 1982). 도파퀴논은 다시 류코크롬(leucochrome)으로 산화되고, 류코크롬의 산화에 의해 생성된 도파크롬이 5,6-디히드록시인돌(5,6-dehydroxy indole; DHI) 또는 5,6-디히드록시인돌 카르복실산(5,6-dehydroxyindole carboxylic acid)으로 전환되며 이 DHI등이 중합을 통해서 단백질과 결합하여 멜라닌을 형성하게 된다(Pavel S. Dynamics of melanogenesis intermediates. J Invest Dermatol 1993 Feb;100(2 suppl):162S-165S).

따라서 멜라닌 과생성 및 침착 저해를 통한 피부 미백 및 피부암 예방을 위한 대부분의 연구가 티로시나제의 활성 저해에 초점을 맞추고 있다. 현재까지 알려지고 있는 티로시나제 저해제로 히드로퀴논, 4-히드록시아니솔, 아스크로브산 유도체, 코지산(kojic acid), 아젤라인산(azelaic acid), 코르티코스테로이드(corticosteroid), 레티노이드(retinoid), 알부틴 및 카테킨 등이 있으나, 이들의 안전성과 경제성 등의 문제점으로 사용에 있어서 어려움이 있다(Tomita et al., 1990; Cabanes et al., 1994; Jung et al., 1995).

실제로 기미, 주근깨, 반점 및 임신기 과색소 침착과 같은 과잉 색소증 치료에 국부적으로 사용되고 있는 4-히드록시아니솔 및 히드로퀴논 등은 강력한 멜라닌 저해활성은 있으나 동시에 색소세포의 변성 또는 치사를 유발하고 세포 본래의 기능을 손상시키는 등의 부작용을 나타낸다.

특히 히드로퀴논 계열의 화합물을 멜라닌 생합성을 저해하는 미백용 크림으로 개발되어 사용되었으나, 세포독성으로 인한 피부 자극 또는 피부병을 유발하는 것으로 알려져 현재 일부 국가에서만 사용이 허가되고 있는 실정이다.

따라서 미리 안정성이 입증되어 있는 천연물을 이용하여 멜라닌 색소 형성 저해물질을 선별하려는 시도들이 이루어지고 있다. 이에 따라 최근에는 천연식물을 이용한 미백 원료, 기능성 식품 및 기능성 화장료 등 각 분야에서 인공물질이 아닌 천연물을 이용한 연구가 활발히 진행되고 있다(Kim et al., 2003; Suk et al., 2004; Lee et al., 2005).

이에, 본 발명자들은 인체 안전성이 확보된 천연 유래인 송악 추출물이 멜라닌 생성 억제성 및 티로시나제 저해활성을 나타내어 미백 효능이 우수함을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 멜라닌 생성 억제성 및 티로시나제 저해활성을 갖는 송악 추출물을 제조하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 송악 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 송악 추출물을 함유하는 미백 화장료 조성물 및 멜라닌 생성 억제제를 제공하는 것이다.

하나의 양태에서 본 발명은 멜라닌 생성 억제성 및 티로시나제 저해활성을 갖는 송악 추출물을 제조하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 송악 추출물에 관한 것이다.

본 발명에 사용되는 송악(Hedera rhombea)은 두릅나무과에 속하는 상록덩굴식물로서 제주도를 비롯하여 전남, 전북, 경남, 경북 및 충남 등지의 산기슭 숲속에서 자생하며, 일본, 중국 및 대만에도 분포한다. 특히 상춘등자(常春藤子)로도 불리는 열매와 상춘등(常春藤)이라 불리는 줄기와 잎에는 루틴(rutin), 키주타사포닌 K₅(kizutasaponin K₅), 카페산(caffeic acid) 및 헤데라제닌-3-아라비노사이드(hederagenin-3-arabinoside)와 같은 다양한 성분들이 들어있어 항경련, 진통, 혈액 응고억제, 부종억제 및 항염증 작용 등 다양한 효능 효과가 있는 것으로 잘 알려져 있다. 생약명으로는 상춘등, 삼각풍, 토풍등 및 백각오공 등으로 불린다. 가을에 잎과 줄기를 채취하여 잘게 썰어서 햇볕에 말려서 사용하며, 거풍, 소종, 풍습성 관절염, 안면신경마비, 현증, 간염, 황달, 종기, 요통, 고혈압, 피부 재생 촉진, 진정 작용, 피부 진균 억제작용, 배농 및 소염작용을 하는 것으로 알려져 있다. 성분으로는 헤데린이라는 결정성 사포닌이 있으며, 이는 헤데라제닌과 아라비노오스, 람노오스로 물 분해되며 녹는점은 섭씨 332 내지 334℃이다. 열매에는 페트로셀린산, 팔미트산, 올레산, 리놀산 및 적은 양의 페트로셀리딘산으로 된 기름이 있다. 줄기에도 잎에 있는 성분이 들어 있다. 민간에서는 줄기와 잎을 물에 축여 찧어 얻은 즙을 각혈에 사용되는 것으로 알려진 물질이다.

청구범위를 포함하는 본 명세서에서 상기 "추출물" 이란 액상 형태, 분말 형태의 추출물을 모두 포함하는 의미이다.

구체적인 양태로서, 본 발명은

(a) 송악 전초를 세척하는 단계;

(b) (a)에서 세척된 전초를 열풍 건조 후 분쇄하는 단계;

(c) (b)에서 수득된 분쇄물을 유기 용매에 침적하고 침출 및 여과하는 단계;

(d) 침출 및 여과 과정을 2 내지 3회 반복하는 단계; 및

(e) 상기 (d)단계의 여과액을 감압농축 및 동결 건조 후 분말을 얻는 단계

를 포함하는 방법에 의해 제조된 멜라닌 생성 억제성 및 티로시나제 저해활성을 갖는 송악 추출물을 제조하는 것이다.

단계 (a)에서 송악 전초를 흐르는 물에 세척 후, 세척된 전초를 단계 (b)에 의해 열풍 건조 후 분쇄한다. 상기 열풍 건조는 3일 동안 30 내지 50℃에서 수행되는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 40℃에서 수행되는 것이다.

단계 (b)에서 수득된 분쇄물을 유기 용매에 침척한다. 상기 유기 용매는 70% 에탄올인 것이 바람직하다. 그 후 교반하여 침출하고, 여과기로 여과한다. 상기 교반은 2 내지 3일 동안 실온에서 수행하는 것이 바람직하다.

단계 (d)에서 침출 및 여과 과정을 2 내지 3회 반복하여 수득한 여과액을 감압농축 및 동결 건조를 수행하여 분말 형태로 송악 추출물을 제조할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기와 같이 추출된 송악 추출물을 유기 용매로 분획함으로써 제조되는, 멜라닌 생성 억제성 및 티로시나제 저해활성을 갖는 송악 분획물을 제공한다. 송악 추출물은 유기 용매로 분획하는 것은 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있으며 상기 분획 용매는 물, 증류수, 1 내지 4의 탄소 수를 갖는 알코올, 에틸아세테이트, n-헥산 및 이들의 혼합 용매로 구성된 군에서 선택된 것이 바람직하다.

구체적인 일 실시예에서, 본 발명자는 상기 추출물 및 분획물 중, 에탄올 추출물과 n-헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 분획물을 DPPH 라디칼 소거활성, NO(nitric oxide) 소거활성, 크산틴 산화효소 억제 및 수퍼옥사이드 소거활성 측정과 같은 항산화 실험을 수행하였다.

그 결과 송악 추출물 및 분획물 중 에틸아세테이트 분획물이 항산화 활성이 가장 우수한 것으로 조사되었다. 그리하여, 상기 에틸아세테이트 분획물을 Prep-LC를 이용하여 단일 화합물인 화합물 1 및 2를 분리하였고, 이를 NMR 및 LC-MS를 이용하여 구조분석을 진행한 결과, 화합물 1은 루틴, 화합물 2는 카페산 임을 알 수 있었다.

또한 상기 추출물 및 분획물을 세포 생존률, 멜라닌 생성량, 티로시나제 활성도 및 NO 생성 억제 정도를 알아보았다.

그 결과 송악 추출물 및 분획물에 의해 세포의 성장이 억제됨을 알 수 있었으며, 농도 의존적으로 멜라닌 생성량, 티로시나제 활성도 및 NO 생성이 억제되는 경향을 나타냄을 확인할 수 있었다.

본 발명의 제조방법에 의해 제조된 송악 추출물 및 분획물은 멜라닌 생성 억제성 및 티로시나제 저해활성을 갖는 송악 추출물 및 분획물은 활성산소종 등 라디칼에 의해 발생하는 여러 만성질환 발병을 지연시키고 나아가서 예방하는데 효과적일 것으로 기대되며, 특히 항노화 및 항염증 효과와 관련된 미백관련 기능성 화장료 조성물 및 멜라닌 생성 억제제로 사용될 수 있다.

다른 양태에 있어서 본 발명은 송악 추출물 및 분획물을 유효성분으로 하는, 멜라닌 생성 저해, 피부 노화 방지 및 미백 기능을 갖는 화장료 조성물에 관한 것이다.

미백 화장료 조성물은 본 발명의 송악 추출물 및 분획물을 유효성분으로 하여, 스킨, 로션, 에센스, 영양 크림, 맛사지 크림 및 클렌징 크림과 같은 각종 크림, 클렌징 폼, 비누, 자외선 차단제 및 팩 등의 기초 화장료 및 파우더, 파운데이션 및 메이크업 베이스를 비롯한 색조 화장료 등으로 제형화될 수 있다. 이때 조성물의 분포를 용이하게 하기 위하여, 조성 내 활성성분에 대한 희석제, 분산제 또는 운반체로서 작용하는, 화장료 조성물에 허용되는 각종 부형제를 포함할 수도 있다. 수분 이외의 부형제 또는 수분을 포함하는 부형제로는 액체 또는 고체 형태의 피부연화제, 용매, 습윤제, 유지성분, 에몰리언트제, 계면활성제, 유기 및 무기 안료, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화방지제, pH 조정제, 향료, 증점제 또는 분말 등을 포함할 수도 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또 다른 양태에 있어서 발명은 송악 추출물 및 분획물을 유효성분으로 하는, 멜라닌 과잉 생성에 의한 질병의 치료를 위한 억제제 조성물을 제공한다.

억제제 조성물은 유효 성분으로서 송악 추출물 및 분획물 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있는데, 이러한 약제학적으로 허용되는 담체는 약품 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 또는 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 억제제 조성물은 또한 첨가제로서 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물 및 멜라닌 생성 억제제 조성물은 알부틴, 코직산 등 공지의 미백 활성 또는 멜라닌 억제 활성을 가진 성분을 추가적으로 포함할 수 있다.

이러한 본 발명의 화장료 및 멜라닌 생성 억제제 조성물은 유효 성분인 송악 추출물 및 분획물에 의해 멜라닌 생성 억제 및 미백에 필요한 탁월한 효과를 가질 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 송악 추출물은 멜라닌 생성 및 티로시나제 활성을 억제하므로 피부 노화 방지, 피부 보호 및 미백 기능을 가지는 화장료, 기미, 주근께, 반점 또는 임신기 과색소 침착 등의 과잉 색소증 치료제 등으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 2에서 얻어진 화합물 1의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에서 얻어진 화합물 1의 ¹³C NMR 스펙트럼이다.
도 3은 본 발명의 실시예 2에서 얻어진 화합물 1의 LC-MS 스펙트럼이다.
도 4는 본 발명의 실시예 2에서 얻어진 화합물 1의 구조식이다.
도 5는 본 발명의 실시예 2에서 얻어진 화합물 2의 ¹H NMR 스펙트럼이다.
도 6은 본 발명의 실시예 2에서 얻어진 화합물 2의 ¹³C NMR 스펙트럼이다.
도 7은 본 발명의 실시예 2에서 얻어진 화합물 2의 LC-MS 스펙트럼이다.
도 8은 본 발명의 실시예 2에서 얻어진 화합물 2의 구조식이다.
도 9는 본 발명의 송악 추출물 및 분획물에 의한 세포 성장 억제 효과를 농도별로 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 송악 추출물 및 분획물에 의한 멜라닌 생성 억제 효과를 농도별로 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 송악 추출물 및 분획물에 의한 티로시나제 활성 저해 효과를 농도별로 나타낸 그래프이다.
도 12a는 본 발명의 송악 추출물 및 분획물에 의한 MTT 분석결과를 농도별로 나타낸 그래프이다.
도 12b는 본 발명의 송악 추출물 및 분획물에 의한 NO 생성 억제 효과를 농도별로 나타낸 그래프이다.

제조예 1: 송악 추출물의 제조

송악 전초를 흐르는 물에 세척 후 3일 동안 40℃ 열풍 건조하여 분쇄기로 분쇄하였다. 이 분쇄물을 70% 에탄올에 침적시키고 2 내지 3일 동안 실온에서 교반하여 침출하였다. 이 침출물을 여과기로 여과하고, 침출 및 여과 과정을 2 내지 3회 더 반복한 다음, 이 여과액을 감압농축하고, 동결건조 하여 분말형태로 제조하였다.

제조예 2: 유기용매 분배분획

상기 분말로 된 송악 추출물을 10g을 1L 증류수에 용해시킨 후 2L의 분별 깔대기로 1L 의 n-헥산을 혼합하여 n-헥산 층과 수층으로 2회 분획하여 n-헥산층을 얻었다.

상기 수층에 1L의 에틸아세테이트를 첨가하고 에틸아세테이트층과 수층으로 3회 분획하여 에틸아세트층을 얻었다.

상기 수층에 1L의 부탄올을 첨가하여 부탄올층과 수층을 분획하고 이를 3회 실시하여 부탄올층을 얻었다.

상기에서 얻은 각각의 분획물을 여과 및 감압 농축하고 동결 건조하여 n-헥산 분획물 0.7g, 에틸아세테이트 분획물 3.7g, 부탄올 분획물 3.2g, 물 분획물 2.4g을 얻었다.

실시예 1: 항산화 실험

1. DPPH 라디칼 소거활성

전자공여능(electron donating ability)측정은 Blosis방법에 의한 DPPH 자유 라디칼 소거법에 따라 측정하였다.

먼저 메탄올에 녹인 다양한 농도시료를 각각 96 well plate에 100㎕씩 분주하고, 0.4mM DPPH 용액을 동일한 양으로 첨가하여 실온에서 10분 동안 반응시킨 후 517㎚에서 측정하였다. 이때 대조군으로는 아스코르브산(ascorbic acid)을 사용하였다. DPPH 라디칼 소거활성은 하기식으로부터 산출하였다.

DPPH 라디칼 소거활성(%)= (A_control-A_sample)/A_control ×100

A_sample = 시료를 첨가한 반응액의 흡광도

A_control = 시료 대신 메탄올을 첨가한 반응액 흡광도

DPPH 소거 활성은 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC₅₀)로 표시하였다.

	DPPH IC₅₀
	잎	열매
에탄올 추출물	>400	329.3
n-헥산 분획물		-
에틸아세테이트 분획물		81.74
부탄올 분획물		389.86
물 분획물		>400
아스코르브산	8.23

상기 표 1은 각 용매에 의해 얻어진 송악 추출물 및 분획물 중에서 에틸아세테이트 분획물이 가장 DPPH 소거 활성이 높음을 나타냈다. 그러나, 아스코르브산보다는 소거 활성이 낮음을 알 수 있었다.

2. NO(Nitric oxide) 소거활성 측정

자연적으로 nitric oxide를 생성하는 물질인 sodium nitroprusside(SNP)를 사용하여 시료의 nitric oxide 소거 활성을 분석하였다. 10mM SNP 용액에 200㎕의 시료를 농도별로 첨가하고 25℃에서 3시간 동안 반응시킨 후 동일한 양의 Griess reagent(2.5% phophoric acid, 1% sulfanilamide, 0.1% N-1-naphthylethylenediamine를 첨가하였다. 실온에서 10분간 반응하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였다. Nitric oxide 소거활성은 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC₅₀)로 표시하였다.

	NO IC₅₀
	잎	열매
에탄올 추출물	276.95	>400
n-헥산 분획물		-
에틸아세테이트 분획물		181.72
부탄올 분획물		>400
물 분획물		-
쿼세틴(quercetin)	13.53

상기 표 2는 각 용매에 의해 얻어진 송악 추출물 및 분획물 중에서 에틸아세테이트 분획물이 가장 NO 소거 활성이 높음을 나타냈다. 그러나, 대조군인 쿼세틴(quercetin)보다는 소거 활성이 낮음을 알 수 있었다.

3. 크산틴 산화효소(Xanthine oxidase) 억제 및 슈퍼옥사이드(superoxide) 소거활성 측정

크산틴 산화효소는 크산틴을 기질로 하여 요산을 생성하는 과정에서 과산소 음이온을 생성한다. 크산틴 산화효소의 억제 활성의 측정에는 290nm에서 크산틴 산화효소에 의하여 생성된 요산의 흡광도를 측정하여 실시하였다.

슈퍼옥사이드의 양은 NBT(nitroblue tetrazolium) 환원방법에 의해 측정하였다.

반응액 (0.5mM 크산틴, 200 mM 포스페이트 완충액(pH7.5) 1mM EDTA)에 50mU/ml 크산틴 산화효소를 첨가하여 요산 생성을 유도하였다.

슈퍼옥사이드 소거활성은 상기 반응액에 0.5mM NBT를 첨가하여 반응하였다. 크산틴 산화효소 억제 및 슈퍼옥사이드 소거활성은 각각 생성된 요산과 슈퍼옥사이드의 흡광도가 50%이상 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC₅₀)로 표시하였다.

	크산틴 산화효소 IC₅₀		슈퍼옥사이드 IC₅₀
	잎	열매	잎	열매
에탄올 추출물	>400	288.01	>400	266.88
n-헥산 분획물		>400		186.77
에틸아세테이트 분획물		163.45		15.08
부탄올 분획물		-		82.15
물 분획물		-		114.06
대조구	알로푸리놀(Allopurinol) 0.4		알로푸리놀(Allopurinol) 0.028

상기 표 3도, 전체적으로 에틸아세테이트 분획물이 크산틴 산화효소 억제 및 슈퍼옥사이드 소거활성이 높음을 나타냈다. 다만, 대조구인 알로푸리놀보다는 다소 낮음을 나타냈다. 알로푸리놀은 크산틴 산화효소 및 슈퍼옥사이드를 억제하는 것으로 알려져 있다

실시예 2: 화합물의 구조 동정(Prep-LC를 이용한 분리)

상기 실시예 1에 따른 활성이 가장 좋게 나타난 에틸아세테이트 분획물 3.7g을 37㎖의 HPLC용 메탄올에 용해한 후 0.45㎛ 시료용 필터에 통과시킨 것을 안정화된 고속 액체 크로마토그래피를 이용하여 분리하고자 하였다. 컬럼(Prep-column ODS, 5㎛, 19×150㎜, Sunfire™, Waters)이 장착된 고속 액체 크로마토그래피(Preparative Liquid Chromatograph, Delta Prep 150, Waters)를 사용하였다. 증류수/아세토니트릴(80/20)을 기울기(gradient)로 80분 동안 분리하여 화합물 1 및 화합물 2를 수득하였다.

상기 Prep-LC를 통해 분리된 각각의 화합물을 NMR(JNM-LA400, JEOL)을 이용하여 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 및 LC-MS를 이용하여 분석하였다.

화합물 1의 결과는 도 1 내지 도 3에 나타나 있으며, 그 화학 구조식은 도 4에 나타나 있다. 이러한 결과는 분리된 화합물 1이 루틴임을 나타낸다.

화합물 2의 결과는 도 5 내지 도 7에 나타나 있으며, 그 화학 구조식은 도 8에 나타나 있다. 이러한 결과는 분리된 화합물 2가 카페산임을 나타낸다.

실시예 3: 세포 실험

1. 시료의 제조

분말로 된 추출물 및 분획물 각각을 100㎎에 에탄올과 1×PBS(Phosphate Buffered Saline, pH 7.4)가 1:1로 혼합된 용매 1㎖을 가하여 완전히 용해시킨 후 여과하여 사용하였다.

2. 세포배양

본 연구에 사용된 melan-a 세포는 non-tumorigrnic mouse melanocyte cell line으로 C57BL의 embryo로부터 유래한 세포이다. melan-a 세포를 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco), 1% Antibiotic-Antimycotic(Gibco), 100nM TPA, L-glutamine와 sodium bicarbonate가 함유된 PRMI 1640 배지(Gibco)를 사용하여 37℃, 10% CO₂ 세포배양기에서 배양하였다.

3. MTT assay를 이용한 세포 생존률 측정

melan-a 세포를 24 well plate에 well당 1×10⁵개의 세포를 접종하고 24시간 동안 37℃, 10% CO₂ 세포 배양기에서 배양한 후 추출물 및 분획물을 각각의 well에 12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖ 및 100㎍/㎖의 농도로 3일간 처리하여 배양하였다. 여기에 PBS 2㎎/㎖의 농도로 제조한 MTT 용액 200㎕를 첨가하고 동일한 배양 조건으로 4시간 배양하였다. 배양액을 제거하고 각 well 당 DMSO 200㎕를 가하여 ELISA reader(μQuant, USA)로 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

도 9에서 보는 바와 같이 대조군의 세포 생존률을 100%로 하였을 때, 송악 추출물 및 각각의 용매 분획물 농도들 중 12.5, 25 및 50㎍/㎖ 농도에서는 각각 82 내지 107%로 대조군에 비해 약간 감소하였거나 증가하였으며, 100㎍/㎖ 농도에서 에탄올 추출물은 68%로, 에틸아세테이트 분획물은 78%로 감소되는 경향을 보였다. 또한 n-헥산 분획물은 50, 100㎍/㎖에서 29%, 10%로 완전한 독성을 보였다. 이처럼 대조군에 비해 12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖ 및 50㎍/㎖의 농도들은 약간의 차이가 있으나 n-헥산 분획물을 제외한 유의할만한 변화를 나타내지 않았으며, 100㎍/㎖ 이상의 투여농도에서 melan-a melanocyte 세포의 성장을 억제함을 알 수 있었다.

4. 멜라닌 생성양 측정

위의 기술한 방법과 같이 세포에 3일간 시료 처리 후 배지를 제거하고 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 각 well당 500㎕의 1N NaOH를 가하고 56℃에서 30분 용해한 후 ELISA reader(μQuant, USA)로 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

도 10에서 보는 바와 같이 대조군인 melazove 30uM((주) 태평양) 처리 시 49%의 멜라닌 생성 억제활성을 보였으며, 에탄올 추출물은 12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖ 및 50㎍/㎖ 농도까지 처리 시 13%, 25% 및 40%로 억제활성을 보였다. 또한 각각의 용매 분획물들 중 부탄올과 물 분획물을 제외한 에틸아세테이트 및 n-헥산 분획물이 100㎍/㎖ 농도에서 42% 및 24%의 멜라닌 생성 억제활성을 보였다. 따라서 송악 추출물은 melan-a 세포에서 투여량이 처리 농도가 증가함에 따라 멜라닌 생성이 억제되는 경향을 보였으며 통계학적으로 유의성이 있음을 나타냈다.

5. 세포 내 티로시나제 활성도 측정

Melan-a 세포를 24 well plate에 위의 기술한 방법과 동일하게 처리한 후, well의 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 만들고, 용해 완충액(lysis buffer, 0.1M sodium phosphate buffer, 0.2mM PMSF, 1% Triton X-100)를 가하였다. 얼음에 방치하여 세포를 파괴시키고, 원심분리한 후 상층액을 취하여 효소활성측정에 사용하였다. 각 시료를 반응액에(12.5mM L-Dopa, 1.5mM L-Tyrosine, 67mM sodium phosphate buffer(pH 6.8)) 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 405㎚에서 흡광도를 측정하였다.

도 11에서 보는 바와 같이 대조군인 melazove 30uM((주) 태평양) 처리 시 30%의 티로시나제 억제활성을 보였으며, 에탄올 추출물은 12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖ 및 50㎍/㎖ 농도까지 처리 시 9%, 15% 및 28%로 억제활성을 보였다. 또한 각각의 용매 분획물 중 n-헥산을 제외한 물, 부탄올 및 에틸아세테이트 분획물의 100㎍/㎖ 농도에서 21%, 20% 및 42%로 높은 티로시나제 억제활성을 보였다. 따라서 송악 추출물은 melan-a 세포에서 투여량이 처리 농도가 증가함에 따라 티로시나제 활성이 억제되는 경향을 보였으며 통계학적으로 유의성이 있음을 나타냈다.

6. 세포 NO 생성억제

Raw264.7 세포 배양은 DMEM 배지에 10% FBS, 1% 스트렙토마이신/페니실린(stereptomycine/phenicliline)을 첨가하여 세포를 유지하였다. 세포농도 1.5×10⁵ cell/ml를 24 well plate에 seeding 한 후 18시간 동안 배양하였다. 시료처리는 100㎍/㎖와 LPS(lipopolysaccaride) 1㎍/㎖를 동시에 처리한 후 24시간 배양하였다. NO 생성 측정은 Griess 시약(1% sulfanilamide, 0.1% N-1-naphthylethylenediamine, 2.5% phosphoric acid) 100㎕와 배양액 100㎕를 혼합한 후 10분 동안 반응시킨다. 그리고 540㎚에서 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

도 12는 LPS로 자극한 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포에서의 MTT 분석 및 NO 생성 억제 활성 결과를 그래프로 나타낸 것이다. NO 생성 억제 활성 결과, 에탄올 추출물은 50㎍/㎖ 농도에서 51%, 헥산 분획물은 6.25㎍/㎖농도에서 69%, 에틸아세테이트 분획물은 12.5㎍/㎖농도에서 59%의 억제활성을 나타냈다. 이러한 결과는 송악 추출물이 항염증 물질 연구개발에 있어서 중요한 기초 자료가 될 것이라 사료된다.

Claims

송악 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 미백 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 송악 에틸아세테이트 분획물의 농도는 25-100㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 송악 에틸아세테이트 분획물은 하기 단계를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물:
(a) 송악 전초를 세척하는 단계;
(b) (a)에서 세척된 전초를 열풍 건조 후 분쇄하는 단계;
(c) (b)에서 수득된 분쇄물을 유기 용매에 침적하고 침출 및 여과하는 단계;
(d) 침출 및 여과 과정을 2 내지 3회 반복하는 단계;
(e) 상기 (d)단계의 여과액을 감압농축 및 동결 건조 후 분말을 얻는 단계; 및
(f) 상기 (e)단계에서 제조된 송악 추출물을 에틸아세테이트로 분획하는 단계.
제3항에 있어서, 상기 (c)단계의 유기 용매가 70% 에탄올인 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 멜라닌 생성 억제성 및 티로시나제 저해활성을 갖는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 송악 에틸아세테이트 분획물에는 루틴 또는 카페산이 포함된 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항의 조성물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 생성 억제제 조성물.
루틴 또는 카페산을 포함하는 미백 조성물.
제8항에 있어서, 루틴 또는 카페산은 송악 에틸아세테이트 분획물에서 유래된 것을 특징으로 하는 조성물.
제8항의 조성물을 포함하는 미백 화장료 조성물.