CN109153734B - 结冷胶水凝胶、制备、方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本文公开了基于结冷胶的水凝胶,其用于体外细胞培养和组织工程和再生医学应用。这种基于结冷胶的水凝胶可以单独使用或与活细胞和/或生物分子组合使用以用于人和/或动物中的应用。用选择的离子螯合取代基对结冷胶进行化学改性,得到拥有可调谐的物理化学和生物性质的新型结冷胶水凝胶。本文所述的改性的结冷胶水凝胶呈现优于现有水凝胶体系的优点,包括溶解性、离子交联通用性、易于配制和可注射性以及在生物组织和表面内的更大粘附性,同时在长期培养过程期间保持包封细胞可存活并且上调健康的细胞外基质标记物的表达。
Description
技术领域
本公开涉及改性的生物吸入式结冷胶(gellan gum),其形成适合用作独立的医疗装置或用于细胞包封(封装,微囊化,encapsulation)的具有改进的物理化学和生物特征的水凝胶。含有包封细胞的改性的结冷胶水凝胶可用于体外细胞培养或在组织工程、再生医学以及药物递送应用中用于细胞和/或活性物质和/或生物分子的微创体内递送和保留。本文公开的改性的结冷胶水凝胶克服了传统上与现有水凝胶体系相关的限制,包括制造的再现性、高水溶性和易于配制。改性的结冷胶通过很多生理学相关阳离子显示出可控的离子交联,并且具有优异的原位粘附性,同时在长期的体外培养期间保持哺乳动物细胞的活力。改性的结冷胶水凝胶进一步促进健康的软骨形成细胞外基质标记物的表达的上调。
本公开还涉及用于软骨和软组织工程和再生医学的组合物。
背景技术
细胞包封技术继续引起对一系列体外细胞培养和筛选模型以及组织工程和再生医学应用的日益关注。特别地,能够在生理学相关条件下形成水凝胶的天然来源的聚合物(包括从微生物或海洋来源获得的多糖)已被广泛研究为用于体外细胞培养和用于哺乳动物细胞和/或生物分子体内包封和递送的基质。另外,某些水凝胶也可以在其他无细胞组织工程应用中作为医疗装置形式的独立产品。水凝胶是由亲水聚合物组成的高度水合的材料,该亲水聚合物在物理、酶促、化学或离子交联过程中形成组织化的三维网络,以形成类似于或模仿哺乳动物组织的细胞外基质(ECM)的柔软和多孔结构。经由微创手术(例如通过注射)而易于递送、生物相容性和渗透性以允许持续流过气体、营养物和代谢废物都是功能性细胞/生物分子包封材料的基本要求。此外,聚合物必须能够通过不损害细胞活力或功能的交联过程形成水凝胶,并且能够将植入的细胞和/或生物分子牢固地保留在所需的作用位点。
迄今为止,已经研究了许多基于天然多糖和蛋白质的水凝胶作为推定的细胞培养物和细胞/生物活性物包封/递送剂。这些包括琼脂糖、藻酸盐、角叉菜胶家族、壳聚糖、透明质酸、胶原、弹性蛋白、纤维蛋白、明胶和丝纤蛋白等。然而,这些材料中的大多数存在显著的缺点,这些缺点严重限制了它们在体外细胞培养、细胞递送或体内独立治疗环境中的一般适用性。这些包括在生产或提取过程中缺乏结构一致性和合成再现性、短期和长期物理和代谢不稳定性、以及在生理学相关介质和pH下的溶解度不足等。在某些情况下,它们还需要与热敏治疗剂不相容的高于生理温度的加工温度,并导致形成针对特定应用具有不适当机械性能的水凝胶。此外,这些材料中的一些具有不受控制的降解速率,使得生物材料的代谢和消除与通过包封细胞和/或生物分子递送产生ECM或组织的速率不同步或不相容。
因此,继续寻找用于细胞和/或生物分子包封并作为独立的医疗装置的更通用的生物材料。最近已提出结冷胶作为用于此目的的替代生物材料(Oliveira,2009;2010)。结冷胶是一种由细菌伊乐假单胞菌(Pseudomonas elodea)分泌的直链阴离子胞外表多糖,其由重复的四糖单元组成,四糖单元由两个D-葡萄糖、一个D-葡糖醛酸和一个L-鼠李糖残基组成[→3)-β-D-Glcp-(1→4)-β-D-GlcpA-(1→4)-β-D-Glcp-(1→4)-α-L-Rhap-(1→]。
在商业上,结冷胶可以两种形式获得,乙酰化(高酰基)和去乙酰化(低酰基)。高酰基结冷胶含有两个酰基取代基,即都位于相同的葡萄糖残基上的乙酸酯(每两个重复单元一个乙酸酯基团)和甘油酸酯(每个重复单元一个甘油酸酯基团),而低酰基结冷胶由碱性水解制得并且通常含有少于5%的酰基取代基至不含酰基。在二价阳离子如Ca2+和Mg2+存在下,当溶液温度降低时,这两种同种型产生具有显著不同机械性质的热可逆水凝胶。这是指结冷胶水凝胶的形成需要麻烦的加热/冷却循环,并且二价阳离子的存在是必要的。仅在一价阳离子例如钠(Na+)和钾(K+)存在下冷却结冷胶溶液需要离子浓度高约100倍,以提供具有与利用二价阳离子获得的那些相似的机械性质的水凝胶。预期这种升高的浓度会因渗透休克而限制包封的细胞存活。另一方面,结冷胶水凝胶显示出低细胞毒性并且对温热和稀酸相对稳定,但当体内植入时,由于二价阳离子的扩散和交换而导致与3D基质内生理单价阳离子有效交联,因此容易随时间丧失机械强度。细胞包封研究已经证明,结冷胶水凝胶能够在一定程度上支持人关节软骨细胞对ECM的生长和沉积。尽管如此,带负电荷的水凝胶的相当大的亲水性选择性地有利于水分子的结合,从而在细胞材料表面上极大地抑制细胞粘附蛋白的吸附,结果是细胞不能粘附。聚合物表面缺乏粘附位点或细胞粘附配体可能对粘附依赖性细胞的存活和功能有害,这可导致细胞活力随时间降低并最终导致性能差的结果。
如所述,结冷胶水凝胶的治疗用途进一步受到市售聚合物在生理温度(37℃)或更低温度下的低水溶性的阻碍。通常约1%w/V浓度的稀释水溶液只能通过在恶劣温度(通常约90℃)下将市售的低酰基聚合物在水中加热至少1小时来获得。不方便的是,当溶液温度降低到约40-42℃时,发生热可逆凝胶化。显然,溶解温度和热凝胶温度都明显高于生理温度(37℃),使得细胞在包封时可能会受到热冲击,从而降低细胞活力和功能。结冷胶的过早热凝胶化对经由窄规格针通过注射递送的溶液也提出主要缺点,因此窄温窗口造成严重的技术限制。
与结冷胶相关的另一个缺点涉及其对生物组织和活体表面的有限粘附性,特别是在体液和外科手术过程中使用的冲洗溶液存在下。由于结冷胶水凝胶像大多数水凝胶一样具高度亲水性,因此它们不能在潮湿环境中有效地粘附到有机或无机表面(软或硬组织)上。因此,一旦经受物理或机械应力,在体内递送或移植的结冷胶水凝胶不可能保留在活体表面,从而严重降低它们在治疗环境中的一般适用性和有效性。
由于结冷胶葡糖醛酸残基的每个四糖重复单元含有一个羧酸(-CO2H)官能团,因此探索了化学改性结冷胶以优化其物理化学和生物性质的可能性。在轻微碱性条件下结冷胶与大量过量的甲基丙烯酸缩水甘油酯的反应(Silva-Correia,2011a)提供甲基丙烯酸化的结冷胶(GG-MA)。这种多用途的半合成材料在较低温度下具有比母体结冷胶更高的水溶性,从而在室温或生理温度下可以在水中获得1-2%w/V浓度的溶液,但在较高浓度下的所得溶液粘度在注射递送可接受的较高范围内,必须注意在溶解过程中避免过量的空气滞留,这可能在交联发生后导致水凝胶内形成不希望的气泡。与母体聚合物一样,GG-MA经历由生理学相关的二价阳离子如Ca2+和Mg2+促进的离子交联以形成水凝胶。另外,由于在甲基丙烯酸酯取代基上存在α,β-不饱和酮残基,因此共价交联可以通过在合适的自由基光引发剂存在下将聚合物溶液暴露于紫外光下来实现。通过改变聚合物浓度和交联方法/程度,可以制备具有可调机械性能的GG-MA水凝胶(Silva-Correia,2011b)。离子交联和光交联的GG-MA水凝胶均已显示出生物相容性,并已用于包封几种细胞类型(Silva-Correia,2013)。
尽管在水溶性和物理化学性质方面有上述改进,但GG-MA与母体聚合物共有某些限制。如WO2011/119059 A1中所述,GG-MA具有“一定程度的生物粘附性”,因此GG-MA水凝胶也不太可能在潮湿环境中有效地粘附于生物组织或表面,并且在施加应力时不可能保留在原位。此外,甲基丙烯酸酯取代基的接枝不能解决与结冷胶水凝胶相关的高亲水性问题,从而GG-MA水凝胶也不能为ECM通过粘附依赖性细胞的长期功能行为和产生提供最合适的环境。最后,由于在体内植入时二价阳离子被三维基质内的一价阳离子交换,因此机械强度随时间损失的问题仍然存在。
最近,表面粘附生物材料的开发集中于仿生方法。尽管受到海浪不断攻击,但海洋贝类表现出令人印象深刻的对潮湿和光滑岩石表面的粘附性,这是因为在其粘附垫的远端产生了直接接触岩石表面的粘附蛋白。将粘附垫连接到贝类的贻贝丝包含升高量的称为L-DOPA(3,4-二羟基-L-苯丙氨酸)的氨基酸,其含有儿茶酚胺药效团。儿茶酚官能团(1,2-二羟基苯基)负责通过涉及将儿茶酚基团氧化成邻醌的机制介导粘附,该过程受到中等碱性pH的海水促进。随后,涉及邻醌部分与海水中充分存在的三价金属离子(主要是Fe3+)配位的离子交联导致由蛋白质网络组成的粘性防水胶的形成。儿茶酚官能团与三价铁离子之间的离子配位键的强度看起来很强。某些三-和双-儿茶酚-Fe3+络合物具有任何已知金属-配体螯合物的一些最高稳定常数,并且在许多情况下,破坏金属离子-儿茶酚络合物所需的力几乎与共价键相当。
因此,已经用许多天然聚合物探索了模拟天然粘附机制的前提,以改进用于细胞包封的水凝胶的粘附性质。已经针对壳聚糖(Ryu,2015)、藻酸盐(Lee,2013)、聚乙二醇(PEG)(Barrett,2013)和透明质酸(Shin,2015)及其混合物等描述了具有可调物理和机械性质的儿茶酚-缀合的聚合物。报道了包封在儿茶酚缀合的藻酸盐水凝胶[Huh-7、Neuro-2A、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、人脂肪源干细胞(hASC)和人神经干细胞(hNSC)]和儿茶酚缀合的透明质酸(人肝细胞)中但仅针对相对短的培养期(分别长达十四天和七天)的各种细胞类型的细胞活力数据。然而,在与金属阳离子发生离子交联之前,必须进行聚合物-儿茶酚缀合物的进一步化学处理步骤,包括儿茶酚官能团的高碘酸钠氧化。除了这种额外的合成加工步骤的不便之外,由此形成的水凝胶由于所得邻醌的形成和聚合具有非常高的着色(棕黑色)。优选地,为了在组织工程和再生医学应用中用作体外细胞培养剂、组织生物粘附剂或细胞递送基质,透明的无色水凝胶将是优选的,因为这些可以允许在混合生物材料和细胞悬浮组分时视觉确认细胞在基质内的均匀分散,以及促进通过成像和生化测定监测生物事件。在PEG-儿茶酚缀合物的情况下,仅利用三价铁离子(Fe3+)形成水凝胶,并且pH对所形成的水凝胶的机械性质具有显著影响。
已经报道了通过进一步并入强吸电子硝基官能化聚合物-儿茶酚缀合物的儿茶酚环以及硝基取代对某些水凝胶的交联和生物粘附性质的影响(Shafiq,2012;Cencer,2015和Ding,2015)。
AU2011381641 B2公开了儿茶酚基团偶联的壳聚糖的制备,该壳聚糖作为具有止血作用的生物粘附剂包含在具有包含硫醇基团的泊洛沙姆的组合物中。
EP2784101A1公开了具有生物粘附性质的羟基苯基官能化的聚(酯酰胺)。
US8968716 B2公开了通过酶促反应原位形成水凝胶的儿茶酚改性的聚合物,其用作组织粘附剂。
WO2015175655A1公开了儿茶酚改性的聚合物作为组织粘附剂或防污涂料。
WO2013/123946公开了自我修复的,pH响应性的儿茶酚改性的聚合物和凝胶组合物。要求对机械性能进行选择性调整,但没有揭示有利的细胞包封性质或生物响应的细节。
从文献中可知,现有的生物材料对体外细胞培养和组织工程以及再生医学应用都存在物理化学和/或生物限制。为此目的设计改进的生物材料应考虑各种因素;(i)在一致质量方面的再现性(ii)水凝胶前体应具有良好的水溶性,有助于在生理温度或低于生理温度下以相关浓度快速溶解,(iii)水凝胶前体应能够形成机械稳定,组织或表面-粘附和几乎无色的水凝胶,而无需进一步的中间化学或生产步骤以将交联官能团引入分子中以及(iv)应与药学上可接受并生理上相关的各种一价、二价和三价金属离子可能发生离子交联。最后,最理想的水凝胶体系应该能够在长时间内维持包封细胞的活力和生物分子的功能,并促进健康的细胞外基质标记物表达的上调。
揭示这些事实是为了说明本公开所解决的技术问题。
发明内容
本公开提供新颖的结冷胶类材料,其包含用酚类或儿茶酚基团或其等排物(isosteres)改性的结冷胶,其能够通过螯合一价、二价和/或三价金属离子形成水凝胶。这些结冷胶水凝胶具有改进的物理化学和生物特性,用于在体外细胞培养和/或在组织工程和再生医学的应用中用于哺乳动物细胞和/或生物分子的包封和体内递送/保留。改性的结冷胶水凝胶克服传统上与当前的水凝胶体系相关的限制,包括易于配制和可注射性、快速溶解、多种离子交联模式、一段时间内持续的机械性能以及更强的原位粘附性,同时在长期培养过程中维持哺乳动物细胞活力和促进健康的细胞外基质标志物表达的上调和组织再生。
在一种优选的实施方式中,改性的结冷胶的酰化度为无酰基(低酰基)至两个酰基取代基(高酰基),即乙酸酯和甘油酸酯,两者均位于相同的葡萄糖残基上,更优选地每个重复单元一个甘油酸酯取代基和每两个重复单元一个乙酸酯取代基。优选地,结冷胶含有少于5%的酰基基团至不含酰基基团。
在一种实施方式中,市售结冷胶(GGc)可以用作制备本文所述的改性的结冷胶水凝胶的起始材料。市售结冷胶优选地为低酰基结冷胶。在一种更优选的实施方式中,水凝胶前体材料使用纯化的结冷胶(GGp)作为起始材料制备(Doner,1997)。市售结冷胶含有二价阳离子杂质以及无机灰分,其可通过用酸形式的合适离子交换树脂处理除去,将结冷胶转化为中间体游离羧酸形式。用稀释的碱金属氢氧化物水溶液如氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化锂水溶液处理结冷胶的这种中间体游离羧酸形式,导致形成结冷胶的相应的单价碱金属盐形式,其在室温下以高达5%w/V的浓度更加可溶于水中,使得这种形式的聚合物更适合于在水性条件下通过合成有机化学进行进一步的结构操作。纯化的结冷胶在二价和三价阳离子存在下形成水凝胶,但仅在单价离子存在下不能形成机械稳定的水凝胶。因此,使用二价阳离子Ca2+和Mg2+作为交联剂制备在生物学研究中用作对照的纯化的结冷胶水凝胶。
可替代地,结冷胶的中间体游离羧酸形式可以用氢氧化铵或氢氧化四烷基铵处理以形成结冷胶的相应的铵盐形式。这些盐具有可溶于极性有机溶剂如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮和DMSO等的优点,使得聚合物的这些铵盐形式更适合于在非水性条件下通过合成有机化学进行进一步的结构操作。
在一种实施方式中,通过改变纯化的结冷胶原料的分子量,可以获得具有100KDa至2500KDa的分子量范围的改性的结冷胶,以便允许控制物理化学和机械性能和定制改性的结冷胶的交联动力学。降低结冷胶分子量的方法是本领域技术人员熟知的。例如,专利US6242035描述了几种降低结冷胶分子量的方法,包括均质化、超声处理、辐射、氧化和水解。由酸催化的水解是用于降低基于多糖的聚合物的分子量的特别熟知的技术。在更极端的水解条件下,多糖可以被分解成低聚糖和组成糖。通过在不同的浓度和反应温度下,使用有机酸和无机酸如硫酸、盐酸、乙酸和三氟乙酸等,可以获得具有一系列分子量的结冷胶。可替代地,可以使用氧化剂如高碘酸钠、过氧化物或2,2,6,6-四甲基哌啶-N-氧基(TEMPO)通过聚合物主链的化学断裂来降低结冷胶的分子量。高碘酸钠对结冷胶的氧化对于获得一系列降低分子量的结冷胶特别有效(Gong,2009)。可替代地,基于来自芽孢杆菌属GL1细菌的胞外结冷胶裂解酶的酶促方法可用于降低结冷胶的分子量(Hashimoto,1999)。
在一种优选的实施方式中,改性结冷胶的分子量为在100至2500KDa之间,更优选地在500至2500KDa之间,并且甚至更优选地在1000至2500KDa之间。
在一种优选的实施方式中,能够螯合一价、二价和/或三价离子的与结冷胶连接的单元是酚类或儿茶酚单元或其等排物。酚类基团是含有一个羟基的碳环芳环,儿茶酚是含有两个相邻羟基的碳环芳环。如果优选的话,酚类或儿茶酚单元可以在芳环上进一步被以下基团中的一个或多个或组合所取代:C1-C6低级烷基基团(甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、戊基和己基);羟基、硝基、氰基、三氟甲基或卤素基团(氟、氯、溴、碘);低级烷氧基基团-OR1其中R1表示如上定义的C1-C6低级烷基基团;基团-C(O)-R2,其中R2表示氢或如上定义的C1-C6低级烷基基团;基团-C(O)-OR3,其中R3表示氢或如上定义的C1-C6低级烷基基团;基团-C(O)NR4R5,其中R4和R5表示氢或如上定义的C1-C6低级烷基基团或基团-SO2R6,其中R6表示氢或如上定义的C1-C6低级烷基基团。
在一种实施方式中,酚类或儿茶酚单元可以经由杂原子(所述杂原子可以是氧或任选取代的氮)或者可替代地,经由杂原子和间隔基或连接基团直接共价连接到结冷胶。连接基团的合适实例包括但不限于C1-C18低级烷基基团(甲基至十八烷基),其经由杂原子与结冷胶的羧酸官能团连接,所述杂原子可以是氧或任选取代的氮。如果优选的话,C1-C18烷基连接基团可以是直链或支链的,任选地进一步被取代并任选地并入一个或多个选自氮、氧或硫的杂原子。在另一种实施方式中,C1-C18连接基团可任选地含有不饱和的碳-碳键。
在一种最优选的实施方式中,酚类或儿茶酚单元经由酰胺氮杂原子和乙基连接基团(-NH(CH2)2-儿茶酚或苯酚)共价连接到结冷胶的羧酸官能团上。
在一种实施方式中,能够螯合一价、二价和三价金属阳离子的熟知的儿茶酚等排物的实例包括含有正交酮、氨基或羟基官能团的饱和或不饱和脂族、碳环或杂环基团,诸如例如,托酚酮、喹啉酮、吡喃酮、吡啶酮和嘧啶酮。其它可能的儿茶酚等排物是本领域技术人员所熟知的。
在一种特别优选的实施方式中,儿茶酚等排物包括3-羟基-4-吡啶酮或5-羟基嘧啶酮-4(3H)-酮。
在一种优选的实施方式中,含有苯酚或儿茶酚单元或其等排物的改性结冷胶在一种或多种一价、二价和/或三价金属离子或其混合物存在下能够进行离子交联,包括Na+、K+、Li+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Sr2+、Ba2+、Co2+、Mn2+、Ni2+、Sn2+、Zn2+、Fe3+、Al3+、Ga3+和Ti3+离子。
在另一种优选的实施方式中,含有苯酚或儿茶酚单元的改性结冷胶能够进行酶促交联,例如在辣根过氧化物酶和过氧化氢存在下。
在又另一种优选的实施方式中,本文所述的改性的结冷胶在室温或生理温度(15-37℃)下以0.01-5%w/V,更优选地1-3%w/V的浓度完全溶于水或其它生理学上可接受的载体中。甚至更优选地,改性的结冷胶在室温下30分钟或更短时间内可溶于水或生理学上可接受的载体中。改性的结冷胶溶液具有更适合通过一系列针规格(7-34)注射的粘度。
本公开涉及一种改性的结冷胶,通过具有根据式I的组成的改性结冷胶的离子交联或酶促交联,可以由此制备水凝胶。
其中,
n是从1-4000的整数,优选地从50至4000,更优选地从500至4000,A表示基团-O-R7或-N-R7R8,其中R7表示根据式II的基团:
-(CH2)g-B
式Ⅱ
其中,
g是从0至18的整数
B表示在芳环上被以下基团中一个或多个,相同或组合任选取代的酚类或儿茶酚基团:C1-C6烷基基团(甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、异戊基、异己基);羟基、硝基、氰基、三氟甲基或卤素基团(氟、氯、溴、碘);烷氧基-OR1,其中R1表示如上定义的C1-C6烷基基团;基团-C(O)-R2,其中R2表示氢或如上定义的C1-C6烷基基团;基团-C(O)-OR3,其中R3表示氢或如上定义的C1-C6烷基基团;基团-C(O)NR4R5,其中R4和R5表示氢或如上定义的C1-C6烷基基团或基团-SO2R6,其中R6表示氢或如上定义的C1-C6烷基基团;或B表示3-羟基-4-吡啶酮或5-羟基嘧啶酮-4(3H)-酮基团;R8表示氢或选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、异戊基或己基的C1-C6烷基基团。
在另一种优选的实施方式中,本发明涉及一种改性结冷胶,通过具有根据式Ⅲ的组成的改性结冷胶的离子交联或酶促交联,可以由此制备水凝胶。
其中,
n是从1-4000的整数,优选地从50至4000,更优选地从500至4000,
R9、R10、R11和R12是相同或不同的,并表示氢、羟基、C1-C6烷基基团(甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、异戊基、异己基);硝基、氰基、三氟甲基或卤素基团(氟、氯、溴、碘);烷氧基基团-OR1,其中R1表示如上定义的C1-C6烷基基团;基团-C(O)-R2,其中R2表示氢或如上定义的C1-C6烷基基团;基团-C(O)-OR3,其中R3表示氢或如上定义的C1-C6烷基基团;基团-C(O)NR4R5,其中R4和R5表示氢或如上定义的C1-C6烷基基团或基团-SO2R6,其中R6表示氢或如上定义的C1-C6烷基基团。
在一种甚至更优选的实施方式中,本发明涉及一种改性结冷胶,通过具有根据式IV的组成的结冷胶的离子交联或酶促交联,可以由此制备水凝胶。
其中:
n是从1-4000的整数,优选地从50至4000,更优选地从500至4000,
R11和R12是相同或不同的,并表示氢、硝基、氰基或卤素(氟、氯、溴、碘)。
在一种最优选的实施方式中,本发明涉及一种改性结冷胶,通过具有根据式V的组成的改性结冷胶的离子交联或酶促交联,可以由此制备水凝胶。
n为从1-4000的整数,优选地从50至4000,更优选地从500至4000。
在一种实施方式中,C1-C6烷基基团选自由以下组成的组:甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、异戊基、己基或异己基。
在一种实施方式中,卤素基团选自由以下组成的组:氟、氯、溴或碘。
在一种实施方式中,结冷胶可以是酶促可交联的,特别是通过辣根过氧化物酶和过氧化氢。
在为获得更好结果的实施方式中,本发明的结冷胶用于人类医学或兽医学中或用作药物或用于体外细胞培养。优选地,本公开的结冷胶用于组织工程或再生医学。更优选地,本公开的结冷胶用于微骨折(microfracture)、或骨、软骨或软组织疾病或病变(病灶,lesions)的治疗或疗法。甚至更优选地,用于透明软骨损害,特别是膝软骨损伤的治疗或疗法。甚至更优选地,本公开的结冷胶用于人间充质干细胞的软骨分化和/或成骨分化和/或成脂分化。
在为获得更好结果的实施方式中,本公开的结冷胶可用于受人间充质干细胞的软骨分化和/或成骨分化和/或成脂分化呈正影响的疾病的治疗或疗法。
在为获得更好结果的实施方式中,本公开的结冷胶可用于骨修复和微骨折。
在为获得更好结果的实施例中,本公开的结冷胶可用于骨折、骨修复的治疗或疗法或骨病的治疗或骨软骨炎的治疗。
在为获得更好结果的实施例中,本公开的结冷胶可用于皮内和透皮疗法。
在一种实施方式中,具有根据式I、III、IV和V的组成的改性结冷胶可以通过使市售结冷胶(GGc)或纯化的结冷胶(GGp)与适当取代的醇或适当取代的伯胺和仲胺在本领域技术人员熟知的合适的偶联剂存在下反应来制得,以促进羧酸的活化从而分别与氧或氮亲核试剂反应形成酯和酰胺。合适的偶联剂包括碳二亚胺例如二环己基碳二亚胺(DCC)或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC),含有或不含有添加剂例如羟基苯并***(HOBt)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、鏻盐例如苯并***-1-基氧基三(二甲基氨基)-六氟磷酸鏻、胍盐和铀盐例如(2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐和N,N,N',N'-四甲基-O-(苯并***-1-基)脲四氟硼酸盐和三嗪例如氰尿酰氯和2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)结合N-甲基吗啉等。特别优选的偶联剂包括4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(DTMMC1)。令人惊讶的是,已经发现DTMMC1可以用作纯化的结冷胶与盐形式(盐酸盐、氢溴酸盐)的伯胺和仲胺反应的偶联剂,不需要加入非亲核碱如三乙胺、二异丙胺或DBU以释放伯胺和仲胺的反应性游离碱形式。这在胺类如多巴胺的情况下尤其重要,其在游离碱形式中具有高反应性,使得其迅速自缩合以形成强烈着色的聚多巴胺,此向多巴胺改性的结冷胶提供了不希望的深色。在使用多巴胺盐酸盐时通过使用DTMMC1作为偶联剂,不需要使用相对于胺盐略微过量的碱,并且获得改性的结冷胶的白色至灰白色粉末。
本公开的另一方面涉及一种水凝胶,其包含本公开的改性结冷胶和合适的溶剂,特别是水溶液。优选地,合适的溶剂是水、细胞培养基、含水盐溶剂或其混合物。
在为获得更好结果的实施例中,本公开的结冷胶的浓度可以为0.01%至5%w/V,优选地0.5%-5%w/V,更优选地0.5%-2.5%w/V,甚至更优选地1.25%-2%w/V。
本公开的另一方面涉及一种包含本公开的结冷胶或水凝胶和选自由以下组成的组的生物活性成分的组合物:细胞、干细胞、蛋白质、生物分子、小分子活性物质、治疗剂或诊断标记物、或其混合物。
在为获得更好结果的实施方式中,细胞或干细胞选自由以下组成的组:哺乳动物软骨细胞、哺乳动物间充质基质/干细胞、哺乳动物骨髓间充质干细胞,或其混合物。
在为获得更好结果的实施方式中,组合物可包含哺乳动物细胞和包含有效量的用于离子交联的阳离子的生理学离子溶液。
在为获得更好结果的实施方式中,组合物可进一步包含骨髓抽吸浓缩物(bonemarrow aspirate concentrate)、生长因子和/或抗生素。
在为获得更好结果的实施方式中,组合物可进一步包含基质,该基质含有本公开的结冷胶或本公开的水凝胶和人脂肪间充质基质/干细胞。
在为获得更好结果的实施方式中,细胞可以包封在结冷胶内,优选地自体细胞内。
在为获得更好结果的实施方式中,生长因子可以是TGF-β1、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、BMP-7(也称为成骨蛋白-1[OP-1])或软骨-衍生的形态发生蛋白CDMP-1和CDMP-2、血小板裂解液,或其混合物。
组合物可以通过各种途径施加,包括局部、肠内和肠胃外。肠胃外施加途径包括动脉内、关节内、腔内、皮内、***内、肌肉内、滑膜内、静脉内和皮下。肠内途径包括口腔和肠胃。局部途径包括应用于皮肤和粘膜。
在一种优选的实施方式中,将组合物以可注射的形式或透皮形式递送给患者,即原位注射或透皮治疗***,更优选地贴剂。
本公开的另一方面涉及一种网状物、盘、支架、三维结构、条带、网、纱布或膜,其包含本公开的结冷胶或本公开的水凝胶、或本公开的组合物。
一种透皮治疗***,特别是贴剂,其包含本公开的结冷胶或本公开的水凝胶,或本公开的组合物。
一种用于在组织工程、再生医学或体外细胞培养中使用的试剂盒,其包含本公开的结冷胶或本公开的水凝胶、或本公开的组合物和哺乳动物细胞。
因此,本公开的另一方面包括制备根据式I、III、IV和V的无色的改性的结冷胶的方法,其通过使式VI的纯化的结冷胶
其中:
n是从1-4000的整数,优选地从50至4000,更优选地从500至4000,
M+表示选自基团Na+、K+和Li+的一价碱金属离子;或M+表示基团N+X4,其中X表示氢或C1-C4烷基基团(甲基、乙基、丙基、丁基),与具有式HO-R7或HN-R7R8的伯醇、仲醇或叔醇、伯胺或仲胺反应进行(其中R7和R8如上定义)并且该反应在至少一种偶联剂存在下和任选地在非亲核碱存在下进行。
市售或纯化的结冷胶与醇和胺的偶联以得到式I、III和IV的结冷胶水凝胶可以在水、蒸馏水或无菌水中,或在极性有机溶剂如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮和二甲基亚砜(DMSO)中,或在缓冲介质如2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)的水溶液中进行,如果反应的pH控制被认为是期望的。如果优选的话,偶联反应可以在水和一种或任选地多种极性有机溶剂的混合物中进行。
在为了获得更好结果的实施方式中,市售或纯化的结冷胶与醇和胺的偶联可以在非亲核碱存在下进行。合适的非亲核碱包括烷基胺如三乙胺、三丁胺和N,N-二异丙基乙胺(Hunig碱),环胺如1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)和N-甲基吗啉,和芳族胺如吡啶、2,2,6,6-四甲基哌啶、2,6-二甲基吡啶和可力丁等。
在为获得更好结果的实施方式中,结冷胶与醇和胺的偶联反应可在0℃至溶剂的沸点之间的温度下进行,优选地在10至60℃之间,甚至更优选地在15至40℃之间。
在为获得更好结果的实施方式中,本公开的改性结冷胶可以通过加入1至50体积的可与水混溶的有机溶剂(包括醇如甲醇、乙醇或异丙醇,酮如丙酮或二烷基基团醚如二***或二异丙醚)来沉淀产物,然后通过过滤进行相分离而从反应混合物中回收。如果需要,可以通过在水中重复重构和沉淀来进一步纯化由此获得的改性结冷胶。
在为获得更好结果的实施方式中,可以将本公开的沉淀的改性结冷胶溶解在水中并通过使用具有合适孔径的纤维素膜用水透析以允许低分子量污染物扩散来纯化。可替代地,纯化可以通过使用例如具有合适孔径的纤维素或聚醚砜膜进行超滤以允许所述污染物通过来实现。
在为获得更好结果的实施方式中,然后含有改性和纯化的结冷胶的水溶液可以是无菌的(不含细菌微生物和内毒素),例如通过0.22μm无病原体的聚醚砜膜过滤,通过施加真空或压力。
在为获得更好结果的实施方式中,本公开的改性结冷胶可以通过首先在0至-210℃,优选地-20至-80℃的温度下冷冻溶液,然后在-40至-90℃的温度下在真空下在约0.01mbar的压力下冻干(冷冻干燥)进行分离。可替代地,改性结冷胶可以通过喷雾干燥溶液进行分离。通过仔细选择喷雾干燥条件,可以获得具有各种粒径的改性结冷胶。如果优选的话,喷雾干燥可以与抗生素、医药成分和添加剂一起使用以形成结冷胶包封或负载的材料。
在为获得更好结果的实施方式中,溶液或固态形式的改性结冷胶的灭菌方法包括湿热或干热、暴露于环氧乙烷、在合适的压力和温度下与超临界流体如二氧化碳接触,任选地在共溶剂如包括甲醇、乙醇或异丙醇的醇,或过氧化物如过氧化氢或过氧乙酸存在下、或UV或γ-辐射等。
由此获得的改性结冷胶可以通过分析技术如核磁共振(NMR)光谱法在结构方面表征。该技术还可用于通过应用基于所选参考峰的积分的数学等式来测定离子螯合酚类和儿茶酚取代基对改性结冷胶的取代度(Hamcerencu,2008)。
在一种实施方式中,通过选择合适的反应温度、试剂化学计量和反应时间,可以获得结冷胶的不同取代度,允许针对具体应用定制改性结冷胶的物理化学、机械和生物性质。优选地,结冷胶的取代度为0.01-30%,更优选地0.1-20%,最优选地0.5-15%。如前一段所述,取代度可以使用文献中关于结冷胶的酯衍生物所报道的等式计算(通过NMR光谱法,在Hamcerencu,2008的第2.4章中描述)。
在为获得更好结果的实施方式中,本公开的改性结冷胶在空气中和生理学(37℃)和室温(20℃)及以下是稳定的物质,其可以以粉末、水溶液或在医学上可接受的载体如无菌注射用水、盐水或磷酸盐缓冲盐水等中的无菌可注射溶液形式的组合物提供。
在为获得更好结果的实施方式中,本公开的改性结冷胶具有低多分散指数(Mw/Mn),优选地<3,更优选地<2.5。多分散指数可以通过凝胶渗透或尺寸排阻色谱法测定。为此目的,可以使用Malvern Viscotek TDA 305折射计进行折射率检测,其通常在一组四列上配备有直角散射和粘度计检测器(RI-Detector 8110,Bischoff)。***可保持在30℃下,MilliQ水或其他合适的溶剂用作洗脱液,流速为约1mL/min。洗脱时间和RI检测器信号可以用市售多糖组校准,该多糖组包含具有窄多分散性和Mp(最大峰值处的分子质量)为180Da至708KDa的标准物。
在为获得更好结果的实施方式中,本公开的改性结冷胶可以用作体外和体内应用的无细胞或细胞***,可以使用计算机辅助***手动或自动分配,可以通过例如注射的微创手术递送至人/动物体,以及在作用的所期位点通过生理学相关的阳离子或可替代地通过制剂的其他医药上可接受的阳离子添加剂直接进行离子交联。
在为获得更好结果的实施方式中,本公开的改性结冷胶可以以医药上可接受的量与生物活性剂或治疗剂混合用于定点递送和保留。在一种优选的实施方式中,生物或治疗剂是细胞、干细胞、蛋白质、诊断标记物或小分子活性物质、或其混合物。当生物或治疗剂是细胞时,细胞可以是自体的或同种异体的。
在为获得更好结果的实施方式中,细胞可涉及软骨形成细胞。在一种优选的实施方式中,细胞涉及多能干细胞或多潜能干细胞。在一种更优选的实施方式中,细胞涉及成人间充质基质/干细胞。在一种优选的实施方式中,细胞从骨髓或脂肪组织获得,其可以在从患者分离后立即使用或者可替代地从主细胞库或工作细胞库获得。在这种情况下,所述细胞的供体在相关因素方面也是合格的,例如年龄、体重指数、血源性病原体的缺乏、是否存在任何特定的医学病症。在一种优选的实施方式中,细胞已经就无菌性、活性和间充质基质/干细胞标志物的表达被证明是合格的。在一种更优选的实施方式中,软骨形成祖细胞的亚群选自初始基质/干细胞,例如表达但不限于CD73、CD106、CD271、CD29、SOX-9、dlk1/FA1、CD44和CD151标记物的细胞。在一种优选的实施方式中,细胞在无异源细胞培养基中扩增,以达到所需数量的细胞,其在1至10的通道,优选地2至5的通道中使用。
在为获得更好结果的实施方式中,本公开的改性结冷胶可以单独与软骨细胞进行混合或与软骨细胞与间充质基质/干细胞组合进行混合。可替代地,可以将改性结冷胶与选自以下的细胞混合:胚胎干细胞、胎儿干细胞、成人干细胞、羊膜干细胞、诱导多能干细胞、外胚层谱系细胞,包括星形胶质细胞、伯特歇尔细胞、脉络丛细胞、上皮细胞、claudis细胞、柱状细胞、视锥光感受器、暗细胞、导管细胞、室管膜细胞、上皮细胞、腺细胞、毛细胞、玻璃体细胞、齿间细胞、角质形成细胞、晶状体纤维细胞、亮细胞、merkel细胞、muller细胞、肌上皮细胞、神经元、少突胶质细胞、指状细胞、柱细胞、松果体***、松果体细胞、垂体细胞(pituicytes)、垂体细胞(pituitary cells)、半月面细胞、杆状细胞、皮脂腺细胞、分泌细胞、鳞状细胞、星状细胞、血管纹细胞、支持细胞、脑室膜细胞、I型味蕾细胞、前庭器官膜细胞、内胚层谱系细胞,包括腺泡细胞、α细胞、亲银细胞、β细胞、刷状缘细胞、泡心细胞、嫌色细胞、纤毛呼吸道细胞、克立拉细胞、δ细胞、管细胞、上皮细胞、胃肠胰细胞、腺细胞、肝细胞、泌酸细胞、潘纳斯细胞、肺细胞、主要(主)细胞、肺内分泌细胞、分泌性胃细胞、胸腺上皮-网状细胞、胸腺细胞、甲状腺滤泡细胞、发酵细胞、中胚层谱系细胞,包括脂肪细胞、刷状缘细胞、成牙骨质细胞、软骨细胞、纤毛生殖细胞(雄性和雌性)、黄体细胞、树突状细胞、管细胞、内皮细胞、上皮细胞、红细胞、成纤维细胞网状细胞、卵泡细胞、腺细胞、***、枯否细胞、朗格汉斯细胞、白细胞、***细胞、衬细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、致密斑细胞、肥大细胞、巨核细胞、系膜细胞、间皮细胞、小胶质细胞、单核细胞、破骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞、肌成纤维细胞、非纤毛细胞、髓核细胞、壁细胞、外周细胞、浆细胞、浆细胞样树突状细胞、附睾主要细胞、浦肯野纤维细胞、分泌细胞、浆膜细胞、支持细胞、肌腱细胞、***细胞、内膜层细胞、束状带、肾小球和网状细胞、足细胞、软骨细胞、周皮细胞、骨细胞、成纤维细胞、滑膜细胞、神经嵴谱系细胞,包括颈动脉体i型细胞、嗜铬细胞、肠神经胶质细胞、上皮细胞、黑素细胞、肌上皮细胞、神经元、成牙本质细胞、滤泡旁细胞、卫星细胞、雪旺细胞、小强荧光细胞、鳞状细胞、颈动脉体II型细胞和分泌细胞、或其混合物。
在为获得更好结果的实施方式中,改性结冷胶可以以医药上可接受的量混合或包封生物活性剂或治疗剂用于经由局部、肠内或肠胃外途径定向递送和保留,比如例如,眼、鼻、耳、舌下、直肠、***或皮肤施加,作为改进物质的生物利用度和/或释放曲线以提高总体功效的手段。本文中的生物剂或治疗剂被定义为旨在增强、改变或维持生物或生理功能的药物或美容剂。例如,生物活性剂或治疗剂可包含α-肾上腺素能激动剂;β-肾上腺素能激动剂;α-肾上腺素能阻滞剂;β-肾上腺素能阻滞剂;酒精忌避剂;醛糖还原酶抑制剂;醛固酮拮抗剂;氨基酸;合成代谢物;止痛药;麻醉剂;食欲抑制剂、抗酸剂;驱肠虫药;抗痤疮剂;抗过敏药;抗雄激素;抗心绞痛剂;抗焦虑剂;抗心律不齐药;抗哮喘药;抗菌剂和抗生素;抗脱发药和抗秃顶剂;抗阿米巴药;抗体;抗胆碱能药物;抗凝血剂和血液稀释剂;抗结肠炎药物;抗惊厥药和抗癫痫药物;抗膀胱炎药物;抗抑郁药;抗糖尿病剂;止泻剂;抗利尿药;解毒剂;止吐药;抗***;抗气胀药;抗真菌剂;抗原;抗青光眼剂;抗组胺药;抗功能亢进药;抗甲状腺机能亢进剂;抗高脂蛋白血症药;抗高血压药;抗低血压药;抗感染药;抗炎剂;抗疟药;抗偏头痛剂;抗肿瘤药;抗肥胖剂;抗帕金森病剂;抗运动障碍药;抗肺炎剂;抗原虫剂;止痒剂;抗银屑病药;抗精神病药;退热药;抗风湿药;抗分泌剂;抗休克药物;解痉药;抗血栓药;抗肿瘤剂;镇咳药;抗溃疡药;抗病毒剂;抗焦虑药;灭菌剂;骨增密剂;支气管扩张剂;钙通道阻滞剂;碳酸酐酶抑制剂;强心剂和心脏***;化疗药物;胆汁类药(choloretics);胆碱能药;慢性疲劳综合症药物;CNS***和抑制剂;凝固剂;避孕药;囊性纤维化药物;减充血剂;利尿剂;多巴胺受体激动剂和拮抗剂;酶、***;祛痰药;胃活动过多药物;糖皮质激素;止血药;HMG CoA还原酶抑制剂;激素;催眠药;免疫调节剂;免疫抑制剂;泻药;用于口腔和牙周疾病的药物;缩瞳剂;单胺氧化酶抑制剂;黏液溶解剂;多发性硬化症药物;肌肉松弛剂;散瞳剂;***拮抗剂;NMDA受体拮抗剂;寡核苷酸;眼科药物、催产药;肽、多肽;蛋白质;多糖;孕激素;***素;蛋白酶抑制剂;呼吸***;镇静药;5-羟色胺摄取抑制剂;性激素;戒烟药物;平滑肌松弛剂和***;类固醇;溶栓;镇静剂;尿酸化剂;尿失禁药物;血管扩张剂;血管保护药;皮肤保护剂和防晒剂、或其混合物。
在为获得更好结果的实施方式中,本公开的改性结冷胶可以使用手动或自动化方法和***加工以形成不同类型的支架,例如水凝胶、多孔支架、纤维、三维结构、微粒、纳米粒子、胶囊、膜、网、纱布或盘。在另一种优选的实施方式中,可以加工改性的结冷胶以形成具有改进的粘膜粘附性质的可喷雾凝胶。
在为获得更好结果的实施方式中,本公开的改性的结冷胶水凝胶可进一步包含第二改性或未改性的结冷胶。
在为获得更好结果的实施方式中,本文公开的改性的结冷胶水凝胶可以作为独立医疗装置用作组织填充剂或贴剂。在一种优选的实施方式中并且借助于实例,在微骨折的上下文中,改性的结冷胶水凝胶可以用作比用于支架增强的其他材料改进的医疗装置(MFX)。20世纪80年代开发的MFX已成为用于相对较小的症状性软骨性软骨病变的一线关节镜治疗方法。简而言之,在微骨折期间,通过钻孔或使用克氏针将软骨下骨板渗入软骨缺损内导致出血并形成纤维蛋白凝块,其应该填充缺损部位并覆盖暴露的骨表面。然后,多潜能的骨髓来源的间充质干细胞渗入凝块并促进修复组织的形成。不幸的是,修复组织主要由纤维软骨的软骨组成,与正常的健康透明型软骨相比,具有较差的生物化学和生物机械特性。此外,该方法的临床功效是高度可变的,可能是由于纤维蛋白凝块可以简单地从病变部位脱离,与其一起或允许释放的骨髓干细胞逃逸的事实。
因此,通过在病变部位内提供更有可能促进II型胶原和蛋白多糖含量增加的环境,努力集中于改进透明样组织的更有效再生。因此,已提出基于天然或合成聚合物的支架植入物用作医疗装置(表1)以增强MFX方法,目的是维持纤维蛋白凝块在缺损内,促进骨髓干细胞粘附和迁移,同时协助将修复组织与健康软骨的相邻周围区域整合。
表I.微骨折中的支架增强医疗装置
尽管如此,表1中给出的所有医疗装置都显示出各种缺点。首先,后三者需要关节切开术,其涉及完全暴露关节,导致患者发病和复杂的手术后恢复过程。理想的医疗装置应通过微创手术递送,即通过关节镜手术注射。其次,MFX空间中的绝大多数现有医疗装置包含动物组分,其由于可能的朊病毒污染和感染问题,过敏反应以及某些地区的伦理考虑因素而不合需要。理想的医疗装置将不含异源,并由非动物来源的材料制造。最后,并且最重要的是,绝大多数现有医疗装置没有自主粘附性质,这意味着需要额外的固定助剂,例如纤维蛋白胶。除了非无异源因素外,这还为外科手术增加了另一个复杂步骤。理想的医疗装置将能够在病变部位内保留在原位,而无需进一步固定。
令人惊讶的是,本文公开的无异源的改性结冷胶提出了这些要求并克服了现有技术的限制。在MFX手术期间观察到出血后,就可以在关节镜检查期间通过注射器注射将改性的结冷胶制剂施加于病变部位,并允许约10分钟进行聚合。在此期间,使用0.9%w/V氯化钠溶液使改性的结冷胶水凝胶保持水合,其一价钠离子促进聚合物在表面进行离子交联。由于改性的结冷胶水凝胶的粘附性质,因此不需要进一步的固定助剂,并且水凝胶能够对病变部位提供更好填充并且还将包含骨髓干细胞的血凝块保持在病变内,导致更高质量的软骨再生,并与周围健康组织更好地整合。
在另一种优选的实施方式中,改性的结冷胶水凝胶可用于包封自体骨髓抽吸浓缩物,其可通过本领域技术人员已知的技术获得,并且使用相同方法将制剂通过关节镜递送到病变部位。
在另一种实施方式中,单独或与细胞一起的改性的结冷胶水凝胶可以进一步负载有生长因子,比如例如TGF-β1、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、BMP-7(也称为成骨蛋白-1[OP-1])和软骨衍生的形态发生蛋白CDMP-1和CDMP-2、血小板裂解液和/或小分子如抗生素。
附图说明
以下附图提供了优选实施例用于说明本说明书,并且不应视为限制本发明的范围。
图1表示纯化的结冷胶的1H NMR光谱(D2O,1%w/V,70℃)。
图2表示用3当量的多巴胺改性的纯化的结冷胶的1H NMR光谱(GG-DOPA3,D2O,1%w/V,70℃)。
图3表示6-硝基多巴胺半硫酸盐的1H NMR光谱(NITRODOPA,DMSO-d6,1%w/V,70℃)。
图4表示用1当量的6-硝基多巴胺改性的纯化的结冷胶的1H NMR光谱(GG-NITRODOPA1,D2O,1%w/V,70℃)。
图5表示作为GG-DOPA3在1%w/V浓度下的水溶液的剪切速率增加的函数的粘度曲线。
图6表示由改性的结冷胶制备的典型的多孔脱水无细胞支架(左),再水化的无细胞支架(中间)和水凝胶(右)。
图7表示使用全血作为交联剂由改性的结冷胶制备的典型水凝胶。
图8表示随时间浸入水溶液中的改性的结冷胶支架的溶胀特征。
图9表示随时间浸入水溶液中的改性的结冷胶支架的吸水能力。
图10a表示在测试条件后,基于GG的水凝胶在8mm直径和2mm厚的离体软骨病变内的固定。注意GGp-DOPA1和GGp-DOPA3水凝胶的完全固定,以及GGp和GG-MA水凝胶的仅部分固定。
图10b表示猪关节(中心图像),具有在按顺序通过所有粘附测试之后,用GGp-DOPA3水凝胶填充显示为1和3-7的六个缺损。显示为X的缺损是空白对照损伤。
图11表示培养21天后包封在基于GG的制剂中的细胞的活/死成像。绿色=活;红色=死。放大倍数=50x。
图12表示在GGp-DOPA1、GGp-DOPA3、GGp或GG-MA水凝胶中分化成软骨形成谱系的人脂肪基质/干细胞的基因表达。结果表示为培养21天后细胞的表达比率(d21),归一化至培养前的值(d0)。
具体实施方式
本公开提供含有离子螯合酚类和儿茶酚取代基的改性的结冷胶,其适于在室温和生理温度(37℃)下赋予改进的凝胶化和配制特性,并且形成最低程度着色,显著表面粘附的水凝胶,其在包封在水凝胶内后保持更长时间的更高细胞活力,并促进健康细胞外基质标记物表达的上调。
本领域技术人员将理解以下描述以及本文使用的术语,以便最好地描述所公开的主题,并且选择这样做的实施例并非旨在穷举或将本发明限于所公开形式。替代方法,等同物和条件对于本领域技术人员来说是显而易见的。
市售结冷胶的纯化
将市售结冷胶(Sigma,5g)溶解于蒸馏水(500mL)中,同时加热至60℃。在30分钟内加入Amberlyst IR-120(H+型)离子交换树脂,直至溶液pH稳定在约2.4下。将溶液在60℃下搅拌10分钟,然后过滤除去树脂。向滤液中加入氢氧化钠水溶液直至pH达到8.5。将溶液倒入乙醇中,形成沉淀。在室温下搅拌1小时后,倾析出液相,过滤剩余的沉淀物,溶于蒸馏水中并用蒸馏水透析。冷冻和冷冻干燥后,得到纯化的结冷胶,呈白色固体,3.2g。纯化的结冷胶产物的1H NMR光谱(图1)与预期的结构一致。
利用三当量的多巴胺改性的纯化的结冷胶(GGp-DOPA3)
在室温下,将100mg纯化的结冷胶溶解在10mL蒸馏水中。然后将0.124g DTMMC1溶解在2mL水中并逐滴加到该溶液中,将其在室温下搅拌30分钟。接下来,将3摩尔当量的多巴胺盐酸盐(DOPA,85mg)溶解在2mL水中并逐滴加到溶液中,然后将溶液搅拌24小时。第二天,将溶液从搅拌中去除并加入10mL乙醇并将溶液静置1小时。然后,倾析乙醇,将剩余的沉淀物溶于蒸馏水中,用蒸馏水透析5天,然后在-20℃下冷冻并冷冻干燥,得到产物(GGp-DOPA3),呈白色固体128mg。产物的1H NMR光谱(图2)与多巴胺改性的结冷胶的预期结构一致。在这种情况下的取代度测定为约4%。
通过相对于纯化的结冷胶原料适当地降低或增加上述实例中使用的活化剂和多巴胺盐酸盐的摩尔当量,可以获得取代度为0.01-30%的改性结冷胶。例如,以1或7.5摩尔当量应用以上所描述的方法,能够获得分别具有更低(GGP-DOPA1)和更高(GGP-DOPA7.5)取代度(2.1和5.6%)的DOPA改性的结冷胶。
通常,DOPA改性的结冷胶含有约7-10%的水形式的残余水分。对残留溶剂、金属、重金属和可浸出杂质返回分析水平的测试通常低于测试方法的检测限。
通过进一步改变纯化的结冷胶原料的分子量,可以获得具有各种分子量的DOPA改性的结冷胶(表II),如通过凝胶渗透或尺寸排阻色谱法(GPC-SEC),用于测定聚合物材料的平均分子量(Mw)、平均分子数(Mn)和特性粘度(IV)的标准技术进行测定的。
表II.使用具有不同分子量的纯化的结冷胶原料,GGp-DOPA3的代表性批次的分子量。
批次 | Mw(KDa) | Mn(KDa) | Mw/Mn | IV(cm<sup>3</sup>/g) |
#1 | 2080 | 1170 | 1.8 | 3190 |
#2 | 1454 | 673 | 2.2 | 2020 |
#3 | 2604 | 1687 | 1.5 | 4247 |
对于本领域技术人员显而易见的是,通过应用相同的合成方法并使用适当取代的醇(R7-OH)和伯/仲胺(HN-R7R8)代替多巴胺,可以制备本文公开的整个范围的改性的结冷胶。
多巴胺盐酸盐的硝化
向多巴胺盐酸盐(1.92g,10mmol)的蒸馏水(25mL)中的搅拌溶液中加入亚硝酸钠(1.52g,22mmol),将该溶液在冰水浴中冷却。然后,逐滴加入硫酸(1mL)的蒸馏水(10mL)中的溶液,使反应混合物在外观上变成深橙红色。在添加结束时,形成浓稠的黄橙色沉淀物。然后将混合物在室温下搅拌过夜,然后过滤并依次用冰冷水、无水乙醇和二***洗涤。真空干燥后,得到6-硝基多巴胺半硫酸盐的黄色固体。产物的1H NMR光谱(图3)与预期的结构一致。
利用1当量的6-硝基多巴胺(GGp-NITRODOPA1)改性的纯化的结冷胶
在室温下将500mg纯化的结冷胶溶解在蒸馏水(50mL)中。然后将0.20g DTMMC1溶解在蒸馏水(5mL)中并逐滴加到该溶液中,在室温下搅拌30分钟。接下来,将1摩尔当量的6-硝基多巴胺半硫酸盐(NITRODOPA,220mg)溶解在N,N-二甲基乙酰胺(8mL)中并逐滴加到该溶液中,然后将其搅拌24小时。第二天,将溶液倒入500mL乙醇中,并将沉淀物搅拌1小时。然后,滤出沉淀物,用乙醇洗涤,然后溶解在蒸馏水(200mL)中。将产物用蒸馏水透析5天,然后冷冻并冷冻干燥,得到呈橙黄色固体的产物(GGp-NITRODOPA1)。产物的1H NMR光谱(图4)与通过硝基多巴胺改性的结冷胶的预期结构一致。
通过适当地降低或增加上述实例中使用的活化剂和硝基多巴胺半硫酸盐的摩尔当量,可以获得取代度为0.01-30%的改性的结冷胶。例如,以3摩尔当量应用上述方法,可以获得具有更高(GGp-NITRODOPA3)取代度的NITRODOPA-改性的结冷胶。
如上所述制备2-氯多巴胺盐酸盐(McCarthy,1986)和1-(2'-氨基乙基)-2-甲基-3-羟基-4-吡啶酮二盐酸盐(Dobbin,1993)。通过以这些材料应用上述实例中的方法,还获得了相应的改性的结冷胶水凝胶前体。
在一种优选的实施方式中,改性的结冷胶(本文例举GG-DOPA3)可以在5至40℃,优选地15至37℃的温度下,优选地在温和搅拌下,以无菌或其他方式溶解并保持在去离子水中不到一个小时。同样在另一种优选的实施方式中,溶解介质可包括细胞培养基、磷酸盐缓冲盐水溶液或氯化钠盐水溶液。
在一种实施方式中,溶解时间为在0.5至1小时之间,优选地小于30分钟。
改性的结冷胶溶液的优选浓度为0.01%至5%w/V,更优选地0.1至4%w/V,甚至更优选地0.5至3%w/V。
在一种优选的实施方式中,改性的结冷胶溶液是剪切稀化液体,其(图5)具有足够的流动性并且具有合适的粘度以通过注射器注射。改性的结冷胶溶液的优选特性粘度在5mg/mL的浓度下为1000-5000cm3/g,更优选地1500-4500cm3/g(表II)。改性的结冷胶溶液明显不含夹带空气,透明无色,几乎无色或外观颜色浅。通过这种溶液的离子交联形成的改性的结冷胶水凝胶是透明的并且明显不含夹带气泡。
改性的结冷胶水凝胶形成
初始目标聚合物浓度为1.25%w/V。称取12.5mg GGp-DOPA3到塑料小瓶中,加入磁力搅拌棒。加入1mL无菌注射用水。手动轻柔地确保小瓶中的水与所有材料接触以保湿。开始磁力搅拌并持续,直至材料在室温下完全溶解。最终的溶液是透明和粘稠的。使用理想的磁体尺寸和指示的磁力搅拌速率使气泡的形成最小化。如果需要,将溶液静置以使夹带的气泡逸出。
溶解完全后,停止磁力搅拌。向聚合物溶液中加入250μL磷酸盐缓冲盐水(含有Ca2 +/Mg2+的PBS)(水凝胶:含有Ca2+/Mg2+的PBS的比率为8:2)。含有Ca2+/Mg2+的PBS中的二价阳离子促进聚合物的离子交联。最终聚合物浓度为1%w/V。轻轻旋转溶液一分钟。同时,在孔板中,在每个孔的底部放置一个圆柱形塑料模具。小心地用所需体积的交联聚合物溶液填充模具而不干扰模具。5分钟后,用PBS(含有Ca2+/Mg2+)覆盖模具。使孔板静置适当的时间,然后取出模具。将凝胶留在PBS溶液中(悬浮液)适当的时间。从孔板中取出凝胶(图6,右)。
在另一种优选的实施方式中,可以使用细胞培养基代替PBS来促进离子交联。
在另一种优选的实施方式中,可以加入除Ca2+和Mg2+之外的阳离子以经由离子交联形成改性的结冷胶水凝胶。一种或多种二价和三价离子或其混合物,例如Fe2+、Cu2+、Sr2+、Ba2+、Co2+、Mn2+、Ni2+、Sn2+、Zn2+、Fe3+、Al3+、Ga3+和Ti3+可以在生理学相关的浓度下以药学上可接受的盐形式加入制剂中,例如氯化物和硫酸盐及其水合物。由于这些离子的化合价和离子半径不同,因此可以获得具有广泛的物理化学和机械性质的改性的结冷胶水凝胶。
令人惊讶的是,与结冷胶和先前报道的结冷胶的改性相反,除二价和三价阳离子之外的离子可用于以相等的浓度离子交联本文公开的改性的结冷胶。特别地,生理上相关的单价阳离子例如单独的Na+、K+和Li+或其混合物都能够促进机械稳定的水凝胶的形成。这与未改性的纯化的结冷胶相反,如前所述,其仅在单价阳离子存在下不形成水凝胶。在一种优选的实施方式中,离子交联通过0.9%氯化钠溶液促进。
该发现与生理流体特别相关。因此,改性的结冷胶水凝胶可以通过使用人或动物全血或血浆作为交联剂来获得(图7),因为它们富含单价阳离子作为电解质。该方面在微骨折的上下文中特别相关。
此外,本文公开的改性的结冷胶在单价阳离子存在下形成稳定水凝胶的惊人能力克服了涉及二价和单价阳离子交换的结晶胶和甲基丙烯酸酯化胶在体内随时间观察到的机械稳定性问题。因此,本文公开的改性的结冷胶比结冷胶和甲基丙烯酸酯化结冷胶在体内保持其更长时间的机械性能。
改性的结冷胶多孔无细胞支架
通过应用以下代表性方法,可以由改性的结冷胶形成改性的结冷胶多孔无细胞支架。
在室温下,在搅拌下将GGp-DOPA3(375mg)溶于蒸馏水(30mL)中,得到1.25%w/V溶液。然后,将7.5mL含有Ca2+和Mg2+离子的PBS置于塑料盘的中心,紧接着将GGp-DOPA3溶液加入塑料盘中,并用刮刀与交联溶液剧烈混合。然后将所得混合物静置30分钟至1小时。在此期间之后,加入另外的PBS溶液直至盘的顶部完全浸没。然后使盘静置15至30分钟。然后通过用直径为12mm的圆柱形冲头冲压水凝胶来形成聚合物圆柱体。然后将得到的聚合物圆柱体转移到24孔板(每个孔中一个圆盘)中并用PBS覆盖,然后每9小时更换PBS三次。然后,从每个孔中除去过量的PBS后,将板在-80℃下冷冻24小时。然后将板从冷冻机中取出并冻干3至5天,得到多孔脱水的GGp-DOPA3支架(图6,左)。
所述多孔支架可用作组织植入物、组织填充物或用于支架增强,例如与微骨折结合。
GGp-DOPA3支架可以使用例如PBS溶液再水化(图6,中间),并且可以用作例如无细胞构建体,或者可以用于体外接种各种细胞类型,包括脂肪或骨髓来源的间充质基质/干细胞,从而为体内应用提供载有细胞的植入物。
GGp-DOPA3支架的溶胀特性
用卡尺测量九个圆柱形支架(长度和高度),并将每个支架置于单独的板孔中。每个孔用PBS填充,1分钟后,从溶液中取出支架并立即用卡尺测量(长度和高度)。然后,立即将支架再次置于PBS溶液中,并在30分钟、1小时、6小时、24小时、2天、3天、4天、5天和6天的时间点重复相同的步骤。记录所有测量值,并计算不同时间点的支架体积,如图8所示。
GGp-DOPA3支架的吸水特征
称重九个圆柱形支架,并将每个支架置于单独的板孔中。每个孔用PBS填充。1分钟后,将支架从溶液中取出,除去过量的溶液,称重支架。然后,将支架再次置于溶液中,并在30分钟、1小时、6小时、24小时、2天、3天、4天、5天和6天的时间点重复相同的步骤。记录在不同的时间点的所有重量,如图9所示。
评估和比较GGp-DOPA水凝胶粘附性-离体固定在软骨损伤内
在人膝关节中,股骨内侧软骨是III级和IV级深度病变的最常见部位。针对软骨修复所治疗的人体病变大小为0.5-12cm2。在人类中,5个位置的平均关节软骨厚度为2.2-2.5mm,而猪为2-4mm。关于用于诱导软骨病变的软骨厚度,猪模型更类似于人类的情况。因此,使用与人类中发现的类似的离体条件来测试新的基于改性结冷胶的水凝胶的固定,包括:病变位置、大小、深度以及物理应力(重力和摩擦)。
在猪关节中产生8mm直径(0.5cm2)的圆形软骨病变(临界尺寸缺损-软骨宽度的50%)。移除病变部位的软骨,直至达到软骨下骨,并且病变的深度为约2mm。对每个病变计算用于进行测试的确定的水凝胶体积(V=πr2×高度)。如前所述配制GGp-DOPA1(1%w/V)、GGp-DOPA3(1%w/V)、GGp(1%w/V)和GG-MA(2%w/V)水凝胶并移液到病变处,使每个病变被完全填充。然后使用生理盐水溶液(0.9%w/V)诱导交联5分钟。进行了以下应力测试;
重力测试:将原型缓慢地上下颠倒,使病变面朝下。剧烈振荡原型以确认水凝胶固定在病变内(阳性结果)或水凝胶从病变中脱位(阴性结果)。
摩擦测试-组装原型关节并模拟关节运动以确认水凝胶固定在病变内(阳性结果)或水凝胶断裂或从病变中脱位(阴性结果)。
通过将关节浸入37℃盐水溶液中过夜来进一步模拟生理温度内的固定。
两种GGp-DOPA水凝胶制剂(GGp-DOPA1和GGp-DOPA3)成功地经受住所有应力测试条件,在2mm厚的软骨病变内保持完全完整性(图10a)。此外,可以在固定测试后从病变中完整地去除3D GGp-DOPA水凝胶。相反,在同一测试***中仅观察到GGp和GG-MA制剂的部分固定,并且还观察到水凝胶碎裂。
关于水凝胶制剂的浓度,发现1%w/V在粉末溶解时间、溶液粘度和3D水凝胶稠度和稳定性方面特别适合于GGp-DOPA1、GGp-DOPA3和GGp。然而,对于GG-MA,需要2%w/V的最小浓度以实现类似的性质。这些结果证实,用离子螯合取代基改性的结冷胶水凝胶在相同或更低的浓度下比现有技术的结冷胶水凝胶具有显著更高的粘附性。
为了进一步证实结冷胶水凝胶的粘附性质,在猪关节内的若干位置产生软骨病变来重复该固定试验,其中软骨厚度的变化可进一步挑战水凝胶的粘附。在所有六个位置(图10b),在按顺序测试之后发现水凝胶在原位。
本文公开的改性的结冷胶水凝胶的改进的粘附性质意味着可以处理更大尺寸的软骨病变(>4cm2),因为与其他水凝胶不同,本发明的改性的结冷胶水凝胶能够粘附到更大的表面上。举例来说,目前可用的治疗选择,例如微骨折、ACI或MACI仅对治疗1-4cm2之间的较小病变有效。因此,改性的结冷胶水凝胶提供优于护理治疗选择的现有技术和标准的优点。
体外评估细胞在GGp-DOPA水凝胶中的活力
通过体外培养多达21天评估包封在基于结冷胶的水凝胶内的人软骨形成细胞的活力,21天是软骨形成所需的最短时间范围。在室温下将细胞与代表性的基于GG的溶液混合,得到1%w/V浓度的GGp-DOPA1、GGp-DOPA3和GGp水凝胶,以及2%w/V浓度的GG-MA水凝胶,所有制剂含有5百万个细胞/mL。
进行具有不同细胞类型的两种独立培养,即具有人软骨细胞和人脂肪间充质基质/干细胞(hASC)。使用软骨形成生长因子,维持hASC未分化或诱导进入软骨细胞谱系中。移取单个20μL细胞水凝胶并加入细胞培养基以促进水凝胶的交联,从而产生稳定且可转移的单个3D结构。
在体外培养后,通过特异性染色通过显微镜观察活细胞和死细胞,由此通过钙黄绿素AM将活细胞染成绿色,并通过碘化丙啶将死细胞染成红色(图11)。
关于脂肪基质/干细胞,与其他制剂相比,在GGp-DOPA3水凝胶内观察到明显增加的活细胞密度。这对于分化的和未分化的细胞都是明显的(图11,中间和右侧列)。此外,在GGp-DOPA3水凝胶内观察到比在GGp-DOPA1水凝胶内更好的细胞分布,而在GGp和GG-MA水凝胶内明显观察到没有细胞的空隙区域。
对于软骨细胞培养,在各种水凝胶制剂中观察到实际上相等的细胞密度和活力(图11,左侧列)。这些结果证实,与现有技术的结冷胶水凝胶相比,GGp-DOPA水凝胶在包封后能够长时间维持不同的细胞类型存活,并且通过明智地选择取代度,可以优化细胞活力和在水凝胶中的分布。
体外评价GGp-DOPA水凝胶体内的软骨形成
II型胶原是健康关节透明软骨中最丰富的细胞外基质组分。另一方面,I型胶原的存在与不健康的纤维软骨组织有关。
因此,体外培养多达21天来评估包封在基于结冷胶的水凝胶内的人软骨形成细胞对这两种标记物的表达。实验方案如前用于评估细胞活力所述。
令人惊讶地发现,不同的水凝胶制剂对II型胶原和I型胶原的表达具有非常深远和意想不到的影响。在所测试的四种制剂中,GGp-DOPA3明显诱导II型胶原的表达至更高水平,而不是I型胶原(图12)。虽然这种区分因子是显而易见的,但更明显的是II型胶原的表达比I型胶原高4倍。除了胶原II的表达与胶原I相比增加外,II型胶原上调的整体水平因GGp-DOPA3比任何其他制剂平均高13倍,这也支持其软骨形成友好特性。
因此,令人惊讶地表明,离子螯合基团的性质和该取代基对结冷胶的取代度都有利于软骨形成。考虑到潜在的治疗应用,例如透明软骨再生,如本文所述的具有确定取代度的含有离子螯合基团的某些改性的结冷胶水凝胶具有明显提高基于细胞的软骨病变治疗的功效的潜力。
因此,如本文所述的用离子螯合取代基改性的结冷胶水凝胶通过促进长期细胞活力和健康细胞外基质标记物表达的上调,同时在身体组织和表面内显示出改进的粘附行为,为体外细胞培养和组织工程和再生医学提供显著优势。
无论何时在本文档中使用,术语“包括”旨在表示所陈述的特征、整数、步骤、组分的存在,而不是排除一个或多个其他特征、整数、步骤、组分或其组的存在或添加。
本文件中引用的所有参考文献通过引用整体并入本文,如同每个参考文献已通过引用单独并入。
本领域技术人员将认识到或只是使用常规的实验就能够确定本文所述的本发明具体实施例的许多等同物。本发明的范围不限于以上描述,而是如所附权利要求中所述。
在权利要求的说明书中使用单数形式的元件或特征的情况下,还包括复数形式,反之亦然,如果没有特别排除的话。例如,术语“一个细胞”或“该细胞”还包括复数形式“细胞”或“该细胞”,反之亦然。在权利要求中,例如“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”的冠词可以意指一个或多于一个,除非相反地指出或从上下文中显而易见。如果组成员中的一个、多于一个或所有在给定产品或过程中存在,使用或以其他方式相关,则认为在组中一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述是满足的,除非另有说明相反或从上下文中显而易见。本发明包括这样的实施例,其中该组的恰好一个成员在给定产品或过程中存在,使用或以其他方式相关。本发明还包括其中多于一个或所有组成员在给定产品或过程中存在,使用或以其他方式相关的实施例。
此外,应理解,本发明包括所有变型、组合和置换,其中来自一个或多个权利要求或来自说明书的相关部分的一个或多个限制、要素、条款、描述性术语等被引入另一个权利要求中。例如,可以修改依赖于另一个权利要求的任何权利要求以包括在依赖于相同基本权利要求的任何其他权利要求中找到的一个或多个限制。此外,在权利要求叙述组合物的情况下,应理解包括将组合物用于本文公开的任何目的的方法,以及包括根据本文公开的任何制备方法或该领域已知的其他方法制备组合物的方法,除非另有说明或者除非本领域普通技术人员明白会出现矛盾或不一致。
在给出范围的情况下,包括端点。此外,应理解,除非另外指出或从上下文和/或本领域普通技术人员的理解中另外显而易见,否则表示为范围的值可以在本发明的不同实施例中假定在所述范围内的任何具体值,达到该范围下限单位的十分之一,除非上下文另有明确规定。还应理解,除非另有说明或从上下文和/或本领域普通技术人员的理解中另外显而易见,否则表示为范围的值可以假定给定范围内的任何子范围,其中子范围的端点以与该范围下限单位的十分之一相同的精度表达。
另外,应理解,本发明的任何特定实施例可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。在给出范围的情况下,该范围内的任何值可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。本发明的组合物和/或方法的任何实施例、要素、特征、应用或方面可以从任何一个或多个权利要求中排除。出于简洁的目的,本文未明确阐述排除一个或多个元件、特征、目的或方面的所有实施例。
上述实施例是可组合的。
以下权利要求进一步阐述了本公开的特定实施例。
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Claims (32)
3.根据前述权利要求1或2所述的结冷胶,其中所述结冷胶是可通过选自由以下组成的组的一种或多种一价、二价或三价阳离子或其混合物进行离子交联的:Na+、K+、Li+、Ca2+、Mg2 +、Fe2+、Cu2+、Sr2+、Ba2+、Co2+、Mn2+、Ni2+、Sn2+、Zn2+、Fe3+、Al3+、Ga3+和Ti3+。
4.根据前述权利要求1或2所述的结冷胶,其中所述结冷胶的取代度为0.2-15%。
5.根据前述权利要求1或2所述的结冷胶,其具有在500KDa和2500KDa之间的分子量。
6.根据前述权利要求1或2所述的结冷胶,其用于人类医学或兽医学或作为药物。
7.根据前述权利要求1或2所述的结冷胶,其用于组织工程或再生医学。
8.根据前述权利要求1或2所述的结冷胶,其用于体外细胞培养。
9.根据前述权利要求1或2所述的结冷胶,其用于微骨折。
10.根据前述权利要求1或2所述的结冷胶,其用于骨、软骨或软组织疾病或病变的治疗或疗法。
11.根据前述权利要求1或2所述的结冷胶,其用于透明软骨损害的治疗或疗法。
12.根据前述权利要求1或2所述的结冷胶,其用于人间充质干细胞的软骨分化和/或成骨分化和/或成脂分化。
13.根据权利要求12所述的结冷胶,其用于受人间充质干细胞的软骨分化和/或成骨分化和/或成脂分化正影响的疾病的治疗或疗法。
14.根据前述权利要求1或2所述的结冷胶,其用于骨修复。
15.根据前述权利要求1或2所述的结冷胶,其用于皮内和透皮疗法。
16.一种水凝胶,其包含前述权利要求中任一项所述的结冷胶和合适的溶剂。
17.根据权利要求16所述的水凝胶,其中所述合适的溶剂是水、细胞培养基、含水盐溶剂,或其混合物。
18.根据前述权利要求16或17所述的水凝胶,其中所述结冷胶的浓度是0.5%-5%w/v。
19.根据前述权利要求16或17所述的水凝胶,其中所述结冷胶的浓度为1.0%-2%w/v。
20.一种组合物,包含前述权利要求1-15中任一项所述的结冷胶或前述权利要求16-19中任一项所述的水凝胶和选自由以下组成的组的生物活性成分:哺乳动物细胞、小分子活性物质、治疗剂或诊断标记物,或其混合物。
21.根据权利要求20所述的组合物,其中所述哺乳动物细胞选自哺乳动物干细胞。
22.根据权利要求20所述的组合物,其中所述哺乳动物细胞选自由以下组成的组:哺乳动物软骨细胞、哺乳动物间充质基质细胞、哺乳动物间充质干细胞,或其混合物。
23.根据权利要求22所述的组合物,其中所述哺乳动物间充质干细胞选自哺乳动物骨髓间充质干细胞。
24.根据前述权利要求22所述的组合物,其包含所述结冷胶,并且进一步包含骨髓抽吸浓缩物、生长因子和/或抗生素。
25.一种包含基质的组合物,所述基质含有权利要求1-15中任一项所述的结冷胶或权利要求16-19中任一项所述的水凝胶以及人脂肪间充质基质/干细胞。
26.根据前述权利要求25所述的组合物,其中所述细胞包封在所述结冷胶内,并且是自体细胞。
27.根据前述权利要求24所述的组合物,其中生长因子是TGF-β1、骨形态发生蛋白BMP-2、BMP-7或软骨衍生的形态发生蛋白CDMP-1、CDMP-2、血小板裂解液,或其混合物。
28.根据前述权利要求20至27中任一项所述的组合物,其为可注射的形式。
29.一种网状物、盘、水凝胶支架、条带、纱布或膜,其包含权利要求1-15中任一项所述的结冷胶或权利要求16-19中任一项所述的水凝胶,或权利要求20-28中任一项所述的组合物。
30.一种透皮治疗***,其包含权利要求1-15中任一项所述的结冷胶或权利要求16-19中任一项所述的水凝胶,或权利要求20-28中任一项所述的组合物。
31.一种用于在组织工程、再生医学或体外细胞培养中使用的试剂盒,其包括基质,所述基质含有权利要求1-15中任一项所述的结冷胶或权利要求16-19中任一项所述的水凝胶,或权利要求20-28任一项所述的组合物和哺乳动物细胞。
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