KR102534568B1 - 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체 (gitr) 항체 및 이의 이용 방법 - Google Patents

글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체 (gitr) 항체 및 이의 이용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102534568B1
KR102534568B1 KR1020197005244A KR20197005244A KR102534568B1 KR 102534568 B1 KR102534568 B1 KR 102534568B1 KR 1020197005244 A KR1020197005244 A KR 1020197005244A KR 20197005244 A KR20197005244 A KR 20197005244A KR 102534568 B1 KR102534568 B1 KR 102534568B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
amino acid
seq
acid sequence
ser
antibody
Prior art date
Application number
KR1020197005244A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190039532A (ko
Inventor
웨인 에이 마라스코
콴 카렌 주
Original Assignee
다나-파버 캔서 인스티튜트 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. filed Critical 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크.
Publication of KR20190039532A publication Critical patent/KR20190039532A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102534568B1 publication Critical patent/KR102534568B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2086—IL-13 to IL-16
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 발명은 GITR (글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체로도 공지됨)에 결합하는 인간화된 단일클론 항체를 포함한다. 발명된 항체의 GITR에 결합으로 이의 리간드, GITR-L에 결합을 저해하고, 그리고 암 치료에 이용될 수 있다.

Description

글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체 (GITR) 항체 및 이의 이용 방법
관련된 출원
본 출원은 2016년 7월 22일자로 제출된 미국 가특허 출원 번호 62/365,712, 그리고 2016년 8월 16일자로 제출된 미국 가특허 출원 62/375,634에 대해 우선권을 주장하며, 이들 출원은 이들 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 항-글루코코르티코이드(glucocorticoid)-유도된 종양 괴사 인자 수용체 (GITR) 항체 뿐만 아니라 이의 이용 방법에 관계한다.
정부 관심
본 발명은 []에 의해 제공되는 [ ] 에서 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명의 특정 권리를 보유한다.
서열 몰록은 참고자료로 편입
[ ]로 명명된 텍스트 화일 내용은 [ ]일자에 만들어졌으며, 크기는 [ ] 길로바이트이며, 이의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
발명의 배경
면역계는 자가면역 질환을 예방하기 위하여 내성을 유지하면서, 병원성 개체 (예 : 암)를 제거하기 위한 효과적인 반응 사이의 균형을 이루어야 한다. T 세포는 면역 기능 억제와 능동 면역 거부의 균형을 유지하는데 중요한 역할을 한다. T 조절 세포 (Tregs)는 CD25+, CD4+, FOXp3+ 및 글루코코르티코이드-유발 종양 괴사 인자 관련 수용체(GITR)의 발현을 특징으로 한다. Tregs는 병리학적인 면역 반응을 억제하고, 궁극적으로 면역학적 자가-내성을 조절하여 면역 항상성을 유지한다. Tregs의 존재는 다양한 병리학적 실체 제거를 담당하는 활성화된 작동체(effector) T 세포의 활성을 억제한다.
인간 상피 악성종양은 순환계와 종양 자체 내에서 증가된 양의 Tregs의 존재와 관련되어 왔다. 암 환자의 억제 Tregs의 증가는 작동체 세포를 포함한 고전적 T 세포의 억제를 가져오고, 결과적으로 IFN-γ 생산의 하향 조절을 유도한다. 생체내 암 동물 모델에서 Tregs의 존재 또는 활성의 감소는 작동체 T 세포의 양과 활성의 증가를 결과하였고, 이는 종양의 크기의 감소 및/또는 다른 암 증상의 완화로 대개 이어진다.
T 세포 활성화는 Tregs와 작동체 T 세포 모두에서 GITR 수준의 상향 조절을 초래한다. Tregs 면역 억제 기능은 감소되고, 작동체 T 세포의 활성이 증가되는 것과 같이 GITR의 활성을 조절하는 방법은 진지하게 연구가 지속되고 있다. GITR 리간드, GITR-L은 수지상 세포, 대식세포 및 B 세포를 비롯한 다양한 세포에서 발현된다. 기존 연구들은 암 모델에서 외인성 GITR-L의 투여 후, 또는 GITR을 길항하는 대체 수단에 의해 증가된 항-종양 면역 활성 연관성을 보여주었다.
증가가 존재하는 경우, 그리고 Tregs가 암에 미치는 역할을 감안할 때, GITR을 통해 Tregs의 활동과 존재를 조절하는 것에 대한 더 많은 관심이 암에 대한 더 깊은 이해와 궁극적으로 암 치료에서 가장 중요하다. 따라서, 작동체 T 세포 활성을 촉진시키는 수단으로써, 그리고 그 결과 항-종양 활성으로써, GITR에 결합하고, 그리고 이의 리간드 GITR-L에 결합을 특이적으로 조절할 수 있는 물질이 다급하게 필요하다.
발명의 요약
다양한 양태에서, 본 발명은 인간 항-글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체 (GITR)에 결합하는 단리된 인간화된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 상기 항체는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 영역; 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 영역; 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 영역; 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 영역; 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 영역; 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 영역; 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 영역; 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 영역; 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 영역; 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 영역; 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 영역; 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 영역; 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 영역을 보유한다.
추가 양태에서, 본 발명은 차례로 서열 번호. 53, 54 또는 55의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3 (VH-CDR)을 보유한; 그리고, 서열 번호. 56, 57, 또는 58의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3 (VL-CDR); 차례로 서열 번호. 59, 60, 또는 61의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3 (VH-CDR); 그리고, 서열 번호. 62, 63, 또는 64의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3 (VL-CDR); 차례로 서열 번호. 65, 66, 또는 67의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3 (VH-CDR); 그리고, 서열 번호. 68, 69, 또는 70의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3 (VL-CDR);차례로 서열 번호. 71, 72, 또는 73의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3 (VH-CDR); 그리고, 서열 번호. 74, 75, 또는 76의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3 (VL-CDR); 차례로 서열 번호. 77, 78, 또는 79의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3 (VH-CDR); 그리고, 서열 번호. 80, 81, 또는 82의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3 (VL-CDR); 차례로 서열 번호. 83, 84, 또는 85의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3 (VH-CDR); 그리고, 서열 번호. 86, 87, 또는 88의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3 (VL-CDR); 차례로 서열 번호. 65, 72, 또는 89의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3 (VH-CDR); 그리고, 서열 번호. 90, 91, 또는 92의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3 (VL-CDR); 차례로 서열 번호. 93, 94, 또는 95의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3 (VH-CDR); 그리고, 서열 번호. 96, 97, 또는 98의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3 (VL-CDR); 차례로 서열 번호. 99, 100, 또는 101의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3 (VH-CDR); 그리고, 서열 번호. 102, 103, 또는 104의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3 (VL-CDR); 차례로 서열 번호. 65, 72, 또는 105의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3 (VH-CDR); 그리고, 서열 번호. 106, 107, 또는 108의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3 (VL-CDR); 차례로 서열 번호. 109, 72, 또는 110의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3 (VH-CDR); 그리고, 서열 번호. 111, 112, 또는 113의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3 (VL-CDR); 차례로 서열 번호. 65, 72, 또는 114의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3 (VH-CDR); 그리고, 서열 번호. 115, 116, 또는 117의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3 (VL-CDR); 그리고 차례로 서열 번호. 101, 118, 또는 119의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3 (VH-CDR); 그리고, 서열 번호. 120, 121, 또는 122의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3 (VL-CDR)을 갖는 단리된 인간화 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편을 제공한다.
상기 항체는 일가(monovalent) 또는 이가(bivalent)이다. 예를 들면, 상기 항체는 단일 쇄(chain) 항체다. 상기 항체는 10-5 M 내지 10-12 M 범위의 결합 친화력을 갖는다. 일부 양태들에서 상기 항체는 IgG4 중쇄 불변 영역을 보유한다. 다른 양태들에서, 상기 항체는 아미노산 위치 234 및 235에서 돌연변이를 함유하는 Fc 영역을 보유한다. 상기 돌연변이는 예를 들면, L234A 및 L235A이다.
다른 양태들에서, 본 발명은 본 발명의 인간 GITR 항체 및 종양-연합된 항원, 사이토킨 또는 세포 표면 수용체에 또한 결합하는 항체를 함유하는 이중-특이적 항체를 포함한다.
임의선택적으로, 본 발명의 항체는 톡신, 방사능라벨, siRNA, 소분자(small molecule), 또는 사이토킨과 같은 치료에 연계된다.
본 발명에 따른 항체를 생산하는 세포 또한 본 발명에서 제공된다.
다양한 양태들에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여함으로써, 대상으로부터 조절 T-세포를 감손시키는 방법들을 제공한다.
본 발명의 다른 방법들은 이를 필요로 하는 대상에게 본 발명에 따른 항체를 포함하는 조성물을 투여함으로써, 항원에 대한 면역 반응을 증대시키는 것을 포함한다. 상기 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 종양 연합된 항원이다.
다양한 양태들에서, 본 발명에 따른 항체의 투여는 항원 특이적 T 세포 활성의 증가 및/또는 NK 세포 세포독성의 증가를 초래한다.
일부 양태들에서, 본 발명의 방법들은 상기 대상에게 IL-15의 투여를 더 포함한다.
여전히 또다른 양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상에게 본 발명에 따른 항체를 포함하는 조성물을 투여함으로써, 암의 증후를 치료 또는 경감시키는 방법을 포함한다. 상기 암은 GITR 또는 이의 리간드, GITR-L가 과다발현되는 암이다. 임의선택적으로, 상기 대상에게 사이토킨, 이를 테면, IL-15 또는 화학치료요법적 물질이 더 투여된다.
본 발명은 서열 번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 그리고 51의 핵산 서열을 보유한 핵산을 더 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 서열 번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52의 폴리펩티드를 인코드하는 핵산, 또는 서열 번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52의 아미노산 서열을 보유한 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명에 따른 핵산을 함유하는 벡터가 또한 제공된다. 본 발명에는 본 발명에 따른 벡터를 함유하는 세포가 또한 포함된다.
다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적 숙련자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사한 또는 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은하기에 기술된다. 본 명세서에서 언급된 모든 특허 출원, 특허 및 참고자료는 이들의 전문이 참고자료에 명시적으로 편입된다. 충돌이 있는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 조정할 것이다. 추가로, 본 명세서에서 공개된 재료, 방법 및 예시는 설명을 위한 것이며, 이에 국한시키고자 하는 의도는 없다.
본 발명의 다른 특징, 목적 및 장점은 다음의 상세한 설명 및 청구항들으로부터 자명할 것이며, 이에 포함될 것이다.
도 1은 항-GITR 항체를 식별하기 위하여 이용된 ELISA 시험관내(in vitro) 결합 분석을 기획하고, 그 결과를 설명한다. 플레이트는 각각 2ug/ml의 A) hGITR-His; B) hGITR-mlgG2a; C) mGITR-His; 또는 D) mlgG2a로 피복되었다. 각 상응하는 웰에 대한 OD 측정치가 템플릿 아래에 표시된다.
도 2는 4 가지 상이한 농도 (1E10 내지 1E13 입자/mL) 내지 2가지 상이한 농도의 hGITR-mlg에서 중간 규모 발견 면역분석(meso scale discovery immunoassay)에 의해 측정된, 표시된 항-GITR 파아지(phage) 항체의 결합 활성을 보여주는 한 쌍의 그래프이다.
도 3은 8가지 상이한 농도의 hGITR-mlg에서 중간 규모 발견 면역분석에 의해 측정된, 표시된 항-GITR 파아지 항체의 결합 활성을 보여주는 한 쌍의 그래프이다.
도 4는 항-GITR 파아지 항체를 사용하여 수행된 유동세포측정 결합 분석에 대한 데이터를 예시한다. 항-GITR 파아지 AB의 4 가지 농도를 안정한 GITR 또는 대조군 CA9를 발현하는 CHO 세포와 함께 시험하였다.
도 5는 개개의 콜로니의 배양 상청액으로부터의 단일 농도의 파아지 항체에 의한 유동세포측정 GITR 결합 데이터를 나타내는 그래프이다. 주황색 막대는 GITR을 발현하는 CHO 세포에 대한 결합을 나타내고, 파란색 막대는 GITR 발현이 없는 CHO 세포(CA9 대조군)에 대한 결합을 나타낸다.
도 6은 단일 콜로니로부터의 파아지 상청액에 대한 ELISA GITR 결합 데이터를 나타낸다. 개별 클론에 대한 클론 주형(template), OD450 및 각 플레이트의 코팅 패턴이 표시된다.
도 7은 항-GITR 본 발명에 따른 항체의 유동세포측정 및 ELISA 결과를 나타낸다.
도 8은 온전한 IgG1-Fc (LALA) 돌연변이체 형태로 발현된 항-GITR 항체의 GITR 결합을 유동세포측정 분석으로 분석된 그래프이다. GITR(+) CHO 세포 계통에 항-GITR mAb의 결합은 5-포인트 2X 연속 희석에 의해 이중으로(duplicates) 테스트되었다.
도 9는 세포 표면 발현된 GITR에 결합하는 항-GITR IgG1-Fc (LALA) 항체 결합의 다른 유동세포측정 분석을 나타내는 그래프이다. GITR(+) CHO 세포 계통에 항-GITR mAb의 결합은 5-포인트 2X 연속 희석에 의해 이중으로 테스트되었다.
도 10은 IgG1-Fc (LALA) 형태 (패널 A) 또는 IgG4 형태 (패널 B)로 발현된, 대표적인 항-GITR IgG1 항체의 GITR 결합능은 유동세포측정에 의해 분석되어 나타낸다. GITR(+) CHO 세포 계통에 항-GITR mAb의 결합은 4-포인트 2X 연속 희석에 의해 이중으로 테스트되었다.
도 11은 47ng/ml에서 GITR 리간드와 항-GITR E1-3H7 IgG4, TT1-3C6 IgG4 또는 시판되는 GTI-10 IgG1 항체의 10-포인트 2x 연속 희석 간의 결합 경쟁을 도시한다.
도 12는 항-GITR E1-3H7 IgG4 또는 TT1-3C6이 Promega 사의 GloResponseTM NF-κB-luc2P/GITR Jurkat 세포를 사용한 시험관내 분석에서 GITR 리간드 유도된 루시퍼라제 발현을 공조적으로 증가시킨다는 것을 보여준다.
상세한 설명
본 발명은 GITR으로 또한 알려진, 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체에 특이적으로 대항하는 인간화된 단일클론 항체를 제공한다 상기 항체는 인간 GITR에 대해 광범위하게 검증된 Mehta I/II 인간 항체-파아지 디스플레이 라이브러리의 사용을 통해 동정되었다. 이들 항체는 GITR에 대한 새로운 종류의 인간 단일 클론 항체를 나타낸다.
이러한 항-GITR 인간 단일클론 항체는 본 명세서에서 "huGITR 항체"로 지칭된다.
상피 암의 경우 조절 T 세포 (Tregs)의 양이 증가한다는 증거가 있다. GITR은 Tregs에 의해 유지되는 우세한 면역학적 자가-내성에 핵심 역할을 한다는 증거도 있다. Tregs에서의 GITR 발현과 암 중 Tregs의 증가 사이의 연관성은 향상된 작동체 T 세포 기능을 증진시키는 수단으로써 GITR 활성을 표적으로 할 수 있는 기회를 제공한다. 특히, 이것은 암 치료에 대한 잠재적 면역요법인 GITR을 목표로 한다.
Tregs는 CD28, CD4, FOXP3, 그리고 GITR을 발현한다. 작동체 T 세포 활성의 억제는 대개 활성화된 T 세포 핵 인자, NF-AT로 FOXP3 이량체화 방식에 의해 대개 중재되며, 이로써 IFN-γ, IL-2 및 IL-4가 억제된다. 리간드와의 결합에 의해 증가된 GITR 결찰(ligation)은 Treg가 활성화된 T 세포에 미치는 억제 효과를 감소시키는 것으로 나타났다. 추가적으로, GITR을 직접적으로 표적하는 항체는 또한 Treg 억제 기능을 감소시키는 것으로 나타났다.
GITR은 Tregs와 작동체 T 세포 모두에서 발현되지만, GITR의 발현 양은 전립선 암에서 현저히 더 크다. 이와 같이, GITR은 암을 비롯한 다양한 질병에서 Tregs의 억제 기능의 조절에 대한 양호한 후보 표적으로 간주되어왔다. 뮤린 모델에서 GITR의 자극으로 Treg 억제 활성이 감소한다는 결과를 보였다. 다른 연구들에서 GITR 활성을 길항하면 악성 세포로 가는 Treg를 줄이는 결과가 또한 나타냈다. 이들 데이터를 종합하면, GITR은 암의 병태 생리학에서 중요한 수용체임을 나타낸다.
본 발명은 GITR 단백질에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 항체를 제공한다. GITR에 대한 본 발명의 항체의 결합은 GITR에 결합하는 GITR 리간드의 능력을 방해한다. 다양한 메커니즘에 의해, huGITR 항체는 Treg가 작동체 세포에 미치는 억제 기능을 감소시킨다. huGITR 항체의 투여는 Treg 결핍, 작동체 T 세포 (Teff) 증식의 증가, 항원 특이적 T 세포 활성 증가 및 작동체 사이토킨 생산 증가를 초래할 수 있다. 일부 경우에서, huGITR 항체는 항원-특이적 면역 반응을 촉진하거나 증가시킨다.
따라서, 본 발명의 huGITR 항체는 T-세포 활성 조절에 유용하다. 구체적으로 huGITR 항체는 Treg 활성을 억제할 수 있고, Teff 활성을 촉진시킬 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 huGITR 항체는 NK-세포 세포독성을 증가시키고, IFNγ 분비를 증가시킨다.
huGITR 항체는 일가 또는 이가(bivalent)이며, 단일 또는 이중 쇄다. 기능적으로, huGITR 항체의 결합 친화력은 10-5M 내지 10-12 M 범위 안에 있다. 예를 들면, huGITR 항체의 결합 친화력은 10-6 M 내지 10-12 M, 10-7 M 내지 10-12 M, 10-8 M 내지 10-12 M, 10-9 M 내지 10-12 M, 10-5 M 내지 10-11 M, 10-6 M 내지 10-11 M, 10-7 M 내지 10-11 M, 10-8 M 내지 10-11 M, 10-9 M 내지 10-11 M, 10-10 M 내지 10-11 M, 10-5 M 내지 10-10 M, 10-6 M 내지 10-10 M, 10-7 M 내지 10-10 M, 10-8 M 내지 10-10 M, 10-9 M 내지 10-10 M, 10-5 M 내지 10-9 M, 10-6 M 내지 10-9 M, 10-7 M 내지 10-9 M, 10-8 M 내지 10-9 M, 10-5 M 내지 10-8 M, 10-6 M 내지 10-8 M, 10-7 M 내지 10-8 M, 10-5 M 내지 10-7 M, 10-6 M 내지 10-7 M 또는 10-5 M 내지 10-6 M 범위에 있다.
더욱이, 본 발명의 항체는 톡신, 방사능라벨, siRNA, 또는 사이토킨을 포함하나, 이에 국한되지 않는 치료요법적 물질을 포함한다.
13개의 독특한 단일클론 huGITR 항체가 식별되었다. 여기에는 mAb #E1-3B4, #E1-3E5 (#P2-2D12로도 지칭됨), #E1-3E9, #E1-3H7 (#E5-3B2 및 #ET1-3B1로도 지칭됨), #ET1-3D6, #ET1-3E12, #P1-2A11, #P4-2F1, #T1-3G7, #TT1-3C6 (#E1-3F6로도 지칭됨), TT1-3C8, #TT1-3F5, 그리고 #TT5-3E2이 포함된다. 상기 가변 영역 핵산 서열 및 아미노산 서열은 표 1A-13B에 나타낸다. 이들 항체의 가변 영역과 연합된 CDRs의 아미노산 서열은 표 14에 나타낸다.
단일클론 인간 GITR 항체의 핵산 및 아미노산 서열은 하기에서 제공된다:
Figure 112019022533469-pct00001
Figure 112019022533469-pct00002
Figure 112019022533469-pct00003
Figure 112019022533469-pct00004
Figure 112019022533469-pct00005
Figure 112019022533469-pct00006
Figure 112019022533469-pct00007
Figure 112019022533469-pct00008
Figure 112019022533469-pct00009
Figure 112019022533469-pct00010
Figure 112019022533469-pct00011
Figure 112019022533469-pct00012
Figure 112019022533469-pct00013
Figure 112019022533469-pct00014
Figure 112019022533469-pct00015
Figure 112019022533469-pct00016
Figure 112019022533469-pct00017
Figure 112019022533469-pct00018
Figure 112019022533469-pct00019
Figure 112019022533469-pct00020
Figure 112019022533469-pct00021
Figure 112019022533469-pct00022
Figure 112019022533469-pct00023
Figure 112019022533469-pct00024
Figure 112019022533469-pct00025
Figure 112019022533469-pct00026
본 명세서에서 기술된 huGITR 항체는 GITR에 결합한다. 하나의 양태에서, huGITR 항체는 GITR에 대해 높은 친화력 및 높은 특이성을 갖는다. 또다른 양태에서, huGITR 항체는 GITR 수용체에 결합할 수 있고, 리간드 GITR-L이 이의 수용체 GITR에 결합하는 것을 방지, 억제, 또는 차단시킬 수 있다.
Figure 112019022533469-pct00027
Figure 112019022533469-pct00028
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 huGITR 항체의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열과 특정 동일성 또는 유사성 백분율을 갖는 항체를 특징으로 한다. 예를 들면, 상기 항체는 본 명세서에 기재된 huGITR 항체중 임의의 하나의 특정 영역 또는 전장과 비교하였을 때, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 더 높은 동일성을 가질 수 있다. 본 발명의 핵산 및 단백질에 대한 서열 동일성 또는 유사성은 당분야에 공지된 방법에 의해 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 서열 비교 알고리즘 (즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬 또는 육안 검사를 이용하여, 본 발명의 핵산 및 단백질에 대한 서열 동일성 (%) 또는 유사성을 결정할 수 있다.
아미노산 서열에 관해서, 당업자는 인코드된 서열에서 단일 아미노산 또는 작은 비율의 아미노산을 변경, 추가, 결실 또는 치환하는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개별적인 치환, 결실 또는 부가는 본 명세서에서 집합적으로 "보존적으로 변형된 변이체(conservatively modified variant)"로 지칭된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 변경으로 인해 아미노산이 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환된다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 이 기술 분야에 잘 알려져 있다. 본 명세서에 개시된 huGITR 항체의 보존적으로 변형된 변이체는 비변형된 GITR 항체와 비교하여, GITR에 대한 교차-반응성의 증가를 나타낼 수 있다.
항체
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 (Ig) 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 항원과 특이적으로 (면역 반응하는) 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 의미한다. "특이적 결합한다" 또는 "~와 면역 반응한다"는 이 항체가 원하는 항원의 하나 이상의 항원 결정기와 반응하고, 다른 폴리펩티드와는 반응하지 않는다는 것을 의미한다. 항체는 다중클론, 단일클론, 키메라, dAb (도메인 항체), 단일 쇄, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편, scFv 및 Fab 발현 라이브러리를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
단일 쇄 Fv ("scFv") 폴리펩티드 분자는 펩티드-인코딩 링커에 의해 연결된 VH- 및 VL-인코딩 유전자를 포함하는 융합 유전자로부터 발현될 수 있는 공유 결합된 VH:VL 이형이량체(heterodimer)다. (Huston 외, (1988) Proc Nat Acad Sci USA 85(16):5879-5883). 자연적으로 응집되었지만 화학적으로 분리된 경질 및 중질 폴리펩티드 쇄를 항체 V 영역으로부터 scFv 분자로 전환시키는 화학 구조를 식별하기 위한 다수의 방법이 기술되어 있으며, 이때 상기 구조는 항원-결합 부위의 구조와 실질적으로 유사한 3 차원 구조로 폴딩될 수 있다. 가령, U.S. 특허 번호. 5,091,513; 5,132,405; 그리고 4,946,778 참고.
매우 큰 순수(naive) 인간 scFv 라이브러리는 과다(plethora) 표적 분자에 대해 재배열된 항체 유전자의 큰 원천을 제공하기 위해 만들어졌고, 그리고 만들어질 수 있다. 질환-특이적 항체를 분리하기 위해, 더 작은 라이브러리를 감염성 질환이 있는 개인으로부터 구축할 수 있다. (Barbas 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9339-43 (1992); Zebedee 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3175-79 (1992) 참고).
일반적으로, 인간으로부터 수득된 항체 분자는 IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD 클래스 중 임의의 것에 관련되며, 이들은 분자 내에 존재하는 중쇄의 성질에 의해 서로 상이하다. 특정 클래스에는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 그리고 다른 종류의 서브클래스(subclasses)도 있다. 더욱이, 인간에서 경쇄는 카파 사슬 또는 람다 사슬일 수 있다. "항원 결합 부위"또는 "결합 부분"이라는 용어는 항원 결합에 관여하는 면역글로불린 분자의 부분을 의미한다. 상기 항원 결합 부위는 중쇄("H") 및 경쇄 ("L")의 N 말단 가변 영역 ("V")의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. "초가변 영역 (hypervariable regions)"이라 불리는 중쇄 및 경쇄의 V 부위 내의 3 개의 매우 다양한 스트레취는 "틀(framework) 영역"또는 "FRs"로 알려진, 더 보존된 인접 스트레취 사이에 끼어있다. 따라서, "FR"이라는 용어는 면역글로불린의 초가변영역 사이, 그리고 이에 인접하게 자연적으로 발견되는 아미노산 서열을 의미한다. 항체 분자에서, 경쇄의 3 개의 초가변 영역 및 중쇄의 3 개의 초가변 영역은 3 차원 공간에서 서로에 대해 상대적으로 배치되어, 항원-결합 표면을 형성한다. 항원-결합 표면은 결합된 항원의 3-차원 표면에 상보적이며, 중쇄 및 경쇄의 각각의 3 개의 초가변 영역은 "상보성-결정 영역(complementarity-determining regions)" 또는 "CDR"으로 지칭된다. scFv 항체의 CDRs을 함유하는 VH 및 VL 영역을 표 1A 내지 표 13B에 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프(epitope)"는 면역글로불린, scFv 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정 인자를 포함한다. 에페토프 결정인자는 일반적으로 아미노산이나 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹핑으로 구성되며, 일반적으로 특이적인 3 차원 구조 특성, 뿐만 아니라 특이적 전하 특성을 가지고 있다. 예를 들면, 항체는 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단 펩티드에 대항하여 생성될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역학적 결합", 및 "면역학적 결합 성질"은 면역글로불린 분자와 면역글로불린의 특이적인 항원 사이에서 발생하는 비-공유적 상호 작용 유형을 의미한다. 면역학적 결합 상호작용의 강도 또는 친화력은 이 상호작용의 해리 상수 (Kd)로 표현될 수 있으며, 이때 더 작은 Kd는 더 큰 친화력을 나타낸다. 선택된 폴리펩티드의 면역학적 결합 특성은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 정량화될 수 있다. 그러한 방법 중 하나는 항원-결합 부위/항원 복합체 형성 및 해리의 속도를 측정하는 것을 수반하고, 이때 이러한 속도는 복잡한 파트너의 농도, 상호작용의 친화력 그리고 양쪽 방향에서 이 비율에 동등하게 영향을 주는 기하학적 매개 변수에 따라 달라진다. 따라서, 결합-속도 상수"(Kon) 및 "해리-속도 상수"(Koff)는 모두 농도 및 결합(association)과 해리(dissociation)의 실제 속도의 계산에 의해 결정될 수 있다. (Nature 361:186-87 (1993) 참고). Koff /Kon의 비율은 친화력과 관련이 없는 모든 매개변수의 취소를 가능하게 하며, 이는 해리 상수 Kd와 같다. (전반적으로, Davies 외, (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473 참고). 분석, 이를 테면, 방사능리간드 결합 분석 또는 당분야의 숙련자들에게 공지된 유사한 분석에 의해 측정하였을 때, 평형 결합 상수 (Kd)가 ≤10 μM, 바람직하게는 ≤ 10 nM, 더욱 바람직하게는 ≤ 10 nM, 그리고 가장 바람직하게는 ≤ 100 pM 내지 약 1 pM인 경우, 본 발명의 항체는 GITR 에피토프에 특이적으로 결합한다고 말한다.
본 발명의 GITR 단백질, 또는 이의 유도체, 단편, 유사체, 상동체 또는 오르소로그(ortholog)는 이들 단백질 성분에 면역특이적으로 결합하는 항체의 생성에서 면역원으로서 이용될 수 있다. 프로테오리포좀(proteoliposome)에 커플링된 GITR 단백질, 또는 이의 유도체, 단편, 유사체, 상동체 또는 오르소로그(ortholog)는 이들 단백질 성분에 면역특이적으로 결합하는 항체의 생성에서 면역원으로서 이용될 수 있다.
인간 단일클론 항체가 본 발명의 인간 단일클론 항체의 GITR 결합을 저해하는 지를 확인함으로써, 인간 단일클론 항체가 본 발명의 인간 단일클론 항체와 동일한 특이성을 갖는지를 과도한 실험없이 결정하는 것이 가능하다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 만일, 테스트될 인간 단일클론 항체는 본 발명의 인간 단일클론 항체와 경쟁한다면(본 발명의 인간 단일클론 항체에 의해 결합 감소로 나타날 때), 상기 두 단일클론 항체는 동일한 에피토프에 결합하거나, 또는 매우 관련된 에피토프에 결합할 가능성이 있다.
인간 단일클론 항체가 본 발명의 인간 단일클론 항체의 특이성을 보유하는 지를 결정하는 또다른 방법은 본 발명의 인간 단일클론 항체를 이와 보통 반응성이 있는 GITR 단백질과 사전-배양하고(pre-incubate), 그리고 테스트되는 인간 단일클론 항체가 GITR에 결합하는 이의 능력이 저해되는 지를 결정하기 위하여, 인간 단일클론 항체가 추가된다. 시험되는 인간 단일클론 항체가 억제된다면, 십중팔구는 이 항체는 본 발명의 단일클론 항체와 동일하거나, 또는 기능적으로 동등한 에피토프 특이성을 가질 것이다. 본 발명의 인간 단일클론 항체의 스크리닝은 GITR을 이용하고, 상기 테스트 단일클론 항체가 GITR을 중화시킬 수 있는지를 결정함으로써, 수행될 수 있다.
당 업계에 공지된 다양한 절차를 이용하여 본 발명의 단백질, 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 상동체(analogs homologs) 또는 오르소로그에 대항하여 지향된 폴리클론 또는 단일클론 항체의 제조할 수 있다. (예를 들면, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, 그리고 Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 본 명세서의 참고자료에 편입됨).
항체는 주로 면역 혈청의 IgG 분획(fraction)을 제공하는 단백질 A 또는 단백질 G를 사용하는 친화력 크로마토그래피와 같은 잘 알려진 기술에 의해 정제될 수 있다. 후속적으로, 또는 대안으로, 찾고 있는 면역글로불린의 표적인 특이적 항원, 또는 이의 에피토프는 면역친화력 크로마토 그래피에 의해 면역 특이적 항체를 정제하기 위하여, 컬럼 상에 고정화될 수 있다. 면역글로블린의 정제는 예를 들면, D. Wilkinson에 의해 논의된다 (The Scientist, The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000)에 의해 공개됨, pp. 25-28).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단일클론 항체(monoclonal antibody)" 또는 "MAb" 또는 "단일클론 항체 조성물(monoclonal antibody composition)"은 독특한 경쇄 유전자 산물 및 독특한 중쇄 유전자 산물로 구성된 항체 분자의 오직 하나의 분자 종을 함유하는 항체 분자의 집단을 지칭한다. 구체적으로, 단일클론 항체의 상보성 결정 영역 (CDRs)은 이 집단의 모든 분자에서 동일하다. MAbs는 이에 대한 독특한 결합 친화력을 특징으로 하는 항원의 특정 에피토프와 면역반응할 수 있는 항원 결합 부위를 함유한다.
단일클론 항체는 이를 테면, Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)에서와 같은 하이브리도마(hybridoma) 방법을 이용하여 준비될 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물은 전형적으로 면역화제로 면역화되어, 면역원(immunizing agent)에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 대안으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다.
면역원은 전형적으로 단백질 항원, 이의 단편 또는 이의 융합 단백질을 포함할 것이다. 일반적으로, 사람 기원 세포가 바람직하다면, 말초 혈액 림프구가 사용되고, 또는 사람이 아닌 포유류가 바람직한 경우 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 그 다음, 림프구를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 융합제를 사용하여 불멸화된 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). 불멸화된 세포주는 일반적으로 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포로 형질 전환된다. 보통, 렛(rat) 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 불멸화 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 또는 그 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들면, 만일 부모 세포가 하이포산핀 구아닌 포스포리보실 전이효소(HGPRT 또는 HPRT)가 부족한 경우, 하이브리도마의 배양 배지에는 전형적으로 HGPRT가 결핍된 세포의 성장을 막는 하이포산핀, 아미노프테린 및 티미딘 ("HAT 배지")이 포함될 것이다.
바람직한 불사화 세포주는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 발현을 뒷받침하고, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 세포주다. 더욱 바람직한 불멸화된 세포주는 쥐의 골수종 세포주로서, 예를 들어, Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California 및 American Type Culture Collection, Manassas, Virginia로부터 수득할 수 있다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종(heteromyeloma) 세포주는 또한 인간 단일클론 항체의 생산을 위해 기술되어 왔다. (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur 외, Monoclonal Antibody Production Techniques 및 Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63) 참고).
하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지는 항원에 대항하여 지향된 단일클론 항체의 존재에 대해 분석될 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 단일클론 항체의 결합 특이성은 시험관내 결합 분석, 예를 들면, 면역침강 법 또는 방사 면역 측정법 (RIA) 또는 효소-연계된 면역흡착 분석법 (ELISA)에 의해 결정된다. 이러한 기술 및 분석은 당 업계에 공지되어 있다. 단일클론 항체의 결합 친화력은 예를 들면, Scatchard analysis of Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)에 의해 결정될 수 있다. 더욱이, 단일클론 항체의 치료요법적 용도에서, 표적 항원에 대해 고도의 특이성 및 높은 결합 친화력을 갖는 항체를 동정하는 것이 중요하다.
목적하는 하이브리도마 세포가 동정된 후, 클론을 제한 희석 과정에 의해 서브클로닝하고 표준 방법으로 성장시킬 수 있다. (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103 참고). 이러한 목적을 위한 적절한 배양 배지는 예를 들어, Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 대안으로, 하이브리도마 세포는 포유 동물에서 복수(ascites)로써 생체 내에서 성장할 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 단일클론 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 하이드록실 아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기 영동, 투석 또는 친화력 크로마토그래피에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리되거나 또는 정제될 수 있다.
단일클론 항체는 이를 테면, U.S. 특허 번호 4,816,567에서 기술된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 또한 만들어질 수 있다. 단일클론 본 발명의 항체를 인코딩하는 DNA는 통상적인 절 (가령, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써) 용이하게 단리되고, 그리고 서열화될 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로 작용한다. 일단 단리된 DNA를 발현 벡터에 넣은 다음, 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예를 들면, 유인원(simian) COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 형질 감염시켜, 재조합 숙주 세포에서 단일클론 항체를 합성할 수 있다. 상기 DNA는 예를 들면, 상동성 뮤린 서열의 위치에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인의 코딩 서열을 대체하거나(U.S. 특허 번호. 4,816,567; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)) 또는 면역글로불린 코딩 서열에 비-면역글로불린 폴리펩티드의 코딩 서열의 전부 또는 일부를 공유적으로 결합시킴으로써 또한 변형될 수 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 키메라 이가 항체를 생성하기 위해 본 발명의 항체의 불변 도메인을 대신하여 치환될 수 있거나, 또는 본 발명의 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인을 대신하여 치환될 수 있다.
온전한 인간 항체는 CDRs을 포함하는 경쇄 및 중쇄의 전체 서열이 인간 유전자로부터 유래하는 항체 분자이다. 이러한 항체는 본 명세서에서 "인간화된 항체(humanized antibodies)", "인간 항체", 또는 "온전한(fully) 인간 항체"로 명명된다. 인간 단일클론 항체는 트리오마(trioma) 기술에 의해 제조될 수 있는데; 인간 B세포 하이브리도마 기술 (Kozbor, 외, 1983 Immunol Today 4: 72 참고); 그리고 인간 단일클론 항체를 만들기 위한 EBV 하이브리도마 기술(Cole, 외, 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 참고). 인간 단일클론 항체는 인간 하이브리도마를 이용하여, 생산될 수 있거나 (Cote, 외, 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030 참고) 또는 인간 B세포를 입스타인 바르 바이러스(Epstein Barr Virus)로 시험관내에서 형질변환시킴으로써 (Cole, 외, 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 참고) 생산될 수 있다.
또한, 인간 항체는 또한 파아지 디스플레이 라이브러리를 포함하는 추가적인 기술을 사용하여 생산될 수 있다(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks 외, J. Mol. Biol., 222:581 (1991) 참고). 유사하게, 인간 항체는 유전자삽입(transgenic) 동물, 예를 들어, 내생성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전하게 불 활성화되었던 마우스로 인간 면역글로불린 유전자좌를 도입함으로써 제조될 수 있다. 공격(challenge)을 받게 되면, 인간 항체 생산이 관찰되며, 이는 유전자 재배열, 어셈블리(assembly) 및 항체 레퍼토리(repertoire)를 포함하여 모든 측면에서 인간에서 볼 수 있는 것과 매우 유사하다. 이 방법은 예를 들면, U.S. 특허 번호. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, 그리고 Marks 외, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg 외, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); 그리고 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)에서 기술된다.
인간 항체는 항원에 의한 도전에 반응하여 동물의 내생성 항체보다는 오히려 완전히 인간 항체를 생산하도록 변형된 유전자삽입 비-인간 동물을 사용하여 부가적으로 생산될 수 있다. (PCT 공개 WO94/02602 참고). 비인간 숙주에서 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 인코딩하는 내생성 유전자는 무력화되었으며, 인간의 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 인코딩하는 활성 좌위(loci)가 숙주의 게놈 안으로 삽입된다. 인간 유전자는 예를 들어, 요구되는 인간 DNA 절편을 함유하는 효모 인공 염색체를 사용하여 혼입된다. 모든 원하는 변형을 제공하는 동물은 그 변형물의 완전한 보체보다 적은 양을 함유하는 중간 유전자삽입 동물을 교배시킴으로써, 자손으로서 획득된다. 이러한 비인간 동물의 바람직한 구체예는 마우스이며, PCT 공개 WO 96/33735 및 WO 96/34096에 개시된 바와 같은 XenomouseTM로 명명된다. 이 동물은 완전한 인간 면역글로블린을 분비하는 B 세포를 생성한다. 항체는 관심 면역원으로 면역화한 후, 예를 들면, 폴리클론 항체의 조제물로 직접적으로 수득될 수 있거나, 또는 대안으로 상기 동물의 불멸화 B 세포로부터 가령, 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 형태로 수득될 수 있다. 추가적으로, 인간 가변 영역을 갖는 면역글로불린을 인코딩하는 유전자는 직접적으로 항체를 얻기 위해 회수 및 발현시킬 수 있거나, 또는 예를 들어, 단쇄 Fv (scFv) 분자와 같은 항체의 유사체를 수득하기 위해 추가로 변형시킬 수 있다.
내생성 면역글로불린 중쇄의 발현이 없는 마우스로 예시된 비인간 호스트를 생산하는 방법의 예는 미국 특허 번호 5,939,598에 개시되어 있다. 이 마우스는 재배열된 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 전사체의 형성을 방지하기 위하여 배아 줄기 세포에서 적어도 하나의 내생성 중쇄 유전자좌로부터 J 절편(segment) 유전자를 결실시키고, 이 결실은 선택성 표지를 인코딩하는 유전자를 함유하는 표적 벡터에 의해 영향을 받으며; 그리고 배아 줄기 세포로부터 이의 체세포와 배아 세포가 선택성 표지를 인코딩하는 유전자를 포함하는 유전자삽입 마우스를 생산하는 것을 포함하는 방법에 의해 획득될 수 있다.
관심대상 항체, 예컨대, 인간 항체를 생산하는 한 방법은 미국 특허 번호 5,916,771에 개시되어 있다. 이 방법은 배양물에서 하나의 포유류 숙주 세포에 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 도입하고, 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 다른 포유 동물 숙주 세포에 도입하고, 그리고 두 세포를 융합시켜 하이브리드 세포를 만드는 것을 포함한다. 상기 하이브리드 세포는 중쇄 및 경쇄를 함유하는 항체를 발현한다.
이 절차의 또 다른 개선으로, 면역원상의 임상적으로 관련된 에피토프를 동정하는 방법 그리고 높은 친화력을 갖는 관련 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체를 선택하는 상관 방법이 PCT 공개 WO 99/53049에 개시되어 있다.
상기 항체는 상기에서 기술된 단일 쇄 항체를 인코딩하는 DNA 절편을 함유하는 벡터로 발현될 수 있다.
벡터, 리포좀, 네이키드(naked) DNA, 어쥬번트(adjuvant)-연합된 DNA, 유전자 총, 카테테르(catheters) 등을 포함할 수 있다. 백터는 화학 콘쥬게이트(conjugates) 이를 테면, WO 93/64701에 기술된, 표적화 모이어티 (가령, 세포의 표면 수용체에 리간드를), 그리고 핵산 결합 모이어티(moiety) (가령, 폴리리신), 바이러스 벡터 (가령, DNA 또는 RNA 바이러스 벡터), 융합 단백질, 이를 테면, PCT/US 95/02140 (WO 95/22618)에 기술되어 있는 표적 모이어티 (가령, 표적 세포에 특이적인 항체) 및 핵산 결합 모이어티 (가령, 프로타민), 플라스미드, 파아지, 등을 함유하는 융합 단백질을 포함한다. 상기 벡터는 염색체, 비-염색체 또는 합성일 수 있다.
바람직한 벡터는 바이러스 벡터, 융합 단백질 및 화학적 콘쥬게이트를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 몰로니(moloney) 뮤린 백혈병 바이러스를 포함한다. DNA 바이러스 벡터가 선호된다. 이들 벡터는 수두 벡터, 이를 테면, 오르소폭스(orthopox) 또는 아비폭스(avipox) 벡터, 헤르페스바이러스 벡터 이를 테면, 헤르페스 심플렉스(herpes simplex) I 바이러스 (HSV) 벡터 (Geller, A. I. 외, J. Neurochem, 64:487 (1995); Lim, F., 외, in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A. I. 외, Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603 (1993); Geller, A. I., 외, Proc Natl. Acad. Sci USA 87:1149 (1990), 아데노바이러스 벡터(Adenovirus Vectors) (see LeGal LaSalle 외, Science, 259:988 (1993); Davidson, 외, Nat. Genet 3:219 (1993); Yang, 외, J. Virol. 69:2004 (1995) (참고) 및 아데노-연합된(Adeno-associated) 바이러스 벡터 (Kaplitt, M. G.. 외, Nat. Genet. 8:148 (1994) (참고)를 포함한다.
수두 바이러스 벡터는 세포질에 유전자를 도입한다. 아비폭스 바이러스 벡터는 핵산의 오직 단기 발현만을 초래한다. 아데노바이러스 벡터, 아데노-연합된 바이러스 벡터 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) 벡터는 신경 세포 안으로 핵산을 도입시킬 때 바람직하다. 아데노바이러스 벡터는 아데노-연합된 바이러스 (약 4 개월)보다 짧은 기간 (약 2 개월)을 결과하여, 이는 HSV 벡터보다 더 짧다. 특정 벡터는 표적 세포 및 치료되는 상태에 따라 달라질 것이다. 도입은 표준 기술, 가령, 감염, 형질감염, 형질도입 또는 형질전환에 의해 이루어질 수 있다. 유전자 전달 방식의 예는 예를 들어, 네이키드 DNA, CaPO4 침전, DEAE 덱스트란, 전기천공(electroporation), 원형질체 융합, 리포 펙션, 세포 미세주입 및 바이러스 벡터를 포함한다
상기 벡터는 본질적으로 원하는 표적 세포를 표적화하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 정위(stereotaxic) 주입은 벡터 (가령, 아데노바이러스, HSV)를 원하는 위치로 유도하는데 사용될 수 있다. 추가적으로, 입자는 SynchroMed Infusion System과 같은 미니 펌프 주입 시스템을 사용하여 뇌 실내 (icv) 주입으로 전달할 수 있다. 대류(convection)라고 불리는 벌크 유동에 기초한 방법은 또한 뇌의 확장된 영역에 큰 분자를 전달하는데 효과적이며, 벡터를 표적 세포에 전달하는데 유용할 수 있다. (Bobo 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2076-2080 (1994); Morrison 외, Am. J. Physiol. 266:292-305 (1994) 참고). 사용될 수 있는 다른 방법은 카테테르, 정맥 내, 비경구, 복강내 및 피하 주사, 및 경구 또는 다른 공지된 투여 경로를 포함한다.
이 벡터는 다양한 방법으로 사용할 수 있는 다량의 항체를 발현하는 데 사용할 수 있다. 예를 들면, 시료에서 GITR의 존재를 검출하기 위하여. 상기 항체는 또한 GITR에 결합하여, 이의 활성을 파괴시키려는 시도에 사용될 수 있다.
기술은 본 발명의 항원 단백질에 특이적인 단일-쇄 항체의 제조에 적용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,946,778 참조). 또한, 단백질 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 동사체에 대해 원하는 특이성을 갖는 단일클론 Fab 단편을 신속하고 효과적으로 동정하기 위해, Fab 발현 라이브러리 (가령, Huse, 외, 1989 Science 246: 1275-1281 참조)의 구축을 위해 방법을 적용할 수 있다. 단백질 항원에 대한 이디오타입(idiotypes)을 함유하고, 다음에 기술된 것들을 포함하나, 이에 국한되지 않는 항체 단편은 당업계에 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다: (i) 항체 분자의 펩신 절단에 의해 생성된 F(ab')2 단편; (ii) F(ab')2 단편의 이황화 다리를 환원시킴으로써 생성된 Fab 단편; (iii) 파파인 및 환원제로 상기 항체 분자를 처리하여 생성된 Fab 단편, 그리고 (iv) Fv 단편.
헤테로콘쥬게이트(heteroconjugate) 항체 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 헤테로콘쥬게이트 항체는 두 개의 공유 결합된 항체로 구성된다. 이러한 항체는 예를 들어, 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화시키고 (미국 특허 번호 4,676,980 참조), 그리고 HIV 감염의 치료(WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089 참조).를 위해 제안되어 왔다. 항체는 가교 결합제가 관련된 것을 비롯하여 합성 단백질 화학에서의 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 제조될 수 있다는 것도 고려된다. 예를 들어, 면역독소는 이황화물 교환 반응을 이용하거나, 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-멀캅토부티리미데이트(methyl-4-mercaptobutyrimidate)를 포함하며, 예를 들어 미국 특허 번호 4,676,980에 개시된 것들을 포함한다.
예를 들어, 암 치료에 있어서 항체의 유효성을 향상시키기 위해, 작동체 기능에 관하여 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직 할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)는 Fc 영역으로 도입될 수 있고, 이로써 이 영역에서 쇄 사이 이황화 결합 형성이 허용될 수 있다. 따라서, 생성된 동종이량체 항체는 내화(internalization) 능력 개선 및/또는 보체-매개된 세포 사멸의 증가 및 항체-의존성 세포 독성(ADCC)을 가질 수 있다. (Caron 외, J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) 및 Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992) 참고). 대안으로, 이중 Fc 영역을 가지며, 따라서 보체 용해 및 ADCC 능력이 향상된 항체를 작제할 수 있다. (Stevenson 외, Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989) 참고).
특정 양태에서, 본 발명의 항체는 항체의 항원-비의존적 작동체 기능, 특히 항체의 순환 반감기를 변경시키는 아미노산 치환을 포함하는 Fc 변이체를 포함할 수 있다. 이러한 항체는 이러한 치환이 결여 된 항체와 비교할 때 FcRn에 대한 증가 된 또는 감소 된 결합을 나타내며, 따라서 혈청에서 반감기가 증가되거나 감소된다. FcRn에 대해 향상된 친화력을 갖는 Fc 변이체는 보다 긴 혈청 반감기를 가질 것으로 예상되며, 예를 들어, 만성 질환 또는 장애를 치료하기 위해, 투여된 항체의 긴 반감기가 요구되는 포유류를 치료하는 방법에 유용한 적용을 가진다. 대조적으로, 감소된 FcRn 결합 친화력을 갖는 Fc 변이체는 보다 짧은 반감기를 가질 것으로 예상되며, 이러한 분자는 예를 들어, 짧은 순환 시간이 유리한 포유 동물에 투여하는데 유용한데, 가령, 생체내 진단 영상, 또는 시작 항체가 장기간 순환계에 존재할 때 독성 부작용이 있는 상황에 유용하다. 감소된 FcRn 결합 친화력을 갖는 Fc 변이체는 또한 태반을 횡단하기 어렵고, 따라서 임산부의 질병 또는 장애의 치료에도 유용하다. 또한, 감소된 FcRn 결합 친화력이 요구될 수 있는 다른 용도로는 뇌, 신장 및/또는 간으로의 국소화(localization)가 요구되는 용도가 포함된다. 하나의 예시적인 양태에서, 본 발명의 변형된 항체는 혈관계로부터 신장 사구체의 상피를 통과하는 수송의 감소를 나타낸다. 다른 구체예에서, 본 발명의 변경된 항체는 뇌로부터 혈관 공간으로 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 관통하는 수송의 감소를 나타낸다. 한 구체예에서, FcRn 결합이 변경된 항체는 Fc 도메인의 "FcRn 결합 루프" 내에 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 갖는 Fc 도메인을 포함한다. FcRn 결합 루프는 아미노산 잔기 280-299 (EU 번호 매김에 따라)로 구성된다. FcRn 결합 활성을 변경시키는 예시적인 아미노산 치환은 본원에 참고로 인용된 국제 PCT 공개 번호 WO05/047327에 개시되어 있다. 특정 예시적 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 하기 치환체 중 하나 이상을 갖는 Fc 도메인을 포함한다: V284E, H285E, N286D, K290E 및 S304D (EU 번호 매김).
일부 구체예에서, mAb의 항체 의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 활성이 변경되도록 mAb의 불변 영역에 돌연변이가 도입된다. 예를 들면, 돌연변이는 CH2 도메인에서 LALA 돌연변이다. 하나의 양태에서, bsAb는 ADCC 활성을 감소시키는, 이형이량체 mAb의 하나의 scFv 단위 상에 돌연변이를 포함한다. 또다른 양태에서, 상기 mAb는 이형이량체 mAb의 두 쇄 모두에 돌연변이를 포함하는데, 이로써 ADCC 활성은 완전하게 제거된다. 예를 들면, mAb의 하나 또는 양쪽 scFv 단위 상에 도입된 돌연변이는 CH2 도메인에서의 LALA 돌연변이다. 가변 ADCC 활성을 갖는 이들 mAbs는 mAbs가 이 mAbs에 의해 인식되는 하나의 항원을 발현하는 세포에 대하여 최대 선택성 살상을 발휘내지만, 그러나, 이 mAbs에 의해 인식되는 두 번째 항원에 대해서는 최소 살상을 발휘하도록 최적화될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 진단 및 치료 방법에서 사용하기 위한 항체는 당화를 감소시키거나 제거하기 위해 변경된 불변 영역, 예를 들어, IgG1 또는 IgG4 중쇄 불변 영역을 갖는다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 또한 항체의 당화를 변경시키는 아미노산 치환을 포함하는 Fc 변이체를 또한 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 Fc 변이체는 감소된 당화 (가령, N-또는 O-연계된 당화)를 가질 수 있다. 예시적인 구체예에서, Fc 변이체는 아미노산 위치 297 (EU 번호 매김)에서 정상적으로 발견되는 N-연계된 글리칸의 감소된 당화를 포함한다. 또다른 구체예에서, 항체는 당화 모티브 근처 또는 그 안에 아미노산 치환체, 예를 들어, 아미노산 서열 NXT 또는 NXS를 함유하는 N-연계된 당화 모티프(motif)를 갖는다. 특정 구체예에서, 상기 항체는 아미노산 위치 228 또는 299 (아미노 번호)에 아미노산 치환을 갖는 Fc 변이체를 포함한다. 더욱 특정한 구체예에서, 항체는 S228P 및 T299A 돌연변이 (EU 번호 부여)를 포함하는 IgG1 또는 IgG4 불변 영역을 포함한다.
감소된 또는 변경된 당화를 부여하는 예시적인 아미노산 치환은 본원에 참고로 인용된 국제 PCT 공개 번호 WO05/018572에 개시되어 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 당화가 제거되도록 변형된다. 이러한 항체 또는 이의 단편은 "아글리(agly)" 항체 또는 이의 단편 (가령, "아글리 (agly)"항체)로 지칭될 수 있다. 이론에 구속되지 않지만, "아글리(agly)"항체 또는 이의 단편은 생체 내에서 개선된 안전성 및 안정성 프로파일을 가질 수 있다. 예시적인 아글라 항체 또는 이의 단편은 Fc-작동체 기능이 없고, 이로 인하여 GITR을 발현하는 정상적인 생체 기관에 대한 Fc 매개된 독성에 대한 잠재력이 제거된, IgG4 항체의 무당화된 Fc 영역을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 변경된 글리칸을 포함한다. 예를 들면, 상기 항체는 Fc 영역의 Asn297에서 N-글리칸 상에 감소된 수의 푸코즈 잔기를 가질 수 있고, 즉 무푸코실화(afucosylated)된다. 또다른 구체예에서, 상기 항체는 Fc 영역의 Asn297에서 N-글리칸 상에 변경된 수의 시알산 잔기를 가질 수 있다. iii) 공유 부착
본 발명은 독소 (가령, 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 동물 유래의 효소적으로 활성 독소 또는 이의 단편) 또는 방사성 동위 원소 (즉, 방사능접합체(radioconjugate))와 같은 세포 독성 물질에 접합된 항체를 포함하는 면역 접합체(immunoconjugates)에 관한 것이다.
사용 가능한 효소적으로 활성 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 에어로기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래), 리신 A 쇄, 아브린(abrin) A 쇄, 모데신(modeccin) A 쇄, 알파-사르친(sarcin), 말레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴(dianthin) 단백질, 피토라카 아미리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠루신(curcin), 크로틴(crotin), 사파오나리아 오피닐리니스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 레스토로친(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin) 및 트리코테센(tricothecenes)을 포함한다. 방사능접합된 항체를 생산하기 위해 다양한 방사성 핵 종이 사용할 수 있다. 예로는 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 그리고 186Re를 포함한다.
상기 항체 및 세포독성 물지의 콘쥬게이트는 다양한 이가기능성(bifunctional) 단백질-커플링 물질, 이를 테면, N-숙시니미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이가기능성 유도체(이를 테면, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (이를 테면, 디숙시니미딜 수베레이트), 알데히드(이를 테면, 글루타알데히드), 비스-아지도 화합물(이를 테면, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조니움 유도체 (이를 테면, 비스-(p-디아조니움벤조일)에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (이를 테면, 토일렌 2,6-디이소시아네이트), 그리고 비스-활성 플로린 화합물 (이를 테면, 1,5-디플루오르-2,4-디니트로벤젠)을 이용하여 만든다. 예를 들면, 리친 면역 독소는 Vitetta et al., Science 238 : 1098 (1987)에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-라벨된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 상기 항체에 대한 방사성 뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트제이다. (WO94/11026 참조).
당해 기술 분야의 숙련자는 매우 다양한 가능한 모이어티가 생성 항체 또는 본 발명의 다른 분자에 커플링될 수 있음을 인식 할 것이다. (예를 들면, "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989) 참조, 이들의 전문은 본 명세서의 참고자료에 편입됨).
커플링은 항체 및 다른 잔기가 각각의 활성을 유지하는 한, 두 분자를 결합시키는 임의의 화학 반응에 의해 달성될 수 있다. 이 연계(linkage)는 예로써, 공유 결합, 친화력 결합, 개재(intercalation), 좌표 결합 및 복합화와 같은 많은 화학적 기전을 포함할 수 있다. 그러나, 바람직한 결합은 공유 결합이다. 공유 결합은 기존 측쇄의 직접 응축에 의해, 또는 외부 가교 결합 분자에 의해 달성될 수 있다. 많은 2가(bivalent) 또는 다가(polyvalent) 연계 물질은 본 발명의 항체와 같은 단백질 분자를 다른 분자에 커플링시키는데 유용하다. 예를 들면, 대표적인 커플링제는 티오에스테르, 카보디이미드, 숙시니미드 에스테르, 디이소시아네이트, 글루타르알데히드, 디아조 벤젠 및 헥사메틸렌 디아민과 같은 유기 화합물을 포함할 수 있다. 이 목록은 당업계에 공지된 다양한 종류의 커플링제를 하나도 빠짐없이 기록한 것이 아니라, 보다 일반적인 커플링제의 예시다. (Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen 외, Immunological Reviews 62:185-216 (1982); 그리고 Vitetta 외, Science 238:1098 (1987) 참조). 바람직한 링커는 문헌에 기재되어 있다. (예를 들면, Ramakrishnan, S. 외, Cancer Res. 44:201-208 (1984)는 MBS (M-말레이미도벤조일-N-히드록시숙시니미드 에스테르)의 사용을 기술한다. U.S. 특허 번호 5,030,719 참고, 여기에서는 올리고펩티드 링커에 의해 항체에 커플링된 할로겐화 아세틸 하이드라지드 유도체의 용도를 기술한다. 특히 바람직한 링커는 다음을 포함한다: (i) EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노-프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드; (ii) SMPT (4-숙시니미딜옥시카르보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)-톨루엔(Pierce Chem. Co., Cat. (21558G); (iii) SPDP (숙시니미딜-6 [3-(2-피리딜디티오) 프로피오아미도]헥사노에이트(Pierce Chem. Co., Cat #21651G); (iv) 술포-LC-SPDP (술포숙시니미딜 6 [3-(2-피리딜디티오)-프로피안아미드] 헥사노에이트(Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G); 그리고 (v) EDC에 접합된 술포-NHS (N-히드록시술포-숙신이미드: Pierce Chem. Co., Cat. #24510).
상기 기술된 링커는 상이한 속성을 갖는 성분을 함유하여, 상이한 물리-화학적 특성을 갖는 콘쥬게이트를 유도한다. 예를 들면, 알킬 카르복실레이트의 술포-NHS 에스테르는 방향족 카르복실레이트의 술포-NHS 에스테르 보다 더 안정적이다. NHS-에스테르 함유 링커는 설포-NHS 에스테르보다 가용성이 덜하다. 또한, 링커 SMPT는 입체적으로 방해를 받은 디설파이드 결합을 포함하고, 증가된 안정성을 갖는 콘쥬게이트를 형성할 수 있다. 디설파이드 결합은 일반적으로 다른 연계보다 덜 안정적인데, 그 이유는 디설파이드 결합이 시험관내에서 절단되어, 이용가능한 접합체가 더 적기 때문이다. 술포-NHS, 구체적으로, 카르보디미드 커플링의 안정성을 향상시킬 수 있다. 카르보디미드 커플링 (이를 테면, EDC)은 술포-NHS와 함께 사용되는 경우, 카르보디미드 커플링 반응 단독보다 가수분해에 더 강한 에스테르를 형성한다.
본 명세서에 개시된 항체는 또한 면역리포좀으로서 제제화될 수 있다. 상기 항체를 함유하는 리포좀은 당분야에 공지된 방법, 이를 테면, Epstein 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang 외, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 그리고 U.S. 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545에서 기술된 방법에 의해 준비된다. 향상된 순환 시간을 갖는 리포좀은 미국 특허 번호 5,013,556에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 이용한 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 특정의 공극 크기의 필터를 통해 압출되어 원하는 직경의 리포좀이 압출된다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 Martin 외, J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)에 기재된 방법에 따라, 디술파이드-교환 반응을 통하여 리포좀에 접합될 수 있다.
GITR에 대항하는 항체의 용도
본 발명의 GITR 단백질 또는 그의 단편과 특이적으로 결합하는 항체는 GITR 연합 질환 또는 장애를 치료하기 위해 투여될 수 있다. "GITR-연합된 질환 또는 장애"에는 질병 상태 및/또는 질병 상태와 관련된 증상이 포함되는데, 이때 GITR의 증가된 수준 및/또는 GITR이 관련된 세포의 신호 전달 경로의 활성화가 발견된다. 예시적인 GITR-연합된 질환 또는 장애는 암 및 염증성 질환을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
많은 암은 GITR을 과다발현하며, GITR의 상향 조절은 높은 위험성 예후 인자와 관련이 있다. 종양 세포에서의 GITR 또는 이의 리간드 GITR-L의 과발현은 또한 종양 세포가 항-종양 면역을 회피하는 기전을 나타낼 수 있다. 이러한 암에는 고형 종양 및 혈액 종양이 포함된다. 본 발명의 항체의 사용은 Tregs를 억제 또는 고갈시키고, Teffs를 자극한다. 또한, 본 발명의 항체는 NK 세포의 독성을 증가시키고 IFNγ 생산을 증가시킨다.
이중-특이적, 폴리클론, 단일클론, 인간화 및 온전한 인간 항체를 비롯한 본 발명의 항체는 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 제제는 일반적으로 대상에서 암을 치료 또는 예방하고, 백신 효율을 증가 시키거나 또는 자연 면역 반응을 증가시키는데 이용될 것이다. 항원 제재, 바람직하게는 이의 특이성 및 그의 표적 항원에 대한 높은 친화력을 갖는 항체 제재는 대상에게 투여되며, 일반적으로 표적과의 결합으로 인해 효과를 나타낼 것이다. 상기 항체의 투여는 GITR 단백질의 활성을 억제 또는 간섭하거나 방해할 수 있다.
본 발명의 GITR 단백질 또는 이의 단편과 특이적으로 결합하는 항체는 약제학적 조성물의 형태로 암을 치료하기 위해 투여될 수 있다. 항체를 포함하는 치료학적 조성물의 제조에 포함되는 원리 및 고려사항, 뿐만 아니라 성분의 선택에 대한 지침은 예를 들면, Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, 외, editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, 그리고 Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; 그리고 Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New York에 제공된다.
본 발명의 항체의 치료 유효량은 일반적으로 치료 목적을 달성하는데 필요한 양에 관한 것이다. 상기 한 바와 같이, 이것은 항체와 이의 표적 항원 사이의 결합 상호 작용일 수 있으며, 특정 경우에 표적의 기능을 간섭한다. 투여에 요구되는 양은 또한 항체의 특이적 항원에 대한 이 항체의 결합 친화력에 더욱 의존할 것이며, 그리고 이 항체가 투여되는 대상의 유리 체적(free volume)으로부터 투여된 항체가 고갈되는 속도에 의존할 것이다. 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 치료학적으로 효과적인 투여를 위한 통상적인 범위는 비제한적 예로써, 약 0.1 mg/kg 체중 내지 약 50 mg/kg 체중일 수 있다. 일반적인 투약 빈도는 예를 들면, 일일 2 회에서 일주일에 한 번의 범위일 수 있다.
항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 가장 작은 억제 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열에 기초하여, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 보유하는 펩티드 분자를 설계할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성 및/또는 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. (가령, Marasco 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993) 참조). 제형(formulation)은 또한 치료되는 특정 징후에 필요한 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 악영향을 미치지 않는 보완 활성을 갖는 활성 화합물을 함유할 수 있다. 대안으로, 또는 부가적으로, 조성물은 예를 들어 세포 독성제, 사이토킨 (예: IL-15), 화학요법제 또는 성장-억제제와 같은 이의 기능을 강화시키는 물질을 포함할 수 있다. 이러한 분자는 목적하는 목적에 효과적인 양으로 적절하게 조합하여 존재한다.
활성 성분들은 예를 들면, 액적형성(coacervation) 기술 또는 계면(interfacial) 중합화, 예를 들면, 콜로이드성 약물 운반계(예를 들면, 리포좀, 알부민 미소구, 미소유화액, 나노-입자, 그리고 나노캡슐) 또는 거대유화액에서 차례로 예를 들면, 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-미소캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐에 의해 준비된 미소캡슐 안에 포집될 수도 있다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 무균이어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
서방성(sustained-release) 제재를 준비할 수 있다. 서방성 제재의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스를 포함하며, 이때 상기 매트릭스는 성형된 물품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로 캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 젖산-글리콜산 공중합체, 이를 테면, LUPRON DEPOTTM (젖산-글리콜산 공중합체와 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미소구), 그리고 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 젖산-글리콜산과 같은 중합체는 100 일 이상 분자를 방출할 수 있지만, 특정 하이드로겔은 더 짧은 시간 동안 단백질을 방출한다.
본 발명에 따른 항체는 시료 중의 GITR (또는 이의 단백질 또는 이의 단백질 단편)의 존재를 검출하기 위한 물질로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 탐지가능한 라벨을 함유한다. 항체는 폴리클론, 또는 더욱 바람직하게는, 단일클론일 수 있다. 고유 항체, 또는 이의 단편 (가령, Fab, scFv, 또는 F(ab)2)이 이용될 수 있다. 프로브 또는 항체와 관련하여 용어 "라벨된(labeled)"은 프로브 또는 항체에 검출가능한 물질을 커플링 (가령, 물리적으로 연계)함으로써, 이 프로브 또는 항체의 직접 라벨링하는 것 뿐만 아니라, 직접적으로 라벨된 다른 시약과의 반응성에 의한 프로브 또는 항체를 간접적으로 라벨링하는 것을 포괄하는 의미다. 간접 라벨의 예는 형광-라벨된 2 차 항체를 사용한 1 차 항체의 검출 및 형광-라벨된 스트렙타비딘으로 검출할 수 있는 바이오틴으로 DNA 프로브의 말단-라벨링을 포함한다. "생물학적 시료"라는 용어는 대상으로부터 분리된 조직, 세포 및 생물학적 유체 뿐만 아니라 이 대상 내에 존재하는 조직, 세포 및 체액을 포함하도록 의도된다. 따라서 "생물학적 시료"라는 용어의 사용에는 혈액 및 혈청, 혈장 또는 림프액을 포함한 혈액의 분획 또는 성분이 포함된다. 즉, 본 발명의 검출 방법은 시험관내뿐만 아니라 생체내에서 생물학적 시료 중의 분석 대상 mRNA, 단백질, 또는 게놈 DNA를 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 분석물 mRNA를 검출하기 위한 시험관내 기술은 Northern 하이브리드화 및 원위치(in situ) 하이브리드화를 포함한다. 분석물 단백질의 검출을 위한 시험관내 기술은 효소 연계된 면역흡착 분석 (ELISAs), Western 블롯, 면역 침전 및 면역 형광을 포함한다. 분석물 게놈 DNA를 검출하기 위한 시험관내 기술은 Southern 하이브리드화를 포함한다. 면역분석을 시행하는 과정은 예를 들면, "ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; "Immunoassays", E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; 그리고 "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985에서 기술된다. 더욱이, 분석물 단백질의 검출을 위한 생체내 기술은 라벨된 항-분석물 단백질 항체를 대상에 도입하는 것을 포함한다. 예를 들면, 상기 항체는 표준 이미징 기술에 의해 대상에서 존재와 위치가 검출될 수 있는 방사성 표지로 라벨될 수 있다.
GITR 단백질 (또는 이의 단편)에 지향된 항체는 GITR 단백질의 국소화 및/또는 정량화와 관련된 당분야에 공지된 방법에 이용될 수 있는데 (가령, 적절한 생리학적 시료 안에 GITR 단백질의 수준을 측정하는 용도, 진단 방법에 사용, 단백질의 이미지화에 사용, 그리고 이와 유사한 용도). 주어진 구체예에서, GITR 단백질, 또는 항체 유래된 항원 결합 도메인을 함유하는이의 유도체, 단편, 유사체 또는 동사체에 특이적인 항체는 약리학적으로 활성인 화합물 (이하 "치료제(Therapeutics)"라 함)로서 이용된다.
본 발명의 GITR 단백질에 특이적인 항체는 면역친화력, 크로마토 그래피 또는 면역침전과 같은 표준 기술에 의해 GITR 폴리펩티드를 단리하는데 사용될 수 있다. GITR 단백질 (또는 이의 단편)에 대한 항체는 예를 들어, 주어진 치료법의 효능을 결정하기 위한 임상 시험 절차의 일부로써, 조직 내 단백질 수준을 모니터하기 위해 진단학적으로 사용될 수 있다. 항체를 검출가능한 물질에 커플링 (가령, 물리적으로 연계)시킴으로써 검출은 용이하게 실행될 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보철(prosthetic) 그룹, 형광 물질, 발광 물질, 생물 발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 적절한 효소의 예로는 양고추냉이 과산화효소, 알칼리 포스포타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하며; 적절한 보철 그룹의 예로는 스트렙타아비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 포함하고; 적절한 형광 물질의 예로는 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레신(fluorescein) 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트이아지닐아민 플루오레신, 단실 클로라이드 또는 피코에리틴을 포함하며; 발광 물질의 예로는 루미놀을 포함하고; 생물발광 물질의 예로는 루시퍼라제, 루시페린, 그리고 에쿠오린(aequorin)을 포함하고, 그리고 적절한 방사능 활성 물질의 예로는 125I, 131I, 35S, 또는 3H를 포함한다.
약제학적 조성물
본 발명의 항체 또는 물질 (본 명세서에서 "활성 화합물"로도 지칭함), 및 이의 유도체, 단편, 유사체 및 동사체는 투여에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 이러한 조성물은 전형적으로 항체 또는 물질 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 수용가능한 담제"는 임의의 그리고 모든 용액, 분산 배지, 코팅, 항균 및 항곰팡이 물질, 그리고 약제학적 투여에 양립되는 등장 및 흡수 지연 물질을 포함한다. 적합한 담체는 이 분야의 표준 참고 문헌인 Remington 's Pharmaceutical Sciences의 최신판에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 편입된다. 이러한 담체 또는 희석제의 바람직한 예는 물, 염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액 및 5 % 인간 혈청 알부민을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 리포좀 및 비-수성 비히클, 예컨대, 고정(fixed) 오일이 또한 사용될 수 있다. 약학적으로 활성인 물질용 이러한 매질 및 물질의 이용은 당업계에 공지되어 있다. 상기 활성 화합물과 양립할 수 없는 임의의 통상적인 매질 또는 물질을 제외하고, 상기 조성물에 사용이 고려된다. 보충 활성 화합물 또한 상기 조성물에 혼합될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 의도된 투여 경로와 양립할 수 있도록 제형화된다. 투여 경로의 예로는 비경구, 예컨대, 정맥내, 피내, 피하, 경구 (가령, 흡입), 경피 (즉, 국소), 점막 및 직장 투여가 포함된다. 비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 주사용수, 식염수, 고정 유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석제, 이를 테면, 주사용수, 염수, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균제, 이를 테면, 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 이를 테면, 아스코르브산 또는 중아황산 나트륨; 킬레이팅 물질, 이를 테면, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA); 완충제, 이를 테면, 아세테이트, 구연산 또는 인산염, 그리고 등장성 조절제, 이를 테면, 염화 나트륨 또는 덱스트로스. pH는 염산 또는 수산화 나트륨과 같은 산 또는 염기로 조절될 수 있다. 비경구제재는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰풀, 일회용 주사기 또는 다중 용량 바이알에 넣을 수 있다.
주사용으로 사용에 적합한 약제학적으로 수용가능한 운반체들은 멸균 수성 용액 또는 분산액과 멸균 주사용 용액 또는 분산의 임기 조제용 멸균 분말을 포함할 수 있다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리 염수, 정균수, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, N.J.) 또는 인산 완충된 염수 (PBS)를 포함한다.ㅤ 모든 경우에있어서, 조성물은 무균이어야하며, 주사의 용이성이 존재할 정도로 유동적이어야 한다. 그것은 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야 하며, 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다. 상기 운반체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올 (가령, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이와 유사한 것들), 그리고 이들의 적합한 혼합물들이 포함된 용매 또는 분산액 매질이 될 수 있다. 예를 들면, 피복제, 이를 테면 레시틴의 이용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 이용에 의해 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 아스크르빈산, 티메로졸 및 이와 유사한 것들과 같은 다양한 항박테리아 및 항진균제를 포함시킴으로써 확보될 수 있다. 많은 경우들에 있어서, 등장성 물질들, 예를 들면, 슈가, 다가알코올, 이를 테면 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨이 조성물에 포함되는 것이 바람직할 것이다. 흡수를 지연시키는 물질, 이를 테면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 물질이 조성물에 포함됨으로써 주사가능한 조성물의 연장된 흡수를 가져올 수 있다.
멸균 주사용 용액은 필요에 따라 활성 화합물을 적절한 용매에 상기 열거한 성분들 중 하나 또는 조합물과 혼합하고, 이어서 여과 멸균함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 무균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 활성 성분의 분말과 미리 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 추가의 원하는 성분을 생성하는 진공 건조 및 동결-건조이다.
구강 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐에 포집시키거나 압축하여 정제로 만들수 있다. 구강 치료학적 투여를 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입될 수 있고 테블릿, 트로키제(troches) 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강 세척제로서 사용하기 위해 유체 담체를 사용하여 제조될 수 있으며, 이때 유체 담체 내의 화합물은 경구로 제공되고, 휙 소리를 내면서 움직이고, 그리고 뱉아내거나 삼킨다. 약학적으로 양립가능한 결합제 및/또는 어쥬번트 물질은 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 테블릿, 알약, 캡슐제, 트로키제 및 이와 유사한 것 등은 다음의 성분 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제, 이를 테면, 미소결정 셀룰로오스, 검 트라가탄 또는 젤라틴; 부형제, 이를 테면, 전분 또는 락토즈, 분해제, 이를 테면, 알긴산, 프리모겔(Primogel), 또는 옥수수 전분; 윤활제, 이를 테면, 스테아레이트 마그네슘 또는 스테로테스(Sterotes); 활택제, 이를 테면, 콜로이드성 이산화실리콘; 감미제, 이를 테면, 설탕 또는 사카린; 또는 풍미제, 이를 테면, 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지 풍미.
흡입 투여 용으로, 상기 화합물은 적절한 추진체, 예를 들어 이산화탄소와 같은 가스를 함유하는 압력 용기 또는 디스펜서, 또는 네불라이져(nebulizer)로부터의 에어로졸 분무 형태로 전달된다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단일 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 침투되는 장벽에 적합한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 당업계에 일반적으로 공지되어 있으며, 예를 들어, 점막 투여용으로, 세제, 담즙 염 및 푸시딘산(fusidic acid) 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌약의 사용을 통해 수행될 수 있다. 경피 투여를 위해, 활성 화합물은 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이 연고, 살베(salves), 겔 또는 크림으로 제형화된다.
이들 화합물은 좌제 형태 (가령, 코코아 버터 및 기타 글리세리드와 같은 통상적인 좌약 기제로) 또는 직장 전달용 정체 관장(retention enemas)으로 제조될 수도 있다.
한 구체예에서, 상기 활성 화합물들은 화합물이 신체로부터 신속하게 제거되는 것으로부터 이 화화합물을 보호하는 운반체와 함께 만들어질 수 있는데, 이를 테면 임플란트 및 미소포집 운반시스템이 포함된 방출 제어 제형이 된다. 생분해가능한, 생체적합성 폴리머, 이를 테면 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드리드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르소에스테르, 및 폴리락트산이 이용될 수 있다. 이러한 제재를 준비하는 방법은 당업계 숙련자들에게 잘 알려져 있을 것이다. 이 물질은 또한 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.로부터 상업적으로 입수할 수 있다. (바이러스성 항원에 대한 단일클론 항체로 감염된 세포를 표적으로하는 리포솜을 포함하는) 리포좀 현탁액을 또한 약학적으로 허용가능한 담체로 사용할 수 있다. 이들은 예를 들어, 미국 특허 번호 4,522,811에 기재된 바와 같이 당업자에게 공지 된 방법에 따라 제조될 수 있다.
투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투약 단위 형태로 경구 또는 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 바람직하다. 본 원에 사용된 투여 단위 형태는 치료하고자 하는 대상에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된(discrete) 단위를 의미하고; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 사전결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 명세는 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성 될 특정 치료 효과 및 그리고 개인의 치료를 위한 이러한 활성 화합물을 배합하는 분야에 고유한 제한 사항에 따라 좌우된다.
상기 약제학적 조성물은 투여 지침과 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
진단학적 분석
huGITR 항체는 예를 들어, 주어진 치료 및/또는 예방 요법의 효능을 결정하기 위한 임상 시험 절차의 일부로서, 면역 세포 질환 (가령, CLL)의 발달 또는 진행을 모니터하기 위해 진단 학적으로 사용될 수 있다.
일부 양태들에서, 진단 목적을 위해, 본 발명의 huGITR 항체는 검출 가능한 모이어티에 연결되어, 암 또는 만성 감염을 앓고 있는 대상에서 T 세포 고갈을 검출하는 방법을 제공한다.
검출 가능한 모이어티는 항체 또는 단편에 직접적으로 접합되거나, 또는 간접적으로 예를 들어, 형광 2 차 항체를 사용하여 접합될 수 있다. 직접 접합은 상기 항체 또는 항체 단편에 예를 들어, 형광단(fluorophore)의 표준 화학 결합, 또는 유전 공학을 통해 수행할 수 있다. 형광 또는 생물 발광 단백질에 결합된 항체 또는 항체 단편을 함유하는 키메라 또는 융합 단백질을 작제할 수 있다. 예를 들면, Casadei, 외는 포유 동물 세포에서 에쿠오린과 항체 유전자의 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터 구조체를 제조하는 방법을 기술하고 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 프로브 또는 항체와 관련하여 용어 "라벨된(labeled)"은 프로브 또는 항체에 검출가능한 물질을 커플링 (가령, 물리적으로 연계)함으로써, 이 프로브 또는 항체의 직접 라벨링하는 것 뿐만 아니라, 직접적으로 라벨된 다른 시약과의 반응성에 의한 프로브 또는 항체를 간접적으로 라벨링하는 것을 포괄하는 의미다. 간접 라벨의 예는 형광-라벨된 2 차 항체를 사용한 1 차 항체의 검출 및 형광-라벨된 스트렙타비딘으로 검출할 수 있는 바이오틴으로 DNA 프로브의 말단-라벨링을 포함한다. "생물학적 시료"라는 용어는 대상으로부터 분리된 조직(가령, 생검), 세포 및 생물학적 유체 뿐만 아니라 이 대상 내에 존재하는 조직, 세포 및 체액을 포함하도록 의도된다. 즉, 본 발명의 검출 방법은 시험관내뿐만 아니라 생체내에서 생물학적 시료 중에서 GITR를 발현시키는 세포를 검출하는데 사용될 수 있다. GITR의 검출을 위한 시험관내 기술은 효소 연계된 면역흡착 분석 (ELISA), Western 블롯, 면역 침전 및 면역 형광을 포함한다. 더욱이, GITR의 검출을 위한 생체내 기술은 라벨된 항-GITR 항체를 대상에 도입하는 것을 포함한다. 예를 들면, 상기 항체는 표준 이미징 기술에 의해 대상에서 존재와 위치가 검출될 수 있는 방사성 표지로 라벨될 수 있다. "표적화된" 콘쥬게이트의 경우, 즉, 표적화 모이어티-대상 또는 동물 안에 특정 부위 또는 부위들에 이 콘쥬게이트를 국소화시킬 수 있도록 기획된 분자 또는 특징-를 함유하는 접합체-의 경우, 국소화란 해당 대상내에서 결합된, "국소화된" 것과 결합안된, "유리(free)" 엔터티 간에 평형이 기본적으로 이루어진 상태를 말한다. 그러한 평형이 달성되는 속도는 투여 경로에 따라 달라진다. 예를 들면, 혈전을 국소화시키기 위해 정맥내 주사에 의해 투여된 콘쥬게이트는 주사 후 몇 분 이내에 국소화를 이루거나, 또는 혈전에서의 축적을 달성할 수 있다. 반면에, 장내에서 감염을 국소화하기 위해, 경구 투여된 콘쥬게이트는 국소화를 달성하는데 몇 시간이 걸릴 수 있다. 대안으로, 국소화는 엔터티(entity)가 투여된 후, 선택된 시간에서 대상 또는 동물 안에 상기 엔터티의 위치를 단순히 지칭할 수도 있다. 또다른 예로서, 국소화는 모이어티가 투여 후에 분포될 때 국소화가 달성된다.
상기 모든 경우에, 국소화를 달성하기 위한 시간의 합리적인 추정은 당업자에 의해 이루어질 수 있다. 더욱이, 시간의 함수로서, 국소화 상태는 광검출기 장치로 본 발명의 방법에 따라 검출가능한 모이어티 (예를 들어, 발광 콘쥬게이트)을 영상화함으로써 이어질 수 있다. 사용된 "광 검출기 장치(photodetector device)"는 적당한 시간 내에 포유 동물 내에서 희미한 빛을 이미징할 수있고, 그러한 장치에서 이 신호를 사용하여 이미지를 구축할 수 있도록 충분히 높은 감도를 가져야 한다.
매우 밝은 광 생성 부분을 사용할 수 있는 경우, 및/또는 이미지화되는 대상 또는 동물의 표면 근처에 위치하는 광-생성 융합 단백질을 검출할 수 있는 경우, 한 쌍의 "야간-투시경(night-vision)" 고글 또는 예를 들어, Silicon Intensified Tube (SIT) 카메라(가령, Hammamatsu Photonic Systems, Bridgewater, N.J.)와 같은 표준 고-감도 비디오 카메라가 사용될 수 있다. 그러나, 보다 일반적으로, 보다 민감한 광 검출 방법이 요구된다.
극단적으로 낮은 광 레벨에서, 단위 면적당 광자 플럭스는 너무 낮아, 이미지화된 장면이 더 이상 연속적으로 나타나지 않는다. 대신, 그것은 시간적으로나 공간적으로 서로 구별되는 개별적인 광자에 의해 표현된다. 모니터에서 볼 때, 이러한 이미지는 빛의 섬광 지점으로 나타나며, 각각은 감지된 단일 광자를 나타난다. 이러한 검출 된 광자를 시간 경과에 따라 디지털 이미지 프로세서에 축적함으로써, 이미지가 획득되고 구축될 수 있다. 각 이미지 포인트의 신호에 강도 값이 할당된 기존 카메라와 달리, 광자 계수 이미징에서는 신호의 진폭이 중요하지 않다. 대물렌즈(objective)는 단순히 신호 (광자)의 존재를 감지하고, 시간의 경과에 따라 그 위치와 관련하여 신호의 발생을 계산하는 것이다.
아래에서 설명되는 적어도 두 가지 유형의 광 검출기 장치는 개별 광자를 검출하고, 이미지 프로세서가 분석할 수 있는 신호를 생성 할 수 있다. 감소된-노이즈 광 검출기는 광자 신호를 증폭하는 것과는 반대로, 광자 검출기의 배경 노이즈를 줄임으로써 감도를 얻는다. 검출기 어레이를 냉각하면, 노이즈가 주로 감소된다. 이 장치에는 "역박막화된(backthinned)", 냉각 CCD 카메라라고 하는 전하 결합 장치 (CCD) 카메라가 포함된다. 보다 민감한 장비에서, 냉각은 예를 들어, 액체 질소를 사용하여 이루어지므로, CCD 어레이의 온도는 약 -120℃가 된다. "역박막화된(backthinned)"이란 광자가 검출되는 경로 길이를 줄이고, 이로 인하여 양자 효율을 높이는 초-박형 백플레이트(ultra-thin backplate)를 의미한다. 특히 민감한 역박막화된 극저온 CCD 카메라는 Photometrics, Ltd.(Tucson, Ariz.)에서 제공하는 시리즈 200 카메라인 "TECH 512"이다.
"광자 증폭 장치(photon amplification devices)"는 탐지 화면에 도달하기 전에 광자를 증폭시킨다. 이 클래스에는 마이크로 채널 강화장치와 같은 강화 장치가 있는 CCD 카메라가 포함된다. 마이크로채널 강화장치는 전형적으로 카메라의 검출 스크린에 수직이며, 동일한 시간대에 있는(co-extensive) 금속 어레이 채널을 포함한다. 마이크로채널 어레이는 이미지화될 시료, 대상 또는 동물과 카메라 사이에 배치된다. 어레이의 채널로 들어가는 대부분의 광자는 나가기 전에 채널의 한쪽에 접촉한다. 어레이에 제공되는 전압은 각 광자 충돌로부터 많은 전자를 방출시킨다. 이러한 충돌로부터의 전자는 "샷건(shotgun)" 패턴으로 원점 채널을 빠져 나와, 카메라로 감지된다.
강화된 마이크로채널 어레이를 연속적으로 배치함으로써 감도를 더욱 향상시킬 수 있고, 차례로 제 1 스테이지에서 생성된 전자는 제 2 스테이지에서 증폭된 전자 신호를 생성한다. 그러나, 감도의 증가는 공간 해리의 댓가로 달성되며, 이는 증폭의 각 추가 단계마다 감소된다. 대표적인 마이크로채널 강화장치-기반 단일-광자 검출 장치는 Hamamatsu에서 시판중인 C2400 시리즈이다.
이미지 프로세서는 예를 들어, 모니터 상에 표시되거나, 또는 비디오 프린터 상에 인쇄될 수 있는 이미지를 구축하기 위해 광자를 카운트하는 광 검출기 장치에 의해 생성된 신호를 처리한다. 이러한 이미지 프로세서는 전형적으로 전술한 민감한 광자-카운팅 카메라를 포함하는 시스템의 일부로서 판매되며, 따라서 동일한 소스로부터 이용 가능하다. 이미지 프로세서는 대개 구매한 이미징 시스템의 일부로 포함되거나 또는 포함되지 않을 수 있는, IBM-호환 PC 또는 Apple Macintosh (Apple Computer, Cupertino, Calif.)와 같은 개인용 컴퓨터에 연결된다. 이미지가 디지털 파일 형태로 되면, 다양한 이미지 처리 프로그램 (이를 테면, "ADOBE PHOTOSHOP", Adobe Systems, Adobe Systems, Mt. View, Calif.)에서 조작하여 인쇄할 수 있다.
한 구체예에서, 생물학적 샘플은 시험 대상으로부터의 단백질 분자를 함유한다. 하나의 바람직한 생물학적 샘플은 대상으로부터 통상적인 수단에 의해 분리된 말초 혈액 백혈구 시료다.
본 발명은 또한 생물학적 시료에서 GITR 또는 GITR-발현시키는 세포의 존재를 검출하기 위한 키트를 포함한다. 예를 들면, 상기 키트는 다음을 포함한다: 생물학적 시료 안에 암 또는 종양 세포를 탐지할 수 있는 라벨된 화합물 또는 물질 (가령, 항-GITR scFv 또는 단일클론 항체); 시료 안에 GITR의 양을 측정하는 수단; 그리고 시료 안에 있는 GITR의 양을 표준과 비교하는 수단. 표준은 일부 구체예에서 비-암 세포 또는 이의 세포 추출물이다. 화합물 또는 물질는 적합한 용기에 포장될 수 있다. 상기 키트는 시료에서 암을 검출하기 위해 키트 사용 지침서를 추가로 포함할 수 있다.
이중-특이적 항체
이중-특이적 항체(bsAb)는 2 개의 가변 도메인 또는 scFv 유닛을 포함하는 항체로서, 결과적인 항체는 2 개의 상이한 항원을 인식한다. 본 발명은 GITR 및 제 2 항원을 인식하는 이중-특이적 항체를 제공한다. 예시적인 제 2 항원은 종양 연합된 항원, 사이토킨 및 세포 표면 수용체를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 제 2 항원은 CAIX (탄산 탈수소효소 IX, 또는 G250), IL-10 또는 CCR4일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 제 2 항원은 세포 표면 수용체이며, 이때 상기 세포 표면 수용체는 PD-1, PDL1, CCR4, IL21R, BTLA, HVEM 또는 TIM3이다. 본 발명의 이중-특이적 항체는 본 명세서에서 개시하고 있는 huGITR 항체의 중쇄와 경쇄 조합 또는 scFv을 포함한다.
이중-특이적 항체의 구축
이중-특이적 본 발명의 항체는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 구축될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 이중-특이적 항체는 단일 폴리펩티드이며, 이때 2개의 scFv 단편은 항체를 만들기 위하여 2개의 scFv 단위 사이에 분자내 연합을 허용하는 충분한 길이의 긴 링커 폴리펩티드에 의해 결합된다. 다른 구체예에서, 상기 이중-특이적 항체는 공유 또는 비-공유 결합에 의해 연계된 하나 이상의 폴리펩티드다.
또다른 구체예에서, 상기 이중-특이적 항체는 "노브 인투 홀(knob into hole)" 방법 (Ridgway 외, Protein Eng 7:617-621 (1996))을 이용하여 구축된다. 이 방법에서, 중쇄-경쇄 페어링이 유지되는 동안, 2개의 상이한 가변 도메인의 Ig 중쇄는 환원되어 중쇄 페어링을 선택적으로 파괴한다. 2 개의 상이한 항원을 인식하는 2 개의 중쇄-경쇄 이형이량체는 혼합되어, 이형결찰 페어링 형성을 촉진시키며, 이는 CH3 도메인의 조작된 "노브 인투 홀(knob into hole)"을 통해 중재된다.
또다른 구체예에서, 하이브리드 항체를 생성하기 위하여, 상기 이중-특이적 항체는 두 개 또는 그 이상의 상이한 항체로부터 중쇄-경쇄 이량체를 교환을 통하여 작제되고, 이때 하이브리드 항체는 제 1 중쇄-경쇄 이량체는 GITR을 인지하고, 제 2 중쇄-경쇄 이량체는 제 2 항원을 인지한다. 중쇄-경쇄 이량체의 기전은 인간 IgG4 형성과 유사한데, 이는 이중특이적 분자로 또한 기능을 한다. IgG 중쇄의 이량체화는 각 중쇄 및 디설파이드 다리의 CH3 도메인을 페어링과 같은 분자내 힘에 의해 유도된다. CH3 도메인 (R409)에서 특정 아미노산의 존재는 IgG4 분자의 이량체 교환 및 구축을 촉진시키는 것으로 나타났다. 중쇄 페어링(pairing)은 또한 항체의 힌지(hinge) 영역에서 중쇄사슬간(interheavy chain)의 디설파이드 다리에 의해 더욱 안정화된다. 특히, IgG4에서 힌지 영역은 아미노산 226-230에서 아미노산 서열 Cys-Pro-Ser-Cys (서열 Cys-Pro-Pro-Cys를 함유하는 안정한 IgG1 힌지 영역과 비교하여)를 함유한다. 위치 229에서 세린의 서열 차이는 IgG4가 힌지 영역에서 신규한 쇄내(intrachain) 디술파이드를 형성하는 경향과 관련이 있다 (Van der Neut Kolfschoten, M. 외, 2007, Science 317:1554-1557 및 Labrijn, A.F. 외, 2011, Journal of immunol 187:3238-3246).
따라서, 본 발명의 이중-특이적 항체는 CH3 도메인에서 R409 잔기 및 GITR 또는 제 2 항원을 인식하는 항체의 힌지 부위에서의 Cys-Pro-Ser-Cys 서열의 도입을 통해 생성되어, 중쇄-경쇄 이량 체가 교환되어 GITR을 인식하는 하나의 중쇄-경쇄 이량체와 제 2 항원을 인식하는 제 2 중쇄-경쇄 이량체를 갖는 항체 분자를 생산되고, 이때 제 2 항원은 본 명세서에서 공개된 임의의 항원이다. 알려진 IgG4 분자는 본 명세서에 개시된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄가 GITR 또는 제 2 항원을 인식하도록 또한 변형될 수 있다. 상기 본 발명의 이중-특이적 항 체를 작제하는 이 방법을 사용하면, IgG4 분자의 본질적인 특징으로 인해 유익할 수 있으며, 이때 Fc 영역은 면역 반응의 작동체 시스템, 이를 테면, 특정 백혈구에 의해 발현되는 보체 및 Fc 수용체와 같은 수용체와 상호작용을 잘 하지 못한다는 점에서 다른 IgG 아형과 다르다. 이러한 특유의 특성으로 인하여 이들 IgG4-기반의 이중 특이적 항체가 치료적 용도로 매력적이며, 이때 상기 항체는 표적 (들)에 결합해야 하고, 표적(들)과 관련된 신호 전달 경로를 기능적으로 변경시키지만, 작동체 활성을 촉발시키지는 않아야 한다.
일부 구체예에서, bsAb의 항체 의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 활성이 변경되도록 bsAb의 불변 영역에 돌연변이가 도입된다. 예를 들면, 돌연변이는 CH2 도메인에서 LALA 돌연변이다. 하나의 양태에서, bsAb는 ADCC 활성을 감소시키는, 이형이량체 bsAb의 하나의 scFv 단위 상에 돌연변이를 포함한다. 또다른 양태에서, 상기 bsAb는 이형이량체 bsAb의 두 쇄 모두에 돌연변이를 포함하는데, 이로써 ADCC 활성은 완전하게 제거된다. 예를 들면, bsAb의 하나 또는 양쪽 scFv 단위 상에 도입된 돌연변이는 CH2 도메인에서의 LALA 돌연변이다. 가변 ADCC 활성을 갖는 이들 bsAbs는 bsAbs가 이 bsAb에 의해 인식되는 하나의 항원을 발현하는 세포에 대하여 최대 선택성 살상을 발휘내지만, 그러나, 이 bsAb에 의해 인식되는 두 번째 항원에 대해서는 최소 살상을 발휘하도록 최적화될 수 있다.
본원에 개시된 이중-특이적 항체는 질환 또는 의학적 상태, 예를 들어, 암의 치료에 유용할 수 있다. 본 발명의 이중 특이적 항체는 증가된 Tregs와 관련된 질환 또는 의학적 상태에서 특히 유용할 수 있다. I
치료 방법
본 발명은 암의 위험이 있는 (또는 걸릴 가능성이 있는) 대상 또는 다른 세포 증식-관련 질환 또는 장애를 치료하는 예방적 및 치료 적 방법을 제공한다. 이러한 질병 또는 장애는 예를 들어, GITR의 이상 발현과 관련된 질환 또는 장애를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 상기 방법은 증상 암을 치료, 예방 또는 경감시키는데 사용된다. 대안으로, 상기 방법은 GITR이 T 세포 반응에서 음성 조절 역할을 하는 암의 증상을 치료, 예방 또는 완화시키는데 사용된다. 대안으로, 상기 방법은 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 피부암, 간암, 췌장암 또는 위암과 같은 고형 종양의 증상을 치료, 예방 또는 완화시키는데 사용된다. 추가적으로, 본 발명의 방법들은 백혈병 및 림프종과 같은 혈액 암을 치료하는데 사용된다. 대안으로, 상기 방법은 전이된 증상 암을 치료, 예방 또는 경감시키는데 사용된다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 단일클론 항체, 본 발명의 scFv 항체 또는 본 발명의 이중-특이적 항체를 대상에게 투여함으로써 대상의 증상 암 또는 세포 증식성 질환 또는 장애를 예방, 치료 또는 경감시키는 방법을 제공한다. 예를 들면, huGITR 항체는 치료 유효량으로 투여될 수 있다.
암 또는 세포 증식과 관련된 질병 또는 장애의 위험이 있는 대상에는 암 가족력이 있는 환자, 또는 공지의 또는 의심가는 암 유발 인자에 노출된 대상이 포함된다. 예방적 약제의 투여는 이 질환을 방지하거나, 또는 대안으로 이의 진행을 지연시키기 위하여 암이 현시되기 전에 실시될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 GITR 항체와 세포를 접촉시킴으로써, 종양 세포 성장이 억제되거나, Treg 활성이 감소되거나, Teff 활성이 증가되거나, 또는 NK-세포 세포독성이 증가된다. 상기 세포는 GITR을 나타내는 모든 세포가 된다. 예를 들면, 상기 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다.
또한, 항원에 대한 면역 반응을 증가시키거나 또는 강화시키는 방법이 본 발명에 포함된다. 면역 반응은 본 발명의 단일클론 항체 또는 scFv 항체를 대상에게 투여함으로써 증가되거나 또는 강화된다. 면역 반응은 예를 들어, 항원 특이적 T 작동체 기능을 증가시킴으로써 증가된다. 상기 항원은 바이러스 (가령, HIV), 박테리아, 기생충 또는 종양 항원이다. 면역 반응은 자연적인 면역 반응이다 자연 면역 반응은 감염의 결과인 면역 반응을 의미한다. 상기 감염은 만성 감염이다. 항원에 대한 면역 반응의 증가 또는 증진은 당업계에 공지된 다수의 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 면역 반응은 다음 중 하나를 측정하여 측정할 수 있다: T 세포 활성, T 세포 증식, T 세포 활성화, 작동체 사이토킨 생성 및 T 세포 전사 프로파일을 포함한다.
대안으로, 면역 반응은 예방 접종으로 인한 반응이다. 따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 단일클론 항체 또는 scFv 항체 및 백신을 대상에 투여함으로써 백신 효율을 증가시키는 방법을 제공한다. 항체 및 백신은 연속적으로 또는 동시에 투여된다. 백신은 종양 백신, 박테리아 백신 또는 바이러스 백신이다.
복합적 방법
본 발명은 GITR 단백질의 동일한 에피토프 또는 대안으로 GITR 단백질의 2 개의 상이한 에피토프에 결합하는 2 가지 항체를 투여함으로써, 환자에서 암을 치료하는 것을 제공한다. 대안으로, 암은 GITR에 결합하는 제 1 항체 및 GITR 이외의 단백질에 결합하는 제 2 항체를 투여함으로써 치료된다. 예를 들면, GITR이외의 다른 단백질은 PD-1, PD-L1, CAIX, CCR4 및 IL-10을 포함할 수 있지만, 이에 국한되지 않는다. 예를 들면, GITR이외의 다른 단백질은 종양-연합된 항원이다.
일부 구체예에서, 본 발명은 huGITR 항체 단독, 또는 GITR 이외의 다른 단백질을 인식하는 추가의 항체와 함께, 면역 반응을 수행하거나 증강시킬 수 있는 세포와 함께 투여하는 것을 제공한다. 예를 들면, 이들 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 또는 PBMC에서 발견되는 임의의 세포 유형, 예를 들어, 세포 독성 T 세포, 대식세포 및 자연 살해 세포 (NK)일 수 있다.
추가적으로, 본 발명은 GITR 단백질 그리고 항-신생물제, 예컨대 소분자, 성장 인자, 사이토킨 또는 이를 테면, 펩티드, 펩티드 유사체, 펩토이드, 폴리뉴클레오티드, 지질-유래 매개체 및 프로테아제와 같은 생체 분자를 포함하는 기타 치료제에 결합하는 항체의 투여를 제공한다. 소분자는 무기 분자 및 소형 유기 분자를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 적합한 성장 인자 또는 사이토킨은 IL-2, GM-CSF, IL-12, 그리고 TNF-알파를 포함한다. 소분자 라이브러리는 당분야에 공지된다. (Lam, Anticancer Drug Des., 12:145, 1997. 참고)
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 기술될 것이지만, 청구 범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예들
실시예 1: 항-GITR 항체의 단리 여기에는 13개의 항-GITR 단일 클론 항체의 단리가 기재되어 있다. hGITR-mlg로 패닝은 Mehta I/II 파아지 디스플레이 라이브러리를 사용하여, 상이한 항원 농도 및 세척 조건으로 3 회 수행하였다. mGITR-his로 패닝은 상이한 항원 농도 및 세척 조건으로 2 회 수행하였다. ELISA 분석을 수행하여 2ug/ml의 hGITR-mlgG2a 또는 mGITR-His으로 라운드 2 및 3으로부터 단일 클론을 스크리닝하였다. ELISA 양성 클론을 서열분석하고, 도 1에 기재된 바와 같은 음성 대조군을 포함하는 두 번째 ELISA 분석으로 확인하였다. 43 개의 독특한 클론이 확인되었다.
클론은 2 가지 상이한 농도의 hGITR-mIgG2a 항원 및 4 가지 상이한 농도의 PEG 정제된 항-GITR 파아지-AB에서 MSD (중간 규모 발견 시스템)를 사용하여, hGITR에 대한 결합에 대해 추가로 시험하였다(도 2). 두 번째 실험은 8 가지 농도의 hGITR-mlg 및 일정 수의 PEG 정제 된 항-GITR 파아지-AB를 사용하여 실행되었다 (도 3).
실시예 2: H GITR 및 M GITR 패닝으로부터 ELISA 양성 및 FACS 양성 클론의 특징화
초기 ELISA 및 hGITR-mlg 패닝을 이용한 FACS 스크리닝 후, 총 29 개의 독특한 클론이 확인되었다. ELISA 분석 후, 이들 클론 중 10 개는 항-hGITR에 결합하지만, hGITR-His에는 결합하지 않는 것으로 확인되었다. 이들 클론 중 19 개는 hGITR-mlg와 His를 모두 결합하였으며, 그 중 4 개는 약한 결합 효율을 보였다. 15 개의 클론은 FACS 분석에서 양성이었고, 3 개는 다른 것보다 약한 결합을 가졌다. 두 라운드의 mGITR-His 패닝 후에, 6 개의 총 ELISA 독특한 양성 클론이 또한 있었다. 이들 클론 중 4 개는 항-mGITR-His에만 결합하고, 2 개는 mGITR-His 및 hGITR-his에 결합하였다. 하나의 scFV는 mGITR에 대해 선택되었지만, hGITR-mlg 및-His와 강력하게 반응한다.
실시예 3: 항-GITR 항체의 특징화
항-GITR의 결합을 네 가지 상이한 농도의 항-GITR 파아지-AB를 사용하여 시험하였다. 또한, GITR 또는 CA9를 발현하는 안정한 CHO 세포를 항-GITR 항체 결합에 대해 시험하였다. GITR 결합을 분석하기 위해, FACS 분석을 사용하여 FITC 양성 CHO 세포의 백분율을 도 4에 나타낸다. 제 3의 FACS GITR 결합 분석을 단일 콜로니로부터의 파아지 상청액으로 단일 농도를 사용하여 수행하였다(도 5). 이 분석에서 CA9를 발현하는 CHO 세포가 아닌, GITR을 발현하는 CHO 세포에 결합된 항-GITR 항체가 드러났다. 단일 콜로니로부터 단일 농도의 파아지 상청액을 사용하여 추가의 ELISA 분석을 위해 GITR 결합에 대해 양성인 것을 선택하였다 (도 6). 유동세포측정 및 ELISA에서 모두 양성이었던 선택된 항-GITR 항체의 최종 목록은 도 7에 나와 있다.
실시예 4: IGG1-FC(LALA) 돌연변이체 형태 및 IGG4 형태에서 항-GITR MAB의 구축 및 발현
우리가 새로 발견한 항-GITR 파아지 scFv 항체의 VH 및 VL 단편은 IgG1 Fc (LALA) 돌연변이 형태 또는 IgG4 형태에서 발현되는 포유류 발현 벡터 TCAE로 PCR 클론시켰고, 이들 두 형태는 모두 ADCC 활성이 감소되거나, 또는 최소이다. 293F 세포의 시험관내 형질감염시, 세포 상청액을 수확하고, IgG 농도를 인간 IgG 정량 분석에 의해 정량하였다. 이어서, 상청액을 사용하여 유동세포측정법을 사용하여, GITR (+) CHO 세포에 대한 이들 IgG mAbs의 GITR 결합 활성을 시험하였다. 도 8-10에 제공된 결과는 대부분의 항-GITR 항체가 IgG 형태로 전환 시에 그들의 GITR 결합 활성을 유지함을 입증한다.
실시예 5: GITR 리간드와 항-GITR 항체 사이의 결합 경쟁
새로 발견된 항-GITR 항체의 특성을 더욱 밝히기 위해, 증가된 양의 정제된 항-GITR E1-3H7 IgG4 또는 TT1-3C6 IgG4와 일정 농도의 GITR 리간드를 유동세포측정으로 각각 수행하여, 경쟁 결합 분석을 수행하였다. 도 11은 항-GITR 항체의 양(PE-라벨된 마우스 항-인간 항체에 의해 검출됨,을 증가시킴으로써 GITR 리간드의 결합이 감소함(Alexa 488 라벨된 항-HA-태그에 의해 검출됨)을 보여주는데, 다소 그 정도는 적지만, 상업용 GTI10 항체와 공유되는 특징이다. NF-κB-luc2P/GITR Jurkat 수용체 세포는 항-GITR E1-3H7 IgG4 또는 TT1-3C6 IgG4 항체의 농도를 증가시키면서, 동시에 GITR 리간드의 농도는 일정하게 하여 배양할 때, 루시퍼라제 활성은 리간드 또는 항-GITR 항체 단독으로 항온 배양한 경우보다 높은 수준으로 증가하였고, 이는 상업용 GTI10 항체와 공유되지 않는 특징이다(도 12). 이들 결과는 항-GITR E1-3H7 IgG4 또는 TT1-3C6은 GloResponseTM NF-κB-luc2P/GITR Jurkat 세포(Promega)에서 GITR 리간드 유도된 루시퍼라제 발현을 공조적으로 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
기타 구체예들
본 발명이 그의 상세한 설명과 관련하여 설명되었지만, 전술 한 설명은 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하지 않으며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항의 범위에 의해 특정된다. 다른 양태들, 장점들 및 수정들은 다음 청구 범위의 범주 내에 있다:
SEQUENCE LISTING <110> DANA-FARBER CANCER INSTITUTE, INC. <120> GLUCOCORTICOID-INDUCED TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR (GITR) ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF <130> 5031461-40-KR1 <140> <141> <150> PCT/US2017/043504 <151> 2017-07-24 <150> 62/375,634 <151> 2016-08-16 <150> 62/365,712 <151> 2016-07-22 <160> 122 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 364 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaagt cttagttgga atactggtcg agtagcctat 180 gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ttccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag acctgaggac acggccttct attactgtgc aaaaggctcc 300 gcccttggct tagttggctg gttcgacgcc tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc 360 tcag 364 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Leu Ser Trp Asn Thr Gly Arg Val Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Ser Ala Leu Gly Leu Val Gly Trp Phe Asp Ala Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 322 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tcttctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60 acatgccaag gagacagtct cagaacctat tatggaagtt ggtaccagca gaagccagga 120 caggcccctc tacttgtctt ctatggcaaa gagagtcggc cctcagggat cccagaccga 180 ttctctggct ccacctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240 gatgaggctg actattactg taactcccag gacagcagtg gtgacttatt attcggcgga 300 gggaccaagc tgaccgtcct ag 322 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Thr Tyr Tyr Gly 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val Phe Tyr 35 40 45 Gly Lys Glu Ser Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Thr Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Gln Asp Ser Ser Gly Asp Leu 85 90 95 Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 5 <211> 352 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 caggtgcagc tggtgcaatc tgggggaggc ttggtccagt ctgggaagtc cgtgagactc 60 tcttgtgcag cctctggatt cacatttggt gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120 ccaggaaagg gcctggagtg ggtcgcaggc attactagga atagtggtcg catagcctat 180 gcggactttg tgaagggccg attcatcatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagcgaaatg 300 actggggctt atgatatttg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc ag 352 <210> 6 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Lys 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Thr Arg Asn Ser Gly Arg Ile Ala Tyr Ala Asp Phe Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Glu Met Thr Gly Ala Tyr Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 325 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 tcttctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60 acatgccaag gagacggcct cagatactat tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120 caggccccta tacttgtcct ctttggtaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga 180 ttctctggct ccagctcagg aaatacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240 gatgaggctg actattactg taactcgcgg gacagcagtg gtaaccatcg attcttcgga 300 actgggacca aggtcaccgt cctaa 325 <210> 8 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Gly Leu Arg Tyr Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Leu Phe 35 40 45 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His 85 90 95 Arg Phe Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 9 <211> 361 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagcaa taaatactac 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtat attactgtgc gaaagaggat 300 tactatgata gtagtggttc gaactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 g 361 <210> 10 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Asp Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Ser Asn Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 331 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 ctgcctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaattatg tatactggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcacctat aggaatgatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta tttctgttca gcttgggatg acagcctggg tggcgaggtc 300 ttcggaactg ggaccaaggt caacgtccta g 331 <210> 12 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Thr Tyr Arg Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Gly Gly Glu Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Asn Val Leu 100 105 110 <210> 13 <211> 355 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agccatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaatcggt 300 acggcggatg cttttgatat ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcag 355 <210> 14 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ile Gly Thr Ala Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 331 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 cagtctgccc tgactcagcc accctcagtg tctgggaccc ccggacagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaggcgtccc caacatcgga agtaatcctg taaactggta cctccaccgc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat aatagcaatc agtggccctc aggggtccct 180 gaccgatttt ctggctccag gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240 tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgga tggtctggtt 300 ttcggcggag ggaccaagtt gaccgtccta g 331 <210> 16 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Val Pro Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Pro Val Asn Trp Tyr Leu His Arg Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Ser Asn Gln Trp Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asp Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 17 <211> 373 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc tagagaaaaa 300 agcagcagct ggtacggggg ggacaactgg ttcgacccct ggggccaggg caccctggtc 360 accgtctcct cag 373 <210> 18 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Lys Ser Ser Ser Trp Tyr Gly Gly Asp Asn Trp Phe Asp 100 105 110 Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 331 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 cagtctgccc tgactcagcc tcgctcagtg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60 tcctgcactg gaagcagcag tgatgttggt ggttatcatt atgtctcctg gtaccaacaa 120 tacccaggca aagtccccaa actgatgatt tatgatgtct ctaggcggcc ctcaggggtt 180 tctgatcgct tctctggctc caagtctggc agcacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caagcagcag cactgtggtc 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta c 331 <210> 20 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 His Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Arg Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 21 <211> 390 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 caggtgcagc tggtgcaatc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180 gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240 atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagatgta 300 caccccttag atatagcagt ggctgccgac gattactact actacggtat ggacgtctgg 360 ggccaaggca ccctggtcac cgtctcctca 390 <210> 22 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Val His Pro Leu Asp Ile Ala Val Ala Ala Asp Asp Tyr 100 105 110 Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 23 <211> 325 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 tcttctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60 acatgccaag gagacagcct cacaaccaat tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120 caggcccctg ttcttgtcat ctatggtaaa aacaagcggc cctcagggat cccagaccga 180 ttctctggct ccatctcagg gaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggag 240 gatgaggctg actattactg taactcccgg gacagcagtg gtaagcatta tgtcttcgga 300 actgggacca aggtcaccgt cctag 325 <210> 24 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Thr Thr Asn Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Lys Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ile Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Lys His 85 90 95 Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 25 <211> 367 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagattgg 300 ggcctagtac aactggaatc cggctatgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctcag 367 <210> 26 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Trp Gly Leu Val Gln Leu Glu Ser Gly Tyr Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 334 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccaacag 120 cttccaggaa aagcccccaa actcctcatc tatgataata ccaatcggcc ctcgggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cagtgggctc 240 cagtctgagg atgaggctga ttattactgt gcagcatggg atgaaagcct gaatggtcag 300 gtcttcggaa ctgggaccaa ggtcaccgtc ctag 334 <210> 28 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Glu Ser 85 90 95 Leu Asn Gly Gln Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 29 <211> 367 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 caggtacagc tgcagcagtc aggcccagga ctggtgaagc cttcggggac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctctggtgg ctccatcagc agtagtgact ggtggagttg ggtccgccag 120 gtcccaggga aggggctgga gtggattggg gaaatctatc acagtggcag tcccaactac 180 aacccgtccc tcaggggtcg agtcaccata tcagtagaca agtcgaagaa ccagttctcc 240 ctgaagctga gctctgtgac cgccgcggac acggccgtct attactgtgc gagagaaaga 300 gttgctccta cagtagacgg tgcttttgat gtctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360 tcctcag 367 <210> 30 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Asp Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Arg Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Val Ala Pro Thr Val Asp Gly Ala Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 31 <211> 322 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 gacatcgtga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattacc acctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ctatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ttgtcaacag gccagcagtt tccctctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggatctcaa ac 322 <210> 32 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Thr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Ser Ser Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Leu Lys 100 105 <210> 33 <211> 364 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttcgggata cagctttacc aactactgga tcggctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gattgggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccaccag cactgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gaggataaag 300 agttactatg atagtagtgg ttattacctc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tcag 364 <210> 34 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Lys Ser Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 35 <211> 322 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 cagtctgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggacagac ggccagcata 60 acctgtgggg gaaacaacat tgggagtaaa agtgtgcact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tcctggtcgt ctatgatgat agcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240 gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagtagta gtgaagaggt attcggcgga 300 gggaccaagc tgaccgtcct ag 322 <210> 36 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Glu 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 37 <211> 346 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 gaggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgacgac acggctgtct attactgtgc gagaaggggg 300 ttcatggacg tctggggcaa aggcaccctg gtcaccgtct cctcag 346 <210> 38 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Phe Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 39 <211> 325 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 tcttctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaccatc 60 acatgccaag gagacatcct cgaagcctat tatgcaagtt ggtaccagca gaggccagga 120 caggcccctg tccttgtcat ctatggcgaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccgg 180 ttctctggct ccaggtcagg aaacacagcc tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240 gatgaggctg actattattg taactctcgg gacagcagtg gtagccatgt ggtattcggc 300 ggagggacca agatgaccgt cctgg 325 <210> 40 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ile Leu Glu Ala Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Arg Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Ser His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Met Thr Val Leu 100 105 <210> 41 <211> 346 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttaac agctttgcca tgacctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggcac 300 gcttttgata tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctcag 346 <210> 42 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe 20 25 30 Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly His Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 43 <211> 337 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 gacatcgtga tgacccagtc tccactctct ctgtccgtca cccctgggca gccggcctcc 60 atctcctgca agtctagtca gagcctcctg catagtgatg gaaagaccta tttgtattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gcctccacaa ctcctgatct atgaagtttc caaccggttc 180 tctggagtgc cagataggtt cagtggcagc gggtcaggga cagatttcac actgaaaatc 240 agccgggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaagtat acagcttcct 300 ctcactttcg gcggagggac caaggtggag atcaaac 337 <210> 44 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser 85 90 95 Ile Gln Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 45 <211> 352 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaagataaa 300 ggtggggggt tcgacccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc ag 352 <210> 46 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Lys Gly Gly Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 47 <211> 331 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgcc agcaactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120 ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaggataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgatagtac ctctcatgtc 300 ttcggaactg ggacccaggt caccgtccta g 331 <210> 48 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val 35 40 45 Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly 65 70 75 80 Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser 85 90 95 Thr Ser His Val Phe Gly Thr Gly Thr Gln Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 49 <211> 373 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata cagctttacc aactactgga tcggctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg ggtggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagaccaggg 300 tattactatg gttcggggag ttattataac gttgactact ggggccaggg caccctggtc 360 accgtctcct cag 373 <210> 50 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Asn Val Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 51 <211> 322 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 cagcctgggc tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac agccagcatc 60 acctgctctg gagatgaatt gggggataaa tttgctttct ggtatcaaca aaagccaggc 120 cagtcccctg tgctggtcat ctatcaagat agtaagaggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccatctctgg gaacacggcc accctgacta tcagcagggt cgaggccgga 240 gatgaggccg actatttctg tcaggtgtgg gatagcaatg gtggtccccc attcgggaga 300 gggaccaagc tgaccgtcct ag 322 <210> 52 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Gln Pro Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Glu Leu Gly Asp Lys Phe Ala 20 25 30 Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ile Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Val Trp Asp Ser Asn Gly Gly Pro 85 90 95 Pro Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala 1 5 <210> 54 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Leu Ser Trp Asn Thr Gly Arg Val 1 5 <210> 55 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Ala Lys Gly Ser Ala Leu Gly Leu Val Gly Trp Phe Asp Ala 1 5 10 <210> 56 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Ser Leu Arg Thr Tyr Tyr 1 5 <210> 57 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Gly Lys Glu 1 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Asn Ser Gln Asp Ser Ser Gly Asp Leu Leu 1 5 10 <210> 59 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr Ala 1 5 <210> 60 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Ile Thr Arg Asn Ser Gly Arg Ile 1 5 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Ala Ser Glu Met Thr Gly Ala Tyr Asp Ile 1 5 10 <210> 62 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Gly Leu Arg Tyr Tyr Tyr 1 5 <210> 63 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Gly Lys Asn 1 <210> 64 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Arg Phe 1 5 10 <210> 65 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 66 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys 1 5 <210> 67 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Ala Lys Glu Asp Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Ser Asn Tyr 1 5 10 <210> 68 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr 1 5 <210> 69 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Arg Asn Asp 1 <210> 70 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Ser Ala Trp Asp Asp Ser Leu Gly Gly Glu Val 1 5 10 <210> 71 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Gly Phe Thr Phe Ser Ser His Ala 1 5 <210> 72 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 73 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Ala Lys Ile Gly Thr Ala Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 74 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Val Pro Asn Ile Gly Ser Asn Pro 1 5 <210> 75 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Asn Ser Asn 1 <210> 76 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asp Gly Leu Val 1 5 10 <210> 77 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 78 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 79 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Ala Arg Glu Lys Ser Ser Ser Trp Tyr Gly Gly Asp Asn Trp Phe Asp 1 5 10 15 Pro <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr His Tyr 1 5 <210> 81 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Asp Val Ser 1 <210> 82 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Val Val 1 5 10 <210> 83 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly 1 5 <210> 84 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr 1 5 <210> 85 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Ala Arg Asp Val His Pro Leu Asp Ile Ala Val Ala Ala Asp Asp Tyr 1 5 10 15 Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 20 <210> 86 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Ser Leu Thr Thr Asn Tyr 1 5 <210> 87 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Gly Lys Asn 1 <210> 88 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Lys His Tyr Val 1 5 10 <210> 89 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Ala Lys Asp Trp Gly Leu Val Gln Leu Glu Ser Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp 1 5 <210> 91 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Asp Asn Thr 1 <210> 92 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Ala Ala Trp Asp Glu Ser Leu Asn Gly Gln Val 1 5 10 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Asp Trp 1 5 <210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro 1 5 <210> 95 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Ala Arg Glu Arg Val Ala Pro Thr Val Asp Gly Ala Phe Asp Val 1 5 10 15 <210> 96 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Gln Ser Ile Thr Thr Tyr 1 5 <210> 97 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Ala Ala Ser 1 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Gln Gln Ala Ser Ser Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 99 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp 1 5 <210> 100 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr 1 5 <210> 101 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Ala Arg Ile Lys Ser Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Leu 1 5 10 <210> 102 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Asn Ile Gly Ser Lys Ser 1 5 <210> 103 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Asp Asp Ser 1 <210> 104 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Glu Val 1 5 10 <210> 105 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Ala Arg Arg Gly Phe Met Asp Val 1 5 <210> 106 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Ile Leu Glu Ala Tyr Tyr 1 5 <210> 107 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Gly Glu Asn 1 <210> 108 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Ser His Val Val 1 5 10 <210> 109 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe Ala 1 5 <210> 110 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Ala Lys Gly His Ala Phe Asp Ile 1 5 <210> 111 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr 1 5 10 <210> 112 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Glu Val Ser 1 <210> 113 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Met Gln Ser Ile Gln Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> 114 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Ala Lys Asp Lys Gly Gly Gly Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 115 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr 1 5 <210> 116 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 Glu Asp Asn 1 <210> 117 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Gln Ser Tyr Asp Ser Thr Ser His Val 1 5 <210> 118 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr 1 5 <210> 119 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119 Ala Arg Pro Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Asn Val Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 120 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120 Glu Leu Gly Asp Lys Phe 1 5 <210> 121 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Gln Asp Ser 1 <210> 122 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 Gln Val Trp Asp Ser Asn Gly Gly Pro Pro 1 5 10

Claims (27)

  1. 다음을 포함하고, 인간-글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체(GITR)에 결합하는, 단리된 인간화된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    a. 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역;
    b. 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역;
    c. 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역;
    d. 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역;
    e. 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역;
    f. 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역;
    g. 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역;
    h. 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역;
    i. 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역;
    j. 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역;
    k. 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역;
    l. 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역; 또는
    m. 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역, 그리고 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역.
  2. 다음을 포함하고, 인간-글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체(GITR)에 결합하는, 단리된 인간화된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (a) 서열 번호: 53, 54 또는 55의 아미노산 서열을 차례로 포함하는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3(VH-CDR); 그리고, 서열 번호: 56, 57, 또는 58의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3(VL-CDR);
    (b) 서열 번호: 59, 60, 또는 61의 아미노산 서열을 차례로 포함하는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3(VH-CDR); 그리고, 서열 번호: 62, 63, 또는 64의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3(VL-CDR);
    (c) 서열 번호: 65, 66, 또는 67의 아미노산 서열을 차례로 포함하는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3(VH-CDR); 그리고, 서열 번호: 68, 69, 또는 70의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3(VL-CDR);
    (d) 서열 번호: 71, 72, 또는 73의 아미노산 서열을 차례로 포함하는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3(VH-CDR); 그리고, 서열 번호: 74, 75, 또는 76의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3(VL-CDR);
    (e) 서열 번호: 77, 78, 또는 79의 아미노산 서열을 차례로 포함하는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3(VH-CDR); 그리고, 서열 번호: 80, 81, 또는 82의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3(VL-CDR);
    (f) 서열 번호: 83, 84, 또는 85의 아미노산 서열을 차례로 포함하는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3(VH-CDR); 그리고, 서열 번호: 86, 87, 또는 88의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3(VL-CDR);
    (g) 서열 번호: 65, 72, 또는 89의 아미노산 서열을 차례로 포함하는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3(VH-CDR); 그리고, 서열 번호: 90, 91, 또는 92의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3(VL-CDR);
    (h) 서열 번호: 93, 94, 또는 95의 아미노산 서열을 차례로 포함하는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3(VH-CDR); 그리고, 서열 번호: 96, 97, 또는 98의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3(VL-CDR);
    (i) 서열 번호: 99, 100, 또는 101의 아미노산 서열을 차례로 포함하는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3(VH-CDR); 그리고, 서열 번호: 102, 103, 또는 104의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3(VL-CDR);
    (j) 서열 번호: 65, 72, 또는 105의 아미노산 서열을 차례로 포함하는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3(VH-CDR); 그리고, 서열 번호: 106, 107, 또는 108의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3(VL-CDR);
    (k) 서열 번호: 109, 72, 또는 110의 아미노산 서열을 차례로 포함하는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3(VH-CDR); 그리고, 서열 번호: 111, 112, 또는 113의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3(VL-CDR);
    (l) 서열 번호: 65, 72, 또는 114의 아미노산 서열을 차례로 포함하는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3(VH-CDR); 그리고, 서열 번호: 115, 116, 또는 117의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3(VL-CDR); 또는
    (m) 서열 번호: 101, 118, 또는 119의 아미노산 서열을 차례로 포함하는 가변 중쇄 상보성 결정 영역 1, 2, 또는 3(VH-CDR); 그리고, 서열 번호: 120, 121, 또는 122의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 1, 2 또는 3(VL-CDR).
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 일가 또는 이가인 항체.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 단일 쇄 항체인 항체.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 10-5 M 내지 10-12 M 범위의 결합 친화력을 갖는 항체.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 IgG4 중쇄 불변 영역을 갖는 항체.
  7. 청구항 1에 있어서, Fc 영역은 아미노산 위치 234 및 235에서 돌연변이를 포함하는 것인 항체.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 돌연변이는 L234A 및 L235A인 항체.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 종양-연합된 항원, 사이토킨 또는 세포 표면 수용체에 또한 결합하는 이중 특이적 항체인 항체.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 치료요법적 물질에 연계된 항체.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 치료요법적 물질은 톡신, 방사능라벨, siRNA, 소분자, 또는 사이토킨인 항체.
  12. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항의 항체를 생산하는 단리된 세포.
  13. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 항체 및 약제학적으로 수용가능한 담체를 포함하는, 암의 증후를 치료 또는 경감시키기 위한 약제학적 조성물.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 암은 GITR 또는 이의 리간드, GITR-L이 과다발현되는 암인 약제학적 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 항체가 사이토킨 또는 화학치료요법적 물질과 조합하여 사용되는 것인 약제학적 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 사이토킨은 IL-15인 약제학적 조성물.
  17. 서열 번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 또는 51의 핵산 서열을 포함하는 핵산.
  18. 서열 번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 또는 52의 폴리펩티드를 인코드하는 핵산.
  19. 서열 번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 또는 52의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  20. 청구항 17 또는 18의 핵산을 포함하는 벡터.
  21. 청구항 20의 벡터를 포함하는 단리된 세포.
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
KR1020197005244A 2016-07-22 2017-07-24 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체 (gitr) 항체 및 이의 이용 방법 KR102534568B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662365712P 2016-07-22 2016-07-22
US62/365,712 2016-07-22
US201662375634P 2016-08-16 2016-08-16
US62/375,634 2016-08-16
PCT/US2017/043504 WO2018018039A2 (en) 2016-07-22 2017-07-24 Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (gitr) antibodies and methods of use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190039532A KR20190039532A (ko) 2019-04-12
KR102534568B1 true KR102534568B1 (ko) 2023-05-18

Family

ID=59501631

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197005244A KR102534568B1 (ko) 2016-07-22 2017-07-24 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체 (gitr) 항체 및 이의 이용 방법

Country Status (13)

Country Link
US (2) US11046777B2 (ko)
EP (1) EP3487884A2 (ko)
JP (1) JP7082967B2 (ko)
KR (1) KR102534568B1 (ko)
CN (2) CN109689689B (ko)
AU (2) AU2017300788B2 (ko)
BR (1) BR112019001262A2 (ko)
CA (1) CA3031194A1 (ko)
IL (2) IL296127A (ko)
MX (1) MX2019000963A (ko)
RU (1) RU2019104896A (ko)
SG (1) SG11201900500TA (ko)
WO (1) WO2018018039A2 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2019240247A1 (en) * 2018-03-21 2020-10-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Fc variant compositions and methods of use thereof
CN113087799B (zh) * 2018-04-09 2023-03-31 原启生物科技(上海)有限责任公司 抗pd-l1抗体及其用途
KR20230083316A (ko) * 2020-10-09 2023-06-09 더 호스피탈 포 식 칠드런 Sars-cov-2를 표적화하는 폴리펩티드, 및 관련 조성물 및 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006105021A2 (en) * 2005-03-25 2006-10-05 Tolerrx, Inc. Gitr binding molecules and uses therefor

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5030719A (en) 1986-08-28 1991-07-09 Teijin Limited Cytotoxic antibody conjugates and a process for preparation thereof
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
WO1991000360A1 (en) 1989-06-29 1991-01-10 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
EP0463151B1 (en) 1990-01-12 1996-06-12 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
ATE204902T1 (de) 1990-06-29 2001-09-15 Large Scale Biology Corp Melaninproduktion durch transformierte mikroorganismen
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DE69127627T2 (de) 1990-08-29 1998-02-19 Genpharm Int Produktion und Nützung nicht-menschliche transgentiere zur Produktion heterologe Antikörper
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1992020373A1 (en) 1991-05-14 1992-11-26 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
EP0666923A1 (en) 1991-09-05 1995-08-16 The University Of Connecticut Targeted delivery of poly- or oligonucleotides to cells
WO1994002602A1 (en) 1992-07-24 1994-02-03 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
DK0669836T3 (da) 1992-11-13 1996-10-14 Idec Pharma Corp Terapeutisk anvendelse af kimære og radioaktivt mærkede antistoffer og humant B-lymfocytbegrænset differentieringsantigen til behandling af B-cellelymfom
AU1925195A (en) 1994-02-22 1995-09-04 Dana-Farber Cancer Institute Nucleic acid delivery system, method of synthesis and uses thereof
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
CA2536408A1 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Biogen Idec Ma Inc. Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same
EP1697415A1 (en) 2003-11-12 2006-09-06 Biogen Idec MA Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
WO2005123774A2 (en) * 2004-06-15 2005-12-29 Erol Fikrig Antibodies to west nile virus polypeptides
US8709424B2 (en) * 2009-09-03 2014-04-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-GITR antibodies
WO2013039954A1 (en) * 2011-09-14 2013-03-21 Sanofi Anti-gitr antibodies
AR097306A1 (es) 2013-08-20 2016-03-02 Merck Sharp & Dohme Modulación de la inmunidad tumoral
TW201605896A (zh) * 2013-08-30 2016-02-16 安美基股份有限公司 Gitr抗原結合蛋白
CN108064242B (zh) * 2014-05-28 2022-10-21 阿吉纳斯公司 抗gitr抗体和其使用方法
BR112016028378A2 (pt) 2014-06-06 2017-10-24 Bristol Myers Squibb Co anticorpos contra o receptor do fator de necrose tumoral induzido por glicocorticoide (gitr) e usos dos mesmos
CN107250159A (zh) * 2014-10-03 2017-10-13 达纳－法伯癌症研究所公司 糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(gitr)抗体及其使用方法
MA41044A (fr) * 2014-10-08 2017-08-15 Novartis Ag Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer
WO2016073906A2 (en) * 2014-11-06 2016-05-12 Scholar Rock, Inc. Transforming growth factor-related immunoassays

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006105021A2 (en) * 2005-03-25 2006-10-05 Tolerrx, Inc. Gitr binding molecules and uses therefor

Also Published As

Publication number Publication date
AU2024200994A1 (en) 2024-03-07
CN109689689B (zh) 2022-12-06
US11046777B2 (en) 2021-06-29
NZ750097A (en) 2023-11-24
JP7082967B2 (ja) 2022-06-09
MX2019000963A (es) 2019-11-28
US20220098314A1 (en) 2022-03-31
AU2017300788B2 (en) 2023-11-16
JP2019524111A (ja) 2019-09-05
CN116082506A (zh) 2023-05-09
WO2018018039A2 (en) 2018-01-25
AU2017300788A1 (en) 2019-02-07
KR20190039532A (ko) 2019-04-12
US20210101989A1 (en) 2021-04-08
CN109689689A (zh) 2019-04-26
IL296127A (en) 2022-11-01
SG11201900500TA (en) 2019-02-27
WO2018018039A3 (en) 2018-02-22
IL264376A (en) 2019-02-28
EP3487884A2 (en) 2019-05-29
BR112019001262A2 (pt) 2019-05-07
RU2019104896A3 (ko) 2021-04-29
CA3031194A1 (en) 2018-01-25
RU2019104896A (ru) 2020-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2018226425B2 (en) Human Monoclonal Anti-PD-L1 Antibodies and Methods of Use
US20200261578A1 (en) Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (gitr) antibodies and methods of use thereof
US11723973B2 (en) Humanized CC chemokine receptor 4 (CCR4) antibodies and methods of use thereof
US20220098314A1 (en) Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (gitr) antibodies and methods of use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant