KR102528090B1 - 트롬빈 안티트롬빈 복합체의 측정 시약 및 측정 방법 - Google Patents

Abstract

피검자 유래의 혈액 시료 중의 트롬빈 안티트롬빈 복합체(TAT)를 라텍스 응집법에 따라 측정하기 위한 시약으로서, 폴리 양이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 시약. 이에 따라, 헤파린의 영향을 피해서 TAT를 정확하게 측정할 수 있다.

Description

트롬빈 안티트롬빈 복합체의 측정 시약 및 측정 방법

본 발명은, 시료 중의 트롬빈(T) 안티트롬빈(AT) 복합체(TAT)를 측정하는 시약 및 방법에 관한 것이다.

트롬빈 안티트롬빈 복합체(TAT)는 혈액 응고가 진행할 때에 혈액 중에 생성되는 단백질 복합체로서, 혈액 중의 TAT 정량은 파종성 혈관내 응고 증후군(DIC) 등 혈전증 진단에 유용하다. 그러나 TAT의 존재량은 유리(遊離) 안티트롬빈 존재량의 약 100,000분의 1이기 때문에, 측정이 쉽지 않다.

현재 주류인 TAT 정량법은, 지멘스사의 Enzygnost(등록상표) TAT　micro 등의 효소 면역 측정법(ELISA)을 이용하는 시약 키트, 및 LSI 메디엔스사의 스테이시아(등록상표)　CLEIA　TAT 등의 화학 발광효소 면역 측정법(CLEIA)을 이용하는 시약 키트를 이용하는 방법이 있지만, 모두 고상·액상 분리(B/F분리)가 필요한 측정법으로써, 번잡한 세정 작업이 필요하고, 수작업 혹은 전용 기기가 필요하다.

특허문헌 1~4에는 B/F 분리가 필요하지 않은 라텍스 응집법을 이용하는 시약계가 보고되었지만, 모두 체외에서 합성한 TAT를 완충제로 희석하여 제작한 샘플을 측정한 것이고, 라텍스 응집법을 이용하여 사람 검체 중의 TAT를 정확하게 농도 측정할 수 있는 시약의 보고는 없다. 또, 이들 문헌은 모두 항체의 특이성에 의존해서 TAT 측정 시약을 구축하고 있든지, 첨가제에 의해 그 교차 반응성에 따른 영향을 회피하고 있는 것이다. 특허문헌 5는 교차 반응성을 갖지 않는 항체를 사용하는 샌드위치 측정법에 따른 TAT 측정에 대해서 개시하고 있지만, 임상적으로 이용하기 위한 충분한 감도는 아니다.

따라서, 측정이 간편한 라텍스 응집법에서 고감도·고정밀도로 생체 시료 중의 TAT를 측정하는 시약 및 방법이 요구되고 있었다.

본 발명자들은 B/F 분리가 필요하지 않은 라텍스 응집법을 이용하여 사람 검체 중의 TAT를 정확하게 농도 측정 가능한 시약을 보고했지만(특허문헌 6, 7), 임상 응용을 위해서는 더욱 개선의 여지가 있었다.

특허문헌 1: 일본 공개특허공보 2001－289850호 특허문헌 2: 일본 공개특허공보 2001－221800호 특허문헌 3: 일본 공개특허공보 평7－238099호 특허문헌 4: 일본 공개특허공보 2002－316999호 특허문헌 5: 일본 공개특허공보 평3－48158호 특허문헌 6: 일본 특허출원 2015－074168호 특허문헌 7: 일본 특허출원 2015－074173호

도 1에 기재된 바와 같이, 라텍스 응집법에 따른 TAT 측정에서는, 안티트롬빈 측에 결합해서 TAT를 인식하는 항체, 및 트롬빈 측에 결합해서 TAT를 인식하는 항체의 2종류 항체가 사용된다. 그리고 원리적으로는 TAT가 존재할 때에만 두 항체가 결합하여 라텍스 응집이 일어나서 TAT의 정량이 가능해진다.

하지만, 특허문헌 6, 7에서 이용되는 것과 같은 TAT의 안티트롬빈 측에 결합하는 항체로서, TAT에 대한 반응이 안티트롬빈에 대한 반응의 100배 이상인 단일 클론 항체를 이용했을 때에도, 혈전 색전증이나 DIC 치료 등에서 항(抗)응고약으로 이용되는 헤파린(특히, 미분획 헤파린)의 영향으로 비특이적인 반응이 생겨서, 부정확한 측정 결과가 되는 것이 본 발명자들의 검토로 분명해졌다. 이것은 아마도 헤파린이 혈중에서 안티트롬빈과 복합체를 형성하여 안티트롬빈을 다량체화 하는 것에 기인한다고 생각된다. 이러한 헤파린-안티트롬빈 복합체는 통상의 안티트롬빈에 비해서, TAT를 형성했을 때의 안티트롬빈 구조에 더 가깝다고 생각되며, 더욱 다량체를 형성하고 있다고 생각된다. 따라서, 헤파린 투여 환자의 검체를 측정하면, TAT에 대한 반응이 안티트롬빈에 대한 반응의 100배 이상인 단일 클론 항체를 결합한 라텍스 입자를 이용해도, 그것이 헤파린-안티트롬빈 복합체를 인식하고, 단독으로 응집이 발생하여 이것이 비특이 반응으로 본 반응에 추가되어 버린다. 이러한 헤파린-안티트롬빈 복합체에 의한 비특이적 반응은 B/F 분리가 가능한 측정법에서는 생기지 않는 문제로써, 본 발명자가 처음 발견한 라텍스 응집법을 이용한 TAT 측정 시약에 특유한 문제이다.

종래 라텍스 응집법에 따른 TAT 측정 시약에서의 안티트롬빈의 영향 회피법으로는 특허문헌 1, 2와 같은 방법이 알려져 있지만, 헤파린에 의해서 안티트롬빈 다량체가 생기는 점, 헤파린에 의해서 다량체화 한 안티트롬빈의 영향 회피책에 대해서는 아무런 시사가 되어 있지 않다.

여기서, 본 발명은, B/F 분리나 세정 작업을 필수로 하지 않는 라텍스 응집법을 이용한, 생체 시료 중의 TAT 측정 시약 및 측정 방법에서, 헤파린 등의 영향을 회피하여 정확하게 TAT를 측정할 수 있는 시약 및 방법을 제공하는 것이다.

이 과제를 해결하기 위해서 예의 검토한 결과, 본 발명자는 TAT 측정 시약 중에 브롬화 헥사디메트린 등의 폴리 양이온을 첨가함으로써 헤파린-안티트롬빈 복합체에 의한 비특이적 응집을 회피하고, 생체 시료 중의 TAT를 정확하게 측정할 수 있다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 이하를 제공한다.

[1] 피검자 유래의 혈액 시료 중의 트롬빈 안티트롬빈 복합체(TAT)를 라텍스 응집법에 따라서 측정하기 위한 시약으로서, 폴리 양이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 시약.

[2] 상기 피검자가 헤파린 투여된 환자인, [1]에 기재된 시약.

[3] 상기 폴리 양이온이 브롬화 헥사디메트린, 키토산류, 변성 덱스트란, 아미노 덱스트란, 히드록시 메틸 셀룰로오스 트리 메틸 아민, 라이소자임, 스페르민, 스페르미딘, 폴리 리신, 폴리아르기닌, 폴리오르니틴, 황산 프로타민, 히드록시 에틸 셀룰로오스 트리 메틸 아민, 헤파린 결합 단백질, 폴리 알릴 아민, 염산 폴리 알릴 아민, 폴리(디알릴 디알킬 아민), 폴리아미드 아민, 폴리아민, 염화 폴리 비닐 벤질 트리 메틸 암모늄, 염화 폴리 디알릴 디메틸 암모늄, 폴리 에틸렌 이민, 폴리 프로필렌 이민, 폴리 프로필 에틸렌 이민, 폴리이미다졸린, 폴리 비닐 아민, 폴리 비닐 피리딘, 폴리(아크릴 아미드/브롬화 메타크릴 옥시 프로필 트리 메틸 암모늄), 폴리(염화 디아릴 디메틸 암모늄/N－이소프로필 아크릴 아미드), 폴리(디메틸 아미노 에틸 아크릴레이트/아크릴 아미드), 폴리 디메틸 아미노 에틸 메타크릴레이트, 폴리디메틸아미노 에피클로로히드린, 폴리에틸렌이미노 에피클로로히드린, 브롬화 폴리 메타크릴 옥시 에틸 트리 메틸 암모늄, 염화 히드록시 프로필 메타크릴옥시 에틸 디메틸 암모늄, 폴리(메틸 디에틸 아미노 에틸 메타크릴레이트/아크릴 아미드), 폴리(메틸/구아니딘), 브롬화 폴리 메틸 비닐 피리디늄, 폴리(비닐 피롤리돈-디메틸 아미노 에틸 메타크릴레이트)및 브롬화 폴리 비닐 메틸 피리디늄으로 이루어지는 군에서 선택되는, [1] 또는 [2]에 기재된 시약.

[4] 상기 폴리 양이온이 브롬화 헥사디메트린, 폴리 에틸렌 이민, 폴리 프로필 에틸렌 이민 등의 폴리 알킬렌 아민, 황산 프로타민, 폴리 리신, 폴리오르니틴, 및 아미노 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는, [1] 또는 [2]에 기재된 시약.

[5] 상기 시약이, 라텍스에 결합한 안티트롬빈 측에 결합해서 TAT를 인식하는 제1 항TAT 항체와, 라텍스에 결합한 트롬빈 측에 결합해서 TAT를 인식하는 제2 항TAT 항체를 포함하는, [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 시약.

[6] 상기 제1 항TAT 항체가 TAT에 대한 반응성이 유리 안티트롬빈에 대한 반응성의 100배 이상인 항체인, [5]에 기재된 시약.

[7] 피검자 유래의 혈액 시료 중에 존재하는 TAT를 측정하는 방법으로써, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 시약을 이용하여 라텍스 응집법을 실시함으로써 TAT를 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.

[8] 상기 피검자가 헤파린이 투여된 환자인, [7]에 기재된 방법.

본 발명에 의하면, 라텍스 응집법의 시약에 의해, 생체 시료 중의 미량인 TAT를 헤파린의 영향을 회피하면서 정확하게 측정(정량)하는 것이 가능하다. 이에 따라, 헤파린 투여 환자 혈장(또는 헤파린 채혈관으로 채취한 혈장)에서도 정확하게 라텍스 응집법에 따른 TAT 측정이 가능하고, DIC 치료에도 이용되는 헤파린 투여가 이루어진 환자 검체 중의 TAT를 정확하게 측정할 수 있는 점은 진단상 유용하다.

도 1은 라텍스 응집법에 따른 TAT 측정 방법의 모식도이다.
도 2는 간접 저해 ELISA법에 따른 반응계의 모식도이다.
도 3은 간접 저해 ELISA법에 따른 클론 TAT-5의 각 항원에 대한 결합성을 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 헤파린 첨가 혈장(모델 검체)에서의 브롬화 헥사디메트린의 효과를 나타내는 도면이다.
도 5는 헤파린 처리 혈액 또는 헤파린 비처리 혈액의 각각에 대해서 브롬화 헥사디메트린의 농도를 변화시켰을 때의 검출 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 헤파린 처리 혈액 또는 헤파린 비처리 혈액에 추가로 TAT 농도가 50ng/mL가 되도록 혈청을 첨가하고, 각각에 대해서 브롬화 헥사디메트린(폴리브렌)의 농도를 변화시켰을 때의 검출 결과를 나타내는 도면이다. 아래는 위 도면을 확대한 것을 나타낸다.
도 7은 헤파린 처리 혈액 또는 헤파린 비처리 혈액의 각각에 대해서 황산 프로타민의 농도를 변화시켰을 때의 검출 결과를 나타내는 도면이다. 아래는 위 도면을 확대한 것을 나타낸다.
도 8은 브롬화 헥사디메트린의 있음(＋) 없음(－)으로서, 제2 시약A 또는 제2 시약B를 이용하여 임상 검체를 평가한 측정 결과를 나타내는 도면이다.

본 발명의 TAT 측정 시약은,

피검자 유래의 혈액 시료 중의 트롬빈 안티트롬빈 복합체(TAT)를 라텍스 응집법에 따라서 측정하기 위한 시약으로서, 폴리 양이온을 포함한다.

이하, 본 발명의 TAT 측정 시약의 일례를 실시의 일 양태로서 기재하지만, 본 발명의 범위는 이것에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 TAT 측정 시약은, 바람직하게는 생체 시료 중의 TAT를 측정하기 위한 2종류의 항TAT 항체를 각각 결합시킨 라텍스 입자를 이용한 샌드위치계에서의 라텍스 응집법에 따른 면역 측정 시약이다.

본 발명에 사용할 수 있는 항체는, 예를 들면, 안티트롬빈 측에 결합해서 TAT를 인식하는 항체(제1 항체)와 트롬빈 측에 결합해서 TAT를 인식하는 항체(제2 항체)를 조합하여 사용할 수 있다.

제1 항체로서는, 안티트롬빈 측에 결합해서 TAT를 인식할 수 있는 항체이면 좋다. TAT에 대한 반응성과 유리 안티트롬빈에 대한 반응성에 적어도 100배 이상의 차이를 가지는 항체가 바람직하게 이용된다. 제1 항체의 TAT에 대한 반응성은 유리 안티트롬빈에 대한 반응성보다 100배 이상이면 좋고, 200배 이상이 보다 바람직하며, 1,000배 이상인 것이 더욱 바람직하고, 10,000배 이상인 것이 특히 바람직하다. 교차 반응성은 적을수록 좋기 때문에 특별히 상한은 없지만, 예를 들면, 100,000배 미만, 또는 50,000배 미만이어도 좋다.

상기 항체를 조제하는 데는, 사람 이외의 동물에 대해서, 유리 안티트롬빈을 면역한 것이어도 좋고, TAT를 면역한 것이어도 좋으며, 안티트롬빈 측에 결합해서 TAT를 인식할 수 있는 항체이면 본 발명에 사용할 수 있다.

여기서, 본 발명에서 안티트롬빈 측에 결합한다는 것은, 시료 중에 가장 많이 존재하는 유리한 상태의 안티트롬빈이 유리 트롬빈과 결합하여 복합체(TAT)를 형성하는 상태의 안티트롬빈에 결합하는 것을 의미한다. 따라서, 복합체를 형성했을 때의 구조를 가지는 안티트롬빈을 복합체형 구조 안티트롬빈, 복합체를 형성하고 있지 않을 때의 구조를 가지는 안티트롬빈을 유리형 구조 안티트롬빈(유리 안티트롬빈)으로 칭했을 경우, 안티트롬빈 측에 결합한다는 것은 복합체형 구조 안티트롬빈에 결합하는 것을 의미한다.

유리형 구조 안티트롬빈은 복합체형 구조 안티트롬빈과 다른 구조를 가진다. 그것은 유리형 구조 안티트롬빈은 유리 트롬빈과 결합하여 복합체를 형성함으로써 그 구조가 변화한 상태로 존재하기 때문이다.

생체 내에서의 TAT와 TAT를 형성하지 않는 유리 안티트롬빈의 존재 비율은 정상인의 측정치 폭을 참고하여 1:60,000~1:110,000 사이로 생각할 수 있지만, 일반적으로는 약 1:100,000으로 존재하는 것으로 생각된다. 또, 패혈증이나 간질환 환자에게서 그 존재 비율이 변화하는 경우가 알려져 있지만, 유리 안티트롬빈 양이 적어지는 경우에도 1:50,000 정도라고 여겨진다. 따라서, 제1 항체가 유리 안티트롬빈에도 반응성을 나타내면 TAT의 정량이 곤란하게 된다. 여기서, TAT를 정량하려면, 유리 안티트롬빈에 대한 반응성이 낮은 항체를 사용할 필요가 있고, 그러기 위해서, TAT에 대한 반응성이 유리 안티트롬빈에 대한 반응성의 100배 이상인 항체를 이용한다.

본 발명에서 「TAT에 대한 반응성이 유리 안티트롬빈에 대한 반응성의 100배 이상」이란, 각 항원에 대한 친화성의 비가 100배 이상인 경우나, 후술하는 간접 저해 ELISA로 평가했을 때의 일정 비율의 저해율을 나타내는데 필요한 항원량의 비가 100배 이상인 경우 등을 들 수 있다.

TAT에 대한 반응성이 유리 안티트롬빈에 대한 반응성의 100배 이상인 항체는 후술하는 실시예에 기재된 방법으로 얻을 수 있지만, 이하에 상기 항체를 간접 저해 ELISA로 평가 또는 스크리닝하는 경우에 대해서 설명한다.

우선, 안티트롬빈 측에 결합해서 TAT를 인식하는 항체(제1 항체의 후보 항체)를 준비한다. 이러한 항체는 후술하는 혼성 세포에 의한 단일 클론 항체 생성법 등으로 항체를 얻은 후, 결합 부위가 안티트롬빈 측인 TAT를 인식하는 항체를 선택하면 좋다. 물론, 미리 결합 부위가 안티트롬빈 측인 TAT를 인식하는 항체가 존재하는 경우에는 그것을 이하의 평가계에 제공하면 된다.

즉, 후보 항체와 일정량(예를 들면, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50㎍/mL)의 TAT, 또는 TAT 반응을 저해할 수 있는 항원을 포함하는 용액을 충분한 시간(예를 들면, 12시간) 반응시킨다. 그 다음, 상기 반응액을 TAT를 고정화한 기재와 일정시간 반응시킨다. 그 후, 세정 조작을 실시한 후, 표지 2차 항체를 이용하여 기재상 TAT에 결합한 항체의 양(항체 잔존율)을 측정한다.

예를 들면, 우선, 상기 항체의 반응을 저해하는 항원이 존재하지 않는 조건에서, 일정량의 TAT를 플레이트 등의 기재에 고상(固相)한다. 기재에 고상하는 항원(TAT)의 양은, 당업자라면 사용하는 항원의 분주량(分注量)과 평가 대상인 항체의 종류의 관계를 고려해서 적당히 설정할 수 있다.

상기 항체의 반응을 저해하는 항원이 존재하지 않는 조건에서, 각 농도(예를 들면, 0.04~1㎍/mL)의 상기 제1 항체의 후보 항체를 상기 TAT를 고정화한 기재와 일정시간 반응시킨다. 그 후, 세정 조작을 실시한 후, 표지 2차 항체(항마우스 IgG－HRP)를 이용해서, 기재상의 TAT에 결합한 항체의 양을 측정한다. 흡광도가 1.0 부근(표 1에 기재한 방법이라면 1000)이 되는 항체 농도를 결정한다. 이 항체 농도를 항원에 의한 저해시의 항체 농도로 할 수 있다(표 3; 반응시 농도(㎍/mL)).

그 다음, 상기 방법으로 결정한 농도의 후보 항체와 일정량(예를 들면, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50㎍/mL)의 TAT 또는 유리 안티트롬빈을 포함하는 용액을 충분한 시간(예를 들면, 12시간) 반응시킨다. 그 다음, 상기 반응액을 TAT를 고정화한 기재와 일정시간 반응시킨다. 그 후, 세정 조작을 실시한 후, 표지 2차 항체(항마우스 IgG－HRP)를 이용해서 기재상의 TAT에 결합한 항체의 양(항체 잔존율)을 측정한다.

또한, 항체 잔존율은 항원에 의한 흡수가 실시하지 않을 때에 얻어지는 검출치를 100%로 하여 산출할 수 있다.

항체의 유리 안티트롬빈에 대한 반응성이 높은 경우는 TAT에 결합할 수 있는 항체의 양이 줄어들기 때문에, 표지 2차 항체에 의해서 검출되는 항체의 양이 적어지고(항체 잔존율이 낮아지고), 한편, 항체가 유리 안티트롬빈에 대한 반응성이 낮은 경우는 TAT에 결합할 수 있는 항체가 많이 남기 때문에, 표지 2차 항체에 의해 검출되는 항체의 양이 많아진다(항체 잔존율이 높아진다).

이 항체 잔존율을 최초로 TAT와 항체를 반응시킨(저해 반응을 TAT로 실시했다) 후, 반응액을 고체화 TAT와 반응시켰을 때의 항체 잔존율과 비교한다.

그리고 예를 들면, 유리 안티트롬빈을 50㎍/mL 더해서 저해 반응 시켰을 때의 항체 잔존율이 50%였던 경우, 같은 항체 잔존율을 나타내는데 필요한 TAT의 양을 상기 TAT로 저해했을 때의 결과로부터 산출한다. TAT로 저해했을 때에, 항체 잔존율 50%를 달성하는데 필요한 TAT 저해 항원의 양이 0.50㎍/mL 미만이면, TAT에 대한 반응성이 유리 안티트롬빈에 대한 반응성의 100배 이상으로 할 수 있다.

이와 같이 해서 선택된 항체를 제1 항체로서 선택할 수 있다. 또한, 제1 항체는 단일 클론 항체의 경우, TAT에 대한 친화성(Kd)이 10^-8 이하인 것이 바람직하지만, 당업자라면 TAT에 대한 친화성의 수치를 참고로 하여 라텍스 시약에 적합한 항체를 적절하게 선택할 수 있다.

제1 항체로서 안티트롬빈 측에 결합해서 TAT를 인식할 수 있는 항체를 선택한 경우, 제2 항체로서는 트롬빈 측에 결합해서 TAT를 인식할 수 있는 항체이면 좋고, 트롬빈에 대해서 특이적으로 반응하는 항체를 사용할 수 있다. 시료 중에 있어서, 유리 트롬빈은 거의 존재하지 않기 때문에, 유리 트롬빈에 대해서 교차 반응성을 가지는 항체여도 이용할 수 있는 경우가 많다. 당업자라면 적당히 선택해서 사용할 수 있다.

상기 항체를 조제함에 있어서는, 사람 이외의 동물에 대해서 유리 트롬빈을 면역한 것이어도 좋고, TAT를 면역한 것이어도 좋으며, 트롬빈 측에 결합해서 TAT를 인식할 수 있는 항체이면 본 발명에 사용할 수 있다.

여기서, 본 발명에서 트롬빈 측에 결합한다는 것은, 시료 중에 존재하는 유리한 상태의 트롬빈이, 안티트롬빈에 결합해서 복합체(TAT)를 형성하는 상태의 트롬빈에 결합하는 것을 의미한다. 따라서, 복합체를 형성했을 때의 구조를 가지는 트롬빈을 복합체형 구조 트롬빈, 복합체를 형성하지 않을 때의 구조를 가지는 트롬빈을 유리형 구조 트롬빈이라고 칭했을 경우, 트롬빈 측에 결합한다는 것은, 복합체형 구조 트롬빈에 결합하는 것을 의미한다.

유리형 구조 트롬빈은 복합체형 구조 트롬빈과 다른 구조를 가질 가능성을 생각할 수 있다. 그것은, 유리형 구조 트롬빈은 안티트롬빈과 결합해서 복합체를 형성함으로써 그 구조가 변화한 상태로 존재함에 의한 것이다.

제2 항체로서는, 트롬빈 측에 결합해서 TAT를 인식하는 항체이면 특별히 제한되지 않는다. 단일 클론 항체의 경우, TAT에 대한 친화성(Kd)이 10^-8 이하인 것이 바람직하지만, 당업자라면 TAT에 대한 친화성 수치를 참고로 하여 라텍스 시약에 적합한 항체를 적당히 선택하는 것이 가능하다.

또, 본 발명에 사용하는 항체로서 예를 들면, TAT에 특이적으로 결합하는 항체, 즉 트롬빈이나 안티트롬빈에는 반응하지 않지만, TAT에만 특이적으로 반응하는 항체로서, 에피토프(epitope)가 다른 2종류의 항체를 조합해서 사용할 수도 있다.

상기 제1 항체 및 제2 항체는 다중 클론 항체 또는 단일 클론 항체 모두 사용할 수 있다. 이들 항체는 당업자라면 공지의 방법에 따라 취득할 수 있다.

항체 제작용으로 면역원을 면역하는 동물로는, 양, 말, 염소, 토끼, 마우스, 랫 등이 사용 가능하고, 특히 다중 클론 항체 제작에는 토끼, 염소 등이 바람직하다. 또, 혼성 세포를 제작하는 공지의 방법에 따라서 단일 클론 항체를 얻는 것도 가능하고, 이 경우는 마우스, 랫 혹은 토끼 등이 바람직하다. 혼성 세포 및 단일 클론 항체의 조제는, 정법, 예를 들면, 속 생화학 실험강좌(일본 생화학회편) 또는 면역 생화학 연구법(일본 생화학회편)에 기재된 방법에 따라서 실시할 수 있다.

면역원으로서는, 상술한 것처럼 TAT를 사용해도 좋고, 비트로넥틴이 결합한 VTAT를 면역원으로 제작한 항체를 본원 발명에 사용할 수도 있다. 또, 제1 항체의 경우는 안티트롬빈을, 제2 항체의 경우에는 트롬빈을 사용해도 좋다.

이들 면역원은 생체로부터 채취된 시료를 원료로 하여 정제된 TAT를 사용해도 좋고, 유리 트롬빈과 유리 안티트롬빈을 혼합하여 인비트로(in vitro)로 합성한 TAT를 사용해도 좋다. 합성 TAT로서는, 예를 들면, 생물 제제로서 입수 가능한 트롬빈과 안티트롬빈을 시험관 내에서 배양하여 얻을 수 있는 TAT여도 좋고, 대장균이나 포유동물세포, 바큐로 바이러스를 감염시킨 곤충 세포 등, 기존의 번역 발현계를 사용해서 발현시킨 것을 회수하여 정제한 것을 면역원으로 사용해도 좋다.

또, 입체 구조의 차이를 부분적인 펩티드만으로 면역시키는 것이 가능한 경우, 구체적으로 항체의 결합 부위를 특정하여 항체를 제작하고 싶은 경우에는, 제1 항체의 경우는 안티트롬빈, 제2 항체의 경우는 트롬빈의 부분 펩티드를 이용해서 제작할 수도 있다. 그 경우의 항원으로서의 펩티드 배열의 선택이나 펩티드 단편의 합성 방법, 면역 방법은 기존의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항체에는 항체 단편이 포함된다. 상기 항체 단편은, 원하는 항체의 단편이고, 게다가 원래의 항체와 동일한 반응성을 가지는 항체 단편이다. 본 발명에서 이용할 수 있는 항체 단편에는, 예를 들면, Fab, Fab＇, F(ab＇)₂, 또는 Fv 등이 포함된다. 이들 단편은, 예를 들면, 항체를 통상적인 방법에 따라서 단백질 분해 효소에 의해서 소화하고, 계속해서 단백질 분리·정제의 통상적인 방법에 따라서 얻을 수 있다. 이것들은 그대로 라텍스 입자에 고상해서 사용할 수 있지만, Fab＇ 단편이나 F(ab＇)₂ 단편에 조제한 것을 라텍스 입자에 고상할 수 있다. 항체의 Fc 단편에 대한 비특이 반응을 회피하는 관점에서, Fab＇나 F(ab＇)₂가 보다 바람직하다.

본 발명에서 사용하는 항체는, 우선 혼성 세포에 의한 단일 클론 항체 생성법 등에 의해 TAT 항체(후보 항체)를 얻고, 그 후 TAT 항체(후보 항체) 중에서 상기와 같은 방법 및 기준으로 제1 항체 및 제2 항체를 선택하여 얻을 수 있다.

제1 항체와 제2 항체의 조합은 라텍스 응집법에서 TAT 측정이 가능하면 특히 제한되지 않지만, 혈장 등의 생체 시료 중에 포함되는 매트릭스(백그라운드)의 영향이 최소인 항체 조합을 선출하는 것이 바람직하다.

TAT 측정 시약에 요구되는 감도는, 정상인과 환자를 명확하게 구별할 수 있는 기준치, 혹은 그 2배의 농도를 측정할 수 있는 것이 필요하기 때문에, 본 발명의 시약은 생체 시료 중의 10~15ng/mL의 TAT를 정량할 수 있는 시약인 것이 바람직하고, 3~4ng/mL의 TAT를 정량할 수 있는 시약인 것이 보다 바람직하며, 1ng/mL 정도의 농도에서도 정량할 수 있는 시약인 것이 더욱 바람직하다.

상기 제1 항체 및 제2 항체를 결합시키는 라텍스 입자는 라텍스 응집 반응에 사용할 수 있는 것이면 특히 제한되지 않지만, 평균 입자 지름이 0.05㎛~0.5㎛인 것이 바람직하고, 0.2~0.4㎛인 것이 보다 바람직하다.

사용하는 라텍스 입자의 종류는, 1종류의 라텍스 입자만을 사용해도 좋고, 복수 종의 라텍스 입자를 사용해도 좋다. 예를 들면, 입자 지름이 다른 라텍스 입자를 조합해서 사용할 수 있다. 라텍스 입자는 단일 입자지름으로 제조하는 것이 실질적으로 곤란한 점에서, 입자 전체의 평균 입자 지름으로 규정된다. 따라서, 평균 입자 지름 0.05㎛~0.5㎛라고 하는 경우, 그 범위에 포함되지 않는 라텍스 입자를 포함하는 경우라도, 본 발명에 해당하는 경우가 있다. 당업자에게 있어서, 입자 지름이 다른 라텍스 입자가 포함되는 것은 상식의 범위 내이고, 당업자라면 그 입자 지름의 분포에 크게 치우침이 없는 입자군을 포함하는 용액을 사용하여 라텍스 시약을 구축하는 것이 가능하다.

또, 이 평균 입자 지름은 공지의 방법으로 측정할 수 있고, 예를 들면, 투과형 전자현미경 장치를 이용한 화상 해석에 의해서 산출된다.

본 발명과 관련되는 라텍스 입자로서는, 통상 이 분야에서 이용되는 것이면 특히 한정되지 않지만, 예를 들면, 스티렌, 염화 비닐, 아크릴로니트릴, 아세트산 비닐, 아크릴산 에스테르, 메타크릴산 에스테르 등의 비닐계 모노머를 중합시켜서 이루어지는 단일 중합체(예를 들면, 폴리스티렌, 메타크릴산 중합체, 아크릴산 중합체 등)로 이루어지는 입자, 부타디엔계 공중합체(예를 들면, 스티렌-부타디엔 공중합체, 메틸메타크릴레이트-부타디엔 공중합체, 아크릴로니트릴-부타디엔 공중합체 등)로 이루어지는 입자, 그 이외의 공중합체(예를 들면, 스티렌-스티렌 설폰산염 공중합체, 메타크릴산 에스테르 공중합체, 아크릴산 에스테르 공중합체, 염화 비닐-아크릴산 에스테르 공중합체 등)로 이루어지는 입자를 들 수 있다. 관능기로서 카르복실기, 1급 아미노기, 카르바모일기(－CONH₂), 수산기, 알데히드기 등을 가지고, 또한, 기체가 상기 유기계 미립자로 이루어지는 입자를 들 수 있다.

라텍스 입자에 항체를 고상하는 방법으로는, 공지의 방법에 준해서 실시하면 되고, 예를 들면, 항체와 라텍스 입자를 완충액 중에서 현탁시켜서 25℃에서 1시간 반응시킨 후, 원심 분리, 블로킹 처리 등, 통상 이 분야에서 실시되는 처리에 의해 얻을 수 있다. 또, 항체와 라텍스 입자를 화학 결합에 의해 고상하는 방법이나, 비오틴-아비딘 반응에 의해 항체를 고상하는 방법도 선택할 수 있다.

라텍스 입자에 항체를 결합시킬 때는, 항체가 상기 TAT에 대한 반응성 및 특이성을 유지할 수 있는 조건으로 실시한다.

바람직한 시약을 조제하기 쉬운 점에서, 제1 항체를 고상한 제1 라텍스 입자, 제2 항체를 고상한 제2의 라텍스 입자로서 항체의 종류마다 고상 라텍스 액을 조제할 수도 있고, 1종류의 라텍스 입자에 제1 항체와 제2 항체를 고상시켜서 시약을 조제할 수도 있다. 항체와 라텍스 입자를 어떻게 고상시켜서 시약을 조제할 것인가는 당업자라면 적절하게 설계할 수 있다.

본 발명의 시약에 적용할 수 있는 피검시료는 TAT를 함유할 가능성이 있는 피검시료인 한, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 생체 시료인 점이 바람직하고, 포유동물 유래의 시료인 것이 보다 바람직하며, 사람 유래의 시료인 것이 더욱 바람직하다. 생체 유래의 시료로서는, 혈청, 혈장을 특히 바람직하게 사용할 수 있다. 바람직하게는, 헤파린(예를 들면, 종농도 1~2U/mL)이 투여된 사람 유래의 혈액 시료이고, 더욱 바람직하게는, 헤파린이 투여된 사람 유래 혈장의 측정에 특히 바람직하게 사용할 수 있다. 포유동물 유래의 시료인 것이 바람직하고, 사람 유래의 시료인 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 시약은 1시약계여도 좋고, 2시약계여도 좋다. 본 발명의 시약이 1시약계인 경우는, 생체 시료에 상기 제1 및 제2 항체를 각각 고상한 라텍스 입자 현탁액과 브롬화 헥사디메트린 등의 폴리 양이온을 포함하는 반응액을 첨가하여, 항원 항체 반응을 일으키게 함으로써, 생체 시료 중의 TAT를 측정할 수 있다. 본 발명의 시약이 2시약계인 경우에는, 완충액 성분을 주체로 해서 브롬화 헥사디메트린 등의 폴리 양이온을 포함하는 제1 시약을 생체 시료에 첨가한 후, 추가로 상기 제1 항체, 제2 항체를 각각 고상한 라텍스 입자를 포함하는 제2 시약을 첨가함으로써, 항원 항체 반응을 일으키게 하여 생체 시료 중의 TAT를 측정할 수 있다. 또, 폴리 양이온을 항체 결합 라텍스 입자와 함께 제2 시약에 함유시켜도 좋다. 보다 정확하게 측정하려면 2시약계가 바람직하다.

폴리 양이온으로서는 시료 중의 헤파린과 결합해서 헤파린과 안티트롬빈의 결합을 저해하는 것이면 좋지만, 예를 들면, 이하와 같은 것을 사용할 수 있다.

천연으로 생기는 폴리 양이온으로서는, 메틸 글리콜 키토산 등의 키토산류, 디에틸 아미노 에틸 변성 덱스트란 등의 변성 덱스트란, 아미노 덱스트란, 히드록시 메틸 셀룰로오스 트리 메틸 아민, 라이소자임, 스페르민, 스페르미딘, 폴리 리신, 폴리아르기닌, 폴리오르니틴, 황산 프로타민, 히드록시 에틸 셀룰로오스 트리 메틸 아민 및 단백질을 들 수 있다.

단백질로서는, 헤파린에 결합하는 성질을 가지고 있으면 좋고, 헤파린 결합 모티프 펩티드로서 이미 알려진 BXXB, BBXB, BBBXXB, BXXBBXB(여기서, B는 염기성 아미노산, X는 임의의 아미노산을 의미한다)의 배열을 가지는 단백질 펩티드를 사용할 수 있다. 구체적으로는, 활성화 제X인자, 헤파린 결합성 성장 인자, 락토페린, 트랜스페린, 비트로넥틴, 엔도뉴클레아제, 리파아제, 스테로이드 수용체, 히스톤 등의 DNA 결합 단백질, PF4 등이다.

합성 폴리 양이온의 예는, 폴리 알릴 아민, 염산 폴리 알릴 아민, 폴리(디알릴 디알킬 아민), 폴리아미드 아민, 폴리아민, 염화 폴리 비닐 벤질 트리 메틸 암모늄, 브롬화 헥사디메트린, 염화 폴리 디알릴 디메틸 암모늄, 폴리 에틸렌 이민, 폴리 프로필렌 이민, 폴리 프로필 에틸렌 이민, 폴리이미다졸린, 폴리 비닐 아민, 폴리 비닐 피리딘, 폴리(아크릴 아미드/브롬화 메타크릴 옥시 프로필 트리 메틸 암모늄), 폴리(염화 디아릴 디메틸 암모늄/N－이소프로필 아크릴 아미드), 폴리(디메틸 아미노 에틸 아크릴레이트/아크릴 아미드), 폴리 디메틸 아미노 에틸 메타크릴레이트, 폴리디메틸아미노 에피클로로히드린, 폴리에틸렌이미노 에피클로로히드린, 브롬화 폴리 메타크릴 옥시 에틸 트리 메틸 암모늄, 염화 히드록시 프로필 메타크릴옥시 에틸 디메틸 암모늄, 폴리(메틸 디에틸 아미노 에틸 메타크릴레이트/아크릴 아미드), 폴리(메틸/구아니딘), 브롬화 폴리 메틸 비닐 피리디늄, 폴리(비닐 피롤리돈-디메틸 아미노 에틸 메타크릴레이트) 및 브롬화 폴리 비닐 메틸 피리디늄이다.

이들 폴리 양이온 중에서는, 브롬화 헥사디메트린, 폴리 에틸렌 이민, 폴리 프로필 에틸렌 이민 등의 폴리 알킬렌 아민, 황산 프로타민, 폴리 리신, 폴리오르니틴, 아미노 덱스트란 등을 들 수 있고, 특히, 브롬화 헥사디메트린 혹은 황산 프로타민을 사용하는 것이 바람직하다.

폴리 양이온의 분자량으로서는, 질량 평균 분자량으로 수백~수백 만이 알려져 있지만, 본 발명에서 바람직하게 이용할 수 있는 것은, 분자량 1,000~100,000이며, 보다 바람직하게는 1,000~10,000의 폴리 양이온을 사용할 수 있다.

폴리 양이온은, 반응계에 최종 농도 0.0002~1w/v%로 존재시키는 것이 바람직하고, 0.0005~0.1w/v%로 존재시키는 것이 보다 바람직하며, 0.001~0.05w/v%로 존재시키는 것이 더욱 바람직하다.

라텍스 입자 상에는, 통상 SO^3-이나 SO^4-, COO^-와 같은 마이너스 충전이 존재하기 때문에, 시약 중에 폴리 양이온을 첨가하는 것은 측정 대상물의 비존재하에서도 폴리 양이온의 플러스 충전에 의해 응집이 유발되는 것을 쉽게 생각할 수 있고, 측정계에 대한 영향이 우려되기 때문에 통상은 사용이 망설여지는 것이다. 그러나 본 발명자는 검체 중에서 헤파린이 안티트롬빈과 결합하여 생기는 안티트롬빈 다량체가 브롬화 헥사디메트린 등의 폴리 양이온에 의해 해리되는 것을 발견했다. 상기 폴리 양이온을 사용함으로써, 이러한 부작용(응집)을 일으키지 않고, 헤파린에 의한 영향만을 회피하여 정확하게 TAT를 측정할 수 있었던 것은 의외였다.

라텍스 입자의 응집 정도는, 예를 들면 흡광도를 이용해서 측정하고, 미리 구해놓은 표준품의 검량선으로부터 그 농도를 구함에 따라서, 검체 중의 TAT 농도를 정량할 수 있다. 또한, 흡광도의 측정 파장은, 통상 340nm~1000nm, 바람직하게는 500nm~900nm로 측정하면 좋다. 라텍스 응집 반응을 측광하는 시간은, 라텍스 응집 반응이 생기는 시간을 시간당 변화 속도, 혹은 일정시간의 변화량에 따라서 측광할 수 있다. 예를 들면, 흡광도를 측정하는 경우, 라텍스 응집 반응이 시작되고 나서 30초 후부터 5분 후의 시간당 흡광도 변화 속도, 혹은 일정시간의 흡광도 변화량에 따라서 측광할 수 있다. 반응 온도는 10~50℃인 것이 바람직하고, 20~40℃인 것이 보다 바람직하다. 반응 시간은 적당히 결정할 수 있고, 예를 들면 범용 자동 분석기에서는 10~15분간의 반응 시간으로 측정할 수 있다. 또한, 당업자라면 광학 기기 혹은 범용 자동 분석기를 이용한 분석에서, 공지한 방법에 따라, 반응 온도, 반응 시간, 측정 파장, 측정 시간, 시약 구성, 라텍스 농도, 라텍스 고정화하는 항체 농도, 각종 첨가제 농도를 적절하게 결정할 수 있다.

본 발명에 이용되는 라텍스 입자의 농도는, 라텍스 응집법에 따른 면역학적 측정 시약에 적용할 수 있는 농도이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, TAT를 측정하기 위해서 필요한 반응시의 라텍스 입자의 농도는 0.005w/v%~0.2w/v%가 바람직하고, 0.01w/v%~0.1w/v%인 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 시약은, 항체를 고정화한 라텍스 입자 이외에도, 라텍스 응집법에 따른 면역학적 측정 시약에 첨가 가능한 첨가제, 예를 들면, 완충액, 응집 촉진제, 비특이 반응 억제제, 증감제 등을 더욱 함유할 수 있다. 본 발명의 시약에 첨가 가능한 증감제로서는, 알긴산 나트륨이나 알긴산 프로필렌 글리콜 등을 들 수 있다. 또, 본 발명의 시약에 첨가 가능한 응집 촉진제로서는, 수용성 고분자나 단백질이 바람직하게 이용된다. 예를 들면, 덱스트란이나 덱스트란 황산, 폴리 비닐 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리 비닐 피롤리돈 등의 수용성 고분자나, 소혈청알부민 등의 알부민류, γ－글로불린 등의 글로불린류를 들 수 있다.

상기 완충액으로서는, 예를 들면, pH5.8~6.6에 완충능력을 가지는 완충액을 사용할 수 있다. 6.0~6.4인 것이 보다 바람직하고, 6.1~6.3인 것이 더욱 바람직하며, 6.15~6.25인 것이 특히 바람직하다. 1시약계이면 시약의 pH가 상기 범위로 조정되고 있으면 좋고, 2시약계이면 혼합했을 때에 pH가 상기 범위가 되도록 구성되어 있으면 좋다. 예를 들면, 완충액 성분을 주체로 한 제1 시약과, 항체를 고상한 라텍스 입자를 포함하는 제2 시약으로 구성되는 경우에, 제1 시약의 pH가 상기 범위로 조정되고, 두 시약을 혼합했을 때에 혼합액의 pH가 상기 범위가 되도록 하는 형태를 들 수 있다.

pH는 pH 조절제로 조절되어도 좋지만, 완충액으로 조정되는 것이 바람직하다. 트리스 완충액, 비스 트리스 완충액, 인산 완충액, 또는 구드 완충액 등이 바람직하게 사용되고, 반응시의 완충액 농도는 10~500mmol/L인 것이 바람직하며, 20~200mmol/L인 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 시약에 첨가할 수 있는 비특이 반응 억제제로서는, 비특이 반응의 원인 물질에 대한 항체나 수용체, 트리스 완충액, 인산 완충액, 글리신 완충액, 붕산 완충액, 구연산 완충액, 아세트산 완충액 또는 구드 완충액 등의 완충액류, EDTA, CyDTA, DTPA, EGTA, NTA, NTP 등의 킬레이트제, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 황산나트륨, 황산칼슘, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산나트륨 등의 염류, 지방산 디에탄올 아미드, 폴리 옥시 에틸렌 알킬 에테르, 폴리 옥시 에틸렌 알킬 페닐 에테르, 지방산 소르비탄 에스테르, 알킬 폴리 글루코시드, 알킬 모노 글리세릴 에테르, 폴리 옥시 에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 지방산 알카놀 아미드, 알킬 글리코시드 등의 비이온성 계면활성제를 들 수 있다.

본 발명의 시약은, 표준 물질로서 사용할 수 있는 TAT를 포함해도 좋다. TAT는 생체로부터 정제된 TAT여도 좋고, 유전자 재조합 등으로 합성된 TAT여도 좋다. 합성 TAT로서는, 예를 들면, 생물 제제로서 입수 가능한 트롬빈과 안티트롬빈을 시험관 내에서 배양해서 얻을 수 있다. 또, 대장균이나 포유동물 세포, 바큐로 바이러스를 감염시킨 곤충 세포 등에서, 이미 알려진 번역 발현계를 사용하여 발현시킨 것을 회수해서 정제한 것을 혼합하여 TAT를 합성할 수도 있다.

실시예

실시예 1 합성 TAT의 조제

시판하는 사람 트롬빈 제제(일본 혈액제제기구제)와 안티트롬빈 제제(일본 혈액제제기구제)를 PBS(다르벡코 PBS(－) 분말 「닛스이(닛스이 제약 주식회사제)」를 9.6g/L로 용해)로 희석하고, 1:3의 몰비로 혼합한 후, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 30분 후, DFP(플루오르 인산 디이소프로필, 와코쥰야꾸사제)를 0.75mM가 되도록 첨가해서 반응을 정지했다.

얻어진 반응물에는 미반응 트롬빈, 안티트롬빈이 포함되기 때문에, 미리 500mM의 NaCl을 포함하는 50mM Tris－HCl 완충액(pH7.4)으로 평형화한 Hiload 26/60 Superdex 200 HR(GE 헬스케어사제)로 정제했다.

TAT 획분은 SDS－PAGE로 확인한 후에 회수했다. 얻어진 TAT는 0.5%의 BSA를 포함하는 생리 식염수로 희석하고, CLEIA 시약(스테이시아(등록상표) CLEIA TAT, LSI 메디엔스사제)을 이용해서 수치를 정했다. 이것을 합성 TAT로서 사용했다.

실시예 2 항TAT 항체의 조제

세포 융합법은, 안도 다미에·이와사키 다쓰오/저서 「단일 클론 항체/혼성 세포와 ELISA」(고단샤)에 따라서 실시했다.

실시예 1에서 조제한 합성 TAT 50㎍을 프로인트 완전 아쥬반트(DIFCO사제)와 혼합하여 투여 항원으로 했다.

BALB/c 마우스(암컷, 4주령)에 2주 간격으로 3회 투여하고, 4회째 투여는 절반량인 25㎍를 정주(靜注)했다.

1주일 후, 비장으로부터 림프구를 분리하여, 골수종 세포 P3x63-Ag. 8과 혼합한 후, 폴리에틸렌 글리콜(PEG4000, 머크사제)을 이용해서 세포 융합을 실시했다.

HAT 선택 배지에 의해 혼성 세포를 선택하여, 1주일 후에 목적으로 하는 항체를 생성하는 혼성 세포를 합성 TAT에 대한 결합 활성을 지표로 스크리닝했다. 즉, 0.05M의 탄산 완충액(pH9.5)에서 합성 TAT를 각각 0.2㎍/mL으로 희석하고, 이뮤노 플레이트(Maxisorp, NUNC사제)에 50μL/웰을 첨가했다. 4℃에서 밤새 반응시킨 후, 0.05% Tween-20을 포함하는 PBS로 3회 세정하고, 1.0% BSA를 포함하는 PBS를 각 웰에 100μL 첨가하여 블로킹을 실시했다.　그 다음, 배양 상청 각 웰에 50μL 첨가하고, 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 0.05% Tween-20을 포함하는 PBS로 3회 세정했다. 퍼옥시다제 표지 항마우스 이뮤노 글로불린 항체(Dako사제)를 0.05% Tween-20을 포함하는 PBS로 1000배로 희석해서, 각 웰에 50μL 첨가했다.

37℃1시간 반응 후, 마찬가지로 5회 세정하여 o-페닐렌 디아민 용액(와코쥰야꾸사제)을 각 웰에 50μL 첨가했다. 실온에서 5~10분간 반응시킨 후, 2N 황산 용액으로 반응을 정지했다.

플레이트 분광 광도계(EL312e, BIO－TEK INSTRUMENTS사제)로 492nm의 흡광도를 측정했다. 합성 TAT와의 반응이 양호한 항체를 생성하는 세포를 선택하여, 한계 희석법으로 복제를 실시했다. 10일 후, 스크리닝을 실시하여, 합성 TAT와 반응하는 항체를 생성하는 혼성 세포를 취득했다.

실시예 3 항트롬빈 항체의 조제

실시예 2와 동일한 방법으로 면역 항원을 트롬빈으로 하여 항트롬빈 항체를 얻었다. 트롬빈에 대해서 특이적으로 반응하는 항체를 선택하고, 이 중 1클론을 항트롬빈 항체(T-1)로 사용했다.

실시예 4 간접 저해 ELISA에 의한 항체 특이성의 평가

간접 저해 ELISA법에 따라서, 각 항체의 반응성을 평가했다. 간접 저해 ELISA법에 따른 반응계의 모식도를 도 2에 나타낸다.

평가하고자 하는 0.04~0.4㎍/mL 농도의 TAT를 인식하는 항체(항TAT 항체) 후보를 저해 항원(프로트롬빈(엔자임 리서치사제), 트롬빈, 안티트롬빈, 합성 TAT)과 혼합하여 배양했다. 일부 저해된 상기 항체 후보를 일차 항체로 하여 96 웰 플레이트에 고상화 한 합성 TAT와 결합시켰다. 또, 퍼옥시다제 표지 항마우스 이뮤노 글로불린 항체(Dako사제)를 2차 항체로서 결합시키고, 발색 기질을 첨가하여 흡광도를 측정했다. 또, 발색의 변화율로부터 항체의 잔존율을 계산했다.

특정의 항체(TAT-5)에 대해서, 각 저해 항원을 이용했을 때의 흡광도를 표 1에, 흡광도로부터 계산된 항체의 잔존율을 표 2에 나타냈다.

예를 들면, TAT의 저해 항원 농도가 10㎍/mL일 때의 잔존율은 285/1066×100=26.7(%)이다. 각 항체의 각 항원 농도에 대해서 잔존율을 산출했다. 또, 표 중에서, Pro-T는 프로트롬빈을, T는 트롬빈을, AT는 안티트롬빈을 나타낸다.

[표 1]

[표 2]

또, 안티트롬빈 50㎍/mL로 저해하였을 때의 잔존율과 동등한 저해율이 되는 TAT 항원량을 산출하여 비교함으로써, 안티트롬빈에 대한 TAT의 반응성 차이(배율)를 구했다. 이 차이가 크면, 안티트롬빈과 비교해서 TAT에 대한 특이성이 강한 것을 의미한다. 계산은 TAT의 저해 곡선(저해항원 첨가농도 대비 수-잔존율%)을 그려서, 스플라인 함수를 이용하여 실시했다.

예를 들면, TAT-5의 경우, 안티트롬빈 50㎍/mL의 잔존율은 74.0%이고, 그 잔존율과 같아지는 TAT 항원량은 1.144㎍/mL이다. 즉, 반응성의 차이는 50/1.144=44배이다(도 3).

그 외에, 항체 클론 27종류에 대해서 상기 배율을 계산했다. 첨가 TAT와 안티트롬빈 양의 차이(배율)가 100배 이상이 되는 항체는 13종류, 1000배 이상이 되는 항체는 7종류, 10000배 이상이 되는 항체는 2종류 존재했다. 5종류의 항체에 대해서, 표 3에 나타낸다.

[표 3]

실시예 5 헤파린 첨가 혈장(모델 검체)에서의 브롬화 헥사디메트린의 효과

제1 시약: 100mM　Bis－tris(도진가가쿠사제)　pH6.2, 700mM NaCl(와코쥰야꾸사제), 0.05% 에마르겐 150(카오사제), 0.20% 알긴산 나트륨(와코쥰야꾸사제), 0.15%　BSA(시그마 알드리히사제), 0.05% 브롬화 헥사디메트린(시그마 알드리히사제)을 제1 시약으로 이용했다. 또, 비교예는 상기 제1 시약에서 브롬화 헥사디메트린을 제외한 것을 이용했다.

제2 시약: TAT에 대한 반응성이 안티트롬빈에 대한 반응성의 100배 이상인 TAT의 안티트롬빈측에 반응하는 마우스 단일 클론 항체 TAT-1을 흡착한 폴리스티렌 라텍스 입자와 항트롬빈 마우스 단일 클론 항체를 흡착한 폴리스티렌 라텍스 입자를, 각 항체 감작 입자가 700nm에서의 흡광도가 1.0이 되도록 0.05% 아지화 나트륨 용액으로 희석해서 혼합한 것(제2 시약A: 라텍스 입자 농도 0.01%), 혹은 TAT에 대한 반응성이 안티트롬빈에 대한 반응성의 100배 이상인 TAT의 안티트롬빈측에 반응하는 마우스 단일 클론 항체를 흡착한 폴리스티렌 라텍스 입자만을 700nm에서의 흡광도가 1.0이 되도록 0.05% 아지화 나트륨 용액으로 희석해서 혼합한 것(제2시약B)을 각각 제2 시약으로 이용했다.

샘플: 헤파린나트륨 주「다나베」(다나베 미쓰비시 제약사제)를 1 또는 2U/mL가 되도록 첨가한 정상인 합동 혈장 또는 헤파린 미첨가의 정상인 합동 혈장을 각각 측정했다.

측정 기기: 7170S(히타치 하이테크놀로지즈사제)

파라미터: 샘플량 12μL, 제1 시약 90μL, 제2 시약 90μL, 주파장 570nm, 부파장 800nm으로 설정하고, 측광 포인트 34포인트째 흡광도로부터 20포인트째 흡광도를 공제한 것을 ΔAbs로 하여 측정했다.

결과·고찰

결과를 도 4에 나타낸다. 비교예(브롬화 헥사디메트린 없음)의 제1 시약을 이용한 경우, 제2 시약 A, B 모두 헤파린의 농도 의존적인 비특이적 응집이 동일한 정도로 인정된 것에 대해서, 실시예(브롬화 헥사디메트린 있음)의 제1 시약을 이용한 경우는 모두 응집이 보이지 않았다. 이것으로부터, 헤파린-안티트롬빈 복합체에 의한 비특이적 응집은 TAT의 안티트롬빈 측을 인식하는 항체를 흡착한 입자에 의해서 유발되고, 브롬화 헥사디메트린을 첨가함으로써 헤파린-안티트롬빈 복합체가 해소되는 점이 시사되었다.

실시예 6 브롬화 헥사디메트린 첨가량의 검토

제1 시약: 브롬화 헥사디메트린 첨가량을 0~0.05w/v% 사이에서 변화시킨 것 외에는 실시예 5와 동일.

제2 시약: 실시예 5의 제2 시약A를 이용했다.

샘플: 헤파린 나트륨 주 「다나베」를 2U/mL 첨가한 정상인 합동 혈장 또는 헤파린 나트륨 주 「다나베」를 2U/mL 첨가하여, TAT 농도가 50ng/mL가 되도록 혈청을 첨가한 정상인 합동 혈장

측정 기기·파라미터: 실시예 5와 동일하게 실시했다.

결과·고찰: 결과를 도 5, 도 6에 나타낸다. 2U/mL의 헤파린에 대해서, 0.0005%(종농도 0.0002%)의 브롬화 헥사디메트린(폴리브렌) 첨가로 효과가 나타났다. 또, 0.05%(종농도% 0.023%) 첨가까지 헤파린 무첨가의 베이스 혈장으로 브롬화 헥사디메트린의 플러스 충전에 유래하는 라텍스 입자의 비특이적 응집이 생기지 않는 것이 확인되었다. 따라서, 브롬화 헥사디메트린은 0.0005%(종농도 0.0002%) 이상이 바람직하고, 0.005%(종농도 0.002%) 이상이 더욱 바람직하다는 것을 알았다.

또, 도 6(a)에 나타난 바와 같이, 폴리 양이온의 첨가에 의해서도, 목적으로 하는 TAT 검출 반응에 큰 영향을 미치지 않는 것이 확인되었다. 도 6(b)는 베이스 라인 부근을 확대한 도면이다.

실시예 7 황산 프로타민의 효과

제1 시약: 브롬화 헥사디메트린을 대신해서 황산 프로타민(와코쥰야꾸사제)의 첨가량을 0~0.01w/v% 사이에서 변화시킨 것 외에는 실시예 5와 동일하게 조제하였다.

제2 시약: 실시예 5의 제2 시약A를 이용했다.

샘플: 헤파린 나트륨 주 「다나베」를 2U/mL 첨가한 정상인 합동 혈장 측정 기기·파라미터: 실시예 5와 동일하게 실시했다.

결과·고찰

결과를 도 7에 나타낸다. 황산 프로타민을 첨가하지 않았던 경우에 비해서, 황산 프로타민을 0.001%(종농도 0.0005%) 이상 첨가한 경우에는, 헤파린 첨가 혈장의 흡광도가 큰 폭으로 감소하여 개선을 볼 수 있었다. 게다가, 황산 프로타민을 0.01%(종농도 0.005%) 첨가한 경우에는 브롬화 헥사디메트린 첨가시와 마찬가지로, 헤파린 첨가에 의한 비특이적 응집이 거의 억제당하는 것이 확인되었다. 따라서, 황산 프로타민은 0.001%(종농도 0.0005%) 이상이 바람직하고, 0.01%(종농도 0.005%) 이상이 보다 바람직하다는 것을 알았다.

실시예 8 실검체에서의 브롬화 헥사디메트린의 효과

제1 시약: 실시예 5와 동일함.

제2 시약: 실시예 5의 제2 시약 A, B를 이용했다.

샘플: 비특이 반응이 확인된 점에서, 헤파린 제제가 투여되었다고 추정되는, 구연산 Na 혈장(검체 1, 2) 2검체를 이용했다.

측정 기기·파라미터: 실시예 5와 동일하게 실시했다.

결과·고찰

결과를 도 8에 나타낸다. 브롬화 헥사디메트린을 첨가하지 않을 때는 제2 시약A, 제2 시약B 중에서 어느 하나를 이용한 경우에도 높은 신호가 검출되었다. 한편, 브롬화 헥사디메트린의 첨가로 인해 비특이적 응집이 해소되고, 제2 시약A, 즉 2종류의 항체를 사용한 경우에 TAT 특이적인 검출이 가능하게 되었다. 이상으로부터, 실제 혈장 검체에서도 브롬화 헥사디메트린의 효과가 확인되었다.

이상과 같이, 검체 중에서 헤파린이 안티트롬빈과 결합함으로써 생기는 안티트롬빈 다량체가 브롬화 헥사디메트린 등의 폴리 양이온에 의해 해리하는 것은 본 발명자가 발견한 뜻밖의 효과이다. 폴리 양이온을 사용함으로써, 이러한 부작용이 발생하지 않고, 헤파린에 의한 영향만을 회피하여 TAT를 정확하게 측정하는 것이 가능해졌다.

Claims (8)

1. 피검자 유래의 혈액 시료 중의 트롬빈 안티트롬빈 복합체(TAT)를 라텍스 응집법에 따라서 측정하기 위한 시약으로서, 상기 피검자는 헤파린이 투여된 환자이고, 상기 시약은 헤파린과 결합할 수 있는 폴리 양이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 시약.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 폴리 양이온이 브롬화 헥사디메트린, 키토산류, 변성 덱스트란, 아미노 덱스트란, 히드록시 메틸 셀룰로오스 트리 메틸 아민, 라이소자임, 스페르민, 스페르미딘, 폴리 리신, 폴리아르기닌, 폴리오르니틴, 황산 프로타민, 히드록시 에틸 셀룰로오스 트리 메틸 아민, 헤파린 결합 단백질, 폴리 알릴 아민, 염산 폴리 알릴 아민, 폴리(디알릴 디알킬 아민), 폴리아미드 아민, 폴리아민, 염화 폴리 비닐 벤질 트리 메틸 암모늄, 염화 폴리 디알릴 디메틸 암모늄, 폴리 에틸렌 이민, 폴리 프로필렌 이민, 폴리 프로필 에틸렌 이민, 폴리이미다졸린, 폴리 비닐 아민, 폴리 비닐 피리딘, 폴리(아크릴 아미드/브롬화 메타크릴 옥시 프로필 트리 메틸 암모늄), 폴리(염화 디아릴 디메틸 암모늄/N－이소프로필 아크릴 아미드), 폴리(디메틸 아미노 에틸 아크릴레이트/아크릴 아미드), 폴리 디메틸 아미노 에틸 메타크릴레이트, 폴리디메틸아미노 에피클로로히드린, 폴리에틸렌이미노 에피클로로히드린, 브롬화 폴리 메타크릴 옥시 에틸 트리 메틸 암모늄, 염화 히드록시 프로필 메타크릴옥시 에틸 디메틸 암모늄, 폴리(메틸 디에틸 아미노 에틸 메타크릴레이트/아크릴 아미드), 폴리(메틸/구아니딘), 브롬화 폴리 메틸 비닐 피리디늄, 폴리(비닐 피롤리돈-디메틸 아미노 에틸 메타크릴레이트)및 브롬화 폴리 비닐 메틸 피리디늄으로 이루어지는 군에서 선택되는, 시약.
4. 제1항에 있어서,
   상기 폴리 양이온이 브롬화 헥사디메트린, 폴리 에틸렌 이민, 폴리 프로필 에틸렌 이민 등의 폴리 알킬렌 아민, 황산 프로타민, 폴리 리신, 폴리오르니틴 및 아미노 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는, 시약.
5. 제1항, 제3항 또는 제4항에 있어서,
   상기 시약이, 라텍스에 결합한 안티트롬빈 측에 결합해서 TAT를 인식하는 제1 항TAT 항체와, 라텍스에 결합한 트롬빈 측에 결합해서 TAT를 인식하는 제2 항TAT 항체를 포함하는, 시약.
6. 제5항에 있어서,
   상기 제1 항TAT 항체가 TAT에 대한 반응성이 유리 안티트롬빈에 대한 반응성의 100배 이상인 항체인, 시약.
7. 피검자 유래의 혈액 시료 중에 존재하는 TAT를 측정하는 방법으로써, 상기 피검자는 헤파린이 투여된 환자이고, 상기 방법은 제1항, 제3항 또는 제4항에 기재된 시약을 이용하여 라텍스 응집법을 실시함으로써 TAT를 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 삭제

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