KR102527520B1 - 직업성 천식 진단용 조성물 및 이를 이용한 직업성 천식 진단방법 - Google Patents

직업성 천식 진단용 조성물 및 이를 이용한 직업성 천식 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 직업성 천식 진단용 조성물 및 이를 이용한 직업성 천식 진단방법에 관한 것으로, 직업성 천식을 진단할 수 있는 바이오마커에 대하여 제시된다. 본 발명의 발명자들은 직업성 천식 바이오마커 발굴을 위하여 직업성 천식의 생체 대사산물 모니터링 데이터베이스를 구축하기 위하여 직업성 천식이 유발된 동물 모델을 구축하고, 동물 모델의 대사물질에 대한 분석을 통해 특정 물질이 직업성 천식의 바이오마커임을 확인하였다. 본 발명에 따르면 직업성 천식에 대한 대사산물의 프로파일링 및 패턴 분석을 통해 바이오마커를 제공함으로써 검체의 시료에서 직업성 천식을 쉽게 구별할 수 있기 때문에 직업성 천식 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

직업성 천식 진단용 조성물 및 이를 이용한 직업성 천식 진단방법{Composition for diagnosis of occupational asthma and method for diagnosis of occupational asthma using the same}
본 발명은 직업성 천식 진단용 조성물 및 이를 이용한 직업성 천식 진단방법에 관한 것이다.
일반적으로 천식(asthma)은 만성 기도 염증 및 기도과민성을 특징으로 하는 폐질환으로, 대기오염물질, 황사, 알레르겐(allergen) 등에 의하여 발생된다. 천식은 색색거리는 천명, 호흡곤란, 재채기, 심한 경우 산소부족으로 인한 청색증 및 흉통을 나타낸다.
직업성 천식(occupational asthma)은 직업상 취급하는 물질이나 작업 과정 중에 생산되는 중간물질 또는 최종산물이 원인으로 관여하는, 즉 직업으로 인해 발생하는 천식을 의미한다. 산업화된 국가에서의 직업성 호흡기 질환 중 가장 흔한 질환으로서, 성인에서 발현되는 천식의 약 9~15%에 해당한다. 세계적으로 연간 발병률은 근로자 100만 명당 12~170명으로 알려져 있다. 직업성 천식이 발병하기 쉬운 직업으로는 페인트 분무자, 제빵제과업자, 화학공장 및 화학물 취급자, 동물 실험자, 용접공, 식품공장 및 제약공장 종사자, 간호사 등이 있다. 직업성 천식은 특징적으로 작업장에 있을 때 증상이 더 악화되고, 작업장에서 벗어났을 때 증상이 호전된다. 이러한 증상이 작업장의 물질에 의한 것일 경우 직업성 천식으로 정의된다.
직업성 천식을 진단하는 방법은 특수건강검진을 통해 발견되는데, 주로 비특이적 기관지 과민성, 피부 단자 시험, IgE 특이 시험, 폐활량 측정 검사, 장업장에서의 최고 호기 유속 및 특수 흡기 유발 검사 등의 진단 방법을 통한 검진 방법을 통한다.
직업성 천식을 유발하는 것으로 가장 잘 알려진 물질로는 디이소시아네이트(diisocyanate)가 있으며, TDI(toluene diisocyanate), MDI(diphenyl-methane diisocyanate), HDI(hexamethylene diisocyanate)로 나뉘어 진다. 차량시트, 소파, 침대, 접착제, 폴리우레탄 도료, 단열재, 자동차부품공장 등에서 사용되는 것으로 알려져 있다. 이러한 물질에 노출되면 기도상피세포에서는 활성 산소뿐만 아니라 여러 가지 싸이토카인을 분비하여 다양한 염증반응세포들을 기도로 이동시킴으로써 천식을 유발하게 된다(Shin YS, Kim MA, Pham LD, Park HS. Cells and mediators in diisocyanate-induced occupational asthma. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2013;13(2):125-31).
천식의 증상이 발생하기 전에도 기도 내에서는 다양한 정도의 염증 반응이 진행된다. 천식의 증상 발현 이전에 기도의 염증을 확인하기 위해서는 조직검사 등의 침습적인 방법이 보다 정확하지만, 검사의 위험성과 유용성 측면에서 모든 환자에게 적용하기에 제한점이 있다. 따라서, 천식의 조기 발견, 치료와 예후 예측을 위한 수단으로서 바이오마커의 중요성이 날로 커지고 있으며, 바이오마커를 발굴하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있으나, 아직까지 연구자들 간에 합의를 도출하여 임상에서 널리 쓰이는 것은 거의 없다(Allergy Asthma Respir Dis 4(1):4-13, January 2016, Biomarkers of adult asthma and personalized medicine).
또한, 직업성 천식은 일반적인 천식과 분리하여 진단과 치료가 이루어져야 하나 직업성 천식에 대한 체계적인 기전연구가 되어 있지 않기 때문에 아직까지 진단과 치료에 어려움을 겪고 있다.
이에 본 발명자들은 직업성 천식의 바이오마커를 발굴하여 직업성 천식의 생체 대사산물 모니터링 데이터베이스를 구축하기 위하여 직업성 천식이 유발된 동물 모델을 구축하고, 동물 모델의 대사물질에 대한 분석을 통해 특정 물질이 직업성 천식의 바이오마커임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허 제10-2019-0003117호 대한민국 공개특허 제10-2019-0029087호
따라서, 본 발명의 목적은, 직업성 천식을 유도한 천식 마우스 모델을 구축하고, 직업성 천식을 진단하기 위한 신규 바이오마커를 제공하는 것이다.
이상에서의 본 발명에서 해결하고자 하는 다양한 과제들은 이에 한정하는 것이 아니라, 후술할 실시예 및 청구범위에 기재된 사항을 통하여 본 발명이 속하는 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 분명하게 이해될 수 있을 것이다.
전술한 목적을 달성하기 위해 본 발명에 따른 직업성 천식의 진단을 위한 정보제공 방법은 검체로부터 분리된 시료 내 오르니틴(ornithine), 5-메틸우리딘(5-methyluridine), 3-하이드록시뷰티르산(3-hydroxybutyric acid), 1-메틸히스티딘(1-methylhistidine), 스페르민(spermine), 트리고넬린(trigonelline), NG-메틸아르기닌(NG-methylarginine), 감마-하이드록시라이신(γ-hydroxylysine) 및 시스-우로칸산(cis-urocanic acid) 농도를 측정하는 단계; 및, 상기 측정된 농도를 정상 대조군 시료의 농도와 비교하는 단계; 를 포함한다.
여기서 상기 측정된 농도는 과황산암모늄(Ammonium persulfate, APS)으로 유도된 직업성 천식 동물 모델의 폐 조직 또는 폐포세포의 대사산물 농도일 수 있다.
또한, 상기 시료는 피부조직, 신경조직, 폐조직, 전혈, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 소변, 타액, 비액, 객담, 골수, 양수, 복수 및 질 분비물 중에 선택되는 것일 수 있다.
또한, 상기 정상 대조군 시료의 농도와 비교하는 단계는, 정상 대조군 시료의 농도에 비하여 측정된 농도가 유의미하게 높은 경우에 직업성 천식으로 판단하는 것 일 수 있다.
본 발명의 다른 일실시예에 따른 직업성 천식 진단용 조성물은 오르니틴(ornithine), 5-메틸우리딘(5-methyluridine), 3-하이드록시뷰티르산(3-hydroxybutyric acid), 1-메틸히스티딘(1-methylhistidine), 스페르민(spermine), 트리고넬린(trigonelline), NG-메틸아르기닌(NG-methylarginine), 감마-하이드록시라이신(γ-hydroxylysine) 및 시스-우로칸산(cis-urocanic acid) 의 농도를 측정하는 제제를 포함한다.
또한, 본 발명의 다른 일실시예에서 직업성 천식 치료제의 스크리닝 방법은 검체로부터 분리된 세포 또는 분리된 조직에 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 상기 후보물질 처리군에서 오르니틴(ornithine), 5-메틸우리딘(5-methyluridine), 3-하이드록시뷰티르산(3-hydroxybutyric acid), 1-메틸히스티딘(1-methylhistidine), 스페르민(spermine), 트리고넬린(trigonelline), NG-메틸아르기닌(NG-methylarginine), 감마-하이드록시라이신(γ-hydroxylysine) 및 시스-우로칸산(cis-urocanic acid) 의 농도를 측정하는 단계; 및, 상기 측정된 오르니틴(ornithine), 5-메틸우리딘(5-methyluridine), 3-하이드록시뷰티르산(3-hydroxybutyric acid), 1-메틸히스티딘(1-methylhistidine), 스페르민(spermine), 트리고넬린(trigonelline), NG-메틸아르기닌(NG-methylarginine), 감마-하이드록시라이신(γ-hydroxylysine) 및 시스-우로칸산(cis-urocanic acid) 의 농도가 처리전보다 유의미하게 감소하면 상기 후보물질을 직업성 천식 치료제로 선택하는 단계를 포함한다.
전술한 바와 같은 본 발명에 따르면 직업성 천식에 대한 대사산물의 프로파일링 및 패턴 분석을 통해 바이오마커를 제공함으로써 검체의 시료에서 직업성 천식을 쉽게 구별할 수 있기 때문에 직업성 천식 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
이상에서의 본 발명에 따른 효과는 상기에 한정되는 것은 아니며, 기타 본 발명의 효과들은 후술할 실시예 및 청구범위에 기재된 사항을 통하여 본 발명이 속하는 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 분명하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 BALF 내 전체 세포 (total cell), 대식세포 (macrophage), 호산구 (eosinophils), 호중구 (neutrophil), 림프구 (lymphocyte)의 세포 수를 나타낸 것이다.
도 2는 BALF 내 IL-4, IL-5, total IgE의 농도를 나타낸 것이다.
도 3은 83종의 대사산물들의 volcano plot 볼케이노 플랏 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 대사산물들의 PCA score plot, PLS-DA score plot, PLS-DA의 VIP score 상위 5개의 대사산물을 나타낸 것이다.
도 5는 P-value 상위 5개의 대사산물들의 unsupervised hierarchical clustering 과 heatmap 결과를 나타낸 것이다.
먼저, 본 발명을 설명하기 앞서 본 발명에서 용어 ‘을 포함하는(comprising)’이란 ‘함유하는(including)’또는 ‘특징으로 하는(characterized by)’과 동일한 의미로 사용되며, 본 발명에 따른 조성물 또는 방법에 있어서, 구체적으로 언급되지 않은 추가적인 구성 성분 또는 방법의 단계 등을 배제하지 않는다. 또한 용어 ‘로 구성되는(consisting of)’이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 ‘필수적으로 구성되는(essentially consisting of)’이란, 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 물질 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계 등을 포함할 수 있는 것을 의미한다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명하도록 한다.
본 발명은 직업성 천식 진단용 조성물 및 이를 이용한 직업성 천식 진단방법에 관한 것으로, 직업성 천식을 진단할 수 있는 바이오마커에 대하여 제시된다.
본 발명의 발명자들은 직업성 천식 바이오마커 발굴을 위하여 직업성 천식의 생체 대사산물 모니터링 데이터베이스를 구축하기 위하여 직업성 천식이 유발된 동물 모델을 구축하고, 동물 모델의 대사물질에 대한 분석을 통해 특정 물질이 직업성 천식의 바이오마커임을 확인하였다. 본 발명에 따르면 직업성 천식에 대한 대사산물의 프로파일링 및 패턴 분석을 통해 바이오마커를 제공함으로써 검체의 시료에서 직업성 천식을 쉽게 구별할 수 있기 때문에 직업성 천식 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
구체적으로 본 발명은 동물 모델의 83종 대사산물 중에 직업성 천식의 바이오마커 후보군으로 오르니틴(ornithine), 5-메틸우리딘(5-methyluridine), 3-하이드록시뷰티르산(3-hydroxybutyric acid), 1-메틸히스티딘(1-methylhistidine), 스페르민(spermine), 트리고넬린(trigonelline), NG-메틸아르기닌(NG-methylarginine), 감마-하이드록시라이신(γ-hydroxylysine) 및 시스-우로칸산(cis-urocanic acid)을 선정하였으며, 이들의 통계 분석을 통해 과황산암모늄(Ammonium persulfate, APS)에 유도된 동물 모델의 폐포세포 내에서 농도가 유의미하게 증가하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일실시예에서 검체로부터 분리된 시료 내 오르니틴(ornithine), 5-메틸우리딘(5-methyluridine), 3-하이드록시뷰티르산(3-hydroxybutyric acid), 1-메틸히스티딘(1-methylhistidine), 스페르민(spermine), 트리고넬린(trigonelline), NG-메틸아르기닌(NG-methylarginine), 감마-하이드록시라이신(γ-hydroxylysine) 및 시스-우로칸산(cis-urocanic acid) 농도를 측정하는 단계 및, 상기 측정된 농도를 정상 대조군 시료의 농도와 비교하는 단계를 포함하는 직업성 천식의 진단을 위한 정보제공 방법을 제시한다.
본 발명에서 검체로부터 분리된 시료는 피부조직, 신경조직, 폐조직, 전혈, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 소변, 타액, 비액, 객담, 골수, 양수, 복수 및 질 분비물 중에 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폐 조직일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 농도 측정 방법은 당업계에서 공지되어 있는 방법은 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 웨스턴 블랏팅(western blotting), 닷 블랏팅(dot blotting), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사능 면역분석법(RIA), 방사면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 면역조직 화학염색, 면역침전법(immunoprecipitation), Sandwich ELISA법, 보체 고정 분석법, 유세포 분석법(FACS) 또는 단백질 칩, 크로마토그래피, 기체 크로마토그래피 방법 등이 있으나, 이들에 제한되지 않는다.
본 발명에서 제시되는 바이오마커는 과황산암모늄(Ammonium persulfate, APS)으로 유도된 직업성 천식 동물 모델의 폐 조직 세포의 대사산물의 농도로서 판별될 수 있다. 본 발명에서 직업성 천식 동물 모델은 기관지폐포세척액(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)으로부터 면역세포의 분화와 IL-4, IL-5, IgE를 측정하였다. 대조군과 비교하여 호중구의 유의미한 증가, 호산구와 림프구의 유의미한 증가를 보인다.
과황산암모늄(Ammonium persulfate)은 소맥분 표백제로 지칭하는 것으로 과황산암모늄은 무색 결정 또는 백색의 결정성 분말로서 독한 매운 냄새가 난다. 화학식이 (NH4)2S2O8이다. 과황산암모늄은 독성이 약하나 다량 섭취시 인체에 유해하고 피부에 장기간 접촉 시 부식을 일으키는 것으로 알려져 있다. 그러나 과황산암모늄의 독성연구가 완벽히 진행된 바 없어 밀가루에 허용되는 양이 정해져 있지 않다. 통상적으로 소맥분에 분말 또는 수용액으로 첨가하는데 이스트 푸드에 배합해서 사용된다. 또한 소맥분의 표백 효과 외에도 숙성 작용 및 빵의 용적률을 증대하며 조직 개량에 도움을 주어 빵의 품질을 향상시킨다. 본 발명에서는 제빵에 사용되는 과황산암모늄(Ammonium persulfate)의 직업성 천식 관계를 확인하였으며, 과황산암모늄으로 유발되는 직업성 천식의 바이오마커를 통한 진단에 관하여 설명된다.
본 발명에서 바이오마커는 오르니틴(ornithine), 5-메틸우리딘(5-methyluridine), 3-하이드록시뷰티르산(3-hydroxybutyric acid), 1-메틸히스티딘(1-methylhistidine), 스페르민(spermine), 트리고넬린(trigonelline), NG-메틸아르기닌(NG-methylarginine), 감마-하이드록시라이신(γ-hydroxylysine) 및 시스-우로칸산(cis-urocanic acid) 중에 적어도 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 오르니틴(ornithine) 또는 3-하이드록시뷰티르산(3-hydroxybutyric acid)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 더욱 바람직하게는 본 발명에서 바이오마커의 전체 농도를 확인함으로써 직업성 천식 진단에 이용될 수 있다.
또한, 본 발명에서 직업성 천식으로 판단은 정상 대조군 시료의 농도와 비교하는 단계에서 정상 대조군 시료의 바이오마커 농도에 비하여 측정된 바이오마커 농도가 유의미하게 높은 경우에 직업성 천식으로 판단될 수 있다.
검체로부터 분리된 시료에서 측정한 바이오마커의 농도 수준은 정상 대조군과 비교하여 증가한 검체를 직업성 천식으로 판단하는 것이다. 통상적으로 바이오마커의 농도의 변화가 있는지 확인하기 위해서 다수의 정상 대조군의 시료로부터 바이오마커의 농도를 측정하여 정상 범위의 기준을 세운다. 따라서, 본 발명에서는 제시되는 각 바이오마커 마다 정상 범위의 농도 기준을 정하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 바이오마커의 농도를 측정하는 제제를 포함하는 직업성 천식 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 바이오마커는 오르니틴(ornithine), 5-메틸우리딘(5-methyluridine), 3-하이드록시뷰티르산(3-hydroxybutyric acid), 1-메틸히스티딘(1-methylhistidine), 스페르민(spermine), 트리고넬린(trigonelline), NG-메틸아르기닌(NG-methylarginine), 감마-하이드록시라이신(γ-hydroxylysine) 및 시스-우로칸산(cis-urocanic acid) 중에 적어도 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 오르니틴(ornithine) 또는 3-하이드록시뷰티르산(3-hydroxybutyric acid)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 상기 진단용 조성물은 각 바이오마커의 농도를 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 조성물일 수도 있고, 유효성분으로서 각 바이오마커의 농도를 측정하는 제제로 이루어진 조성물일 수도 있으며, 또는 유효성분으로서 각 바이오마커의 농도를 측정하는 제제가 필수적으로 구성되는 조성물일 수도 있다.
농도를 측정할 수 있는 제제의 예로서, 3-하이드록시뷰티르산(3-hydroxybutyric acid)의 활성을 측정하기 위한 제제는 3-하이드록시뷰티르산 (Ketone Body) Colorimetric Assay Kit (Cayman) 등과 같은 3-하이드록시뷰티르산(3-hydroxybutyric acid)의 기질, 3-하이드록시뷰티르산(3-hydroxybutyric acid)으로 생성되는 반응 산물을 측정하기 위한 제제 또는 효소와 기질, 반응 조효소, 반응인자, 이온, 그리고 정량화를 위하여 표준 곡선(standard curve)을 도출하는 데 필요한 반응 산물의 표준 용액 등을 이용하여 측정될 수 있다.
본 발명은 다른 실시예로서, 상기 직업성 천식 진단용 조성물을 포함하는, 직업성 천식 진단 키트를 제공한다.
본 발명에서 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트 또는 래피드(rapid) 키트 중에 적절하게 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 직업 천식 진단 키트는 분석 방법따라 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
예를 들어 상기 진단용 키트는 바이오마커를 확인하기 위해 역전사 중합효소반응을 수행할 수 있는 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. RT-PCR (역전사 중합효소반응) 키트는 상기 바이오마커의 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 각 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 상기 바이오마커의 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 본 발명의 바이오마커들에 대한 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 항체는 각 바이오마커에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 바이오마커의 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체를 이용하는 것이 바람직하다. 또한 ELISA 키트는 대조군에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 항체와 컨주게이트된 효소 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 직업성 천식 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 직업성 천식 치료제의 스크리닝 방법은 오르니틴(ornithine), 5-메틸우리딘(5-methyluridine), 3-하이드록시뷰티르산(3-hydroxybutyric acid), 1-메틸히스티딘(1-methylhistidine), 스페르민(spermine), 트리고넬린(trigonelline), NG-메틸아르기닌(NG-methylarginine), 감마-하이드록시라이신(γ-hydroxylysine) 및 시스-우로칸산(cis-urocanic acid)로 이루어진 바이오마커 중에 적어도 하나 이상을 이용할 수 있다.
구체적으로 검체로부터 분리된 세포 또는 분리된 조직에 치료제 후보물질을 처리하는 단계,
상기 후보물질 처리군에서 오르니틴(ornithine), 5-메틸우리딘(5-methyluridine), 3-하이드록시뷰티르산(3-hydroxybutyric acid), 1-메틸히스티딘(1-methylhistidine), 스페르민(spermine), 트리고넬린(trigonelline), NG-메틸아르기닌(NG-methylarginine), 감마-하이드록시라이신(γ-hydroxylysine) 및 시스-우로칸산(cis-urocanic acid) 의 농도를 측정하는 단계 및,
상기 측정된 오르니틴(ornithine), 5-메틸우리딘(5-methyluridine), 3-하이드록시뷰티르산(3-hydroxybutyric acid), 1-메틸히스티딘(1-methylhistidine), 스페르민(spermine), 트리고넬린(trigonelline), NG-메틸아르기닌(NG-methylarginine), 감마-하이드록시라이신(γ-hydroxylysine) 및 시스-우로칸산(cis-urocanic acid) 의 농도가 처리전보다 감소하면 상기 후보물질을 직업성 천식 치료제로 선택하는 단계를 포함하여 구성된다.
본 발명의 용어, "직업성 천식 치료제 후보물질"은 통상적인 선정방식에 따라 천식 또는 직업성 천식 치료의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 또는 화합물 등이 될 수 있다.
본 발명의 “직업성 천식 치료제의 스크리닝 방법”은, 직업성 천식에 상기 바이오마커가 관련됨을 확인함으로써, 측정된 바이오마커의 농도를 치료제 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하는 방식으로 이용될 수 있다.
직업성 천식을 예방 또는 치료할 수 있는 후보물질의 부재 하에 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물에서의 상기 바이오마커들의 농도 수준을 측정하고, 또한, 상기 후보물질의 존재 하에서 농도 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 상기 후보물질이 존재할 때의 바이오마커의 농도 수준이 상기 후보물질의 부존재 하에서의 수준보다 감소시키는 물질을 직업성 천식의 예방 또는 치료용 제제로 예측할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.
<실시예 1> 과황산암모늄(Ammonium persulfate, APS) 유도 직업성 천식 마우스 모델 구축 및 대사물질 프로파일링
1-1 동물모델 준비
감작을 위해 1, 4, 8, 11일에 대조군 (n=10)과 APS유도 마우스 모델 (n=9)에 인산완충생리식염수(phosphate buffer saline, PBS)와 과황산암모늄(Ammonium persulfate, APS) (117.3 mg/kg/day)를 기도 내에 각각 투여 하였다.
이어서 챌린지를 위해 15, 16, 17일에 대조군과 APS 유도 마우스 모델에 각각 PBS(VC)와 APS (117.3mg/kg/day)를 기도 내에 추가 투여하였다.
19일 째 대조군과 마우스 모델을 검시하여 폐 조직 시료를 얻은 후 시료를 전처리하여 기체크로마토그래프-텐덤질량분석기와 액체크로마토그래프-텐덤질량분석기를 이용하여 유기대사물질들에 대한 프로파일 분석을 수행하였다.
1-2 실험결과
(1) APS로 유도한 직업성 천식 동물 모델이 잘 구축되었는지 확인하기 위해 기관지폐포세척액(bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 내에 면역세포의 분화와 IL-4, IL-5, IgE를 측정하였다. 대조군과 비교하여 폭발적인 호중구의 증가, 호산구와 림프구의 큰 증가를 확인하였다(도 1). 또한 IgE의 증가를 확인하였고, IL-4와 IL-5는 큰 증가를 보이지 않았다(도 2).
이는 기존에 비강내 투여하였던 방법에 비해서 기도 내로 직접 투여하여 투여 물질이 직접 폐로 진입하는 것으로 정확한 동물 모델을 구축하였다.
<실시예 2> 직업성 천식을 진단하기 위한 신규 잠재적 바이오마커 탐색
상기 실시예 1에서 새롭게 구축된 APS 유도 직업성 천식 마우스 모델의 폐조직에서 유기대사산물에 대한 프로파일과 패턴분석을 통하여 직업성 천식을 진단하기 위한 잠재적 바이오마커 탐색을 수행하였다.
구체적으로 직업성 천식 유도 마우스 모델과 대조군 마우스의 폐 조직을 균질화, 단백질 제거, 추출, 필터, 유도체화 등의 전처리를 수행한 뒤 기체 크로마토그래프-텐덤질량분석기와 액체크로마토그래프-텐덤 질량분석기를 이용하여 유기대사물에 대한 프로파일 분석을 수행하였다.
구체적으로, 마우스 모델에서 얻은 폐 조직의 전처리는 초음파를 이용한 폐 조직의 균질화, 아세토니트릴 첨가를 통한 단백질 제거, 액체-액체상 추출 및 필터를 하였으며, 유기산의 유도체화는 메톡시아민 하이드로클로라이드(methoxiamine hydrochloride)을 첨가하여 MO(methoxime) 유도체화 후, N-메틸-N-(터트-뷰틸디메틸실릴) 트리플루오로아세트아미드(N-metyl-N-(tertbutyldimethylsilyl) trifluoroacetamide)를 첨가하여 TBDMS(tert-butyl dimethylsilyl) 유도체화를 진행하였다. 지방산의 유도체화는 N-메틸-N-(터트-뷰틸디메틸실릴) 트리플루오로아세트아미드(N-metyl-N-(tertbutyldimethylsilyl) trifluoroacetamide)를 첨가하여 TBDMS(tert-butyl dimethylsilyl) 유도체화를 진행하였다. 폴리아민의 유도체화는 에틸 클로로포메이트(Ethyl chloroformate)를 첨가하여 EOC(ethoxycarbonyl)유도체화 후 펜타플로로프로피오닉 언하이드라이드(pentafluoropropionic anhydride)를 첨가하여 PFP(pentafluoropropionyl유도체화를 진행하였다.
정량분석을 수행한 유기대사산물들에 대하여 바이오마커 탐색을 위해 많이 활용되는 통계 분석인 volcano plot, multivariate analysis 중에 주성분 분석(principle component analysis, PCA)과 부분 최소 제곱 판별 분석(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA), 그리고 자율계층 클러스터링 히트맵(unsupervised hierarchical clustering heatmap)을 수행하였다.
대조군과 APS유도 직업성 천식 마우스의 폐 조직에서 각각 83종의 대사산물을 확인할 수 있었다. 이후, 확인된 83종의 대사산물을 이용하여 통계분석을 수행하였다.
2-1 볼케이노 플랏(volcano plot)
볼케이노 플랏(volcano plot)을 통해 p-values (0.05 <p; Wilcoxon-rank test)와 2-fold change를 모두 만족하는 오르니틴(ornithine), 5-메틸우리딘(5-methyluridine), 3-하이드록시뷰티르산(3-hydroxybutyric acid), 1-메틸히스티딘(1-methylhistidine)과 스페르민(spermine)의 5종의 대사산물을 확인하였다. (도 3)
2-2 PCA 및 PLS-DA
PCA를 통해 PC1 (35.7%)와 PC2 (31.1%)로 두 그룹을 클러스터링 할 수 있었고, PLS-DA를 통해 component1 (35%)와 component2 (18.9%)로 두 그룹을 클러스터링 할 수 있었다. PLS-DA의 VIP score 상위 5개의 대사산물을 평가한 결과 3-하이드록시뷰티르산(3-hydroxybutyric acid), 5-메틸우리딘(5-methyluridine), 오르니틴(ornithine), 트리고넬린(trigonelline) 및, NG-메틸아르기닌(NG-methylarginine)이 두 그룹을 차별화할 수 있는 대사산물로 평가되었다. (도 4)
3-3 Heatmap 분석
Heatmap 분석을 통해 p-value (0.05 <p; Wilcoxon-rank test) 순으로 평가해 보았을 때 트리고넬린(trigonelline), 감마-하이드록시라이신 (γ-hydroxylysine), 3-하이드록시뷰티르산(3-hydroxybutyric acid), 오르니틴(ornithine) 및 시스-우로칸산(cis-urocanic acid)의 5종의 대사산물 만으로도 두 그룹을 명확하게 클러스터링 할 수 있었다(도 5).
측정된 83종의 대사산물들을 이용하여 volcano plot, PCA와 PLS-DA 그리고 heatmap의 통계 분석을 통해 대사산물들을 평가한 결과, 유의하게 나타난 바이오마커를 확인하였으며, 이들 바이오마커는 직업선 천식을 진단 또는 치료 하는데 활용될 수 있다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명되었으나, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

  1. 검체로부터 분리된 시료 내 오르니틴(ornithine), 5-메틸우리딘(5-methyluridine), 3-하이드록시뷰티르산(3-hydroxybutyric acid), 1-메틸히스티딘(1-methylhistidine), 스페르민(spermine), 트리고넬린(trigonelline), NG-메틸아르기닌(NG-methylarginine), 감마-하이드록시라이신(γ-hydroxylysine) 및 시스-우로칸산(cis-urocanic acid) 농도를 측정하는 단계; 및,
    상기 측정된 농도를 정상 대조군 시료의 농도와 비교하는 단계;
    를 포함하는 직업성 천식의 진단을 위한 정보제공 방법으로써,
    상기 측정된 농도는 과황산암모늄(Ammonium persulfate, APS)으로 유도된 직업성 천식 동물 모델의 폐 조직 또는 폐포세포의 대사산물 농도인 것을 특징으로 하는 직업성 천식의 진단을 위한 정보제공 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 시료는 피부조직, 신경조직, 폐조직, 전혈, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 소변, 타액, 비액, 객담, 골수, 양수, 복수 및 질 분비물 중에 선택되는 것을 특징으로 하는 직업성 천식의 진단을 위한 정보제공 방법.
  4. 제1항에 있어서, 정상 대조군 시료의 농도와 비교하는 단계는, 정상 대조군 시료의 농도에 비하여 측정된 농도가 높은 경우에 직업성 천식으로 판단하는 것을 특징으로 하는 직업성 천식의 진단을 위한 정보제공 방법.
  5. 오르니틴(ornithine), 5-메틸우리딘(5-methyluridine), 3-하이드록시뷰티르산(3-hydroxybutyric acid), 1-메틸히스티딘(1-methylhistidine), 스페르민(spermine), 트리고넬린(trigonelline), NG-메틸아르기닌(NG-methylarginine), 감마-하이드록시라이신(γ-hydroxylysine) 및 시스-우로칸산(cis-urocanic acid) 의 농도를 측정하는 제제를 포함하는 직업성 천식 진단용 조성물으로써,
    상기 농도 측정은 과황산암모늄(Ammonium persulfate, APS)으로 유도된 직업성 천식 동물 모델의 폐 조직 또는 폐포세포의 대사산물의 농도를 측정한 것인, 조성물.
  6. 제5항의 조성물을 포함하는 직업성 천식 진단 키트.
  7. 검체로부터 분리된 세포 또는 분리된 조직에 치료제 후보물질을 처리하는 단계;
    상기 후보물질 처리군에서 오르니틴(ornithine), 5-메틸우리딘(5-methyluridine), 3-하이드록시뷰티르산(3-hydroxybutyric acid), 1-메틸히스티딘(1-methylhistidine), 스페르민(spermine), 트리고넬린(trigonelline), NG-메틸아르기닌(NG-methylarginine), 감마-하이드록시라이신(γ-hydroxylysine) 및 시스-우로칸산(cis-urocanic acid) 의 농도를 측정하는 단계; 및,
    상기 측정된 오르니틴(ornithine), 5-메틸우리딘(5-methyluridine), 3-하이드록시뷰티르산(3-hydroxybutyric acid), 1-메틸히스티딘(1-methylhistidine), 스페르민(spermine), 트리고넬린(trigonelline), NG-메틸아르기닌(NG-methylarginine), 감마-하이드록시라이신(γ-hydroxylysine) 및 시스-우로칸산(cis-urocanic acid) 의 농도가 처리전보다 감소하면 상기 후보물질을 직업성 천식 치료제로 선택하는 단계를 포함하는, 직업성 천식 치료제의 스크리닝 방법으로써,
    상기 농도 측정은 과황산암모늄(Ammonium persulfate, APS)으로 유도된 직업성 천식 동물 모델의 폐 조직 또는 폐포세포의 대사산물의 농도를 측정한 것인, 스크리닝 방법.
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