KR102526056B1 - 식물성 콜라겐의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 우수한 피부 재생, 보습 및 피부 장벽 강화 효과를 갖는 식물성 콜라겐을 제조하는 방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 우수한 피부 재생, 보습 및 피부 장벽 강화 효과를 갖는 식물성 콜라겐을 제조하는 방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
콜라겐은 피부, 뼈, 머리카락 등을 구성하는 단백질의 일종으로, 특히 피부 진피층과 결합 조직을 구성하는 주성분이다. 콜라겐은 피부의 탄력과 보습을 담당하는 주요 성분이나, 노화와 함께 그 양이 점차 줄어 40대 이후에는 절반 수준으로 감소된다. 피부 노화 지연 및 개선에 대한 관심이 높아지면서, 콜라겐을 포함하는 화장품에 대한 수요가 증가하고 있다.
동물성 콜라겐이나 해양성 콜라겐을 사용한 다양한 제품이 제안되었으나, 안정성 면에서 식물성 콜라겐이 선호되면서 이에 관한 연구 개발이 꾸준히 진행되고 있다. 일례로, 등록특허 10-1783469는 금화규로부터 수용성 식물성 콜라겐을 용출시키는 단계를 포함하는 식물성 콜라겐의 추출 방법을 개시하고 있다. 그러나, 종래의 추출 방법으로 제조된 콜라겐은 피부 재생, 보습 및 피부 장벽 강화에 충분한 효과를 발휘하지 못하는 바, 피부 노화 지연 및 개선에 보다 우수한 효과를 갖는 식물성 콜라겐의 개발이 요구된다.
본 발명은 우수한 피부 재생, 보습 및 피부 장벽 강화 효과를 갖는 식물성 콜라겐을 제조하는 방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 식물성 콜라겐의 제조방법은 식물로부터 식물 추출물을 제조하는 단계, 상기 식물 추출물을 효소로 처리하여 식물성 단백질을 제조하는 단계 및 상기 식물성 단백질을 알코올에 침전하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 식물성 콜라겐은 우수한 피부 재생, 보습 및 피부 장벽 강화 효과를 제공한다. 본 발명에 따라 제조된 식물성 콜라겐은 콜라겐을 구성하는 주요 아미노산인 GPH(글리신(Glycine), 프롤린(Proline) 및 하이드록시 프롤린(Hydroxy Proline))의 함량이 높고, 동물성 콜라겐이나 종래 제조방법에 따른 식물성 추출물에 비해 독성이 낮은 동시에, 피부 재생, 보습 및 피부 장벽 강화 효과가 우수하다.
도 1은 본 발명에 따라 제조된 식물성 콜라겐의 세포 독성 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따라 제조된 식물성 콜라겐의 피부 재생 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따라 제조된 식물성 콜라겐의 세포 독성 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 식물성 콜라겐의 보습 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따라 제조된 식물성 콜라겐의 피부 장벽 강화 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따라 제조된 식물성 콜라겐의 피부 재생 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따라 제조된 식물성 콜라겐의 세포 독성 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 식물성 콜라겐의 보습 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따라 제조된 식물성 콜라겐의 피부 장벽 강화 효과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명에 대하여 설명한다. 그러나, 하기 내용에 의해서만 한정되는 것은 아니며, 필요에 따라 각 구성요소가 다양하게 변형되거나 선택적으로 혼용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 사상 및 기술범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 식물성 콜라겐의 제조방법은 식물로부터 식물 추출물을 제조하는 단계, 상기 식물 추출물을 효소로 처리하여 식물성 단백질을 제조하는 단계 및 상기 식물성 단백질을 알코올에 침전하는 단계를 포함한다.
<식물성 콜라겐의 제조방법>
식물 추출 단계
본 발명에 따른 식물성 콜라겐의 제조방법은 식물로부터 식물 추출물을 제조하는 단계를 포함한다.
상기 식물은 작약꽃(Paeonia albiflora), 퀴노아, 오트, 동백꽃, 튤립, 자주개자리씨 및 병풀로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이들에 제한되는 것은 아니다.
상기 식물의 추출 방법으로는 공지의 방법을 사용할 수 있고, 예를 들어, 초고압 고온 추출, 열수 추출, 알코올 추출, 마이크로웨이브 추출, 초임계 추출 및 초음파 추출로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 방법이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
추출 용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 에틸에테르, 헥산 및 1,3-부틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다. 일례로, 상기 추출 용매는 물 또는 에탄올, 예를 들어 70 %(v/v) 에탄올일 수 있다. 바람직하게는 상기 추출 용매는 물일 수 있다.
식물과 추출 용매의 혼합비는 1 : 1 내지 100 중량비, 예를 들어 1 : 20 내지 40 중량비일 수 있다. 식물에 대한 추출 용매의 혼합비가 전술한 범위 미만인 경우 식물 성분이 충분히 추출되지 않을 수 있고, 전술한 범위를 초과하는 경우 사용되는 용매 량에 비해 적은 수율을 얻게 되어 비효율적이다.
상기 추출은 초고압 고온 조건하에서 수행될 수 있다. 일례로, 압력이 1 내지 20 psi, 예를 들어 10 내지 20 psi이고, 온도가 60 내지 150 ℃, 예를 들어 100 내지 150 ℃인 조건 하에서 수행될 수 있다. 전술한 조건으로 추출하는 경우, 콜라겐을 높은 효율로 추출할 수 있다. 일례로, 상기 추출은 15 psi, 125 ℃인 조건 하에서 수행될 수 있다.
상기 추출은 1 내지 3회 수행될 수 있다. 일례로, 상기 추출은 2회 수행될 수 있다.
효소 처리 단계
본 발명에 따른 식물성 콜라겐의 제조방법은 상기 식물 추출물을 효소로 처리하여 식물성 단백질을 제조하는 단계를 포함한다.
상기 효소는 파파인, 펩신, 콜라게나아제, 트립신, 알칼라아제, 브로멜라인, 터마밀 및 플라보자임으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질 분해 효소를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조된 식물 추출물을 냉각한 후 상기 효소를 첨가하고, 30 내지 70 ℃, 예를 들어 55 내지 65 ℃에서 1 내지 8 시간, 예를 들어4 내지 6 시간 동안 가수분해 반응을 진행시킬 수 있다. 전술한 조건을 벗어나는 경우, 효소가 충분히 활성화되지 못할 수 있다.
상기 효소는 해당 기술분야에 공지된 양으로 첨가될 수 있고, 예를 들어, 식물 추출물 총 중량을 기준으로 0.001 내지 1 중량%, 예를 들어 0.1 중량% 첨가될 수 있다.
상기 가수 분해된 용액을 70 내지 100 ℃, 예를 들어 85 내지 95 ℃에서 0.5 내지 3 시간, 예를 들어 0.5 내지 1.5 시간 동안 가온하여 첨가된 효소를 실활시킨다.
상기 효소의 실활 후, 상기 가수 분해된 용액을 냉각한 후 여과한다. 여과 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 0.2 내지 150 μm, 예를 들어 0.4 내지 0.5 μm 필터(filter)를 사용하여 여과할 수 있다.
알코올 침전 단계
본 발명에 따른 식물성 콜라겐의 제조방법은 상기 식물성 단백질을 알코올에 침전하여 식물성 콜라겐을 제조하는 단계를 포함한다.
상기 알코올은 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급 알코올로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다. 일례로, 상기 알코올은 에탄올일 수 있다.
상기 제조된 식물 단백질과 알코올의 혼합비는 1 : 2 내지 5의 중량비, 예를 들어 1 : 3의 중량비일 수 있다. 식물 단백질에 대한 알코올의 혼합비가 전술한 범위 미만인 경우, 콜라겐 침전이 충분히 발생하지 못할 수 있다.
상기 혼합비로 혼합한 후, 20 내지 30 ℃에서 0.5 내지 24 시간, 예를 들어 상온에서 1 시간 방치한다. 방치 시간이 전술한 범위 미만인 경우 콜라겐이 충분히 응집되지 않을 수 있고, 전술한 시간을 초과하더라도 추가적인 응집이 발생되지 않을 수 있다.
상기 침전 후, 상기 용액을 여과한다. 여과 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 0.2 내지 150 μm 필터(filter)를 사용하여 여과할 수 있다.
여과 후, 필요에 따라 세정 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 에탄올, 예를 들어 70 %(v/v) 에탄올을 사용하여 상기 여과물을 세정할 수 있고, 1 내지 3회 세정할 수 있다.
<화장료 조성물>
본 발명의 화장료 조성물은 전술한 방법으로 제조된 식물성 콜라겐을 포함한다. 화장료 조성물 총 중량을 기준으로, 상기 식물성 콜라겐을 0.001 내지 20 중량%, 예를 들어 0.01 내지 5 중량% 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 탈크, 색소 등을 더 포함할 수 있고, 산화 방지제, 방부제 등 해당 기술분야에서 통상 사용되는 첨가제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 해당 기술분야에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 스프레이 등의 제형으로 제조될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 어떠한 의미로든 본 발명의 범위가 실시예로 한정되는 것은 아니다.
[제조예]
작약꽃과 증류수를 1 : 30의 중량비로 혼합한 후, 15 psi의 압력, 125 ℃의 온도 하에서 2회 추출하여 작약꽃 추출물을 제조하였다. 상기 작약꽃 추출물을 냉각한 후, 작약꽃 추출물 총 중량을 기준으로 파파인 0.1 중량%를 투입하여 60 ℃에서 5 시간 동안 가수분해시켰다. 상기 가수 분해된 용액을 90 ℃에서 1시간 동안 가온하여 파파인을 실활시킨 후, 상기 용액을 냉각한 후 0.45 μm 필터로 여과하여 작약꽃 단백질을 제조하였다.
상기 제조된 작약꽃 단백질과 에탄올을 1 : 3의 중량비로 혼합한 후, 상온에서1 시간 동안 방치하였다. 이후 상기 용액을 40 μm 필터로 여과한 후, 70 %(v/v) 에탄올로 2회 세정하여 작약꽃 콜라겐을 제조하였다.
[아미노산 성분 분석]
상기 제조예의 작약꽃 단백질 및 작약꽃 콜라겐의 아미노산 성분을 분석하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 작약꽃 단백질을 구성하는 총 아미노산 중 콜라겐을 구성하는 주요 아미노산인 GPH(글리신(Glycine), 프롤린(Proline) 및 하이드록시 프롤린(Hydroxy Proline))의 농도는 9.18 중량%인 데 비하여, 작약꽃 콜라겐을 구성하는 총 아미노산 중 GPH의 농도는 17.29 중량%로 높게 나타났다.
[재생 효과 실험]
세포 독성 시험(MTT assay)
상기 제조예의 작약꽃 콜라겐 및 동물성 콜라겐(300 Da, Fish Collagen)을 사용하여, MTT assay에 따라 세포 독성 시험을 실시하였다. 구체적으로, HaCaT 세포주를 96 well plate에 well 당 적정 농도로 200 μL 분주하고 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터 조건 하에 24 시간 배양하였다. 배양된 세포에 샘플을 농도 별로 처리한 후, 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터 조건 하에 24 시간 배양하였다. 배양 완료 3시간 전 5 mg/mL MTT 20 μL 처리 후 3 시간 동일 조건으로 배양하였다. 배양 완료 후 배양액을 버리고 DMSO 150 μL 분주 후 상온에서 10 분 교반하였다. Microplate reader(Thermo, UV/Vis)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 (실험군 흡광도/대조군 흡광도) X 100 수식으로 도출하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 작약꽃 콜라겐은 50 μg/mL 농도 이하에서 세포 독성을 나타내지 않았고, 해당 농도에서 후술의 재생 효능 평가를 진행하였다.
재생 효능 평가(Wound healing assay)
상기 제조예의 작약꽃 콜라겐 및 동물성 콜라겐(300 Da, Fish Collagen)을 사용하여, Wound healing assay에 따라 재생 효능 평가를 실시하였다. 구체적으로, HaCaT 세포주를 24 well plate에 well 당 적정 농도로 1 mL 분주하고, 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터에서 24 시간 배양한 후 분주한 각질 형성 세포에 피펫 끝으로 scratch(긁힘, 손상)를 유도하고, 0 시간대에 세포층의 이미지를 현미경 사진으로 찍었다. 이후, 세포층에 샘플을 농도 별로 처리한 후 48 시간 동안 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 추가 배양한 후, 48 시간대 세포층의 이미지를 현미경 사진으로 찍어 Cell migration을 측정하였다. 0 시간대에 비하여 48 시간 후의 scratch 면적이 감소할수록 세포 이동능이 우세한 것으로, 피부 재생의 효능이 높은 것으로 평가될 수 있다.
도 2에 나타난 바와 같이, 작약꽃 콜라겐은 동물성 콜라겐에 비해 우수한 피부 재생 효과를 나타내었다.
[보습 및 장벽 강화 효과 실험]
세포 독성 시험(MTT assay)
상기 제조예의 작약꽃 콜라겐 및 동물성 콜라겐(300 Da, Fish Collagen)을 사용하여, MTT assay에 따라 세포 독성 평가를 실시하였다. 구체적으로, HaCaT 세포주를 96 well plate에 well 당 적정 농도로 200 μL 분주하고, 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터 조건 하에 24 시간 배양하였다. 배양된 세포에 샘플을 농도 별로 처리한 후, 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터 조건 하에 24 시간 배양하였다. 배양 완료 3시간 전 5 mg/mL MTT 20 μL 처리 후, 3 시간 동일 조건으로 배양하였다. 배양 완료 후 배양액을 버리고 DMSO 150 μL 분주 후 상온에서 10 분 교반하였다. Microplate reader(Thermo, UV/Vis)를 이용하여 570 nm에서 흡광도 측정하였다. 세포 생존율은 (실험군 흡광도/대조군 흡광도) X 100 식으로 도출하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 작약꽃 콜라겐은 100 μg/mL 농도 이하에서 세포 독성을 나타내지 않았고, 해당 농도에서 후술의 보습 및 장벽 강화 효과 실험을 진행하였다.
보습/장벽 강화 효능 평가(qRT-PCR)
상기 제조예의 작약꽃 콜라겐 및 동물성 콜라겐(300 Da, Fish Collagen)을 사용하여, qRT-PCR에 따라 보습 및 장벽 강화 효능 평가를 실시하였다. 구체적으로, HaCaT 세포주를 60 mm dish에 well 당 적정 농도로 4 mL 분주하고, 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터에서 24 시간 배양하였다. 배양된 세포에 Serum starvation 24 시간 진행 후 샘플을 농도 별로 처리하고, 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터 조건 하에 24 시간 배양하였다. 배양 완료 후, Trizol(Invitrogen) 1 mL 처리하여 RNA 추출하고, 클로로포름, 2-프로판올, 75 % EtOH 및 원심분리기를 사용하여 RNA 응축 및 워싱을 진행하였다. RNA 건조 후 Nuclease free water 적정량을 넣고 Nano drop(ALLSHENG)을 이용하여 정량하였다. 각 RNA를 동일 농도가 되도록 제조한 후, cDNA Synthesis Kit(PhileKorea) 이용하여 Reverse transcription 하였다. 합성된 cDNA 및 Primer(보습/장벽 인자 Oligonucleotide), SYBR green, Nuclease free water를 적정 비율로 혼합한 후, Real time PCR 장비(Applied Biosystem, Quantstudio 5)를 사용하여 RT-qPCR을 실행하였다. PCR 결과 분석은 △△Ct 값을 산출하여 유전자의 발현을 비교하였다. 효능 평가 시 사용한 인자는 보습/장벽 강화 기능을 보유한 인자이기 때문에 음성 대조군 대비 샘플의 mRNA 발현이 높게 측정될수록 보습/장벽 강화 효능이 높은 것으로 평가될 수 있다.
도 4에 나타난 바와 같이, 작약꽃 콜라겐은 동물성 콜라겐에 비해 AQP3, HAS2 발현 효과가 높게 나타났고, 이는 우수한 보습 효과를 나타냄을 의미한다.
또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 작약꽃 콜라겐은 동물성 콜라겐에 비해 IVL 발현 효과가 높게 나타났고, 이는 우수한 피부 장벽 강화 효과를 나타냄을 의미한다.
Claims (8)
- 식물로부터 식물 추출물을 제조하는 단계, 상기 식물 추출물을 효소로 처리하여 식물성 단백질을 제조하는 단계 및 상기 식물성 단백질을 알코올에 침전하는 단계를 포함하는 식물성 콜라겐의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 식물은 작약꽃(Paeonia albiflora), 퀴노아, 오트, 동백꽃, 튤립, 자주개자리씨 및 병풀로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 식물성 콜라겐의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 추출 용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 에틸에테르, 헥산 및 1,3-부틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하고,
상기 식물과 상기 추출 용매의 혼합비는 1 : 1 내지 100의 중량비이고,
상기 추출은 압력이 1 내지 20 psi이고, 온도가 60 내지 150인 조건 하에서 수행되는 식물성 콜라겐의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 추출 용매는 물이고,
상기 식물과 상기 추출 용매의 혼합비는 1 : 20 내지 40의 중량비이고,
상기 추출은 압력이 10 내지 20 psi이고, 온도가 100 내지 150 ℃인 조건 하에서 수행되는 식물성 콜라겐의 제조방법. - 제1항에 있어서, 상기 효소는 파파인, 펩신, 콜라게나아제, 트립신, 알칼라아제, 브로멜라인, 터마밀 및 플라보자임으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질 분해 효소를 포함하고,
상기 효소를 첨가한 후 30 내지 70 ℃에서 1 내지 8 시간 동안 가수분해 반응을 진행시키고,
상기 효소는 식물 추출물 총 중량을 기준으로 0.001 내지 1 중량% 첨가되는 식물성 콜라겐의 제조방법. - 제5항에 있어서, 상기 가수 분해된 용액을 70 내지 100 ℃에서 0.5 내지 3 시간 동안 가온하여 첨가된 효소를 실활시키고,
상기 효소의 실활 후, 상기 가수 분해된 용액을 냉각한 후 0.2 내지 150 μm 필터(filter)를 사용하여 여과하는 식물성 콜라겐의 제조방법. - 제1항에 있어서, 상기 알코올은 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급 알코올로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하고,
상기 제조된 식물성 단백질과 상기 알코올의 혼합비는 1 : 2 내지 5의 중량비이고,
상기 침전 후, 상기 용액을 0.2 내지 150 μm 필터(filter)를 사용하여 여과하는 식물성 콜라겐의 제조방법. - 화장료 조성물 총 중량을 기준으로, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따라 제조된 식물성 콜라겐을 0.001 내지 20 중량% 포함하는 화장료 조성물.
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