JP6818889B2 - 細胞透過性が向上したペプチド核酸複合体およびそれを含む薬学的組成物 - Google Patents
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Description
[A≡C(+)]
Aは、標的とする遺伝子と結合可能な配列、または標的とする遺伝子配列を有する生理活性核酸(Bioactive Nucleic Acid)であり、
Cは、生理活性核酸と結合可能なキャリアペプチド核酸(Carrier Peptide Nucleic Acid)であり、
「≡」は、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との相補的な結合を意味し、
Aで表される生理活性核酸は、全体的に陰電荷または中性を有し、
C(+)は、キャリアペプチド核酸が全体的に陽電荷を有することを意味し
キャリアペプチド核酸は、キャリアペプチド核酸が全体的に陽電荷を帯びるように改変されたペプチド核酸単量体を1つ以上含む。
また、本発明は、以下のものを提供する。
[項目1]
下記構造式(1)の構造を有する核酸複合体:
[構造式(1)]
[A≡C (+) ]
前記構造式(1)中、
Aは、標的とする遺伝子と結合可能な配列、または標的とする遺伝子配列を有する生理活性核酸(Bioactive Nucleic Acid)であり、
Cは、生理活性核酸と結合可能なキャリアペプチド核酸(Carrier Peptide Nucleic Acid)であり、
「≡」は、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との相補的な結合を意味し、
Aで表される生理活性核酸は、全体的に陰電荷または中性を有し、
C (+) は、キャリアペプチド核酸が全体的に陽電荷を有することを意味し
キャリアペプチド核酸は、キャリアペプチド核酸が全体的に陽電荷を帯びるように改変されたペプチド核酸単量体を1つ以上含む。
[項目2]
前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸は、各々2個〜50個の核酸単量体を含むことを特徴とする項目1に記載の核酸複合体。
[項目3]
前記生理活性核酸は、DNA、RNA、LNA、PNAおよび改変されたペプチド核酸で構成された群から選択された核酸単量体からなることを特徴とする項目1に記載の核酸複合体。
[項目4]
全体的に陽電荷を有すること特徴とする項目1に記載の核酸複合体。
[項目5]
前記キャリアペプチド核酸は、前記生理活性核酸と一部もしくは全部が相補的な配列で構成されることを特徴とする項目1に記載の核酸複合体。
[項目6]
前記一部が相補的な配列で構成されるキャリアペプチド核酸は、1つ以上のユニバーサル塩基を含むことを特徴とする項目5に記載の核酸複合体。
[項目7]
前記キャリアペプチド核酸は、全体的に陽電荷を有するように1個以上のガンマ−またはアルファ−バックボーン改変ペプチド核酸単量体を含むことを特徴とする項目1に記載の核酸複合体。
[項目8]
前記ガンマ−またはアルファ−バックボーン改変ペプチド核酸単量体は、電気的陽性を有するようにリジン(Lysine, Lys, K), アルギニン(Arginine, Arg, R), ヒスチジン (Histidine, His, H), ジアミノ酪酸(Diamino butyric acid, DAB), オルニチン(Ornithine, Orn)およびアミノ酸類似体で構成された群から選択される1つ以上の陽電荷を有するアミノ酸をバックボーンに含むことを特徴とする項目7に記載の核酸複合体。
[項目9]
前記ガンマ−またはアルファ−バックボーン改変ペプチド核酸単量体は、陰電荷を有するアミノ酸であるグルタミン酸(Glutamic acid,Glu,E)、アスパラギン酸(Aspartic acid,Asp,D)またはアミノ酸類似体をバックボーンに含むことを特徴とする項目8に記載の核酸複合体。
[項目10]
前記ガンマ−またはアルファ−バックボーン改変ペプチド核酸単量体は、陽電荷のアミノ酸を有する単量体が、陰電荷のアミノ酸を有する単量体に比べてより多く含まれ、全体的にキャリアペプチド核酸の電荷が陽性となることを特徴とする項目8に記載の核酸複合体。
[項目11]
前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸の結合は、それぞれの5´−方向性と3´−方向性に基づいて、平行(parallel)または逆平行(antiparallel)の結合であることを特徴とする項目1に記載の核酸複合体。
[項目12]
前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との間の結合力(融解温度、melting temperature、Tm)は、生理活性核酸と、生理活性核酸の標的遺伝子との間の結合力よりも低いことを特徴とする項目1に記載の核酸複合体。
[項目13]
前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸は、平行結合(parallel binding)または部分的特異的結合(Partial specific binding)により互いに結合することによって、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との間の結合力(融解温度、melting temperature、Tm)が、生理活性核酸と、生理活性核酸の標的遺伝子との間の結合力よりも低いことを特徴とする項目12に記載の核酸複合体。
[項目14]
前記キャリアペプチド核酸は、リンカー、ユニバーサル塩基(universal base)、および生理活性核酸の対応する塩基と相補的ではないペプチド核酸塩基から選択される1つ以上のペプチド核酸塩基を有することにより、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との間の結合力(融解温度、melting temperature、Tm)が、生理活性核酸と、生理活性核酸の標的遺伝子との間の結合力よりも低いことを特徴とする項目12に記載の核酸複合体。
[項目15]
前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との間の結合力を調節することで、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸の分離時点および生理活性核酸と生理活性核酸の標的遺伝子との結合時点が調節されることを特徴とする項目12に記載の核酸複合体。
[項目16]
前記ユニバーサル塩基(universal base)は、アデニン(adenine)、グアニン(guanine)、シトシン(cytosine)、チミン(thymine)およびウラシル(Uracil)などの天然塩基、並びに、イノシンPNA(inosine PNA)、インドールPNA(indole PNA)、ニトロインドールPNA(nitroindole PNA)、および無塩基(abasic)といった、選択性なしに結合し、相補的な結合力より低い結合力を有する塩基からなる群から選択される1つ以上であることを特徴とする項目14に記載の核酸複合体。
[項目17]
疎水性残基(hydrophobic moiety)、親水性残基(hydrophilic moiety)、標的抗原特異的抗体、アプタマー、消光剤、 蛍光マーカーおよび発光マーカーからなる群から選択される1つ以上の物質が、生理活性核酸および/またはキャリアペプチド核酸に結合されていることを特徴とする項目1に記載の核酸複合体。
[項目18]
前記疎水性残基(hydrophobic moiety)、親水性残基(hydrophilic moiety)、標的抗原特異的抗体、アプタマー、消光剤、 蛍光マーカーおよび発光マーカーからなる群から選択される1つ以上の物質と、生理活性核酸および/またはキャリアペプチド核酸との結合は、単純共有結合またはリンカー媒介性の共有結合であることを特徴とする項目17に記載の核酸複合体。
[項目19]
前記核酸複合体は、5nm〜300nmの粒子サイズを有することを特徴とする項目1に記載の核酸複合体。
[項目20]
前記核酸複合体の粒子サイズは、核酸複合体の電荷平衡を調節することで調節されることを特徴とする項目19に記載の核酸複合体。
[項目21]
項目1〜20のいずれか1項に記載の核酸複合体を含む、標的遺伝子の発現調節用組成物。
[項目22]
項目1〜20のいずれか1項に記載の核酸複合体を含む疾病の予防または治療用組成物。
[項目23]
前記疾病は、癌、炎症性疾患、老人性黄斑変性、希少疾患および重症疾患、心血管疾患、代謝性疾患または皮膚疾患であることを特徴とする項目22に記載の組成物。
[項目24]
前記核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子は、サバイビン(Survivin)、VEGF、アンドロゲンレセプター(Androgen receptor)、KRAS、クラスタリン(Clusterin)、TGFβR2、ERBB3、トランスグルタミナーゼ 2(Transglutaminase 2)、ABCB1、Hsp27、STAT3およびPD−L1からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする項目23に記載の組成物。
[項目25]
前記核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子は、VEGFであることを特徴とする項目23に記載組成物。
[項目26]
前記核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子は、IFI16、TLR6およびTIEG1からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする項目23に記載の組成物。
[項目27]
前記皮膚疾患は、乾癬、色素沈着関連皮膚疾患、およびアトピー疾患から選択されることを特徴とする項目26に記載の組成物。
[項目28]
水性溶液、クリーム、ゲル、ペースト、ローションおよび軟膏から選択されるいずれか一つの剤型を有することを特徴とする項目27に記載の治療用組成物。
[項目29]
前記核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子は、PDE4BおよびPellino−1からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする項目23に記載の組成物。
[項目30]
核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子は、SMN2、ApoB−100、ICAM−1、ApoCIII、TTR、HTT、GHr、SOD1、ANGPTL3、PKK、miR−21、TMPRSS6、FMR1およびConnexin 26からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする項目23に記載の組成物。
[項目31]
項目1〜20のいずれかに記載の核酸複合体を含む疾病の診断用組成物。
[項目32]
項目1〜20のいずれかに記載の核酸複合体を用いることを含む、標的遺伝子の発現調節方法。
[項目33]
構造式(1)の核酸複合体の電荷平衡を調節することを含む、前記核酸複合体の粒子サイズ調節方法。
[A≡C(+)]
Aは、標的とする遺伝子と結合可能な配列、または標的とする遺伝子配列を有する生理活性核酸(Bioactive Nucleic Acid)であり、
Cは、生理活性核酸と結合可能なキャリアペプチド核酸(Carrier Peptide Nucleic Acid)であり、
「≡」は、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との相補的な結合を意味し、
Aで表される生理活性核酸は、全体的に陰電荷または中性を有し、
C(+)は、キャリアペプチド核酸が全体的に陽電荷を有することを意味し
キャリアペプチド核酸は、キャリアペプチド核酸が全体的に陽電荷を帯びるように改変されたペプチド核酸単量体を1つ以上含む。
他の観点において、本発明は、本発明による核酸複合体を含む皮膚疾患の予防または治療用組成物を提供する。前記皮膚疾患としては、乾癬(psoriasis)、色素沈着関連皮膚疾患、およびアトピー疾患などが挙げられるが、これに限定されない。本発明による皮膚疾患治療のための核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子は、IFI16、TLR6およびTIEG1で構成された群から選択されたいずれか一つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
以下、本発明を、実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
本発明による構造式(1)の核酸複合体の効能を検証するために、標的遺伝子としてサバイビンを使用した。サバイビンは、今まで先行された殆どの新生腫瘍や形質変異された細胞株で共通して発現されるタンパク質であって、坑癌治療において重要な標的となるのであろうと予測されている(survivin: a new target for anti−cancer therapy. Cancer Treat Rev. 35(7):553−62, 2009)。
実施例1で表2の構造を有するように製造された生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体を用いて、粒子のサイズを分析しようとした。
実施例1で製造された複合体の粒子サイズを分析するために、走査型電子顕微鏡(Field emission scanning electron microscopy)を用いて粒子サイズを分析した。走査型電子顕微鏡分析のために、キャリアペプチド核酸と生理活性核酸250nMをハイブリダイズすることで用意された複合体3ulをシリコンウェハに落とした後、−70℃で1時間冷凍させた後、20分間凍結乾燥させた。乾燥した複合体をオスミウム(osmium)に10分間コーティングした後、5kVから10kVの走査型電子顕微鏡で分析した。
実施例1の方法により、様々な電気的性質を有する複合体を製造し、粒子サイズを分析するために実施例2−1の方法で分析した。
実施例1で表2の構造を有するように製造された生理活性核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体を用いて、細胞透過性を分析しようとした。
ATCC(American Type Culture Collection、米国)から入手したヒト子宮癌細胞(HeLa)をDMEM培養培地(Dulbecco Modified Eagle Medium、WELGENE、韓国)に10%(v/v)ウシ胎仔血清、ペニシリン100units/ml、ストレプトマイシン100μg/mlを添加し、37℃、5%(v/v)CO2の条件下で培養した。
実施例3−1で培養されたHeLa細胞株(5x103cells/ウェル)を同一の培養条件で8−ウェルプレートで24時間培養した後、実施例1で製作された生物学的活性を有するペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸が結合されている複合体を500nMの濃度で処理し、37℃、5%(v/v)CO2の条件下で、24、48、72および96時間の間隔で培養してから、複合体の細胞内への導入を測定した。
生物学的活性を有するペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸が結合されている複合体の細胞内への導入程度を確認するために、共焦点燎微鏡(Confocal microscopy)で観察した。核はDAPI染色で確認し、生物学的活性を有するペプチド核酸は、Cy3を標識して細胞内への導入有無を確認した。
生物学的活性を有するペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸が細胞内に導入されて標的遺伝子と会合した時に、その結合が分離されるかを確認するために、Cy3で標識した生理活性核酸と、Alexa488で標識したキャリアペプチド核酸との重畳シグナルの有無を共焦点燎微鏡(Confocal microscopy)で観察した。
生物学的活性を有する単一生理活性小干渉リボ核酸およびキャリアペプチド核酸が結合されている複合体の細胞内への導入程度を確認するために、共焦点燎微鏡(Confocal microscopy)で観察した。核はDAPI染色により確認し、生物学的活性を有する単一生理活性小干渉リボ核酸はCy3で標識して細胞内への導入有無を確認した。
実施例1で表2の構造を有するように製造された生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体を用いて、腫瘍細胞株での標的遺伝子の発現抑制効率を分析しようとした。
ATCC(American Type Culture Collection、米国)から入手したヒト由来大膓癌細胞(SW480)およびヒト由来乳癌細胞(SK−BR−3)をRPMI1640培養培地(Roswell Park Memorial Institute 、WELGENE、韓国)に10%(v/v)ウシ胎仔血清、ペニシリン100units/ml、ストレプトマイシン100μg/mlを添加し、37℃、5%(v/v)CO2の条件下で培養した。
ヒト由来の癌細胞株の培養条件、および生物学的活性を有するペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸が結合されている複合体の処理方法は、実施例3と同様であった。但し、6−ウェルプレートにウェル当り1x105cellsを培養し、複合体で処理した後、72、96時間の間隔で培養してから、標的遺伝子の発現抑制有無を確認した。
実施例4−2の条件で処理された細胞株から総タンパク質を抽出し、BCA定量法(Bicinchoninic acid assay)によりタンパク質を定量した。タンパク質を電気泳動(SDS−PAGE)上でタンパク質のサイズ毎に分離し、分離されたゲル状のタンパク質をメンブレンに移した後、抗−サバイビン抗体(Cell Signaling, 米国)、抗−CyclinD 1(SantaCruz, 米国) ウサギ由来抗体を1次反応させ、2次反応として抗−ウサギ抗体(SantaCruz, 米国)を用いて反応させてから、ECL(Enhanced chemiluminescence, Amersham, 米国)溶液で処理した。抗体処理および洗浄過程済みの前記メンブレンは、LAS下で、サバイビン(Survivin)および下位経路(downstream)遺伝子であるCyclin D1のタンパク質の発現様相を確認した。
実施例1で表2の構造を有するように製造された様々な電気的性質を有する生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体の調節を用いて、腫瘍細胞株での標的遺伝子の発現抑制効率を分析しようとした。
SW480とSK-BR-3細胞株の培養条件、および生物学的活性を有するペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸が結合されている複合体の処理方法は、実施例2と同様であった。但し、6−ウェルプレートにウェル当り1x105cellsを培養し、複合体で処理した後、24、48、72および96時間の間隔で培養してから、標的遺伝子の発現抑制有無を確認した。
実施例4−1の条件で実験を行い、生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体の調節を用いて腫瘍細胞株での標的遺伝子の発現抑制効率を分析した。
実施例1で表2の構造を有するように製造された様々な電気的性質を有するが、異なる長さによる生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体の調節を用いて、腫瘍細胞株で細胞生存率の抑制効率を分析しようとした。
SW480細胞株の培養条件、および生物学的活性を有するペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸が結合されている複合体の処理方法は、実施例2と同様であった。但し、培養された細胞を96−ウェルプレートにウェル当り6x103cells培養し、複合体で処理後、24、48、72および96時間の間隔で培養してから、処理時間経過後に細胞生存率を確認した。
実施例6−1の条件で処理された細胞株に、MTT(3−(4,5−Dimethylthiazol−2−yl)−2,5−Diphenyltetrazolium Bromide)溶液を1XPBSで5mg/mLの濃度となるように製造し、ウェル当り20μLで処理して4時間培養した後、OD(optical density)をスペクトロフォトメータ(spectrophotometer)で測定して分析した。
実施例1で表2の構造を有するように製造された、サバイビンを標的遺伝子とする生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸を含む候補物質複合体を用いて、腫瘍細胞株および腫瘍細胞を移植した動物モデルで標的遺伝子の発現抑制による腫瘍の抑制を分析しようとした。
SW480細胞株の培養条件、および生物学的活性を有するペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸が結合されている複合体の処理方法および実験内容は、実施例4および5と同様であった。
実施例6−1の条件で処理された細胞株に、MTT(3−(4,5−Dimethylthiazol−2−yl)−2,5−Diphenyltetrazolium Bromide)溶液を1XPBSで5mg/mLの濃度となるように製造し、ウェル当り20μLで処理して4時間培養した後、OD(optical density)をスペクトロフォトメータ(spectrophotometer)で測定して分析した。
実施例4−1の条件で処理された細胞株に対して、実施例4−3の実験条件でタンパク質の発現様相を確認した。
坑癌薬効の評価のために、特定病原体不在(SPF)BALB/C系および雌ヌードマウス(Nara Biotech Co、韓国)を用いてヒト由来大膓癌細胞を培養し、5週齢のヌードマウスに移植するために、培養されたSW480細胞株を3×107cells/mlに調節した後、調節された細胞培養液をマウス当り0.3ml(9×106cells/mouse)ずつ右側の肩胛部と胸壁との間の腋窩部の皮下に注入した。生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸の候補物質複合体を、陰性対照物質(1、2mg/kg)と物質1、2、3(1、2mg/kg)として調製されたものをマウス当り0.1mlずつ2回/週(days0、3、7、10、14、17)で尾静脈投与した。全ての動物に対して、注射開始時および試験期間中に、投与直前の一般症状の観察および体重測定を行った。癌細胞移植後、群毎の平均腫瘍サイズが44.1mm3に達したときから18日目まで総9回、個体毎にVernier caliperを用いて3方向を測定した後、長さ(length)×幅(width)×高さ(height)/2の計算式により計算した。薬物投与開始18日目に、眼窩静脈からヘパリンチューブを用いて採血(5000rpm、5分間遠心分離、上清である血漿のみを分離しvialに分注して−70℃で保管)した後、CO2ガスでマウスを安楽死させてから、腫瘍を分離して化学天秤(chemical balance)で重量を測定し、腫瘍組織の写真を撮影した。
坑癌薬効の評価を行ったマウスからの採血により血液中の血漿を分離し、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)とアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)分析キット(Biovision、米国)分析溶液に適切な希釈比率で希釈して、ウェル当り20μLとなるように入れ、また、血漿中のアミノトランスフェラーゼ(ALT)とアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)の量の定量を助ける標準物質もともに用意して入れた後、分析キット内の方法に従って反応溶液(分析溶液を含む酵素および染色試薬混合物)を製造してウェル当り総100μLとなるように入れてよく混ぜてから、570nmでODをスペクトロフォトメータで測定した。
多くの癌細胞で高い発現が確認されている血管内皮成長因子であるVEGFは、癌細胞で細胞血管増殖を誘導すると知られている。そのため、これに対する新規複合体を用いてVEGFを抑制し、坑癌薬理効果を確認しようとした。
ATCC(American Type Culture Collection、米国)から入手したヒト乳癌細胞(MDA−MB−231)とヒト肺癌細胞(A549)を、DMEM培養バッジ(Dulbecco Modified Eagle Medium、WELGENE、韓国)に10%(v/v)ウシ胎仔血清、ペニシリン100units/ml、ストレプトマイシン100μg/mlを添加して、37℃、5%(v/v)CO2の条件下で培養した。
血管内皮成長因子を抑制するための新規複合体として、血管成長の必須遺伝子であるVEGF mRNAと相補的な配列(配列番号41)の生理活性ペプチド核酸を製作し、生理活性ペプチド核酸と相補的なキャリアペプチド核酸(配列番号42〜43)を製作した後、同量をハイブリダイズして複合体を製作した(表3参照)。生物学的活性を有するペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸が結合されている複合体の処理方法は、実施例2と同様であった。
新規複合体の血管内皮成長因子の抑制程度を分析するために、実施例8−1で培養された細胞を96−ウェルプレートにウェル当り6x103cells培養し、複合体で処理後、24、48、72および96時間の間隔で培養した後、処理時間経過後に実施例6−2の実験条件で細胞生存率を確認した。
新規複合体の血管内皮成長因子の抑制程度を分析するために、実施例7−1で培養された細胞を6−ウェルプレートにウェル当り1x105cells培養し、複合体で処理後、24、48、72および96時間の間隔で培養した後、処理時間経過後に実施例4−3の実験条件で抗−VEGF抗体(SantaCruz, 米国)および抗−p−Akt1(Cell Signaling, 米国)を用いてタンパク質の発現を分析した。
新規複合体の血管内皮成長因子の抑制による細胞死滅を分析するために、実施例7−1で培養された細胞を6−ウェルプレートにウェル当り1x105cells培養し、複合体で処理後、72時間培養した後、細胞を収集してからFITC Annexin V Apoptosis Detection Kit(BD、米国)のAnnexin V binding buffer500μLによく溶解した。その後、FITC Annexin VとPropidium Iodide Staining Solutionをそれぞれ5μL処理した後、流細胞分析器専用のチューブに移してから用いて、処理時間経過後にFACS CantoII(BD,米国)で分析した。
2日間培養器で培養した後に得られたゼブラフィッシュの卵を用いた。具体的に、実施例8−1の方法によって培養されるヒト由来乳癌細胞であるMDA−MB−231をCellTracTM CFSE(Thermoscientific,米国)を用いて緑色で30分間染色してから収集し、ゼブラフィッシュ1匹当り150個の染色されたヒト由来乳癌細胞を微注入法によりゼブラフィッシュ幼虫に注入した。ヒト由来乳癌細胞が注入されたゼブラフィッシュを、新規複合体が含まれた水が入っている96ウェルプレートに分注した後、4日間培養器で培養した。4日間培養した後には、0.04%のトリカイン(tricaine)を用いて麻酔した後、蛍光顕微鏡(OLYMPUS、日本)で分析した。
老人性黄斑変性の原因と知られている黄斑における血管内皮成長因子であるVEGFに対する新規複合体を、ヒト由来網膜色素上皮細胞に処理して血管生成を抑制するかを確認した。
ATCC(American Type Culture Collection、米国)から入手したヒト網膜色素上皮細胞(ARPE−19)を、DMEM−F12培養バッジ(Dulbecco Modified Eagle Medium/ Nutrient Mixture F12、Gibco、米国)に10%(v/v)ウシ胎仔血清、ペニシリン100units/ml、ストレプトマイシン100μg/mlを添加して、37℃、5%(v/v)CO2の条件下で培養した。
血管内皮成長因子を抑制するための新規複合体は実施例7−2と同様に使用して、新規複合体の処理方法は実施例2と同様であった。
新規複合体の血管内皮成長因子の抑制程度を分析するために、実施例9−1で培養された細胞を96−ウェルプレートにウェル当り6x103cells培養し、複合体で処理後、24、48、72、96および120時間の間隔で培養した後、処理時間経過後に実施例6−2の実験条件で細胞生存率を確認した。
新規複合体の血管内皮成長因子の抑制程度を分析するために、実施例9−1で培養された細胞を6−ウェルプレートにウェル当り1x105cells培養し、複合体で処理後、24、48、72、96および120時間の間隔で培養した後、処理時間経過後に実施例4−3の実験条件で抗−VEGF抗体(SantaCruz,米国)、抗−p−Akt1(Cell Signaling,米国)および 抗−p−ERK−1(Cell Signaling,米国)を用いてタンパク質の発現を分析した。
新規複合体を用いて皮膚疾患である乾癬に対する効能を検証するために、標的遺伝子であるIFI16(Interferon gamma inducible protein 16)を抑制して抗炎症薬理効果を確認しようとした。
CLS(Cell Line Service、ドイツ) から入手したヒト由来表皮角化細胞(HaCaT)を、DMEM−F12培養バッジ(Dulbecco Modified Eagle Medium、WELGENE、韓国)に10%(v/v)ウシ胎仔血清、ペニシリン100units/ml、ストレプトマイシン100μg/mlを添加して、37℃、5%(v/v)CO2の条件下で培養した。
IFI16を抑制するための新規複合体として、IFI16 mRNAと相補的な配列(配列番号44〜47)の生理活性ペプチド核酸を製作し、生理活性ペプチド核酸と相補的なキャリアペプチド核酸(配列番号48)を製作した後、同量をハイブリダイズして複合体を製作した(表4参照)。生物学的活性を有するペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸が結合されている複合体の処理方法は、実施例2と同様であった。
IFI16の抑制程度を分析するために、実施例10−1で培養された細胞を96−ウェルプレートにウェル当り6x103細胞を24時間培養した後、生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体で処理し、ヒト表皮角化細胞の炎症反応を誘導するために、IL−17Aを20ng/mLで処理してから、72、96および120時間培養した後、実施例6−2の実験条件で細胞生存率を確認した。
新規複合体のIFI16の抑制程度を分析するために、実施例10−1で培養された細胞を6−ウェルプレートにウェル当り1x105cells培養し、複合体で処理後、72、96、120および144時間の間隔で培養した後、処理時間経過後に実施例4−3の実験条件で抗−IFI16抗体(Cell Signaling,米国)および抗−p−NF−kB抗体(Cell Signaling,米国)を用いてタンパク質の発現を分析した。
6週齢のBalb/C雄マウスの右側耳に、毎日20mgのイミキモドを12日間塗布することで乾癬を誘導したマウスモデルに、新規複合体を2日に1回ずつ総12日間(6回)液状またはクリームで塗布し、右側耳の厚さを測定(マイクロメーター)し、乾癬誘導前の初期右側耳の厚さと、乾癬誘導後、対照群に対する新規複合体処理群の耳厚さの差を確認した。
実施例10−5と同様の条件で新規複合体を塗布した後、マウスの右側耳をバイオプシーして総タンパク質を抽出し、BCA定量法(Bicinchoninic acid assay)を用いてタンパク質を定量した。実施例10−4の方法によりタンパク質の発現を確認した。
実施例10−5と同様の条件で新規複合体を塗布した後、マウスの右側耳をバイオプシーして4%のホルムアルデヒド溶液で固定した後、パラフィン包埋して製作したパラフィンブロックをミクロトームで切片とし、脱パラフィンした組織をスライドガラスに載せてマウンティングして、ヘマトキシリン−エオシン(Hematoxylin−Eosin)染色のための準備をした。
多くの癌細胞遺伝子の表面で発現されるPD−L1により、T細胞のPD−1と結合して免疫細胞による死滅が誘導されず、癌細胞の増殖を誘導し続けると知られている。そのため、高い発現を示すヒト由来乳癌細胞で、PD−L1を標的とする新規複合体を用いてPD−L1を抑制して免疫坑癌効果を確認しようとした。
実施例8−1と同様の方法で培養した。
PD−L1を抑制するための新規複合体として、癌細胞の表面に発現しているPD−L1 mRNAと相補的な配列(配列番号49)の生理活性ペプチド核酸を製作し、生理活性ペプチド核酸と相補的なキャリアペプチド核酸(配列番号50)を製作した後、同量をハイブリダイズして複合体を製作した(表5参照)。生物学的活性を有するペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸が結合されている新規複合体の処理方法は、実施例2と同様であった。
新規複合体のPD−L1の抑制程度を分析するために、実施例11−1で培養された細胞を6−ウェルプレートにウェル当り1x105cells培養し、複合体で処理後、96、120および144時間の間隔で培養した後、処理時間経過後に実施例4−3の実験条件で抗−PD−L1抗体(Abcam、英国)を用いてタンパク質の発現を分析した。
新規複合体を用いて、細菌の増殖に必須遺伝子と知られたacpPを標的遺伝子とし、複合体によって細菌増殖も抑制されるかを確認しようとした。
細菌DH5α(Enzynomics、韓国)をLuria−Bertani(LB)brothに接種した後、30℃で105CFUとなるように培養した。
細菌増殖を抑制するための新規複合体として、細菌の必須遺伝子であるacpP mRNAと相補的な配列(配列番号51)の生理活性核酸を製作し、生理活性核酸と相補的なキャリアペプチド核酸(配列番号52)を製作した後、同量をハイブリダイズして複合体を製作した(表6参照)。
新規複合体の細菌増殖抑制程度を分析するために、実施例12−1で培養された細菌に、実施例6−2で製作された複合体を1μMの濃度で24時間処理した後、段階希釈した培養液を固体培地に同量ずつ落としてから、12、24、48時間観察した。その結果、図18に示されたように、1本鎖からなる生理活性核酸のみで処理した実験区に比べて、複合体形態で処理した実験区の成長が阻害されることを確認した。
Claims (18)
- 下記構造式(1)の構造を有する核酸複合体:
[構造式(1)]
[A≡C(+)]
前記構造式(1)中、
Aは、標的とする遺伝子と結合可能な配列、または標的とする遺伝子配列を有する生理活性核酸(Bioactive Nucleic Acid)であり、
Cは、生理活性核酸と結合可能なキャリアペプチド核酸(Carrier Peptide Nucleic Acid)であり、
「≡」は、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との相補的な結合を意味し、
Aで表される生理活性核酸は、全体的に陰電荷を有するペプチド核酸(Peptide Nucleic Acid:PNA)であり、
C(+)は、キャリアペプチド核酸が全体的に陽電荷を有することを意味し
キャリアペプチド核酸は、キャリアペプチド核酸が全体的に陽電荷を帯びるように改変されたペプチド核酸単量体を1つ以上含み、前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との間の結合力(融解温度、melting temperature、Tm)は、生理活性核酸と、生理活性核酸の標的遺伝子との間の結合力よりも低いことを特徴とする。 - 前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸は、各々2個〜50個の核酸単量体を含むことを特徴とする請求項1に記載の核酸複合体。
- 全体的に陽電荷を有することを特徴とする請求項1に記載の核酸複合体。
- 前記キャリアペプチド核酸は、前記生理活性核酸と一部もしくは全部が相補的な配列で構成されることを特徴とし、前記一部が相補的な配列で構成されるキャリアペプチド核酸は、1つ以上のユニバーサル塩基を含む、請求項1に記載の核酸複合体。
- 前記キャリアペプチド核酸は、全体的に陽電荷を有するように1個以上のガンマ−またはアルファ−バックボーン改変ペプチド核酸単量体を含むことを特徴とし、前記ガンマ−またはアルファ−バックボーン改変ペプチド核酸単量体は、陽電荷のアミノ酸を有する単量体が、陰電荷のアミノ酸を有する単量体に比べてより多く含まれ、全体的にキャリアペプチド核酸の電荷が陽性となることを特徴とする、請求項1に記載の核酸複合体。
- 前記ガンマ−またはアルファ−バックボーン改変ペプチド核酸単量体は、電気的陽性を有するようにリジン(Lysine, Lys, K), アルギニン(Arginine, Arg, R), ヒスチジン (Histidine, His, H), ジアミノ酪酸(Diamino butyric acid, DAB), オルニチン(Ornithine, Orn)およびアミノ酸類似体で構成された群から選択される1つ以上の陽電荷を有するアミノ酸をバックボーンに含むことを特徴とする請求項5に記載の核酸複合体。
- 前記ガンマ−またはアルファ−バックボーン改変ペプチド核酸単量体は、陰電荷を有するアミノ酸であるグルタミン酸(Glutamic acid,Glu,E)、アスパラギン酸(Aspartic acid,Asp,D)またはアミノ酸類似体をバックボーンに含むことを特徴とする請求項6に記載の核酸複合体。
- 前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸の結合は、それぞれの5´−方向性と3´−方向性に基づいて、平行(parallel)または逆平行(antiparallel)の結合であることを特徴とする請求項1に記載の核酸複合体。
- 前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸は、平行結合(parallel binding)または部分的特異的結合(Partial specific binding)により互いに結合することによって、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との間の結合力(融解温度、melting temperature、Tm)が、生理活性核酸と、生理活性核酸の標的遺伝子との間の結合力よりも低いことを特徴とする請求項1に記載の核酸複合体。
- 前記キャリアペプチド核酸は、リンカー、ユニバーサル塩基(universal base)、および生理活性核酸の対応する塩基と相補的ではないペプチド核酸塩基から選択される1つ以上のペプチド核酸塩基を有することにより、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との間の結合力(融解温度、melting temperature、Tm)が、生理活性核酸と、生理活性核酸の標的遺伝子との間の結合力よりも低いことを特徴とする請求項1に記載の核酸複合体。
- 前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との間の結合力を調節することで、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸の分離時点および生理活性核酸と生理活性核酸の標的遺伝子との結合時点が調節されることを特徴とする請求項1に記載の核酸複合体。
- 前記ユニバーサル塩基(universal base)は、アデニン(adenine)、グアニン(guanine)、シトシン(cytosine)、チミン(thymine)およびウラシル(Uracil)などの天然塩基、並びに、イノシンPNA(inosine PNA)、インドールPNA(indole PNA)、ニトロインドールPNA(nitroindole PNA)、および無塩基(abasic)といった、選択性なしに結合し、相補的な結合力より低い結合力を有する塩基からなる群から選択される1つ以上であることを特徴とする請求項10に記載の核酸複合体。
- 疎水性残基(hydrophobic moiety)、親水性残基(hydrophilic moiety)、標的抗原特異的抗体、アプタマー、消光剤、蛍光マーカーおよび発光マーカーからなる群から選択される1つ以上の物質が、生理活性核酸および/またはキャリアペプチド核酸に結合されていることを特徴とする請求項1に記載の核酸複合体。
- 前記疎水性残基(hydrophobic moiety)、親水性残基(hydrophilic moiety)、標的抗原特異的抗体、アプタマー、消光剤、蛍光マーカーおよび発光マーカーからなる群から選択される1つ以上の物質と、生理活性核酸および/またはキャリアペプチド核酸との結合は、単純共有結合またはリンカー媒介性の共有結合であることを特徴とする請求項13に記載の核酸複合体。
- 前記核酸複合体は、5nm〜300nmの粒子サイズを有することを特徴とし、前記核酸複合体の粒子サイズは、核酸複合体の電荷平衡を調節することで調節されることを特徴とする請求項1に記載の核酸複合体。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載の核酸複合体を含む、標的遺伝子の発現調節用組成物。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載の核酸複合体を含む疾病の予防または治療用組成物であって、前記疾病は、癌、炎症性疾患、老人性黄斑変性、希少疾患および重症疾患、心血管疾患、代謝性疾患または皮膚疾患であることを特徴とする、前記治療用組成物。
- 前記核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子は、サバイビン(Survivin)、VEGF、アンドロゲンレセプター(Androgen receptor)、KRAS、クラスタリン(Clusterin)、TGFβR2、ERBB3、トランスグルタミナーゼ 2(Transglutaminase 2)、ABCB1、Hsp27、STAT3、PD−L1、IFI16、TLR6、TIEG1、PDE4B、Pellino−1、SMN2、ApoB−100、ICAM−1、ApoCIII、TTR、HTT、GHr、SOD1、ANGPTL3、PKK、miR−21、TMPRSS6、FMR1およびConnexin 26からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項17に記載の組成物。
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