KR102494612B1 - 개량 Tm 매핑법 - Google Patents

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Abstract

융해 온도(Tm)값 측정 오차가 ±0.5℃ 이내인 실시간 PCR(real-time PCR) 기기로도 적어도 속(屬) 수준(genus level)에서, 그리고 대부분은 종(種) 수준(species level)에서 정확히 균을 식별·동정(同定)할 수 있는 개량 Tm 매핑법을 제공한다. 불완전 일치 배열의 장쇄(長鎖) 소광(消光) 프로브를 사용하는 개량 Tm 매핑법은, PCR 튜브 간의 Tm값 측정 오차가 ±0.5℃ 이내인 실시간 PCR 기기로도 적어도 속 수준에서, 그리고 대부분은 종 수준에서 정확히 균을 식별·동정할 수 있다. 따라서, 거의 모든 실시간 PCR 기기로 Tm 매핑법의 시행이 가능해져서, 검체 채취 후 4시간 정도 만에 불특정 감염증 기염균(起炎菌)을 동정할 수 있다.

Description

개량 Tm 매핑법
[0001] 본 발명은, 불완전 일치 배열의 선형(線狀) 장쇄(長鎖) 프로브(Imperfect-Match Linear Long probes: IMLL 프로브)를 사용한 Tm 매핑법에 관한 것이다.
[0002] 적절한 항균약 치료를 행하여, 위독한 패혈증 환자를 구명하기 위해서는, 환자 검체 중의 기염균(起炎菌)을 가능한 한 신속히 검출·동정(同定)하는 것이 중요하다.
그러나, 현재의 일반적인 검사법으로는, 검체 채취부터 기염균의 동정까지 통상 2∼3일을 요한다.
그 결과, 광역 스펙트럼의 항균약 사용에 의한 다제(多劑) 내성균의 출현이나, 항균약의 선택 미스에 의해 위독 환자가 치사 상태에 이를 위험성 등, 감염증 조기의 치료에 있어서는 아직도 중대한 리스크를 안고 있다.
이 문제를 해결하기 위해, 검체 채취 후 3시간 이내에 불특정 기염균 동정을 가능하게 하는 Tm 매핑법(Melting Temperature Mapping Method)이 제안된 바 있다(특허문헌 1, 2 및 비특허문헌 1).
[0003] Tm 매핑법은, 모든 세균에 공통인 염기 배열 영역을 타깃으로서 설계한 세균 유니버설 프라이머(universal primer)를 사용하여, 얻어진 7개의 PCR 증폭 산물(産物)의 Tm값(이중가닥 DNA(double-stranded DNA)의 50%가 해리(解離)되어 외가닥 DNA(single-stranded DNA)가 되는 온도)을 측정하고, 그 7개의 Tm값의 조합(=균종(菌種)에 따른 염기 배열의 차이를 반영함)을 균의 지문(finger print)으로 해서, 데이터베이스와의 대조에 의해 동정하는 방법이며, 혈액 배양을 행하지 않고, 채혈로부터 3시간 정도 만에 미지의 기염균을 동정하는 유전자 검사법이다.
WO2007/097323호 팸플릿 WO2010/082640호 팸플릿
화학 요법의 영역 Vol.31 S-1 2015
[0006] Tm 매핑법은 균마다의 염기 배열의 차이를, PCR 증폭 산물의 Tm값의 차이로서 동정에 이용하기 때문에, 불과 5℃ 정도의 차이(×7개의 조합) 내에 200 균 이상이 밀집하게 된다.
그 결과, PCR 튜브 간의 Tm값 측정 오차가 ±0.1℃ 이내의 정확성이 요구되고, 이를 만족하는 실시간 PCR(real-time PCR) 기기는 시판 중인 기기 중에서 불과 몇 대 밖에 없다.
이 점은, Tm 매핑법의 보급의 족쇄가 되고 있다.
이에, 발명자들은, PCR 증폭 산물이 아니라, 롱 프로브(long probe)를 사용하는 새로운 Tm 매핑법을 검토함으로써, 본 발명에 이르렀다.
시판 중인 거의 모든 실시간 PCR 기기로 Tm 매핑법을 시행할 수 있게 된다.
[0007] 롱 프로브로서, 예컨대, 소광(消光) 프로브를 사용하고, 40 염기 전후의 매우 긴 프로브인 동시에, 불완전 일치 배열로서 설계함으로써, 대부분의 균에 결합하여 폭넓은 Tm값을 취득할 수 있는 프로브를 발견하였다.
수많은 미스매치(mismatch)를 갖더라도, 프로브가 긴 만큼, 많은 수소 결합력으로 불완전 일치 배열로 결합할 수 있다.
한편, 긴 프로브는 이차 구조를 취하여 자기 소광(自己消光)되어 버리는 경향이 강하기 때문에, 델타 G를 사용하여 이차 구조를 취하지 않는 롱 프로브의 시작(試作)을 반복하는 등 연구를 추진하고, 동작 확인을 하여 최적의 프로브를 선출하여, 본 발명을 완성하였다.
이 프로브는 미스매치의 수와 위치에 따라, 종래의 PCR 증폭 산물의 Tm값의 균종 간의 차이보다 균종마다 폭넓은, 즉, 균종 간에 최대 20℃ 이상의 차이가 있는 Tm값을 얻을 수 있었다.
발명자들은, 이와 같은 프로브를 IMLL 프로브(Imperfect-Match Linear Long probe)라고 명명하였다.
[0008] 실제로 7개의 IMLL 프로브를 사용하여, 우선 71균종의 Tm 매핑형의 예비 데이터베이스를 작성하였다.
그 결과, 이론적으로 PCR 튜브 간의 Tm값 측정 오차가 ±0.5℃ 이내인 실시간 PCR 기기로도 적어도 속(屬) 수준(genus level)에서, 그리고 대부분은 종(種) 수준(species level)에서 정확히 균을 식별·동정할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
현재 시판되고 있는 실시간 PCR 기기의 PCR 튜브 간 측정 오차는 대부분이 ±0.3℃ 이내이기　때문에, IMLL 프로브를 사용하면, 거의 모든 실시간 PCR 기기로 Tm 매핑법의 시행이 가능해진다.
한편, 설계한 프로브의 성능상, 예컨대 Enterococcus faecalis와 Enterococcus faecium 간의 식별은 거의 불가능하지만, 적어도 속(屬)을 틀리는 일은 없다.
또한, Staphylococcus속(屬)도 배열이 비슷하기 때문에 종 수준의 식별에 문제가 있었지만, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 특이적으로 식별하는 쇼트 프로브(short probe)를 도입한 결과, 불과 10분의 추가 시행으로 황색포도상구균인지, 혹은 황색포도상구균 이외의 Staphylococcus속인지의 판정이 가능해졌다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
[0009] 종래의 Tm 매핑법이란, 도 1에 공정의 흐름을 나타내는 바와 같이, 이하의 공정으로 행하는 감염증 기염균의 신속 동정 방법이다.
참고로, 도 1은, 공정의 흐름을 나타낸 것이며, 그래프는 이미지를 나타낸 데 불과하다.
(1) 혈액 등의 검체로부터 미생물의 DNA를 추출하는 공정.
(2) 추출한 미생물 DNA를 주형(鑄型)으로 하고, 복수의 유니버설 프라이머를 사용하여 네스티드(nested) PCR을 행하는 공정.
(3a) 상기의 공정에서 얻어진 복수의 유전자 증폭물(PCR 앰플리콘(amplicon))의 융해(melting) 해석을 행하는 공정.
(4) 복수의 융해 온도(melting temperature: Tm)값을 이차원으로 매핑하는 공정.
(5) 이차원 매핑의 「형상」을 데이터베이스와 대조하는 공정.
에 의해 감염증 기염균을 동정하는 방법.
[0010] 본 발명의 개량 Tm 매핑법은, 도 2에 공정의 흐름을 나타내는 바와 같이, 상기 (3a)의 공정이, 상기 (2)의 공정에서 얻어진 유전자 증폭물(PCR 앰플리콘)에, 불완전 일치 배열의 선형 장쇄 프로브(Imperfect-Match Linear Long probes: IMLL 프로브)를 가하고, 유전자 증폭물의 Tm값이 아니라, IMLL 프로브의 Tm값의 해석을 행하는 공정 (3)으로 치환된 것이다. 이후의 (4) 및 (5) 공정은, 종래의 Tm 매핑법과 동일하다.
[0011] · 공정 (1): 혈액 등의 검체로부터 미생물의 DNA를 추출하는 공정.
임상 시료(2mL의 전혈(全血) 시료 등)로부터 PCR용 주형으로서 세균 DNA를 직접 추출한다.
추출 방법은, 특별히 한정되지 않고, 임상 시료의 채취, DNA 추출 등은 공지의 방법을 이용하면 된다.
[0012] · 공정 (2): 추출한 미생물 DNA를 주형으로 하고, 복수의 세균 유니버설 프라이머(거의 모든 세균을 검출하는 프라이머)를 사용하여 네스티드 PCR을 행하는 공정.
본 공정은, 5∼7개의 세균 유니버설 프라이머 세트(제2 PCR에 있어서 1개의 튜브당 1개의 프라이머 세트)를 사용한 네스티드 PCR을 포함한다.
이들 프라이머는 거의 모든 종의 세균을 검출할 수 있다.
이 공정의 정밀도를 높이기 위해, 세균 DNA의 오염(contamination)이 없는, 진핵 생물을 호스트 세포로서 재조합형(recombinant)으로 제작한 내열성 DNA 폴리메라아제(polymerase)를 사용하는 것이 바람직하다.
해당 폴리메라아제를 사용함으로써, 세균 유니버설 PCR에 있어서도 위양성(僞陽性, false positive) 결과가 없는, 고감도이며 신뢰성이 높은 세균 검출이 가능해지고, 이에 의해 PCR에 의해 환자 샘플로부터 감염증 기염균을 직접 동정하는 것이 가능해진다.
본 공정에 있어서, 네스티드 PCR이 실행되고, 복수 개, 예컨대, 5개의 PCR 증폭물(앰플리콘)이 얻어진다(도 3).
[0013] · 공정 (3): IMLL 프로브의 Tm값의 해석을 행하는 공정.
예컨대, 영역 1 및 영역 3의 PCR 앰플리콘에 각각 2개의 프로브 타깃을 설치하고, 합계 7개(5종류)의 PCR 앰플리콘을 7종류의 IMLL 프로브(도 3 및 도 4)와 혼합한다.
7개의 Tm값은, 7종류의 IMLL 프로브를 분석함으로써 얻어진다.
[0014] · 공정 (4): 복수의 Tm값을 이차원으로 매핑하는 공정.
예컨대, 7개의 Tm값을 2개의 차원으로 매핑한다. 이 플롯의 형상(Tm 매핑 형상)은, 도 5에 나타내는 바와 같이 종(種) 혹은 속(屬)에 고유한 형상을 나타낸다.
이는 고분해능 융해 곡선(High Resolution Melting-curve: HRM) 해석이 아니라, Tm값만이 측정되어 있다.
[0015] · 공정 (5): 이차원 매핑의 「형상」을 데이터베이스와 대조하는 공정.
Tm 매핑 형상을 데이터베이스의 형상과 비교함으로써, 감염증 기염균을 신속히 동정할 수 있다.
데이터베이스의 형상과의 유사한 정도를 도 6에 나타내는 바와 같이 차이값(Difference Value)의 계산식에 의해 정량적으로 나타낸다.
이 Difference Value가 0에 가까우면 가까울수록, 형상이 보다 일치하고 있음을 의미한다.
[0016] 개량 Tm 매핑법에 사용하는 불완전 일치 배열의 선형 장쇄 프로브(Imperfect-Match Linear Long probes: IMLL 프로브)의 「장쇄 프로브」란, 35∼50 염기, 바람직하게는, 35∼48 염기, 보다 바람직하게는, 38∼45 염기의 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 의미한다.
IMLL 프로브의 균종의 차이에 따른 Tm값의 차이는, 최대로 20℃ 이상이다.
한편, 종래의 Tm 매핑 방법의 균종의 차이에 따른 Tm값의 차이는, 최대여도 5℃ 정도이다.
실제로 71균종의 예비 데이터베이스 중에서의, 종래의 Tm mapping법으로 얻어지는 Tm값의 편차와, 개량 Tm mapping법의 IMLL 프로브에 의해 얻어지는 Tm값의 편차의 차이를 도 7에 나타낸다.
또한, IMLL 프로브는, 표적 배열에 미스매치를 갖는 위치에도 결합할 수 있는 길이의 프로브이다.
예로서, 하기에서 제작한 IMLL 프로브 1-2가 예비 데이터베이스 중의 71균종 각각과 갖는 미스매치를 도 8에 나타낸다.
본 발명의 IMLL 프로브는, 다른 염기 배열을 갖는 많은 세균종에 결합할 수 있다.
그리고, IMLL 프로브는, 긴 프로브에도 불구하고 프로브 자체에 이차 구조가 형성되지 않기 때문에, 표적 배열에 대한 결합이 약화(減弱)되어 버리는 일은 없다.
IMLL 프로브는, 예컨대, 대장균 16S 리보솜 RNA(Accession No. AB548582)와 결합하는 복수의 부위로 하고, 멀티플 얼라인먼트 소프트웨어 프로그램(Clustal X)을 사용하여 설계하고, 화학 합성하면 된다.
[0017] 구체적인 IMLL-프로브로서, 예컨대 이하의 프로브를 작성하였다.
＜IMLL 프로브 1-1＞
· 5'-GTTATCCCACTCTAATAAGCAGGTTACCTACGTATTACTCACCC-3': 배열번호 1
[프로브 사이즈: 44bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA(Accession No. AB548582)의 84-126]
＜IMLL 프로브 1-2＞
· 5'-CACCTACTAGCTAATCTTATCTGGGCACATCCGATGGC-3': 배열번호 2
[프로브 사이즈: 38bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA의 193-230]
＜IMLL 프로브 2-1＞
· 5'-CACGCGGCATGGCTCCATCAGGCTTTCCCCCATTGTCGAAGATTC-3': 배열번호 3
[프로브 사이즈: 45bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA의 335-379]
＜IMLL 프로브 3-1＞
· 5'-CGCCCTGTAATTCCGAATAACGCTAGCTCCCACCGTATTAC-3': 배열번호 4
[프로브 사이즈: 41bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA의 503-543]
＜IMLL 프로브 3-2＞
· 5'-CCAAGTTGAGCCCGGGCCTTTCACTACTGACTTAACAAACCGCC-3': 배열번호 5
[프로브 사이즈: 44bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA의 557-600]
＜IMLL 프로브 4-1＞
· 5'-GGCACAACCTCTTAATACTCATCGTTTACAGCGTGGAC-3': 배열번호 6
[프로브 사이즈: 38bp, 대장균 16S rRNA의 776-813]
＜IMLL 프로브 5＞
· 5'-ATCTCTGCAAAGTTCTAAGGATGTCAAGATTAGGTAAGGTTC-3': 배열번호 7
[프로브 사이즈: 42bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA의 949-990]
＜S. aureus 검출용 쇼트 프로브＞
· 5'-TATCTAATGCAGCGCGGATC-3': 배열번호 8
[프로브 사이즈: 20bp, 결합 부위: 황색포도상구균 16S rRNA(Accession No. AB681291)의 211-230)
여기서, IMLL 프로브는, 멀티플 얼라인먼트 소프트웨어 프로그램을 사용하여 설계한 것이며, 타깃으로 하는 결합 부위에 따라, 다음과 같은 IMLL 프로브를 사용할 수도 있다.
＜IMLL 프로브 1-3＞
· 5'-CAGACCAGCTAACGATCGTCGCCTTAGTAAGCCGTTACCC-3': 배열번호 21
[프로브 사이즈: 40bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA의 231-270]
＜IMLL 프로브 1-4＞
· 5'-CTCAGACCAGCTAACGATCGTTGCCTTAGTAAGCCGTTACCT-3': 배열번호 22
[프로브 사이즈: 42bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA의 231-272]
＜IMLL 프로브 2-2＞
· 5'-GTACTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCATACACGCGGCATGGC-3': 배열번호 23
[프로브 사이즈: 43bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA의 367-409]
＜IMLL 프로브 3-3＞
· 5'-CCTTATCGCCTTCCTCCCCGCTGAAAGTGCTTTAC-3': 배열번호 24
[프로브 사이즈: 35bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA의 401-435]
＜IMLL 프로브 3-4＞
· 5'-CGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTAC-3': 배열번호 25
[프로브 사이즈: 41bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA의 503-543]
＜IMLL 프로브 3-5＞
· 5'-GGCCGACTAATTCCGATTAACGCTTCCACGCTCCGTATTAC-3': 배열번호 26
[프로브 사이즈: 41bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA의 503-543]
＜IMLL 프로브 3-6＞
· 5'-CTTAACAAACCGCCTACGCACCCTTTAAGCCCAATAATTCCGATTAACGC-3': 배열번호 27
[프로브 사이즈: 50bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA의 521-570]
＜IMLL 프로브 3-7＞
· 5'-CTCAAGTTTGCCAGTTTCCGATGAAGTTCCCAGGTTGAGC-3': 배열번호 28
[프로브 사이즈: 40bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA의 590-629]
＜IMLL 프로브 3-8＞
· 5'-CTCAAGTTTGCCAGTTTCGGATGCAGTTTCCAGGTTGAGC-3': 배열번호 29
[프로브 사이즈: 40bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA의 590-629]
＜IMLL 프로브 4-2＞
· 5'-CCACCTCTATGCAGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGG-3': 배열번호 30
[프로브 사이즈: 42bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA의 768-809]
＜IMLL 프로브 6-1＞
· 5'-CCTCCAGTTTGTCATCGGCAGTCTACATTGAGTTCCCAAC-3': 배열번호 31
[프로브 사이즈: 40bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA의 1112-1151]
＜IMLL 프로브 6-2＞
· 5'-CCTCCAGTTTGTCACCGGCAGTCTACATTGAGTTCCCAAC-3': 배열번호 32
[프로브 사이즈: 40bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA의 1112-1151]
＜IMLL 프로브 7-1＞
· 5'-CTTCATGTAATCAGGTTGCAGACTCCAATCCGGACTAAGACGC-3': 배열번호 33
[프로브 사이즈: 43bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA의 1265-1307]
＜IMLL 프로브 7-2＞
· 5'-CTAGCGATTCCGACTTCATGAATACGAGTTGCAGCCTACAAT-3': 배열번호 34
[프로브 사이즈: 42bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA의 1279-1320]
[0018] 본 발명의 개량 Tm 매핑법의 공정 (2)에 사용하는 유니버설 프라이머는, 박테리아의 16S 리보솜 RNA 유전자의, 예컨대, 7개의 영역을 보편적으로 증폭하도록, 세균 보존 영역(bacterial conserved region)을 표적으로 하여 설계하면 된다.
구체적으로는, 멀티플 얼라인먼트 소프트웨어 프로그램(Clustal X)을 사용하여 설계하고, 화학 합성하면 된다.
구체적인 프라이머는 이하와 같다.
＜퍼스트 PCR용 프라이머＞
· 순방향: 5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3': 배열번호 9
· 역방향: 5'-CCGGGAACGTATTCACC-3': 배열번호 10
＜세컨드 PCR(nested PCR)용, 영역 1 프라이머＞
· 순방향: 5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3': 배열번호 11
· 역방향: 5'-CGTAGGAGTCTGGACCGT-3': 배열번호 12
＜세컨드 PCR(nested PCR)용, 영역 2 프라이머＞
· 순방향: 5'-GACTCCTACGGGAGGCA-3': 배열번호 13
· 역방향: 5'-TATTACCGCGGCTGCTG-3': 배열번호 14
＜세컨드 PCR(nested PCR)용, 영역 3 프라이머＞
· 순방향: 5'-AGCAGCCGCGGTAATA-3': 배열번호 15
· 역방향: 5'-GGACTACCAGGGTATCTAATCCT-3': 배열번호 16
＜세컨드 PCR(nested PCR)용, 영역 4 프라이머＞
· 순방향: 5'-AACAGGATTAGATACCCTGGTAG-3': 배열번호 17
· 역방향: 5'-AATTAAACCACATGCTCCACC-3': 배열번호 18
＜세컨드 PCR(nested PCR)용, 영역 5 프라이머＞
· 순방향: 5'-TGGTTTAATTCGATGCAACGC-3': 배열번호 19
· 역방향: 5'-GAGCTGACGACAGCCAT-3': 배열번호 20
[0019] · IMLL 프로브를 사용한 Tm 매핑 데이터베이스의 구축.
QIAGEN사(社)의 RotorGene Q(온도 균일성: ±0.1℃)를 사용하여 복수 회(예컨대 3회) 측정한 Tm값의 평균을 이용해, 우선 71균종의 Tm 매핑 형상을 갖는 예비 데이터베이스를 구축하였다(도 5).
세균은 임상 검체로부터 얻어지고, 다음으로 시퀀스로 배열 결정되고, 종 수준에서 동정되었다.
데이터베이스는 데이터량의 변경이 가능하고, 용이하게 데이터의 변경 및 갱신이 가능하다.
데이터베이스 중의 각각의 Tm 매핑 형상은, 각 세균종의 IMLL Q 프로브의 하이브리디제이션(hybridization)에 있어서의 프로브-표적 미스매치의 수 및 위치를 반영한다.
즉, 각 세균종의 특이적 염기 배열을 반영하여, 유니크한 형상을 나타낸다.
일부의 Tm 매핑 형상에는 데이터 포인트가 없다.
이는, IMLL 프로브가 이들의 표적 영역에 결합되지 않으므로, 그 포인트의 Tm값을 얻을 수 없다는 사실에 기인한다.
기염균을 동정하기 위해, 동정 소프트웨어 프로그램은, Tm 매핑 형상의 상동성(相同性)을 나타내는 차이값(Difference Value)의 계산에 더하여, IMLL 프로브 결합의 유무가 동일한 패턴을 좁힘으로써, 데이터베이스 중의 세균의 검색 범위를 좁힌다.
즉, IMLL 프로브 결합의 패턴도 세균종을 분별하는 특징으로서 이용한다.
[0020] · IMLL 프로브를 사용한 Tm 매핑법의 정밀도의 평가(71균종).
IMLL 프로브를 사용한 Tm 매핑 방법의 정밀도를 평가하기 위해, 예비 데이터베이스에 등록된 동일한 71종의 세균 DNA를 이용하여, QIAGEN사의 RotorGene Q(온도 균일성: ±0.1℃)를 사용해 블라인드 테스트를 행하였다.
즉, 세균의 이름을 감추고, 세균 DNA를 동정하였다. 71균종의 시험에서는, Staphylococcus속에 있어서는 종 수준(Staphylococcus aureus 또는 Staphylococcus hemolyticus 또는 Staphylococcus hominis 또는 Staphylococcus lugdunensis)에서의 Tm 매핑 결과를 좁힐 수는 없었다.
마찬가지로, Enterococcus faecalis와 Enterococcus faecium은 구별하여 동정할 수는 없었다.
나머지 65균종의 Tm 매핑 결과는, 데이터베이스 중의 배열 결정된 세균 DNA와 일치하였다.
Difference Value값의 평균값은 0.242이며, 범위는 0.09∼0.30(표준 편차=0.08)이었다.
[0021] · 예비 데이터베이스 중의 71종의 세균의 Tm 매핑 형상의 유사성의 평가.
평가를 표 1(도 9)에 나타낸다.
정의한 Difference Value값이, Tm 매핑 형상의 데이터베이스에 등록된 각각의 세균종과, 그 외의 세균종과의 차이를 반영하고 있다.
Difference Value값이 제로에 가까워질수록, 데이터베이스에 등록된 세균종의 형상과 Tm 매핑 형상이 보다 유사하다.
측정 기기에 있어서의 PCR 튜브 간의 Tm값 측정 오차(=측정 기기의 온도 균일성)가 ±0.1℃ 이내이면, Difference Value값의 측정 오차 범위는, 0.28 이내가 된다.
마찬가지로, 측정 기기에 있어서의 PCR 튜브 간의 Tm값 측정 오차가 ±0.2℃, ±0.3℃, ±0.4℃, ±0.5℃, ±0.6℃ 이내이면, Difference Value값의 측정 오차 범위는 0.53, 0.80, 1.06, 1.33, 1.59 이내가 된다.
Difference Value값에 따른 각 세균종의 유사성의 해석의 결과, Enterococcus faecalis와 Enterococcus faecium은 구별하여 동정할 수는 없는 것으로 밝혀졌다.
또한, Staphylococcus속에 있어서는 종 수준에서의 동정이 어렵다는 것도 판명되었다.
그 외의 65균종에 있어서는, 타 균종과의 Difference Value값을 상호 간에 1.33　이상 갖고 있기 때문에, 기기의 온도 균일성(PCR 튜브 간의 Tm값 측정 오차)이 ±0.5℃ 이내인 측정 기기를 사용하면, 적어도 속 수준에서, 그리고 대부분은 종 수준에서 정확히 동정 가능한 것으로 밝혀졌다.
즉, 종래의 Tm 매핑법으로는, PCR 튜브 간의 Tm값 측정 오차가 ±0.1℃인 측정 기기밖에 사용할 수 없지만, 본 발명에 의해, Tm 매핑법을 실시할 수 있는 기기가 현격히 확대된다.
[0022] 예컨대, 7개의 IMLL 프로브(배열번호 1∼7)를 사용하여, 우선 71균종의 Tm 매핑 형상 예비 데이터베이스를 작성한 결과, PCR 튜브 간의 Tm값 측정 오차가 ±0.5℃ 이내인 실시간 PCR 기기로도 적어도 속 수준에서, 그리고 대부분은 종 수준에서 정확히 균을 식별·동정할 수 있음을 나타내었다.
현재 시판되고 있는 실시간 PCR 기기의 PCR 튜브 간 측정 오차는 대부분이 ±0.3℃ 이내이기　때문에, IMLL 프로브를 사용하면, 거의 모든 기기로 Tm 매핑법의 시행이 가능해졌다.
[0023] 한편, 패혈증 환자로부터 채취한 전혈 검체(EDTA 채혈관 2mL) 14검체를 사용하여, IMLL 프로브(배열번호 1∼7)를 사용한 Tm 매핑법의 정밀도를 종래의 배양법의 그것과 비교하여 평가하였다.
실시간 PCR 기기는 QIAGEN사의 RotorGene Q(온도 균일성: ±0.1℃)를 사용하고, 기염균 데이터베이스는 71균종의 예비 데이터베이스를 사용하였다.
배양법 또는 시퀀스 결과와 비교한 IMLL 프로브를 사용한 각각의 Tm 매핑법 기염균 동정 결과를 표 2(도 10)에 나타낸다.
Tm 매핑법 기염균 동정 결과가 배양 결과와 일치하지 않을 경우, 시퀀스법을 이용하여 다시 균종 동정을 행하였다. 합계 14검체로 Tm 매핑법에 의한 기염균 동정을 행한 결과, 14검체 모두(14/14)에 있어서, 배양 결과 또는 시퀀스 결과와 일치하였다.
단, IMLL 프로브법에 의해 Staphylococcus속으로 동정된 경우, S. aureus 검출용 쇼트 프로브를 사용하여, S. aureus인지?　혹은 그 이외의 Staphylococcus속(=CNS)인지?…의 추가 검사를 행하고 있다(약 10분의 추가 검사로 판정 가능).
[0024] 다음으로, 본 발명의 7개의 IMLL 프로브(배열번호 1∼7)를 사용하여 QIAGEN사의 RotorGene Q(온도 균일성: ±0.1℃)로 복수 회(예컨대 3회) 측정한 Tm값의 평균을 이용해, 146균종의 Tm 매핑 형상을 갖는 광범위한 데이터베이스를 구축하였다.
등록한 145균종(65균속(菌屬))은 이하와 같음: Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter baumanii, Acinetobacter calcoaceticus, Aeromonas hydrophila, Alistipes onderdonkii, Anaerococcus vaginalis, Arthrobacter cumminsii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis subsp. Subtilis, Bacteroides dorei, Bacteroides finegoldii, Bacteroides fragilis, Bacteroides nordii, Bacteroides salyersiae, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniformis, Bacteroides vulgatus, Bartonella henselae, Bifidobacterium bifidum, Bilophila wadsworthia, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brevibacillus laterosporus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni subsp.jejuni, Campylobacter rectus, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga granulosa, Capnocytophaga haemolytica, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Chryseobacterium gleum, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter freundii, Clostridium difficile, Clostridium histolyticum, Clostridium hylemonae, Clostridium paraputrificum, Clostridium perfringus, Clostridium sporogenes, Clostridium subterminal, Clostridium tertium, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium macginleyi, Corynebacterium striatum, Corynebacterium xerosis, Eggerthella lenta, Eikenella corrodens, Empedobacter brevis, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae subsp.cloacae, Enterococcus avium, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Enterococcus raffinosus, Escherichia albertii, Escherichia coli, Eubacterium limosum, Finegoldia magna, Fusobacterium necrophorum, Fusobacterium periodonticum, Fusobacterium varium, Gardnerella vaginalis, Gemella morbillorum, Geobacillus stearothermophilus, Haemophilus influenzae, Halmonas venusta, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Kocuria rosea, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus jensenii, Lactococcus garvieae, Legionella pneumophila subsp.pneumophila, Leptospira interrogans serovar Copenhageni, Listeria monocytogenes, Micrococcus luteus, Morganella morganii, Nocardia cyriacigeorgica, Odoribacter splanchinicus, Pantoea agglomerans, Parvimonas micra, Pasteurella multocida, Peptoniphilus asaccharolyticus, Peptoniphilus gorbachii, Peptostreptococcus anaerobius, Plesiomonas shigelloides, Porphyromonas gingivalis, Prevotella corporis, Prevotella intermedia, Prevotella melaninogenica, Prevotella timonensis, Prevotella veronalis, Propionibacterium acnes, Propionibacterium granulosum, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Salmonella enterica, Serratia marcescens, Serratia plymuthia, Staphylococcus aureus, Staphylococcus capitis/epidermidis, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus saprophyticus subsp.saprophyticus, Staphylococcus schleiferi subsp.coagulans, Staphylococcus simulans, Staphylococcus warneri, Stenotrophomonas maltophilia, Streptobacillus moniliformis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus anginosus, Streptococcus bovis, Streptococcus constellatus, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus gallolyticus subsp.pasteurianus, Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis, Streptococcus orali, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguinis, Tannerella forsythus, Treponema denticola, Vibrio fluvialis, Vibrio vulnificus, Yersinia enterocolitica subsp.enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis
[0025] · IMLL 프로브를 사용한 Tm 매핑법의 정밀도의 평가(145균종).
IMLL 프로브를 사용한 Tm 매핑 방법의 정밀도를 보다 상세히 평가하기 위해, 우선 145종(65균속)의 세균 DNA를 이용하여 광범위한 데이터베이스를 작성하고, 다음으로 145균종의 데이터베이스에 등록된 것과 동일한 세균 DNA를 이용하여, 로슈·라이프 사이언스사(Roche Life Science社)의 Light Cycler(등록 상표) 480(온도 균일성: ±0.4℃)을 사용해 블라인드 테스트를 행하였다.
즉, 세균의 이름을 감추고, IMLL 프로브를 사용한 Tm 매핑법으로 세균 DNA를 동정하였다.
결과를 표 3-1(도 11) 및 표 3-2(도 12)에 나타낸다.
블라인드 테스트의 결과, 종 수준에서는 145균종 중 115균종이 일치, 속 수준에서는 65균속 모두가 일치하였다. 종 수준에서 불일치의 30균종은, 데이터베이스를 작성한 시점에서 온도 균일성이 ±0.4℃인 기기로는 동일한 속(屬)의 균끼리 좁힐 수 없는 것으로 밝혀졌다.
즉, 예측대로의 결과였다.
온도 균일성이 ±0.4℃인 기기로 종 수준에 있어서 동정할 수 없는 균은, Bacillus속(屬)에서는 6균종 중 3균종, Bacteroides속(屬)에서는 8균종 중 2균종, Campylobacter속(屬)에서는 3균종 중 2균종, Corynebacterium속(屬)에서는 4균종 중 2균종, Enterococcus속(屬)에서는 7균종 중 5균종, Proteus속(屬)에서는 2균종 중 2균종, Staphylococcus속(屬)에서는 11균종 중 9균종, Streptococcus속(屬)에서는 14균종 중 5균종이었다.
이상의 결과, 온도 균일성이 ±0.4℃인 기기를 사용한 경우에도, 65균속을 속 수준에서 정확히 동정할 수 있고, 종 수준에서도 145균종 중 115균종을 정확히 동정할 수 있음을 나타내었다.
적어도 속 수준에서 기염균을 신속히 동정할 수 있으면, 대부분의 경우는 항균약의 선택이 가능하지만, 종 수준의 동정이 필요한 경우는 균종 특이적 쇼트 프로브를 사용하면 된다.
속(屬)이 판명된 후에 쇼트 프로브를 추려서 선택할 수 있고, 10분 정도의 추가 검사로 균종을 종 수준에서 동정할 수 있다.
[0026] 마지막으로, 패혈증 환자로부터 채취한 전혈 검체(EDTA 채혈관 2mL) 40검체(9균종)를 사용하여, IMLL 프로브(배열번호 1∼7)를 사용한 Tm 매핑법의 정밀도를 종래의 배양법의 그것과 비교하여 평가하였다.
실시간 PCR 기기는 로슈·라이프 사이언스사의 Light Cycler(등록 상표) 480(온도 균일성: ±0.4℃)을 사용하고, 기염균 데이터베이스는 145균종의 데이터베이스를 사용하였다.
배양법 또는 시퀀스 결과와 비교한 IMLL 프로브를 사용한 각각의 Tm 매핑법 기염균 동정 결과를 표 4(도 13)에 나타낸다.
Tm 매핑법 기염균 동정 결과를 Staphylococcus속까지 밖에 좁힐 수 없는 경우, S. aureus 검출용 쇼트 프로브를 추가로 사용하여, S. aureus인지, 혹은 S. aureus 이외의 Staphylococcus속(CNS)인지의 판정을 행하였다.
합계 40검체로 Tm 매핑법에 의한 기염균 동정을 행한 결과, 39검체(39/40)에 있어서 종래의 배양 결과와 일치하였다.
단, 배양으로 복수의 균이 검출된 경우, Tm 매핑법으로는 수적으로 우위인 균만을 동정한다.
복수의 균이 수적으로 동일한 정도로 존재하는 경우(검체 No. 40), Tm 매핑법으로는 동정할 수 없어서, 불일치 결과로 하였다.
이상의 결과, 온도 균일성이 ±0.4℃인 기기를 사용한 경우에도, 패혈증 환자 40검체(9균종) 중 39검체를 정확히 동정할 수 있음을 나타내었다.
적어도 속 수준에서 기염균을 신속히 동정할 수 있으면, 대부분의 경우는 항균약의 선택이 가능하지만, 종 수준의 동정이 필요한 경우는 이번 S. aureus 검출용 쇼트 프로브와 같이 균종 특이적 쇼트 프로브를 사용하면 된다.
속이 판명된 후에 쇼트 프로브를 추려서 선택할 수 있고, 10분 정도의 추가 검사로 균종을 종 수준에서 동정할 수 있다.
도 1은, 종래의 Tm 매핑법의 개요도를 나타낸다. 개요도 중에 나타낸 그래프는, 이미지를 나타내는 것이며, 수치는 표시하지 않았다.
도 2는, 본 발명의 개량 Tm 매핑법의 개요도를 나타낸다. 개요도 중에 나타낸 그래프는, 이미지를 나타내는 것이며, 수치는 표시하지 않았다.
도 3은, 프라이머와 프로브 설계의 전략을 나타내는 도면이다. 네스티드 PCR은, 5개의 세균 유니버설 프라이머 세트를 사용하여 실시되고, 7개의 IMLL 프로브가 각각 PCR 앰플리콘에 추가적으로 사용되고, 이어서 7개의 Tm값이 얻어진다.
도 4는, 각 IMLL 프로브의 결합 부위를 나타내는 도면이다.
도 5는, 데이터베이스에 등록된 71균종의 Tm 매핑 형상(IMLL 프로브)을 나타내는 도면이다. 참고로, 도 5는 Tm 매핑 형상을 이미지도(圖)로서 나타낸 것이고, X축은 7개의 Tm값의 평균을 나타내는데, 구체적인 수치는 생략되어 있다.
도 6은, 데이터베이스 중의 균종과의 Tm 매핑 형상의 유사성을 나타내는 차이값(Difference Value)에 관한 계산식을 나타낸다.
도 7은, 종래의 Tm 매핑법으로 얻어지는 Tm값의 편차 범위와, 개량 Tm 매핑법으로 얻어지는 Tm값의 편차 범위와의 차이를 나타낸다.
도 8은, IMLL 프로브 1-2와 각 균종(71균종)의 표적 배열과의 미스매치를 나타낸다.
도 9는, 데이터베이스 중의 71균종 간의 Tm 매핑 형상의 유사성(표 1)을 나타낸다.
도 10은, 71균종의 데이터베이스를 작성하고, 온도 균일성 ±0.1℃인 실시간 PCR 기기를 사용하여 전혈 시료로부터 개시(開始)한 동정의 각각의 결과(표 2)를 나타낸다.
도 11은, 145균종의 데이터베이스를 작성하고, 온도 균일성 ±0.4℃인 실시간 PCR 기기를 사용하여 블라인드 테스트를 행한 각각의 결과(표 3-1)를 나타낸다.
도 12는, 도 11에 이어지는 표 3-2를 나타낸다.
도 13은, 145균종의 데이터베이스를 작성하고, 온도 균일성 ±0.4℃인 실시간 PCR 기기를 사용하여 전혈 시료로부터 개시한 동정의 각각의 결과(표 4)를 나타낸다.
[0028] 다음으로, 본 발명의 불완전 일치 배열의 선형 장쇄 프로브를 사용한 개량 Tm 매핑법을 실시예에서 설명한다.
덧붙여, 본 발명에 따른 프로브를 IMLL 프로브(Imperfect-Match Linear Long probes)라고 표현하였다.
전체의 흐름(워크플로)을 도 2에 나타낸다.
혈액 검체는, 토야마(富山) 대학병원과 나가레스기(流杉) 병원에 있어서, 패혈증이 의심되는 환자로부터 채취한 전혈이며, 이하의 실시예의 모든 절차는, 토야마 대학 윤리위원회의 승인 및 모든 환자로부터 문서에 의한 동의를 얻어 행해졌으며, 또한 실시예의 방법은, 승인된 가이드 라인에 따라 실시되었다.
실시예 1
[0029] ＜전혈로부터의 세균 게놈 DNA의 단리(單離)＞
예컨대, 정맥으로부터 EDTA 채혈관으로 채혈하고, 경도(輕度)의 원심 조작(100×g)으로 혈구를 분리하여 상청액(上淸, supernatant)을 얻는다. 이 상청액을 튜브로 옮기고, 강한 원심 조작(20,000×g)을 행함으로써 세균의 펠릿을 얻는다.
구체적으로는, EDTA 튜브(EDTA-2K 진공 채혈관, 니프로 주식회사(NIPRO Corporation))에 2mL의 정맥혈을 채취하였다.
그 후, 혈액 샘플을 100×g로 5분간 원심 분리하여 혈액 세포를 스핀 다운(spin down)하고, 얻어진 상청액 분획(上淸劃分, supernatant fraction)(1mL, 버피 코트(buffy coat)도 포함함)을 사용하였다.
상청액을 다시 20,000×g로 10분간 원심 분리하고, 펠릿을 흐트러뜨리지 않도록 상청액 분획을 제거하였다.
다음으로, 분자 레벨의 증류수(분자생물학을 위해 탈이온 멸균된 물, NACALAI TESQUE, INC; 이하, 멸균수)를 1mL 첨가하고, 부드럽게 상하 거꾸로 한 후, 20,000×g로 5분간 원심 분리하였다.
이어서, DNA 추출 키트를 사용하기 전에, 펠릿을 재현탁(再懸濁)하지 않도록, 상청액 분획을 다시 주의 깊게 제거하였다.
다음으로, 공급자의 프로토콜에 따라 DNA 추출 키트(QIAamp UCP Pathogen Mini Kit, Qiagen, Germany)를 사용하여 펠릿으로부터 DNA를 단리하였다.
이어서, 100μL의 용출 완충액으로 세균 DNA를 용출(溶出)시켰다.
[0030] ＜세균 콜로니(colony)로부터의 세균 게놈 DNA의 단리＞
세균 콜로니를 멸균 접종 루프로 채취하여 멸균수 1mL에 현탁하였다.
계속해서 20,000×g로 10분간 원심 분리한 후, 상청액을 제거하고 펠릿을 얻었다.
공급자의 프로토콜에 따라, DNA 추출 키트(QIAamp UCP Pathogen Mini Kit, Qiagen)를 사용하여, 얻어진 펠릿으로부터 DNA를 단리하였다. 다음으로, 100μL의 용출 완충액으로 세균 DNA를 용출시켰다.
[0031] ＜PCR 어세이(assay)＞
증폭에는 VeritiTM Thermal Cycler(Applied Biosystems)를 사용하고, IMLL 프로브의 Tm값 해석에는 LightCycler Nano(Roche Applied Science)를 사용하였다.
여기서, 2개의 독립적인 서멀 블록(thermal block)을 갖는 LightCycler Nano를 사용할 경우, Tm 매핑법에 의한 기염균 동정을 위해 7개의 PCR 튜브 모두에 동일한 서멀 블록을 사용하는 것이 바람직하다.
모든 PCR 어세이는, 단일 튜브 어세이(멀티플렉스 PCR 없음)로서 행하였다.
최초의 PCR[PCR(one tube)]에는 RNase 및 DNase 프리(free)인 PCR 튜브(Eppendorf, Germany), 0.2mL PCR 튜브(Qiagen), 네스티드 PCR[Nested PCR(five tubes)]에는 0.1mL의 Strip Tubes and Caps(Qiagen)를 사용하였다.
모든 올리고뉴클레오타이드 프라이머는, 멀티플 얼라인먼트 소프트웨어 프로그램(Clustal X)을 사용하여 설계되고, 라이프 테크놀로지스 재팬 주식회사(Life Technologies Japan Ltd.)(도쿄, 일본)에 의해 합성되었다.
본 시행에 있어서는, IMLL 프로브로서 소광 프로브(Q-프로브)를 채용하였다.
모든 소광 프로브는 멀티플 얼라인먼트 소프트웨어 프로그램(Clustal X)을 사용하여 설계되고, 닛폰스틸 스미킨 에코테크 주식회사(NIPPON STEEL & SUMIKIN ECO-TECH Corporation)(쓰쿠바, 일본)에 의해 합성되었다.
박테리아의 16S 리보솜 RNA 유전자의 7개의 영역을 보편적으로 증폭하도록 박테리아 유니버설 프라이머를 설계하였다(도 3).
[0032] ＜퍼스트 PCR 프라이머＞
· 순방향: 5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'
· 역방향: 5'-CCGGGAACGTATTCACC-3'
(앰플리콘 사이즈: 1378bp)
<세컨드 PCR(nested PCR)용, 영역 1 프라이머＞
· 순방향: 5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'
· 역방향: 5'-CGTAGGAGTCTGGACCGT-3'
(앰플리콘 사이즈: 338bp)
＜세컨드 PCR(nested PCR)용, 영역 2 프라이머＞
· 순방향: 5'-GACTCCTACGGGAGGCA-3'
· 역방향: 5'-TATTACCGCGGCTGCTG-3'
(앰플리콘 사이즈: 199bp)
＜세컨드 PCR(nested PCR)용, 영역 3 프라이머＞
· 순방향: 5'-AGCAGCCGCGGTAATA-3'
· 역방향: 5'-GGACTACCAGGGTATCTAATCCT-3'
(앰플리콘 사이즈: 287bp)
＜세컨드 PCR(nested PCR)용, 영역 4 프라이머＞
· 순방향: 5'-AACAGGATTAGATACCCTGGTAG-3'
· 역방향: 5'-AATTAAACCACATGCTCCACC-3'
(앰플리콘 사이즈: 181bp)
＜세컨드 PCR(nested PCR)용, 영역 5 프라이머＞
· 순방향: 5'-TGGTTTAATTCGATGCAACGC-3'
· 역방향: 5'-GAGCTGACGACAGCCAT-3'
(앰플리콘 사이즈: 120bp)
[0033] 상기의 세균 유니버설 프라이머에 의한 네스티드 PCR로 얻어진 5개의 앰플리콘의, 각각에 결합하는 이하의 7개의 Q-프로브를 설계하였다(도 3 및 도 4).
＜IMLL 프로브 1-1＞
· 5'-GTTATCCCACTCTAATAAGCAGGTTACCTACGTATTACTCACCC-3'
[프로브 사이즈: 44bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA(Accession No. AB548582)의 84-126]
＜IMLL 프로브 1-2＞
· 5'-CACCTACTAGCTAATCTTATCTGGGCACATCCGATGGC-3'
[프로브 사이즈: 38bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA의 193-230]
＜IMLL 프로브 2-1＞
· 5'-CACGCGGCATGGCTCCATCAGGCTTTCCCCCATTGTCGAAGATTC-3'
[프로브 사이즈: 45bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA의 335-379]
＜IMLL 프로브 3-1＞
· 5'-CGCCCTGTAATTCCGAATAACGCTAGCTCCCACCGTATTAC-3'
[프로브 사이즈: 41bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA의 503-543]
＜IMLL 프로브 3-2＞
· 5'-CCAAGTTGAGCCCGGGCCTTTCACTACTGACTTAACAAACCGCC-3'
[프로브 사이즈: 44bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA의 557-600]
＜IMLL 프로브 4-1＞
· 5'-GGCACAACCTCTTAATACTCATCGTTTACAGCGTGGAC-3'
[프로브 사이즈: 38bp, 대장균 16S rRNA의 776-813]
＜IMLL 프로브 5＞
· 5'-ATCTCTGCAAAGTTCTAAGGATGTCAAGATTAGGTAAGGTTC-3'
[프로브 사이즈: 42bp, 결합 부위: 대장균 16S rRNA의 949-990]
＜S. aureus 검출용 쇼트 프로브＞
· 5'-TATCTAATGCAGCGCGGATC-3': 배열번호 8
[프로브 사이즈: 20bp, 결합 부위: 황색포도상구균 16S rRNA(Accession No. AB681291)의 211-230)
[0034] ＜퍼스트 PCR의 순서＞
PCR 반응 혼합물(20μL)의 조성은 이하와 같음: 200μM의 각 핫 스타트 dNTP(CleanAmpTM Hot Start dNTP Mix, Sigma-Aldrich, USA: 사용 전에 Amicon Ultra 50K 원심 필터(Merck Millipore, Germany)로 여과했음), DNA 주형 2μL, 50mM 염화 칼륨, 2.25mM 염화 마그네슘, 10mM 트리스 염산 완충액(pH 8.3), 0.3μM의 각 프라이머, 스톡 버퍼(stock buffer) 용액에 용해한 「진핵 생물을 호스트 세포로서 제작한 내열성 DNA 폴리메라아제」 1.0단위(0.5μL).
이 PCR 반응 혼합물(20μL)로 1st PCR을 실시하였다.
덧붙여, 사카로미세스·세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)를 사용한 「진핵 생물을 호스트 세포로 하는 내열성 DNA 폴리메라아제의 제작」은 공지 방법에 따랐다.
양성 컨트롤로서 대장균(ATCC 25922)으로부터 추출된 2μL(8.0ng/μL)의 DNA를, 음성 컨트롤로서 2μL의 멸균수(NACALAI TESQUE, INC.)를, 각각 2μL의 DNA 템플릿 대신에 사용하였다.
각 샘플을 95℃에서 5분간 인큐베이트하여 핫 스타트 dNTP를 활성화한 후, 94℃에서 10초간 변성시키고, 57℃에서 10초간 어닐(anneal)하고, 72℃에서 30초간 40사이클 신장시켰다.
상기의 결과 생긴 PCR 산물을 멸균수(NACALAI TESQUE, INC)로 100배로 희석하고, 이어서 세컨드(네스티드) PCR의 템플릿으로서 사용하였다.
[0035] ＜세컨드(네스티드) PCR의 순서＞
PCR 반응 혼합물(20μL)의 조성은 이하와 같음: 200μM의 각 핫 스타트 dNTP(CleanAmpTM Hot Start dNTP Mix, Sigma-Aldrich, USA: 사용 전에 Amicon Ultra 50K 원심 필터(Merck Millipore, Germany)로 여과했음), 1st PCR 산물을 100배 희석한 DNA 템플릿 2μL, 50mM 염화 칼륨, 2.25mM 염화 마그네슘, 10mM 트리스 염산 완충액(pH 8.3), 각 포워드(forward) 프라이머 0.75μM, 각 리버스(reverse) 프라이머 0.25μM, 및 스톡 버퍼 용액에 용해한 「진핵 생물을 호스트 세포로서 제작한 내열성 DNA 폴리메라아제」 1.0단위(0.5μL).
영역 1∼5를 증폭하기 위해 사용한 7개의 PCR 반응 혼합물(20μL)을 95℃에서 5분간 인큐베이트하여 핫 스타트 dNTP를 활성화하고, 이어서 94℃에서 10초간 변성하고, 57℃에서 10초간 어닐하고, 72℃에서 10초간 신장시켰다.
30사이클 실시.
[0036] ＜Tm값의 해석＞
세컨드 PCR의 증폭 산물 20μL 중 8μL를 채취하고, 각각 0.12μM의 IMLL Q-프로브(합계 10μL)와 혼합하였다.
Tm값 해석을 위한 전(前)단계 공정으로서, 얻어진 7종의 혼합물을 95℃에서 5분간 가열하고, 4℃/초(秒)로 단계적으로 저하시키고, 이어서 40℃에서 1분간 냉각하였다.
Tm값의 해석은, 40℃∼80℃에서, 0.1℃/스텝(step)으로 온도를 증가시켜 행하였다.
계속해서, LightCycler(등록 상표) Nano 소프트웨어 프로그램을 사용하여 데이터 프로파일을 분석하고, Tm값을 측정하였다.
[0037] ＜기염균 동정 감도의 측정＞
IMLL 프로브를 사용한 Tm 매핑법에 의한 균의 동정 및 검출의 한계는, 기지(旣知)의 균수(CFU)의 대장균(E. coli)을 인산 생리식염액 중에 용해하고, 그 균액(菌液)을 연속적으로(log2배로) 희석한 후, IMLL Q프로브를 사용하여 각 희석 균액을 Tm 매핑법으로 동정을 행함으로써 결정하였다.
동정의 한계는, 「Tm 매핑법에 의한 동정 결과(Difference Value값이 0.5 이하)가 맞는 경우에 있어서, 희석계열(稀釋系列)의 가장 묽은 log2 희석이다」라고 정의된 후에 측정하였다.
LOD(=Limit Of Detection, 즉, 검출 한계)는, 「7개의 Tm값 중 적어도 1개가 측정된 경우의 DNA 템플릿의 최종 log2 희석이다」라고 정의된 후에 측정하였다.
[0038] ＜시퀀스에 의한 세균 게놈 DNA 배열에 근거한 균종 동정＞
최초의 PCR 순서에서 사용된 샘플로부터의 앰플리콘을 정제(精製)하고(QIAquick PCR 정제 키트; QIAGEN), 그 후, 영역 1 포워드 프라이머 및 영역 5 리버스 프라이머를 사용하여 시퀀스를 행하고(3500 Genetic Analyzer; Applied Biosystems), 염기 배열을 결정하였다.
세균 게놈 DNA 배열에 근거한 균종 동정 방법은, DNA 데이터 뱅크(http://www.ddbj.nig.ac.jp/index-j.html)의 BLAST 뉴클레오티드(nucleotide) 데이터베이스 툴을 사용하여, 균종의 온라인 상동성 검색을 행하였다.
[0039] ＜종래의 배양법을 이용한 세균의 생화학적 동정＞
동일한 천자(穿刺) 부위로부터, 혈액 배양용 전혈액(全血液) 샘플(1개의 호기성 혈액 배양병 및 1개의 혐기성 혈액 배양병)을 Tm값 분석을 위한 혈액 샘플과 동시에 수집하였다.
세균의 생화학적 동정에서는, 토야마 대학부속병원 검사부(ISO15189 인증)의 표준적인 방법에 따라 전혈 검체를 분석하였다.
혈액 배양 순서는, BacT/ALERT 3D 시스템(bioMerieux, Inc., Mercy-l' Etoile, France)을 이용하여 행하였다.
양성의 혈액 배양병을 적절한 배지(培地)에서 계대 배양(繼代培養)하고, 충분한 증식이 얻어질 때까지(통상 18∼24시간) 호기적 또는 혐기적으로 인큐베이트하였다.
호기성 균은 주로 MicroScan WalkAway 시스템(Siemens Healthcare Diagnostics, IL, USA), RapID ANA II(Thermo Fisher SCIENTICIC, UK)을 이용하여 동정하고, 혐기성 균은 주로 다양한 라텍스 응집 및 생화학적 스폿 테스트를 이용하여 동정을 행하였다.
단, 균종에 따라서는 특정한 동정 방법을 행하였다.
[0040] 본 발명의 7개의 IMLL 프로브를 사용하는 개량 Tm 매핑법은, PCR 튜브 간의 Tm값 측정 오차가 ±0.5℃ 이내인 실시간 PCR 기기로도 적어도 속 수준에서, 그리고 대부분은 종 수준에서 정확히 균을 식별·동정할 수 있다.
따라서, 거의 모든 실시간 PCR 기기로 Tm 매핑법의 시행이 가능해지기 때문에, 검체 채취 후 4시간 정도 만에 불특정 감염증 기염균을 동정할 수 있는 본 검사법의 광범위한 보급이 기대된다.
SEQUENCE LISTING <110>University of Toyama <120>Improved Tm mapping method <160>34 <210>1 <211>38 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>probe <400>gttatcccactctaataagcaggttacctacgtattactcaccc <210>2 <211>42 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>probe <400>cacctactagctaatcttatctgggcacatccgatggc <210>3 <211>45 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>probe <400>cacgcggcatggctccatcaggctttcccccattgtcgaagattc <210>4 <211>41 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>probe <400>cgccctgtaattccgaataacgctagctcccaccgtattac <210>5 <211>44 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>probe <400>ccaagttgagcccgggcctttcactactgacttaacaaaccgcc <210>6 <211>38 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>probe <400>ggcacaacctcttaatactcatcgtttacagcgtggac <210>7 <211>42 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>probe <400>atctctgcaaagttctaaggatgtcaagattaggtaaggttc <210>8 <211>20 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>probe <400>tatctaatgcagcgcggatc <210>9 <211>20 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>primer <400>agagtttgatcatggctcag <210>10 <211>17 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>primer <400>ccgggaacgtattcacc <210>11 <211>20 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>primer <400>agagtttgatcatggctcag <210>12 <211>18 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>primer <400>cgtaggagtctggaccgt <210>13 <211>17 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>primer <400>gactcctacgggaggca <210>14 <211>17 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>primer <400>tattaccgcggctgctg <210>15 <211>16 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>primer <400>agcagccgcggtaata <210>16 <211>23 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>primer <400>ggactaccagggtatctaatcct <210>17 <211>23 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>primer <400>aacaggattagataccctggtag <210>18 <211>21 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>primer <400>aattaaaccacatgctccacc <210>19 <211>21 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>primer <400>tggtttaattcgatgcaacgc <210>20 <211>17 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>primer <400>gagctgacgacagccat <210>21 <211>40 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>probe <400>cagaccagctaacgatcgtcgccttagtaagccgttaccc <210>22 <211>42 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>probe <400>ctcagaccagctaacgatcgttgccttagtaagccgttacct <210>23 <211>43 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>probe <400>gtactttacaacccgaaggccttcttcatacacgcggcatggc <210>24 <211>35 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>probe <400>ccttatcgccttcctccccgctgaaagtgctttac <210>25 <211>41 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>probe <400>cgcccagtaattccgattaacgcttgcaccctccgtattac <210>26 <211>41 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>probe <400>ggccgactaattccgattaacgcttccacgctccgtattac <210>27 <211>50 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>probe <400>cttaacaaaccgcctacgcaccctttaagcccaataattccgattaacgc <210>28 <211>40 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>probe <400>ctcaagtttgccagtttccgatgaagttcccaggttgagc <210>29 <211>40 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>probe <400>ctcaagtttgccagtttcggatgcagtttccaggttgagc <210>30 <211>42 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>probe <400>ccacctctatgcagacatcgtttacggcgtggactaccaggg <210>31 <211>40 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>probe <400>cctccagtttgtcatcggcagtctacattgagttcccaac <210>32 <211>40 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>probe <400>cctccagtttgtcaccggcagtctacattgagttcccaac <210>33 <211>43 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>probe <400>cttcatgtaatcaggttgcagactccaatccggactaagacgc <210>34 <211>42 <212>DNA <213>Artifical Sequence <223>probe <400>ctagcgattccgacttcatgaatacgagttgcagcctacaat

Claims (6)

  1. 감염증 기염균(起炎菌)의 동정(同定) 방법으로서, 하기 (1)∼(5)의 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 감염증 기염균의 동정 방법.
    (1) 혈액 등의 검체로부터 미생물의 DNA를 추출하는 공정.
    (2) 추출한 미생물 DNA를 주형(鑄型)으로 하고, 복수의 세균 유니버설 프라이머(universal primer)를 사용하여 네스티드(nested) PCR을 행하는 공정.
    (3) 유전자 증폭물에, 불완전 일치 배열의 선형(線狀) 장쇄(長鎖) 프로브(IMLL 프로브)를 가하고, IMLL 프로브의 융해 온도(Tm)값의 해석을 행하는 공정.
    (4) 복수의 IMLL 프로브의 Tm값을 이차원으로 매핑하는 공정.
    (5) 이차원 매핑의 「형상」을 데이터베이스와 대조하는 공정.
    상기 공정 (3)의 불완전 일치 배열의 선형 장쇄 프로브는, 균종(菌種)의 차이에 따른 Tm값의 차이가, 균종 간에 최대 20℃ 이상의 차이이며, 불완전 일치 배열의 선형 장쇄 프로브는 배열번호 1∼8 또는 배열번호 21∼34 중, 어느 한 염기 배열을 가짐.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 공정 (2)의 복수의 세균 유니버설 프라이머를 사용하여 네스티드 PCR을 행하는 공정은, 복수 회의 공정으로 이루어지는 감염증 기염균의 동정 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 공정 (3)의 불완전 일치 배열의 선형 장쇄 프로브는, 35∼50의 염기로 이루어지고, 미스매치(mismatch)의 수와 위치에 따라, 상기 균종의 차이에 따른 Tm값의 차이가 유전자 증폭물에 따른 Tm값의 차이보다 큰 감염증 기염균의 동정 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 배열번호 1∼8 또는 배열번호 21∼34 중, 어느 한 염기 배열을 갖는 불완전 일치 배열의 선형 장쇄 프로브로서, 감염증 기염균(起炎菌)의 동정(同定) 방법에 사용하기 위한 프로브.
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