CN104087654B - 沙门氏菌及其五种血清型的多重pcr鉴定试剂盒 - Google Patents

沙门氏菌及其五种血清型的多重pcr鉴定试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种沙门氏菌及其五种血清型的多重PCR鉴定试剂盒。本发明提供了检测沙门氏菌及其五种血清型的引物组，由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5和引物对6组成。本发明针对沙门氏菌和五种重要的血清型（鼠伤寒、肠炎、阿贡那、猪霍乱和鸡白痢沙门氏菌）的特异性片段，设计用于特异扩增的六对引物，扩增片段大小分别为沙门氏菌-425bp、鼠伤寒-198bp、肠炎-302bp、阿贡那-145bp、猪霍乱-368bp、鸡白痢-249bp，样品基因组经过多重PCR、电泳检测，即可做出相应判定。本发明通过提供六对特异性引物，利用一步多重PCR，可以鉴定出沙门氏菌和五种重要的血清型，具有快速、低成本、操作简单和结果易于判定的特点。

Description

沙门氏菌及其五种血清型的多重PCR鉴定试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种沙门氏菌及其五种血清型的多重PCR鉴定试剂盒。
背景技术
沙门氏菌作为重要的病原微生物之一，可以通过食物传播给人类，造成胃肠炎、败血症等症状，已经成为全世界范围内重要的食源性病原微生物。生化鉴定和血清学分型是研究沙门氏菌病流行病学的常用方法，由于沙门氏菌有2600多种血清型，常规血清学分型需要大量的诊断血清、熟练的技术人员和繁琐的操作步骤，由于粗糙型菌和单相菌的存在，导致常规血清学分型对部分沙门氏菌无法准确分型。因此，更加简单、准确、快速的鉴定方法在实践中具有重要的意义。目前，鼠伤寒、肠炎、阿贡那、猪霍乱和鸡白痢沙门氏菌作为常见的沙门氏菌，建立快速对其进行鉴定的方法在流行病学调查和临床诊断实践中至关重要。
多重PCR技术是在常规PCR的基础上改进而来，即在一个PCR反应体系中，通过添加多对引物，对多个靶点序列进行扩增、检测，其反应原理、试剂组成和操作过程与常规PCR一致，具有更加高效、经济的特点。
通过对已有文献的检索发现，目前对沙门氏菌的PCR鉴定有两种思路：一是针对每个血清型的特异性片段，设计引物进行鉴定；二是针对O抗原和H抗原的编码相关基因，设计引物进行鉴定。刘斌等人（2012）在《FoodControl》杂志发表了《DevelopmentofanovelmultiplexPCRassayfortheidentificationofSalmonellaentericaTyphimuriumandEnteritidis》，针对鼠伤寒和肠炎沙门氏菌的特异性片段设计出引物，对其进行鉴定，由于仅仅能够鉴定两种血清型，具有一定的局限性。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测或辅助检测沙门氏菌或其五种血清型的引物组。
本发明提供的引物组，由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5和引物对6组成；
所述引物对1由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成；
所述引物对2由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成；
所述引物对3由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链DNA分子组成；
所述引物对4由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链DNA分子组成；
所述引物对5由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链DNA分子组成；
所述引物对6由序列表中序列17所示的单链DNA分子和序列表中序列18所示的单链DNA分子组成。
上述引物组中，所述引物组中各条引物之比为等摩尔比；
所述沙门氏菌五种血清型为鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、阿贡那沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。
本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测沙门氏菌或其五种血清型的PCR试剂。
本发明提供的PCR试剂，由上述的引物组、PCR缓冲液和水组成；
上述PCR缓冲液为PremixExTaqTMVersion2.0(Loadingdyemix)，购自TaKaRa，D335A；含有Taq酶、dNTP、Mg2+、Loadingbuffer；其中，Taq酶在反应体系中的量为0.5U、各种dNTP在反应体系中的终浓度均为0.2mM、Mg2+在反应体系中的终浓度为2mM。
所述引物组中的各条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为0.1μM；
所述沙门氏菌五种血清型具体为鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、阿贡那沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。
上述水为无菌水。
本发明的第三个目的是提供一种检测或辅助检测沙门氏菌或其五种血清型的PCR试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或上述PCR试剂；所述沙门氏菌五种血清型具体为鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、阿贡那沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。
上述的引物组或上述PCR试剂在制备检测和/或辅助检测待测细菌是否为沙门氏菌产品中的应用；
或上述的引物组或上述PCR试剂在制备检测和/或辅助检测待测细菌是否为沙门氏菌五种血清型中的任一种产品中的应用也是本发明保护的范围；上述应用中，所述沙门氏菌五种血清型具体为鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、阿贡那沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。
上述应用中的检测和/或辅助检测为用上述的引物组或上述PCR试剂对所述待测细菌进行多重PCR扩增。
上述应用中，所述多重PCR扩增的退火温度为60℃。
本发明的第四个目的是提供一种引物对。
本发明提供的引物对，为如下6种引物对中的任一种：引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5和引物对6；
所述引物对1由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成；
所述引物对2由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成；
所述引物对3由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链DNA分子组成；
所述引物对4由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链DNA分子组成；
所述引物对5由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链DNA分子组成；
所述引物对6由序列表中序列17所示的单链DNA分子和序列表中序列18所示的单链DNA分子组成。
本发明涉及一种基于多重PCR（multiplexpolymerasechainreaction）技术的食源性病原微生物快速鉴定技术。针对沙门氏菌和五种重要的血清型（鼠伤寒、肠炎、阿贡那、猪霍乱和鸡白痢沙门氏菌）的特异性片段，设计用于特异扩增的六对引物，扩增片段大小分别为沙门氏菌-425bp、鼠伤寒-198bp、肠炎-302bp、阿贡那-145bp、猪霍乱-368bp、鸡白痢-249bp，样品基因组经过多重PCR、电泳检测，即可作出相应判定。本发明通过提供六对特异性引物，利用一步多重PCR，可以鉴定出沙门氏菌和五种重要的血清型，具有快速、低成本、操作简单和结果易于判定的特点。
附图说明
图1为多重PCR的扩增结果图
图2为灵敏度检测结果图
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、用于检测沙门氏菌及其血清型的引物的获得
运用生物信息学分析工具BLAST，在全基因组中找出沙门氏菌特异性序列InvA基因（序列1）和五种血清型的特异性序列：鼠伤寒沙门氏菌特异序列（序列2）、肠炎沙门氏菌特异序列（序列3）、阿贡那沙门氏菌特异序列（序列4）、猪霍乱沙门氏菌特异序列（序列5）、鸡白痢沙门氏菌特异序列（序列6)；针对六对特异性序列，应用PrimerPlex2.61分子生物学软件，参数设置：扩增子长度100bp-500bp，引物长度18-25bp，设计出六对PCR引物，引物序列如下：
沙门氏菌特异引物序列：
InvA-F：GCTCGTAATTCGCCGCCATT；（序列7）
InvA-R：CATCAGCAAGGTAGCAGTCAGTATT；（序列8）
鼠伤寒沙门氏菌特异引物序列：
Sty-F：AGCCAGCCGATAACCTCAACTT；（序列9）
Sty-R：CGAAGCCATCTACCGTGAACTG；（序列10）
肠炎沙门氏菌特异引物序列：
Sen-F：CGCAAGGCTATTGTTGAAGTGAAG；（序列11）
Sen-R：CAGTACAGGCACAGCACATCAA；（序列12）
阿贡那沙门氏菌特异引物序列：
Sao-F:AATTGTCTGCGTCATTGAGTTGGA；（序列13）
Sao-R:CGGCGGTTCTTCATCTATCTTCG；（序列14）
猪霍乱沙门氏菌特异引物序列：
Sch-F：CATTACAAGGACGAAGACGCTTATC；（序列15）
Sch-R：CAACAGGTATTGCCAGACACAGT；（序列16）
鸡白痢沙门氏菌特异引物序列：
Sga-F：GACATCAGTACAGTTCTCCACCTC；（序列17）
Sga-R：CACTCCGCTTATTCACCGACAG；（序列18）
实施例2、用于检测沙门氏菌及其血清型的引物的应用
一、引物在检测沙门氏菌及其血清型中的应用
1、基因组DNA的提取
用12株沙门氏菌和10株非沙门氏菌进行检测，菌株组成如表1所示；使用基因组提取试剂盒（Tiangen公司，货号DP302），提取表1中12株沙门氏菌和10株非沙门氏菌的基因组DNA。其中12株沙门氏菌中包括五种血清型沙门氏菌：鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、阿贡那沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。
其中Klebsiella克雷伯氏菌S1、Serratia沙雷氏菌S2、Citrobacter枸橼酸杆菌S3、Enterobactercloacae阴沟肠杆菌S4均记载如下文献中：何涛.动物园灵长类动物肠杆菌科细菌耐药性调查研究.北京:中国农业大学动物医学院,2011夏；
Enterococcusfaecalis粪肠球菌JH2-2记载在如下文献中：LiuY,WangY,WuC,ShenZ,SchwarzS,DuXD,DaiL,ZhangW,ZhangQ,ShenJ.FirstreportofthemultidrugresistancegenecfrinEnterococcusfaecalisofanimalorigin.AntimicrobAgentsChemother.2012Mar;56(3):1650-4；
Proteusvulgaris普通变形杆菌S5记载在如下文献中：WangY,WangY,WuCM,SchwarzS,ShenZ,ZhangW,ZhangQ,ShenJZ.DetectionofthestaphylococcalmultiresistancegenecfrinProteusvulgarisoffoodanimalorigin.JAntimicrobChemother.2011Nov;66(11):2521-6；
SalmonellaSaintpaul圣保罗沙门氏菌S6记载在如下文献中：Li,R.,Lai,J.,Wang,Y.,Liu,S.,Li,Y.,Liu,K.,Shen,J.,Wu,C.2013.PrevalenceandcharacterizationofSalmonellaspeciesisolatedfrompigs,ducksandchickensinSichuanProvince,China.InternationalJournalOfFoodMicrobiology163,14-18。
上述各菌均可从中国农业大学获得。
表1为待检测菌株及其来源
2、多重PCR特异性扩增
将实施例1合成的六对特异PCR引物分别稀释到10μM，然后六对引物等摩尔比例混合，成为混合引物。
20μL多重PCR反应体系中的各组分及其终浓度为：10ulPCR缓冲液[PremixExTaqTMVersion2.0(Loadingdyemix)，购自TaKaRa，D335A，含有Taq酶、dNTP、Mg2+、Loadingbuffer；其中，Taq酶在反应体系中的量为0.5U、各种dNTP在反应体系中的终浓度均为0.2mM、Mg2+在反应体系中的终浓度为2mM]、实施例1的六对PCR引物中的每条引物各0.2μL（混合引物2.4μL，各个引物在反应体系中的终浓度为0.1μM）、模板基因组DNA1μL，用无菌水补足体积。除去模板，反应体系中的其它组分可以组成PCR扩增试剂。
上述模板分别为表1中的12株沙门氏菌的基因组DNA、10株非沙门氏菌的基因组DNA、阳性对照（混合模板，将五种血清型沙门氏菌的基因组DNA等体积混合）和阴性对照（无菌水）。
将20μl多重PCR反应体系按照如下条件进行PCR扩增：
多重PCR反应条件为：95℃预变性5min，之后32个循环（94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s），循环结束后72℃延伸8min，4℃保存；得到PCR产物。
扩增后，在3%琼脂糖凝胶上进行电泳，条件为5V/cm、25min，通过凝胶成像***获取图片。
若得到的PCR产物具有425bp大小的片段，则待测菌株为或候选为沙门氏菌，否则，待测菌株不为或候选不为沙门氏菌；
若得到的PCR产物仅具有425bp和198bp大小的片段，则待测菌株为或候选为鼠伤寒沙门氏菌；否则，待测菌株不为或候选不为鼠伤寒沙门氏菌；
若得到的PCR产物仅具有425bp和302bp大小的片段，则待测菌株为或候选为肠炎沙门氏菌；否则，待测菌株不为或候选不为肠炎沙门氏菌；
若得到的PCR产物仅具有425bp和145bp大小的片段，则待测菌株为或候选为阿贡那沙门氏菌；否则，待测菌株不为或候选不为阿贡那沙门氏菌；
若得到的PCR产物仅具有425bp和368bp大小的片段，则待测菌株为或候选为猪霍乱沙门氏菌；否则，待测菌株不为或候选不为猪霍乱沙门氏菌；
若得到的PCR产物仅具有425bp和249bp大小的片段，则待测菌株为或候选为鸡白痢沙门氏菌；否则，待测菌株不为或候选不为鸡白痢沙门氏菌。
结果如图1所示，泳道1-25分别依次为：DL500DNAMarker、鼠伤寒沙门氏菌ATCC70048、鼠伤寒沙门氏菌ATCC13311、肠炎沙门氏菌ATCC13076、鸡白痢沙门氏菌ATCC10398、阿贡那沙门氏菌ATCC51957、猪霍乱沙门氏菌ATCC7001、鸭沙门氏菌ATCC9270、伦敦沙门氏菌ATCC8389、印第安纳沙门氏菌ATCC51957、布伦登芦普沙门氏菌ATCCBAA-664、德尔卑沙门氏菌ATCC6960、大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC29213、动物空肠弯曲杆菌ATCC33560、粪肠球菌JH2-2、克雷伯氏菌S1、沙雷氏菌S2、枸橼酸杆菌S3、阴沟肠杆菌S4、普通变形杆菌S5、圣保罗沙门氏菌S6、阳性对照（混合模板）、阴性对照（无模板）；泳道8-12所示的ATCC9270、ATCC8389、ATCC51957、ATCCBAA-664、ATCC6960和泳道23所示S6的仅有一条425bp的产物，说明这些菌株为沙门氏菌，且不为五种血清型沙门氏菌中的任一种；泳道2和3所示的ATCC70048、ATCC13311有425bp和198bp的产物，说明这两株菌株为鼠伤寒沙门氏菌；泳道4所示的ATCC13076有425bp和302bp的产物，说明这株菌株为肠炎沙门氏菌；泳道5所示的ATCC10398有425bp和249bp的产物，说明这株菌株为鸡白痢沙门氏菌；泳道6所示的ATCC51957有425bp和145bp的产物，说明这株菌株为阿贡那沙门氏菌；泳道7所示的ATCC57001有425bp和368bp的产物，说明这株菌株为猪霍乱沙门氏菌；阳性对照（混合模板）有所有大小的产物。其他泳道没有425bp的产物，说明为非沙门氏菌。
以上结果表明，引物特异性高，可以用来鉴定沙门氏菌或其五种血清型。
二、灵敏度检测
用上述20μl多重PCR反应体系和上述多重PCR反应条件进行PCR反应，模板为如下五种血清型：鼠伤寒沙门氏菌ATCC70048、肠炎沙门氏菌ATCC13076、鸡白痢沙门氏菌ATCC10398、阿贡那沙门氏菌ATCC51957和猪霍乱沙门氏菌ATCC57001的基因组DNA分别按照每20ul体系中模板量50ng、10ng、5ng、1ng、0.5ng、0.1ng、0.05ng和0.01ng的量进行PCR反应，电泳检测扩增产物。
观察电泳结果，如图2所示：每株沙门氏菌从左到右的模板量依次为50ng、10ng、5ng、1ng、0.5ng、0.1ng、0.05ng和0.01ng，泳道M：DL500DNAMarker，泳道阳：阳性对照（混合模板，按照五种血清型每种50ng的量等体积混合），泳道阴：阴性对照（无菌水）。从图2可以看出，每株菌的第五泳道仍可以看到清晰的条带，相应的DNA量为0.5ng，因此该多重PCR的检测灵敏度为0.5ng/PCR，具有较高的灵敏度。
因此，本发明通过提供六对特异性引物，利用一步多重PCR，可以鉴定出沙门氏菌或五种重要的血清型，具有快速、低成本、操作简单和结果易于判定的特点。

Claims (7)

1.检测或辅助检测沙门氏菌或其五种血清型的引物组，由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5和引物对6组成；
所述引物对1由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成；
所述引物对2由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成；
所述引物对3由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链DNA分子组成；
所述引物对4由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链DNA分子组成；
所述引物对5由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链DNA分子组成；
所述引物对6由序列表中序列17所示的单链DNA分子和序列表中序列18所示的单链DNA分子组成；
所述沙门氏菌五种血清型为鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、阿贡那沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于：
所述引物组中各条引物之比为等摩尔比。
3.检测或辅助检测沙门氏菌或其五种血清型的PCR试剂，由权利要求1或2所述的引物组、PCR缓冲液和水组成；
所述引物组中的各条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为0.1μM；
所述沙门氏菌五种血清型具体为鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、阿贡那沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。
4.检测或辅助检测沙门氏菌或其五种血清型的PCR试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述PCR试剂；所述沙门氏菌五种血清型为鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、阿贡那沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。
5.权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述PCR试剂在制备检测和/或辅助检测待测细菌是否为沙门氏菌五种血清型中的任一种产品中的应用；所述沙门氏菌五种血清型为鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、阿贡那沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于：
所述应用中的检测和/或辅助检测为用权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述PCR试剂对所述待测细菌进行多重PCR扩增。
7.根据权利要求5或6所述应用，其特征在于：
所述多重PCR扩增的退火温度为60℃。
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